專利名稱:診斷傳染性海綿狀腦病的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種診斷傳染性海綿狀腦病的方法和一種使用朊病毒蛋白和層粘連蛋白受體的特異性抗體的診斷性檢驗(yàn)試劑盒。本發(fā)明還涉及所述方法或檢驗(yàn)試劑盒在診斷傳染性海綿狀腦病中的用途。
250年以前,人們發(fā)現(xiàn)了綿羊患的一種疾病,這種疾病伴隨著精神緊張、瘙癢病、共濟(jì)失調(diào),最終癱瘓和死亡。這種疾病在使用英語的國(guó)家被稱為“瘙癢病”(因?yàn)閯?dòng)物為了止癢而在木樁和樹干上摩擦),在法國(guó)被稱為“l(fā)atremblante”而在德國(guó)被稱為“Traberkrankheit”。這些名稱反映了其癥狀的多樣性?!梆W病”被作為一組不僅影響動(dòng)物而且影響人類的疾病傳染性海綿狀腦病(=TSE)的原型來研究。TSE是能攻擊多種哺乳動(dòng)物的致命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
牛海綿狀腦病(BSE)是牛所患的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,它與綿羊和山羊的瘙癢病和人類的克-雅氏病有關(guān)。一種宿主編碼的功能未知的膜相關(guān)糖蛋白,就是所謂的朊病毒蛋白PrP在這種疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。這種細(xì)胞同工型不僅能在神經(jīng)元細(xì)胞上有非常強(qiáng)的表達(dá),而且在非神經(jīng)元細(xì)胞上也可以以不定的頻率測(cè)到。這種膜蛋白對(duì)特異性酶(蛋白酶)的消化敏感(PrP-sen)。然而,可溶性的、惡性形式的PrP(PrP-res)是抗蛋白酶的,它在感染BSE的動(dòng)物大腦中蓄積從而形成淀粉樣斑塊。這種PrP-res形式僅與所有傳染性海綿狀腦病,包括BSE有關(guān),它可以從感染傳染性海綿狀腦病/BSE的腦組織中提取出來。
在早期,人們推測(cè)這種瘙癢病/BSE病原體的非同尋常的特征是它僅由核酸或蛋白組成或既不含核酸也不含蛋白,而是一種多糖或膜片段。目前爭(zhēng)論最多的是“僅含蛋白”的假說和病毒/朊病毒假說“僅含蛋白”的假說是基于不包含核酸并能自我復(fù)制的感染性PrP-res。據(jù)推測(cè)PrP-res可結(jié)合PrP-sen,從而使其轉(zhuǎn)化為惡性同工型。這種惡性同工型的構(gòu)象是以β-折疊結(jié)構(gòu)為特征的,然而其細(xì)胞同工型中卻以α-螺旋占優(yōu)勢(shì)。病毒/朊病毒假說是基于由病毒核酸(可能為RNA)組成的感染因子以及作為該病毒基因組的外殼的朊病毒蛋白。朊病毒外殼的宿主起源可以解釋為什么不發(fā)生免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。核酸的存在可以進(jìn)一步解釋迄今為止被描述過的20種不同的瘙癢病鼠毒株。
細(xì)胞同工型PrP-sen在兩個(gè)天冬酰胺位點(diǎn)被糖基化,它具有33-35000Da的分子量,它通過磷脂酰肌醇糖脂被固定在胞質(zhì)膜的外表面,該糖脂在其羧基端氨基酸處被固定。PrP-sen的最高表達(dá)率可在大腦中檢測(cè)到,但其基因也在非神經(jīng)元性胚胎組織和成人組織中表達(dá)。這種蛋白的生物功能至今仍不清楚。可以設(shè)想,PrP可能是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性(neurotrophic)分化因子的受體。該蛋白還與睡眠/蘇醒節(jié)律有關(guān)。但是,PrP也可能是親神經(jīng)(neurotrophic)病毒的受體。
這種蛋白的正常細(xì)胞同工型能被蛋白酶完全降解(PrP-sen)。相反,惡性異構(gòu)型(PrP-res)被蛋白酶降解為27-30000Da的片段,這種片段仍具有完全的感染力(PrP-res)。PrP-res缺乏成熟PrP-sen蛋白最初的67個(gè)氨基酸。轉(zhuǎn)錄后加工與PrP-sen到PrP-res的轉(zhuǎn)化有關(guān),而且有人懷疑PrP-sen和PrP-res之間唯一的不同在三維結(jié)構(gòu)中。在該蛋白的正常和非正常形式之間,沒有顯示出任何生物化學(xué)方面的不同。這也解釋了為什么這兩種同工型沒有顯示出任何抗原性的不同。此外,PrP-sen和PrP-res具有共同的氨基酸序列。PrP是由染色體基因的單拷貝編碼的,其在哺乳動(dòng)物中高度保守。完整PrP編碼序列包含在單一的外顯子中。
與表達(dá)于表面的PrP-sen比較,PrP-res在胞漿濾泡中累積,這些濾泡中大多數(shù)是次級(jí)溶酶體。
TSE疾病以較長(zhǎng)潛伏期為其特征,潛伏期間觀察不到臨床癥狀,然后是短暫的臨床期,其總是導(dǎo)致死亡。
因?yàn)樽匀桓腥镜膭?dòng)物可能不對(duì)PrP-res起血清學(xué)反應(yīng),通過接種試驗(yàn)動(dòng)物來診斷需要18個(gè)月的工作,所以,迄今為止,瘙癢病和BSE使用組織病理學(xué)、臨床和流行病學(xué)方法進(jìn)行診斷。臨床診斷是于死后對(duì)大腦進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。BSE狀態(tài)可細(xì)分為BSE陽(yáng)性、BSE陰性和BSE可疑。被認(rèn)為BSE可疑的動(dòng)物顯示出與BSE陽(yáng)性的動(dòng)物相同的臨床癥狀。但在檢查時(shí),BSE的組織病理學(xué)表現(xiàn)為陰性。但是這種BSE可疑狀態(tài)可能是一種“前BSE陽(yáng)性”狀態(tài),盡管在一些病例中采用了另一種診斷方法或者動(dòng)物也許沒患BSE。
上述綜合診斷方法包括顯微鏡檢查,例如,神經(jīng)元和神經(jīng)纖維網(wǎng)中BSE特異性液泡、星形膠質(zhì)細(xì)胞增多、神經(jīng)元的丟失和PrP-res,也稱為瘙癢病相關(guān)纖絲(SAF)的異常聚積的沉積。SAF可以原位檢測(cè),如通過對(duì)組織印跡(histoblot)的免疫印跡,以及對(duì)處理過的受感染腦部提取物的蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)印跡,或作為透射電鏡中負(fù)染出的典型原纖維(fibril)聚積。
另一個(gè)間接診斷BSE的方法是分析腦脊液。神經(jīng)學(xué)疾病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中蛋白質(zhì)代謝的質(zhì)和量的改變有關(guān),而這些都反映在腦脊液(CSF)組成的改變中。應(yīng)用雙向凝膠電泳可找到與此疾病相關(guān)的標(biāo)記蛋白。這種可能的標(biāo)記物(僅是BSE的間接指標(biāo))可在實(shí)驗(yàn)型BSE潛伏期的晚期首次檢測(cè)到。然而,通過與取自克-雅氏病人的樣品對(duì)照,這種標(biāo)記物也曾在阿耳茨海默病病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。阿耳茨海默病被認(rèn)為是一種非傳染性海綿狀腦病。
即使開發(fā)了更簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法,這類檢驗(yàn)也不太可能適用于診斷亞臨床BSE。
現(xiàn)有技術(shù)描述了具有朊病毒蛋白抗原決定簇的合成多肽的制備方法(WO93/11155,WO93/23432),天然瘙癢病朊病毒蛋白的特異性抗體(WO97/10505),以及檢測(cè)綿羊的瘙癢病的方法(WO97/37227)。Korth等(1997,自然39074-77)描述了一種小鼠單克隆抗體,該抗體能夠區(qū)分細(xì)胞同工型(PrPc)和瘙癢病同工型(PrPsc)。
本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種診斷亞臨床或臨床傳染性海綿狀腦病的方法。
依據(jù)本發(fā)明,在說明書和權(quán)利要求書范圍內(nèi),通過診斷亞臨床或臨床傳染性海綿狀腦病的方法,該目標(biāo)已經(jīng)達(dá)到。
依據(jù)本發(fā)明,該方法的特征在于a)血液樣品取自活體哺乳動(dòng)物b)細(xì)胞從該血液樣品中濃縮,所述細(xì)胞被稱為靶細(xì)胞c)在靶細(xì)胞上測(cè)定傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的表達(dá)d)所獲得的結(jié)果與對(duì)照值比較。
在本發(fā)明方法的一種具體實(shí)施方案中,靶細(xì)胞已勻漿(homogenised)。
傳染性海綿狀腦病的亞臨床階段是雖感染了朊病毒蛋白但沒有外在臨床癥狀的很長(zhǎng)潛伏期。本發(fā)明使診斷傳染性海綿狀腦病,尤其在沒有外在臨床癥狀的時(shí)期診斷傳染性海綿狀腦病成為可能。因此,本發(fā)明還能診斷疑有傳染性海綿狀腦病,但是在檢驗(yàn)時(shí)組織病理學(xué)表現(xiàn)(仍然)是陰性的哺乳動(dòng)物(疑有傳染性海綿狀腦病,也參照上面對(duì)BSE的描述)。臨床期是出現(xiàn)臨床癥狀的短暫期,它跟隨著亞臨床期,迄今由于缺乏任何治療,它一定導(dǎo)致感染動(dòng)物的死亡。使用本發(fā)明的技術(shù)教導(dǎo),在這一時(shí)期也能診斷傳染性海綿狀腦病。所述傳染性海綿狀腦病(TSE)尤其包括綿羊的瘙癢病、牛海綿狀腦病(BSE)、人類的庫(kù)魯病和克-雅氏病。
測(cè)定標(biāo)記蛋白的表達(dá)意味著所述標(biāo)記蛋白與對(duì)照比較有可證實(shí)的升高或降低?!翱勺C實(shí)地”指,例如,標(biāo)記蛋白的表達(dá)比對(duì)照中的增高或降低50%到100%或?yàn)榻y(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增高或降低??蓽y(cè)定對(duì)照值或標(biāo)準(zhǔn),例如,使用非感染動(dòng)物的細(xì)胞,這些值可用于校準(zhǔn)本發(fā)明的方法。這些方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
標(biāo)記蛋白可能是技術(shù)人員已知,在亞臨床或臨床傳染性海綿狀腦病中可證實(shí)地升高或降低的任一蛋白。比如,標(biāo)記蛋白在對(duì)照中不能檢測(cè)到,而用下面描述的方法在感染動(dòng)物或懷疑患有傳染性海綿狀腦病的動(dòng)物中卻能清楚地鑒定的情況。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明方法的特征在于標(biāo)記蛋白是朊病毒蛋白PrP-sen。本發(fā)明的朊病毒蛋白PrP-sen是朊病毒蛋白的細(xì)胞同工型,其經(jīng)常被稱為PrPc。PrP-sen(sen=敏感的)可被蛋白酶徹底降解。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明方法的特征在于標(biāo)記蛋白是γ干擾素(IFNγ)。而另一種具體實(shí)施方案中所述方法的特征在于標(biāo)記蛋白是牛型γ干擾素(IFNγ)。IFNγ(例如Vilcek,J.和Oliveira,I.C.Int Arch Allergy Immunol1994,104311-316)和牛型IFNγ(Keefe,R.G.等,Vet Immunol Immunopathol,1997,5639-51)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
另一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明方法的特征在于標(biāo)記蛋白是層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)。層粘連蛋白受體(例如Grosso,L.E.等,生物化學(xué),1991,303346-3350)和層粘連蛋白受體前體(例如Castronovo,V.等,生物化學(xué)雜志1991,26620440-20446)是本領(lǐng)域熟知的。另一種具體實(shí)施方案中,所述方法的特征在于標(biāo)記蛋白是牛型層粘連蛋白受體(LR)或牛型層粘連蛋白受體前體(LRP)。
以上的標(biāo)記蛋白可以使用一般技術(shù)人員所熟知的方法檢測(cè)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述標(biāo)記蛋白通過免疫試驗(yàn)測(cè)定。免疫試驗(yàn)使用在本領(lǐng)域現(xiàn)有的所述標(biāo)記蛋白特異性的單克隆抗體或多克隆抗血清。例如,單克隆抗體13和單克隆抗體142可以用于標(biāo)記蛋白PrPsen(Harmeyer S.等,J Gen Virol 1998,79,937-945,見圖1)。免疫試驗(yàn)包括了在本領(lǐng)域所熟知的檢測(cè)方法,如ELISA試驗(yàn)(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))或所謂的夾心ELISA試驗(yàn)、斑點(diǎn)印跡法、免疫印跡法、放射免疫試驗(yàn)(RIA),奧特洛尼(Ouchterlony)擴(kuò)散試驗(yàn)或火箭免疫熒光試驗(yàn)。另一種免疫試驗(yàn)是所謂的蛋白印跡(也稱蛋白轉(zhuǎn)移法)。蛋白印跡的目的是將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白或多肽轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或其他合適的載體上,同時(shí)保留從凝膠上獲得的蛋白或多肽的相對(duì)位置。然后讓它和一種特異性結(jié)合所述蛋白或多肽的抗體保溫。一般的技術(shù)人員就能使用這些方法去完成此處描述的發(fā)明。技術(shù)人員能找到的上述方法和其它檢測(cè)方法的參考文獻(xiàn)列出如下放射免疫分析及有關(guān)技術(shù)入門,Elsevier Science Publishers,阿姆斯特丹,荷蘭;Bullock等,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)Academic Press,Orlando,F(xiàn)L Vol.1(1982),Vol.2(1983),Vol.3(1985);Tijssen,酶免疫分析的實(shí)踐和理論生物化學(xué)和分子生物實(shí)驗(yàn)室技術(shù)Elsevier SciencePublishers,阿姆斯特丹,荷蘭(1985)。
另一個(gè)最特別的實(shí)施方案中,使靶細(xì)胞和標(biāo)記蛋白的特異性抗體保溫,檢測(cè)由此形成的抗原/抗體復(fù)合物。
在本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中,利用分子生物方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白改變的表達(dá)。此處的分子生物方法指檢測(cè)方法,其包括如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或者是技術(shù)人員能在標(biāo)準(zhǔn)參考書上找到的RNA或DNA印跡(如Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,紐約和Bertram,S.and Gassen,H.G.GentechnischeMethoden,G.Fischer Verlag,Stuttgart,New York,1991)。
本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白。在這種特殊形式的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中首先分離出總RNA,然后使用逆轉(zhuǎn)錄酶把總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后用其進(jìn)行PCR。這種檢測(cè)方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的,也是在標(biāo)準(zhǔn)參考書上發(fā)表過的(如Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,紐約和Bertram,S.and Gassen,H.G.GentechnischeMethoden,G.Fischer Verlag,Stuttgart,New York,1991)。
“活體哺乳動(dòng)物”實(shí)例是一般技術(shù)人員熟知的,包括如人類,以及綿羊、山羊、豬、牛、鹿、兔、倉(cāng)鼠、大鼠、小鼠。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述方法的特征在于活體哺乳動(dòng)物是所有牛科動(dòng)物的一種,最優(yōu)選奶牛或綿羊。雖然其應(yīng)用具體涉及牛的傳染性海綿狀腦病的診斷方法,但所教授的技術(shù)同樣適用于可受上述腦病病原體折磨的任何動(dòng)物,因此這種技術(shù)是包含在本發(fā)明中的。
血液樣品中包含的細(xì)胞包括來自造血干細(xì)胞的所有細(xì)胞,例如淋巴細(xì)胞、凝血細(xì)胞、血小板、或紅細(xì)胞。
在另一具體實(shí)施方案中,所述方法的特征在于靶細(xì)胞是白細(xì)胞。術(shù)語白細(xì)胞包括,如多形核白細(xì)胞和單核白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。
在一更具體的實(shí)施方案中,所述方法的特征是靶細(xì)胞是單核白細(xì)胞。術(shù)語單核白細(xì)胞具體指單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和郎罕氏細(xì)胞。
在另一具體實(shí)施方案中,所述方法的特征在于靶細(xì)胞是多形核白細(xì)胞。多形核白細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)海綿狀腦病的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其包括用本發(fā)明方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白改變的表達(dá)所必需的所有元件。
本發(fā)明還具體涉及一種診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其包括傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的特異性抗體。
本發(fā)明還具體涉及一種診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于本發(fā)明抗體是多克隆的。
本發(fā)明還具體涉及一種診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于本發(fā)明抗體是單克隆的。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于它包括用本發(fā)明方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白PrP-sen改變的表達(dá)所必需的所有元件。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于它包括用本發(fā)明方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白IFNγ改變的表達(dá)所必需的所有元件。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于它包括用本發(fā)明方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白牛型IFNγ改變的表達(dá)所必需的所有元件。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于它包括用本發(fā)明方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)改變的表達(dá)所必需的所有元件。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于它包括用本發(fā)明方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白牛型層粘連蛋白受體(LR)或牛型層粘連蛋白受體前體(LRP)改變的表達(dá)所必需的所有元件。
本發(fā)明還具體涉及一種適于進(jìn)行原位免疫試驗(yàn)的診斷性檢驗(yàn)試劑盒。
診斷性檢驗(yàn)試劑盒是本發(fā)明診斷方法的所有成分的集成。實(shí)施本發(fā)明方法的其它元件有(沒有詳盡列舉),容器,如96孔板或微滴板、試管、其它適當(dāng)?shù)娜萜?、表面和基座、膜如硝酸纖維素膜、洗滌劑和緩沖液。診斷性檢驗(yàn)試劑盒還可能包括可以檢測(cè)結(jié)合型抗體,比如標(biāo)記的二抗的試劑、發(fā)色團(tuán)、酶(例如與抗體偶聯(lián)的)及其底物或其它能結(jié)合抗體的底物。
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)傳染性海綿狀腦病的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,該試劑盒包括能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的核酸雜交的寡核苷酸,以及,實(shí)施本發(fā)明方法所需的其它元件。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于,其包括實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的所有必要元件。所述試劑盒可包括,但并不限于除試管或96孔板或微滴板以外的其它合適的容器,表面和基座,膜如硝酸纖維素膜,洗滌劑和反應(yīng)緩沖液(其pH值和鎂濃度可能有不同),無菌水,礦物油,BSA(牛血清白蛋白),MgCl2,(NH4)2SO4,DMSO(二甲亞砜),巰基乙醇,核苷酸(dNTP),酶如Tag聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶,以及作為DNA基質(zhì)的標(biāo)記蛋白或其部分之DNA序列,本發(fā)明標(biāo)記蛋白的特異性寡核苷酸,對(duì)照模板,DEPC水,DNA酶和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它化合物。
本發(fā)明的寡核苷酸是大約15-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)的短核酸分子,它能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與標(biāo)記蛋白的互補(bǔ)核酸序列結(jié)合。關(guān)于嚴(yán)謹(jǐn)條件,技術(shù)人員指選擇大于85%,最好大于90%同源性的條件(參見Sambrook等(1989),分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,紐約;Bertram,S.andGassen,H.G.Gentechnische Methoden,G.Fischer Verlag,Stuttgart,New York,1991)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其包含能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼PrP-sen的核酸雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其包含能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼IFNγ的核酸雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其包含能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼牛型IFNγ的核酸雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其包含能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)的核酸雜交的寡核苷酸。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及PrP-sen特異性抗體在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及IFNγ特異性抗體在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及牛型IFNγ特異性抗體在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)特異性抗體在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼PrP-sen之核酸雜交的寡核苷酸在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼IFNγ之核酸雜交的寡核苷酸在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼牛型IFNγ之核酸雜交的寡核苷酸在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)之核酸雜交的寡核苷酸在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)傳染性海綿狀腦病的診斷用試驗(yàn)試劑在診斷人和動(dòng)物的海綿狀腦病,或?qū)Φ胤叫訠SE或瘙癢病進(jìn)行流行病學(xué)控制方面的應(yīng)用。
圖1蛋白印跡法測(cè)定標(biāo)記蛋白PrPsen該圖顯示,應(yīng)用142單克隆抗體經(jīng)蛋白印跡法測(cè)定BSE感染的牛和BSE陰性對(duì)照動(dòng)物的單核(MN)白細(xì)胞中的標(biāo)記蛋白PrPsen。
細(xì)胞于2%十二烷基肌氨酸鈉中勻漿。勻漿制劑以60ug/孔的濃度點(diǎn)樣在凝膠上。
泳道1分子量標(biāo)志泳道2BSE腦(BSE陽(yáng)性,陽(yáng)性對(duì)照)泳道3奶牛058193號(hào)(BSE陽(yáng)性)泳道4奶牛5061號(hào)(BSE陽(yáng)性)泳道5奶牛2819號(hào)(BSE陽(yáng)性)泳道6奶牛279046號(hào)(BSE陰性,陰性對(duì)照)泳道7奶牛4751號(hào)(BSE陽(yáng)性)所有MN樣品來自BSE感染的牛,僅4751號(hào)奶牛除外。與陰性對(duì)照相比,所有BSE感染的牛均為PrPsen表達(dá)陽(yáng)性。5061號(hào)奶牛(泳道4)的PrPsen表達(dá)相對(duì)較弱,但顯著高于陰性對(duì)照。
圖2RT-PCR法測(cè)定標(biāo)記蛋白IFNγ該圖顯示了應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定BSE感染的牛和BSE陰性對(duì)照動(dòng)物中的標(biāo)記蛋白IFNγ。
泳道1GAPDH對(duì)照,4372號(hào)奶牛(BSE陽(yáng)性)泳道2IFNγ,4372號(hào)奶牛(BSE陽(yáng)性)泳道3GAPDH對(duì)照,441號(hào)奶牛(BSE陰性)泳道4IFNγ,441號(hào)奶牛(BSE陰性)圖3RT-PCR法測(cè)定標(biāo)記蛋白層粘連蛋白受體該圖顯示了RT-PCR法測(cè)定BSE感染的牛中的標(biāo)記蛋白層粘連蛋白受體(LR),所述牛為疑有BSE者以及BSE陰性對(duì)照動(dòng)物。
A部分)泳道1奶牛4471(陽(yáng)性BSE)泳道2奶牛58193(陽(yáng)性BSE)泳道3奶牛462(陰性對(duì)照)泳道4奶牛5621(可疑性BSE)泳道5奶牛5054(可疑性BSE)
泳道6靶DNA對(duì)照泳道7空白泳道8分子量標(biāo)志B部分)針對(duì)A部分)的每一條泳道都有相應(yīng)的D-甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAPDH)的RT-PCR作為對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶不同活性的對(duì)照本發(fā)明參照以下實(shí)施例詳述。
實(shí)施例1利用分離的白細(xì)胞中特異性標(biāo)記蛋白增強(qiáng)的表達(dá)診斷BSE以下實(shí)施例描述對(duì)牛中BSE的診斷,其方法是測(cè)定分離的單核(MN)或多形核(PMN)白細(xì)胞上,標(biāo)記蛋白PrP-sen或IFNγ或?qū)诱尺B蛋白受體(前體)(LR(P))的增強(qiáng)的表達(dá)。
從牛的全血中分離單核(MN)和多形核(PMN)白細(xì)胞這種特殊的血細(xì)胞是通過兩次離心步驟分離,后一步是密度梯度離心,以便獲得所謂的白細(xì)胞“棕黃”層,然后溶解紅細(xì)胞。
步驟1采血血樣(大約400ml)取自所述動(dòng)物,然后直接置于一個(gè)特殊容器中。該容器已經(jīng)含有葡萄糖和檸檬酸鹽的混合物68mM葡萄糖,37.4mM檸檬酸三鈉,17.4mM檸檬酸,調(diào)至PH7.3,作為抗凝劑。血樣和抗凝劑的比例是61。將血樣立即送到實(shí)驗(yàn)室以分離細(xì)胞。
步驟2濃集白細(xì)胞1.離心準(zhǔn)確取40ml經(jīng)抗凝劑處理的牛全血,置于可封閉型無菌50ml離心管中,在無制動(dòng)的旋轉(zhuǎn)離心機(jī)中以800xg室溫離心20分鐘。離心應(yīng)每小時(shí)延長(zhǎng)5分鐘(最多3個(gè)小時(shí)),收集血樣并保存。
第一次離心形成了三個(gè)區(qū)帶;上區(qū)帶血清中間區(qū)帶白細(xì)胞(所謂的“棕黃層”)下區(qū)帶紅細(xì)胞密度離心基質(zhì)可用標(biāo)準(zhǔn)市售基質(zhì)分離白細(xì)胞。我們用NYCOMED LymphoprepTM,密度是1.007g/ml。
小心取出血清,在-20℃冰凍以進(jìn)一步分析。白細(xì)胞層取出后放到一個(gè)新的離心管中。
第二次離心從第一次離心產(chǎn)物中準(zhǔn)確取出15ml白細(xì)胞,置于可封閉型無菌50ml離心管中的35ml的NYCOMED LymphoprepTM(密度1.007g/ml)上。
離心在無制動(dòng)的離心機(jī)中以800g室溫離心20分鐘。
離心應(yīng)每小時(shí)延長(zhǎng)5分鐘(最多3個(gè)小時(shí)),收集血樣并保存。
第二次離心形成4個(gè)區(qū)帶從上到下第一區(qū)帶(殘余)血清第二區(qū)帶單核白細(xì)胞(單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞=棕黃)第三區(qū)帶基質(zhì)界面第四區(qū)帶多形核白細(xì)胞和(殘余)紅細(xì)胞步驟3單核(MN)白細(xì)胞的分離第二區(qū)帶包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,用無菌Pasteur移液管小心吸出,轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌的50ml離心管中。將細(xì)胞用等體積的無菌PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次,然后以600xg于10℃離心15分鐘。將沉淀的細(xì)胞重懸于HBSS(含有NaHCO3的Hanks平衡鹽溶液,無酚紅)中。使用臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活性和細(xì)胞數(shù)。
步驟4多形核(PMN)白細(xì)胞的分離在吸出第二區(qū)帶后,也吸去第一和第三區(qū)帶。然后用三倍的無菌紅細(xì)胞裂解液(ELB,由8.9mM KHCO3,154.9mM NH4Cl和0.01mM EDTA組成)稀釋PMN/紅細(xì)胞混合物,小心混勻,室溫保溫10分鐘。
離心800xg/10分鐘/10℃棄去上清液,細(xì)胞沉淀重懸于20ml ELB緩沖液中,混勻,靜置,再離心。
離心800xg/10分鐘/10℃棄去上清液,沉淀用20ml HBSS(如上,但再加1mM MgCl2)洗滌。
離心800xg/8分鐘/10℃棄去上清液,細(xì)胞重懸于HBSS中。使用臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活性和細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果細(xì)胞數(shù)舉例細(xì)胞類型細(xì)胞數(shù)/ml血液活性1.MN 2.25×106≥93%2.PMN 4.03×106≥98%以下是對(duì)BSE感染動(dòng)物中分離的單核白細(xì)胞和多形核白細(xì)胞的測(cè)定I、朊病毒蛋白的細(xì)胞同工型PrP-sen增加的表達(dá)II、γ干擾素蛋白IFNγ增加的表達(dá)III、層粘連蛋白(前體)受體(LR(P))增加的表達(dá)I、細(xì)胞同工型PrPsen增加的表達(dá)對(duì)照動(dòng)物和BSE感染動(dòng)物的分離的白細(xì)胞中PrPsen的表達(dá)率利用蛋白印跡分析法(Harmeyer S.等,普通病毒學(xué)雜種1998,79,937-945)測(cè)量。其中利用了發(fā)色團(tuán)的顯色作用。
細(xì)胞的裂解分離的白細(xì)胞在2%的十二烷基肌氨酸鈉溶液(Sigma公司,St.Louis,USA)中勻漿10分鐘/4℃。所得勻漿制劑于15,000xg/4℃離心40分鐘。上清經(jīng)抽吸過濾,并貯存在-20℃。
測(cè)定勻漿制劑的蛋白濃度,然后把所有標(biāo)本校準(zhǔn)為6mg/ml蛋白。每孔準(zhǔn)確裝入60μg勻漿物。
使用單克隆抗體13或單克隆抗體142進(jìn)行檢測(cè)。在上面提到的出版物中有這兩種抗體的詳細(xì)描述。抗體分別以1∶10稀釋。
本實(shí)施例中使用的二抗是1∶3000稀釋的AP偶聯(lián)型抗體。
結(jié)果結(jié)果顯示,與健康對(duì)照動(dòng)物對(duì)比,BSE感染動(dòng)物的MN白細(xì)胞和PMN白細(xì)胞中PrP-sen的蛋白表達(dá)顯著升高(也參照?qǐng)D1的蛋白印跡法,樣品來自其它的牛)。
案例號(hào)/樣品BSE狀態(tài)PrPsen增加的表達(dá)4372陽(yáng)性 有4471陽(yáng)性 有4401懷疑 有陰性對(duì)照陰性 無陰性II、IFNγ增高的表達(dá)用兩種方法測(cè)定增高的表達(dá)--用ELISA法測(cè)定蛋白--用RT-PCR法測(cè)定特異性mRNA1.用ELISA法測(cè)定IFNγ采用澳大利亞墨爾本CSL獸醫(yī)有限公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒。
結(jié)果BSE狀態(tài)動(dòng)物數(shù)IFNγ(pg/ml)BSE陽(yáng)性 9 314.0±78.2BSE可疑 9 504.0±109.7BRE陰性 130.0±0.02.用RT-PCR法測(cè)定IFNγmRNARNA(從整個(gè)白細(xì)胞級(jí)分)的分離和后來的RT-PCR使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Yi-Jun Shi and Jing-Zhlong Liu,Genet.Anal.Tech.Appl.,1992,9,149-150;Izraeli S.等,核酸研究1991,21,6051;Michel U.等,Anal.Biochem.1997,249,246-247),有以下改動(dòng)。
RNA的分離使用Promega系統(tǒng)(目錄號(hào)G3191)分離總RNA。
cDNA(RT反應(yīng))應(yīng)用Promega的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(目錄號(hào)A3500)逆轉(zhuǎn)錄已分離的RNA樣品。
PCR反應(yīng)使用兩次PCR反應(yīng)(“嵌套式PCR”)測(cè)定特異性mRNA。
其中使用的γ干擾素的引物是FW1(IFNF1)5’GGAGTATTTTAATGCAAGTAGCCC 3’FW2(IFNF2)5’GTAGCTAAGGGTGGGCCTCT 3’RV(IFNR1)5‘GCTCTCCGGGCCTCGAAAGAGATT 3’預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)該是357個(gè)堿基對(duì)(bp)。
結(jié)果通過該RT-PCR清楚地證實(shí)了IFNγELISA的結(jié)果,即BSE感染動(dòng)物的γ干擾素顯著增加。
圖2顯示了4372和441號(hào)牛的全血樣品中總白細(xì)胞的mRNA的RT-PCR。
III、層粘連蛋白受體(前體)(LR(P))增高的表達(dá)通過RT-PCR測(cè)定表達(dá)。該反應(yīng)也包括對(duì)LRP以及LR的檢測(cè)。目前還沒有描述過牛型LRP或LR的序列。但是,這種蛋白在哺乳動(dòng)物中是高度保守的。人類和鼠的已公開的序列數(shù)據(jù)因此得以比較。在此數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上,建立了如下的引物序列引物正向5’AAGAGGACCTGGGAGAAGCT 3’反向5’CCTTCTCAGCAGCAGCCCTGC 3’預(yù)期產(chǎn)物517bpRNA分離見II.2.的描述。
cDNA(RT反應(yīng))見II.2.的描述。
PCR反應(yīng)單一反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)方法一致。結(jié)果案例號(hào)/樣品BSE狀態(tài)LRP/LR增加的表達(dá)4471陽(yáng)性有58193 陽(yáng)性有5621可疑 (有)5054可疑有對(duì)照(462) 陰性無這些結(jié)果顯示于圖3。
IV.克隆和表達(dá)牛型層粘連蛋白受體(前體)(LR(P))以生產(chǎn)抗LR的特異性抗體。
關(guān)于LR引物的研制為了擴(kuò)增LR的完整基因(Genebank登記編號(hào)S37431)設(shè)計(jì)了針對(duì)牛型LR的引物。引物是根據(jù)牛的c10蛋白基因(Genebank登記編號(hào)M64923)設(shè)計(jì)的。
在下面限定的LR引物中,方框中顯示的是它們的限制性酶切位點(diǎn)??衫眠@些限制性酶切位點(diǎn)直接向大腸桿菌中克隆。
設(shè)計(jì)的LR引物將用于從牛的全血所分離的細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增LR。
三種引物的序列如下LRPF1 5’ATTT TGTCCGGAGCCCTTGATGTCC 3’LRPR1 5’ATTG TTACGACCACTCGGTGGTGGT 3’LRPR2 5’ATTT AACGACCACTCGGTGGTTCC 3’限制性酶切位點(diǎn)LRPF1引物能被Xho酶切,LRPR1引物能被Eco R1酶切,LRPR2引物能被Xba1酶切。
牛型LR基因的RT-PCR和克隆LR引物以50ng/ml的終濃度重懸于無菌水中。
牛的白細(xì)胞RNA是從牛的全血中總白細(xì)胞級(jí)分中分離的。
取5μg的RNA用DNA酶(Gibco BRL)消化,然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,目錄號(hào)A3500)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用引物L(fēng)RPF1、LRPR1和LRPR2進(jìn)行PCR反應(yīng)。
PCR35個(gè)循環(huán),退火溫度50℃。
PCR獲得的擴(kuò)增片段在1%的瓊脂糖凝膠上電泳以測(cè)定片段大小。所得帶經(jīng)凝膠純化,再次檢查其大小,然后從瓊脂糖中轉(zhuǎn)移出片段并重懸于10μl的無菌水中。
把擴(kuò)增的片段連接到質(zhì)粒pGEM-T中(Boehringer Mannheim連接試劑盒)。
測(cè)序所有的克隆經(jīng)并證實(shí)是LR基因。
亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒pBADGm和pTrcHis(都從Invitrogen有限公司獲得),并當(dāng)即檢驗(yàn)克隆中插入片段的存在。
設(shè)計(jì)用于抗LR研制的肽在抗LR抗體的研制中,利用了所設(shè)計(jì)的四種肽,這些肽是使用牛的c10蛋白(Genebank登記編號(hào)64923;蛋白Id.AAA62713.1)設(shè)計(jì)的。
利用能預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)、疏水性、親水性和抗原位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)程序來設(shè)計(jì)肽。
主要參數(shù)用于選擇其中兩種肽為具有親水性的和抗原性的肽,另外兩種肽是按照它們?cè)谒龅鞍椎腃末端區(qū)和N末端區(qū)的位置選擇的。
肽1141 MSGALDVLQMKEEDVLKFLAGC(氨基端)對(duì)應(yīng)于所述蛋白氨基端的氨基酸殘基1-20。
等電點(diǎn)(pI)為4.32。
肽1142 RLLVVTDPRADHQPLTEASYGC(具有抗原性)對(duì)應(yīng)于所述蛋白抗原區(qū)的氨基酸殘基120-140。
等電點(diǎn)(pI)為5.38。
肽1143 KEEQAAEKAVTKEEFQGEWGC(親水性并具有抗原性)對(duì)應(yīng)于所述蛋白的具有親水性和抗原性的區(qū)域中氨基酸殘基212-231。
等電點(diǎn)(pI)為4.48。
肽1144 FTAAQPEVADWSEGVQVPSVGC(羧基端)對(duì)應(yīng)于所述蛋白羧基端氨基酸殘基238-257。
等電點(diǎn)(pI)為3.58。
每種肽與Imject馬來酰亞胺活化的卵白蛋白載體蛋白偶聯(lián),方法如下
在100mM Na2HPO4(pH7.2)中溶解多肽至終濃度為10mg/ml。
在無菌水中溶解Imject馬來酰亞胺活化的卵白蛋白載體蛋白至終濃度為10mg/ml。
在室溫下,使多肽和卵白蛋白偶聯(lián)2小時(shí)。
隨后,使已偶聯(lián)的蛋白溶液對(duì)500倍體積的PBS(pH7.4)透析,然后貯存在-20℃?zhèn)溆谩?br>
多克隆和單克隆抗體的制備多克隆和單克隆抗體的制備以類似于諸如Harmeyer S.等,普通病毒學(xué)雜志,1998的方法進(jìn)行。
簡(jiǎn)述第0天免疫前采血檢測(cè)抗LR抗體,然后注射。
第0天皮下注射0.5ml已偶聯(lián)的肽,所述肽懸浮于完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich,目錄號(hào)F-5881)。
第14天0.5ml已偶聯(lián)的肽的不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich,目錄號(hào)F-5506)進(jìn)行第一次加強(qiáng)注射。
第21天使用不含佐劑的1ml已偶聯(lián)的肽進(jìn)行第二次加強(qiáng)注射。
第31天取血檢測(cè)已產(chǎn)生的抗體。
用于標(biāo)記蛋白測(cè)定的ELISA系統(tǒng)ELISA技術(shù)很適合BSE標(biāo)記蛋白的測(cè)定。在本實(shí)例中,分離特異性血細(xì)胞,所述細(xì)胞表面攜帶有這些標(biāo)記蛋白。
細(xì)胞分離方法使用免疫磁珠(Dynabeads)耗盡法進(jìn)一步分離MN和PMN白細(xì)胞亞類(靶細(xì)胞)。珠子上包被抗牛型白細(xì)胞的特異性抗體。
簡(jiǎn)述-血樣中加入細(xì)胞特異性Dynabeads-靶細(xì)胞的免疫捕獲-靶細(xì)胞的磁性分離-純化靶細(xì)胞的洗滌和濃縮標(biāo)記蛋白的ELISA測(cè)定根據(jù)用靶細(xì)胞特異性捕獲抗體對(duì)靶細(xì)胞的分離來選擇ELISA系統(tǒng)。
-微滴板上包被靶細(xì)胞表面標(biāo)記特異性的第一捕獲抗體。
-與表達(dá)靶細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞一起保溫。結(jié)合至第一捕獲抗體。
-細(xì)胞捕獲后,與直接針對(duì)BSE標(biāo)記蛋白的生物素化第二抗體一起保溫。
-與酶偶聯(lián)的檢測(cè)蛋白一起保溫。加入底物,并用ELISA讀取僅測(cè)定。
權(quán)利要求
1.診斷亞臨床的或臨床的傳染性海綿狀腦病的方法,其特征在于a)血液樣品來自活的哺乳動(dòng)物b)從該血樣濃縮細(xì)胞,所述細(xì)胞被稱為靶細(xì)胞c)在靶細(xì)胞上測(cè)定傳染性海綿狀腦病的標(biāo)記蛋白的表達(dá)d)所獲數(shù)值與對(duì)照值比較。
2.權(quán)利要求1的方法,其特征在于靶細(xì)胞已勻漿。
3.權(quán)利要求1或2的方法,其特征在于標(biāo)記蛋白是朊病毒蛋白PrPsen。
4.權(quán)利要求1到3的方法,其特征在于標(biāo)記蛋白是γ干擾素(IFNγ)。
5.權(quán)利要求1到4的方法,其特征在于標(biāo)記蛋白是牛型γ干擾素(IFNγ)。
6.權(quán)利要求1到5的方法,其特征在于標(biāo)記蛋白是層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)。
7.權(quán)利要求1到6的方法,其特征在于標(biāo)記蛋白是牛型層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)。
8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法,其特征在于利用免疫試驗(yàn)測(cè)定標(biāo)記蛋白。
9.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法,其特征在于使靶細(xì)胞與標(biāo)記蛋白的特異性抗體一起保溫,測(cè)定因此形成的抗原/抗體復(fù)合物。
10.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法,其特征在于利用分子生物學(xué)方法測(cè)定傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的改變的表達(dá)。
11.權(quán)利要求10的方法,其特征在于利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的改變的表達(dá)。
12.權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的方法,其特征在于活體哺乳動(dòng)物是奶牛。
13.權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法,其特征在于靶細(xì)胞是白細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的方法,其特征在于靶細(xì)胞是單核白細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的方法,其特征在于靶細(xì)胞是多形核白細(xì)胞。
16.用于檢測(cè)傳染性海綿狀腦病的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含用權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的表達(dá)改變所必需的所有元件。
17.權(quán)利要求16的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的特異性抗體。
18.權(quán)利要求17的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于所述抗體是多克隆的。
19.權(quán)利要求17的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于所述抗體是單克隆的。
20.權(quán)利要求16到19中任一項(xiàng)的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含用權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白PrP-sen已改變的表達(dá)所必需的所有元件。
21.權(quán)利要求16到20的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含用權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白γ干擾素已改變的表達(dá)所必需的所有元件。
22.權(quán)利要求16到21的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含用權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白牛型γ干擾素已改變的表達(dá)所必需的所有元件。
23.權(quán)利要求16到22的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含用權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)已改變的表達(dá)所必需的所有元件。
24.權(quán)利要求16到23中任一項(xiàng)的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該檢驗(yàn)試劑盒適合進(jìn)行原位免疫試驗(yàn)。
25.用于檢測(cè)傳染性海綿狀腦病的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼傳染性海綿狀腦病標(biāo)記蛋白的核酸雜交的寡核苷酸,還包含實(shí)施權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法的其它必要元件。
26.權(quán)利要求25的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于該試劑盒包含進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的所有必要元件。
27.權(quán)利要求25或26的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于標(biāo)記蛋白是PrP-sen。
28.權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于標(biāo)記蛋白是IFNγ。
29.權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于標(biāo)記蛋白是牛型IFNγ。
30.權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于標(biāo)記蛋白是層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)。
31.權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)的診斷性檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于標(biāo)記蛋白是牛型層粘連蛋白受體(LR)或牛型層粘連蛋白受體前體(LRP)。
32.PrP-sen特異性抗體在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
33.IFNγ特異性抗體在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
34.牛型IFNγ特異性抗體在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
35.層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)特異性抗體在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
36.一種在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼PrP-sen的核酸雜交的寡核苷酸在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
37.一種在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼IFNγ的核酸雜交的寡核苷酸在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
38.一種在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼牛型IFNγ的核酸雜交的寡核苷酸在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
39.一種在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼層粘連蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)的核酸雜交的寡核苷酸在權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法中的應(yīng)用。
40.用于檢測(cè)傳染性海綿狀腦病的檢驗(yàn)試劑盒根據(jù)權(quán)利要求16到39在人類和動(dòng)物的海綿狀腦病的診斷或地方性BSE或瘙癢病的流行病學(xué)控制方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及傳染性海綿狀腦病的亞臨床和臨床診斷的方法,其特征在于可以測(cè)量出一種標(biāo)記蛋白的表達(dá)改變。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中,所測(cè)標(biāo)記蛋白是朊病毒蛋白(PrP-sen)或γ干擾素(IFNγ),或?qū)诱尺B蛋白受體(LR)或?qū)诱尺B蛋白受體前體(LRP)。本發(fā)明還涉及一種檢驗(yàn)試劑盒,該試劑盒使用本發(fā)明標(biāo)記蛋白的特異性抗體。本發(fā)明還涉及一種應(yīng)用寡核苷酸的檢驗(yàn)試劑盒,在嚴(yán)謹(jǐn)條件下該寡核苷酸能夠與編碼本發(fā)明的標(biāo)記蛋白的核酸雜交。此外,本發(fā)明還涉及特異于上述標(biāo)記蛋白的抗體或寡核苷酸在本發(fā)明的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及該檢驗(yàn)試劑盒在診斷傳染性海綿狀腦病方面的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1347501SQ00806414
公開日2002年5月1日 申請(qǐng)日期2000年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月21日
發(fā)明者馬賽厄斯·吉斯, 馬克·S·羅杰斯 申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆維特梅迪卡有限公司