專利名稱：Baff受體(bcma),一種免疫調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及BAFF受體，及其阻斷劑在刺激或抑制B細(xì)胞和免疫球蛋白的表達(dá)方面的用途，其中BAFF是一種屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族的β-細(xì)胞活化因子。該受體可用于抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)，還可以用于治療HIV等免疫抑制性疾病。此外，所述受體及其阻斷劑與高血壓及其相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)。另外，該受體的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可用于對下述病癥進(jìn)行基因治療腫瘤、淋巴瘤、自身免疫疾病或與B-細(xì)胞有關(guān)的遺傳性疾病。阻斷劑，例如特異于所述受體的重組變體或抗體也可用于免疫調(diào)節(jié)?？梢栽诿庖咭种菩约膊≈校肂AFF受體作為B-細(xì)胞刺激劑刺激B細(xì)胞的產(chǎn)生，例如用于接受了器官移植(例如骨髓移植)的患者以及癌癥治療康復(fù)期的病人。也可以用BAFF受體作為佐劑或共刺激劑將B細(xì)胞水平提高和/或恢復(fù)至正常水平。BAFF受體的能夠阻斷B細(xì)胞功能的可溶性形式也可用于抑制B-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及TNF家族中的一種新型受體。一種已被鑒定了的新型受體，BAFF-R(或“BCMA”)。
TNF家族由稱為TNF家族配體及TNF家族受體的配體及其特異性受體成對組成(Bazzoni和Beutler，1996)。該家族參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，還可能參與其它非免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)通常是“總開關(guān)”式的調(diào)節(jié)，因而TNF家族的信號傳遞能夠?qū)е乱訲NF為最典型(best typified)的大量后續(xù)事件。TNF能激發(fā)生物發(fā)生對外來入侵的常規(guī)保護(hù)性炎癥反應(yīng)，該炎癥反應(yīng)涉及改變參與細(xì)胞運輸?shù)恼掣椒肿诱故荆a(chǎn)生趨化因子將特異性細(xì)胞驅(qū)動入特定區(qū)室，以及啟動各種效應(yīng)細(xì)胞。因而，這些途徑的調(diào)節(jié)具有臨床意義。
這類TNF家族細(xì)胞因子介導(dǎo)的各種細(xì)胞應(yīng)答必須通過它們與其特異性細(xì)胞受體結(jié)合才能啟動?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定出了至少兩種不同TNF受體，分子量約為55kDa(TNFR1)和75kDa(TNFR2)[Hohman et al.，J.Biol.Chem.26414927-14934(1989)和Brockhaus et al.，PNAS，873127-3131(1990)]。這兩種TNF受體基因具有廣泛多形性。這兩種TNFR共亨細(xì)胞表面受體的典型結(jié)構(gòu)，包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。1型和2型TNFR的胞外部分都包括由4個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CDR)組成的一段重復(fù)氨基酸序列模式。其它幾種細(xì)胞表面蛋白中也存在類似的CDR重復(fù)模式，這些蛋白包括p75神經(jīng)生長因子受體、B-細(xì)胞CD40抗原。
由于受體很容易轉(zhuǎn)化為免疫球蛋白融合蛋白，所以這些蛋白是用來闡明生物途徑的重要工具。這些二聚體型可溶性受體形式能夠很好地抑制分泌型或表面結(jié)合型配體介導(dǎo)的事件。這些受體通過與它們的配體結(jié)合，來阻斷與那些能夠發(fā)送信號的細(xì)胞相關(guān)受體結(jié)合。這些受體-Ig融合蛋白不僅有實驗性應(yīng)用價值，而且它們已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床，例如用TNF-R-Ig結(jié)合OKT3治療炎性腸道疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和急性臨床綜合征(Eason et al.，1996；Feldmann et al.，1996；van Dullemen et al.，1995)?？深A(yù)計對TNF家族受體的信號傳遞介導(dǎo)的多個事件的操縱可廣泛用于治療免疫相關(guān)疾病，而且還可以用來治療多種因免疫系統(tǒng)參與而導(dǎo)致病理性繼發(fā)癥狀的人類疾病。Osteoprotegerin是一種新近公開的受體，其可溶形式能夠阻斷骨質(zhì)量(bone mass)的損失，因此，由TNF家族受體的信號傳遞所調(diào)控的事件不一定限于免疫系統(tǒng)的調(diào)控?？顾鍪荏w的抗體能阻斷配體結(jié)合，因而也有臨床用途。這類抗體通常壽命很長，與那些血液半衰期較短的可溶性受體-Ig融合蛋白相比，具有優(yōu)勢。
盡管對受體介導(dǎo)的途徑進(jìn)行抑制標(biāo)志著將這些受體的治療作用開發(fā)至了最大限度，但是最初顯示出臨床作用的卻是TNF受體的活化(Aggarwal andNatarajan，1996)。TNF受體的活化能啟動靶細(xì)胞的死亡，因而應(yīng)用于腫瘤治療不只是過去就是現(xiàn)在也還是很有誘惑力的(Eggermont et al.，1996)。這些受體的活化可以通過施用配體，即通過自然途徑來完成，另外那些能與受體交聯(lián)的抗體也是強效的激動劑。因為配體在血液中的半衰期通常都很短，而抗體在血液中存在很長的時間因而在腫瘤學(xué)上更有優(yōu)勢。由于這些受體中大部分都可以在腫瘤上更有選擇性地表達(dá)或者它們只傳遞腫瘤細(xì)胞死亡或分化的信號，所以激動劑抗體可以作為治療癌癥的有力武器。類似地，大多數(shù)主動免疫事件是通過TNF家族受體來介導(dǎo)的，例如宿主炎性反應(yīng)、抗體生成等，因此激動性(agonistic)抗體應(yīng)用于其它非腫瘤學(xué)領(lǐng)域也有有益效果。
矛盾的是，對某種途徑的抑制在治療腫瘤方面也有有益效果。例如一些腫瘤表達(dá)Fas配體，這種表達(dá)能導(dǎo)致Fas陽性淋巴細(xì)胞的死亡，從而使腫瘤能逃避免疫系統(tǒng)。那么，這種情況下，抑制Fas系統(tǒng)就使得免疫系統(tǒng)能夠通過其它途徑對腫瘤作出反應(yīng)，現(xiàn)在這種通路已經(jīng)找到(Green and Ware，1997)。
發(fā)明概述申請人已經(jīng)鑒定出了編碼本申請中稱為″BAFF-R″或″BCMA″的多肽的cDNA克隆，該多肽能結(jié)合腫瘤壞死因子BAFF，BAFF是一種屬于腫瘤壞死因子(″TNF″)家族的B細(xì)胞活化因子。BAFF與此前在WO/9912964(在此引入作為參考)中公開的是同一分子。
一個實施方案中，本發(fā)明提供了BAFF-R的應(yīng)用方法。這類方法中包括下述方法使用BAFF-R多肽抑制動物中的B細(xì)胞生長、樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的B生長及成熟或者免疫球蛋白的生成。另外，還包括了下述方法使用BAFF-R多肽刺激動物中的B細(xì)胞生長、樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的B生長及成熟或者免疫球蛋白的生成，或者使用BAFF-R多肽和抗-T抗體、CD40配體或者抗-CD40配體一起來共刺激動物中的B細(xì)胞生長、樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的B生長及成熟或者免疫球蛋白的生成。
另一實施方案中，本發(fā)明提供了使用BAFF-R治療下列疾病的方法自身免疫疾病、高血壓、心血管疾病、腎病、B細(xì)胞淋巴-增生疾病、免疫抑制性疾病、器官移植以及HIV。另外，還包括了使用藥物治療、抑制或改變免疫應(yīng)答的方法，所述免疫應(yīng)答涉及BAFF-R與其配體之間的信號傳送途徑，以及通過施用特異于BAFF-R或其表位的抗體來抑制炎癥的方法。
本發(fā)明所述方法優(yōu)選通過施用治療有效量的BAFF-R多肽、包含與異源氨基酸序列融合之BAFF-R多肽或其片段的嵌合分子或者抗BAFF-R抗體同系物來實現(xiàn)。
一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括BAFF-R多肽和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥用組合物。
另一實施方案中，本發(fā)明提供了包含與異源多肽或氨基酸序列融合之BAFF-R多肽的嵌合分子。這類嵌合分子的一個實例中包括融合到免疫球蛋白Fc區(qū)或一種表位標(biāo)簽序列上的BAFF-R。
另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種能特異性結(jié)合BAFF-R多肽的抗體?？蛇x擇地，所述抗體是一種單克隆抗體。
附圖簡述

圖1給出人BAFF-R(BCMA)cDNA的核酸序列(SEQ ID NO2)及其推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。翻譯的潛在起始位點為第219或228位的核酸殘基；富含半胱氨酸的區(qū)域(CRD)為SEQ ID NO2中的第240-341位核酸殘基(SEQ ID NO1中的第8-41位氨基酸殘基)；潛在的跨膜區(qū)域為SEQID NO2中的第375-459位核酸殘基。
圖2顯示編碼BAFF-R-Fc的質(zhì)粒pJST538的核酸序列(SEQ ID NO4)及其推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO3)，其中第1-69位核酸殘基為小鼠IgG-κ信號序列；第70-222位核酸殘基為BAFF-R(核酸殘基1-153)；第223-906位核酸殘基為人IgG。
圖3給出pJST535的核酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列，該質(zhì)粒編碼全長人BAFF-R。
圖4給出TNF-R55與BAFF-R間的結(jié)構(gòu)比較。
圖5給出平板測定中，用(a)CH269(1.0μg)或(b)pJST535(0.1μg)，一種編碼全長BAFF-R的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，然后用0.5μg/ml flag-hBAFF染色293EBNA細(xì)胞。
圖6(a)顯示293EBNA細(xì)胞用pJST535轉(zhuǎn)染并染色后的FACS覆蓋圖(overlay)無配體(黑色圖)，1μg/ml標(biāo)簽-hCD40L(粉紅色)或flag-hBAFF(綠色)。然后，所有樣品按照實施例2中所述方法，先用抗-標(biāo)簽M2，接著使用驢抗-小鼠IgG染色。
圖6(b)顯示相同實驗的FACS圖譜以及統(tǒng)計學(xué)分析。
染色情況如下(1)未染色，(2)只用7AAD，(3)第2步驟，且只用7AAD，(4)9μg/ml flag-hBAFF，(5)3μg/ml flag-hBAFF，(6)1μg/ml flag-hBAFF，(7)0.33μg/ml flag-hBAFF，(8)0.11μg/ml flag-hBAFF，(9)標(biāo)簽-hCD40L 1μg/ml。
圖7給出按照實施例4中方法用BAFF-R-Fc進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果。分子量以kDa計，標(biāo)示于圖的左側(cè)。
泳道(1)12.5ng flag-hTWEAK，(2)12.5ng flag-hBAFF，(3)用0.5ml經(jīng)BAFF-R-Fc調(diào)整的培養(yǎng)基使flag-hBAFF免疫沉淀的結(jié)果，(4)用0.5ml經(jīng)BAFF-R-Fc調(diào)整的培養(yǎng)基使flag-hTWEAK免疫沉淀的結(jié)果，(5)用0.5ml經(jīng)BAFF-R-Fc調(diào)整的培養(yǎng)基對未加配體的樣品免疫沉淀的結(jié)果，(6)用來自未轉(zhuǎn)染的293EBNA的0.5ml已調(diào)整過的培養(yǎng)基使flag-hBAFF免疫沉淀的結(jié)果，(7)用來自未轉(zhuǎn)染的293EBNA的0.5ml已調(diào)整過的培養(yǎng)基使flag-hTWEAK免疫沉淀的結(jié)果。
圖8給出脾細(xì)胞增生試驗結(jié)果制成的圖，該圖是用每分鐘摻入小鼠脾細(xì)胞的計數(shù)(CPM)相對于人BAFF的加入量(μg/ml)制成的。
圖9是用來分析BAFF對Raji細(xì)胞的結(jié)合的BAFF阻斷試驗的結(jié)果，該圖是用MFI(平均熒光強度)讀數(shù)相對于RhIgG1(ng/ml)的量繪制而成的。
圖10(a)是對接受了h-Ig(中間的方框)或hBCMA-Ig(下面的方框)的BaffTg小鼠以及注射了PBS的野生型同窩對照小鼠(上面的方框)進(jìn)行FACS分析，得到的IgM對CD1的表達(dá)量，具體描述見實施例11。
圖10(b)，在接受了h-Ig(中間方框)或hBCMA-Ig(下面的方框)的BaffTg小鼠以及注射了PBS的野生型同窩對照小鼠(上面的方框)中，通過對IgD陽性細(xì)胞群的門控(gate)而進(jìn)行的FACS分析所得CD21對IgM的表達(dá)，具體描述見實施例11。
圖10(c)，在接受了h-Ig(中間方框)或hBCMA-Ig(下面的方框)的Baff Tg小鼠以及注射了PBS的野生型同窩對照小鼠(上面的方框)中，通過對IgD陰性細(xì)胞群的門控而進(jìn)行的FACS分析所得CD21對IgM的表達(dá)，具體描述見實施例11。
圖11圖示各組Baff Tg小鼠的脾重(計為mg+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
圖12是用PBS、hIg、hBCMA-Ig處理過的Baff Tg小鼠以及同窩對照小鼠的蛋白尿(mg/dL)相對于注射數(shù)目作圖。
圖13圖示Baff Tg小鼠及野生型對照小鼠的均值(average)平均動脈壓(mmHg)。
圖14圖示Baff Tg小鼠及野生型對照小鼠的個體平均動脈壓(mmHg)。
圖15的條形圖表示用BAFF-R-Ig(BCMA-Ig)，HuIgG或PBS處理后出現(xiàn)重度腎炎的SNF1小鼠的百分比。
圖16圖示用20ug BCMA-Ig，50ug BCMA-Ig，HuIgG或PBS體內(nèi)處理后，小鼠體內(nèi)的CD11c+DC細(xì)胞總數(shù)(以百萬計)。測試的CD11c+DC細(xì)胞群是(1)CD8a-CD4-，(2)CD8a+CD4-，以及(3)CD8a CD4+。
發(fā)明詳述I.定義術(shù)語″BAFF-R″和″BCMA″在本發(fā)明中使用時包括BAFF-R天然序列以及BAFF-R變體(其在本文中另有定義)。所述BAFF-R可以從多種來源分離到，例如從鼠或人組織類型或其它來源，或者用重組或合成的方法來制備。
“BAFF-R天然序列”包括具有與源于自然的BAFF-R氨基酸序列相同的多肽。所述BAFF-R天然序列可以從自然中分離，也可以用重組或合成的方法制備。BAFF-R的天然截短或分泌形式(例如含有胞外結(jié)構(gòu)域序列的可溶形式)、天然變體形式(例如，可替換式剪接形式)以及BAFF-R天然等位變體。一個實施方案中，所述BAFF天然序列是指BAFF多肽的成熟或全長天然序列，其中包括SEQ ID NO1中的第1-184位氨基酸或其片段。
“BAFF-R胞外結(jié)構(gòu)域”或“BAFF-R ECD”是指基本上不含BAFF-R的跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的BAFF-R形式。通常，BAFF-R胞外結(jié)構(gòu)域帶有此類跨膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的不足1％，優(yōu)選不足0.5％?？蛇x擇的，BAFF-R ECD包括SEQ ID NO1中的第8-41位，或4-51位，或1-53位氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，BAFF-R ECD包括SEQ IDNO1中的第1-51位氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，已鑒定的本發(fā)明BAFF-R的胞外結(jié)構(gòu)域是依據(jù)本領(lǐng)域用于鑒定疏水結(jié)構(gòu)域類型的標(biāo)準(zhǔn)來鑒定的。胞外結(jié)構(gòu)域的確切邊界可能各不相同，但很可能本說明書具體提到的結(jié)構(gòu)域的任一末端不超過5個氨基酸。因此，BAFF-R ECD可以任選地包括氨基酸8-41(SEQ ID NO1)。
“BAFF-R變體”是指如下定義的活性BAFF-R，其氨基酸序列與SEQ IDNO1所示BAFF-R全長天然序列或者與BAFF-R ECD序列有至少約80％的同一性。所述BAFF-R變體包括，例如，在SEQ ID NO1所示序列C-末端添加或缺失了一個或多個氨基酸殘基而得到的BAFF-R多肽。通常，BAFF-R變體與SEQ ID NO1所示氨基酸序列之間應(yīng)當(dāng)具有至少約80％或85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90％的氨基酸序列同一性，最優(yōu)選約95％的氨基酸序列同一性。
本發(fā)明中鑒定的BAFF-R序列的″氨基酸序列同一性百分比″是指，將候選序列與BAFF-R序列對齊并在必要時引入缺口以便實現(xiàn)最大限度的序列同一性百分比，而且不將任一保守性取代計入序列同一性時，候選序列中與BAFF-R序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基所占的百分比。為測定氨基酸序列同一性百分比而進(jìn)行的對齊可以通過多種途徑來實現(xiàn)，這些途徑都屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范疇之內(nèi)，例如，使用公眾可得到的電腦軟件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定測算對齊時所用的相應(yīng)參數(shù)，包括為實現(xiàn)所比較全長序列最大限度對齊而需要的任一算法。
術(shù)語“表位標(biāo)簽”在本發(fā)明中出現(xiàn)時是指一嵌合多肽，其中包括融合到一“標(biāo)簽多肽”上的BAFF-R或其結(jié)構(gòu)域序列。所述標(biāo)簽多肽必須有提供一表位所需的足夠殘基，從而可以保證能夠制備到抗該表位的抗體，或者使該表位可被其它一些試劑鑒定，而且該表位必須足夠的短從而保證其不會干擾BAFF-R的活性。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽多肽還應(yīng)當(dāng)是獨一無二的，從而確保其抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。通常，合適的標(biāo)簽多肽有至少6個氨基酸殘基，并且通常為約8～約50個氨基酸殘基(優(yōu)選地，約10～約20個殘基)。
描述本發(fā)明所述各種多肽時使用的″分離的″是指從其所在天然環(huán)境一成分中分離并已經(jīng)得到鑒定的多肽。其天然環(huán)境中的污染成分是指通常不會干擾所述多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可以包括酶、激素、以及其它蛋白性質(zhì)的或非蛋白性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，將所述多肽純化至下述程度(1)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀測得N-末端或內(nèi)部序列的至少15個氨基酸，或者(2)在非還原或還原條件下，使用考馬氏藍(lán)或優(yōu)選銀染可得到均一的SDSPAGE結(jié)果。必須分離的多肽包括位于重組細(xì)胞內(nèi)原位處的多肽，因為BAFF-R天然環(huán)境中的至少一個成分不存在了。但是，分離的多肽通常經(jīng)過至少一個純化步驟制備而成。
術(shù)語″抗體″取其最廣泛的含義，具體包括單一的BAFF-R單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑、以及中和抗體)以及具有多表位特異性的抗BAFF-R抗體組合物。本發(fā)明中使用的“單克隆抗體”指從一組基本上均一的抗體中得到的抗體，即除了可能存在極少量天然發(fā)生的突變外，抗體個體之間是完全相同的。
本發(fā)明中，多肽的“純化制品”或“基本上純化的制品”是指該多肽已經(jīng)從天然狀態(tài)下與其一起出現(xiàn)的其它蛋白、脂類及核酸中分離出來。優(yōu)選地，所述多肽還可分離自其它物質(zhì)，例如用來純化該多肽時使用的抗體、介質(zhì)等。
本發(fā)明使用的“進(jìn)行處理”“處理”以及“治療”是指治愈性治療、預(yù)防性治療、以及防止性治療。
術(shù)語“肽”、“蛋白”以及“多肽”在本發(fā)明中交互使用。
本發(fā)明使用的“生物活性”是指具有可直接或間接實施的體內(nèi)或體外活性。BAFF-R的生物活性片段與該受體的活性位點之間具有，例如，70％的氨基酸同源性，更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％的同源性。受體的同一性或同源性在本發(fā)明中是指候選序列中與SEQ ID NO1所示BAFF-R殘基相同的氨基酸殘基所占的百分比，或者與SEQ ID NO1中指定部分的殘基相同的氨基酸殘基所占的百分比。
本發(fā)明中使用的″哺乳動物″是指分類學(xué)上屬于哺乳動物的任一動物，包括，人、母牛、馬、狗、鼠、以及貓。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述哺乳動物是人。
如非特別說明，本發(fā)明使用的是細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA以及免疫學(xué)中的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都屬于本技術(shù)領(lǐng)域范疇之內(nèi)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中已有描述。
現(xiàn)在對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案做詳細(xì)的參考。本發(fā)明涉及使用BAFF-R和BAFF-R相關(guān)分子影響B(tài)-細(xì)胞的生長和成熟以及免疫球蛋白的分泌。本發(fā)明涉及使用BAFF-R和BAFF-R相關(guān)分子影響免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，應(yīng)免疫相關(guān)疾病的需要。另外，本發(fā)明還包括用BAFF-R或BAFF-R相關(guān)基因通過基因療法治療癌癥和免疫疾病。
用本發(fā)明所述序列轉(zhuǎn)化宿主制備的BAFF-R及其同系物，以及用本領(lǐng)域已知方法純化到的天然BAFF-R，或者是從已知氨基酸序列制備的BAFF-R，都可以用到抗癌、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的方法中。它們也可以用于針對其它疾病的治療及方法中。
本發(fā)明另一方面涉及將編碼BAFF-R的分離的核酸編碼的多肽用于″反義″治療。本發(fā)明中使用的“反義”治療是指施用或在原位生成寡核苷酸或其衍生物，這些寡核苷酸或其衍生物能夠在細(xì)胞環(huán)境中與編碼目的配體的細(xì)胞mRNA和/或DNA發(fā)生特異性地雜交，從而抑制所述編碼蛋白的表達(dá)，即抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。所述結(jié)合可以通過常規(guī)的堿基對互補，或者，例如，在與DNA雙螺旋結(jié)合的情況下，通過與雙螺旋的大溝間的特異性相互作用實現(xiàn)結(jié)合。通常，“反義”治療是指本領(lǐng)域通常使用的一系列技術(shù)，包括以與寡核苷酸序列特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的任一治療方法。
本發(fā)明所述反義構(gòu)建體可以表達(dá)質(zhì)粒的形式來遞送，當(dāng)它在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時，生成的RNA與編碼BAFF-配體的細(xì)胞mRNA的至少一部分互補。可替代地，所述反義構(gòu)建體可以是離體制備的寡核苷酸探針。所述寡核苷酸探針優(yōu)選是經(jīng)過修飾對內(nèi)源性核酸酶有抗性的寡核苷酸，因而在體內(nèi)是穩(wěn)定的。用作反義寡核苷酸的核酸分子的實例有DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯及甲基膦酸酯類似物(參見，例如5,176,996；5,264,564；and5,256,775)。另外，用來構(gòu)建反義治療所用寡聚體的常規(guī)方法已經(jīng)在下列文獻(xiàn)中綜述，例如Van Der Krol et al.，(1988)Biotechniques 6958-976；以及Stein et al.(1988)Cancer Res 482659-2668，在此專門引入作為參考。
如上所述，本發(fā)明的BAFF-R是TNF受體家族的一個成員。其蛋白，片段或同系物可能具有廣泛的治療及診斷用途。
本發(fā)明所述多肽與已在WO99/12964(在此引入作為參考)公開的多肽BAFF特異性地相互作用。但是，本發(fā)明中公開的肽和方法可以用來鑒定可特異性地與BAFF-R或其片段相互作用的分子。
本發(fā)明特定實施方案中包括使用那些衍生自BAFF-R并能結(jié)合BAFF的肽的方法。BAFF-R的片段的制備方法有好幾種，例如，重組、PCR、蛋白酶消化或者化學(xué)合成。多肽的內(nèi)部或末端片段可以通過從編碼該多肽的核酸的一端或兩端除去1個或多個核苷酸制備而成。誘變后DNA的表達(dá)可產(chǎn)生多肽片段。
也可以用本領(lǐng)域的已知技術(shù)制備本發(fā)明所用的嵌合分子。本發(fā)明考慮了以下嵌合分子的用途，所述嵌合分子包括與異源氨基酸序列，例如免疫球蛋白的IgG Fc區(qū)融合的BAFF-R多肽(或其變體)。優(yōu)選地，所述嵌合分子是可溶性的并包括一可溶性的BAFF-R多肽。
多肽片段也可以用本領(lǐng)域的已知技術(shù)化學(xué)合成，例如常規(guī)的Merrifield固相f-moc或t-boc化學(xué)合成法。例如，可以任意地將本發(fā)明的肽和DNA序列分成具有所需長度并且不重疊的片段，或者是分成具有所需長度的重疊片段。下文將對這些方法詳細(xì)描述。
制備可溶性的BAFF-R可溶性的BAFF-R通常能夠有效地發(fā)送信號，因而可以作為模擬天然膜形式的藥物來施用。本發(fā)明所述BAFF-R有可能以可溶性細(xì)胞因子的形式被天然分泌，但是，如果不能天然分泌，那么也可以重構(gòu)基因以便強制分泌。為了制備BAFF-R的可溶性分泌形式，可在DNA水平上除去N-末端跨膜區(qū)域，以及莖干區(qū)域的某些部分，并且用I型或者II型前導(dǎo)序列來取代它們，這些前導(dǎo)序列在所選表達(dá)系統(tǒng)中可允許有效蛋白水解。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變分泌型表達(dá)構(gòu)建體中保留的莖干區(qū)域的數(shù)量，從而使配體結(jié)合特性及分泌效率達(dá)到最優(yōu)化。例如，可以制備到含有全部可能莖干長度的構(gòu)建體，即N-末端截短形式，從而得到第1-51位氨基酸的蛋白質(zhì)?？蓮倪@類分析中得到具有最佳長度的莖干序列。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可溶性的BAFF-R多肽是一分離的天然序列的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1中的第1-51位氨基酸殘基，或其片段；一分離的BAFF-R多肽，其與含有SEQ ID NO1中第1-51位氨基酸或其片段的BAFF-R多肽天然序列之間具有至少80％(更優(yōu)選90％)的氨基酸序列同一性；或者，其中含有SEQ ID NO1中第8-41位氨基酸殘基的分離的BAFF-R多肽，或該多肽的片段。
制備能與BAFF-R反應(yīng)的抗體本發(fā)明還包括能與本發(fā)明請求保護(hù)的BAFF-R或其共受體特異性反應(yīng)的抗體?？?蛋白/抗-肽的抗血清或單克隆抗體可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(參見，例如，AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow和Lane編著(Cold SpringHarbor Press1988))制備?？梢杂盟鲭牡拿庖咴孕问矫庖卟溉閯游?，例如小鼠、倉鼠或兔子。賦予蛋白或肽免疫原性的技術(shù)包括將其偶聯(lián)到載體上，以及本領(lǐng)域熟知的其它技術(shù)。
可以將BAFF-R或其共受體的免疫原性部分結(jié)合佐劑施用。免疫進(jìn)程可以通過檢測血漿或血清中抗體滴度來監(jiān)測?？梢杂盟雒庖咴鳛榭乖ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它免疫測定方法來測定抗體的水平。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體具有針對BAFF-R或其共受體的抗原決定簇，例如SEQ ID NO1所示多肽的抗原決定簇，或密切相關(guān)的人或非人哺乳動物同系物(例如，70、80、或90％同源性，更優(yōu)選至少95％同源性)的免疫特異性。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，抗-BAFF-R抗體或抗-BAFF-共受體抗體與具有下述特征的蛋白質(zhì)基本上不發(fā)生交叉反應(yīng)(即，為特異性反應(yīng))，即與SEQ ID NO1之間同源性小于80％的蛋白質(zhì)，優(yōu)選同源性小于90％的蛋白質(zhì)，最優(yōu)選同源性小于95％的蛋白質(zhì)?！寤旧喜话l(fā)生交叉反應(yīng)″是指，抗體與非同源性蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力，以及該抗體與SEQ ID NO1所示蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力，這二者相比，前者為后者的不足10％，更優(yōu)選不足5％，甚至更優(yōu)選不足1％。
本文中術(shù)語抗體包括該抗體的能與BAFF-R或其受體特異性反應(yīng)的片段?？梢杂贸Ｒ?guī)技術(shù)將抗體片段化，用與上述用于完整抗體的同樣方法來篩選可用的片段。例如，用胃蛋白酶處理抗體得到F(ab’)2片段。所述F(ab’)2片段經(jīng)還原二硫鍵生成Fab′片段。本發(fā)明所述抗體還包括具有抗-BAFF-R或抗-BAFF-共受體活性的生物特異性分子及嵌合分子。因此，針對BAFF-R及其共受體的單克隆抗體及多克隆抗體(Ab)，以及抗體片段，如Fab′及F(ab′)2，都可以用來封閉BAFF-R與其相應(yīng)共受體的作用。
也可以用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備各種形式的抗體。(Winter and Milstein，Nature 349293-299(1991)在此專門引入作為參考)例如，將動物抗體的抗原結(jié)合區(qū)連接到人源抗體的恒定區(qū)構(gòu)建出嵌合抗體(例如，Cabilly等，U.S.4,816,567，在此引入作為參考)。嵌合抗體可以減弱動物抗體用于人的臨床治療時激發(fā)的免疫原性應(yīng)答。
此外，還可以合成出能識別BAFF-R或共受體的重組“人源化抗體”。人源化抗體是主要含有人IgG序列但其中已插入負(fù)責(zé)特異性抗原結(jié)合的區(qū)的嵌合體。用目的抗原免疫動物，分離相應(yīng)抗體，取出負(fù)責(zé)特異性抗原結(jié)合的可變區(qū)序列。然后，將動物源的抗原結(jié)合區(qū)克隆入已經(jīng)刪除了抗原結(jié)合區(qū)的人抗體基因的相應(yīng)位置。人源化抗體可以將人抗體中異源(即，種間)序列的使用降至最低，因而不太可能會在所治療受試者中激發(fā)免疫應(yīng)答。
通過制備含有可變區(qū)以及從不同類的免疫球蛋白分離出的人恒定區(qū)(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗體，可以構(gòu)建出不同類的重組抗體。例如，通過將抗原結(jié)合位點克隆入帶有人鏈恒定區(qū)的載體，可以重組產(chǎn)生具有增加的抗原結(jié)合價的抗體。(Arulanandam et al.，J.Exp.Med.，1771439-1450(1993)，在此引入作為參考。)此外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)改變抗原結(jié)合位點鄰近區(qū)的氨基酸殘基，從而改變重組抗體與其對應(yīng)抗原的結(jié)合親和力。通過基于分子模型的誘變，可以提高人源化抗體的抗原結(jié)合親和力。(Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.8610029-33(1989)在此引入作為參考。
制備同系物制備改變后的DNA及肽序列BAFF-R同系物在氨基酸序列上，或其它不涉及序列的方面，或者二者同時不同于天然生成的BAFF-R。非序列修飾包括BAFF-R的體內(nèi)或體外化學(xué)衍生。非序列修飾包括，但不限于，乙?；?、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化的改變。
優(yōu)選的同系物包括BAFF-R的生物活性片段，其序列與SEQ ID NO1所示序列之間的區(qū)別在于1個或多個保守的氨基酸取代，或者1個或多個非保守的但不會破壞BAFF-配體活性的氨基酸取代、缺失或插入。保守取代一般包括一個氨基酸被另一個具有相似特性的氨基酸取代，例如，下列各組內(nèi)部的取代纈氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。
用途BAFF-R的全長基因(SEQ ID NO2)或其片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，分離出與SEQ ID NO2中所示BAFF-R序列之間具有期望的序列同一性的其它基因。編碼BAFF-R的核酸序列還可以用來構(gòu)建下列用途的雜交探針，即用于對編碼BAFF-R基因進(jìn)行做圖的探針和用來對患有遺傳疾病的個體進(jìn)行基因分析的探針?？梢栽O(shè)計篩選試驗，找出模擬BAFF-R生物活性的先導(dǎo)化合物。這類篩選試驗包括能夠保證化學(xué)文庫高輸出量篩選的試驗，從而使其特別適合用于鑒定小分子藥物侯選物。在考慮范圍之內(nèi)的小分子包括合成的有機化合物或無機化合物。編碼BAFF-R或其修飾形式的核酸還可以用來制備轉(zhuǎn)基因動物或者“基因敲除”動物，這些動物可用于開發(fā)及篩選具有治療價值的試劑。
如本發(fā)明所述，在本發(fā)明一個實施方案中，提供用BAFF-R多肽刺激動物體內(nèi)B-細(xì)胞生長，樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的B-細(xì)胞的生長及成熟或免疫球蛋白的生成的方法，或者是用BAFF-R多肽與抗-T抗體、CD40配體或抗-CD40配體一起共刺激動物體內(nèi)B-細(xì)胞生長，樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的B-細(xì)胞的生長及成熟或免疫球蛋白的生成的方法。另外，還包括用BAFF-R多肽抑制動物體內(nèi)B-細(xì)胞生長，樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的B-細(xì)胞的生長及成熟或免疫球蛋白的生成的方法。
另一實施方案中，本發(fā)明提供了使用BAFF-R治療下列病癥的方法自身免疫疾病、高血壓、心血管病、腎臟疾病、B-細(xì)胞淋巴增生疾病、免疫抑制性疾病、器官移植、炎癥、以及HIV。另外還包括了使用藥劑治療、抑制或改變涉及BAFF-R與其配體間信號傳輸途徑的免疫應(yīng)答。
一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括BAFF-R多肽和一種藥物上可接受的賦形劑的藥用組合物。與BAFF-R多肽適配的載體及其制劑在Oslo等編著的Remington′Pharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack PublishingCo.一書中有描述。通常情況下，制劑中使用適量的藥物學(xué)上可接受的鹽來提供該制劑的等滲性。所述載體的實例包括緩沖溶液，例如鹽水、Ringer′s溶液及葡萄糖溶液。溶液的pH值優(yōu)選約pH5～約pH8，更優(yōu)選約pH7.4～約pH7.8。其它載體包括緩釋制劑，例如固相疏水聚合物的半透基質(zhì)，該基質(zhì)制成一定形式的成型物件，例如脂質(zhì)體、膜或微粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可以根據(jù)施用途徑及所施用BAFF-R多肽的濃度對特定載體進(jìn)一步地優(yōu)化。
施用可以通過注射(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi))或通過輸注等其它方法來完成，以確保能以有效的形式輸送到血流中。
除另有說明外，實施本發(fā)明采用的為細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、蛋白質(zhì)化學(xué)以及免疫學(xué)中的常規(guī)技術(shù)，這些都是本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中已有描述。參見，例如，分子克隆實驗指南，第2版.(Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，編著)，冷泉港實驗室出版，1989；DNA克隆，第I及II卷(D.N.Glover，編著)，1985；寡核苷酸合成，(M.J.Gait，編著)，1984；美國專利US4,683,195(Mullis等)；核酸雜交(B.D.Hames和S.J.Higgins，編著)，1984；轉(zhuǎn)錄和翻譯(B.D.Hames和S.J.Higgins，編著)，1984；動物細(xì)胞培養(yǎng)(R.I.Freshney，編著).Alan R.Liss，Inc.，1987；Immobilized Cells and Enzymes，IRL Press，1986；A PracticalGuide to Molecular Cloning(B.Perbal)，1984；Methods in Enzymology，第154及155卷(Wu et al.，編著)，Academic Press，New York；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos，編著)，1987，Cold SpringHarbor Laboratory；Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Mayer and Walker，編著)，Academic Press，London，1987；Handbookof Experiment Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編著)，1986；Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986。
下列實施例的提供是為了舉例說明本發(fā)明，而決不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1用平板試驗來檢測BAFF與BAFF-R的結(jié)合該實施例中描述用平板試驗測定BAFF與BAFF-R轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。
使用SuperscriptII預(yù)擴(kuò)增試劑盒(Life Technologies)從BJAB polyA+RNA中制備出全長的人BAFF-R，從而得到cDNA模板，并采用與BAFF-R5′及3′端編碼序列互補的引物，用Pful進(jìn)行擴(kuò)增。將得到的PCR產(chǎn)物克隆入CH269，CH269衍生自pCEP4(Invitrogen)。得到的克隆命名為pJST535。將含有EBNA-1基因的人胚胎腎細(xì)胞(293EBNA)接種入已用纖連蛋白包被過的6孔培養(yǎng)板中，然后，用不同濃度的pJST535以及作為背景對照的CH269通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)(Life Technologies)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，測試轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合可溶性flag-hBAFF(氨基酸L83-L285)的能力，操作如下。所有保溫均在室溫下進(jìn)行。吸出孔中用過的培養(yǎng)基，細(xì)胞用BHA緩沖液(20mM HEPES pH7.0，0.5mg/ml BSA，0.1％NaN3)洗滌，與0.5μg/ml FLAG-hBAFF的PBS溶液一起保溫，該PBS中含有1mMMgCl2、1mM CaCl2及0.1％NaN3。保溫1小時后，移去BAFF溶液，并用BHA洗滌細(xì)胞。然后將所述細(xì)胞在含有1μg/ml抗-FLAG單克隆抗體M2(Sigma)的PBS溶液中再保溫30分鐘。吸出該溶液，用BHA洗滌細(xì)胞。然后用1∶3000稀釋后的堿性磷酸酶偶聯(lián)型山羊抗-小鼠IgG F(ab)′2(JacksonImmunoResearch)保溫30分鐘。吸出該溶液，用BHA洗滌細(xì)胞。為了減少內(nèi)源性堿性磷酸酶引起的背景染色量，使細(xì)胞在含有2.5mM左旋咪唑(levamisol)(Vector Laboratories)的100mM NaCl、100mM Tris-Cl pH9.5及5mM MgCl2的溶液中保溫15分鐘。為了檢測堿性磷酸酶的產(chǎn)色反應(yīng)，吸去該抑制劑溶液，用含固紅及萘酚磷酸酯(Pierce)的溶液保溫。觀察染色，在低倍顯微鏡下照相。
所有用BAFF-R表達(dá)質(zhì)粒pJST535轉(zhuǎn)染過的孔都觀察到了固紅染料的沉積。滴定信號的頻率隨轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒量的減少而降低。用對照表達(dá)質(zhì)粒CH269轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞未見染色。另外，當(dāng)染色操作中不使用flag-hBAFF時，或者是用TNF家族成員另一配體，F(xiàn)LAG-標(biāo)記的LIGHT，代替flag-hBAFF也未見染色出現(xiàn)。因此，可見BAFF對BAFF-R轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的染色是特異性的。
實施例2用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)測定BAFF與BAFF-R轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合該實施例描述了用FACS測定試驗檢測BAFF與BAFF-R轉(zhuǎn)染細(xì)胞間的結(jié)合。
用FuGene6(Boehringer Mannheim)將編碼全長BAFF-R的質(zhì)粒pJST535轉(zhuǎn)染入293EBNA細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后第24小時或48小時，用含5mM EDTA的PBS從平板中取出細(xì)胞并計數(shù)。用FACS緩沖液(PBS，其中含有10％胎牛血清、0.1％NaN3和10μg/ml hIgG(Jackson ImmunoResearch)洗滌細(xì)胞，然后取2.5×105個細(xì)胞，用按9μg/ml～0.037μg/ml濃度稀釋入FACS緩沖液的flag-hBAFF，在冰上保溫1小時。用FACS緩沖液洗滌上述細(xì)胞，接著將細(xì)胞置于冰上，用5μg/ml的抗-FLAG單克隆抗體M2保溫30分鐘。用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞，接著將細(xì)胞置于冰上，用含有1∶100稀釋的R-藻紅蛋白偶聯(lián)型F(ab′)2驢抗-小鼠IgG及10μg/ml 7-AAD的溶液保溫30分鐘。細(xì)胞用FACS緩沖液洗滌后，重懸于含1％多聚甲醛的FACS緩沖液中。對選通除去了7-AAD陽性(死)細(xì)胞的部分進(jìn)行FACS測定。
FACS測定結(jié)果表明BAFF-R轉(zhuǎn)染細(xì)胞的級分能結(jié)合BAFF。BAFF的濃度為9μg/ml時，約28％的細(xì)胞結(jié)合BAFF的平均熒光強度(MFI)為366。當(dāng)單獨使用PE-標(biāo)記的驢抗-小鼠試劑時，未見明顯的細(xì)胞轉(zhuǎn)變(shift)。所有細(xì)胞的MFI平均值為5.5，其中只有1.3％的細(xì)胞的MFI為23.5。BAFF-R轉(zhuǎn)染細(xì)胞上的信號隨著BAFF用量的減少而降低。BAFF為100ng/ml時，8.76％的細(xì)胞的MFI為78.9。
實施例3引入GFP標(biāo)記后，用FACS測定BAFF/BAFF-R間的相互作用該實施例中，描述了用BAFF-R和GFP報道質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與BAFF的結(jié)合情況。
按照實施例2所述方法，用pJST535和GFP報道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293EBNA細(xì)胞。該報道質(zhì)粒可編碼一種膜錨定的GFP分子。用這兩種質(zhì)粒共在轉(zhuǎn)染，然后我們分析了能結(jié)合BAFF的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的百分比。從平板中取出細(xì)胞，與BAFF結(jié)合，然后用實施例2所述方法檢測。同樣，為了將死細(xì)胞排除在外，引入7-AAD。用FACS分析樣品，并繪制曲線。右上方象限代表那些結(jié)合了BAFF(藻紅蛋白陽性)并表達(dá)有GFP的細(xì)胞。
盡管并非所有GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞都能結(jié)合BAFF，但是與對照相比，位于右上方象限中的細(xì)胞比例明顯較大。相對于8％，33％的轉(zhuǎn)染細(xì)胞位于右上方象限。這可能是由于，BAFF-R表達(dá)的特定水平是BAFF與細(xì)胞結(jié)合所必須的。還可能是，共受體是高親和力相互作用的必要條件，且該受體限于293EBNA細(xì)胞上。
實施例4用BAFF-R-Fc融合體免疫沉淀flag-hBAFF該實施例描述了flag-hBAFF與BAFF-R-Fc間的特異性相互作用，BAFF-R-Fc是將BAFF-R中富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)與人IgGI的Fc區(qū)融合組成的一種分子。
用RT-PCR從實施例1所述BJAB polyA+RNA中制備BAFF-R的CRD，采用與hBAFF-R編碼序列中第132-152位核苷酸互補的寡核苷酸作為3′端引物。將擴(kuò)增到的PCR片段克隆入CH269，讓其位于鼠IgG-κ信號序列的下游以及人IgG Fc單元的上游。該構(gòu)建體命名為pJST538。構(gòu)建體pJST538或CH269用脂質(zhì)胺轉(zhuǎn)染至293EBNA。轉(zhuǎn)染后20小時，收獲用過的培養(yǎng)基及細(xì)胞提取物。用20mM Tris pH7.5/50mM Nacl/0.5％NP40/0.5％脫氧膽酸溶解細(xì)胞，離心出碎片。取一份用過的培養(yǎng)基及細(xì)胞提取物與等體積2xSDS還原緩沖液合并，煮沸，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western轉(zhuǎn)移。為了確證表達(dá)，用溶有5％脫脂奶粉的TBST對小鼠抗-人IgG偶聯(lián)的辣根過氧化物酶(HRP)做1∶3000稀釋后，用其作為探針與上述膜在室溫下雜交30分鐘，然后用TBST洗滌。用ECL(Amersham)使印跡膜顯色，在膠片上曝光。
用25ng flag-hBAFF或flag-hTWEAK與0.5ml從轉(zhuǎn)染了pJST538 orCH269的293EBNA培養(yǎng)物中取出的用過的培養(yǎng)基，在4℃下攪拌保溫1小時，然后加入30ul蛋白A-Sepharose(Pharmacia)，繼續(xù)攪拌過夜。蛋白A-sepharose珠粒用PBS洗滌2次，然后重懸于2xSDS還原性樣品緩沖液中。SDS-PAGE電泳及western轉(zhuǎn)移后，將印跡膜用含有5μg/ml抗-flag單克隆抗體M2(Sigma)及5％脫脂奶粉的TBST在室溫下保溫1小時。印跡膜用TBST洗滌，然后用以1∶3000稀釋于含5％脫脂奶粉的TBST中的山羊抗-小鼠IgG HRP偶聯(lián)物(Jackson Immunoresearch)室溫下保溫30分鐘。用ECL(Amersham)使印跡膜顯色，在膠片上曝光。
用pJST538轉(zhuǎn)染293EBNA細(xì)胞時，用小鼠抗-人IgG(JacksonImmunoresearch)經(jīng)Western印跡分析在細(xì)胞提取物和用過的培養(yǎng)基中均檢測到了約43kDa蛋白質(zhì)的表達(dá)，這表明BAFF-R-Fc融合體得到了有效的表達(dá)和分泌。
免疫沉淀中，只是在BAFF-R-Fc與flag-hBAFF保溫時出現(xiàn)了一條帶。該條帶與直接加樣的flag-hBAFF共-遷移。其它條帶無一出現(xiàn)信號，表明BAFF-R-Fc與flag-hBAFF之間的相互作用是特異性的。
實施例5制備可溶性受體形式為了形成可用于人的受體抑制劑，應(yīng)當(dāng)獲得人受體胞外區(qū)cDNA序列。如果小鼠形式是已知的，那么就可以用小鼠cDNA序列篩選人cDNA文庫，這類操作在該領(lǐng)域中是常規(guī)的。對于人cDNA序列而言，可以設(shè)計出PCR用的寡核苷酸引物來擴(kuò)增出不帶有跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的受體胞外區(qū)。一般情況下，應(yīng)當(dāng)將連接″TNF結(jié)構(gòu)域″和跨膜區(qū)的最后一個二硫鍵之間的大部分氨基酸也包括在內(nèi)。可以對其中包括的“莖干”區(qū)的數(shù)量進(jìn)行調(diào)整從而使得到的可溶性受體的效力最佳。該擴(kuò)增部分中還應(yīng)當(dāng)構(gòu)建有合適的限制性位點，從而能確保其可克隆入各種C-末端Ig融合嵌合載體。替代地，可在3′末端插入終止信號并制備出一可溶形式的受體而不必要借助使用Ig融合嵌合體的方法。得到的載體可在生物技術(shù)學(xué)用到的大多數(shù)系統(tǒng)中表達(dá)，包括酵母、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞以及所有表達(dá)類型中的現(xiàn)有實例。可以連接各種人源Fc區(qū)從而根據(jù)需要優(yōu)化或消除FcR與補體間的相互作用。替代地，可以使用這些Fc區(qū)的突變形式來選擇性地除去FcR或補體相互作用，或者將N-連接糖連接到Fc區(qū)，這種方式具有特定的優(yōu)勢。
實施例6制備激動抗體或拮抗抗體可用上述可溶性的受體免疫小鼠，用常規(guī)方法制備出單克隆抗體。用ELISA方法鑒定而得到的mAb在各種體外細(xì)胞測定中可以進(jìn)一步作為可溶性抗體或者被固定在可塑性物質(zhì)上的抗體，進(jìn)行激動劑活性的篩選。通常HT29細(xì)胞系的死亡是一種使用便捷的系統(tǒng)，該系統(tǒng)對經(jīng)由眾多TNF受體的信號傳送敏感。如果該細(xì)胞系不具有目標(biāo)受體，可將全長受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HT29細(xì)胞系，從而允許開展細(xì)胞毒性測定。替代地，這類細(xì)胞可以用于細(xì)胞敏感(Cytosensor)裝置，來評定受體的活化是否能激發(fā)pH改變，所述pH改變可指示一個信號傳送事件。TNF家族受體在這類模式中可以有效發(fā)送信號，該方法不需知道該受體所激發(fā)的確切生物學(xué)事件。激動性的mAb可以人源化后用于臨床。這種方法還可以用來限定拮抗性的mAb。這類mAb可以定義為缺乏激動劑活性，以及在用ELISA、經(jīng)典結(jié)合或BIAcore技術(shù)監(jiān)測時抑制受體-配體間相互作用的能力。最后，通過各種細(xì)胞應(yīng)答激動劑抗體而誘導(dǎo)趨化因子的分泌，這種誘導(dǎo)可以形成篩選試驗。
實施例7受體-配體相互作用的抑制劑的篩選使用受體-Ig融合蛋白，可以從組合支庫中篩選出能夠直接結(jié)合該受體的分子。然后可以使用受體-Ig融合蛋白和一種能抑制受體-配體間相互作用的可溶性配體，用ELISA模式的試驗來對上述這些分子進(jìn)行測試。該ELISA可以直接用于從各種天然產(chǎn)物文庫等來源中篩選抑制活性化合物。可以將所述受體轉(zhuǎn)染入HT29等細(xì)胞系形成一種生物測試(本例中為細(xì)胞毒性)，然后可將其用作篩選試驗。
實施例8BAFF-R-IgG導(dǎo)致正常小鼠體內(nèi)B細(xì)胞數(shù)目的減少8周齡的雌性BALB/c小鼠購自Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)。第-8、-5、-1和+2天，在小鼠(每3個一組)腹膜內(nèi)注入PBS，400μg人BAFF-R-huIgGI(hBAFF-R-Ig)融合蛋白(Teresa Cachero，Biogen提供)，或者400μg純化后的人IgG(HuIgG)(Sandoz，Basel，Switzerland)。第0天時，小鼠接受了100μl 10％綿羊紅細(xì)胞(SRBC)(Colorado Serum Company，Denver，CO)。
宰殺時，通過心臟穿刺將血液收集入含有EDT的試管，用低滲緩沖液溶解紅細(xì)胞。不加EDTA而收集血液用于血清制備。從脾和腸系膜淋巴結(jié)(MLN)制備單細(xì)胞懸液，用低滲緩沖液溶解紅細(xì)胞。使用PE-偶聯(lián)的抗-CD45R/B220、抗-多配體聚糖/CD138和抗-B7.2，以及FITC-偶聯(lián)的抗-IgM及抗-CD45R/B220，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。所有單抗均購自Pharmingen(SanDiego，CA)。
簡而言之，在冰上，用10μg/ml Fc Block(Pharmingen)封閉Fc受體15分鐘，接著加入PE-和FITC-偶聯(lián)的mAb，在冰上保溫20-30分鐘。用1x洗滌細(xì)胞，并懸浮于0.5％多聚甲醛中。在FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(BectonDickinson，San Jose，CA)上獲取細(xì)胞熒光數(shù)據(jù)，并用CELLQuestTM軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行分析。
用hBAFF-R-Ig處理后，所測試的外周血和外周淋巴器官中B細(xì)胞數(shù)目減少了約50％。在PBS處理過和HuIgG-處理過的小鼠中，B220高IgM低B細(xì)胞分別占細(xì)胞總數(shù)的23.4％和21.5％，而hBAFF-R-Ig-處理過的小鼠中，這一細(xì)胞類群所占細(xì)胞的比例僅為9.9％。PBS處理過的小鼠以及HuIgG-處理過的小鼠的血液中，漿細(xì)胞(多配體聚糖/CD138+)僅分別輕微減少5.7％和4.8％，與之相比，hBAFF-R-Ig-處理過的小鼠減少了3.9％。PBS處理過和HuIgG-處理過的小鼠中，B220+細(xì)胞上的B7.2分子分別上調(diào)了3.1％和4.5％，與之相比，hBAFF-R-Ig處理過的小鼠上調(diào)比例為1.9％。
hBAFF-R-Ig處理過的小鼠的脾內(nèi)，B220高B細(xì)胞顯著減少，表現(xiàn)為18.8％，與之相比，PBS-和HuIgG-處理過的小鼠分別為36.7％和40％。IgM高和IgM低的細(xì)胞亞群中也觀察到了這種下降趨勢(見表8A)。脾內(nèi)新生成B細(xì)胞隔室，B220低IgM高(數(shù)據(jù)未顯示)中未見變化。PBS-處理過的和HuIgG-處理過的小鼠的脾內(nèi)，漿細(xì)胞(多配體聚糖/CD138+)減少的比例分別為3.3％和3.4％，與之相比，hBAFF-R-Ig處理過的小鼠中的比例為2.4％。
hBAFF-R-Ig處理過的小鼠的MLN中B220+B細(xì)胞減少14.1％，與之相比，PBS-處理過的以及HuIgG-處理過的小鼠分別為26.7％和35.8％。數(shù)據(jù)總結(jié)于8A。
表8A.hBAFF-R-Ig、PBS以及HuIgG-處理過的小鼠中的B細(xì)胞類群1
1材料和方法部分中描述了對小鼠的處理，數(shù)據(jù)以％±標(biāo)準(zhǔn)差表示
hBAFF-R-Ig處理過的小鼠在用SRBC免疫后，血液中B7.2+B細(xì)胞以及血液和脾內(nèi)的漿細(xì)胞的百分比降低，這表明對B細(xì)胞活化和/或成熟存在抑制，且大大增強了活化B細(xì)胞的清除。極小百分比的抗原特異性B細(xì)胞被活化，并可應(yīng)答任一抗原，本例中為SRBC。因為hBAFF-R-Ig處理導(dǎo)致所檢測的全部組織中B細(xì)胞百分比都明顯減少，達(dá)50％，所以hBAFF-R-Ig活性可能還靶向靜息的成熟B細(xì)胞。
因此，可以將BAFF-R融合蛋白用作治療藥物臨床用于B細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。所述疾病包括那些天然狀態(tài)下自身免疫的疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、自身免疫溶血性貧血、特發(fā)的血小板減少性紫癜、抗磷脂(antiphospholipid)綜合征、恰加斯病(Chaga’s disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、韋格納(Wegener’s)肉芽腫病、結(jié)節(jié)性多動脈炎和急進(jìn)性腎小球腎炎。所述治療藥劑還可以用于漿細(xì)胞疾病，例如多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫(Waldenstrom’s)巨球蛋白血癥、重鏈病(Heavey-chaindisease)、原發(fā)性或免疫細(xì)胞相關(guān)的淀粉樣變性病、以及非顯著性單克隆丙種球蛋白病(MGUS)。腫瘤學(xué)對象包括B細(xì)胞癌、白血病、和淋巴瘤。
實施例9用可溶性BAFF-R體外封閉BAFF誘導(dǎo)的B細(xì)胞增生該實施例中，我們研究表明可溶性BAFF-RhIgG1融合蛋白能夠阻斷小鼠脾細(xì)胞中BAFF誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖。
從Balb/c小鼠中分離小鼠脾細(xì)胞(5×105個細(xì)胞/ml)，并用RPMI(LifeTechnologies)將其培養(yǎng)于96-孔培養(yǎng)板中，該RPMI中加入10％胎牛血清(JRH)、2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素(LifeTechnologies)。然后加入不同量的人BAFF、10μg/ml人BAFF-RhIgG1或人Ig、以及10μg/ml抗小鼠表面μ重鏈(Jackson Immuno Research)。37℃培養(yǎng)48小時后，用1μCi/孔[甲基-3H]胸腺嘧啶(Dupont NEN)脈沖細(xì)胞24小時，用Tomtec(Orange，CT)細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞。用Betaplate液體閃爍計數(shù)儀(Pharmacia Biotech)測定放射活性。
圖8顯示脾細(xì)胞增生試驗的結(jié)果。每分鐘小鼠脾細(xì)胞中摻入的數(shù)目(CPM)相對于所加入的人BAFF試劑的量?？?μ或融合蛋白或?qū)φ説IgG的水平恒定保持為10μg/ml。實心正方形代表單獨用BAFF誘導(dǎo)的增生水平。實心圓代表用BAFF和抗-μ誘導(dǎo)的增生。帶有空心三角形的曲線表示當(dāng)用BAFF-RhIgG1BAFF加抗-μ和BAFF-RhIgG1時觀察到的抑制。空心菱形表示用人Ig對照時觀察到的抑制。
加入BAFF和抗-μ導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞體外增生。細(xì)胞中3H胸腺嘧啶摻入量明顯高于脾細(xì)胞中單獨加入BAFF或單獨加入抗-μ時得到的水平。單用BAFF處理脾細(xì)胞導(dǎo)致3H胸腺嘧啶只以極高的濃度摻入。只加入抗-μ時無增生。向脾細(xì)胞加入10μg/ml人Ig對照，漸增量的BAFF和10μg/ml抗-μ時，增生水平適度漸弱。相反，在相同條件下測定試驗中加入10μg/ml人BAFF-RhIgG1融合蛋白時，增生水平減至單獨使用BAFF處理時的水平。這表明BAFF-RhIgGI融合蛋白能夠抑制BAFF及抗-μ誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增生。
實施例10用BAFF-RhIgG1阻斷BAFF與Raji細(xì)胞的結(jié)合該實施例中，用BAFF-RhIgG1融合蛋白預(yù)保溫BAFF能夠減少BAFF與Raji B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的結(jié)合，描述如下。
在本次FACS測定中，將人BAFF-RhIgG1或人LTβRhIgG1在20μg/ml～39μg/ml范圍內(nèi)做二倍稀釋后，用這些稀釋液以及不加融合蛋白的對照液，在冰上對200ng/ml FLAG-標(biāo)記后的人BAFF預(yù)保溫30分鐘。上述保溫在FACS緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液中含PBS，不含Ca2+或Mg2+，加有10％FCS(JRH)和0.05％疊氮鈉。預(yù)保溫后，將BAFF-融合蛋白加入5×106Raji(ATCC)細(xì)胞/ml。所述保溫在冰上進(jìn)行30分鐘，然后4℃用2mlFACS緩沖液洗滌細(xì)胞。為了檢測結(jié)合的BAFF，向細(xì)胞中加入5μg/ml抗-FLAG抗體M2(Sigma)，冰上保溫30分鐘。再次洗滌細(xì)胞，接著用1∶100稀釋的PE偶聯(lián)驢抗-鼠Ig(Jackson Immuno Research)冰上保溫30分鐘。再用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞后，用1％多聚甲醛固定細(xì)胞，用FACS(BectonDickinson and Co.)讀取結(jié)果。
圖9顯示BAFF阻斷試驗的結(jié)果。顯示檢測BAFF結(jié)合Raji細(xì)胞時從FACS分析中讀取的MFI(平均熒光強度)。實心正方形代表的是結(jié)合細(xì)胞前用人BAFF-RhIgGI預(yù)保溫BAFF的情況下得到的數(shù)據(jù)。圓表示的是向BAFF中加入非特異性融合蛋白人LTβRhIgG1時得到的曲線。X-軸代表與細(xì)胞保溫前向200ng/ml BAFF中加入的融合蛋白的量。
當(dāng)在無融合蛋白的條件下預(yù)保溫人BAFF時，樣品的平均熒光強度(MFI)是80。當(dāng)用人LTβRhIgG1預(yù)保溫BAFF時，即使在20μg/ml水平，BAFF結(jié)合Raji細(xì)胞的檢測結(jié)果不變。但是，當(dāng)用人BAFF-RhIgG1預(yù)保溫BAFF時，MFI大大降低，甚至在625ng/ml融合蛋白的水平下低至20-25。該試驗的背景MFI是7。因此，BAFF-RhIgG1能夠非常有效地阻斷BAFF與Raji B細(xì)胞的結(jié)合。
實施例11BAFF-R-IgG減輕轉(zhuǎn)基因小鼠的狼瘡樣自身免疫病癥該實施例描述了BAFF-R-Ig減少外周B細(xì)胞類群、抑制脾大(splenamegally)和腎炎的效果。
本實驗使用5月齡BAFF轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠(C57BL/6)和年齡相當(dāng)?shù)耐C出生小鼠。BAFF Tg小鼠表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞病癥以及類似系統(tǒng)性紅斑狼瘡的自身免疫表型(Mackay et al.，1999)。該表型包括下述外周B細(xì)胞類群的增加，包括過渡型1(T1)和2(T2)、成熟型(M)、邊緣區(qū)(MZ)以及CD 1高/IgM高B細(xì)胞。
在第0，4，7，11，14，18，21，25，28，32，35天，小鼠腹膜內(nèi)注射PBS，含400mg純化人IgG(hIg)(Sandoz，Basel，Switzerland)(3個/組)或400μg CHO-來源的人BAFF-R-huIgGI(hBCMA-Ig)融合蛋白(2個/組)，第40天時宰殺。
宰殺時，稱脾重，用低滲緩沖液溶解紅細(xì)胞后制備單細(xì)胞懸液。用FITC-偶聯(lián)的抗CD21/CD35，PE-偶聯(lián)的抗-IgD和抗CD1，cychrome-偶聯(lián)的抗-CD45R/B220和生物素偶聯(lián)的抗-IgM進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)。所有Ab均購自Pharmingen(San Diego，CA)。簡而言之，在冰上用10μg/ml FcBlock(Pharmingen)封閉Fc受體10分鐘，接著加入生物素-偶聯(lián)的mAb冰上保溫30分鐘，細(xì)胞用1x洗滌，接著加入FITC、PE、Cychrome-偶聯(lián)的Ab，鏈霉抗生物素蛋白APC和10μg/ml Fc Block。冰上保溫細(xì)胞30分鐘，用1x洗滌，懸浮于0.5％多聚甲醛中。用FACSCalibur(流式血細(xì)胞儀(BectonDickinson，San Jose，CA)讀取細(xì)胞熒光數(shù)據(jù)，并用CELLQuest(軟件(BectonDickinson)分析。
使用尿分析所用的Multistix 10 SG試劑條(Bayer Corp.，DiagnosticsDivision)測定小鼠尿液中蛋白質(zhì)的存在。
結(jié)果見下列表11A和表11B
表11A3月齡脾細(xì)胞分析每個脾中的細(xì)胞總量(×106)T1 T2 MZ 成熟型BAFF Tg小鼠816E23 9.418 9 91816E33 14 30 19 170816E99 14 24 19 150平均值 13+/2.624+/-6 16+/5.7140+/-41同窩對照816E2 5.35.8 3.173816E4 2.43.7 1.944平均值 3.9+/-24.8+/-1.52.4+/-159+/-20按照材料和方法章節(jié)中描述的方法，分離3月齡BAFF Tg小鼠(n＝3)和同齡同窩對照小鼠(n＝2)的脾，進(jìn)行FACS分析。其中T1、T2、M和MZ細(xì)胞通過下列表面標(biāo)記的表達(dá)定義(hi高，lo低，int中間狀態(tài))T1IgD-，IgM高，CD21loMZIgD-，IgMhi，CD21T2IgD+，IgMhi，CD21hiMIgD+，IgMlo，CD21int
表11B10月齡脾細(xì)胞分析每個脾的細(xì)胞總量(×106)T1 T2 MZ成熟型BAFF Tg小鼠802-39 13 100 34630823-3-11 7.543 6.6 200823-3-13 3.150 15180平均值 7.9+/-4.9 64+/-30 19+/-10 340+/-250同窩對照823-3-22 0.76.5 1.4 56802-64 0.28 5.4 1.3 38823-14-130.45 3.4 0.16 38平均值 0.48+/-0.215.1+/-1.5 0.95+/-0.65 44+/-10按照表1所述，對10月齡的BAFF Tg小鼠(n＝3)和同齡同窩對照(n＝3)進(jìn)行FACS分析。
與用PBS和hIg處理后的Baff Tg小鼠相比，向Baff Tg小鼠施用BAFF-R-Ig后，脾內(nèi)T1、T2、M、MZ細(xì)胞群和CD1高/IgM高B細(xì)胞顯著減少，T1、T2、M、MZ細(xì)胞群和CD1高/IgM高B細(xì)胞的總數(shù)減少至近似或者低于用PBS處理的對照同窩小鼠的水平(圖10a，10b，10c)。
BAFF-R處理過的小鼠的脾大小正常，而對照處理過的Baff Tg小鼠表現(xiàn)出脾大(圖11)，這種現(xiàn)象表明BAFF-R-Ig處理Baff Tg小鼠可以減輕Baff-介導(dǎo)的自身免疫疾病。此外，BAFF-R-Ig處理過的小鼠中，作為腎機能障礙指標(biāo)的蛋白尿進(jìn)程得到抑制，而對照處理過的Baff Tg小鼠蛋白尿水平升高因而判定為患了腎炎(圖12)。
Baff轉(zhuǎn)基因小鼠外周B細(xì)胞數(shù)目大大增加，我們進(jìn)一步分析表明這些小鼠中T1，T2，MZ B細(xì)胞亞群大大增加。B細(xì)胞發(fā)育的過渡階段(T1和T2)是自身反應(yīng)性B細(xì)胞大體消除的檢查站。CD1hi/IgM高B細(xì)胞往往位于邊緣區(qū)，在Baff Tg小鼠中也大大增加。后面所述這種B細(xì)胞亞群是NZB/NZW狼瘡小鼠自身抗體生成的主要來源。用BAFF-R-Ig處理Baff Tg小鼠導(dǎo)致T1、T2、MZ和CD1hiB細(xì)胞群降低至近似或低于野生型同窩對照的水平。
BAFF-R-Ig發(fā)揮作用能減少外周B細(xì)胞庫并抑制脾大和腎炎的進(jìn)程。因此，BAFF-R-Ig除了可以用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡狼瘡腎炎外，它還可以用于B細(xì)胞介導(dǎo)的實質(zhì)為自身免疫性的疾病，例如重癥肌無力、自身免疫溶血性貧血、特發(fā)的血小板減少性紫癜、抗磷脂綜合征、恰加斯病、格雷夫斯病、韋格納肉芽腫病、結(jié)節(jié)性多動脈炎和急進(jìn)性腎小球腎炎。這種治療藥劑還可以用于漿細(xì)胞病癥，例如多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、重鏈病、原發(fā)性或免疫細(xì)胞相關(guān)的淀粉樣變性病、以及非顯著性單克隆丙種球蛋白病(MGUS)。腫瘤學(xué)對象包括B細(xì)胞癌、白血病、和淋巴瘤。
實施例12BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠的平均動脈壓本試驗描述了BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠血壓的測定。BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠表型評估中的觀察表明該小鼠有發(fā)生高血壓的可能。
用氯胺酮麻醉上述Baff Tg小鼠。頸部切口暴露左側(cè)頸動脈。頸動脈插入導(dǎo)管測量血壓和心率。導(dǎo)管連接到壓力傳導(dǎo)器，用Gould數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Po-Ne-Mah數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Gould多種波動描記器)測量血壓。從脈動壓力波形中，得出心臟收縮壓、心臟舒張壓、平均壓和心率。使用兩組小鼠BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠(n＝8)和野生型對照(n＝9)。
圖13顯示兩組的均值(average)平均動脈壓(MAP，以mmHg計)。如圖所示，BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠的均值MAP為102±8mmHg。對照小鼠的均值MAP為92±6mmHg。因此，BAFF小鼠的MAP比對照小鼠升高了10mmHg，盡管這一差異不具有統(tǒng)計顯著性(ANOVA)。
數(shù)據(jù)的更詳細(xì)分析見圖14。該圖中，顯示了單個動物的結(jié)果。野生型對照(BAFF-)中，數(shù)據(jù)分布呈典型的二項分布。相反，BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠(BAFF+)中，數(shù)據(jù)分布成兩組，其中一組為120-130mmHg，而另一組為80-90mmHg。
與陰性對照小鼠相比，BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠作為一個群體，往往易發(fā)高血壓。個體動脈壓水平分析表明BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠分布成兩個亞群，其一有高血壓，而另一類血壓正常。因此，施用可溶性BAFF-R、融合蛋白或者抗體類似物可以減輕高血壓的后果。
實施例13用BAFF-R-Ig處理已患病的SNF1小鼠可減慢其向重度腎炎發(fā)展的進(jìn)程。
雌性狼瘡-易感(SWRxNZB)F1(SNFI)小鼠，21周齡，顯示中度腎炎(30-100mg/dl蛋白尿)，在8周期間，每周向這些小鼠腹腔內(nèi)注射200μg融合蛋白人BAFF-R-huIgGI(hBCMA-Ig)、人IgG(HuIgG)(Sandoz)或200μlPBS。每周都取每個小鼠的尿液用Albustix(Bayer Corp.，Terrytown，NY)進(jìn)行蛋白尿的監(jiān)測。蛋白尿超過100mg/dl被定為重度腎炎。BAFF-R-Ig產(chǎn)自瞬間轉(zhuǎn)染的EBNA 293細(xì)胞。從過量表達(dá)有hBCMA-Ig的293細(xì)胞培養(yǎng)物中取用過的培養(yǎng)基，上樣于蛋白A層析柱。用25mM磷酸鹽100mM NaClpH 2.8洗脫蛋白質(zhì)，然后用1/20體積的0.5M NaPO4 pH 8.6中和。根據(jù)OD280選擇級分，對其進(jìn)行還原及非還原的SDS-PAGE凝膠電泳，Western印跡鑒定純化后的蛋白質(zhì)。
處理終止后3周，用BAFF-R-Ig處理過的小鼠中有50％出現(xiàn)重度腎炎，而接受過HuIgG和PBS的小鼠中分別有75％和87.5％(見圖15)。這些數(shù)據(jù)表明可溶性BAFF受體、BCMA-Ig，能夠阻滯B cell-介導(dǎo)的自身免疫疾病，例如狼瘡腎炎，使病程顯著延遲。
實施例14正常小鼠用BAFF-R-Ig處理后，脾樹突狀細(xì)胞(DC)數(shù)目減少并出現(xiàn)非典型的脾內(nèi)定位(atypical splenic localization)向7周齡雌性BALB/c小鼠(3個/組)腹腔內(nèi)注射20μg或50μg人BAFF-R-IgG1(hBCMA-Ig)、50μg人IgG(HuIgG)或者100μl PBS，每周一次，共4周。hBCMA-Ig融合蛋白純化自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清。最后1次注射的8周后取脾，用膠原酶(Sigma cat.#C-5138)37℃消化1小時。制備單細(xì)胞懸液，用低滲緩沖液溶解紅細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次。制備脾細(xì)胞，用抗-CD11c-生物素再用鏈霉抗生物素蛋白-APC、抗-CD8a-cychrome，和抗-CD4-FITC對細(xì)胞染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析評估DC類群。
在另一試驗中，雌性BALB/c(N＝3)小鼠腹腔內(nèi)注射100μg hBCMA-Ig，每周一次，共四周，然后用CO2預(yù)冷了的2-甲基丁烷將脾臟速凍于OCT中。制備冷凍切片，用丙酮固定。切片與抗-CD11c-生物素再與鏈霉抗生物素蛋白-AP以及底物BCIP(Pierce)一起保溫以顯示樹突狀細(xì)胞，切片與mAb MOMA-1再與抗-大鼠IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch)以及底物3，3′二氨基聯(lián)苯胺(Sigma，St.Louis MO，Cat.&num；D-1293)一起保溫以顯示嗜金屬(metallophilic)巨噬細(xì)胞，切片與抗-CD35-生物素再與鏈霉抗生物素蛋白-AP以及底物(堿性磷酸酶底物試劑盒I，Vector cat#SK5100)一起保溫以顯示濾泡樹突狀細(xì)胞(FDC)。
用20μg或50μg BCMA-Ig體內(nèi)處理小鼠，每周1次，共四周，這樣處理后的小鼠，與用HuIgG和PBS處理后的對照相比，脾內(nèi)的CD11c+樹突狀細(xì)胞顯著減少(student’s t檢驗p＜0.05)。這種減少現(xiàn)象出現(xiàn)在被檢測的所有CD11c+DC類群中CD8a-CD4-，CD8a+CD4-，和CD8a-CD4+(圖16，表14A)。
表14A.BAFF-R-Ig處理導(dǎo)致脾DC數(shù)減少.
脾樹突狀細(xì)胞是重要的抗原提呈細(xì)胞，它們的減少會影響B(tài)細(xì)胞活化、成熟以及體液免疫。
按照材料和方法部分中所述制得冷凍脾切片。BCMA-Ig處理后的小鼠用抗-CD11c染色時呈現(xiàn)出非典型DC歸巢模式。DC通常定位于白髓的T細(xì)胞區(qū)以及邊緣區(qū)內(nèi)，邊緣區(qū)的橋連通道(bridging channel)尤為集中。但是BCMA-Ig處理后的小鼠中DC圍繞在邊緣區(qū)的周長周圍，只有極少數(shù)能夠進(jìn)一步遷徙入白髓(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，阻斷BAFF/BAFF-R與可溶性BAFF受體之間的相互作用能夠干擾DC的歸巢模式，這樣就可以妨礙它們作為抗原提呈細(xì)胞的功能，因而影響B(tài)細(xì)胞活化、成熟及體液免疫。而且經(jīng)免疫組化測定，BCMA-Ig處理后的小鼠脾內(nèi)缺乏CD35+FDC(數(shù)據(jù)未顯示)。由于正是FDC將抗原提呈給生發(fā)中心(GC)內(nèi)的B細(xì)胞，所以缺乏這類細(xì)胞對GC結(jié)構(gòu)以及B細(xì)胞的親和成熟有不利影響。
本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，在不脫離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，可以對本發(fā)明所述多肽、組合物及方法進(jìn)行各種修飾和變更。因此，如果本發(fā)明的修飾和變更落在本發(fā)明所附權(quán)利要求及其等價物的范圍之內(nèi)，那么它們就應(yīng)屬于本發(fā)明所覆蓋的范圍。
權(quán)利要求
1.一種抑制動物體內(nèi)B細(xì)胞生長的方法，該方法包括施用治療有效量的組合物，所述組合物選自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗體同系物。
2.一種抑制動物產(chǎn)生免疫球蛋白的方法，該方法包括施用治療有效量的組合物，所述組合物選自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗體同系物。
3.一種抑制動物體內(nèi)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的B細(xì)胞生長和成熟的方法，該方法包括施用治療有效量的組合物，所述組合物選自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗體同系物。
4.一種治療自身免疫疾病的方法，該方法包括施用治療有效量的組合物，所述組合物選自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗體同系物。
5.一種治療動物高血壓的方法，該方法包括施用治療有效量的B細(xì)胞生長抑制劑，所述抑制劑選自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗體同系物。
6.一種治療動物腎病的方法，該方法包括施用治療有效量的B細(xì)胞生長抑制劑，所述抑制劑選自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗體同系物。
7.一種治療B細(xì)胞淋巴增生疾病的方法，該方法包括施用治療有效量的B細(xì)胞生長抑制劑，所述抑制劑選自(a)BAFF-R多肽或其片段；(b)一種嵌合分子，其包含與異源氨基酸序列融合的BAFF-R多肽或其片段；以及(c)抗-BAFF-R抗體同系物。
8.權(quán)利要求1-7所述方法，其中所述BAFF-R多肽是可溶性的。
9.權(quán)利要求8所述方法，其中所述可溶性BAFF-R多肽包括BAFF-R胞外區(qū)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述BAFF-R胞外區(qū)與免疫球蛋白融合。
11.權(quán)利要求1-7所述方法，其中所述BAFF-R多肽選自a)分離的天然序列BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1中第1-184位的氨基酸或其片段；b)分離的BAFF-R多肽，該多肽與天然序列BAFF-R多肽具有至少80％的氨基酸序列同一性，且該多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；c)分離的BAFF-R多肽，該多肽與天然序列BAFF-R多肽具有至少90％的氨基酸序列同一性，且該多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；d)分離的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第1-51位氨基酸或其片段；以及e)分離的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第8-41位氨基酸或其片段。
12.權(quán)利要求1-7的方法，其中所述抗-BAFF-R抗體同系物是單克隆抗體。
13.權(quán)利要求1-7的方法，其中所述抗-BAFF-R抗體同系物包含BCMA-IgG。
14.權(quán)利要求1-7的方法，其中所述動物是哺乳動物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述哺乳動物是人。
16.一種處理、抑制或改變涉及BAFF-R和BAFF間信號傳輸?shù)拿庖邞?yīng)答的方法，該方法包括施用有效量能夠干擾BAFF-R和BAFF間聯(lián)系的藥劑。
17.一種抑制炎癥的方法，該方法包括施用有效量的特異性針對BAFF-R或其活性片段的抗體。
18.一種抑制炎癥的方法，該方法包括施用有效量的特異性針對BAFF-R或其表位的抗體。
19.一種藥用組合物，其中包括治療有效量的分離的BAFF-R多肽或其片段以及藥物學(xué)上可接受的載體。
20.權(quán)利要求19的藥用組合物，其中所述分離的BAFF-R多肽選自a)分離的天然序列BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；b)分離的BAFF-R多肽，該多肽與天然序列BAFF-R多肽具有至少80％的氨基酸序列同一性，該多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；c)分離的BAFF-R多肽，該多肽與天然序列BAFF-R多肽具有至少90％的氨基酸序列同一性，該多肽中包括SEQ ID NO1的第1-184位氨基酸或其片段；d)分離的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第1-51位氨基酸或其片段；以及e)分離的BAFF-R多肽，其中包括SEQ ID NO1的第8-41位氨基酸或其片段。
21.權(quán)利要求19的藥用組合物，其中所述BAFF-R多肽片段包含與免疫球蛋白融合的BAFF-R胞外區(qū)。
全文摘要
提供了TNF家族的受體:BAFF－R。還提供了BAFF－R的嵌合分子和抗體以及它們的應(yīng)用方法。
文檔編號C07K19/00GK1379815SQ00814288
公開日2002年11月13日 申請日期2000年8月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月17日
發(fā)明者費比尼·麥凱, 杰弗里·布朗寧, 克里斯廷·安布羅斯, 朱爾格·肖普, 帕斯卡爾·施奈德, 杰弗里·湯普森 申請人:比奧根公司, 阿波泰克R＆D股份有限公司