專利名稱：使用模式識(shí)別的受體-配體:脂質(zhì)復(fù)合物的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引發(fā)哺乳動(dòng)物的全身性、非特異性(即，非抗原特異性的)免疫應(yīng)答 以及抗原特異性免疫應(yīng)答(二者均用于免疫接種方案)與引發(fā)血管生成和纖維生成 的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及使用脂質(zhì)體-toll樣受體的配體復(fù)合物引 發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物和方法。
現(xiàn)有技術(shù)描述
對(duì)于用水衛(wèi)生，通過疫苗接種來預(yù)防感染性疾病是最有效、成本效益好與實(shí) 用的疾病預(yù)防方法。沒有其它用藥方案、即使是抗生素對(duì)死亡率降低和人口增長具 有這種優(yōu)異的作用。疫苗接種對(duì)全世界人民健康的影響不言而喻。疫苗接種至少在 全球的一部分控制了以下9種主要疾病天花、白喉、破傷風(fēng)、黃熱病、百日咳、 脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹。疫苗的效力取決于其引發(fā)的概述于下文的保護(hù) 性免疫應(yīng)答的能力。
免疫應(yīng)答是一種識(shí)別外來病原體的極其復(fù)雜極有價(jià)值的自我平衡機(jī)制。對(duì)外 來病原體的最初應(yīng)答稱為"天然免疫力"，其特征是天然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中 性白細(xì)胞和其它白細(xì)胞快速遷移至外來病原體的(入侵)位。這些細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi) 吞噬、消化、裂解病原體或分泌能裂解病原體的細(xì)胞因子。天然免疫應(yīng)答不是抗原特異性的通常認(rèn)為構(gòu)成了抵御外來病原體的第一道防線直至"適應(yīng)性免疫應(yīng)答"產(chǎn) 生。T細(xì)胞和B細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。適應(yīng)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生涉及各種機(jī)理。 對(duì)所有產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的可能機(jī)理的討論超出本章節(jié)的范圍；然而，有一些機(jī) 理已得到良好描述，包括B細(xì)胞識(shí)別抗原然后激活分泌抗原特異性抗體以及通過 與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合而激活T細(xì)胞。
B細(xì)胞識(shí)別涉及抗原與B細(xì)胞的表面免疫球蛋白受體結(jié)合，所述抗原例如有
細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)菌毒素或在病毒膜上發(fā)現(xiàn)的糖蛋白。與受體的結(jié)合將某種信號(hào)遞送
至B細(xì)胞內(nèi)部。這是本領(lǐng)域通常所稱的"第一信號(hào)"。在一些情況中，僅需要一種 信號(hào)即可激活B細(xì)胞。這些能激活B細(xì)胞而不依賴T細(xì)胞輔助的抗原通常稱為T 非依賴性抗原(或胸腺不依賴性抗原)。其它情況需要"第二信號(hào)"這通常是由T輔 助細(xì)胞與B細(xì)胞的結(jié)合而提供。當(dāng)B細(xì)胞受某特定抗原的激活需要T細(xì)胞輔助時(shí)， 該抗原稱為T依賴性抗原(或胸腺依賴性抗原)。除了與B細(xì)胞的表面受體結(jié)合以外， 抗原也可被B細(xì)胞內(nèi)化攝入，然后在B細(xì)胞內(nèi)消化為較小的片段并呈遞至B細(xì)胞 表面的抗原肽-MHCII類分子中。這些肽-MHCII類分子被T輔助細(xì)胞所識(shí)別，該 T輔助細(xì)胞與B細(xì)胞結(jié)合來提供一些抗原所需的"第二信號(hào)"。 一旦B細(xì)胞被激活， B細(xì)胞就開始分泌抵御該抗原的抗體并最終導(dǎo)致該抗原滅活。另一種激活B細(xì)胞 的途徑是通過與淋巴結(jié)和脾臟生發(fā)中心內(nèi)的濾泡樹突狀細(xì)胞(FDC)接觸。濾泡樹突 狀細(xì)胞捕捉循環(huán)流經(jīng)淋巴結(jié)和脾臟的抗原-抗體(Ag-Ab)復(fù)合物并將此復(fù)合物呈遞 至B細(xì)胞而激活它們。
對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的另一種已清楚鑒定的機(jī)理是通過與抗原呈遞細(xì)胞 (例如，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)結(jié)合來激活T細(xì)胞。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是強(qiáng)有 力的抗原呈遞細(xì)胞。巨噬細(xì)胞具有識(shí)別微生物組分的各種受體，例如巨噬細(xì)胞的甘 露糖受體和清除受體。這些受體能結(jié)合微生物，巨噬細(xì)胞吞噬這些微生物并在內(nèi)體 和溶酶體中將其降解。 一些微生物以此種方式直接被破壞。其它微生物被消化成小 肽轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞表面的MHC II類-肽復(fù)合物呈遞給T細(xì)胞。結(jié)合了這些復(fù)合物 的T細(xì)胞被激活。樹突狀細(xì)胞也是強(qiáng)有力的抗原呈遞細(xì)胞能呈遞肽-MHC I類分子 和肽-MHC II類分子而激活T細(xì)胞。
當(dāng)B細(xì)胞與某新抗原結(jié)合時(shí)，誘導(dǎo)B細(xì)胞進(jìn)入稱為"同種型轉(zhuǎn)換"的發(fā)育途 徑。在該發(fā)育變化期間，漿細(xì)胞從產(chǎn)生普通的IgM型抗體轉(zhuǎn)變成為產(chǎn)生高度特異性的IgG型抗體。在漿細(xì)胞群中， 一些細(xì)胞在稱為"克隆擴(kuò)增"的過程中反復(fù)分 裂。這些細(xì)胞成熟后變成將免疫球蛋白釋放入血液的抗體工廠。完全成熟后，它們
變?yōu)槊棵肽茚尫偶s2,000個(gè)相同抗體分子直至死亡的漿細(xì)胞，死亡一般在達(dá)到成熟 后的2或3天內(nèi)。該克隆組中的其它細(xì)胞從不產(chǎn)生抗體，而成為記憶細(xì)胞，在遇到 抗原后可識(shí)別并特異性結(jié)合抗原。
抗原初次攻擊后，產(chǎn)生了許多與初始B細(xì)胞或親代細(xì)胞相同的細(xì)胞，每種細(xì) 胞能以相同于初始B細(xì)胞的方式對(duì)該抗原產(chǎn)生應(yīng)答。因此，如果該抗原第二次出 現(xiàn)，它會(huì)馬上遇到已修正的一個(gè)B細(xì)胞，這些B細(xì)胞已經(jīng)程序變化為特異性IgG 抗體B細(xì)胞，免疫應(yīng)答將立刻開始、更快加速、特異性更強(qiáng)并產(chǎn)生更多數(shù)量的抗 體。該應(yīng)答稱為是繼發(fā)性應(yīng)答或記憶應(yīng)答。由于記憶細(xì)胞可存活數(shù)月或數(shù)年，也由 于引入的外來物質(zhì)有時(shí)量雖極少但足夠持久激發(fā)低水平的免疫應(yīng)答，這種免疫力可 維持?jǐn)?shù)年。這樣，記憶細(xì)胞可定期得到補(bǔ)充。
首次接觸抗原后，抗體應(yīng)答產(chǎn)生往往滯后并且產(chǎn)生的抗體量少，即，基礎(chǔ)應(yīng) 答。第二次接觸相同抗原后，應(yīng)答(即，繼發(fā)性應(yīng)答)更快且強(qiáng)度更高，藉此實(shí)現(xiàn)與 再次感染致病性微生物后的加速繼發(fā)性應(yīng)答相同的免疫狀態(tài)，這正是疫苗接種所尋 求的目的。
分類學(xué)上的活性疫苗一般分為兩類亞單位疫苗和全生物體疫苗。亞單位疫 苗從全生物體的成分制備并且通常開發(fā)來避免使用活的微生物而可能導(dǎo)致疾病或 者避免全生物體疫苗中存在的有毒成分。使用b型流感嗜血桿菌(/^V /7we"zfl)作為 抗該微生物導(dǎo)致人腦膜炎的疫苗是抗原組分疫苗的例子。另一方面，全微生物疫苗 可采用整個(gè)微生物。該微生物是死的還是活的(通常是減毒的)取決于要引發(fā)的保護(hù) 性免疫。例如，白喉疫苗是用甲醛處理百日咳桿菌(5oWeW/apwMwW細(xì)胞制備的 死的全細(xì)胞疫苗。然而，因?yàn)闇缁罘椒ń?jīng)常破壞或改變許多誘導(dǎo)宿主特異性抗體所 需的表面抗原決定簇，使用處死的細(xì)胞通常伴有免疫原性喪失。
與死疫苗截然相反的是，活減毒疫苗與自然感染相似，由活生物體組成，這 些生物體是良性的但通常可在宿主組織中復(fù)制并且估計(jì)可表達(dá)許多天然的靶免疫 原，這些免疫原經(jīng)過加工并呈遞至免疫系統(tǒng)。這種相互作用引發(fā)的保護(hù)性應(yīng)答就如 同免疫接種的個(gè)體此前接觸過該疾病那樣。理想的這些減毒微生物應(yīng)完整保留誘導(dǎo) 特異性抗體所需的細(xì)胞表面成分而不會(huì)導(dǎo)致疾病，這是因?yàn)椋缢鼈儾荒墚a(chǎn)生毒力因子、生長太慢或在宿主中根本不能生長。此外，這些減毒株應(yīng)該基本上不能回 復(fù)至有毒力的野生型菌株。
經(jīng)典的疫苗理論表明用非致死性或減毒病原體預(yù)防性接種能提供具有保護(hù)作 用的免疫應(yīng)答，可抵御隨后遭遇相同或類似病原體的感染。這種方法對(duì)病毒可行， 對(duì)抗原數(shù)量有限的細(xì)菌稍差一些。然而，該方法對(duì)表達(dá)無限數(shù)量的抗原的腫瘤細(xì)胞 行不通。此外，與經(jīng)典免疫方案不同，抗癌疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答必需在接觸抗原之 后而非之前。如果抗癌疫苗想獲得成功，它們必須誘導(dǎo)能根治現(xiàn)存疾病的免疫應(yīng)答， 這需要更加了解腫瘤抗原的性質(zhì)以及宿主-腫瘤的相互作用。最新的疫苗構(gòu)思(例如 基因疫苗)致力于細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)。
基因疫苗含有編碼待產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的抗原的DNA序列。對(duì)要產(chǎn)生的抗原特
異性免疫應(yīng)答的基因疫苗而言，感興趣的基因必須表達(dá)于哺乳動(dòng)物宿主中。通過使 用在疫苗接種患者中表達(dá)感興趣外來基因并能誘導(dǎo)針對(duì)所編碼蛋白的免疫應(yīng)答的 病毒載體(例如，腺病毒、痘病毒)而實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)?；蛘撸墒褂镁幋a外來基因
的質(zhì)粒DNA來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。這些稱為"裸"DNA疫苗的基本施用途徑是肌肉 內(nèi)或皮下。病毒載體系統(tǒng)比裸DNA系統(tǒng)能誘導(dǎo)更佳的免疫應(yīng)答已普遍接受，可能 是因?yàn)椴《具f送系統(tǒng)比裸DNA疫苗能誘導(dǎo)更強(qiáng)的炎癥和免疫激活。病毒疫苗能誘 導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答的性能主要是由于補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)病毒成分的識(shí)別從而 引發(fā)針對(duì)該病毒載體的特異性成分的抗原特異性免疫應(yīng)答，然而，由于這種免疫應(yīng) 答經(jīng)常阻止疫苗的再次施用，這也代表了其潛在的缺陷。
雖然科學(xué)與臨床研究有許多證據(jù)表明免疫系統(tǒng)可摧毀癌性組織，但大多數(shù)情 況中免疫系統(tǒng)未能識(shí)別腫瘤，或者產(chǎn)生的應(yīng)答太微弱以至于無效。參見Farzaneh 等，/mmwm /.roc/a_y， 19:294(1998)。盡管在許多情況中早期診斷可治愈腫瘤，但一 旦腫瘤轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，它幾乎總是致命的。此外，單獨(dú)或聯(lián)合使用化療、放療和 外科手術(shù)觀察到的令人失望的結(jié)果使許多研究人員將注意力轉(zhuǎn)為免疫或生物藥物。 參見Ockert等，/mw訓(xùn)o/.rc^a》20:63 (1999)。因此，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)腫瘤消退 的能力成為腫瘤免疫學(xué)的主要目標(biāo)。近來，免疫原性腫瘤抗原的鑒定與對(duì)T細(xì)胞 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和腫瘤逃逸機(jī)理的更好理解有助于該目標(biāo)的進(jìn)展。參見Boon等， Immunol.Today， 18:267 (1998); Chen, Immunol.Today， 19:27 (1998)。
基于細(xì)胞和腫瘤免疫學(xué)的原理的更深入了解，對(duì)一些動(dòng)物排斥腫瘤而其它動(dòng)物顯示腫瘤生長發(fā)展的機(jī)理的了解逐漸得到進(jìn)展。雖然許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)了耙抗
原，但它們未能刺激免疫應(yīng)答。參見Boon等，(1997); Boon等，/五;cpJkfec/.， 183:725 (1996)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)公認(rèn)是腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵成分，參見Boon 等，(1996); Chen等，XEx; .M^/., 179:523 (1994)。 CTL應(yīng)答足以提供抗腫瘤的保 護(hù)作用并甚至可消除小鼠模型(Mogi等，C7/".Ca"c" J es.， 4:713 (1998))和人中已 發(fā)生的癌癥，參見Gong等，尸rocWwL4cadSc/.美國，97:2715 (2000)。誘導(dǎo)強(qiáng)烈 的抗原特異性CTL應(yīng)答是許多當(dāng)前癌癥疫苗方案的目標(biāo)。
CTL依賴性抗腫瘤免疫接種方案的開發(fā)取決于CTL識(shí)別的腫瘤抗原的鑒定和 有效的抗原遞送方法的開發(fā)。CTL通過識(shí)別由自身MHC I類分子和合成于腫瘤細(xì) 胞的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的肽抗原組成的配體而靶向腫瘤。然而，對(duì)于CTL的誘導(dǎo)和擴(kuò) 增，抗原配體必須由專職性APC細(xì)胞以合適的共刺激方式提供給CTL。將外源性 抗原遞送至專職性APC的內(nèi)源性MHC I類分子限制性加工途徑是癌癥疫苗設(shè)計(jì)中 的關(guān)鍵難點(diǎn)。當(dāng)前開發(fā)的抗原遞送方案包括用有限數(shù)目的肽免疫接種，特別是能在 體內(nèi)進(jìn)入專職性APC的MHCI類途徑的蛋白質(zhì)、分離自腫瘤細(xì)胞的熱激蛋白或利 用載有抗原的APC的過繼性轉(zhuǎn)移。此外，近來的研究表明病毒載體或脂質(zhì)體遞送 的編碼腫瘤抗原的DNA疫苗或者裸DNA疫苗能誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫力。
如上所述，由于轉(zhuǎn)化和降解，給予肽或蛋白質(zhì)所需的方法具有其固有的有限 性。此外，從CTL前體細(xì)胞(CTL-P)產(chǎn)生CTL顯示需要IL-2與高親和力IL-2受體 的相互作用，而導(dǎo)致抗原激活的CTL-P增殖和分化為效應(yīng)CTL。 IL-2不足則誘導(dǎo) Thl細(xì)胞和CTL細(xì)胞凋亡而發(fā)生程序性死亡。免疫應(yīng)答即以這種方式快速終止， 這可降低炎性反應(yīng)所致的非特異性組織損壞。
為克服當(dāng)前疫苗技術(shù)(包括用于癌癥的方法)的缺陷，迫切需要開發(fā)新的改進(jìn)的 疫苗遞送系統(tǒng)。新的改進(jìn)的疫苗的可能需要的一種成分是更強(qiáng)的疫苗佐劑。用于這 些疫苗的佐劑必須模擬感染和/或誘導(dǎo)局部組織損傷以引發(fā)保護(hù)性免疫力。然而， 對(duì)疫苗佐劑和它們?nèi)绾纹鹱饔玫默F(xiàn)有知識(shí)仍不完整。據(jù)認(rèn)為Toll-樣受體(TLR)在天 然和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)與T細(xì)胞和抗體應(yīng)答發(fā)展之間的聯(lián)系中起著重要作用。然而， 如何通過特異性TLR的激活來影響所導(dǎo)致的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的類型仍不十分清 楚。例如，激活不同的TLR實(shí)際上可導(dǎo)致不同類型的T細(xì)胞或B細(xì)胞應(yīng)答。
包括Toll-樣受體的模式識(shí)別受體是新發(fā)現(xiàn)的天然免疫系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)的一個(gè)受體家族，所述細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞。這些受體識(shí)別在其配體
表面的特異性結(jié)構(gòu)模式，因此得名為模式受體。TLR的主要作用是識(shí)別致病性微 生物或其產(chǎn)物并在結(jié)合配體后向細(xì)胞發(fā)出信號(hào)。TLR發(fā)出的信號(hào)激活細(xì)胞并觸發(fā) 抗微生物的防御體系，包括產(chǎn)生例如干擾素、TNF、 IL-12、 IL-1和IL-6的細(xì)胞因 子。因此，TLR受體是作為身體抵御感染性物質(zhì)主要的第一道防線?，F(xiàn)已鑒定了 該受體家族的12個(gè)成員，稱為模式識(shí)別受體。這些受體具有某些共同的特征，包 括(l)主要限于在天然免疫系統(tǒng)的抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)；(2)與配體結(jié)合時(shí)能激活 抗感染性病原體(病毒、細(xì)菌、真菌等)的免疫應(yīng)答；和(3)與果蠅Toll受體結(jié)構(gòu)類似。 因此，可通過與TLR配體結(jié)合來觸發(fā)TLR信號(hào)而激活細(xì)胞防御，可用作有效誘導(dǎo) 免疫刺激的一種方法。
然而，單獨(dú)使用TLR配體進(jìn)行免疫接種可能不是最好。例如，就抗某種抗原 的疫苗接種而言，簡單混合TLR配體與抗原可能是一種不足以引發(fā)免疫應(yīng)答的方 法。此外，施用純化的TLR配體可導(dǎo)致其在血流中快速降解并且非常昂貴，特別 是在較大的動(dòng)物和人中。
還迫切需要提供能引發(fā)全身性、非特異性以及抗原特異性免疫應(yīng)答的更好的 疫苗，這些疫苗要安全、能反復(fù)施用并能通過引發(fā)免疫應(yīng)答來有效預(yù)防和/或治療 疾病，例如感染性疾病、過敏和癌癥。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種疫苗。該疫苗含有以下成分(a)至少一種可 為模式識(shí)別分子(受體)識(shí)別的配體；和(b)—種遞送載體。該配體可與遞送載體形成 復(fù)合物或位于遞送載體內(nèi)。
該配體優(yōu)選被引發(fā)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的天然免疫系統(tǒng)的模式識(shí) 別受體分子識(shí)別并結(jié)合?？蛇x擇能被Toll-樣受體識(shí)別的配體。Toll-樣受體包括(但 不限于)TLR-1、 TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8、 TLR-9、 TLR-IO、 TLR-11和TLR-12或其組合。TLR配體的例子包括(但不限于)革蘭陽 性細(xì)菌(TLR-2)、細(xì)菌內(nèi)毒素(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)、細(xì)菌DNA(TLR-9)、 雙鏈RNA和聚I:C(TLR-3)與酵母菌細(xì)胞壁抗原(TLR-2)。用于制備脂質(zhì)體-TLR 配體復(fù)合物(LTLC)的TLR配體可由能結(jié)合TLR的完整生物體(例如，革蘭+細(xì)菌或酵母菌)、含有TLR配體的蛋白或糖類的部分純化的混合物、含有TLR配 體的純化的蛋白或糖類或脂質(zhì)、或能以天然配體相同的方式結(jié)合并激活TLR的 肽與其它小分子組成。配體更具體說是糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)和 /或蛋白或衍生自真菌、病毒、立克次氏體、寄生蟲、節(jié)肢動(dòng)物或細(xì)菌某一部分 的肽序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疫苗含有多種配體。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種疫苗。該疫苗含有以下成分(a)至少一種用 于接種哺乳動(dòng)物的免疫原；(b)至少一種為模式識(shí)別分子(受體)所識(shí)別的配體；和(c) 遞送載體。所述免疫原和配體可與遞送載體形成復(fù)合物或位于其內(nèi)部。
遞送載體可是任何合適的脂質(zhì)體，包括(但不限于)多層脂泡、陽離子脂質(zhì)體、 與陽離子脂質(zhì)形成復(fù)合物的膽固醇，特別是(但不限于)DOTMA(N-[l-(2，3-二油酰 氧)丙基]-N,N，N-氯化三甲基銨)和膽固醇；DOTAP(l,2-二油酰-3-三甲銨-丙垸) 和膽固醇；DOTIM(l-(2-(油酰氧)乙基)-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑啉鎗)和膽固醇； 與DDAB(二甲基雙十八垸基銨)；PEI(聚乙烯亞胺)、聚胺、脫乙酰殼聚糖、聚 谷氨酸、硫酸魚精蛋白、微球體和膽固醇。 一方面，TLR配體可與荷電的脂質(zhì) 體混合以形成復(fù)合物，由于電荷-電荷相互作用該復(fù)合物基本上會(huì)自發(fā)裝配。在 大多數(shù)情況中，該復(fù)合物中遞送載體與配體的摩爾比應(yīng)大于1，通常是8:1到 16:1。
一方面，該疫苗還含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。賦形劑優(yōu)選含有(但不限 于)5-10%的蔗糖。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及在哺乳動(dòng)物中引發(fā)全身性、非免疫原特異性免 疫應(yīng)答的方法。該方法包括向哺乳動(dòng)物施用含有以下成分的疫苗的步驟(a)至少 一種可為模式識(shí)別分子(受體)所識(shí)別的配體；和(b)遞送載體。該配體與遞送載體形 成復(fù)合物或位于其內(nèi)部。施用步驟可通過任何途徑，包括(但不限于)靜脈內(nèi)、腹膜 內(nèi)、皮下、真皮下、淋巴節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、透皮、吸入、鼻內(nèi)、直腸、陰道、尿道、 局部、口服、眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)、和脊髓內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此施用步 驟聯(lián)合了靜脈內(nèi)和淋巴節(jié)內(nèi)施用。另一方面，此施用步驟聯(lián)合了腹膜內(nèi)和淋巴 節(jié)內(nèi)施用。在還有的方面，此施用步驟聯(lián)合了真皮下和淋巴節(jié)內(nèi)施用。
一方面，本發(fā)明的組合物的給藥劑量為每個(gè)哺乳動(dòng)物約l嗎-lmg。另一方面， 本發(fā)明的組合物的給藥劑量為每個(gè)哺乳動(dòng)物約l|_ig-10(Hig。在還有另一方面，本發(fā)明的組合物的給藥劑量為每個(gè)哺乳動(dòng)物約liag-lOpg。向哺乳動(dòng)物施用疫苗宜產(chǎn)生
以下結(jié)果抗該疾病的免疫力或刺激抗該疾病的效應(yīng)細(xì)胞免疫力。
附圖簡述
加入說明書并成為其中一部分的附圖闡述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且結(jié) 合說明來解釋本發(fā)明的主旨。 附圖內(nèi)容


圖1圖示說明了用模式識(shí)別受體的配體(PRRL)激活后脂質(zhì)體極大提高了天然 免疫力的激活和INF-丫的釋放。
圖2說明了用模式識(shí)別受體的配體(PRRL)激活后脂質(zhì)體改變IL-10的釋放。 圖3圖示說明了用模式識(shí)別受體的配體(PRRL)激活后脂質(zhì)體提高TNF-a的釋放。
圖4圖示說明了體外與模式識(shí)別受體的配體(PRRL)接觸后脂質(zhì)體改變了對(duì)樹 突狀細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)。
圖5說明了與脂質(zhì)-DNA復(fù)合物復(fù)合的肽或蛋白抗原。 圖6說明LANAC和"交叉敏化"。
圖7A和7B圖示說明與其它常規(guī)疫苗相比，LANAC疫苗引發(fā)CTL應(yīng)答的效力。
圖8圖示說明了作為疫苗佐劑的脂質(zhì)體提高了 PRRL引發(fā)CTL應(yīng)答的能力。 圖9圖示說明了脂質(zhì)體-PRRL復(fù)合物也可用作在肺部引發(fā)CTL應(yīng)答的有效疫 苗佐劑。
圖10說明了有效的免疫接種是否需要3部分脂質(zhì)體-抗原-核酸復(fù)合物的確定 方法。
圖IIA和IIB圖示說明用脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物免疫接種引發(fā)功能性T細(xì)胞的能力。
圖12圖示說明了脂質(zhì)體-核酸疫苗接種引發(fā)體液免疫的能力。
圖13圖示說明對(duì)用LANAC疫苗接種引發(fā)T細(xì)胞記憶應(yīng)答的評(píng)價(jià)。
圖14說明了對(duì)粘膜施用LANAC引發(fā)局部和全身性免疫應(yīng)答的能力的評(píng)價(jià)。
圖15說明了對(duì)LANAC分布至淋巴器官效率的評(píng)價(jià)和比較。發(fā)明詳述
本發(fā)明總體上涉及一種新穎的免疫接種方案和用于引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng) 答，特別是患適合于用引發(fā)免疫應(yīng)答來治療的疾病的哺乳動(dòng)物的治療性組合物。特 別適合于用本發(fā)明的方法來治療的疾病包括自身免疫疾病、癌癥、過敏性炎癥和感 染性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物特別可用于預(yù)防和治療原發(fā) 性肺癌、肺轉(zhuǎn)移性疾病、過敏性哮喘和病毒性疾病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于在損傷愈合時(shí)調(diào)節(jié)血管 生成和纖維化形成以及心血管疾病和骨病的治療。本發(fā)明的方法與組合物還可用于 調(diào)節(jié)自身免疫疾病的對(duì)象的免疫應(yīng)答。此外，按照本發(fā)明方法引發(fā)的免疫應(yīng)答可用 于免疫診斷和研究的工具以及試驗(yàn)的開發(fā)和實(shí)施。
更具體地說，本發(fā)明的基因免疫接種方法包括通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用(即， 全身性施用)治療性組合物來引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答，該組合物至少含有一種能
被模式識(shí)別分子(模式識(shí)別受體的配體(PRRL))結(jié)合的配體和一種遞送載體。免疫應(yīng) 答的引發(fā)或調(diào)節(jié)包括增強(qiáng)免疫應(yīng)答或下調(diào)(抑制)免疫應(yīng)答。
包括Toll-樣受體的模式識(shí)別受體是新發(fā)現(xiàn)的天然免疫系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)的受體家 族，所述細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞。已知的TLR的配體的例子 包括革蘭陽性細(xì)菌(TLR-2)、細(xì)菌內(nèi)毒素(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)、細(xì)菌 DNA(TLR-9)、雙鏈RNA和聚I:C(TLR-3)與酵母菌(TLR-2)。能結(jié)合胞吞模式識(shí)別 受體、清除受體或甘露糖結(jié)合受體的其它配體也可用。因此，本發(fā)明可利用任何模 式識(shí)別受體的配體，然而，為了舉例，將結(jié)合TLR配體描述本發(fā)明。
用于制備脂質(zhì)體-TLR配體復(fù)合物(LTLC)的TLR配體包括結(jié)合TLR的完整生 物體(例如，革蘭陽性細(xì)菌或酵母菌)、含有TLR配體的蛋白或糖類的部分純化的 混合物、含有TLR配體的純化的蛋白或糖類或脂質(zhì)、或能以天然配體相同的方式 結(jié)合并激活TLR的肽與其它的小分子。PRRL可與荷電的脂質(zhì)體混合而形成復(fù)合 物，由于電荷-電荷相互作用該復(fù)合物基本上會(huì)自發(fā)裝配。在大多數(shù)情況中，該復(fù) 合物中脂質(zhì)體與PRRL的摩爾比大于1，通常是8:1-16:1
本發(fā)明的治療性組合物也含有一種遞送載體。按照本發(fā)明，該遞送載體含有 能與細(xì)胞的質(zhì)膜融合的脂質(zhì)組合物，藉此使脂質(zhì)體能遞送模式識(shí)別受體的配體(PRRP)和/或核酸進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體也可在其表面摻入免疫原或?qū)饺肫鋬?nèi)部。本
發(fā)明使用的合適載體包括任何脂質(zhì)體。事實(shí)上，本發(fā)明人已證明脂質(zhì)體和PRRL
的組合其免疫剌激作用不限于脂質(zhì)體的某具體類型。本發(fā)明的一些優(yōu)選脂質(zhì)體包括 常規(guī)用于，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因遞送方法的脂質(zhì)體。 一些優(yōu)選的遞送載
體含有多層脂泡(MLV)脂質(zhì)和擠壓脂質(zhì)，但是本發(fā)明不限于這種脂質(zhì)體。
制備MLV的方法為本領(lǐng)域所熟知并描述于，例如美國專利申請系列號(hào) 09/104,759，同前。按照本發(fā)明，"擠壓的脂質(zhì)"是用類似于MLV脂質(zhì)的方法制備 的脂質(zhì)，如全文納入作為參考的Templeton等，A^wre所ofec/z.， 15:647-652 (1997) 所述，該脂質(zhì)接著要通過遞減的過濾器擠壓。單層小脂泡(SUV)脂質(zhì)也可用于本發(fā) 明的組合物與方法，與核酸組合顯示可有效引發(fā)免疫應(yīng)答(參見，美國專利申請系 列號(hào)09/104,759同前)。其它優(yōu)選的脂質(zhì)體輸送載體包括具有聚陽離子脂質(zhì)組合物 的脂質(zhì)體(即，陽離子脂質(zhì)體)。例如，陽離子脂質(zhì)體組合物包括(但不限于)任何能 與膽固醇形成復(fù)合物的陽離子脂質(zhì)體，包括(不限于)DOTMA(N-[l-(2，3-二油酰氧) 丙基]-N,N，N-氯化三甲基銨)和膽固醇；DOTAP(l，2-二油酰-3-三甲銨-丙烷)和膽固 醇；DOTIM(l-(2-(油酰氧)乙基)-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑啉鐡)禾卩膽固醇；PEI(聚乙 烯亞胺)和膽固醇與DDAB(二甲基雙十八烷基銨)和膽固醇。
本發(fā)明的脂質(zhì)體可是任何大小，包括約10-1000納米(nm)或其中的任何大小。 本發(fā)明的脂質(zhì)體成分最優(yōu)選由荷電的脂質(zhì)體組成，該脂質(zhì)體包括荷電脂質(zhì)與中性脂 質(zhì)，例如膽固醇的混合物。為使二者之間電荷-電荷相互作用最大，脂質(zhì)體的凈電 荷可視TLR配體的凈電荷而不同。例如，為制備使用細(xì)菌DNA作為TLR配體的 復(fù)合物，由于其DNA帶凈負(fù)電，可使用陽離子脂質(zhì)體。就無荷電的TLR配體而
言，由于其可靶向抗原呈遞細(xì)胞，優(yōu)選陽離子脂質(zhì)體。在大多數(shù)情況中，脂質(zhì)體也 可配制為具有適合于所需遞送途徑大小的改進(jìn)的多層脂質(zhì)體。為了清楚描述本發(fā)明
的遞送載體成分，本章節(jié)剩余的部分將使用術(shù)語脂質(zhì)體。然而，應(yīng)該理解所述的脂 質(zhì)體成分可用任何上述遞送載體取代。
可修飾本發(fā)明的脂質(zhì)體輸送載體使其靶向哺乳動(dòng)物的特定部位，藉此將本發(fā) 明的核酸分子靶向于該部位并起作用。合適的修飾包括調(diào)整遞送載體的脂質(zhì)部分的 化學(xué)成分。調(diào)整遞送載體的脂質(zhì)部分的化學(xué)成分能使該遞送載體靶向胞外或胞內(nèi)。
例如，可將某化學(xué)成分加入脂質(zhì)體的脂質(zhì)配方中以改變脂質(zhì)體的脂雙層的電荷從而使該脂質(zhì)體能與具有特定電荷特征的某些細(xì)胞融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)遞送途 徑是靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)時(shí)，由于該組合物已在免疫活性器官中提供了有效的免疫激活 而無需其它靶向機(jī)理的幫助，例如不需要通過在脂質(zhì)體中加入外源性靶向分子(即， 抗體)使其，這不是本發(fā)明脂質(zhì)體的必需成分。然而，在一些實(shí)施方案中，也可使 用靶向物質(zhì)使脂質(zhì)體耙向特定的耙細(xì)胞或組織，所述物質(zhì)是例如抗體、可溶性受體 或配體，可將這些物質(zhì)摻入脂質(zhì)體使其靶向該靶向分子所能結(jié)合的特定細(xì)胞或組
織。耙向性脂質(zhì)體描述于，例如Ho等，5/ocfem/j打，25:5500-6(1986); Ho等，J S/o/C/ze/w， 262:13979-84 (1987); Ho等，J5z'o/C/zem， 262:13973-8 (1987)和授予 Huang等的美國專利號(hào)4,957,735，每篇文獻(xiàn)均全文納入作為參考。在一個(gè)實(shí)施方 案中，如果要避免注入的脂質(zhì)體由于血漿蛋白或其它因子的調(diào)理作用而被網(wǎng)狀內(nèi)皮 系統(tǒng)細(xì)胞有效地?cái)z取，可將親水性脂質(zhì)摻入常規(guī)脂質(zhì)體的雙層以形成稱為空間穩(wěn)定 的或"密封"的脂質(zhì)體(Woodle等，說'oc/u'w5/o/ /^A^a， 1113:171-99(1992))，所 述親水性脂質(zhì)例如是神經(jīng)節(jié)苷脂(Allen等，F(xiàn)五^S丄e仏223:42-6 (1987))或聚乙二醇 (PEG)-衍生的脂質(zhì)(Klibanov等，F(xiàn)五^SIe"， 268:235-7 (1990))。這種脂質(zhì)體的變體 描述于，例如授予Unger等的美國專利號(hào)5,705,187;授予Choi等的美國專利號(hào) 5,820,873;授予Tirosh等的美國專利號(hào)5,817,856;授予Tagawa等的美國專利號(hào) 5,686,101;授予Huang等的美國專利號(hào)5,043,164和授予Woodle等的美國專利號(hào) 5,013,556，這些專利全文納入作為參考。
如上所述，本發(fā)明的疫苗或治療性組合物給予哺乳動(dòng)物的方式應(yīng)能將組合物 有效遞送至細(xì)胞、組織和/全身性遞送至哺乳動(dòng)物，由于該組合物的施用而引發(fā)免 疫原特異性免疫應(yīng)答。應(yīng)該注意的是因?yàn)楸景l(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了幾種不同的施用方式可 在無特異性靶向時(shí)也可有效地引發(fā)所需的免疫應(yīng)答，所以盡管可以使本發(fā)明的治療 性組合物特異性靶向特定的細(xì)胞或組織，但這不是必需的。合適的施用方案包括體 內(nèi)或離體的施用方案。按照本發(fā)明，將本發(fā)明的疫苗或治療性組合物施用至患者的 合適方法包括適合于將該組合物遞送給患者的任何體內(nèi)施用途徑。優(yōu)選的施用途徑 對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，這取決于有待預(yù)防或治療的疾病的類型、 所用的免疫原、和/或靶細(xì)胞群。優(yōu)選的體內(nèi)施用方法包括(但不限于)靜脈內(nèi)施用、 腹膜內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、淋巴節(jié)內(nèi)施用、冠脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用(例如頸動(dòng)脈 內(nèi))、皮下施用、透皮遞送、氣管內(nèi)施用、皮下施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、心室內(nèi)施用、吸入(例如，氣溶膠)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、眼內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、支氣管、直腸、局部、 陰道、尿道、肺部施用、導(dǎo)管插入和直接注射入組織。特別優(yōu)選在粘膜組織中引發(fā) 免疫應(yīng)答的遞送途徑。這種途徑包括支氣管、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、其它吸入途 徑、直腸、皮下、局部、透皮、陰道和尿道途徑。 一些特別優(yōu)選的施用途徑包括， 靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、透皮、吸入、鼻內(nèi)、直腸、陰 道、尿道、局部、口服、眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)和脊髓內(nèi)。如上所述，可聯(lián)用多種遞 送途徑，在一些實(shí)施方案中這種聯(lián)用可提高疫苗或組合物的治療效果。因此，本發(fā) 明考慮了兩種或多種施用途徑的任何組合，包括按照免疫接種時(shí)間表同時(shí)進(jìn)行、短 時(shí)間內(nèi)依次進(jìn)行，或在不同時(shí)間進(jìn)行(例如，初次免疫和加強(qiáng)免疫)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或真皮內(nèi)施用與淋巴節(jié)內(nèi)施用的任何一種 或多種相結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)靶細(xì)胞位于腫瘤中或腫瘤附近時(shí)，優(yōu)選的 施用途徑是直接注射進(jìn)腫瘤或腫瘤周圍的組織中。
離體給藥指在患者體外進(jìn)行的調(diào)節(jié)步驟的一部分，例如將本發(fā)明組合物加入
到取自某患者的細(xì)胞群并在該組合物接觸細(xì)胞和/或進(jìn)入細(xì)胞的條件下培養(yǎng)，再將 脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞返回給該患者。當(dāng)靶細(xì)胞可容易地從患者取出并返回時(shí)，離體方法 特別適用。
為提高對(duì)某抗原的免疫應(yīng)答，本發(fā)明的治療性組合物或疫苗可使用上述
PRRL-脂質(zhì)體復(fù)合物加上該抗原(即，疫苗)來制備。因此，在該實(shí)施方案中PRRL: 脂質(zhì)體復(fù)合物用作疫苗佐劑。對(duì)于本發(fā)明的此目的，免疫接種的抗原可包括整個(gè)微 生物或細(xì)胞、部分破裂的微生物或細(xì)胞、從微生物或細(xì)胞制備的裂解物、純化的蛋 白、衍生自微生物或細(xì)胞的糖類或脂質(zhì)或其復(fù)合混合物，或者衍生自微生物或細(xì)胞 的肽抗原。出于制備腫瘤疫苗的目的，本文中的術(shù)語"細(xì)胞"主要表示自體的或同 種異體的腫瘤細(xì)胞。"微生物"表示病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲或寄生病原體。
單用PRRL進(jìn)行免疫接種可能不是最好。例如，就某種抗原的疫苗接種而言， 簡單混合TLR配體和該抗原可能不足以引發(fā)免疫應(yīng)答，參見圖1-4。此外，施用純 化的TLR配體可導(dǎo)致其在血流中快速降解并且非常昂貴，特別是在較大的動(dòng)物和 人中。本發(fā)明的組合物利用遞送載體，例如(但不限于)脂質(zhì)體，可作為非常有效的 方法來加強(qiáng)TLR配體的效力，特別是用于免疫激活(局部與全身性)和引發(fā)T細(xì)胞 應(yīng)答。結(jié)合TLR配體施用脂質(zhì)體有兩個(gè)目的。其一，脂質(zhì)體與TLR配體的組合可通過與脂質(zhì)體的協(xié)同免疫刺激相互作用而大大加強(qiáng)TLR配體固有的免疫刺激性
能。其二，就疫苗而言，脂質(zhì)體的物理作用可使TLR配體和抗原緊密接觸。這進(jìn) 而保證了被TLR配體激活的同一抗原呈遞細(xì)胞也可將該抗原呈遞至T細(xì)胞和B細(xì) 胞。
用于免疫激活而施用的脂質(zhì)體-TLR配體復(fù)合物(LTLC)。基于以前用一種TLR 配體(細(xì)菌DNA)配制的LTLC的研究，預(yù)計(jì)用其它TLR配體制備的LTLC將具有 高度免疫刺激性。特別是，脂質(zhì)體與TLR的組合比單用任一成分的刺激性強(qiáng)得多。 然而，使用不同TLR配體可能刺激不同的TLR將導(dǎo)致數(shù)量和質(zhì)量不同的免疫應(yīng)答。 因此，可使用不同的LTLC制劑來選擇性調(diào)節(jié)所引發(fā)的免疫應(yīng)答類型。根據(jù)需要全 身性還是局部性免疫剌激，可通過各種途徑施用LTLC。例如，通過靜脈內(nèi)或腹膜 內(nèi)施用LTLC可實(shí)現(xiàn)最大的全身性免疫激活，而吸入LTLC可用于在肺部誘導(dǎo)局部 免疫激活。優(yōu)選的施用途徑是吸入、靜脈內(nèi)、口服和腹膜內(nèi)。
LTLC導(dǎo)致的免疫激活可用于治療可通過天然免疫的強(qiáng)激活而可緩解的各種 疾病。LTLC的一種治療性應(yīng)用是治療各種部位，包括肺部、皮膚、肝臟、腹膜腔 和骨髓的癌癥。第二種應(yīng)用是治療或預(yù)防感染性疾病，包括肺或氣道，或其它部位 的病毒、真菌和細(xì)菌感染。另一種應(yīng)用是預(yù)防或治療過敏性疾病，包括哮喘和過敏 性鼻炎。另一種應(yīng)用是用作或協(xié)助疫苗和/或免疫治療來產(chǎn)生造血細(xì)胞分化或造血
細(xì)胞改造。
使用LTLC和抗原的疫苗接種。LTLC的免疫刺激性能也使得它們作為非常有 效的佐劑來增強(qiáng)針對(duì)疫苗中抗原的免疫應(yīng)答。LTLC的佐劑性能增強(qiáng)對(duì)疫苗抗原的 T細(xì)胞應(yīng)答和抗體應(yīng)答。為使用LTLC制備疫苗，可將免疫接種的抗原加入預(yù)制的 LTLC中，或者可先摻入脂質(zhì)體，然后與LTR配體混合。
LTLC加上抗原制備的疫苗可以各種途徑施用，包括常規(guī)途徑(IM、 SC、 ID)。 此外，該疫苗可應(yīng)用于粘膜表面來誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答。例如，吸入LTLC疫苗可用 于引發(fā)對(duì)抗原的肺部免疫應(yīng)答。用LTLC制備的疫苗也可反復(fù)施用而不誘導(dǎo)有害的 針對(duì)疫苗中LTLC成分的免疫反應(yīng)。用于LTLC疫苗中的抗原包括蛋白質(zhì)、肽、糖 類、脂蛋白或上述任何或所有物質(zhì)的復(fù)合混合物。這些抗原可得自細(xì)胞裂解物、病 原生物的裂解物或這些細(xì)胞或生物的純化或合成的組分。此外，也可使用正常細(xì)胞 或細(xì)胞蛋白來制備疫苗以引發(fā)抗正常細(xì)胞蛋白的治療性交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答。后一種應(yīng)用的例子包括用于治療性調(diào)節(jié)早老性癡呆的抗3淀粉樣蛋白的免疫接種。該 疫苗也可用于抵御機(jī)體某特定部位，例如(但不限于)大腦、腎臟或關(guān)節(jié)中異常蛋白 產(chǎn)生所導(dǎo)致的疾病。
使用遞送載體，例如(但不限于)脂質(zhì)體，是一種加強(qiáng)TLR配體的效力，特別
是免疫激活(局部與全身性)和引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的有效方法。與TLR配體結(jié)合的脂 質(zhì)體有兩個(gè)目的。其一，脂質(zhì)體與TLR配體的組合可通過與脂質(zhì)體的協(xié)同免疫刺 激相互作用而大大加強(qiáng)TLR配體固有的免疫刺激性能。其二，就疫苗而言，脂質(zhì) 體的物理作用可使TLR配體和抗原緊密接觸。進(jìn)而保證了被TLR配體激活的同一 個(gè)抗原呈遞細(xì)胞也可將該抗原呈遞至T細(xì)胞和B細(xì)胞。
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)當(dāng)PRRL與脂質(zhì)體聯(lián)合經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射施用 時(shí)，在體內(nèi)具有高度免疫剌激性。所引發(fā)的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度遠(yuǎn)大于單用配體或脂質(zhì) 體(參見實(shí)施例l-4)所誘導(dǎo)的應(yīng)答，并且取決于該復(fù)合物是靜脈內(nèi)還是腹膜內(nèi)施用。 因此，當(dāng)本發(fā)明的PRRL-脂質(zhì)復(fù)合物經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用時(shí)，可誘導(dǎo)強(qiáng)的、全 身性非抗原特異性的免疫應(yīng)答從而導(dǎo)致體內(nèi)多種不同的免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活。本發(fā) 明人還發(fā)現(xiàn)通過本發(fā)明方法施用的LTLC所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答具有強(qiáng)有力的抗腫瘤、 抗過敏和抗病毒性能。本發(fā)明治療性組合物所誘導(dǎo)的免疫激活在數(shù)量上強(qiáng)于 LPS(內(nèi)毒素)或聚I/C(一種典型的抗病毒免疫應(yīng)答誘導(dǎo)劑)所誘導(dǎo)的。此外，所誘導(dǎo) 的免疫刺激類型(例如，由誘導(dǎo)的細(xì)胞因子模式分析所示的特征)在質(zhì)上也不同于 LPS或聚I/C所誘導(dǎo)的。最后，該作用看來與使用病毒遞送系統(tǒng)所產(chǎn)生的補(bǔ)體級(jí)聯(lián) 反應(yīng)的問題無關(guān)。
然而現(xiàn)在我們對(duì)這些LTLC佐劑發(fā)揮效力的免疫學(xué)機(jī)理知之甚少。荷電脂質(zhì) 體的胞吞很可能將抗原和TLR-配體引入抗原呈遞細(xì)胞的發(fā)生抗原加工和TLR激活 的內(nèi)體區(qū)室中。可探索將該獨(dú)特佐劑系統(tǒng)引發(fā)強(qiáng)有力T細(xì)胞應(yīng)答的性能用作研究 不同TLR對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的激活和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的工具。首先評(píng)價(jià)不同 LTLC對(duì)天然免疫力的作用，然后使用模型抗原和耶爾森菌蛋白來引發(fā)抗耶爾森鼠 疫的適應(yīng)性和保護(hù)性免疫力。這些研究提高了我們對(duì)疫苗佐劑和TLR激活總體作 用的基礎(chǔ)知識(shí)，并且也有助于開發(fā)更有效的抗氣溶膠病原體，例如耶爾森氏菌的粘 膜疫苗。
當(dāng)施用途徑是靜脈內(nèi)時(shí)，免疫接種(即，免疫應(yīng)答的引發(fā))的基本部位是肺部，肺是含有大量效應(yīng)細(xì)胞(例如，T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)和抗原呈遞細(xì)胞(例如，
巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)的免疫學(xué)非?；钴S的器官。類似地，當(dāng)施用途徑是腹膜內(nèi) 時(shí)，免疫接種的基本部位是脾臟和肝臟，二者也是免疫學(xué)非?；钴S的器官。
由于通過本發(fā)明方法施用的TLR配體:脂質(zhì)體復(fù)合物的出乎意料的免疫刺激 性能，因?yàn)榭杀苊馐褂脗鹘y(tǒng)佐劑，本發(fā)明的基因免疫接種方法在人類治療中特別有 用。既然一些傳統(tǒng)佐劑可能有毒(例如，弗氏佐劑和其它細(xì)菌細(xì)胞壁成分)并且其它 佐劑效果較差(例如，鋁鹽和鈣鹽)，這是本發(fā)明方法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。此外，當(dāng)前美國 唯一批準(zhǔn)可用于人的佐劑是鋁鹽、氫氧化鋁和磷酸鋁，它們均不刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免 疫力。此外，如以下實(shí)施例所示，宣稱具有佐劑作用的傳統(tǒng)裸DNA遞送在刺激非 抗原特異性免疫應(yīng)答的效率方面遠(yuǎn)低于本發(fā)明的組合物。最后，與施用基于病毒載 體的基因疫苗不同，本發(fā)明的方法可反復(fù)遞送本文所述的治療性組合物而不會(huì)產(chǎn)生 與免疫應(yīng)答的某些非特異性作用相關(guān)的結(jié)果，例如補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本發(fā)明人利用上述方法可產(chǎn)生非抗原特異性免 疫刺激作用的優(yōu)點(diǎn)開發(fā)出更強(qiáng)有力的基因免疫接種策略，該策略使編碼與LTLC形 成復(fù)合物的免疫原和/或細(xì)胞因子的核酸序列(即，操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列)表達(dá) 于哺乳動(dòng)物組織中。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)的免疫原引發(fā)的抗原特異性免疫應(yīng)答 與LTLC引發(fā)的強(qiáng)非抗原特異性免疫應(yīng)答相結(jié)合導(dǎo)致該疫苗的體內(nèi)效力顯著高于 前述基因疫苗(參見實(shí)施例5、 6b-c、 9)。共同施用編碼細(xì)胞因子的核酸分子還可再 次提高該作用，這是因?yàn)榧?xì)胞因子表達(dá)在組織中。
此外，就本發(fā)明組合物靜脈內(nèi)施用而言，在癌癥患者中，肺是轉(zhuǎn)移性腫瘤擴(kuò) 散的主要部位。因?yàn)楸景l(fā)明的方法能誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答來縮小或消除原發(fā)性腫 瘤并控制己存在的任何轉(zhuǎn)移性腫瘤，包括大的轉(zhuǎn)移性腫瘤，它在患有癌癥的哺乳動(dòng) 物中特別成功。因此，不同于前述的基因免疫接種方法，本發(fā)明的基因免疫接種方 法和組合物能引發(fā)全身性、非抗原特異性免疫應(yīng)答(類似于傳統(tǒng)佐劑)并且當(dāng)該核酸 編碼腫瘤抗原時(shí)，可在哺乳動(dòng)物中引發(fā)強(qiáng)的抗原特異性肺內(nèi)(靜脈內(nèi)施用，參見實(shí) 施例9)免疫應(yīng)答，該應(yīng)答能在體內(nèi)有效地顯著縮小或消除已有腫瘤。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是引發(fā)哺乳動(dòng)物的全身性、非抗原特異性免疫應(yīng)答的 方法。該方法通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用至哺乳動(dòng)物含有以下物質(zhì)的治療性組合物 (a)遞送載體；和(b)—種遞送載體形成復(fù)合物或位于其內(nèi)部的模式識(shí)別受體的配體(PRRL)。通過本發(fā)明的方法施用這種組合物可在哺乳動(dòng)物中引發(fā)全身性、非抗原 特異性免疫應(yīng)答。如上所述，該免疫應(yīng)答還具有強(qiáng)的、全身性抗腫瘤、抗過敏性炎 癥(S卩，保護(hù)性)和抗病毒性能。
用于本發(fā)明方法的治療性組合物包含PRRL的組合物，所述PRRL含有TLR-配體，例如(但不限于)革蘭陽性細(xì)菌或酵母菌、含有TLR配體的蛋白或糖類的部 分純化的混合物、含有TLR配體的純化的蛋白或糖類或脂質(zhì)、或能以天然配體相 同的方式結(jié)合并激活TLR的肽與其它小分子?？蓪LR配體與荷電的脂質(zhì)體混合 而形成復(fù)合物，由于電荷-電荷相互作用該復(fù)合物基本上會(huì)自發(fā)裝配。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可改進(jìn)引發(fā)免疫應(yīng)答的本發(fā)明方法使之包括 經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用哺乳動(dòng)物的含有以下物質(zhì)的治療性組合物(a)—種PRRL; (b)遞送載體；和(c)含有編碼某免疫原的核酸序列的重組核酸分子。根據(jù)本發(fā)明， 雖然本文的術(shù)語"抗原"主要用于描述引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答(即，抗原性) 的蛋白，而術(shù)語"免疫原"主要用于描述在體內(nèi)引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的蛋 白，這樣向哺乳動(dòng)物施用此免疫原可提高哺乳動(dòng)物組織對(duì)所遇到的相同或相似蛋白 的免疫原的特異性(抗原特異性)免疫應(yīng)答，因而術(shù)語"免疫原"和"抗原"可互換 使用。根據(jù)本發(fā)明，免疫原或抗原可以是能引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的天然存 在或合成蛋白的任何部分。因此，抗原或免疫原的大小可小至約5-12個(gè)氨基酸或 大至全長蛋白，包括多聚體和融合蛋白。本發(fā)明所用的術(shù)語"免疫原"和"抗原" 不包括超抗原。超抗原在本文中定義為專用術(shù)語。更具體地說，超抗原是能與MHC 分子的胞外部分(即，不在肽結(jié)合溝槽中)結(jié)合而形成MHC:超抗原復(fù)合物的蛋白家 族中的一種分子。當(dāng)TCR與MHC:超抗原復(fù)合物結(jié)合時(shí)可修飾T細(xì)胞的活性。在 某些情況中，MHC:超抗原復(fù)合物可具有促有絲分裂作用(即，刺激T細(xì)胞增殖的能 力)或抑制作用(即，消除T細(xì)胞亞組)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫原選自腫瘤抗原、過敏原或感染性疾病病原 體的抗原(即，病原體抗原)。在該實(shí)施方案中，所述核酸序列操作性連接于轉(zhuǎn)錄控 制序列，如此免疫原可在哺乳動(dòng)物的組織中表達(dá)，藉此在該哺乳動(dòng)物中引發(fā)上述非 特異性免疫應(yīng)答和免疫原特異性免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明方法的其它實(shí)施方案中，要施用至哺乳動(dòng)物的治療性組合物含有編 碼細(xì)胞因子的分離的核酸分子(本文中也稱為"編碼細(xì)胞因子的核酸分子")，其中該核酸分子操作性連接于一條或多條轉(zhuǎn)錄控制序列。當(dāng)施用是經(jīng)靜脈內(nèi)施用時(shí)，向 哺乳動(dòng)物施用這種治療性組合物的結(jié)果是編碼細(xì)胞因子的核酸分子在哺乳動(dòng)物肺 組織中表達(dá)；并且當(dāng)施用是腹膜內(nèi)施用時(shí)，編碼細(xì)胞因子的核酸分子在哺乳動(dòng)物的 脾臟或肝臟組織中表達(dá)。應(yīng)該注意的是術(shù)語"一種"實(shí)際表示一種或多種，例如一 種細(xì)胞因子表示一種或多種細(xì)胞因子。因此，術(shù)語"一種"、"一種或多種"和"至 少一種"在本文可互換使用。編碼細(xì)胞因子的核酸序列可作為編碼免疫原的核酸序 列存在于同一個(gè)重組核酸分子上或不同的重組核酸分子上。
如下文將詳細(xì)討論的，用于本發(fā)明方法的組合物含有(a)遞送載體；(b)—種 TLR配體。此外，該組合物還可含有核酸分子，這種核酸分子包含(l)未操作性 連接于轉(zhuǎn)錄控制序列的分離的核酸序列；(2)分離的非編碼核酸序列；(3)編碼操作 性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列的免疫原的分離重組核酸分子，其中所示復(fù)合物中脂質(zhì)體與 TLR摩爾比大于1，通常約是8:1-15:1，，復(fù)合物的核酸:脂質(zhì)體比例約1:1-1:64;和 /或(4)編碼細(xì)胞因子的分離的重組核酸分子。這種組合物的各種組分詳述于下文。
引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答可有效治療各種醫(yī)學(xué)疾病，特別是癌癥、過敏性炎 癥和/或感染性疾病。本文使用的術(shù)語"引發(fā)"可與術(shù)語"激活"、"剌激"、"產(chǎn)生" 或"上調(diào)"互換使用。根據(jù)本發(fā)明，在哺乳動(dòng)物中"引發(fā)免疫應(yīng)答"表示具體控制 或影響免疫應(yīng)答的活性，包括激活免疫應(yīng)答、上調(diào)免疫應(yīng)答、提高免疫應(yīng)答和/或 改變免疫應(yīng)答，例如通過引發(fā)某種類型的免疫應(yīng)答進(jìn)而使哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的主要 類型從有害或效果差的類型變?yōu)橛幸婊虮Ｗo(hù)性的類型。例如，在Th2型應(yīng)答(占優(yōu)) 的哺乳動(dòng)物中引發(fā)Thl型應(yīng)答可將免疫應(yīng)答的整體效果從有害改變?yōu)橛幸?，反?亦然。引發(fā)能改變哺乳動(dòng)物整體免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)答，在治療過敏性炎癥、分枝桿 菌感染或寄生蟲感染中尤其有用。根據(jù)本發(fā)明，與Thl型T淋巴細(xì)胞(或Thl淋巴 細(xì)胞)的活性相比，以Th2型免疫應(yīng)答(占優(yōu))為特征的疾病(或者稱為Th2型免疫應(yīng) 答)可分類為與輔助T淋巴細(xì)胞亞組(本領(lǐng)域稱為Th2型T淋巴細(xì)胞或Th2淋巴細(xì) 胞)的活性占優(yōu)相關(guān)的疾病。根據(jù)本發(fā)明，Th2型T淋巴細(xì)胞的特征在于其能產(chǎn)生 一種或多種細(xì)胞因子，統(tǒng)稱為Th2型細(xì)胞因子。如本文使用的Th2型細(xì)胞因子包 括白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-9(IL-9)、白介素 -IO(IL-IO)、白介素-13(IL-13)和白介素-15(IL-15)。相反，Thl型淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì) 胞因子包括IL-2和IFN?；蛘?，有時(shí)Thl型免疫應(yīng)答的特征在于能產(chǎn)生IgG2a或IgG3同種型抗體(人的等價(jià)抗體是IgGl、 IgG2或IgG3)，但是有時(shí)Th2型免疫應(yīng)答 的特征在于主要產(chǎn)生包括IgGl(人的等價(jià)物約是IgG4)和IgE的同種型抗體。
本發(fā)明的方法優(yōu)選引發(fā)抗腫瘤、抗過敏原或抗感染性疾病病原體的免疫應(yīng)答。 具體地說在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答表示調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)免疫力(即，輔助T細(xì)胞(Th) 活性、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性、NK細(xì)胞活性)和/或體液免疫(即，B細(xì)胞/ 免疫球蛋白活性)，包括Thl型和/或Th2型細(xì)胞和/或體液免疫活性。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，本發(fā)明被能提高引發(fā)抗腫瘤、過敏原或感染性疾病病原體的效應(yīng)細(xì)胞免 疫力。本文使用的效應(yīng)物細(xì)胞免疫力表示增加組合物所施用至的哺乳動(dòng)物中效應(yīng)細(xì) 胞的數(shù)量和/或活性。具體說，T細(xì)胞活性表示增加腫瘤細(xì)胞或病原體區(qū)域中的T 細(xì)胞數(shù)量和/或活性。類似地，NK細(xì)胞活性表示增加NK細(xì)胞的數(shù)量和/或活性。 在本發(fā)明的方法中，效應(yīng)細(xì)胞免疫力可是全身性或局限于哺乳動(dòng)物中該治療性組合 物主要靶向的區(qū)域(g卩，雖然本發(fā)明的組合物在身體的其它位點(diǎn)也是有效的，靜脈 內(nèi)施用就耙向肺內(nèi)而腹膜內(nèi)施用就耙向脾臟或肝臟內(nèi))中引發(fā)。根據(jù)本發(fā)明，效應(yīng) 細(xì)胞包括輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或 天然殺傷細(xì)胞。例如，本發(fā)明的方法可用于增加哺乳動(dòng)物中殺傷細(xì)胞的數(shù)量，當(dāng)衍 生自腫瘤細(xì)胞、過敏原或病原體的抗原一起呈遞給所述殺傷細(xì)胞時(shí)，它們能殺死靶 細(xì)胞或釋放細(xì)胞因子。
根據(jù)本發(fā)明，引發(fā)非抗原特異性免疫應(yīng)答(即，非特異性免疫應(yīng)答)包括剌激非 特異性免疫細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞)，以及誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，特別是 產(chǎn)生IFN，和非特異性激活效應(yīng)細(xì)胞，例如NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和/或T淋巴細(xì) 胞。更具體地說，本發(fā)明的方法和組合物所引發(fā)的全身性、非抗原特異性免疫應(yīng)答 可導(dǎo)致哺乳動(dòng)物中天然殺傷(NK)細(xì)胞的功能和數(shù)量提高，其中NK功能的提高定 義為NK細(xì)胞的功能水平與未用本發(fā)明組合物免疫接種的哺乳動(dòng)物或經(jīng)非全身性 (即，非靜脈內(nèi)、非腹膜內(nèi))途徑施用本發(fā)明組合物(其中所遞送的TLR配體的量與 TLR配體:脂質(zhì)體的比例是相同的)的哺乳動(dòng)物的NK細(xì)胞功能水平相比，有可檢測 的提高。NK功能(即活性)可通過對(duì)合適的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)來測定。NK細(xì) 胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)的例子見實(shí)施例l(圖1)。可通過流式細(xì)胞術(shù)分析測量各種器官 (包括脾臟、淋巴結(jié)、肺和肝臟)的細(xì)胞NK1.1/CD69分子的上調(diào)來衡量NK細(xì)胞的 激活(參見實(shí)施例4，圖4)。此外，本發(fā)明的方法和組合物引發(fā)的全身性非抗原特異性免疫應(yīng)答可增加哺乳動(dòng)物各種器官(包括脾臟和肺)中NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-y， 其中IFN產(chǎn)生的增加定義為IFN產(chǎn)生的水平與未施用本發(fā)明組合物的哺乳動(dòng)物或 以非全身性途徑施用本發(fā)明組合物(其中遞送的TLR配體的量與TLR配體:脂質(zhì)體 的比例是相同的)的哺乳動(dòng)物NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFNi4目比，有可檢測的增加。IFN-y 的產(chǎn)生可通過IFN-yELISA(本領(lǐng)域已知，實(shí)施例1，圖l)測定。通過本發(fā)明方法施 用的本發(fā)明組合物優(yōu)選能誘導(dǎo)血液、脾臟或肺的每5X106個(gè)單核細(xì)胞產(chǎn)生約 100pg/ml的IFN-y、更優(yōu)選至少產(chǎn)生約500pg/ml的IFN-y、還要優(yōu)選至少產(chǎn)生約 1000pg/ml的IFN-y、再優(yōu)選至少產(chǎn)生約5000pg/ml的IFN-y、甚至更優(yōu)選產(chǎn)生約 10,000pg/ml的IFN-y。
因此，本發(fā)明的方法優(yōu)選能在易于引發(fā)免疫應(yīng)答的哺乳動(dòng)物中引發(fā)保護(hù)該哺 乳動(dòng)物免受疾病影響和/或預(yù)防疾病發(fā)生的免疫應(yīng)答，其中該疾病包括癌癥、過敏 性炎癥和/或感染性疾病。本文使用的短語"保護(hù)其免受疾病影響"表示減輕疾病 的癥狀、降低疾病的發(fā)生率和/或降低疾病的嚴(yán)重性。當(dāng)將本發(fā)明的組合物施用至 哺乳動(dòng)物時(shí)，保護(hù)哺乳動(dòng)物指本發(fā)明的治療性組合物預(yù)防疾病發(fā)生和/或治愈或緩 解疾病癥狀、征兆或病因的能力。因此，保護(hù)哺乳動(dòng)物免受疾病影響包括預(yù)防疾病 發(fā)生(預(yù)防性治療)和治療患有疾病的哺乳動(dòng)物(治療性治療)。具體說，保護(hù)哺乳動(dòng) 物免受疾病影響是一些情況下通過誘導(dǎo)有益或保護(hù)性免疫應(yīng)答并抑制(例如，降低、 抑制或阻斷)過度活躍或有害的免疫應(yīng)答從而在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)。 術(shù)語"疾病"表示哺乳動(dòng)物正常健康狀況的任何異常變化，包括疾病癥狀已存在以 及異常(例如，感染、基于突變、遺傳缺陷等)已發(fā)生但癥狀還未出現(xiàn)等情況。
更具體地說，當(dāng)通過本發(fā)明的方法將本文所述治療性組合物施用至哺乳動(dòng)物
時(shí)，宜產(chǎn)生以下結(jié)果疾病緩解、疾病消除、腫瘤或疾病相關(guān)的損傷減少、腫瘤或 疾病相關(guān)的損傷消除、防止原發(fā)性疾病導(dǎo)致的繼發(fā)癥(例如原發(fā)性癌癥的轉(zhuǎn)移)、預(yù) 防了疾病和激或抵御該疾病的效應(yīng)細(xì)胞免疫。
用于本發(fā)明方法的治療性組合物中的一種成分是核酸序列，包括編碼和/或非 編碼核酸序列與寡核苷酸(下述)和較大的核酸序列。雖然短語"核酸分子"主要從 物理上指核酸分子，而短語"核酸序列"主要表示該核酸分子上的核苷酸序列，但 該兩短語可互換使用。本文使用的"編碼的"核酸序列表示至少編碼某肽或蛋白質(zhì) 一部分的核酸序列(例如一部分開放讀框)，更具體指可表示操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列的編碼某肽或蛋白質(zhì)的核酸序列，從而可表達(dá)該肽或蛋白質(zhì)。"非編碼的"核 酸序列表示不編碼某肽或蛋白質(zhì)任何部分的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，"非編碼"核 酸可含有轉(zhuǎn)錄單元的調(diào)節(jié)區(qū)域，例如啟動(dòng)子區(qū)域。術(shù)語"空載體"可與術(shù)語"非編 碼"載體互換使用，具體表示沒有某肽或蛋白質(zhì)的編碼部分的核酸序列，例如沒有 基因插入物的質(zhì)粒載體。短語"操作性連接"表示將其核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列相 連，其連接方式可使該分子轉(zhuǎn)染(即，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)入宿主細(xì)胞中能表達(dá)。因 此，"非操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列"的核酸序列表示包含編碼和非編碼核酸序列 二者的任何核酸序列，但所述序列與轉(zhuǎn)錄序列的連接方式不能使該分子轉(zhuǎn)染入宿主 細(xì)胞時(shí)可表達(dá)。應(yīng)該注意的是該短語未排除在該核酸分子中存在轉(zhuǎn)錄控制序列。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性組合物中所含的核酸序列摻入 重組核酸分子并編碼免疫原和/或細(xì)胞因子。如下所詳述的，優(yōu)選的免疫原包括腫 瘤抗原、過敏原或感染性疾病病原體的抗原(即，病原體抗原)。術(shù)語"重組分子" 主要表示操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列的核酸分子或核酸序列，但該短語可與施用于 哺乳動(dòng)物的"核酸分子"互換使用。
根據(jù)本發(fā)明，分離的，或生物學(xué)純的核酸分子或核酸序列是從其天然環(huán)境中 取得的核酸分子或核酸序列。因此，"分離的"或"生物學(xué)純的"無需反映該核酸
分子被純化的程度。用于本組合物的分離的核酸分子可包括DNA、 RNA或它們的 衍生物。寡核苷酸的核酸序列一般約1-500個(gè)核苷酸，更常見至少長約5個(gè)核苷酸， 或以整數(shù)(例如，6、 7、 8、 9、 10等)遞增直至約500個(gè)核苷酸的任何長度。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的寡核苷酸包括含有在哺乳動(dòng)物中具有免疫原性的 胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)基序的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該寡核苷酸(例如CpG) 是脫甲基的。DNA中CpG基序的甲基化涉及基因表達(dá)的控制和其它幾種漸成發(fā)育 (epigenk)作用。.甲基化抑制了含有CpG的細(xì)菌或病毒DNA的免疫刺激性能。本 領(lǐng)域還知道在某特定序列中含有未甲基化的CpG基序的細(xì)菌DNA與合成的寡聚 脫氧核苷酸可激活脊椎動(dòng)物免疫細(xì)胞。
本發(fā)明的PRRL:核酸:脂質(zhì)復(fù)合物的免疫激活作用可通過真核以及原核生物的 核酸誘導(dǎo)，這表明不論核酸的來源，PRRL:核酸:脂質(zhì)復(fù)合物具有的某些性能是固 有的免疫激活。因此，由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)核酸的來源對(duì)核酸-脂質(zhì)復(fù)合物引發(fā)免疫 應(yīng)答的能力無顯著影響，故核酸分子可衍生自任何來源，包括哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲或病毒來源。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明治療性組合物的核酸分子 不是細(xì)菌核酸分子。
分離的編碼免疫原(例如，腫瘤抗原、過敏原或病原體抗原)或編碼細(xì)胞因子的 核酸分子可得自其天然來源，所述核酸分子可以是能編碼以下物質(zhì)的整個(gè)(即完全 的)基因或其一部分具有B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表位的腫瘤抗原、具有B細(xì)胞和/或
T細(xì)胞表位的過敏原、具有B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表位的病原體抗原、或者能與其互 補(bǔ)受體結(jié)合的細(xì)胞因子蛋白。核酸分子也可使甩重組DNA技術(shù)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆)或化學(xué)合成來生產(chǎn)。核酸分子包括天然核酸分子及其同源物， 包括(但不限于)天然等位基因變體和修飾的核酸分子，修飾包括核酸分子中的核苷 酸插入、刪除、取代和/或反轉(zhuǎn)，修飾的方式基本上不會(huì)影響核酸分子編碼本發(fā)明 方法所用的免疫原或細(xì)胞因子的能力。
核酸分子同源物可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多方法來產(chǎn)生(參見，例如 Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual), 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)，該文獻(xiàn)全文納入作為參考。例如，可使用各種技術(shù) 修飾核酸分子，包括(但不限于)經(jīng)典的誘變技術(shù)和重組DNA技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變、 化學(xué)處理核酸分子來誘導(dǎo)突變、核酸片段的限制性內(nèi)切酶切割、核酸片段的連接、 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和/或核酸序列所選擇區(qū)域的誘變、寡核苷酸混合物的合 成并連接各組混合物來"構(gòu)建"核酸分子的混合物及這些方法的組合。核酸分子同 源物可通過篩檢該核酸所編碼蛋白的功能(例如，合適的腫瘤抗原、過敏原或病原 體抗原免疫原性、或細(xì)胞因子活性)從修飾的核酸混合物中選擇。篩檢免疫原性(例 如腫瘤抗原、過敏原或病原體抗原的免疫原性、或細(xì)胞因子活性)的技術(shù)是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的，包括各種體外和體內(nèi)試驗(yàn)。
如前所述，本發(fā)明的免疫原或細(xì)胞因子蛋白包括(但不限于)由具有全長免疫原 或細(xì)胞因子編碼區(qū)域的核酸分子所編碼的蛋白；由具有部分免疫原區(qū)域的核酸分子 編碼的蛋白，所述區(qū)域含有至少一種T細(xì)胞表位和/或至少一種B細(xì)胞表位；由具 有細(xì)胞因子編碼區(qū)域的核酸分子編碼的能與細(xì)胞因子互補(bǔ)受體結(jié)合的蛋白；融合蛋 白和含有不同的免疫原和或細(xì)胞因子相組合的嵌合蛋白。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括編碼至少全長免疫原(包括腫瘤抗原、過敏原、病 原體抗原或這種免疫原的同源物)一部分的分離的核酸。本文使用的"某免疫原的至少一部分"表示含有T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位的免疫原蛋白的一部分。在一個(gè)實(shí) 施方案中，編碼免疫原的核酸分子包括這種免疫原的整個(gè)編碼區(qū)域。本文使用的免 疫原同源物是具有的氨基酸序列充分類似于天然免疫原氨基酸序列(即，天然存在 的、內(nèi)源性或野生型免疫原)的蛋白，即編碼該同源物的核酸序列所編碼的蛋白能 引發(fā)對(duì)該天然免疫原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的編碼腫瘤抗原的核酸分子編碼的抗原，可以是具有T細(xì)胞識(shí)別表位
的腫瘤抗原、具有B細(xì)胞識(shí)別表位的腫瘤抗原、僅由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原和
腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞都表達(dá)的腫瘤抗原。用于本發(fā)明方法的腫瘤抗原優(yōu)選至少含
有一種T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位。因此，在哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)該腫瘤抗原可引發(fā) 哺乳動(dòng)物組織產(chǎn)生對(duì)該腫瘤的腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答。如上所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 施用本發(fā)明的核酸:脂質(zhì)復(fù)合物可在體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的全身性、非抗原特異性、抗腫 瘤應(yīng)答，并且該作用提高了對(duì)該核酸分子表達(dá)的腫瘤抗原的抗原特異性免疫應(yīng)答。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼選自以下癌癥的腫瘤抗原黑
色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、頭頸癌、甲狀腺癌、軟組織肉瘤、骨癌、睪丸癌、 前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮膚癌、腦癌、血管肉瘤、血管肉瘤、肥大細(xì)胞瘤、
原發(fā)性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃腸癌、腎細(xì)胞癌、造血瘤(hematopoietic ne叩lasias) 和它們的轉(zhuǎn)移性癌。
本發(fā)明的編碼病原體抗原的核酸分子編碼感染性疾病病原體的抗原，這些抗 原包括含含有T細(xì)胞識(shí)別的表位病原體抗原、B細(xì)胞識(shí)別表位的病原體抗原、僅由 病原體編碼的病原體抗原和病原體和其它細(xì)胞都表達(dá)的病原體抗原。用于本發(fā)明的 病原體抗原優(yōu)選至少含有一種T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位并且僅由病原體表達(dá)(即受感 染哺乳動(dòng)物的內(nèi)源性組織不能表達(dá))。因此，病原體抗原在哺乳動(dòng)物某組織中的表 達(dá)可在哺乳動(dòng)物該組織中及全身引發(fā)對(duì)該病原體的抗原特異性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的病原體免疫原包括(但不限于)細(xì)菌、病毒、寄生蟲、朊病毒、立克次 氏體或真菌表達(dá)的免疫原。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選病原體免疫原包括導(dǎo)致哺乳動(dòng)物
慢性或急性感染性疾病的免疫原。例如，用于本發(fā)明方法的一些優(yōu)選病原體免疫原 是導(dǎo)致慢性感染的病原體的免疫原，包括(但不限于)免疫缺陷病毒(HIV)、結(jié)核分 枝桿菌(Myco6acfen'wm fw6ercw/oy/力、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、利氏曼蟲、弓型蟲 (7bxo; /fl:ywa)、隱球菌(O7;7tococcw)、芽生菌(5/aWo附少ce力、組織胞漿菌(幼'Wo; A^ma)和假絲酵母(Ca^fe^)。也包括能導(dǎo)致慢性感染的抗生素耐藥性細(xì)菌菌株，例如葡 萄球菌OS鄉(xiāng)/y;/ococ，)、假單胞菌(尸se油,腿)、鏈球菌,ep/ococ，)、腸球菌 (^^^00^)和沙門氏菌(&^0加//")。此外，對(duì)于抗急性疾病的免疫接種，可從 中獲得免疫原的優(yōu)選病原體包括(但不限于)炭疽桿菌(5aa7/w""Arac&)、弗朗西斯 氏菌(尸ra"c/se〃a)、耶爾森氏菌(l^vye"/a)、巴斯德氏菌(尸aWewe〃a)、天花痘病毒 (small pox)與其它革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌病原體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法或組合物中的病原體抗原包 括病毒的免疫原。如上所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物和方法在抵御病毒感染 tnn口'汀々M木ir"r'付力U"/tl。'寸寸力u定3州本次B力刀i^:施用ti、j KM寸f次股勺PRRL:加;貝復(fù) 合物進(jìn)一步復(fù)合以在體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的全身性、非抗原特異性、抗病毒應(yīng)答而不管該 核酸是否編碼或表達(dá)某免疫原。當(dāng)操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列的核酸序列確實(shí)編碼 某病毒抗原從而在哺乳動(dòng)物某組織中表達(dá)該病毒抗原時(shí)，本發(fā)明的組合物還可引發(fā) 除上述全身性免疫應(yīng)答外的強(qiáng)烈的病毒抗原特異性免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述病毒的免疫原可選自人免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括編碼全長過敏原至少的一部分或該過敏原蛋白 同源物的過敏原編碼核酸分子，并且包括含有T細(xì)胞識(shí)別表位的過敏原、具有B 細(xì)胞識(shí)別表位的過敏原與在過敏炎癥相關(guān)疾病中作為致敏劑的過敏原。這些過敏原 可經(jīng)吸入、皮下或口服施用。用于本發(fā)明治療性組合物的優(yōu)選過敏原包括植物花粉、 藥物、食物、毒液、昆蟲排泄物、霉菌、動(dòng)物液體、動(dòng)物毛發(fā)和動(dòng)物皮屑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括編碼全長細(xì)胞因子的至少一部分或該細(xì)胞因子 蛋白同源物的細(xì)胞因子編碼核酸分子。本文使用的"細(xì)胞因子的至少一部分"表示 具有細(xì)胞因子活性并能與細(xì)胞因子受體結(jié)合的細(xì)胞因子蛋白的一部分。編碼細(xì)胞因 子的核酸分子優(yōu)選含有細(xì)胞因子的整個(gè)編碼區(qū)域。本文使用的細(xì)胞因子同源物指其 氨基酸序列充分類似于天然細(xì)胞因子氨基酸序列的蛋白，從而使之具有細(xì)胞因子活 性(即，天然存在的或野生型細(xì)胞因子相關(guān)的活性)。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞因子包括能 影響其它細(xì)胞生物學(xué)功能的蛋白。受細(xì)胞因子影響的生物學(xué)功能包括(但不限于)細(xì) 胞生長或停止、細(xì)胞分化或細(xì)胞死亡。本發(fā)明的細(xì)胞因子優(yōu)選能與細(xì)胞表面的特異 性受體結(jié)合，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。
本發(fā)明的編碼細(xì)胞因子的核酸分子編碼能影響細(xì)胞的生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，所述細(xì)胞包括(但不限于)淋巴細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、肥大細(xì)胞、天 然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì) 胞、朗格漢斯細(xì)胞、在任何細(xì)胞來源的肉芽腫和腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，更優(yōu)選間 充質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突 狀細(xì)胞。
本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞因子的(編碼)核酸分子編碼造血生長因子、白介素、干擾素、 免疫球蛋白超家族分子、腫瘤壞死因子家族分子和/或趨化因子(即，調(diào)節(jié)細(xì)胞(特別 是吞噬細(xì)胞)的遷移與激活的蛋白)。更優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞因子(編碼)核酸分子編碼 白介素。還要優(yōu)選的用于本發(fā)明方法的細(xì)胞因子核酸分子編碼白介素-2(IL-2)、白
介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)和/或干擾素 -Y(IFN-Y)。最優(yōu)選的用于本發(fā)明方法的細(xì)胞因子(編碼)核酸分子編碼白介素 -2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-18(IL-18)和/或干擾素-Y(IFN-力。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白，本發(fā)明要應(yīng)用的細(xì)胞因子衍生自所有類型的哺乳動(dòng) 物。從中獲得細(xì)胞因子的優(yōu)選哺乳動(dòng)物包括小鼠、人和家養(yǎng)寵物(例如。狗、貓)。 從中獲得細(xì)胞因子的更優(yōu)選的哺乳動(dòng)物包括狗和人。從中獲得細(xì)胞因子的還要優(yōu)選 的哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明編碼細(xì)胞因子的核酸分子優(yōu)選衍生自與待治療哺乳動(dòng)物相同種類的哺 乳動(dòng)物。例如，衍生自犬(即，狗)核酸分子的編碼細(xì)胞因子的核酸分子優(yōu)選用于治 療犬。本發(fā)明包括操作性連接于一條或多條轉(zhuǎn)錄控制序列而形成重組分子的本發(fā)明 核酸分子。如上所述，短語"操作性連接"表示某核酸分子連接于轉(zhuǎn)錄控制序列， 其連接方式使得該分子在轉(zhuǎn)染(即，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)進(jìn)宿主細(xì)胞后能表達(dá)。用于 本發(fā)明組合物中的核酸分子優(yōu)選操作性連接于允許該分子在哺乳動(dòng)物接受者中瞬 時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。為避免長時(shí)間免疫激活的不利的影響(例如，休克、過度 炎癥、免疫耐受)，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是核酸分子編碼的免疫原或細(xì)胞因子在 免疫接種的哺乳動(dòng)物中表達(dá)約72小時(shí)到1個(gè)月、優(yōu)選約1周到1個(gè)月、更優(yōu)選約 2周到1個(gè)月。例如當(dāng)發(fā)生與長時(shí)間免疫激活相關(guān)的不利作用時(shí)，表達(dá)不要超過l 個(gè)月時(shí)間。然而，如果某特定組合物不會(huì)發(fā)生這種作用或者該作用可避免或受到控 制，延長表達(dá)則可接受。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如可通過選擇合適的轉(zhuǎn)錄控制序列 來實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)。適合于瞬時(shí)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列描述于下文。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)、延伸和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制 序列是控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的序列，例如啟動(dòng)子。增強(qiáng)子、操縱子和阻遏序列。合適的轉(zhuǎn) 錄控制序列包括可在至少一種用于本發(fā)明方法的重組細(xì)胞中起作用的任何轉(zhuǎn)錄控 制序列。各種這樣的轉(zhuǎn)錄控制序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列 包括能在哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞，優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的序列。更優(yōu)
選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括(但不限于)猿病毒40(SV-40)、 (3-肌動(dòng)蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒長末 端重復(fù)序列(LTR)、 Rous肉瘤病毒(RSV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、 tac、 lac、 trp、 trc、 oxy-pro、 omp/lpp、 rrnB、噬菌體lambda(X)(例如XpL和XpR與含有這種啟動(dòng)子的 融合物)、噬菌體T7、 T71ac、噬菌體T3、噬菌體SP6、噬菌體SPOl、金屬硫蛋白、 a交配因子、Pichia醇類氧化酶、a病毒亞基因組啟動(dòng)子(例如辛德比斯病毒亞基因 組啟動(dòng)子)、桿狀病毒、玉米夜蛾(/^//0^^^ )昆蟲病毒、牛痘病毒和其它痘病毒、 肝炎病毒、和腺病毒轉(zhuǎn)錄控制序列、以及能控制原核細(xì)胞中基因表達(dá)的其它序列。 其它合適的轉(zhuǎn)錄控制序列包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(例如，T細(xì)胞特異性增 強(qiáng)子和啟動(dòng)子)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄控制序列也包括與編碼免疫原的基因相關(guān)的天然存 在的轉(zhuǎn)錄控制序列，所述免疫原包括腫瘤抗原、過敏原、病原體抗原或細(xì)胞因子。 用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括使得待表達(dá)的核酸分子瞬時(shí)表達(dá) 的啟動(dòng)子，從而能使該核酸分子編碼的蛋白在充分引發(fā)免疫應(yīng)答的時(shí)間后終止表 達(dá)。與免疫系統(tǒng)的長時(shí)間激活相關(guān)的不利作用可通過選擇啟動(dòng)子和能使核酸分子瞬 時(shí)表達(dá)的其它轉(zhuǎn)錄控制因子來避免。本發(fā)明的方法與以前描述的基因治療/基因取 代方法之間還有另一點(diǎn)差別。與編碼用于本發(fā)明的免疫原和/或細(xì)胞因子的核酸分 子一起使用的合適啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和其它非逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟 動(dòng)子，例如RSV啟動(dòng)子、腺病毒啟動(dòng)子和猿病毒啟動(dòng)子。在基因治療/基因取代方 法中可能很需要LTR組織特異性啟動(dòng)子自我復(fù)制病毒的啟動(dòng)子和乳頭瘤病毒的啟 動(dòng)子，因?yàn)樗鼈兛商峁┺D(zhuǎn)基因的長時(shí)間表達(dá)，但這些啟動(dòng)子不宜用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄 控制序列。
可為DNA或RNA的本發(fā)明的重組分子也可含有額外的調(diào)節(jié)序列，例如翻譯 調(diào)節(jié)序列、復(fù)制起點(diǎn)和其它與該重組細(xì)胞相容的調(diào)節(jié)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明的重組分子也含有分泌信號(hào)(即，信號(hào)片段核酸序列)而使表達(dá)的免疫原或細(xì)胞 因子蛋白從產(chǎn)生它們的細(xì)胞中分泌出來。合適的信號(hào)片段包括(l)免疫原信號(hào)片段(例如，腫瘤抗原、過敏原或病原體抗原信號(hào)片段)；(2)細(xì)胞因子信號(hào)片段；(3) 或能指導(dǎo)本發(fā)明的免疫原和/或細(xì)胞因子蛋白分泌的異源信號(hào)。
優(yōu)選的本發(fā)明的重組分子包括含有編碼免疫原的核酸序列的重組分子、含有 編碼細(xì)胞因子的核酸序列的重組分子、或同時(shí)含有編碼免疫原的核酸序列和編碼細(xì) 胞因子的核酸序列形成嵌合性分子的重組分子(即，編碼免疫原的核酸序列與編碼 細(xì)胞因子的核酸序列處于同一重組分子中)。包含于這種重組嵌合分子中的核酸分 子操作性連接于一條或多條轉(zhuǎn)錄控制序列，其中包含于嵌合重組分子中的每個(gè)核酸 分子可利用相同或不同的轉(zhuǎn)錄控制序列來表達(dá)。
可利用本發(fā)明的一種或多種重組分子來產(chǎn)生用于本發(fā)明方法中的編碼產(chǎn)物 (即，免疫原蛋白或細(xì)胞因子蛋白)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在有效產(chǎn)生蛋白的條 件下表達(dá)核酸分子來產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。產(chǎn)生所編碼產(chǎn)物的優(yōu)選方法是通過用一種或多 種重組分子轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞來形成重組細(xì)胞。適合轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞包括任何可被轉(zhuǎn)染 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可是未受轉(zhuǎn)染細(xì)胞或已用至少一種核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可是任何能產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原(例如，腫瘤、過敏原或病 原體)和/或細(xì)胞因子的細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物的肺細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、 肌肉細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、肥大細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、在任何細(xì)胞來源的肉 芽腫和腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞更優(yōu)選哺乳動(dòng)物間充質(zhì)細(xì)胞、上 皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、T細(xì)胞 和樹突狀細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的方法，宿主細(xì)胞優(yōu)選在體內(nèi)(即，在哺乳動(dòng)物中)轉(zhuǎn)染，即將與脂 質(zhì)體遞送載體形成復(fù)合物的核酸分子經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用至哺乳動(dòng)物。將本發(fā)明 的核酸分子轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞可通過能將待施用的核酸分子與脂質(zhì)體遞送載體插入 體內(nèi)細(xì)胞中的任何方法，包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法來實(shí)現(xiàn)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解可使用重組DNA技術(shù)來提高轉(zhuǎn)染的核酸分子的
表達(dá)，例如，通過操縱轉(zhuǎn)基因(即，重組核酸分子)表達(dá)的持續(xù)時(shí)間、宿主細(xì)胞內(nèi)的 該核酸分子的拷貝數(shù)、核酸分子轉(zhuǎn)錄的效率、所得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被翻譯的效率和翻譯后 修飾的效率。用于提高本發(fā)明核酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括(但不限于)將核酸分子 操作性連接于高拷貝數(shù)質(zhì)粒、將該核酸分子整合入宿主細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)染色體、在質(zhì)粒中加入載體穩(wěn)定性序列、提高重組分子表達(dá)的持續(xù)時(shí)間、取代或修飾轉(zhuǎn)錄控 制信號(hào)(例如，啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子)、取代或修飾翻譯控制信號(hào)(例如，核糖體 結(jié)合位點(diǎn)、SD序列)、修飾本發(fā)明的核酸分子使之對(duì)應(yīng)于宿主細(xì)胞所用的密碼子， 和刪除使轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的序列。本發(fā)明所表達(dá)的重組蛋白的活性可通過片段化、修 飾或衍生編碼這種蛋白的核酸分子而得到提高。此外，可修飾核酸分子，特別是質(zhì) 粒部分(包括轉(zhuǎn)錄控制序列)來制備更具免疫刺激性的核酸分子，例如將CpG基序 加入核酸中。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)哺乳動(dòng)物患癌癥時(shí)，經(jīng)靜脈內(nèi)施用至哺
乳動(dòng)物的治療性組合物含有多種重組核酸分子，其中每個(gè)重組核酸分子含有cDNA 序列，而每種cDNA序列編碼腫瘤抗原或其片段(即，上述腫瘤抗原的至少一部分， 優(yōu)選含有T或B細(xì)胞表位的部分)。將從自體腫瘤樣品分離到的全RNA擴(kuò)增成 cDNA序列。每個(gè)cDNA序列均操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物 施用至患癌癥的哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致編碼腫瘤抗原的cDNA序列在哺乳動(dòng)物的組織中 (靜脈內(nèi)施用在肺組織中而腹膜內(nèi)施用在脾臟和肝臟組織中)表達(dá)。在其它實(shí)施方案 中，這種治療性組合物含有的重組核酸分子具有編碼細(xì)胞因子的核酸序列，其中該 核酸序列操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物施用至哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致 編碼細(xì)胞因子的核酸序列在哺乳動(dòng)物的上述組織中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方 案，自體腫瘤樣品得自治療性組合物要施用的哺乳動(dòng)物。因此，該治療性組合物中 的cDNA序列將編碼該癌癥的腫瘤抗原，從而引發(fā)對(duì)該腫瘤的免疫應(yīng)答。在該實(shí) 施方案中，因?yàn)槭┯弥敛溉閯?dòng)物的基本上所有的抗原均是該腫瘤樣品所表達(dá)的，故 無需知道給定腫瘤樣品中的哪些抗原最具免疫原性(即，最佳免疫原)。此外，引發(fā) 針對(duì)多種腫瘤抗原/免疫原的免疫應(yīng)答可能有益于提高抵御該癌癥的免疫應(yīng)答的療 效。
在本發(fā)明方法的該實(shí)施方案中，上述多種重組核酸分子也可表示核酸分子文 庫，特別是cDNA文庫。產(chǎn)生cDNA文庫的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，這種方 法披露于Sambrook等，同上。更具體地說，在該實(shí)施方案中，治療性組合物含有 編碼腫瘤抗原的或代表自體腫瘤樣品所表達(dá)基因的多種重組cDNA分子或其片段。
該多種重組核酸分子可例如可通過以下方法制備從自體腫瘤樣品分離得到總 RNA,將該RNA轉(zhuǎn)變(即，擴(kuò)增)成多種cDNA分子，然后通過將cDNA分子克隆進(jìn)重組載體以形成多種重組分子制成cDNA文庫。本文使用的總RNA表示使用本 領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離自細(xì)胞樣品的所有RNA，通常包括mRNA、hnRNA、tRNA 和rRNA。從細(xì)胞樣品(例如腫瘤樣品)中分離總RNA的方法是本領(lǐng)域已知的(參見， 例如Sambrook等，同上)。在其它實(shí)施方案中，從總RNA中擴(kuò)增cDNA之前，可 對(duì)RNA進(jìn)行選擇分離得到poly-A RNA(即，在3'末端含有poly-A尾部的RNA、 反映了 mRNA、編碼細(xì)胞所表達(dá)蛋白的原代RNA轉(zhuǎn)錄物)。在還有另一個(gè)實(shí)施方 案中，為去除存在于哺乳動(dòng)物非腫瘤細(xì)胞(S卩，正常細(xì)胞)中的抗原的編碼核酸分子， 這種cDNA文庫可"減去"該哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞樣品的cDNA文庫，從而增強(qiáng)抗 該腫瘤特異性抗原的腫瘤特異性免疫應(yīng)答并防止有害的免疫應(yīng)答。減去核酸文庫的 方法也是本領(lǐng)域已知的(參見Sambrook等，同上)。
在患有癌癥的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中， 經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用至哺乳動(dòng)物的治療性組合物含有多種重組核酸分子，其中每 個(gè)重組核酸分子含有cDNA序列，每種cDNA序列編碼腫瘤抗原或其片段(即，上 述腫瘤抗原的至少一部分)。在該實(shí)施方案中，cDNA序列從分離自同一組織學(xué)類 型腫瘤的多個(gè)同種異體腫瘤樣品的總RNA中擴(kuò)增。每個(gè)cDNA序列均操作性連接 于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物施用至患有癌癥的哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致編碼腫瘤 抗原的cDNA序列在該哺乳動(dòng)物的組織中(如上所述，根據(jù)施用途徑而)表達(dá)。在其 它實(shí)施方案中，這種治療性組合物含有的重組核酸分子具有編碼細(xì)胞因子的核酸序 列，其中該核酸序列操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物施用至哺乳 動(dòng)物可導(dǎo)致編碼細(xì)胞因子的核酸序列在該哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。
在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，含有編碼腫瘤抗原的DNA序列的多種重組核酸分 子(即，cDNA文庫)從分離自同一組織學(xué)類型腫瘤的多個(gè)同種異體腫瘤樣品的總 RNA中擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明，多個(gè)同種異體腫瘤樣品是相同組織類型腫瘤的腫瘤樣 品，其分離自兩個(gè)或多個(gè)種類相同的哺乳動(dòng)物，這些個(gè)哺乳動(dòng)物至少在主要組織相 容性復(fù)合物(MHC)上不同，通常是在其它遺傳基因座上不同。因此，編碼腫瘤抗原 的多種重組分子代表了分離該RNA的任何個(gè)體中存在的基本上所有腫瘤抗原。本 發(fā)明方法的該實(shí)施方案提供了能補(bǔ)償各個(gè)患者之間表達(dá)相同組織學(xué)類型的腫瘤抗 原所存在的天然差異的基因疫苗。因此，施用該治療性組合物可有效引發(fā)對(duì)各種腫 瘤抗原的免疫應(yīng)答，從而可將同一治療性組合物施用至各種不同的個(gè)體。通過本發(fā)明的方法遞送的這種治療性組合物特別可用于治療，但也可用于預(yù)防性治療。從多 個(gè)同種異體腫瘤樣品制備這種CDNA文庫的方法相同于上述自體腫瘤樣品的方法。 在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi)或 腹膜內(nèi)施用至哺乳動(dòng)物的治療性組合物含有多種重組核酸分子，其中每個(gè)重組核酸
分子含有cDNA序列，而每個(gè)cDNA序列編碼感染性疾病病原體的免疫原或其片 段(即，上述病原體抗原的至少一部分)。在該實(shí)施方案中，cDNA序列是從分離自 感染性疾病病原體的總RNA中擴(kuò)增得到。每個(gè)cDNA序列均操作性連接于轉(zhuǎn)錄控 制序列。將這種治療性組合物施用至患有或可能接觸感染性疾病的哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致 編碼病原體抗原的cDNA序列在該哺乳動(dòng)物的組織中(如上所述，根據(jù)施用途徑而) 表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，這種治療性組合物含有的重組核酸分子具有編碼細(xì)胞因 子的核酸序列，其中該核酸序列操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物 施用至哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致編碼細(xì)胞因子的核酸序列在該哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。
在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，編碼病原體抗原的多種重組分子代表了要從中分 離得到該RNA的感染性疾病病原體中存在的基本上所有抗原。在該實(shí)施方案中， 因?yàn)槭┯弥敛溉閯?dòng)物基本上所有的抗原均是病原體表達(dá)的，故無需知道給定腫瘤樣 品中哪些抗原最具免疫原性(即，最佳免疫原)。此外，引發(fā)針對(duì)多種病原體抗原/ 免疫原的免疫應(yīng)答可能有益于提高抵御該感染性疾病的免疫應(yīng)答的療效。從感染性 疾病病原體中制備這種cDNA文庫的方法相似于上述腫瘤樣品的方法。
在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的本發(fā)明方法的還有一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi) 或腹膜內(nèi)施用至哺乳動(dòng)物的治療性組合物含有多種重組核酸分子，其中每個(gè)重組核 酸分子含有從至少一種過敏原分離的總RNA擴(kuò)增得到的cDNA序列。在該實(shí)施方 案中，該cDNA序列從分離自至少一種，優(yōu)選多種過敏原的總RNA或其片段經(jīng)擴(kuò) 增而得。每個(gè)cDNA序列均操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物施 用至患有或可能接觸過敏炎癥相關(guān)疾病的哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致編碼該過敏原的cDNA 序列在哺乳動(dòng)物的組織中(如上所述，根據(jù)施用途徑而)表達(dá)。在其它實(shí)施方案中， 這種治療性組合物含有的重組核酸分子具有編碼細(xì)胞因子的核酸序列，其中該核酸 序列操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物施用至哺乳動(dòng)物導(dǎo)致編碼細(xì) 胞因子的核酸序列在哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，編碼過敏原 的多種重組分子代表了分離得到該RNA的過敏原中存在的基本上所有抗原。此外，多種過敏原可同時(shí)施用。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及在患有癌癥的哺乳動(dòng)物中引發(fā)腫瘤抗原特異性 免疫應(yīng)答和全身性、非特異性免疫應(yīng)答的方法，所述方法的步驟包括向哺乳動(dòng)物經(jīng) 靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用含有以下物質(zhì)的治療性組合物(a)脂質(zhì)體送載體；(b)至少一
種PRRL;和(c)分離自腫瘤樣品的總RNA，其中該RNA編碼腫瘤抗原或其片段。 向哺乳動(dòng)物施用這種治療性組合物可導(dǎo)致編碼腫瘤抗原或其片段的RNA在該哺乳 動(dòng)物組織中表達(dá)。如上所述，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向哺乳動(dòng)物施用此治療性組合 物之前富集RNA中的poly-A。在其它實(shí)施方案中，該治療性組合物含有的重組核 酸分子具有編碼細(xì)胞因子的核酸序列，其中該核酸序列操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序 列。將這種治療性組合物施用至哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致編碼細(xì)胞因子的核酸序列在其引入 的哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。
在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，總RNA或者優(yōu)選富含poly-A的RNA分離自上述 腫瘤樣品(參見Sambrook等，同上)，如前所述將其與脂質(zhì)體遞送載體形成復(fù)合物 并經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用至患有癌癥的哺乳動(dòng)物。然后該RNA所編碼的腫瘤樣品 基本上在哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)所有抗原。雖然RNA通常在血清中被RNA酶快速 降解，但本發(fā)明人相信與陽離子脂質(zhì)形成復(fù)合物的RNA可受到保護(hù)免遭RNA酶 降解而直至其到達(dá)基因表達(dá)的組織。本發(fā)明方法的該具體實(shí)施方案將RNA施用至 哺乳動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)在于可直接在體內(nèi)引發(fā)針對(duì)多種腫瘤抗原的免疫應(yīng)答而基本上無 需在體外操作腫瘤組織或宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及在患有感染性疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā)病原體抗 原特異性免疫應(yīng)答和全身性、非特異性免疫應(yīng)答的方法，所述方法的步驟包括向哺 乳動(dòng)物經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用含有以下物質(zhì)的治療性組合物(a)脂質(zhì)體遞送載體； (b)至少一種PRRL;和(c)分離自感染性疾病病原體的總RNA，其中該RNA編碼病
原體抗原或其片段。向哺乳動(dòng)物施用這種治療性組合物可導(dǎo)致編碼該腫瘤抗原或其 片段的RNA在此哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。如上所述，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向哺乳 動(dòng)物施用此治療性組合物之前富集該RNA中的poly-A。在其它實(shí)施方案中，該治 療性組合物含有的重組核酸分子具有編碼細(xì)胞因子的核酸序列，其中該核酸序列操 作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物施用至哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致編碼細(xì)胞因 子的核酸序列在該哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及在患有過敏性炎癥相關(guān)疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā) 過敏原特異性免疫應(yīng)答和全身性、非特異性免疫應(yīng)答的方法，所述方法的步驟包括 向哺乳動(dòng)物經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用含有以下物質(zhì)的治療性組合物(a)脂質(zhì)體遞送 載體；(b)至少一種PRRL;和(c)分離自過敏原的總RNA，其中該RNA編碼至少一 種過敏原蛋白或其片段。向哺乳動(dòng)物施用這種治療性組合物可導(dǎo)致編碼至少一種過 敏原或其片段的RNA在該哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。如上所述，在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 向哺乳動(dòng)物施用治療性組合物之前富集該RNA中的poly-A。在其它實(shí)施方案中， 該治療性組合物含有的重組核酸分子具有編碼細(xì)胞因子的核酸序列，其中該核酸序 列操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列。將這種治療性組合物施用至哺乳動(dòng)物可導(dǎo)致編碼細(xì) 胞因子的核酸序列在該哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)。
本發(fā)明的治療性組合物包括脂質(zhì)體載體。根據(jù)本發(fā)明，該脂質(zhì)體載體含有能 在靜脈內(nèi)施用時(shí)將本發(fā)明的治療性組合物優(yōu)先遞送至哺乳動(dòng)物的肺組織而在腹膜 內(nèi)施用時(shí)優(yōu)先遞送至哺乳動(dòng)物的脾臟和肝臟組織的脂質(zhì)組合物。短語"優(yōu)先遞送" 指雖然脂質(zhì)體可將核酸分子遞送至哺乳動(dòng)物的肺或脾臟和肝臟組織以外的部位，但 這些組織是遞送的主要部位。
本發(fā)明的脂質(zhì)體載體可修飾以靶向哺乳動(dòng)物的特定部位，藉可此將PRRL和/ 或本發(fā)明的核酸分子靶向該部位并應(yīng)用于該部位。合適的修飾包括調(diào)整遞送載體的 脂質(zhì)部分的化學(xué)配方。調(diào)整遞送載體的脂質(zhì)部分的化學(xué)配方能導(dǎo)致該遞送載體靶向 胞外或胞內(nèi)。例如，可將某化學(xué)物質(zhì)加入脂質(zhì)體的脂質(zhì)配方中以改變脂質(zhì)體脂雙層 的電荷使該脂質(zhì)體能與具有特定電荷特征的某些細(xì)胞融合。因?yàn)楸景l(fā)明組合物及其 施用途徑已對(duì)免疫活性器官提供了有效的免疫激活而無需其它靶向機(jī)制幫助，所以 其它靶向機(jī)制，例如在脂質(zhì)體上加入外源性尋靶分子(即，抗體)來靶向，不是本發(fā) 明脂質(zhì)體輸送載體的必需成分(但可能是任選成分)。此外，就療效而言，本發(fā)明不 需要某給定核酸分子所編碼的蛋白在靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞、病原體等)中表達(dá)。 當(dāng)這些蛋白表達(dá)在靶位點(diǎn)附近(即，毗鄰部位)時(shí)，包括當(dāng)這些蛋白是由非靶細(xì)胞表 達(dá)時(shí)，本發(fā)明的組合物和方法也是有效。
脂質(zhì)體輸送載體優(yōu)選能在哺乳動(dòng)物中維持穩(wěn)定足夠時(shí)間以將PRRL或PRRL
和本發(fā)明的核酸分子遞送至哺乳動(dòng)物的優(yōu)選部位。本發(fā)明的脂質(zhì)體輸送載體優(yōu)選在 施用至的哺乳動(dòng)物中至少能維持約30分鐘穩(wěn)定、更優(yōu)選至少約l小時(shí)、再優(yōu)選至少約24小時(shí)穩(wěn)定。
本發(fā)明的脂質(zhì)體輸送載體含有能與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合的脂質(zhì)組合物而能遞送
PRRL與核酸分子(如果需要)進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)體復(fù)合物經(jīng)靜脈內(nèi) 施用時(shí)，本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)體復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率宜至少為約1皮克(pg)表達(dá)的蛋 白Z1毫克(mg)總組織蛋白/1微克((ig)遞送的核酸。本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)體復(fù)合物的 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)選至少為約10pg表達(dá)的蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸，更優(yōu)選 至少為約50pg表達(dá)的蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸，最優(yōu)選至少為約100pg 表達(dá)的蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸。當(dāng)本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)體復(fù)合物的 遞送途徑是經(jīng)腹膜內(nèi)時(shí)，該復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率可低至lfg表達(dá)的蛋白/lmg總組織 蛋白/lpg遞送的核酸，但上述量是更優(yōu)選的。
本發(fā)明的脂質(zhì)體輸送載體的直徑宜約為100-500納米(nm)、優(yōu)選約150-450nm、 更優(yōu)選約200-400nm。
本發(fā)明使用的合適的脂質(zhì)體可是任何脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的脂質(zhì)體包括通常 用于，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因遞送方法的脂質(zhì)體。優(yōu)選的脂質(zhì)體輸送載體 含有多層脂泡(MLV)脂質(zhì)和擠壓脂質(zhì)。制備MLV的方法為本領(lǐng)域所熟知并描述于， 例如本文的實(shí)施例章節(jié)。按照本發(fā)明，"擠壓的脂質(zhì)"是以類似于MLV脂質(zhì)的方 法制備的脂質(zhì)，但如全文納入作為參考的Templeton等，Ato"w Bz'o/ecA.， 15:647-652 (1997)所述，該脂質(zhì)然后要被擠壓通過(孔徑)大小遞減的過濾器。雖然單層小脂泡 (SUV)脂質(zhì)可用于本發(fā)明的組合物與方法中，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)與核酸形成復(fù)合物 在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，多層脂泡脂質(zhì)明顯比SUV更具免疫刺激性。更優(yōu)選的脂質(zhì)體輸送 載體包括含有聚陽離子脂質(zhì)組合物的脂質(zhì)體(即，陽離子脂質(zhì)體)和/或具有與聚乙二 醇偶聯(lián)的膽固醇骨架的脂質(zhì)體。優(yōu)選的陽離子脂質(zhì)體組合物包含(但不限 于)DOTMA和膽固醇、DOTAP和膽固醇、DOTIM和膽固醇，及DDAB和膽固醇。 在本發(fā)明的方法中用作遞送載體的最優(yōu)選脂質(zhì)體組合物包含DOTAP和膽固醇。
使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可將脂質(zhì)體與本發(fā)明的PRRL形成復(fù)合物(參見，例如 美國專利申請系列號(hào)09/104,759)。參見實(shí)施例16。
根據(jù)本發(fā)明，本文中陽離子脂質(zhì):PRRL復(fù)合物也稱為TLAC。其中DNA是空 載體的陽離子脂質(zhì):DNA復(fù)合物也稱為EC/CLDC。 CLDC進(jìn)一步與本發(fā)明的免疫 原形成復(fù)合物可稱為脂質(zhì)-抗原-DNA復(fù)合物(LADC)或稱為疫苗(Vacc)或治療性組合物。
加入脂質(zhì)體的本發(fā)明PRRL的合適濃度，包括能將足夠量的PRRL遞送進(jìn)哺 乳動(dòng)物以引發(fā)全身性免疫應(yīng)答的有效濃度。而如果要加入本發(fā)明的核酸分子，其合 適濃度包括能將足夠量的核酸分子遞送進(jìn)哺乳動(dòng)物以引發(fā)全身性免疫應(yīng)答的有效 濃度。當(dāng)該核酸分子編碼免疫原或細(xì)胞因子時(shí)，加入脂質(zhì)體的核酸分子的合適濃度 包括將足夠量的核酸分子遞送進(jìn)細(xì)胞使得該細(xì)胞能產(chǎn)生足夠的免疫原和/或細(xì)胞因 子蛋白從而以所需方式調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞免疫力的有效濃度。優(yōu)選將約O.lpg-lO)Lig的 本發(fā)明核酸分子與約8nmol脂質(zhì)體結(jié)合，更優(yōu)選約0.5昭-5嗎的核酸分子與約8nmo1 脂質(zhì)體結(jié)合，再優(yōu)選約1.(^g的核酸分子與約8nmol脂質(zhì)體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明組合物中的核酸與脂質(zhì)之比Oig核酸:nmol脂質(zhì))優(yōu)選核酸:脂質(zhì)的重量比 至少為約1:1(即，lpg核酸:lnmol脂質(zhì))，更優(yōu)選至少約1:5，還要優(yōu)選至少約1:10。 再優(yōu)選至少約1:20。本文所述的比例是基于該組合物中陽離子脂質(zhì)的量，而非該組 合物中脂質(zhì)的總量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中核酸與脂質(zhì)之比優(yōu)選核 酸:脂質(zhì)的重量比約1:1-1:64，更優(yōu)選核酸:脂質(zhì)的重量比約1:5-1:50，還要優(yōu)選核酸: 脂質(zhì)的重量比約1:10-1:40，再優(yōu)選核酸:脂質(zhì)的重量比約1:15-1:30。另一個(gè)特別優(yōu) 選的核酸:脂質(zhì)之比是約1:8-1:16，更優(yōu)選1:8-1:32。核酸經(jīng)非全身性途徑(即，肌肉 內(nèi)、氣管內(nèi)、真皮內(nèi))施用通常約1:1-1:3的比例，本發(fā)明的全身性施用途徑所用的 核酸遠(yuǎn)少于脂質(zhì)，并且可獲得比非全身性施用途徑相等或更好的結(jié)果。此外，與本 發(fā)明的全身性免疫激活組合物與方法相比，即使通過靜脈內(nèi)施用，設(shè)計(jì)用于基因治 療/基因取代的組合物通常要使用更多的核酸(例如，6:1-1:10，而1:10是所用DNA 的最小量)。
根據(jù)本發(fā)明，有效的施用方案(S卩，以有效的方式施用治療性組合物)包括能在 患病哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答的合適劑量參數(shù)和施用方式，從而較佳地保護(hù)該哺乳 動(dòng)物抵御疾病。用于具體疾病的有效劑量參數(shù)可使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定。這 些方法包括，例如測定存活率、副作用(即，毒性)和疾病的進(jìn)展或消退。具體在治 療癌癥時(shí)，可通過評(píng)估應(yīng)答反應(yīng)率確定本發(fā)明治療性組合物劑量參數(shù)的有效性。這 種應(yīng)答反應(yīng)率表示具有部分或完全緩解應(yīng)答反應(yīng)的治療患者在患者群中的百分比。 緩解可通過，例如測量腫瘤大小或顯微鏡檢查組織樣品中癌細(xì)胞的存在來確定。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在合適期間一次或多次施用時(shí)，合適的單次劑量是能在患病哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的劑量。劑量可依治療的疾病而變。在癌癥的治療中，合 適的單次劑量取決于所治療的癌癥是原發(fā)性腫瘤還是轉(zhuǎn)移癌。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使 用適合于經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用的技術(shù)，基于哺乳動(dòng)物大小來確定本發(fā)明治療性組 合物的全身性施用的合適單次劑量。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)體或PRRL:核酸:脂質(zhì)體復(fù)合 物的合適的單次劑量約為哺乳動(dòng)物的每公斤體重施用O.lpg-lOOpg的該復(fù)合物。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的單次劑量約為lpg-10iig/每公斤體重。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，PRRL:脂質(zhì)體復(fù)合物的合適單次劑量是至少施用至哺乳動(dòng)物約O.lpg的 PRRL，更優(yōu)選至少約l(ig的PRRL，還要優(yōu)選至少約IO嗎的PRRL，再優(yōu)選至少 約50嗎的PRRL，再要優(yōu)選至少施用至哺乳動(dòng)物約lOO)ig的PRRL。
當(dāng)本發(fā)明的PRRL:核酸:脂質(zhì)體復(fù)合物含有要在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的核酸分子 時(shí)，本發(fā)明的PRRL:核酸:脂質(zhì)體復(fù)合物的合適單次劑量宜導(dǎo)致至少約lpg表達(dá)的 蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸。本發(fā)明的核酸:脂質(zhì)體復(fù)合物的合適單次劑 量更優(yōu)選是能導(dǎo)致至少約10pg表達(dá)的蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸的劑 量，還優(yōu)選至少約50pg表達(dá)的蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸，再優(yōu)選至少 約100pg表達(dá)的蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸。當(dāng)本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)復(fù) 合物的施用途徑是腹膜內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)體復(fù)合物的合適單次劑量是可導(dǎo) 致低至lfg表達(dá)的蛋白/lmg總組織蛋白/lpg遞送的核酸的劑量，但上述量是更優(yōu) 選的。
能引發(fā)哺乳動(dòng)物全身性、非抗原特異性免疫應(yīng)答本發(fā)明治療性組合物的合適 單次劑量是含有足夠量的與脂質(zhì)體輸送載體形成復(fù)合物的核酸分子，與未施用本發(fā) 明治療性組合物的哺乳動(dòng)物(即，對(duì)照哺乳動(dòng)物)相比，該組合物經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi) 施用時(shí)，能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。包含在本發(fā)明的核酸:脂 質(zhì)復(fù)合物中的核酸分子的優(yōu)選劑量見上述。
能引發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的治療性組合物的合適單次劑量是在用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染將該 蛋白分子導(dǎo)入患癌癥哺乳動(dòng)物組織的細(xì)胞后能降低、優(yōu)選能消除腫瘤的足夠量的編 碼腫瘤抗原的重組分子，可單獨(dú)使用或與編碼細(xì)胞因子的重組分子組合使用。
根據(jù)本發(fā)明，用于引發(fā)抗感染性疾病和/或與這種疾病相關(guān)損傷的免疫應(yīng)答的 治療性組合物的合適單次劑量基本上與用于治療腫瘤的劑量(以上詳述的)類似，該組合物含有與脂質(zhì)體組合的編碼病原體的重組分子，可單獨(dú)使用或與編碼細(xì)胞因子 的重組分子與脂質(zhì)體組合使用。用于引發(fā)抗過敏原的免疫應(yīng)答的治療性組合物的單 次劑量基本上與用于治療腫瘤的劑量類似，該組合物含有與脂質(zhì)體組合的編碼過敏 原的重組分子，可單獨(dú)使用或與編碼細(xì)胞因子的重組分子與脂質(zhì)體組合使用。
施用至哺乳動(dòng)物的劑量次數(shù)取決于疾病的(嚴(yán)重)程度和個(gè)體患者對(duì)該治療的 應(yīng)答對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是明顯的。例如，大的腫瘤比較小的腫瘤需要更多劑 量。然而在一些情況中，如果具有大腫瘤的患者比具有較小腫瘤的患者對(duì)該治療性 組合物應(yīng)答更佳，則具有大腫瘤的患者需要的劑量小于具有較小腫瘤的患者。所以， 本發(fā)明的范圍包括治療某給定疾病所需的任何數(shù)量的合適劑量數(shù)。
要注意的是，由于施用PRRL:脂質(zhì)復(fù)合物和用其作加強(qiáng)免疫相隔時(shí)間明顯長
于一般的基因治療/基因取代施用方案，本發(fā)明方法與以往述及的基因治療/基因取 代方案有所不同。例如，根據(jù)本發(fā)明治療疾病之需，用本發(fā)明的組合物和方法引發(fā)
免疫應(yīng)答通常包括初次施用該治療性組合物，然后在初次施用后3-4周作加強(qiáng)免 疫，然后任選在第一次加強(qiáng)后每3-4周再作加強(qiáng)免疫。相反，為獲得足夠的基因表 達(dá)來產(chǎn)生或取代所需的基因功能，基因治療/基因取代方案通常需要更頻繁地施用 核酸(例如，每周施用一次)。
治療性組合物的優(yōu)選劑量次數(shù)是每位患者約施用2-10次、更優(yōu)選每位患者約 施用3-8次、還要優(yōu)選每位患者約施用3-7次，該組合物含有PRRL、編碼腫瘤抗 原的重組分子，可單獨(dú)使用或與編碼細(xì)胞因子的重組分子組合使用。如上所述，這 種施用優(yōu)選每3-4周一次直至癥狀出現(xiàn)緩解，然后每月施用一次直至疾病消退。
根據(jù)本發(fā)明，能引發(fā)對(duì)感染性疾病和/或其相關(guān)損傷免疫應(yīng)答的治療性組合物 的劑量次數(shù)基本上與用于治療腫瘤的劑量次數(shù)(以上詳述的)類似，該組合物含有編 碼病原體抗原的重組分子，可單獨(dú)使用或與和PRRL:脂質(zhì)體輸送載體形成復(fù)合物的 編碼細(xì)胞因子的重組分子組合使用。
將治療性組合物以在哺乳動(dòng)物中引發(fā)全身性、非抗原特異性免疫應(yīng)答的方式 施用，并且該組合物中的核酸分子編碼免疫原時(shí)，能使所施用的本發(fā)明重組分子在 待治療疾病的哺乳動(dòng)物中表達(dá)產(chǎn)生免疫原性蛋白(對(duì)腫瘤、病原體抗原或過敏原而 言)或免疫調(diào)節(jié)蛋白(對(duì)細(xì)胞因子而言)。根據(jù)本發(fā)明的方法，治療性組合物可通過靜 脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射施用，優(yōu)選通過靜脈內(nèi)施用。靜脈內(nèi)注射可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的方法，可將PRR:核酸:脂質(zhì)復(fù)合物可施用至哺乳動(dòng)物的 任何部位，其中特別是當(dāng)脂質(zhì)體輸送載體含有陽離子脂質(zhì)體時(shí)，可以全身性施用 (即，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用)。當(dāng)使用靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用時(shí)，特別是當(dāng)使用靜脈內(nèi) 施用時(shí)，在哺乳動(dòng)物的任何部位施用會(huì)引發(fā)強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答。合適的施用部位包 括免疫激活的靶位點(diǎn)不限于在接近施用部位具有毛細(xì)血管床的第一器官(即，可將 組合物施用于遠(yuǎn)離耙免疫位點(diǎn)的施用部位)。換言之，例如，雖然腎臟不是接近施 用部位具有毛細(xì)血管床的第一器官，但用于治療哺乳動(dòng)物腎腫瘤的本發(fā)明組合物可 經(jīng)靜脈內(nèi)施用至哺乳動(dòng)物的任何部位而引發(fā)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答和有效地減小 或消除該腫瘤。當(dāng)需要特異性抗腫瘤作用(即，減小或消除腫瘤)和施用途徑是靜脈 內(nèi)時(shí)，施用部位依舊是可靜脈內(nèi)輸入組合物的任何部位，而無論腫瘤與施用部位在 何位置。就腹膜內(nèi)施用的抗腫瘤療效而言(但非免疫激活/免疫接種)，當(dāng)腫瘤位于腹 膜腔內(nèi)或當(dāng)腫瘤是小腫瘤時(shí)，優(yōu)選使用該施用方式。如上所述，就免疫接種和免疫 激活而言，特別是與非全身性途徑相比，本文的實(shí)施例部分的結(jié)果表明腹膜內(nèi)施用 是合適的施用方式。
在本發(fā)明的方法中，可將治療性組合物施用至脊椎動(dòng)物綱哺乳類的任一成員， 包括(但不限于)靈長類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、家畜和家養(yǎng)寵物。家畜包括可食用或產(chǎn) 生有用產(chǎn)品(例如，綿羊的羊毛產(chǎn)品)的哺乳動(dòng)物。受保護(hù)的哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人、犬、 貓、小鼠、大鼠、綿羊、牛、馬和豬，人與犬特別優(yōu)選，而人最優(yōu)選。盡管本發(fā)明 的治療性組合物能在哺乳動(dòng)物的近交種類中引發(fā)抗疾病的免疫應(yīng)答，但該組合物對(duì) 在哺乳動(dòng)物的遠(yuǎn)交種類中引發(fā)免疫應(yīng)答特別有用。
如上所述，通過本方法施用的本發(fā)明的治療性組合物可用于在患有各種疾病， 特別是癌癥、過敏性炎癥和感染性疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。當(dāng)經(jīng)靜脈內(nèi)或 腹膜內(nèi)施用時(shí)，由于本發(fā)明的治療性組合物克服了癌細(xì)胞逃避免疫消除的機(jī)制(即， 癌細(xì)胞借以逃避哺乳動(dòng)物響應(yīng)于該疾病所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)，所以該組合物有利于 在患癌癥的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。癌細(xì)胞，例如可因?yàn)閮H有微弱的免疫原性、 能改變細(xì)胞表面抗原和誘導(dǎo)免疫抑制而逃避免疫消除。用于在患癌癥的哺乳動(dòng)物中 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的合適的治療性組合物含有本發(fā)明的PRRL:脂質(zhì)復(fù)合物或PRRL:核 酸:脂質(zhì)復(fù)合物，其中的核酸沒有操作性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列，或更優(yōu)選編碼操作 性連接于轉(zhuǎn)錄控制序列的腫瘤抗原編碼重組分子，該組合物可單獨(dú)使用或與編碼細(xì)胞因子的重組分子組合使用(分開用或一起用)。進(jìn)入靶子肺或脾臟和肝臟細(xì)胞后， 本發(fā)明的治療性組合物能在哺乳動(dòng)物中引發(fā)全身性、非特異性免疫應(yīng)答并導(dǎo)致產(chǎn)生 腫瘤抗原(以及在某些實(shí)施方案中為細(xì)胞因子)而激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞、天然殺傷細(xì) 胞、T輔助細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。這類細(xì)胞的激活克服了對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的相對(duì)缺 乏，破壞了癌細(xì)胞。
包含編碼腫瘤抗原的核酸分子的本發(fā)明治療性組合物可用于在患癌癥(包括腫 瘤和轉(zhuǎn)移癌)的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。用該治療性組合物治療克服了傳統(tǒng)方法 不能治療轉(zhuǎn)移性癌癥的缺點(diǎn)。例如，本發(fā)明的組合物可靶向使用外科方法難以治療 的散播的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞。此外，施用這種組合物不會(huì)導(dǎo)致許多癌癥治療方法，例如 高溫、光動(dòng)力超聲波、聚焦超聲波、化療和放療或外科方法造成的有害副作用，并 且可反復(fù)施用。此外，通過本發(fā)明方法施用的組合物通常耙向腫瘤的脂泡，所以在 腫瘤細(xì)胞自身中表達(dá)腫瘤抗原或細(xì)胞因子無需提供抵抗腫瘤的療效。實(shí)際上，本發(fā) 明的總體優(yōu)點(diǎn)在于輸送該組合物自身即可引發(fā)強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答并且核酸分子至 少能在耙位點(diǎn)的臨近區(qū)域(在該位點(diǎn)或毗鄰位點(diǎn))表達(dá)，從而提供有效的免疫激活以 及抵抗耙腫瘤的療效。
或者，癌癥治療(例如上述治療方案的一種或組合)可與本發(fā)明的治療性組合物 聯(lián)合使用。將腫瘤的癌癥治療方法(例如放療)與注射本發(fā)明的治療性組合物相結(jié)合 的原理是要提供用于摻入該疫苗中的腫瘤抗原的來源。觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的腫瘤輻
射會(huì)導(dǎo)致游離的腫瘤抗原局部釋放進(jìn)腫瘤組織。當(dāng)將TLRC注射到正在凋亡的腫 瘤中時(shí)，垂死細(xì)胞釋放的腫瘤抗原將自發(fā)摻入到TLRC中(由于電荷-電荷相互作 用)，這將導(dǎo)致在原位產(chǎn)生自身腫瘤疫苗。摻入到TLRC佐劑中的腫瘤抗原然后將 誘導(dǎo)局部天然免疫力的激活、募集專職性抗原呈遞細(xì)胞(APC)，接著在最接近的引 流淋巴結(jié)中APC攝取并呈遞抗原。遞送放療療劑之后注射TLRC。在次情況中， 直至腫瘤抗原到達(dá)引流淋巴結(jié)后才激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，因此當(dāng)腫瘤再次接受輻射 時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞可免遭破壞。因此，腫瘤可接受多輪放療和腫瘤內(nèi)TLRC遞送。這 可用作免疫系統(tǒng)的加強(qiáng)疫苗而進(jìn)一步促進(jìn)抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)。此外，患者仍可繼 續(xù)接受當(dāng)前對(duì)其腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，不必中斷放療時(shí)間安排。癌癥療劑可在導(dǎo)入 本發(fā)明的組合物之前、同時(shí)或之后施用。
誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的其它方法也可與局部腫瘤內(nèi)注射TLRC佐劑聯(lián)用。例如，注射促凋亡藥物(例如，喜樹堿)、注射光敏劑聯(lián)合腫瘤的紫外線照射、腫瘤電穿孔 或局部高溫均可用于引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死以釋放腫瘤抗原慘入到TLRC佐劑 中。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了可治療任何腫瘤的注射針和放療方法。所提出的治療方案圍繞 標(biāo)準(zhǔn)放療方案而設(shè)計(jì)，該標(biāo)準(zhǔn)方案通常包括在每周的第五天向腫瘤局部施用多種放
射組分，持續(xù)3-4周。所提出的組合方案涉及在放療開始(第1天)時(shí)腫瘤內(nèi)注射 TLRC，并在第5天、第12天、第19天也可能在第26天再次注射。然后，每月 在腫瘤部位注射TLRC兩次，持續(xù)3-4個(gè)月，或者直至手術(shù)摘除腫瘤或腫瘤消退。 待施用的TLRC/LNAC劑量基于腫瘤大小，用LNAC時(shí)劑量通常是每次注射 250-1000嗎核酸(非編碼質(zhì)粒DNA或CpG寡聚核苷酸)。
可用這種方法治療的典型腫瘤包括不可切除的頭頸腫瘤(例如，鱗狀細(xì)胞癌)、 復(fù)發(fā)性黑色素瘤、乳腺癌和其它皮膚或皮下組織的惡性腫瘤。
另一個(gè)實(shí)施方案考慮了聯(lián)合腫瘤內(nèi)注射TLRC與腫瘤凋亡或壞死誘導(dǎo)劑來誘 導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法。該治療方案涉及施用能引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死的藥物 (通過局部或全身性注射)來提供TLRC佐劑所需的抗原來源。在施用凋亡/壞死藥物 之后將TLRC佐劑施用至腫瘤組織中。這方案以凋亡藥物加上TLRC的一系列交 替循環(huán)反復(fù)進(jìn)行。這種藥物的例子包括同時(shí)施用光動(dòng)力療劑和TLRC、凋亡誘導(dǎo)劑 (FasL， TRAIL,喜樹堿)或腫瘤壞死或溶解誘導(dǎo)劑，如TNF-a或蒸餾水?？捎眠@種 方法治療的典型腫瘤包括上述腫瘤。此外，用PDT，對(duì)于不易接近部位(例如肝臟 或腎臟)的腫瘤可用超聲波引導(dǎo)的注射方法將TLRC注射進(jìn)腫瘤組織中來治療。
含有編碼腫瘤抗原的核酸分子的本發(fā)明治療性組合物優(yōu)選用于在患癌癥的哺 乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答，所述癌癥包括(但不限于)黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、 頭頸癌、甲狀腺癌、軟組織肉瘤、骨癌、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮 膚癌、腦癌、血管肉瘤、血管肉瘤、肥大細(xì)胞瘤、原發(fā)性肝癌、肝癌、肺癌、胰腺 癌、胃腸癌、腎細(xì)胞癌、造血瘤、間充質(zhì)組織癌和它們的轉(zhuǎn)移性癌?？捎帽景l(fā)明的 治療性組合物治療的特別優(yōu)選的癌癥包括原發(fā)性肺癌和肺轉(zhuǎn)移性癌癥。本發(fā)明的治 療性組合物可用于在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答來治療可能在這類癌癥中形成的腫 瘤，包括惡性和良性腫瘤。在患癌癥的哺乳動(dòng)物的肺組織中表達(dá)腫瘤抗原(即，通 過靜脈內(nèi)遞送)宜產(chǎn)生的結(jié)果有癌癥緩解、癌癥相關(guān)的腫瘤縮小、癌癥相關(guān)的腫瘤消除、預(yù)防轉(zhuǎn)移性癌癥、預(yù)防癌癥和激或了抵御癌癥的效應(yīng)細(xì)胞免疫力。
含有編碼感染性疾病病原體免疫原的核酸分子的本發(fā)明治療性組合物的優(yōu)點(diǎn) 是能在患感染性疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。對(duì)應(yīng)于免疫應(yīng)答的感染性疾病是 病原體導(dǎo)致的疾病，其中引發(fā)對(duì)該病原體的免疫應(yīng)答可導(dǎo)致本文上述的預(yù)防性或治 療性作用。這種方法可提供對(duì)病原體繁殖所致原發(fā)性損傷(例如，肉芽腫)的長期靶 向治療。本文使用的術(shù)語"損傷"表示哺乳動(dòng)物感染病原體后形成的損傷。用于在 患感染性疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的治療性組合物含有與脂質(zhì)體輸送載體 組合的編碼病原體抗原的重組分子，可單獨(dú)使用或與本發(fā)明的編碼細(xì)胞因子的重組 分子組合使用。類似于上述治療癌癥的機(jī)理，在患感染性疾病的哺乳動(dòng)物中用感染 性疾病病原體的免疫原(和或不和細(xì)胞因子)引發(fā)免疫應(yīng)答可導(dǎo)致T細(xì)胞、天然殺傷 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性增加從而克服了對(duì)病原體所形成損傷的免疫應(yīng)答的相對(duì)缺乏。 在患感染性疾病的哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)免疫原優(yōu)選產(chǎn)生的結(jié)果有疾病緩解、已有的 該疾病相關(guān)損傷好轉(zhuǎn)、疾病癥狀緩解、產(chǎn)生抗該疾病的免疫力和激或抗該疾病的效 應(yīng)細(xì)胞免疫力。
本發(fā)明的治療性組合物對(duì)于在患病原體導(dǎo)致的感染性疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā) 免疫應(yīng)答特別有用，所述病原體包括(但不限于)細(xì)菌(包括寄居于宿主細(xì)胞中的胞內(nèi) 細(xì)菌)、病毒、寄生蟲(包括內(nèi)部寄生蟲)、真菌(包括致病性真菌)和體內(nèi)寄生蟲?？?用本發(fā)明的治療性組合物治療的優(yōu)選感染性疾病包括慢性感染性疾病，更優(yōu)選肺部 感染性疾病，例如肺結(jié)核?？捎帽景l(fā)明的治療性組合物治療的特別優(yōu)選的感染性疾 病包括人免疫缺陷病毒(HIV)、結(jié)核分枝桿菌、皰疹病毒、乳頭瘤病毒
(pa/ ///omav/ms)、假絲酵母(C""c/Wa)感染的疾病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可用本發(fā)明的治療性組合物治療的感染性疾病是病毒性 疾病，優(yōu)選是包括人免疫缺陷病毒和貓免疫缺陷病毒等的病毒導(dǎo)致的病毒性疾病。
含有編碼免疫原為過敏原的核酸分子的本發(fā)明治療性組合物的優(yōu)點(diǎn)是能在患 過敏性炎癥相關(guān)疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。過敏性炎癥相關(guān)疾病是一種所引 發(fā)的針對(duì)致敏劑(例如過敏原)的免疫應(yīng)答(例如，Th-2免疫應(yīng)答)可導(dǎo)致炎性介質(zhì)釋 放的疾病，該介質(zhì)募集參與哺乳動(dòng)物炎癥的細(xì)胞并且存在這種介質(zhì)可導(dǎo)致組織損傷 有時(shí)導(dǎo)致死亡。用于在患過敏性炎癥相關(guān)疾病的哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的治療性 組合物含有與PRRL:脂質(zhì)體輸送載體組合的編碼過敏原的重組分子，可單獨(dú)使用或與編碼細(xì)胞因子的重組分子組合使用。
可用本發(fā)明的方法和組合物治療的優(yōu)選過敏性炎癥相關(guān)的疾病包括過敏性氣 道疾病、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎和足部過敏。
本發(fā)明的治療性組合物對(duì)于啟動(dòng)損傷愈合、骨生成、骨移植和/或血管生成和 纖維形成特別有用。血管生成和纖維形成是行使人體生長和修復(fù)過程的關(guān)鍵成分。 不充分的血管生成能力可加重心血管疾病，例如外周脈管疾病(PVD)的嚴(yán)重性。在 PVD中，將血液攜帶至手臂或腿部的動(dòng)脈變得狹窄或堵塞，使得血流變慢或停滯。
該疾病最常影響腿部。由于許多人將PVD的癥狀，例如腿部或手臂的疼痛或麻木 認(rèn)為是衰老的正常情況，他們患有PVD而不知。刺激血管生成已用作緩解PVD成 因的一種方法。
血管生成在損傷愈合中也起著重要作用。對(duì)損傷的應(yīng)答非常原始，但卻是修 復(fù)受傷組織完整性的基本性的天然宿主免疫應(yīng)答。高級(jí)脊椎動(dòng)物的損傷(愈合)涉及 導(dǎo)致纖維化結(jié)疤的快速修復(fù)過程。外傷、感染或外來物體所致?lián)p傷的愈合很大程度 上由細(xì)胞因子介導(dǎo)促進(jìn)了炎癥和愈合。最初的損傷觸發(fā)血凝和急性局部炎性應(yīng)答， 然后間充質(zhì)細(xì)胞募集并增殖。由于圍繞損傷的局部區(qū)域過度的Thl應(yīng)答造成的炎 癥超越了控制可導(dǎo)致?lián)p傷不愈合。失控的基質(zhì)聚集導(dǎo)致纖維化后遺癥和結(jié)疤。炎癥 和基質(zhì)長入正在為愈合的創(chuàng)傷之間的平衡受到局部區(qū)域中適當(dāng)細(xì)胞因子混合物的 調(diào)節(jié)。
骨肉瘤是最常見的影響青春期人和青年人的原發(fā)性骨腫瘤之一。傳統(tǒng)的治療 方法需要截肢然后通過化療延長生存期。用帶有大量的外皮的同種異體移植物進(jìn)行 的肢體補(bǔ)救通常用作截肢的替代方法。多項(xiàng)研究表明肢體補(bǔ)救治療未對(duì)存活率有不 利影響，許多患者感到他們的生活質(zhì)量有提高。盡管此種外科技術(shù)是成功的，但常 常發(fā)生復(fù)雜的術(shù)后并發(fā)癥。這些并發(fā)癥包括骨髓炎、移植物不聯(lián)合(non-union)與骨 折。骨髓炎是最常見的與肢體同種異體移植補(bǔ)救相關(guān)的并發(fā)癥。骨髓炎難以治愈并 且常導(dǎo)致多次校正手術(shù)、慢性疼痛、肢體使用功能不佳， 一些病例仍要截肢。
以上3個(gè)例子的相同主題是調(diào)節(jié)血管生成和纖維化應(yīng)答與損傷愈合和骨移植 相關(guān)的并發(fā)癥需要能提高愈合時(shí)間和移植手術(shù)成功率的化合物。
宜將本發(fā)明的治療性組合物優(yōu)選施用至哺乳動(dòng)物，藉此在哺乳動(dòng)物中引發(fā)新 血管生成。該方法包括通過皮下和肌肉內(nèi)施用途徑將治療性組合物施用至哺乳動(dòng)物的步驟。該治療性組合物包含(a)脂質(zhì)體輸送載體；和(b)模式識(shí)別受體的配體。
模式識(shí)別受體的配體可含有至少一種Toll-樣受體的配體，例如(但不限于)革蘭 陽性細(xì)菌的提取物、分枝桿菌的提取物、酵母提取物、脂多糖(LPS)、肽聚糖、脂
肽、脂磷壁酸、鞭毛蛋白、細(xì)菌DNA、雙鏈RNA、酵母多糖、和咪唑并喹啉 (imidazoquinoline)化合物。其中所述的脂質(zhì)體輸送載體含有脂質(zhì)，例如(但不限于) 多層脂泡脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、擠壓脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)和中性脂質(zhì)的組合物、陽離子 脂質(zhì)和甾醇的組合物。
通過與惰性基質(zhì)組合本發(fā)明的治療性組合物的釋放時(shí)間延長延長，所述惰性 基質(zhì)是例如(但不限于)明膠和膠原。也可將UNA等穩(wěn)定(isostabilizing)試劑加入遞 送載體，例如(但不限于)甜菜堿、三甲銨正氧化物(trimetylaminen-oxide)和L-肉毒 堿，這些試劑可單用或組合使用。此外，該脂質(zhì)遞送載體可含有DNA凝聚試劑， 例如(但不限于)聚(L-賴氨酸)、亞精胺或精胺，這些試劑可單用或組合使用。
該治療性組合物的toll樣受體的配體與脂質(zhì)之比約是1:1-1:64，所治療的哺乳 動(dòng)物可是人、犬、貓、小鼠、大鼠、綿羊、牛、馬和豬。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性組合物可通過緩釋聚合物施用?？芍苽?與Toll樣受體的配體分子和抗原(包括肽、蛋白、糖類、糖脂、脂蛋白或其它抗原 或其組合)形成復(fù)合物并配制為微球的含有陽離子脂質(zhì)體的聚(L-丙交酯)(PLA)微 球。能包裹脂質(zhì)體-Toll樣受體的配體-抗原復(fù)合物(LATLC)并在體內(nèi)生物液體中提 供緩慢但穩(wěn)定釋放的其它聚合物(例如，聚(L-丙交酯-共聚-乙交酯))也是可接受的。
脂質(zhì)體-Toll樣受體的配體-抗原復(fù)合物(LATLC)與PLA可在有機(jī)溶劑中配制， 然后擠壓凝聚形成包裹有的LATLC的PLA微球。最理想的制劑由直徑為l-10(im 的PLA微球組成。由于該大小最易為抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞) 所攝取，該直徑是最可取的。聚合物設(shè)計(jì)為可使得LATLC在組織中緩釋達(dá)l-6個(gè) 月。包裹有LATLC的微球可通過各種途徑施用，包括SC、 IM、真皮內(nèi)，以及各 種粘膜途徑，包括口服、鼻內(nèi)、吸入、直腸內(nèi)和透皮施用。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可將治療有效濃度或劑量的本文所述治療性 組合物與藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的生物可降解或非生物可降解的運(yùn)載體、賦形劑 或稀釋劑相組合。本文使用的藥學(xué)上可接受的賦形劑表示適合于將用于本發(fā)明方法 的治療性組合物遞送至體內(nèi)合適的部位的任何物質(zhì)。優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的賦形劑的形式是在PRRL和/或本發(fā)明的核酸分子到達(dá)某細(xì)胞后，能維持模式識(shí)別受體的
配體和/或本發(fā)明的核酸分子和使PRRL和/或核酸分子進(jìn)入細(xì)胞和(如果核酸分子 編碼待表達(dá)的蛋白時(shí))被細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明合適的賦形劑包括能轉(zhuǎn)運(yùn)，但不一定使
PRRL和/或核酸分子特異性靶向某細(xì)胞的賦形劑或制劑(本文也稱為非靶向運(yùn)載
體)。標(biāo)準(zhǔn)的賦形劑包括明膠、酪蛋白、卵磷脂、阿拉伯樹膠、膽固醇、黃芪膠、 硬脂酸、氯化芐烷銨、硬脂酸鈣、 一硬脂酸甘油酯、十六醇十八醇混合物、十六垸 基聚乙二醇乳化蠟、山梨聚糖酯、聚氧乙烯垸基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧 乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚乙二醇、硬脂酸聚氧乙烯酯、膠態(tài)二氧化硅、磷酸鹽、 十二烷基硫酸鈉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥乙基纖維素、 羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酯、非結(jié)晶纖維素、硅酸鎂鋁、三乙醇 胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、糖和淀粉。運(yùn)載體的示范性例子包括(但決不限
于)水、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、含有血清的溶液、Hank溶液、 其它水性生理平衡溶液、油、酯類、聚(乙酸乙烯-乙烯酯)、乳酸和乙醇酸的共聚物、 聚(乳酸)、明膠、膠原基質(zhì)、多糖、聚(D，L丙交酯)、聚(蘋果酸)、聚(己內(nèi)酯)、纖 維素、白蛋白、淀粉、酪蛋白、葡聚糖、聚酯、乙醇、丙烯酸酯(mathacrylate)、聚 氨酯、聚乙烯、乙烯基聚合物、糖醇、它們的混合物等。水性運(yùn)載體可含有接近受 者生理?xiàng)l件所需的合適的輔助物質(zhì)，例如通過提高化學(xué)物質(zhì)穩(wěn)定性和等滲性。特別 優(yōu)選的賦形劑包括非離子稀釋劑，優(yōu)選的非離子緩沖液是用水配制的5%葡萄糖 (DW5)。參見，例如《雷明頓藥劑學(xué)的科學(xué)與實(shí)踐》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy), 2000， Gennaro， AR編，Eaton ， Pa.:Mack Publishing Co 。
合適的輔助性物質(zhì)包括，例如乙酸鈉、氯化鈉、乳酸鈉、氯化鉀、氯化鈣和 用于生產(chǎn)磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液的其它物質(zhì)。輔助性物質(zhì)也 可包括防腐劑，例如硫柳汞、間-或鄰-甲酚、福爾馬林和苯甲醇。本發(fā)明的治療性 組合物可通過常規(guī)方法滅菌和/或凍干。
本發(fā)明提供實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。因此，本發(fā)明提供了各種試劑盒。這 些試劑盒可用于以下任一或多種用途(并且因此包裝有用于以下一種或多種用途的 使用說明書)用于治療性或預(yù)防性地治療個(gè)體來抵御致病微生物，例如病毒、真 菌或細(xì)菌感染；治療個(gè)體的某些形式的癌癥；預(yù)防某些形式癌癥的擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移；預(yù) 防某些形式癌癥的一種或多種癥狀；減輕一種或多種癌癥相關(guān)癥狀；減緩癌癥在個(gè)體中的發(fā)展；或?qū)€(gè)體進(jìn)行疫苗接種以抵御某些形式的癌癥。
本發(fā)明的試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)容器，這些容器含有本發(fā)明的治療性組合物 和本文所述的合適賦形劑以及一套使用說明書，雖然含有使用說明的電子存儲(chǔ)介質(zhì) (例如，磁盤或光盤)也可接受，但說明書通常是關(guān)于本發(fā)明組合物對(duì)所預(yù)定治療疾 病的用法和劑量的書面說明書。試劑盒內(nèi)包含的使用說明書一般包括用于預(yù)定治療 方案的劑量、給藥方案和施用途徑的信息。本發(fā)明的治療性組合物的容器可裝有單 位劑量、散裝(例如，多個(gè)劑量包裝)或亞單為劑量。
本發(fā)明的治療性組合物可以任何方便的、合適的包裝方式包裝。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的治療性組合物可與本領(lǐng)域已知的其它 治療方法組合或與之聯(lián)用。
另一個(gè)實(shí)施方案考慮將本發(fā)明的組合物加入到一種醫(yī)學(xué)裝置中，然后將該裝 置置于體內(nèi)所需的靶位置，在該位置將本發(fā)明的組合物從醫(yī)學(xué)裝置洗出。因此，例 如，本發(fā)明所述裝置是關(guān)于血管支架的。然而，應(yīng)該理解的是以下實(shí)施方案涉及任 何可加入本發(fā)明組合物的醫(yī)學(xué)裝置而不限于該醫(yī)學(xué)裝置的任何具體類型。
本發(fā)明的裝置可將治療有效量的本發(fā)明組合物提供至靶部位，例如患病或受 傷的身體組織或器官。所需的精確治療效果取決于所治療的疾病、所施用的制劑和 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的各種其它因素。實(shí)施本發(fā)明所需的本發(fā)明組合物的量也 隨所用PRRL的性質(zhì)而變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明組合物涂布的醫(yī)學(xué)裝置是用于進(jìn)行或有助于醫(yī) 學(xué)治療的支架或?qū)Ч?。因此，本發(fā)明可與任何合適的或所需的支架組件和配件聯(lián)合 使用，并且包括多種支架設(shè)計(jì)方式的任一種。這些支架設(shè)計(jì)方式可包括，例如基礎(chǔ) 性的固體或管狀可彎曲支架膜或氣囊導(dǎo)管支架；直到復(fù)雜的裝置，包括多管道式或 多擠壓內(nèi)腔以及各種配件，例如導(dǎo)線、探針、超聲波(儀)、光纖、電生理學(xué)(配件)、 血液或化學(xué)物質(zhì)取樣組件。換言之，本發(fā)明可與任何合適的支架或?qū)Ч艿脑O(shè)計(jì)方式 聯(lián)合使用，而不限于導(dǎo)管的具體類型。
本文使用的"醫(yī)學(xué)裝置"表示用于預(yù)防或治療醫(yī)學(xué)疾病的可暫時(shí)性或永久性 引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的裝置。這些裝置包括經(jīng)皮下、透皮或外科手術(shù)引入，安置在器 官、組織或腔隙內(nèi)的任何裝置。醫(yī)學(xué)裝置包括支架、合成移植物、人造心臟瓣膜、 人造心臟和使修復(fù)性器官和血管循環(huán)相連接的固定物、靜脈瓣膜、腹主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤(AAA)移植物、下腔靜脈過濾器、導(dǎo)管(包括永久性藥物輸注導(dǎo)管)、栓塞圈、用于 脈管栓塞的栓塞物質(zhì)(例如，PVA泡沫)、網(wǎng)孔修補(bǔ)材料、Dracon脈管顆粒矯型金屬 板、金屬條和螺絲以及脈管縫合線。
出于本發(fā)明的目的，"洗出"表示涉及通過(藥物)涂層與體液的直接接觸來提 取或釋放(藥物)的任何釋放過程。
在一個(gè)實(shí)施方案中，醫(yī)學(xué)裝置可設(shè)計(jì)為具有將本發(fā)明組合物遞送至所需的身 體部位的孔洞，可按美國專利號(hào)5,972,027披露的方法制備，該專利引作參考。簡 言之，該方法包括提供粉末狀金屬或聚合物材料、將粉末經(jīng)高壓形成壓縮物、燒結(jié) 該壓縮物形成最終的多孔金屬或聚合物、用該多孔金屬制備支架任選至少將本發(fā)明 的組合物(和任選的一種或多種其它藥物)加載進(jìn)孔中。例如，該支架可用本發(fā)明的 組合物和任選的一種或多種其它藥物通過本領(lǐng)域已知的任何方法浸漬，包括高壓加 載，此時(shí)將支架置于所需的一種或多種藥物的槽中浸泡并施以高壓，或者抽真空。 藥物可用揮發(fā)性或非揮發(fā)性溶液運(yùn)載。使用揮發(fā)性溶劑時(shí)，藥物加載后，可使揮發(fā) 性運(yùn)載體溶液揮發(fā)。抽真空時(shí)，金屬支架孔中的空氣被抽去被含有藥物的溶液所取 代。或者，將支架植入所需的身體部位而非使藥物加載于多孔支架，然后通過遞送 管將藥物注射入空心支架，接著藥物可從支架孔中穿出到達(dá)所需部位。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，支架可設(shè)計(jì)為含有如美國專利號(hào)6，273，913Bl所述可加 載本發(fā)明組合物的儲(chǔ)槽或管道，該專利引為參考。生物相容物質(zhì)的涂層或膜可涂布 于儲(chǔ)槽上，從而控制藥物從儲(chǔ)槽向動(dòng)脈壁擴(kuò)散。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)之一是可優(yōu)化該涂層 的性能來實(shí)現(xiàn)優(yōu)越的生物相容性和附著性能，而無需額外的加載和釋放藥物的能 力?？衫脙?chǔ)槽的大小、形狀、位置和數(shù)量來控制藥物的量，從而控制所遞送的劑
實(shí)際上，此種支架可用適合于該設(shè)計(jì)的物理性能的任何生物相容材料制成， 并且可是生物可降解或非生物可降解的。這種材料是彈性還是非彈性的取決于涂布 于其上的聚合物層的柔韌性或彈性。因此，本發(fā)明的醫(yī)學(xué)裝置總體上可從各種材料 制備，包括常規(guī)材料、形狀記憶合金、各種塑料和聚合物、碳或碳纖維、乙酸纖維 素、硝酸纖維素、硅酮等。
例如，本發(fā)明的醫(yī)學(xué)裝置，例如(但不限于)支架可由其上涂布有基質(zhì)的聚合物 或金屬結(jié)構(gòu)元件組成，或者該支架可是基質(zhì)與聚合物混合形成的的組合物。制造可延展支架的合適的生物相容金屬包括高級(jí)不銹鋼；鈦合金，包括NiTi(稱 為鎳鈦合金的基于鎳-鈦的合金)；鈷合金，包括鈷-鉻-鎳合金，例如Elgiloy⑧和 Phynox ;基于鈮-鈦(NbTi)的合金；鉭、金和鉑-銥。
合適的非金屬生物相容材料包括(但不限于)聚酰胺、聚烯烴(例如，聚丙烯、 豕乙怖寺卜個(gè)口J吸儀tfJ求鵬(KH ，》J不一 〒股乙?guī)熌躂和土鄉(xiāng)Kl吸儀tfJ服肪族聚酉旨(例
如，乳酸、乙醇酸、丙交酯、乙交酯、對(duì)二嗯酮(para-dioxanone)、亞丙基碳酸酯、 s-己內(nèi)酯等的均聚物和共聚物，及其混合物)。 基質(zhì)
在一個(gè)實(shí)施方案中，醫(yī)學(xué)裝置(例如支架或移植物)用基質(zhì)涂布。用于涂布本發(fā) 明支架或移植物的基質(zhì)可從各種材料制備。對(duì)基質(zhì)的基本要求是要有充分的彈性和 柔韌性以使之在支架或合成移植物的暴露表面維持不破裂。
(A) 天然材料
基質(zhì)可選自天然物質(zhì)，例如可在人體中被酶降解的或在人體中水解不穩(wěn)定的 成膜聚合物性生物分子，如纖維蛋白、纖維蛋白原、肝素、膠原、彈性蛋白和可吸 收的生物相容多糖，如殼聚糖、淀粉、脂肪酸(及其酯)、葡糖醛-聚糖(glucoso-glycan)、
透明質(zhì)酸、碳、層粘連蛋白和纖維素。
(B) 合成材料
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于涂布支架或合成移植物的基質(zhì)選自能支持本發(fā)明組 合物的任何生物相容性聚合物材料。所選擇的聚合物必須是生物相容性聚合物并且 當(dāng)該支架被植入時(shí)，其對(duì)血管壁的刺激最小。該聚合物是生物穩(wěn)定的還是生物可吸 收的聚合物取決于所需的釋放速率或聚合物穩(wěn)定性程度。
制備聚合物基質(zhì)的合適材料包括(但不限于)聚羧酸、纖維素聚合物、硅酮粘合 劑、纖維蛋白、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、馬來酐聚合物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙 二醇、聚環(huán)氧乙垸、氨基葡聚糖、多糖、聚酯、聚(氨基酸)聚氨酯、分段聚氨酯-脲/肝素、硅酮、聚酸酯、聚酑、聚碳酸酯、聚丙烯、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、聚 己酸內(nèi)酯、聚戊酸羥丁酯、聚丙烯酰胺、聚醚、聚草酸亞垸酯(polyalkylenes oxalate)、 p聚酰胺、聚(亞氨基碳酸酯)、聚氧雜酯(polyoxaester)、聚氨基酯(polyamidoester)、 含有氨基的聚氧雜酯、聚磷腈、乙烯基鹵化物聚合物、聚乙二烯鹵化物、聚丙烯腈、 聚乙烯酮、聚乙烯基芳香族化合物(例如，聚苯乙烯)、甲基丙烯酸乙烯-甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS樹脂和乙酸乙烯-乙烯酯；聚酰胺，例如Nylon 66和 聚己內(nèi)酰胺；垸基樹脂；聚碳酸酯；聚甲醛；聚酰亞胺；聚醚；環(huán)氧樹脂、聚氨酯； 人造纖維；三乙酸人造纖維、纖維素、乙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素；玻璃紙；硝 酸纖維素；丙酸纖維素；纖維素醚(即，羧甲基纖維素和羥垸基纖維素)及其混合物 和共聚物。
用于涂布的聚合物優(yōu)選具有足夠高的分子量而不是蠟樣或粘性的成膜聚合 物。該聚合物也優(yōu)選能附著于支架并且在沉積于支架上后不易變形從而不會(huì)因血液 動(dòng)力學(xué)應(yīng)力而移動(dòng)。該聚合物分子量優(yōu)選足夠高以提供充分的剛性使其不會(huì)在支架 操作或放置時(shí)被蹭掉并且在支架擴(kuò)張期間不會(huì)破裂。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該基質(zhì)涂層可含有如納入本文作為參考的美國專利號(hào) 6,569,195 B2所述的第一共聚物和第二共聚物的混合物，其中第一共聚物具有第一
種高的釋放速率，而第二共聚合物具有第二種、相對(duì)低于第一釋放速率的釋放速率。 第一和第二共聚物優(yōu)選易蝕或生物可降解。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一共聚物比第二 共聚物更親水。例如，第一共聚物可含有聚乳酸/聚環(huán)氧乙垸(PLA-PEO)共聚物， 第二共聚物可含有聚乳酸/聚己酸內(nèi)酯(PLA-PCL)共聚物。PLA-PEO和PLA-PCL共 聚物的形成方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。隨時(shí)間推移而遞送的本發(fā)明組合物的 相對(duì)量和劑量釋放速率可通過控制較快釋放聚合物與較慢釋放聚合物的相對(duì)含量 來控制。就較高初始釋放速率而言，較快釋放聚合物的比例可高于較慢釋放聚合物。 如果需要大部分劑量在長時(shí)期內(nèi)釋放，大部分聚合物可是較慢釋放的聚合物。
或者，可利用頂部涂層來延緩藥學(xué)制劑的釋放，或可用作遞送不同藥學(xué)活性 物質(zhì)的基質(zhì)。例如，可釆用層疊的快速和慢速水解的共聚物涂層使藥物分階段釋放 或控制置于不同層的不同制劑的釋放?？衫萌軇┲腥芙庑圆煌木酆衔飿?gòu)建用來 遞送不同藥物或控制藥物釋放方式的不同聚合物層。例如，因?yàn)閟-己內(nèi)酯-共聚-丙 交酯彈性體可溶于乙酸乙酯，而s-己內(nèi)酯-共聚-乙交酯彈性體不溶于乙酸乙酯?？?使用乙酸乙酯作為溶劑制備的涂布溶液，將含有藥物的第一層s-己內(nèi)酯-共聚-乙交 酯彈性體涂布于s-己內(nèi)酯-共聚-乙交酯彈性體涂層之上。本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于理 解的是許多層疊方法可用于提供所需的藥物遞送。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過混合本發(fā)明的組合物和任選一種或多種其它治療性 藥物與涂布混合物配制的涂層聚合物來配制所述涂層。本發(fā)明的組合物和治療性藥物可采取液體、精細(xì)分級(jí)的固體或任何其它合適的物理形式。該混合物可任選含有 一種或多種添加劑，例如無毒輔助物質(zhì)，如稀釋劑、運(yùn)載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等。 其它合適的添加劑可與聚合物和本發(fā)明的組合物和藥學(xué)活性藥物或化合物一起配 制。例如可將選自上述生物相容性成膜聚合物列表的親水性聚合物加入到生物相容 性疏水涂層來改變釋放方式(或可將疏水性聚合物加入親水性涂層來改變釋放方 式)。例如，將選自下列的親水性聚合物加入脂肪族聚酯涂層來改變釋放方式聚 環(huán)氧乙垸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素及其組合。 可通過監(jiān)測本發(fā)明的組合物與治療性藥物的體外或體內(nèi)釋放方式來確定合適的相 對(duì)用量。
生物可降解的基質(zhì)
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是不改變該醫(yī)學(xué)裝置結(jié)構(gòu)與功能的合成或天然 的生物可降解的聚合物，例如乳酸、乙醇酸的脂肪族和羥基聚合物、混合的聚合物
和混合物、聚羥基丁酯和聚羥基-戊酯和對(duì)應(yīng)的混合物、或聚二噁酮(polydioxanon)、 改性淀粉、明膠、改性纖維素、己內(nèi)酰胺(caprolactaine)聚合物、聚丙烯酸、聚甲基 丙烯酸或其衍生物。這種生物可降解的聚合物與血液或其它體液接觸后可以受控方 式崩解(取決于載體材料的性能和涂層厚度)，接著緩慢釋放包含于其中的本發(fā)明組 合物。生物可降解涂層的討論見專門引為參考的美國專利號(hào)5,788,979。 將基質(zhì)涂布于醫(yī)學(xué)裝置
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物作為完整涂層的一部分至少涂 布于支架的外表面。將溶液涂布于支架上并使溶劑蒸發(fā)，藉此使得支架表面留有聚 合物和治療性物質(zhì)的涂層。溶液通?？捎萌魏魏线m的方法涂布于支架上，例如通過 浸漬、噴霧或乳槳沉積或蒸氣沉積。為涂布醫(yī)學(xué)裝置，例如支架，該支架浸在或用 粘性適中的基質(zhì)溶液噴涂。每一層涂好后，干燥支架再涂下一層。在一個(gè)實(shí)施方案 中，薄的油漆樣基質(zhì)涂層的厚度不超過100微米。選擇通過浸漬還是噴霧來涂布主 要取決于溶液的粘度和表面張力，然而，發(fā)現(xiàn)以細(xì)滴噴霧(例如得自噴槍的)作噴涂 可提供最均勻的涂層從而最佳控制涂布到支架上的涂層材料量。無論是通過噴霧還 是浸漬涂布，通常都需要多次涂布步驟來改善涂層的均勻性和控制涂布到支架上的 治療性物質(zhì)的量。包含在支架上的本發(fā)明組合物的量可通過涂布多層薄的溶液涂層 同時(shí)使涂布之間使其干透來容易地控制。整個(gè)涂層應(yīng)該足夠薄使得其不會(huì)顯著改變導(dǎo)管支架的血管內(nèi)遞送方式。涂層的粘附力和本發(fā)明組合物的遞送速率可通過選擇 合適的生物可吸收或生物穩(wěn)定的聚合物以及本發(fā)明的組合物與聚合物溶液之比來 控制。
為提供該實(shí)施方案的涂布支架，首先制備含有溶劑、溶解于溶劑的聚合物、 分散于溶劑中的本發(fā)明的組合物以及任選的交聯(lián)試劑的溶液。選擇與本發(fā)明的組合 物相容的溶劑和聚合物很重要。溶劑必須能將聚合物以所需濃度置于溶液中。溶劑 和聚合物的選擇也必須不會(huì)化學(xué)改變本發(fā)明組合物的治療特性。然而，本發(fā)明的組 合物僅需能分散在溶劑中，因此，可以是與該溶劑形成真正的溶液或分散在溶劑中 的細(xì)小顆粒。涂層涂布的優(yōu)選條件是聚合物和本發(fā)明的組合物具有共同的溶劑。該 條件是濕涂層是真正的溶液。含有本發(fā)明組合物的作為分散在溶劑中的聚合物溶液 固體分散物的涂層也可用，但不理想。在分散條件下，如果使用開槽或穿通孔的支 架，必須小心保證分散的藥物粉末的顆粒大小(最初粉末的大小及其聚集物和凝聚 物)足夠小從而不會(huì)導(dǎo)致涂層表面不規(guī)則或堵塞支架的開槽或穿通孔。當(dāng)將分散液 涂布到支架上需要改善涂層表面的光滑性或保證所有的藥物顆粒全部包裹進(jìn)聚合
物，或者當(dāng)需要減緩分散液或溶液沉積藥物的釋放速率時(shí)，可涂布用于提供藥物緩 釋的同一聚合物的透明(僅有聚合物)頂層或另一種聚合物以進(jìn)一步限制藥物擴(kuò)散
出涂層。
組合物涂布支架的外表面和內(nèi)表面，并且隨著其固化，將這些表面包裹在本 發(fā)明制劑的聚合物/組合物中。因此，干燥的支架在其表面包含本發(fā)明組合物的涂 層。浸漬方法優(yōu)選使得該溶液或懸浮液不會(huì)完全充滿支架的內(nèi)部或堵塞小孔。本領(lǐng) 域己知防止這種情況發(fā)生的方法，包括調(diào)節(jié)用于制備該組合物的溶液的表面張力、 浸漬后清潔腔室和放置直徑小于腔室的內(nèi)膜使得支架的所有表面與內(nèi)膜之間存在 通道。一種浸漬支架遠(yuǎn)端的替代方法是用含有本發(fā)明組合物的蒸氣形式的組合物噴 涂外表面和內(nèi)表面。
在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇能牢固粘附在支架或合成移植物表面的基質(zhì)。例如， 這可通過以連續(xù)薄層方式涂布基質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。每層基質(zhì)可加入抗體?；蛘?，本發(fā)明的 組合物可僅涂布于直接接觸血管腔的層上。不同類型的基質(zhì)可以連續(xù)涂布形成連續(xù) 層。
選擇的溶劑在粘度、聚合物的沉積水平、藥物制劑的溶解性、支架的濕潤性和適合涂布支架的溶劑的蒸發(fā)速率之間具有適當(dāng)?shù)钠胶?。在?yōu)選的實(shí)施方案中，所 選的溶劑應(yīng)是本發(fā)明組合物和聚合物都能溶于其中的溶劑。在一些情況下，選擇的 溶劑必須能使涂層聚合物溶解于其中而藥物制劑能分散于該溶劑的聚合物溶液中。 在該情況下，選擇的溶劑必須能懸浮本發(fā)明組合物的小顆粒而不使它們聚集或凝聚 成顆粒集合體在涂布時(shí)堵塞支架溝槽。雖然目標(biāo)是在加工過程中將溶劑除去使涂層 完全干燥，但該溶劑無毒、非致癌和不污染環(huán)境是很大的優(yōu)點(diǎn)。混合溶劑系統(tǒng)也可 用于控制粘度和蒸發(fā)速率。在所有情況中，溶劑決不能與本發(fā)明的組合物反應(yīng)或使 之失活或與涂層聚合物反應(yīng)。優(yōu)選的溶劑包括(但不限于)丙酮、N-甲基吡咯烷酮
(NMP)、 二甲基亞砜(DMSO)、甲苯、二甲苯、二氯甲垸、氯仿、1,1,2-三氯乙垸(TCE)、 各種氟利昂、二嗯垸、乙酸乙酯、四氫呋喃(THF)、 二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲基 乙酰胺(DMAC)、水和緩沖鹽水。
在一個(gè)實(shí)施方案中，支架用前聚合物、交聯(lián)劑和本發(fā)明組合物的混合物涂布， 然后經(jīng)過固化步驟，該步驟中前聚合物和交聯(lián)劑協(xié)同作用以產(chǎn)生含有本發(fā)明組合物 的固化聚合物基質(zhì)。固化過程包括溶劑的蒸發(fā)與聚合物的固化和交聯(lián)。某些硅酮材 料可在較低的溫度(即，室溫至5(TC)下固化，即所謂的室溫硫化(RTV)過程。當(dāng)然， 時(shí)間和溫度可隨具體的硅酮、交聯(lián)劑和生物活性物質(zhì)而變。
導(dǎo)管上涂層的量一般隨聚合物而變，可是涂布后導(dǎo)管總重量的約0.1-40%。聚 合物涂層可根據(jù)待涂布的聚合物的量進(jìn)行一次或多次涂布步驟。
將本發(fā)明的組合物加入基質(zhì)
本發(fā)明的組合物可共價(jià)或非共價(jià)地?fù)饺牖|(zhì)，其中該涂層可使得本發(fā)明的組 合物從中受控釋放。本發(fā)明的組合物可通過與基質(zhì)涂布溶液混合而摻入每層基質(zhì) 中?；蛘?，本發(fā)明的組合物可共價(jià)或非共價(jià)涂布在己涂布于醫(yī)學(xué)裝置的最后基質(zhì)層
上。如下所述，從醫(yī)學(xué)裝置上釋放本發(fā)明組合物的所需速率方式可通過改變涂層厚 度、本發(fā)明組合物的徑向分布(層對(duì)層)、混合方法、本發(fā)明組合物的量、不同層的 不同基質(zhì)聚合物材料的組合以及聚合物材料的交聯(lián)密度來確定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物加入到含有基質(zhì)的溶液中。例如，本發(fā) 明的組合物可以其合適的濃度與含有聚合物的溶液一起孵育。應(yīng)該理解的是，本發(fā) 明組合物的濃度可變并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需過多的實(shí)驗(yàn)就可確定最佳濃 度。然后通過本文所述的任何方法將本發(fā)明的組合物/聚合物混合液涂布到裝置上。溶液中本發(fā)明的組合物與聚合物之比取決于聚合物將本發(fā)明組合物固定到支 架上的效率和涂層將本發(fā)明組合物釋放入血管組織的速率。如果本發(fā)明的組合物保 留在支架上的效率較低，則需要更多聚合物，以提供能限制極本發(fā)明易溶組合物洗
出的洗出基質(zhì)。因此，本發(fā)明的組合物與聚合物適當(dāng)寬廣的比例可約是10:1-1:100。 本發(fā)明的組合物沉積到涂布的支架上
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的醫(yī)學(xué)裝置(例如支架)含有至少一層沉積在到至 少一部分支架涂層上的本發(fā)明組合物。如果需要，多孔層中可沉積本發(fā)明的組合物， 其中該多孔層中含有聚合物，從而可控制本發(fā)明組合物的釋放還能避免本發(fā)明組合 物降解。涂布該實(shí)施方案支架的方法披露于專門引為參考的美國專利號(hào)6,299,604。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物共價(jià)偶聯(lián)于基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明的組合物可通過使用異質(zhì)-或同質(zhì)-雙功能接頭分子共價(jià)偶聯(lián)于基質(zhì)。用于與 本發(fā)明組合物連接的接頭分子通常包括在組合物附著到支架后與基質(zhì)分子共價(jià)偶 聯(lián)。與基質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)后，該接頭分子提供了許多功能性活性基團(tuán)，可用這些基團(tuán)共 價(jià)偶聯(lián)一種或多種類型的本發(fā)明組合物。接頭分子可直接共價(jià)偶聯(lián)于基質(zhì)(即，通 過羧基)，或通過熟知的偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)，例如酯化、酰胺化和?；＠?，該 接頭分子可以是聚胺功能性聚合物，例如聚乙烯亞胺(PEI)、聚烯丙胺(PALLA)或聚 乙二醇(PEG)。各種PEG衍生物(例如mPEG-琥珀酰亞胺丙酯或mPEG-N-羥基琥珀 酰亞胺)與共價(jià)偶聯(lián)的方法可購自Shearwater Corporation, Birmingham, Ala.(也參 見引為參考的Weiner等，J.Biochem.Bi叩hysMethods, 45:211-219(2000))。應(yīng)該理 解的是，具體偶聯(lián)劑的選擇取決于本發(fā)明組合物所用的遞送載體的類型，這種選擇 無需過多的實(shí)驗(yàn)。
用本發(fā)明的組合物涂布支架
在又一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明組合物的薄層共價(jià)或非共價(jià)地與支架的外表 面結(jié)合。在該實(shí)施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法將支架表面制備成從分子上可接 受本發(fā)明的組合物。如果需要，可使本發(fā)明的組合物沉積在多孔層中，該多孔層中 含有聚合物，可通過聚合物控制本發(fā)明組合物的釋放并且還避免本發(fā)明組合物降 解。
含復(fù)合物的醫(yī)學(xué)裝置
在本發(fā)明醫(yī)學(xué)裝置的其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物通過在該醫(yī)學(xué)裝置形成之前，將本發(fā)明的組合物直接與醫(yī)學(xué)裝置中融化的聚合物混合與形成復(fù)合物，而 由該醫(yī)學(xué)裝置體提供。例如，本發(fā)明的組合物可混合進(jìn)例如硅酮橡膠或尿烷等材料 中。然后通過常規(guī)方法，例如擠壓、轉(zhuǎn)移到模或鑄造等加工以形成具體的構(gòu)型。該 方法得到的醫(yī)學(xué)裝置的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的組合物可分散于整個(gè)醫(yī)學(xué)裝置主體中。因 此，當(dāng)該醫(yī)學(xué)裝置與身體組織、器官或液體接觸時(shí)，本發(fā)明的組合物存在于該醫(yī)學(xué) 裝置的外表面可發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用。
本發(fā)明還通過以下非限制性實(shí)施例得到說明。所有的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的相同的意義。以下的具體例子說明了本發(fā)明組合物的制 備方法并且不能理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制?？尚薷倪@些方法來生產(chǎn)本發(fā)明包括 但未明確披露的組合物。此外，以略有變化的方式來生產(chǎn)相同組合物的這些方法的 變化形式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見的。
實(shí)施例
本文的實(shí)施例目的是舉例說明實(shí)施本發(fā)明的各種方面而絕非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
脂質(zhì)體通過模式識(shí)別受體的配體(PRRL)激活后顯著提高了天然免疫力的活性
和IFN-Y釋放
對(duì)陽離子脂質(zhì)體提高PRRL引發(fā)的免疫激活的能力在體外使用脾細(xì)胞試驗(yàn)作 評(píng)估。脾細(xì)胞從正常ICR小鼠制備并以5X 106/ml濃度加入24孔板的每個(gè)孔中。 含有質(zhì)粒DNA("DNA")、 CpG寡聚核苷酸("CpG")、咪唑并喹啉(R-848; InVivogen) 和純化的大腸桿菌內(nèi)毒素("LPS")的一系列不同的PRRL與陽離子脂質(zhì)體混合以 形成復(fù)合物。使用等摩爾量的DOTIM(十八烯氧基-乙基-2-十七碳烯基-3-羥乙 基)(octadecenoyloxy-ethyl-2-heptadecenyl-3-hydroxyethyl)和膽固醇制備陽離子脂質(zhì) 體并用0.5%的葡萄糖水溶液復(fù)水。為形成特定的PRRL-脂質(zhì)體復(fù)合物，將30jamo1 陽離子脂質(zhì)體加入0.5%的葡萄糖水溶液中，然后加入3嗎各種PRRL并用移 液器混合。為比較免疫剌激活性，將2.5^1的脂質(zhì)體-PRRL復(fù)合物加入每孔脾細(xì)胞 中使PRRL終濃度為500ng/ml。向其它孔中單加PRRL(50ng/ml)或脂質(zhì)體。細(xì)胞培 養(yǎng)物孵育18小時(shí)，然后收集上清液并用商業(yè)ELISA試驗(yàn)(R & D系統(tǒng))分析其IFN-y 的濃度。然后如圖1所示對(duì)IFN-y濃度進(jìn)行作圖。這些結(jié)果表明與單用PRRL相比，脂質(zhì)體-PRRL復(fù)合物是更強(qiáng)的免疫應(yīng)答和IFN-Y釋放的激活劑。此外，這些結(jié)果說 明這種脂質(zhì)體(以及其它潛在的遞送系統(tǒng))在總體上能充分改變各種PRRL的免疫刺 激性能。
買施例2
脂質(zhì)體通過模式識(shí)別受體的配體(PRRL)激活后改變了 IL-10的釋放 用實(shí)施例1所述的脾細(xì)胞試驗(yàn)評(píng)估了脂質(zhì)體提高天然免疫系統(tǒng)的一種關(guān)鍵性 免疫抑制細(xì)胞因子釋放的能力。PRRL(和或不和脂質(zhì)體一起)以終濃度500ng/ml加 入后，培育18小時(shí)。然后用ELISA測定來評(píng)估釋放進(jìn)上清液的IL-IO。出乎意料 的是，圖2的數(shù)據(jù)顯示脂質(zhì)體與PRRL組合可通過促進(jìn)IL-10的釋放(例如，用DNA 或R-848作為PRRL)或抑制IL-10的釋放(例如，用CpG或LPS作為PRRL)而顯著 改變PRRL的免疫學(xué)性能。例如，與單用LPS相比，脂質(zhì)體-LPS強(qiáng)烈抑制了IL-lO 的釋放，而脂質(zhì)體-R848象脂質(zhì)體-CpG—樣實(shí)際上增加了IL-10的釋放。因此，脂 質(zhì)體-TLR配體復(fù)合物的形成以TLR-配體特異性方式改變了該配體本身所引發(fā)的 細(xì)胞因子的釋放。細(xì)胞因子釋放的改變包括剌激與抑制兩種作用。在體內(nèi)，細(xì)胞因 子釋放的這種改變可能具有產(chǎn)生T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答的重要結(jié)果。這些資料再次 證實(shí)通過加入脂質(zhì)體或其它運(yùn)載體分子可充分改變PRRL的免疫學(xué)性能。
實(shí)施例3
脂質(zhì)體通過模式識(shí)別受體的配體(PRRL)激活后改變TNF-a的釋放 使用實(shí)施例1所述的脾細(xì)胞試驗(yàn)評(píng)估了脂質(zhì)體提高天然免疫系統(tǒng)的第二種關(guān) 鍵性刺激性細(xì)胞因子的釋放的能力。PRRL(和或不和脂質(zhì)體一起)以終濃度 500ng/ml加入后，培育18小時(shí)。然后用ELISA測定來評(píng)估釋放進(jìn)上清液的TNF-a。 圖3顯示的數(shù)據(jù)說明，與單用PRRL相比，脂質(zhì)體與PRRL的復(fù)合物是更強(qiáng)的免疫 刺激劑進(jìn)一步支持了可通過脂質(zhì)體來改變PRRL性能的原理。
實(shí)施例4
體外脂質(zhì)體通過與模式識(shí)別受體的配體(PRRL)接觸后改變了對(duì)樹突狀細(xì)胞的
激活的調(diào)節(jié)脾細(xì)胞與終濃度為500ng/ml的PRRL(和或不和脂質(zhì)體一起)一起孵育18小時(shí)。 然后收集脾細(xì)胞對(duì)細(xì)胞表型標(biāo)記(例如，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞標(biāo)記)的表面表達(dá)以 及早期激活標(biāo)記CD69的表達(dá)進(jìn)行免疫染色。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞并測定 了 CD69在樹突狀細(xì)胞上的表達(dá)。CD69的細(xì)胞表面表達(dá)表示為平均熒光強(qiáng)度 (MFI)。如CD69表達(dá)的上調(diào)所反映的，這些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)體形成復(fù)合物的 PRRL(就質(zhì)粒DNA和CpG寡聚核苷酸而言)提高了細(xì)胞激活，參見圖4。因此，如 CD69表達(dá)額外上調(diào)所反映的，脂質(zhì)體也可用于改變PRRL的細(xì)胞激活性能。
實(shí)施例5
與脂質(zhì)-DNA復(fù)合物混合的肽或蛋白抗原 使用與脂質(zhì)-DNA復(fù)合物混合的肽或蛋白抗原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來直接評(píng)估抗原特異 性應(yīng)答。在這些實(shí)驗(yàn)中使用MHC-肽四聚體來定量測定CTL數(shù)目和分布。使用 Kb-ova8四聚體在C57B16小鼠中追蹤用ova和優(yōu)勢的CTL表位肽(SIINFEKL; ova8) 免疫的CTL應(yīng)答。Kb-ova8四聚體由Ross Kedl，國家猶太醫(yī)學(xué)與研究中心(National Jewish Medical and Research Center), Denver, Colorado提供。這些實(shí)驗(yàn)使用較低劑 量的肽或蛋白(一般每次免疫每只小鼠接種l-5mg)來評(píng)估免疫的效果。出乎意料地 發(fā)現(xiàn)，用非編碼質(zhì)粒DNA和ova8肽一起配制的脂質(zhì)體-抗原-核酸復(fù)合物(LANAC) 極其有效地引發(fā)了CTL應(yīng)答(圖5，右下圖)。為分析LANAC免疫的效力，小鼠也 用經(jīng)ova8肽脈沖的自體骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞(DC)免疫和用四聚體評(píng)估CTL應(yīng) 答。這些研究表明，與樹突狀細(xì)胞疫苗接種相比，LANAC疫苗具有強(qiáng)烈的引發(fā)對(duì) 肽抗原的免疫應(yīng)答的能力。
CD8+T細(xì)胞對(duì)I類MHC四聚體(H-2 Kb)和模型抗原(卵白蛋白)的應(yīng)答反應(yīng)用 于定量測定CD8+T細(xì)胞對(duì)肽抗原免疫的應(yīng)答反應(yīng)(圖5，左上圖)。每只C57B16小 鼠(每組3-4只)免疫接種兩次，隔一周用體外以LPS激活，然后用lmM Kb-結(jié)合 ova8肽(SIINFEKL)脈沖的1 X 106自體骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞(DC)免疫。使用DC 通過SC途徑(圖5，右上圖)或IP途徑(圖5，左下圖)免疫小鼠。另一組小鼠(圖5， 右下圖)用LANAC配制的5mgova8肽免疫，然后經(jīng)IP注射。第二次免疫5天后， 收集脾細(xì)胞不作體外再次刺激立即用Kb-ova8四聚體(PE-標(biāo)記的)染色，然后用 CD8-APC、 CD44-FITC和II類MHC-PE/Cy5抗體染色。對(duì)所有CD8+(排除II類MHC+細(xì)胞后)進(jìn)行門控并分析四聚體和CD44染色情況；CD44高染色T細(xì)胞代表 記憶CTL染色。四聚體+細(xì)胞的數(shù)目表示為所分析的CD8+細(xì)胞總數(shù)的百分比。用 LANAC配制的ova8肽免疫誘導(dǎo)了比用ova8-脈沖的DC(脾CD8 T細(xì)胞總數(shù)的10% 為Ag特異性，而DC疫苗接種后為l-2n/。)更強(qiáng)的CTL應(yīng)答(圖3，右上幅)。與SC 或IM途徑相比，用LANAC經(jīng)IP途徑免疫是誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的最有效途徑(數(shù)據(jù) 未在文中顯示)。
實(shí)施例6 LANAC與"交叉敏化" 進(jìn)行一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來測試LANAC是否可用于有效地"交叉敏化"對(duì)蛋白抗原的 CTL應(yīng)答。就這些實(shí)驗(yàn)而言，完整的ova蛋白(經(jīng)小心過濾以除去任何小分子量的 肽)代替肽加入LANAC中并如實(shí)施例5所述免疫小鼠。第二次免疫5天后，使用 Kb-ova8四聚體評(píng)估脾臟中的CTL應(yīng)答。出乎意料的是，LANAC在交叉敏化對(duì)蛋 白抗原的CTL應(yīng)答中非常有效(圖6，中間圖)。LANAC引發(fā)的對(duì)蛋白抗原的CTL 應(yīng)答比相同量(重量)的肽抗原的應(yīng)答強(qiáng)1.5倍。因?yàn)槟芤l(fā)對(duì)蛋白抗原的CTL應(yīng)答 使得最終可能用完整的蛋白抗原來免疫人，而無需考慮MHC背景或靶抗原肽的特 異性，這些結(jié)果非常重要。此外，該系統(tǒng)的應(yīng)答用非復(fù)制系統(tǒng)引發(fā)，而以前證實(shí)的 最好的CTL應(yīng)答用復(fù)制性載體引發(fā)，所述復(fù)制性載體例如是病毒(牛痘病毒、腺病 毒)或重組細(xì)菌(沙門氏菌、李斯特菌)。II類MHC四聚體用于證實(shí)LANAC系統(tǒng)能 引發(fā)強(qiáng)烈的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答。用MCC抗原免疫的小鼠產(chǎn)生了超過用DC免疫引發(fā) 的強(qiáng)烈的CD4應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示于文中)(圖6，右圖)。因此，LANAC配制的疫苗 能引發(fā)強(qiáng)烈和平衡的對(duì)蛋白抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。
實(shí)施例7
與其它常規(guī)疫苗相比，LANAC疫苗引發(fā)CTL應(yīng)答的效力 使用Kb-ova8四聚體評(píng)估用肽(圖7A)或蛋白(圖7B)免疫后Ag特異性CTL應(yīng) 答的強(qiáng)度。用完全弗氏佐劑配制的50mg肽或經(jīng)肽(lmm)-脈沖的DC引發(fā)對(duì)肽的免 疫應(yīng)答。就蛋白疫苗接種而言，通過IV注射用編碼Ova的牛痘病毒、經(jīng)兩側(cè)IM 注射用100mg編碼ova的質(zhì)粒DNA或用經(jīng)ova蛋白脈沖的DC來免疫小鼠。每只小鼠用含有5mg肽或蛋白的LANAC免疫，然后如實(shí)施例6所述分析脾細(xì)胞的四 聚體應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)表明LANAC疫苗在引發(fā)CTL應(yīng)答方面也優(yōu)于其它常規(guī)類型 的疫苗。
比較了 LANAC疫苗與其它常規(guī)疫苗在引發(fā)CTL應(yīng)答中的效力，所述常規(guī)疫 苗包括肽遞送系統(tǒng)(肽脈沖的DC，以完全弗氏佐劑配制的肽)和蛋白疫苗(ova-DNA 疫苗、ova-牛痘病毒、ova-脈沖的DC)。免疫C57B16小鼠(每組4只小鼠)并評(píng)價(jià)脾 臟中的CTL應(yīng)答。在各種情況中，特別是蛋白疫苗，LANAC配制的疫苗明顯更 好(圖7A)。
實(shí)施例8
脂質(zhì)體提高作為疫苗佐劑的PRRL引發(fā)CTL應(yīng)答的能力 在小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來確定在不同的PRRL中加入脂質(zhì)體是否可提高PRRL作 為疫苗佐劑的能力。評(píng)估PRRL包含有質(zhì)粒DNA、 CpG寡聚核苷酸、聚I:C(合成 的ds-RNA模擬物)、酵母聚糖(得自酵母細(xì)胞壁)、與R-848和LPS。使用能定量測 定體內(nèi)卵白蛋白特異性CD8+T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的MHC-肽四聚體試劑評(píng)估了 C57B16小鼠對(duì)模型抗原卵白蛋白的免疫應(yīng)答。用5嗎卵白蛋白與不同的脂質(zhì)體 -PRRL復(fù)合物疫苗一起免疫小鼠兩次，間隔一周，然后用MHC-肽四聚體和流式細(xì) 胞術(shù)分析脾和肺細(xì)胞。為制備不同的疫苗，脂質(zhì)體先加入到lml 5%的葡萄糖水溶 液中，接著加入100pg的各種特異性PRRL，再加入卵白蛋白。通過IP途徑用200^1 脂質(zhì)體-PRRL復(fù)合物免疫小鼠。然后收集脾細(xì)胞并首先用MHC-肽四聚體作免疫染 色，接著用CD8和CD44染色。然后用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞并基于每個(gè)處理組3 只小鼠的組大小計(jì)算抗原特異性CTL的平均百分比。對(duì)照小鼠未接著疫苗。示于 圖8的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含PRRLDNA、 CpG寡聚物、聚I:C、酵母聚糖和R-848 的脂質(zhì)體復(fù)合物均可作為有效的疫苗佐劑在體內(nèi)引發(fā)CTL應(yīng)答。相反，脂質(zhì)體-LPS 不是有效的疫苗佐劑。也發(fā)現(xiàn)僅與卵白蛋白一起施用的DNA或CpG寡聚物，或 脂質(zhì)體只加上卵白蛋白不能有效地引發(fā)CTL應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，將運(yùn)載體 分子(例如脂質(zhì)體)加入PRRL可顯著提高其作為疫苗佐劑的效力，特別是用于引發(fā) CTL應(yīng)答。實(shí)施例9
脂質(zhì)體-PRRL復(fù)合物也可作為引發(fā)肺中CTL應(yīng)答的有效疫苗佐劑 進(jìn)行以上實(shí)施例8所述的實(shí)驗(yàn)來確定脂質(zhì)體-PRRL復(fù)合物是否也可引發(fā)肺組 織中的強(qiáng)烈CTL應(yīng)答。這種T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)抵御吸入性病原體(例如流感病毒)的免 疫應(yīng)答中特別需要。用卵白蛋白第二次免疫后收集肺細(xì)胞并用MHC-肽四聚體分析 肺細(xì)胞來定量測定卵白蛋白特異性CTL應(yīng)答。如圖9所示，與脾臟應(yīng)答相比，除 了在肺中酵母聚糖更有效而R-848無效外，發(fā)現(xiàn)肺中對(duì)用脂質(zhì)體-PRRL疫苗佐劑 免疫的CTL應(yīng)答的模式類似于圖8所示的免疫小鼠的脾臟應(yīng)答。因此，這數(shù)據(jù)表 明，除了在淋巴組織中(例如脾臟)有應(yīng)答外，脂質(zhì)體-PRRL疫苗佐劑也能在外周組 織(例如肺)中有效地引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。
實(shí)施例10
確定3部分的脂質(zhì)體-抗原-核酸復(fù)合物是否為有效免疫所需 為確定3部分的脂質(zhì)體-抗原-核酸復(fù)合物是有效免疫所需，用結(jié)合有各種脂質(zhì) 體和DNA組合的5嗎ova蛋白經(jīng)通過IP途徑免疫小鼠。將Ova蛋白加入等量的單 獨(dú)質(zhì)粒DNA(圖10，第一圖)中、單獨(dú)的脂質(zhì)體(圖IO，第二圖)或脂質(zhì)體加上DNA 中(圖10，第三圖)("ova/LADC";注意"LADC"表示與"LANAC"相同的制劑)。 收集脾細(xì)胞用Kb-ova8四聚體染色來定量測定CTL應(yīng)答。與用脂質(zhì)-DNA復(fù)合物 引發(fā)的應(yīng)答相比，觀察到單用DNA或脂質(zhì)體的CTL應(yīng)答極其微弱，這表明脂質(zhì) 體、TLR配體和抗原的3部分的組合確實(shí)是有效免疫所需的。
實(shí)施例11
用脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物免疫引發(fā)的T細(xì)胞的功能能力 也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來評(píng)估用脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物免疫引發(fā)的T細(xì)胞的功能能力。將 用LANAC配制的ova8肽(示于圖11A)或肽-脈沖的DC(示于圖IIB)免疫的小鼠(每 組4只)的脾細(xì)胞在體外用ova8肽再次刺激，用ELISA評(píng)估IFN-y的產(chǎn)生。用LANAC 配制的ova8肽或DC疫苗免疫的小鼠的T細(xì)胞產(chǎn)生了高水平的IFN-y釋放，而僅 用LANAC配制的ova蛋白(和不用ova脈沖的DC)不引發(fā)CTL的IFN-丫釋放。使 用其它抗原(包括仙臺(tái)病毒、滅活的RSV、 RSVM2肽、黑色素瘤trp-2抗原和KLH蛋白)的LANAC免疫通過在體外使培養(yǎng)的T細(xì)胞與抗原接觸也引發(fā)了高水平的 IFN-Y產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未示于文中)。此夕卜，LANAC免疫小鼠(ovq8或trp2肽)的T細(xì)胞在 體外再次刺激5天后也產(chǎn)生了高水平的特異性CTL活性(數(shù)據(jù)未示于文中)。這些 數(shù)據(jù)表明LANAC免疫確實(shí)能引發(fā)對(duì)各種抗原的功能性Thl和Tcl T細(xì)胞細(xì)胞因子 應(yīng)答。
實(shí)施例12
脂質(zhì)體-核酸疫苗接種引發(fā)體液應(yīng)答的能力 還用ova-LANAC系統(tǒng)(但是在BALB/c小鼠中)評(píng)估了脂質(zhì)體-核酸疫苗接種引 發(fā)體液應(yīng)答的能力。參見圖12A，用10昭以LANAC或完全弗氏佐劑(CFA)配制的 ova(蛋白)經(jīng)SC途徑免疫BALB/c小鼠兩次(間隔兩周)，用ELISA測定收集的連續(xù) 血清樣品的抗ova抗體滴度(圖12B)。用LANAC經(jīng)SC免疫引發(fā)的抗體應(yīng)答幾乎 與CFA引發(fā)的相等。經(jīng)IP途徑免疫的小鼠產(chǎn)生了更高的滴度，平均滴度為 1:1,300,000。用其它抗原，包括KLH免疫動(dòng)物后也觀察到了類似的滴度(數(shù)據(jù)未示 于文中)。因此，脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物也非常有效地誘導(dǎo)了體液免疫力。這些數(shù)據(jù)進(jìn) 一步表明，如四聚體染色所評(píng)估的，CTL應(yīng)答確實(shí)是強(qiáng)烈的CD4 T細(xì)胞和體液免 疫應(yīng)答的有力預(yù)兆。
實(shí)施例13
評(píng)估對(duì)LANAC疫苗接種的T細(xì)胞記憶應(yīng)答 進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來評(píng)估對(duì)LANAC疫苗接種的T細(xì)胞記憶應(yīng)答。用 ova-LANAC通過IP途徑免疫兩次后，通過酶消化小鼠的肺組織獲得CD8+T細(xì)胞， 使用kb-ova8四聚體進(jìn)行分析。免疫后5天(圖13，上兩幅)和免疫后30天(圖13， 下兩幅)定量測定對(duì)照組和疫苗接種組小鼠(每組3只)的四聚體陽性細(xì)胞。以tet+細(xì) 胞占肺CD8 T細(xì)胞總數(shù)的平均百分比作圖。雖然在免疫兩周時(shí)有大量的CTL應(yīng)答， 但有爭議的是這些T細(xì)胞實(shí)際上是短命的會(huì)快速消失。
用四聚體檢查了CTL記憶細(xì)胞，包括淋巴器官和外周組織。已知，例如小鼠 的病毒感染最初導(dǎo)致淋巴器官中的Ag特異性T細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增，然后這些長壽 記憶CTL擴(kuò)散至非淋巴組織中，包括肺。用ova-LANAC免疫后確實(shí)觀察到發(fā)生了相同的現(xiàn)象。在第二次IP免疫后第5天的肺組織中，發(fā)現(xiàn)抗原特異性CTL的大
量擴(kuò)增，其數(shù)量與LCMV感染后觀察到的相當(dāng)(圖13)。特別是，這些小鼠的肺細(xì) 胞中，每3個(gè)CD8+T細(xì)胞中有兩個(gè)是ova特異性的。在肝臟中也觀察到了大量的 ova特異性CTL(數(shù)據(jù)未示于文中)?？赡芡瑯又匾氖牵l(fā)現(xiàn)外周組織中的這些CTL 也是長壽的。第二次免疫后第30天檢查小鼠，肺CD8+T細(xì)胞總數(shù)的約30。/。仍然是 ova特異性的，60天時(shí)該數(shù)目依舊很高(未顯示)。此外，當(dāng)在體外用ova肽再次刺 激傻種后)30天小鼠的脾細(xì)胞時(shí)，它們?nèi)阅墚a(chǎn)生高水平的IFN-y(數(shù)據(jù)未示于文中)。 因此，用LANAC免疫產(chǎn)生了極大量的長時(shí)間存在于肺和其它組織的記憶性CTL。 肺組織中存在大量的長壽記憶性T細(xì)胞是提高對(duì)吸入性病原體(例如，耶爾森菌屬 (Fm!'m'a))的快速應(yīng)答的很理想的狀況。
實(shí)施例14
評(píng)估經(jīng)粘膜施用LANAC引發(fā)局部和全身性免疫應(yīng)答的能力 因?yàn)槭褂肔ANAC作胃腸外免疫非常有效，故評(píng)估了經(jīng)粘膜施用LANAC引 發(fā)局部和全身性免疫應(yīng)答的能力。用5mg/小鼠的ova-LANAC 口服(圖14，中間一 幅)或鼻內(nèi)途徑(圖14，右邊一幅)免疫小鼠兩次，然后用四聚體定量測定Ag特異性 CTL應(yīng)答。通過酶消化收集肺細(xì)胞，對(duì)活的脾臟淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行門控 分析。
用四聚體檢測到鼻內(nèi)免疫在肺中引發(fā)了相當(dāng)強(qiáng)的CTL應(yīng)答(圖14，右一幅)。 然而，最令人感到意外的是口服施用5mg ova蛋白在引發(fā)全身性CTL應(yīng)答中非常 有效，包括血液、脾臟、肝臟和肺(圖14，中間一幅)。事實(shí)上，口服對(duì)引發(fā)CTL 應(yīng)答與SC或IM免疫同樣有效。同等重要的是，如經(jīng)離體再剌激后產(chǎn)生高水平的 IFN-y所證實(shí)的那樣，口服免疫引發(fā)的CTL是長壽(至少60天)和功能性的(數(shù)據(jù)未 示于文中)。因此，使用脂質(zhì)體-TLR配體復(fù)合物作為佐劑的蛋白疫苗口服途徑免疫 可能是一種粘膜疫苗接種的快速方法。
實(shí)施例15
評(píng)估和比較LANAC分布到淋巴器官中的效率使用BODIPY標(biāo)記的脂質(zhì)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來評(píng)估和比較LANAC分布到淋巴器官 中的效率。確定了用LANAC經(jīng)SC或IP途徑免疫的6小時(shí)或24小時(shí)后標(biāo)記的復(fù) 合物是否可在在淋巴結(jié)中鑒定到。在腹部兩側(cè)SC免疫后，收集腹股溝淋巴結(jié)，而 在IP免疫后收集腸系膜淋巴結(jié)。用CDllb、 CDllc和II類MHC的抗體染色淋 巴結(jié)細(xì)胞作流式細(xì)胞術(shù)分析。對(duì)活細(xì)胞設(shè)置分析閘門使只有結(jié)合了 LANAC的細(xì)胞 得到分析。免疫接種兩處部位的淋巴結(jié)中均發(fā)現(xiàn)復(fù)合物，但在IP免疫后LANAC 在引流淋巴結(jié)中的分布配更有效(圖15)。該復(fù)合物主要包含在CDllbhl、CDllcb 和II類中介細(xì)胞內(nèi)。IP免疫后，在腹膜液體中觀察到與該相同的細(xì)胞群結(jié)合的標(biāo) 記復(fù)合物。因此，看來IP注射后LANAC在淋巴結(jié)中的攝取更有效，這與IP注射 后引發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)于SC或iv后引發(fā)有關(guān)(數(shù)據(jù)未示于文中)。圖15所示的含 有標(biāo)記的LANAC遷移至腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)胞具有與巨噬細(xì)胞最一致的表型。然 而，幾種出版物現(xiàn)已證實(shí)在腹膜腔內(nèi)存在樹突狀細(xì)胞。這些處于靜息狀態(tài)下的細(xì)胞 通常具有巨噬細(xì)胞樣形態(tài)，但可通過炎性刺激或用不同細(xì)胞因子的混合物，特別是
GM-CSF+/-TNF-a誘導(dǎo)分化為典型的樹突狀細(xì)胞。因此，情況很可能是在注射后， 真正的巨噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞樣的樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞均存在腹膜的胞吞 LANAC中。一旦這些前-DC攝取了此復(fù)合物，它們通過TLR接受了激活信號(hào)， 成熟為更典型的DC，然后遷移至進(jìn)行抗原呈遞的區(qū)域淋巴結(jié)。在皮膚中，情況可 能是典型的DC(例如朗格漢斯細(xì)胞)對(duì)LANAC攝取和抗原呈遞更重要。
實(shí)施例16 制備陽離子脂質(zhì)DNA復(fù)合物(CLDC) 如上所述(Solodin等，S!'oc/iemf"^， 34:13537-13544(1995)，全文納入作為參 考)，用于以下實(shí)驗(yàn)的陽離子脂質(zhì)體(除非另有指出)由摩爾比為1:1的DOTAP(l，2-二油酰-3-三甲銨-丙烷)和膽固醇混合而成，在圓底試管中干燥，然后用0.5%的葡 萄糖溶液(D5W)加熱至50。C、 6小時(shí)復(fù)水。用類似于所述一些實(shí)驗(yàn)的方法制備其它 脂質(zhì)(例如，DOTMA)。該方法得到由多層脂泡(MLV)組成的脂質(zhì)體，本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)與小單層脂泡(SUV)相比，MLV具有最佳的轉(zhuǎn)染效率。MLV和相關(guān)"擠壓脂質(zhì)" 的產(chǎn)生也描述于Liu等，Atoww5/ofed 15:167-173 (1997)和Templeton等，Atowe 5/ofec/z.， 15:647-652 (1997); 二者均全文納入作為參考。如前所述，使用改進(jìn)的堿裂解法和聚乙二醇沉淀(Liu等，1997，同上)純化大腸桿菌的質(zhì)粒DNA(pCR3.1， Invitrogen)。將用于注射的DNA懸浮于蒸餾水中。真核DNA(鮭魚睪丸和小牛胸腺) 購自Sigma化學(xué)品公司(Sigma Chemical Company)。就本文報(bào)道的許多實(shí)驗(yàn)而言， 所述質(zhì)粒DNA不含有基因插入物(除非另有注釋)，因此稱為"非編碼"或"空載 體"DNA。
用于這些實(shí)驗(yàn)的陽離子脂質(zhì)TLR-配體通過室溫輕柔地將TLR配體加入用5% 葡萄糖溶液(D5W)配制的脂質(zhì)溶液中，然后輕柔地上下移液抽吸數(shù)次以保證適當(dāng)?shù)?混合。TLR-配體:脂質(zhì)之比是l:8(1.0pg的DNA與8nmo1脂質(zhì))。復(fù)合物在制備后 30-60分鐘內(nèi)使用。如上所述，為制備用于一些實(shí)驗(yàn)(所示的)中的小單層脂泡(SUV)， 使用上述MLV脂質(zhì)體經(jīng)過5分鐘的超聲波處理形成CLDC(Liu等，1997，同上)。
以上描述應(yīng)理解為僅是對(duì)本發(fā)明主旨的描述。此外，因?yàn)樵S多改進(jìn)和改變對(duì) 本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的，本發(fā)明不希望受限于上述顯示的具體構(gòu)建物和方 法。因此，所有合適的改進(jìn)和等價(jià)物均屬于以下權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。 當(dāng)短語"含有"、"含有的"、"包括"和"包含的"用于本說明書和后面的權(quán)利要求 書中時(shí)，其表示所述特征、整數(shù)、組分或步驟的存在，但它們不排除一種或多種其 它特征、整數(shù)、組分、步驟或其組合的存在或加入。
權(quán)利要求
1.一種方法，所述方法包括將含有至少一種模式識(shí)別受體分子的配體和遞送載體的組合物施用至受試對(duì)象。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別受體的配體包括信號(hào) 模式識(shí)別受體的配體。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)模式識(shí)別受體包括至少一 種選自下組的受體Toll樣受體TLR-l、 TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8、 TLR-9、 TLR-IO、 TLR-ll和TLR-12和甘露聚糖結(jié)合凝集素，以 及巨噬細(xì)胞甘露糖受體和清除受體。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述配體包括TLR-2、 TLR-3和/ 或TLR-9的配體。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別受體的配體包括內(nèi)吞 模式識(shí)別受體或清除受體或甘露糖結(jié)合受體的配體。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，還包括調(diào)節(jié)所述受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括提高免疫應(yīng)答。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括下調(diào)免疫應(yīng)答。
9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括提高易患癌 癥的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述癌癥包括以下一種或多種癌 癥肺癌、皮膚癌、肝癌、骨髓癌、白血病、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、 淋巴瘤、腦癌、腎細(xì)胞癌和間充質(zhì)組織癌。
11. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括提高易患 感染性疾病的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
12. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述感染性疾病由以下一種或多 種生物引起病毒病原體、真菌病原體、細(xì)菌病原體、立克次氏體病原體、寄生蟲 病原體和朊病毒病原體。
13. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括提高或抑 制易患過敏性疾病的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述過敏性疾病由對(duì)內(nèi)源性非自 身抗原的異常免疫應(yīng)答所引起。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述非自身抗原包括吸入的過敏 原、皮膚過敏原和口服過敏原中的至少一種。
16. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括調(diào)節(jié)易患 自身免疫疾病的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病由對(duì)自身抗原 的異常免疫應(yīng)答所引起。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述對(duì)自身抗原的異常免疫應(yīng)答 由至少一種選自以下的抗原所引起衍生自神經(jīng)系統(tǒng)的抗原、衍生自關(guān)節(jié)的抗原、 衍生自血液成分的抗原、衍生自腎臟的抗原與衍生自眼睛的抗原。
19. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括調(diào)節(jié)易患 體內(nèi)異常產(chǎn)生的蛋白質(zhì)所致疾病的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
20. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病由異常產(chǎn)生的 蛋白質(zhì)所引起。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述異常產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括選自 以下的蛋白質(zhì)腦中的異常蛋白、腎臟中的異常蛋白和關(guān)節(jié)中的異常蛋白。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述腦中的異常蛋白包括阿爾茨 海默病中的腦或血液中的異常蛋白。
23. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述施用包括至少通過一種選自 以下的途徑來施用靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、吸入、皮下、真皮內(nèi)、淋巴節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、 鼻內(nèi)、口服、直腸、陰道內(nèi)、囊內(nèi)、眼內(nèi)和局部。
24. —種方法，所述方法包括施用一種能誘導(dǎo)針對(duì)特定細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答 的制劑，所述制劑能誘導(dǎo)針對(duì)該細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答并抑制該類型細(xì)胞的正?；虍?常功能。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述特定細(xì)胞類型包括用于抑制 新血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞。
26. —種方法，所述方法包括施用能刺激新血管生成和/或纖維生成和/或骨生 成的至少一種模式識(shí)別受體的配體和遞送載體。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別受體的配體與所述遞送載體形成復(fù)合物。
28. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別受體選自TLR配 體和其它模式識(shí)別受體。
29. 如權(quán)利要求26所述的方法，還包括治療患有創(chuàng)傷、骨缺陷或骨折的受試對(duì)象。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述創(chuàng)傷包括皮膚或軟組織的創(chuàng) 傷或缺陷。
31. —種組合物，所述組合物包含模式識(shí)別受體分子家族的配體；和遞送載 體，其中所述組合物能在受試對(duì)象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
32. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述誘導(dǎo)免疫應(yīng)答包括誘導(dǎo)天 然免疫應(yīng)答。
33. 如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述天然免疫應(yīng)答包括巨噬細(xì) 胞、中性白細(xì)胞、NK細(xì)胞和/或樹突狀細(xì)胞參與的天然免疫應(yīng)答。
34. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體包括脂質(zhì)體。
35. 如權(quán)利要求34所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體的毫摩爾數(shù)與配體 的毫克數(shù)之比約為1:1-100:1。
36. 如權(quán)利要求34所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體的毫摩爾數(shù)與配體 的毫克數(shù)之比約為16:1或約為8:1。
37. 如權(quán)利要求34所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體至少包括選自帶正 電的脂質(zhì)體、帶負(fù)電的脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體中的一種。
38. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體包括脂質(zhì)體的任 何組合。
39. 如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述帶正電的脂質(zhì)體與模式識(shí) 別受體分子家族的配體形成復(fù)合物。
40. 如權(quán)利要求34所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體由摩爾比為1:1的 DOTIM(l-(2-(油酰氧)乙基)-2-油烯基-3-(2-羥乙基)咪唑啉鑰)的荷電和電中性脂質(zhì)與膽固醇的混合物組成。
41. 如權(quán)利耍求31所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體是非脂質(zhì)體。
42. 如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述非脂質(zhì)體輸送載體包括至 少一種選自以下的載體多肽、多胺、殼聚糖、PEI、聚谷氨酸、硫酸精蛋白和微 球。
43. 如權(quán)利要求34所述的組合物，其特征在于，所述配體包括TLR配體。
44. 如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有細(xì)菌的某一部分。
45. 如權(quán)利要求44所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)菌的某一部分還包括與 TLR結(jié)合的細(xì)菌的某一部分。
46. 如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體包括與TLR-1、 TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 丁LR-7、 TLR-8、 TLR-9、 TLR-IO、 TLR-ll 和TLR-12中任何一個(gè)結(jié)合的細(xì)菌的某一部分。
47. 如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體包括真菌生物 的某一部分。
48. 如權(quán)利要求47所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體包括能與TLR 結(jié)合的真菌生物的某一部分。
49. 如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述真菌生物的某一部分還包 括與以下至少一種受體結(jié)合的酵母的某一部分TLR-1、 TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8、 TLR-9、 TLR-IO、 TLR-11和TLR-12。
50. 如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體包括多細(xì)胞生 物的某一部分。
51. 如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體包括單細(xì)胞生 物的某一部分。
52. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括至少一種選自以 下的物質(zhì)衍生自細(xì)菌病原體某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)、核 酸和/或蛋白或肽序列。
53. 如權(quán)利要求52所述的組合物，還包括與以下至少一種受體結(jié)合的細(xì)菌病原 體的某一部分TLR-1、 丁LR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8、TLR-9、 TLR-IO、 TLR-ll和TLR-12。
54. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括至少一種選自以 下的配體與TLR-1、 TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8、 TLR-9、 TLR-IO、 TLR-ll和TLR-12中的一種或多種結(jié)合的衍生自真菌生物某一 部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)、核酸和/或蛋白或肽序列。
55. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括衍生自真菌生物 某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)、核酸與和/或蛋白或肽序列。
56. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括衍生自病毒生物 某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)、核酸與和/或蛋白或肽序列。
57. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括衍生自立克次氏 體生物某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)、核酸與和/或蛋白或肽序 列。
58. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括衍生自寄生蟲生 物體某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)、核酸與和/或蛋白或肽序列。
59. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括衍生自節(jié)肢動(dòng)物 生物體某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖類、脂質(zhì)、核酸和/或蛋白或肽序列。
60. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體含有編碼TLR配體 的核酸。
61. 如權(quán)利要求60所述的組合物，其特征在于，所述核酸含有至少一種選自以 下的分子細(xì)菌DNA、真核DNA、 dsDNA、 ssDNA合成的寡聚核苷酸、RNA和 合成的RNA。
62. 如權(quán)利要求61所述的組合物，其特征在于，所述寡聚核苷酸含有聚I:C或 相關(guān)的聚I:C寡聚核苷酸的至少一種。
63. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體是兩種或多種不同的 TLR配體以足夠引發(fā)免疫應(yīng)答的比例相混合的混合物。
64. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體由能結(jié)合和/或刺激 模式識(shí)別受體的任何分子組成。
65. 如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述配體包括能結(jié)合并刺激模 式識(shí)別受體的合成產(chǎn)生的配體。
66. 如權(quán)利要求31所述的組合物，還包含有具有甾體骨架的任何分子。
67. 如權(quán)利要求60所述的組合物，還包含有DNA凝聚劑。
68. 如權(quán)利要求67所述的組合物，其特征在于，所述DNA凝聚劑是聚乙烯亞 胺(PEI)。
69. —種組合物，所述組合物含有 至少一種抗原；和一種含有遞送載體的佐劑組合物；和至少一種模式識(shí)別受體分子的配體。
70. 如權(quán)利要求69所述的組合物，還含有與所述遞送載體形成復(fù)合物的所述抗 原和所述模式識(shí)別分子受體的配體。
71. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述模式識(shí)別分子受體的配體 包括TLR受體的配體。
72. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述抗原含有整個(gè)微生物。
73. 如權(quán)利要求72所述的組合物，其特征在于，所述微生物包括至少一種選自 下組的生物病毒生物、細(xì)菌生物、真菌生物、原蟲生物、寄生蟲致病性生物、立 克次氏體生物和節(jié)肢動(dòng)物生物。
74. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述抗原包括至少一種選自以 下的分子蛋白、肽、糖類、脂蛋白、糖肽、糖蛋白、糖脂和脂質(zhì)。
75. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述抗原是細(xì)胞。
76. 如權(quán)利要求75所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞由一種或多種自體或 同種異體腫瘤細(xì)胞組成。
77. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體包括脂質(zhì)體。
78. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體包括選自以下的 脂質(zhì)多層脂泡脂質(zhì)、擠壓脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。
79. 如權(quán)利要求77所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體包括至少一種選自 以下的脂質(zhì)體帶正電的脂質(zhì)體、改進(jìn)的多層脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、中性脂質(zhì)體 和帶負(fù)電的脂質(zhì)體。
80. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體含有至少一對(duì)以 下脂質(zhì)DOTMA和膽固醇；DOTAP和膽固醇；DOTIM和膽固醇；DDAB禾卩膽固醇。
81. 如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體包括非脂質(zhì)體輸 送載體。
82. 如權(quán)利要求81所述的組合物，所述遞送載體包括至少一種選自以下的載 體多肽、多胺、殼聚糖、PEI、聚谷氨酸、硫酸精蛋白和三氯酚。
83. —種疫苗接種的方法，所述方法包括向受試對(duì)象施用抗原組合物；和含 有遞送載體的佐劑組合物；以及TLR配體。
84. 如權(quán)利要求83所述的方法，還包括所述遞送載體與所述抗原和所述TLR 配體形成復(fù)合物。
85. 如權(quán)利要求83所述的方法，還包括通過選自以下的途徑施用所述組合物 靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、吸入、皮下、真皮內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、直腸、陰 道內(nèi)、囊內(nèi)、眼內(nèi)和局部。
86. 如權(quán)利要求83所述的方法，還包括提高易患癌癥的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
87. 如權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于，所述癌癥包括至少一種以下癌癥 肺癌、皮膚癌、肝癌、骨髓癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、腦 癌、腎細(xì)胞癌和間充質(zhì)組織癌。
88. 如權(quán)利要求83所述的方法，還包括提高易患感染性疾病的受試對(duì)象的免疫 應(yīng)答。
89. 如權(quán)利要求88所述的方法，其特征在于，所述感染性疾病包括至少一種由 以下生物引起的疾病病毒病原體、真菌病原體、細(xì)菌病原體、立克次氏體病原體、 寄生蟲病原體、節(jié)肢動(dòng)物病原體和朊病毒病原體。
90.一種組合物，所述組合物含有含有至少一種抗原、遞送載體和模式識(shí)別受體分子的至少一種配體的佐劑組合物。
91. 如權(quán)利要求90所述的組合物，還含有摻入所述遞送載體中，然后與模式識(shí) 別分子受體的配體相混合的所述抗原。
92. 如權(quán)利要求91所述的組合物，其特征在于，所述模式識(shí)別分子受體的配體 包括TLR配體。
93. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體含有脂質(zhì)體。
94. 如權(quán)利要求93所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體的納克數(shù)與脂 質(zhì)體的納摩爾數(shù)之比約為1:1-100:1。
95. 如權(quán)利要求93所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體由至少一種選自以下的分子組成帶正電的脂質(zhì)體、帶負(fù)電的脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體和改進(jìn)的多層脂質(zhì)體。
96. 如權(quán)利要求95所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)體還包括與細(xì) 菌DNA形成復(fù)合物的所述陽離子脂質(zhì)體。
97. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述遞送載體由荷電與中性脂 質(zhì)的混合物組成。
98. 如權(quán)利要求卯所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有能與TLR 結(jié)合的細(xì)菌的某一部分。
99. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有細(xì)菌的細(xì) 胞壁成分。
100. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體結(jié)合至少一種 選自以下的受體TLR-1、 TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8、 TLR-9、 TLR-IO、 TLR-ll和TLR-12。
101. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體結(jié)合TLR2、 TLR5或TLR9。
102. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有鞭毛蛋白。
103. 如權(quán)利要求102所述的組合物，其特征在于，所述鞭毛蛋白含有能結(jié)合并 激活TLR 5的鞭毛蛋白的最小部分。
104. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有核酸。 、
105、如權(quán)利要求104所述的組合物，其特征在于，所述核酸包括至少一種選自以下的分子細(xì)菌DNA、真核DNA、合成的寡聚核苷酸物和RNA。
106. 如權(quán)利要求105所述的組合物，其特征在于，所述RNA包括至少一種選 自以下的分子雙鏈RNA、單鏈RNA和合成的RNA。
107. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有能結(jié)合 TLR3的聚I:C和聚I:C相關(guān)寡聚核苷酸中的至少一種。
108. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有真菌或酵 母菌生物的某一部分。
109. 如權(quán)利要求108所述的組合物，所述真菌或酵母菌生物的該部分含有該生物體的細(xì)胞壁的某一部分。
110. 如權(quán)利要求卯所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體含有兩種或多種不同的TLR配體以足夠引發(fā)免疫應(yīng)答的比例混合的混合物。
111. 如權(quán)利要求90所述的組合物，其特征在于，所述TLR配體由能結(jié)合和/ 或刺激TLR的任何配體組成。
112. —種治療患癌癥的受試對(duì)象的方法，所述方法包括 與至少一種癌癥治療方法相結(jié)合，施用至少一種模式識(shí)別受體的配體和遞送載體；其中所述方法能引發(fā)易患癌癥的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
113. 如權(quán)利要求112所述的組合物，其特征在于，所述癌癥治療方法包括高溫 療法、放療、化療、光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)、外科手術(shù)、超聲波和聚焦超聲波的至少 一種。
114. 如權(quán)利要求112所述的方法，其特征在于，給予所述療法的順序不同會(huì)產(chǎn) 生不同的應(yīng)答。
115. 如權(quán)利要求114所述的方法，其特征在于，先進(jìn)行放療。
116. 如權(quán)利要求114所述的方法，其特征在于，最后進(jìn)行放療。
117. 如權(quán)利要求114所述的方法，其特征在于，同時(shí)進(jìn)行放療。
118. 如權(quán)利要求112所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別受體的配體含有 核酸分子。
119. 如權(quán)利要求112所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別受體的配體含有 細(xì)菌DNA。
120. 如權(quán)利要求112所述的方法，其特征在于，所述遞送載體含有脂質(zhì)體。
121. 如權(quán)利要求112所述的方法，其特征在于，所述遞送載體包括非脂質(zhì)體輸 送載體。
122. —種方法，所述方法包括用含有至少一種模式識(shí)別分子受體的配體和遞送載體的組合物涂布醫(yī)學(xué)裝置。
123. 如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于，所述醫(yī)學(xué)裝置包括植入的裝置。
124. 如權(quán)利要求123所述的方法，其特征在于，所述植入裝置由至少一種以下 裝置組成導(dǎo)管、支架、網(wǎng)孔修補(bǔ)材料、滌綸血管假體、矯型金屬板、金屬條和螺 絲。
125. 如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于，所述遞送裝置包括緩釋顆粒和 遞送載體。
126. 如權(quán)利要求125所述的方法，其特征在于，所述遞送載體含有脂質(zhì)體。
127. 如權(quán)利要求126所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體還含有與惰性基質(zhì) 或緩釋生物材料相結(jié)合的脂質(zhì)體。
128. 如權(quán)利要求127所述的方法，其特征在于，所述惰性基質(zhì)包括至少一種選 自以下的材料膠原、明膠、PLA(已定義)微球、血清凝塊和有機(jī)凝膠。
129. —種方法，所述方法包括向受試對(duì)象施用含有至少一種模式識(shí)別分子受 體的配體；遞送裝置以及放射療法的組合。
130. 如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別分子受體的配體 包括信號(hào)模式識(shí)別受體的配體。
131. 如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于，所述模式識(shí)別分子受體的配體 包括模式識(shí)別受體的配體。
132. 如權(quán)利要求129所述的方法，還包括提高所述受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
133. 如權(quán)利要求132所述的方法，其特征在于，所述提高免疫應(yīng)答包括提高易 患癌癥的受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
134. 如權(quán)利要求133所述的方法，其特征在于，所述癌癥包括至少一種選自以 下的癌癥肺癌、皮膚癌、肝癌、骨髓癌、腦癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、乳腺癌、前 列腺癌、間充質(zhì)組織癌、淋巴瘤和結(jié)腸癌。
135. 如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于，給予所述療法的順序不同可產(chǎn) 生不同的應(yīng)答。
136. 如權(quán)利要求135所述的組合物，其特征在于，先進(jìn)行放療。
137. 如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，最后進(jìn)行放療。
138. 如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，同時(shí)進(jìn)行放療。
139. 如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于，所述配體含有能結(jié)合模式識(shí)別 受體的合成化合物。
140. 如權(quán)利要求139所述的方法，其特征在于，所述合成化合物含有咪唑并喹 啉(immadazoquinoline)。
141. 一種試劑盒，所述試劑盒裝有遞送容器； 遞送裝置；至少一種模式識(shí)別受體的配體；和 有或沒有某種抗原；其中所述配體能引發(fā)受試對(duì)象的免疫應(yīng)答。
142. 如權(quán)利要求141所述的試劑盒，還裝有一種或多種化療制劑。
143. —種方法，所述方法包括向受試對(duì)象施用含有至少一種模式識(shí)別分子受 體的配體；和遞送載體的組合物，其中所述組合物能提高骨愈合。
144. 如權(quán)利要求143所述的方法，其特征在于，在骨移植之前施用所述組合物。
145. 如權(quán)利要求143所述的方法，其特征在于，所述配體用緩釋材料包裹。
146. —種方法，所述方法包括向受試對(duì)象施用含有至少一種模式識(shí)別分子受體的配體；和 一種遞送載體的組合物，其中所述組合物能減輕損傷。
147. 如權(quán)利要求146所述的方法，其特征在于，所述損傷包括至少一種氧化應(yīng) 力損傷和/或凋亡介導(dǎo)的損傷。
148. 如權(quán)利要求147所述的方法，其特征在于，所述損傷包括粘膜炎、槳膜炎、 薄壁組織損傷、多次灌注損傷、或放療和/或化療相關(guān)的損傷。
149. 如權(quán)利要求146所述的方法，其特征在于，所述組合物還能誘導(dǎo)天然免疫 應(yīng)答。
150. 如權(quán)利要求146所述的方法，其特征在于，所述組合物施用至晚期受試對(duì)象。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于免疫激活的疫苗和方法，所述疫苗和方法能有效引發(fā)哺乳動(dòng)物的全身性、非抗原特異性免疫應(yīng)答和強(qiáng)烈的抗原特異性免疫應(yīng)答。該方法在保護(hù)哺乳動(dòng)物免患疾病中特別有效，所述疾病包括癌癥、過敏性炎癥相關(guān)疾病、感染性疾病或與自身抗原的有害活性相關(guān)的疾病。本發(fā)明也披露了用于這種方法的治療性組合物。
文檔編號(hào)A61K39/02GK101304759SQ200480023786
公開日2008年11月12日 申請日期2004年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月14日
發(fā)明者J·費(fèi)爾曼, S·W·道 申請人:巨瓦日斯生物治療股份有限公司;克羅拉多州立大學(xué)研究基金會(huì)