專利名稱：從發(fā)酵肉湯中回收抑素化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離所需化學(xué)產(chǎn)物的方法，該化學(xué)產(chǎn)物得自在含水發(fā)酵肉湯中實(shí)施的反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及從發(fā)酵肉湯中分離帕伐他丁，密實(shí)菌素(compactin)和洛伐他丁，尤其是分離由密實(shí)菌素發(fā)酵而成的帕伐他丁。
背景技術(shù)：
心血管疾病的并發(fā)癥諸如心肌梗塞、中風(fēng)和外周血管疾病在美國(guó)占死亡原因的一半。血流中高水平的低密度脂蛋白(LDL)與冠狀損傷的形成有關(guān)，冠狀損傷將阻礙血液流動(dòng)，且能使血栓破裂和導(dǎo)致血栓形成，Goodman和Gilman，The Pharmacological Basis of Therapeutics(治療學(xué)之藥理學(xué)基礎(chǔ))879(第9版，1996)。降低血漿中LDL水平證明能降低心血管疾病病人和雖無心血管疾病但患有高膽固醇的病人臨床發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。斯堪的納維亞辛伐他丁生存研究小組(ScandinavianSimvastatin Survival Study Group)，1994；脂類研究臨床項(xiàng)目(Lipid Research Clinics Program)，1984a，1984b。
抑素(statin)藥物是目前用于降低易患心血管疾病的病人血管中LDL水平的最有療效的藥物。此類藥物特別包括密實(shí)菌素、洛伐他丁、辛伐他丁、帕伐他丁和氟伐他丁。抑素藥物的作用機(jī)理已有較詳細(xì)的說明。它們通過競(jìng)爭(zhēng)性地阻止3-羥基-3-甲基-戊二?；?輔酶A還原酶(＂HMG-CoA還原酶＂)而破壞了膽固醇和其它固醇在肝臟中的合成。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA到甲羥戊酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，該反應(yīng)為生物合成膽固醇的速率決定步驟。因此，阻止該反應(yīng)將導(dǎo)致膽固醇在肝臟中形成速度的減慢。
帕伐他丁是化合物[1S-[1α(β*，δ*)2α，6α，8β(R*)，8aα]]-1，2，6，7，8，8a-六氫-β，δ，6-三羥基-2-甲基-8-(2-甲基-1-氧代丁氧基)-1-萘-庚酸(CAS登記號(hào)No.81093-370)的常用醫(yī)藥名稱。帕伐他丁游離酸形式的分子結(jié)構(gòu)描述于式(Ia)中，其中R＝OH。其內(nèi)酯形式描述于式(Ib)中，其中將原子標(biāo)號(hào)，以表明原子的編號(hào)方式。 帕伐他丁、密實(shí)菌素(式Ib，R＝H)、洛伐他丁(式Ib，R＝CH3)、辛伐他丁和氟伐他丁各自具有烷基鏈，該烷基鏈由閉合形成內(nèi)酯的羧酸基團(tuán)封端，并且在相對(duì)于羧酸基團(tuán)的β和δ位置上帶兩個(gè)羥基基團(tuán)。所述烷基鏈?zhǔn)荋MG-CoA還原酶的結(jié)合部分。在δ位的羧酸基團(tuán)和羥基基團(tuán)傾向于內(nèi)酯化，如式(Ib)所示?？蓛?nèi)酯化的化合物如抑素可以游離酸的形式、或以內(nèi)酯的形式、或者兩種形式的平衡混合物存在。內(nèi)酯化作用導(dǎo)致了生產(chǎn)抑素藥物的加工困難，這是因?yàn)橛坞x酸和內(nèi)酯形式的化合物具有不同的極性。提純其中一種形式的方法可能會(huì)與雜質(zhì)一起除去另一種形式，導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。因此，為了以高產(chǎn)率進(jìn)行分離，當(dāng)處理可內(nèi)酯化的化合物時(shí)通常必須非常小心。
帕伐他丁顯示了優(yōu)于其它抑素的重要的治療優(yōu)點(diǎn)。帕伐他丁選擇性地抑制膽固醇在肝臟和小腸中的合成，但基本不影響其在外周細(xì)胞中的合成。Koga，T.等，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)(Biochim Biophys.Acta)，1990，1045，115-120。這一選擇性似乎部分歸因于六氫化萘核的C-6位置上羥基的存在。C-6位置在密實(shí)菌素中被氫原子占據(jù)，在洛伐他丁中則被甲基占據(jù)。較其它更具親脂性的同類物質(zhì)而言，帕伐他丁透過周邊細(xì)胞的親脂性膜的能力要弱些，Serajuddin等，藥物科學(xué)雜志(J.Pharm.Sci.)，1991，80，830-34，且帕伐他丁有限的移動(dòng)性被認(rèn)為是導(dǎo)致其在肝臟和腸中更容易發(fā)生局部定位的原因。
根據(jù)美國(guó)專利4,346,227(此處引入作為參考)，帕伐他丁具報(bào)道由M.Tanaka等在研究密實(shí)菌素的代謝時(shí)被作為密實(shí)菌素的代謝物分離而首次獲得。根據(jù)′227專利，帕伐他丁可通過使用各種微生物發(fā)酵密實(shí)菌素而得到，這些微生物是犁頭霉屬(Absidia coerulea)IFO4423孢子，小克銀漢霉屬(Cunninghamella echinulata)IFO 4445，產(chǎn)玫瑰色鏈霉菌(Streptomyces rosochromogenua)NRRL 1233，Syncephalastrum racemosum IFO 4814和Syncephalastrumracemosum IFO 4828。發(fā)酵之后，帕伐他丁通過以下方法從發(fā)酵肉湯中分離將肉湯酸化到pH值為3，然后用乙酸乙酯萃取帕伐他丁和其它非親水性的有機(jī)物，接著用鹽水洗滌。通過加入催化量的三氟醋酸使帕伐他丁游離酸內(nèi)酯化，之后用稀碳酸氫納中和，在硫酸鈉上干燥，然后蒸發(fā)至干燥。殘余物用制備反相高效液相色譜(＂HPLC＂)進(jìn)行純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，反相HPLC對(duì)于大規(guī)模化合物制劑的純化而言不是一個(gè)經(jīng)濟(jì)的方法。
美國(guó)專利5,942,423涉及到使用馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)菌株的密實(shí)菌素到帕伐他丁的微生物羥基化。記載在實(shí)施例中的唯一分離方法是分離微量的物質(zhì)用于發(fā)酵肉湯分析量HPLC的分析。根據(jù)更為廣泛的關(guān)于從肉湯中分離帕伐他丁的討論，優(yōu)選的分離方法是HPLC。
共同轉(zhuǎn)讓、共同未決的PCT申請(qǐng)序列號(hào)PCT/US00/19384涉及了使用Micromonospora maculata菌株的密實(shí)菌素到帕伐他丁的微生物羥基化，所述菌株能異乎尋常地抵抗密實(shí)菌素的抗菌效果。
美國(guó)專利5,202,029涉及了一種使用HPLC純化HMG-CoA還原酶抑制劑的方法。在HPLC柱上進(jìn)行雜質(zhì)分離后，HMG-CoA還原酶抑制劑以溶于洗脫劑的溶質(zhì)形式從HPLC柱上洗脫下來。洗脫劑被部分蒸發(fā)，之后加入水以誘導(dǎo)HMG-CoA還原酶抑制劑結(jié)晶。
美國(guó)專利5,616,595涉及通過切向過濾從發(fā)酵肉湯中回收水不溶性化合物的連續(xù)方法。所述發(fā)酵肉湯通過過濾器進(jìn)行循環(huán)。由于通過過濾器的水份損失，因此肉湯經(jīng)每次循環(huán)逐漸濃縮。一旦達(dá)到所需的濃度，使用可溶解所需化合物的溶劑來漿化濃縮的肉湯。然后使所述漿液通過過濾器進(jìn)行循環(huán)。所需化合物的溶液作為濾液收集起來，再?gòu)脑摓V液中分離出所需的化合物，并任選地進(jìn)行進(jìn)一步的純化。據(jù)說此方法能廣泛適用于各種化合物，包括洛伐他丁、帕伐他丁和辛伐他丁。
分離內(nèi)酯形式的洛伐他丁的方法記載于美國(guó)專利5,712,130中。在此方法中，洛伐他丁用乙酸丁酯從發(fā)酵肉湯中萃取出來。然后將所得溶液進(jìn)行離心，棄去分離出來的水相。有機(jī)相則在大于40℃下真空蒸餾，此操作除了能夠濃縮溶液之外，還能通過去除水份而促進(jìn)內(nèi)酯化作用。洛伐他丁內(nèi)酯的晶體在冷卻時(shí)結(jié)晶，并重結(jié)晶達(dá)到90％或者更高的純度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，本方法對(duì)于分離抑素的游離羧酸或者羧酸鹽形式并不適合。
目前，最經(jīng)濟(jì)可行的制備帕伐他丁的方法是通過密實(shí)菌素在C-6位置的酶的羥基化。然而，所知的從發(fā)酵肉湯中分離出抑素的方法并不適合于分離鈉鹽形式的帕伐他丁，不能達(dá)到藥學(xué)上可接受的純度水平，或者需要色譜分離以獲到高純度。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中對(duì)于無需色譜純化即能有效地從發(fā)酵肉湯中高純度、高產(chǎn)率地分離出用于制備規(guī)模的帕伐他丁的有效方法的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供從含水發(fā)酵肉湯中分離抑素化合物的有效方法。本發(fā)明尤其提供了無需色譜分離的、工業(yè)制備規(guī)模的純化帕伐他丁、密實(shí)菌素和洛伐他丁的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是為了得到高純形式和高產(chǎn)量的帕伐他丁，以便獲得顯著的微生物轉(zhuǎn)換反應(yīng)的立體選擇性和區(qū)域選擇性，并還獲得較高的產(chǎn)率，且更為經(jīng)濟(jì)。帕伐他丁是以最少量的溶劑消耗從肉湯中分離出來，以高產(chǎn)率提純后轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上可接受的鈉鹽。
本方法涉及從含水發(fā)酵肉湯中將帕伐他丁萃取到有機(jī)溶劑中，將帕伐他丁反萃取到堿性水溶液中，且任選地重萃取至有機(jī)溶劑中或者濃縮水溶液，從而產(chǎn)生水溶液或有機(jī)溶液，其帕伐他丁的濃度相對(duì)于最初在發(fā)酵肉湯中的濃度更為富集。通過沉淀帕伐他丁的金屬鹽或者銨鹽從富含溶液中得到帕伐他丁，然后再通過重結(jié)晶其鹽而進(jìn)行提純。重結(jié)晶的鹽隨后進(jìn)行鹽型轉(zhuǎn)換，形成帕伐他丁鈉鹽，而所有過剩的鈉離子用離子交換樹脂去除。帕伐他丁鈉鹽然后可從溶液中通過重結(jié)晶、冷凍干燥或者其它方法分離出來。
發(fā)明詳述本發(fā)明是從含水發(fā)酵肉湯中分離帕伐他丁、密實(shí)菌素和洛伐他丁的方法。通過從發(fā)酵肉湯中分離帕伐他丁鈉來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。然而應(yīng)理解的是，本方法能用于提純通過微生物或者酶過程而制備的其他化合物。密實(shí)菌素的酶促羥基化帕伐他丁鈉是通過密實(shí)菌素的酶促羥基化而合成的，如在美國(guó)專利5,942,423和4,346,227中所描述。從中分離帕伐他丁的羥基化肉湯可以是用于工業(yè)規(guī)模的密實(shí)菌素發(fā)酵用的任何含水肉湯。如果發(fā)酵結(jié)束時(shí)肉湯呈中性或者堿性，則加入酸使肉湯pH值為約1到6，優(yōu)選為1到5.5，更優(yōu)選為2到4。可使用的酸包括鹽酸、硫酸、三氟醋酸或者任何其它質(zhì)子酸，優(yōu)選1M水溶液中pH小于1的酸。酸化發(fā)酵肉湯使得任何帕伐他丁羧酸鹽轉(zhuǎn)化成了游離酸和/或內(nèi)酯。帕伐他丁鈉的分離本發(fā)明的方法涉及以下步驟形成富含帕伐他丁的溶液，從富含帕伐他丁的溶液中獲得其鹽，純化帕伐他丁鹽，將帕伐他丁鹽轉(zhuǎn)化成帕伐他丁鈉鹽且分離出帕伐他丁鈉鹽。
在第一步中，通過順序的萃取和反萃取操作，從含水發(fā)酵肉湯中獲得帕伐他丁的相對(duì)較高濃度的溶液。發(fā)酵通常是在很高的稀釋度下進(jìn)行的。肉湯通過稀釋達(dá)到較高的最大酶潛能。高稀釋度的缺點(diǎn)是必須操作大體積的發(fā)酵介質(zhì)，直至以更富集的形式得到所需產(chǎn)物為止。大體積對(duì)于分離方法有嚴(yán)格要求。色譜方法通常對(duì)于分離如此大的體積不實(shí)用，尤其當(dāng)其中的溶劑是水的時(shí)候。當(dāng)使用萃取方法進(jìn)行分離的時(shí)候，有機(jī)萃取液的溶劑必須具有足夠的極性，以同水競(jìng)爭(zhēng)有利的產(chǎn)物分配，但極性也不能太大而導(dǎo)致主要溶解于水中。如果萃取沒有效果，則需要大體積的有機(jī)溶劑來以高產(chǎn)率分離所需產(chǎn)物，然而此操作伴隨著對(duì)處于發(fā)酵設(shè)備中間和周圍的人員健康和安全的危險(xiǎn)隱患。
我們發(fā)現(xiàn)，甲酸C2-C4烷基酯和C2-C4羧酸的C1-C4烷基酯能從水性發(fā)酵肉湯中非常有效地萃取帕伐他丁。帕伐他丁內(nèi)酯的分配系數(shù)通常是1000∶1或者更高，而游離酸的分配系數(shù)通常是10∶1或者更高。所述烷基可以是直鏈、支鏈或者環(huán)狀的。優(yōu)選的酯包括甲酸乙酯、甲酸正丙酯、甲酸異丙酯、甲酸正丁酯、甲酸仲丁酯、甲酸異丁酯、甲酸叔丁酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸正丙酯、丙酸異丙酯、丙酸丁酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸正丙酯、丁酸異丙酯、丁酸丁酯、異丁酸甲酯、異丁酸乙酯、異丁酸丙酯和異丁酸丁酯。在這些優(yōu)選的有機(jī)溶劑中，我們發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯和甲酸乙酯特別適宜。最優(yōu)選的萃取溶劑是乙酸異丁酯。其它的有機(jī)溶劑也可代替這些酯類。可使用鹵化的鹵代烴、芳香化合物、酮和酯，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、丁基甲基酮、二乙基醚和甲基叔丁基醚。
在本發(fā)明的富集步驟中，通過有機(jī)萃取溶劑與發(fā)酵肉湯相接觸而形成有機(jī)萃取液，有機(jī)溶劑優(yōu)選選自以上所列。發(fā)酵肉湯的pH在大約1到大約6之間，優(yōu)選pH值在大約2到大約4之間。
可以使用任何適用于以間歇或連續(xù)法對(duì)大體積液體進(jìn)行混合的設(shè)備。由于發(fā)酵通常以間歇過程進(jìn)行，因此間歇分離法為自然的選擇。相應(yīng)地，可以使用常規(guī)的大體積混合機(jī)和沉淀池或者適用于混合及相分離的設(shè)備。本發(fā)明在此方面的優(yōu)選方式中，較小部分(優(yōu)選小于50％(體積/體積))的萃取溶劑與發(fā)酵肉湯相接觸，優(yōu)選伴隨溫和的機(jī)械攪拌。在接觸與相分離后，從耗盡帕伐他丁的發(fā)酵肉湯中分離出含有帕伐他丁的萃取溶劑。然后所述肉湯可一次或多次與有機(jī)萃取溶劑相接觸，且每次均可對(duì)得到有機(jī)萃取液進(jìn)行合并。所得的帕伐他丁有機(jī)萃取液的體積可大于或得小于所述發(fā)酵肉湯的體積。
形成富含帕伐他丁的溶液的第二個(gè)操作是將帕伐他丁反萃取至堿性水溶液中。反萃取除去了一些或者全部非極性有機(jī)雜質(zhì)，且如果存在有帕伐他丁內(nèi)酯的話，將促進(jìn)帕伐他丁內(nèi)酯環(huán)再次打開。盡管不想使其以任何方式受限于特定的化學(xué)理論或者機(jī)理，但是根據(jù)非常確定的化學(xué)理論，帕伐他丁在堿性含水萃取液中為羧酸鹽陰離子的形式。通過使用體積少于有機(jī)萃取液的一定體積的水性堿，反萃取可用來濃縮帕伐他丁。所述堿優(yōu)選為NaOH、NH4OH或者KOH，最優(yōu)選為NH4OH或者NaOH，且堿性水溶液優(yōu)選pH值在大約7.0到大約13.7之間，更優(yōu)選在大約7到大約13之間，最優(yōu)選在大約7.5到大約11之間。萃取溶劑與堿性水溶液相接觸，直到有機(jī)相中的帕伐他丁量基本被耗盡為止，如通過薄層色譜或者其它方法(包括主觀判斷)所確定的，其已進(jìn)行了完全萃取所需的充分接觸。為達(dá)到最佳回收，可采用多種反萃取。然而，當(dāng)有機(jī)相是乙酸丁酯時(shí)，單一的反萃取非常有效。優(yōu)選地，實(shí)施反萃取時(shí)堿性水溶液的體積少于有機(jī)萃取液體積的三分之一，更優(yōu)選少于四分之一，而最優(yōu)選是少于有機(jī)萃取液體積的約五分之一。在本方法中用于隨后從中獲得帕伐他丁的濃縮水溶液的優(yōu)選濃度范圍為大約2到大約50g/L，更優(yōu)選為大約5到大約15g/L。
含水萃取液可通過蒸餾、優(yōu)選通過真空蒸餾進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，以提高溶液的濃度。在通過蒸餾進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮之前，應(yīng)將pH調(diào)整到大約7到大約13.7之間，優(yōu)選在大約7.5到大約11之間，最優(yōu)選在大約8到大約10之間。真空蒸餾可通過在5-120mmHg絕對(duì)壓力下將含水萃取液由大約30℃加熱到大約80℃進(jìn)行。本方法相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員能力所及范圍內(nèi)的其它真空蒸餾條件的選取都是可行的。
作為在隨后的操作中從富集水溶液中獲得帕伐他丁的另一不同選擇，也可從富集有機(jī)溶液中得到帕伐他丁。在含水萃取液用酸再次酸化后，通過將帕伐他丁重萃取至有機(jī)溶劑中而形成富含帕伐他丁的有機(jī)溶液，酸化用的酸優(yōu)選三氟醋酸、鹽酸、硫酸、乙酸或者磷酸，更優(yōu)選的是硫酸或者磷酸，酸化至pH為大約1.0到大約6.5，更優(yōu)選為大約2.0到大約4.0。根據(jù)條件，帕伐他丁羧酸鹽陰離子可被質(zhì)子化而形成極性小于羧酸鹽的帕伐他丁游離酸，或者被內(nèi)酯化為極性更小的形式。
帕伐他丁重萃取至重萃取溶劑中，該溶劑選自上述適用于從發(fā)酵肉湯中萃取帕伐他丁的有機(jī)溶劑。該有機(jī)溶劑可以但不必同于從發(fā)酵肉湯中萃取帕伐他丁所用的溶劑。在此重萃取中，通過重萃取至一定量的有機(jī)溶劑中而實(shí)現(xiàn)帕伐他丁的進(jìn)一步富集，其中所述有機(jī)溶劑優(yōu)選少于約50％(體積/體積)的含水萃取液的體積，更優(yōu)選為大約33％(體積/體積)到大約20％(體積/體積)，再更優(yōu)選大約為25％(體積/體積)含水萃取液的體積。相應(yīng)地，如在實(shí)施例1中進(jìn)一步所例證，帕伐他丁可從100L發(fā)酵肉湯中以最初有機(jī)萃取液的89％的產(chǎn)率濃縮至8L高含量的有機(jī)溶液。將為本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，通過進(jìn)行多重萃取可以得到更高產(chǎn)率的純化帕伐他丁，而在用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式中只對(duì)單一的萃取進(jìn)行了描述。此優(yōu)選方式實(shí)現(xiàn)了節(jié)約溶劑和高產(chǎn)率之間的平衡。偏離通過重復(fù)萃取(以上僅描述了一種)而進(jìn)一步提高產(chǎn)率的優(yōu)選方式并不必然背離本發(fā)明的精神。在進(jìn)行用“鹽析”法從富集有機(jī)溶液中獲得帕伐他丁的操作之前，優(yōu)選將該富集有機(jī)溶液進(jìn)行干燥，且任選地用活性碳進(jìn)行脫色，所述干燥可以使用常規(guī)干燥劑如MgSO4、Na2SO4、CaSO4、硅石和珍珠巖等。然后通過常規(guī)方法，如通過過濾或者傾斜對(duì)經(jīng)干燥和/或脫色的富集有機(jī)溶液進(jìn)行分離。
在本方法的下一步驟中，可如情所致從富集水溶液或富集有機(jī)溶液中獲得帕伐他丁鹽。該鹽從富集溶液中通過沉淀獲得。通過向富集溶液中加入金屬鹽、氨水、胺、氨的鹽或者胺鹽誘導(dǎo)沉淀發(fā)生。
可用的金屬鹽包括氫氧化物、醇鹽、鹵化物、碳酸鹽、硼酸鹽、磷酸鹽、硫氰酸鹽、醋酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫代硫酸鹽及任何其它的在水中具有高溶解度的鹽。金屬鹽的金屬包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂、銅、鐵、鎳、錳、錫、鋅和鋁。優(yōu)選的鹽類是以下金屬陽離子的鹽類Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+和Ai3+。最優(yōu)選用以誘導(dǎo)帕伐他丁金屬鹽沉淀的鹽的金屬陽離子是Na+和K+。
通過加入氨水或者胺，帕伐他丁還可作為銨鹽或者胺鹽沉淀。所述胺可以是伯、仲或叔胺。不是太受阻以致于阻止胺氮和帕伐他丁羧基基團(tuán)之間的離子相互作用的任何烷基胺或者芳基胺均可以使用。所述胺類包括但不限于甲基、二甲基、三甲基、乙基、二乙基、三乙基及其它C1-C6的伯、仲和叔胺；且進(jìn)一步包括嗎啉、N-甲基嗎啉、異丙基環(huán)乙基胺、哌啶等。無論在氮上的取代不存在、存在或具有多重性，我們?cè)谙挛闹袑⑼ㄟ^氨或胺的反應(yīng)而形成的鹽稱為銨鹽。其含義意在包括胺的鹽和氨的鹽。
還可以通過單獨(dú)加入銨鹽或者加入結(jié)合氨水、胺或其它金屬鹽的銨鹽來誘發(fā)帕伐他丁銨鹽沉淀。優(yōu)選的銨鹽是以下的氨鹽NH4CI、NH4Br、NH4I、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)3PO4、(NH4)2S2O4、NH4OAc和NH4SCN，最優(yōu)選的是NH4Cl。
金屬鹽、銨鹽和高沸點(diǎn)液體及固體胺可通過常規(guī)方法加入，優(yōu)選是在具有優(yōu)良通風(fēng)的區(qū)域，以固體、純液體或者以在水溶劑或有機(jī)溶劑中的溶液形式加入。加入氣態(tài)氨需要特殊的裝置，以處置腐蝕性氣體。包括壓力倉、調(diào)節(jié)器、閥門或者管線的這樣的裝置是廣泛地可以獲得的。氨在常壓(環(huán)境壓力)下引入到所述富含溶液的上部，或者當(dāng)使用壓力倉時(shí)，所用壓力為高壓。或者，氨可以泡狀通過溶液，優(yōu)選要伴有攪拌，以減少通入管被沉降的帕伐他丁銨鹽堵塞。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過加入氨或者胺從所述富含溶液中得到銨鹽形式的帕伐他丁。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過向富含溶液通入氣態(tài)氨而從中得到以帕伐他丁氨鹽形式的帕伐他丁。氨產(chǎn)生高極性的帕伐他丁銨鹽，該鹽易于從逆溶劑(antisolvent)中以高產(chǎn)率沉淀出來。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過加入氣態(tài)氨和銨鹽得到以帕伐他丁氨鹽形式的帕伐他丁。最優(yōu)選的銨鹽是NH4Cl，其具有的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)所述富含有機(jī)溶液還沒有充分干燥的時(shí)候，其形成濃縮的氯化銨水溶液。
金屬鹽、氨鹽、胺鹽和/或者銨鹽加入時(shí)的溫度可通過進(jìn)行小規(guī)模的反應(yīng)并監(jiān)控該反應(yīng)的放熱度這種常規(guī)的試驗(yàn)過程來確定。優(yōu)選的是，溶液的溫度不能超過40℃。雖然可出現(xiàn)高達(dá)80℃的溫度而并不引起帕伐他丁明顯分解，但是本發(fā)明中的很多有機(jī)溶劑將會(huì)在較低的溫度下沸騰。當(dāng)使用氨時(shí)，優(yōu)選的溫度范圍是從大約-10℃到大約40℃。
一旦沉淀顯示出終止的跡象，或者帕伐他丁的析出通過其它方式被確定基本上完成時(shí)，加入過程應(yīng)停止。當(dāng)使用了氨或者揮發(fā)性胺時(shí)，容器必須進(jìn)行排氣以排除過剩的煙氣。所得結(jié)晶通過過濾、傾斜溶劑、蒸發(fā)溶劑或者其它類似的方法進(jìn)行分離，優(yōu)選方法為過濾。
在任選地對(duì)沉淀的結(jié)晶進(jìn)行沖洗后，通過一次或者多次的重結(jié)晶對(duì)帕伐他丁鹽進(jìn)行提純。為了提純帕伐他丁鹽，首先將該鹽溶解在水中。優(yōu)選使用小量的水。當(dāng)?shù)玫降氖前符}而不是金屬鹽或者氨鹽時(shí)，進(jìn)行溶解通常需要多一點(diǎn)的水。一旦帕伐他丁鹽已完全溶解，通過加入逆溶劑而使溶液的極性下降。逆溶劑是帕伐他丁鹽在其中很難溶解的水溶性有機(jī)溶劑或者溶劑混合物。適宜的水溶性有機(jī)溶劑包括丙酮、乙腈、乙酸烷基酯、異丁醇和乙醇。
帕伐他丁鹽可自發(fā)的重結(jié)晶，或者也可以通過采取進(jìn)一步的步驟諸如加入共同離子、冷卻或者加入晶種的方法而誘發(fā)其重結(jié)晶。通過加入共同離子來進(jìn)一步誘發(fā)重結(jié)晶時(shí)，將具有與帕伐他丁鹽相同的金屬離子或者銨離子的鹽加入到混合物中。用于誘導(dǎo)帕伐他丁鹽重結(jié)晶的適宜的鹽類是與將帕伐他丁鹽從富含溶液中沉淀出來所用的鹽相同的金屬鹽或銨鹽。根據(jù)優(yōu)選的方法(其中帕伐他丁以銨鹽的形式獲得)，是加入先前用于獲得帕伐他丁鹽的氨或者胺的氯化物鹽來使帕伐他丁鹽重結(jié)晶。在最選的實(shí)施方案中(其中得到的是帕伐他丁的氨鹽)，加入的鹽最優(yōu)選為NH4Cl。
重結(jié)晶可在大約-10℃和大約60℃之間進(jìn)行，優(yōu)選在大約0℃和大約50℃之間，最優(yōu)選是在大約0℃和大約40℃之間。在帕伐他丁鹽基本上從溶液中重結(jié)晶出來后，將該晶體分離且可以例如1∶1的乙酸異丁酯和丙酮的混合物進(jìn)行洗滌，之后進(jìn)行干燥。干燥可在常溫下進(jìn)行，但優(yōu)選是在低于45℃、最好在約40℃的溫和高溫下進(jìn)行。任選地，可重復(fù)進(jìn)行重結(jié)晶以獲得良好效果，如實(shí)施例7和8所示。每次重復(fù)過程獲得大約92-96％的產(chǎn)率。
即使在重結(jié)晶后，帕伐他丁依然含有有機(jī)雜質(zhì)，該雜質(zhì)在HPLC上的相對(duì)保留時(shí)間(RRT)是0.9。在聯(lián)用UV檢測(cè)和HPLC色譜的基礎(chǔ)上，估計(jì)有機(jī)雜質(zhì)大約為總組成的0.2％。有機(jī)雜質(zhì)可通過以下方法除去。
所述帕伐他丁鹽溶解在水中，然后優(yōu)選加入最少量的或者大約6mlg-1和大約0.2％(體積/體積)的異丁醇。通過加入氫氧化鈉升高pH值從大約pH 8到大約pH 14，優(yōu)選從大約pH 10到大約pH 13.7，且將此混合物在大約10℃到大約50℃下保持10-200分鐘，優(yōu)選為在大約20℃到大約30℃下保持60-100分鐘。該溶液然后用無機(jī)酸或者有機(jī)酸、優(yōu)選鹽酸或者硫酸再次酸化至pH為大約pH 4到大約pH 9，更優(yōu)選為大約pH 5到大約pH 9，最優(yōu)選為大約pH 6到大約pH 7.5。在調(diào)整了pH后，向溶液中加入氯化銨以鹽析出帕伐他丁鹽。如果使用的水量大約是6mlg-1，則建議使用每克帕伐他丁鹽大約2.0-2.3g氯化銨。優(yōu)選用4到6小時(shí)分批加入氯化銨。
在加入氯化銨后，帕伐他丁銨鹽可以自發(fā)結(jié)晶。否則，可以通過冷卻、加入晶種或者其它常用規(guī)手段誘發(fā)重結(jié)晶。盡管重結(jié)晶優(yōu)選通過加入共同離子如加入氯化銨來誘發(fā)進(jìn)行，重結(jié)晶也可以通過用逆溶劑稀釋來誘發(fā)進(jìn)行，如前述重結(jié)晶步驟中優(yōu)選的做法。然而，在該操作中，必須小心謹(jǐn)慎而不能無意中使帕伐他丁鹽沉淀。如更詳細(xì)地示于實(shí)施例1中的，RRT＝0.9的有機(jī)雜質(zhì)的量減少至低于檢測(cè)限，且帕伐他丁銨鹽達(dá)到了約99.3％的純度，接近藥用可接受的純度水平。在本發(fā)明方法的這一階段，可以得到有機(jī)雜質(zhì)少于約0.7％(重量/重量)的帕伐他丁銨鹽。
經(jīng)過重結(jié)晶去掉有機(jī)雜質(zhì)后，該帕伐他丁鹽經(jīng)過鹽形轉(zhuǎn)換成為帕伐他丁鈉。在此所使用的鹽形轉(zhuǎn)換是指有機(jī)鹽分子的陽離子同另一陽離子相交換的任何方法。在鹽形轉(zhuǎn)換中，通過將所述鹽溶解于含水溶劑中、向該水溶液中加入任何質(zhì)子酸如鹽酸、硫酸、磷酸、三氟醋酸或者醋酸、然后用有機(jī)溶劑將帕伐他丁從所述水溶液中萃取出來而首先將帕伐他丁從其金屬鹽或者銨鹽中解離出來。質(zhì)子酸以中和或者酸化的量加入所述水溶液中，優(yōu)選將其酸化至pH為大約1到大約6，更優(yōu)選為大約2到大約4。在向水溶液中加入質(zhì)子酸之前或者之后，將該水溶液與不能與水混溶的有機(jī)溶劑如乙酸異丁酯或者任何其它的不能與水混溶的有機(jī)溶劑相接觸。在使所述水溶液與不能與水混溶的有機(jī)溶劑相接觸且用質(zhì)子酸處理后，所得含有帕伐他丁的有機(jī)相將從水相分離，在任選用水進(jìn)行洗滌以除去銨殘質(zhì)后，用含水氫氧化鈉對(duì)帕伐他丁進(jìn)行反萃取。優(yōu)選的NaOH用量相對(duì)于帕伐他丁量?jī)H為適度摩爾過量，優(yōu)選為小于其1.1當(dāng)量，更優(yōu)選為小于其1.02當(dāng)量。
在萃取到含水氯化鈉中之后，清除過量的鈉陽離子，以獲得1∶1當(dāng)量的鈉陽離子和帕伐他丁。清除是通過使用水不溶性的離子交換樹脂完成的。適宜的離子交換樹脂是陽離子樹脂和螯合型樹脂，優(yōu)選是強(qiáng)酸與弱酸交換樹脂。
在強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂中，可用的是那些具有磺酸(SO3-H+)基團(tuán)的。這些包括商業(yè)制成品AmberliteIR-118、IR-120、252H；Amberlyst15、36；Amberjet1200(H)(Rohm and Haas)；Dowex50WX系列、DowexHCR-W2、Dowex650C、DowexMarathon C、DowexDR-2030和DowexHCR-S離子交換樹脂(Dow化學(xué)公司)；DiaionSK 102至116樹脂系列(三菱化學(xué)公司)和Lewatit SP 120(拜耳)。優(yōu)選的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂是Amberlite120、Dowex50WX和DiaionSK系列。
弱酸型陽離子交換樹脂包括那些具有側(cè)鏈羧酸基團(tuán)的。弱酸型陽離子交換樹脂包括的商業(yè)制成品為AmberliteCG-50、IRP-64、IRC50和C67；DowexCCR系列；Lewatit CNP系列和DiaionWK系列；其中最優(yōu)選AmberliteIRC50、LewatitCNP 80和DiaionWK 10。次優(yōu)選螯合型交換樹脂。一些可得的商品變種包括DuoiteC-718和C-67(Rohm & Haas)。
含有帕伐他丁鈉鹽和過量鈉陽離子的溶液可與離子交換樹脂相接觸，所用方法是任何本領(lǐng)域所熟知的方法，包括使溶液通過樹脂柱或樹脂床，或者攪拌在燒瓶?jī)?nèi)的足夠量的樹脂和溶液。接觸的方式不重要。在去除了過剩鈉離子之后，雖然pH值會(huì)隨稀釋作用而變化，但帕伐他丁鈉鹽溶液的pH值應(yīng)該在大約6.5到大約10的范圍內(nèi)，優(yōu)選在大約7.4到大約7.8的范圍內(nèi)。帕伐他丁鈉鹽溶液從較高的pH值降低到較低的pH值并隨后平穩(wěn)在較低的pH值水平，這一現(xiàn)象是過量的Na+離子基本除盡的征兆。當(dāng)清除完成后，帕伐他丁鈉鹽溶液可從樹脂上以常規(guī)方式脫離出來。它可從樹脂柱或者樹脂床以洗脫劑收集，也可用過濾、傾斜等方法分離出來。
帕伐他丁鈉可從帕伐他丁鈉溶液中通過結(jié)晶作用分離出來。有效的結(jié)晶首先需要部分去除水份，這可通過真空蒸餾或者毫微過濾(nano-filtration)進(jìn)行。優(yōu)選的是，帕伐他丁鈉鹽的水溶液在結(jié)晶前從20重量/體積％濃縮至50重量/體積％。如有需要，在濃縮后，帕伐他丁鈉鹽水溶液可用H+形式的離子交換樹脂調(diào)節(jié)到pH為大約7到大約10之間。
向帕伐他丁鈉溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑或者有機(jī)溶劑混合物將有助于所述結(jié)晶作用。尤其可提到的是丙酮和丙酮/乙腈、乙醇/乙腈和乙醇/乙酸乙酯混合物。最優(yōu)選用于結(jié)晶帕伐他丁鈉的溶劑體系是1/3/12水/丙酮/乙腈混合物，其是通過濃縮帕伐他丁鈉溶液至大約30重量/體積％然后加入合適體積的1/4丙酮/乙腈混合物而形成的。其它最優(yōu)選的結(jié)晶溶劑混合物是水-丙酮(1∶15)。
帕伐他丁鈉也可通過帕伐他丁鈉水溶液的冷凍干燥而獲得。
無論是通過結(jié)晶或者其它提高產(chǎn)品純度的方法，實(shí)施本發(fā)明方法而分離出來的帕伐他丁鈉基本上不含帕伐他丁內(nèi)酯。正如以下實(shí)施例中所證明的，分離出來的帕伐他丁鈉所含總雜質(zhì)量可少于0.5％(重量/重量)。另外，按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，分離出的帕伐他丁鈉的總雜質(zhì)量為0.2％(重量/重量)或者更小，其中的兩例在實(shí)施例1和實(shí)施例15中有所例證?？傠s質(zhì)中所含的主要雜質(zhì)包括表帕伐他丁(epipravastatin)鈉、3′-OH密實(shí)菌素鈉、6-羥基異密實(shí)菌素鈉和帕伐他丁內(nèi)酯。
以下實(shí)施例在其某些具體實(shí)施方案中描述了本發(fā)明的實(shí)施過程。然而這些實(shí)施例不能看作是對(duì)本發(fā)明精神的限制?？紤]到說明書和實(shí)施例，其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。這就意味著說明書，包括實(shí)施例，僅視為是示范性的，而本發(fā)明的范圍和精神則在權(quán)利要求書中表明。
實(shí)施例實(shí)施例1帕伐他丁的純化通過加入硫酸而酸化發(fā)酵肉湯(100L)到pH大約2.5至大約5.0。酸化的發(fā)酵肉湯用乙酸異丁酯(3×50L)萃取。乙酸異丁酯萃取產(chǎn)率使用HPLC肉湯內(nèi)標(biāo)對(duì)照法分析測(cè)得是95％。HPLC條件(反相)為柱C18，粒徑5μm，長(zhǎng)度150mm，直徑4.6mm；流動(dòng)相45％甲醇/水，0.1％Et3N，0.1％冰醋酸；流動(dòng)速率1.3ml min-1；柱溫25℃；注射體積10μl；內(nèi)標(biāo)對(duì)羥基苯甲酸乙酯；檢測(cè)UVλ＝238nm。
然后，復(fù)合乙酸異丁酯相通過加入濃氫氧化銨，用水(35L)在大約pH 7.5到大約pH 11.0時(shí)萃取。然后所得帕伐他丁水溶液通過加入5M硫酸被再次酸化至pH為大約2.0到大約4.0，并用乙酸異丁酯(8L)進(jìn)行反萃取。所得帕伐他丁在乙酸異丁酯中的溶液用珍珠巖(Perlite)和Na2SO4進(jìn)行部分干燥。傾析所述帕伐他丁溶液，然后從干燥劑中過濾，并用活性炭脫色(1.7g)。然后對(duì)溶液進(jìn)行過濾，除去炭，并轉(zhuǎn)移至配有氣體入口的燒瓶中。
在15-25℃下伴隨快速攪動(dòng)，將氨氣導(dǎo)入溶液上部空間。在進(jìn)一步的沉淀顯示出終止的跡象時(shí)，關(guān)閉氨氣，向混合物中加入氯化銨以易于過濾。沉淀的帕伐他丁羧酸銨鹽結(jié)晶由過濾收集得到，先后用乙酸異丁酯和丙酮洗滌，得到大約94％純度的帕伐他丁銨鹽，該純度由聯(lián)用λ＝238nm UV檢測(cè)的HPLC測(cè)定。
帕伐他丁銨鹽通過從飽和的氯化銨溶液中重結(jié)晶而進(jìn)一步純化，操作如下。含有162g活性物質(zhì)的帕伐他丁鹽溶解于水(960ml)中，且在大約35-40℃用丙酮(96ml)和乙酸異丁酯稀釋(96ml)。然后將溶液冷卻至大約30-32℃，加入固體NH4Cl以誘發(fā)帕伐他丁銨結(jié)晶，加至結(jié)晶無明顯增加為止。在加入氯化銨之后，將溶液冷卻至大約0-26℃。帕伐他丁銨晶體經(jīng)過濾收集后，如前所述，用乙酸異丁酯和丙酮洗滌，然后在大約40℃下干燥。所得帕伐他丁銨鹽晶體(155.5g)的純度大約為98％，其由利用前述條件的HPLC測(cè)定。
通過如下的另一結(jié)晶作用使帕伐他丁銨鹽進(jìn)一步純化。帕伐他丁銨鹽(155.5g活性物質(zhì))溶于水(900ml)中。加入異丁醇(2ml)之后，通過加入濃氫氧化鈉溶液使pH值升高到大約pH 10到大約pH 13.7之間，然后將溶液在常溫下攪拌75分鐘。加入硫酸使溶液中和至大約pH7，然后加入固體NH4Cl以誘導(dǎo)帕伐他丁銨結(jié)晶。晶體(150g)通過過濾收集，然后用丙酮洗滌。帕伐他丁銨的純度據(jù)測(cè)為約99.3％，其通過使用前述條件下的HPLC檢測(cè)測(cè)定。
帕伐他丁銨然后經(jīng)鹽形轉(zhuǎn)換成鈉鹽，方法如下。帕伐他丁銨鹽晶體溶解于水(1800ml)中。加入乙酸異丁酯(10.5L)。然后通過加入硫酸，將溶液酸化至pH在大約2到4之間，硫酸使帕伐他丁回復(fù)到游離酸的形式。含帕伐他丁的乙酸異丁酯相用水(5×300ml)洗滌。隨后帕伐他丁轉(zhuǎn)化成為其鈉鹽，并通過在水(900-2700ml)上旋動(dòng)乙酸異丁酯溶液，并同時(shí)間歇性地加入8m NaOH直至pH值達(dá)到大約7.4至大約13之間，而使其反萃取至另一水相中。
然后用離子交換樹脂處理帕伐他丁鈉鹽溶液，去除過剩的鈉陽離子。在分離之后，水相在常溫下相對(duì)H+形式的AmberliteIRC50交換樹脂攪拌30分鐘。持續(xù)攪拌直至pH達(dá)到大約7.4到7.8之間。
然后過濾溶液以除去樹脂，且將溶液在真空下部分濃縮至重量為508g。接著溶液用乙腈(480ml)進(jìn)行稀釋，所用溶劑為1.4∶1的乙腈水溶劑混合劑。然后在活性炭(5g)上攪拌所述溶液，以進(jìn)行脫色。當(dāng)濾去活性炭之后，帕伐他丁鈉通過產(chǎn)率為90％的重結(jié)晶以晶體形式獲得，重結(jié)晶是在進(jìn)一步加入丙酮和乙腈以形成1/3/12的水/丙酮/乙腈的混合物(5.9L)并冷卻至大約-10至大約0℃之后發(fā)生的。所得帕伐他丁鈉鹽從初始發(fā)酵的活性物質(zhì)開始的總產(chǎn)率為65％，純度約為99.3％，這些數(shù)據(jù)通過前述條件下的HPLC測(cè)得。
實(shí)施例2按照實(shí)施例1的程序，但是省略從水/丙酮/乙腈的混合物重結(jié)晶過程，通過對(duì)濃縮的帕伐他丁鈉的水溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到約99％純度的帕伐他丁鈉，其產(chǎn)率約為72％。將本實(shí)施例的最終純度與實(shí)施例1相比較，證明帕伐他丁鈉的重結(jié)晶較之冷凍干燥產(chǎn)生更純一些的產(chǎn)物。
實(shí)施例3-6同實(shí)施例1中的操作，帕伐他丁鈉從發(fā)酵肉湯中分離出來的純度和產(chǎn)率示于表1中，在轉(zhuǎn)換鹽形的操作中使用相應(yīng)的溶劑。
表1實(shí)施例號(hào)有機(jī)溶劑產(chǎn)率(％)純度(％)3CH2Cl26396.64乙酸乙酯 5899.55甲酸乙酯 5199.66丁基甲基酮6199.5實(shí)施例7同實(shí)施例1的操作，但是通過重復(fù)一次帕伐他丁銨鹽的結(jié)晶過程來進(jìn)一步純化帕伐他丁銨鹽，得到的帕伐他丁鈉純度約為99.6％，產(chǎn)率為58.4％。
實(shí)施例8同實(shí)施例1的操作，但是通過重復(fù)兩次帕伐他丁銨鹽的結(jié)晶過程來進(jìn)一步純化帕伐他丁銨鹽，得到的帕伐他丁鈉純度約為99.8％，產(chǎn)率為53％。
實(shí)施例9同實(shí)施例1的操作，加入硫酸使發(fā)酵肉湯(100L)被酸化至大約pH2.5到大約pH 5.0。酸化的發(fā)酵肉湯用乙酸異丁酯(3×50L)萃取。之后，結(jié)合的乙酸異丁酯相用水(35L，已加入濃氫氧化銨使其堿化至大約pH 7.5到大約pH 11.0)進(jìn)行萃取。
與實(shí)施例1中再次酸化含水萃取液且用乙酸異丁酯萃取以獲得進(jìn)一步富含(帕伐他丁)的有機(jī)溶液的做法不同，在此將含水萃取液在真空下濃縮至140g/L。所得的濃縮溶液pH大約為4.0到大約8。過量的氨通過蒸發(fā)除去。
氯化銨晶體(405g)緩慢地分批加入到濃縮溶液中，加入時(shí)間為四個(gè)小時(shí)，帕伐他丁銨鹽即在常溫下結(jié)晶出來。所得晶體然后通過過濾分離且用飽和氯化銨溶液洗滌。晶體在40℃下加入水中(1L)。其溶解后溫度降到30℃，然后氯化銨(330g)分批加入到溶液中，加入時(shí)間為兩小時(shí)。之后將溶液在常溫下攪拌15小時(shí)，帕伐他丁銨鹽晶體通過過濾回收，并先后用乙酸異丁酯和丙酮進(jìn)行洗滌，然后干燥。所得晶體隨后通過轉(zhuǎn)置鈉鹽的重結(jié)晶進(jìn)一步提純，再用實(shí)施例1所述方法分離。所得帕伐他丁鈉的純度約為99.6％，產(chǎn)率為64.7％。
實(shí)施例10同實(shí)施例1的操作，但是帕伐他丁鈉鹽從水/丙酮的1/15混合物中結(jié)晶出來，其從初始發(fā)酵的活性物質(zhì)的總產(chǎn)率是64％，純度為99.6％，如HPLC所測(cè)。
實(shí)施例11按照實(shí)施例9前兩個(gè)段中的方法，得到濃縮含水萃取液(140g.L-1)。濃縮含水萃取液被分成三等份。所得的濃縮溶液中然后加入1MHCL酸化至pH約4.0到pH約8.0。按照實(shí)施例9第三段的方法，但是需要用表2中的鹽代替氯化銨，從每一份中帕伐他丁鹽沉淀出來且轉(zhuǎn)化成鈉鹽。
表2鹽純度(％) 產(chǎn)率(％)KCl 99.3 42NaCl99.4 38LiCl99.1 3權(quán)利要求
1.一種從發(fā)酵肉湯中分離選自帕伐他丁、密實(shí)菌素和洛伐他丁的化合物的鈉鹽的方法，包括以下步驟a)形成所述化合物的富含溶液；b)從所述富含溶液中得到該化合物的鹽；c)純化該化合物的鹽；d)通過以下方法轉(zhuǎn)換該化合物的鹽型成為該化合物的鈉鹽i)將該化合物從其鹽中解離出來，ii)將該化合物與氫氧化鈉水溶液相接觸，由此形成該化合物鈉鹽的水溶液，和iii)通過將該化合物的鈉鹽水溶液與水不溶性離子交換樹脂接觸，除去過剩的鈉離子；和e)從該化合物鈉鹽的水溶液中分離出該化合物的鈉鹽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，所述富含溶液是富含的水溶液，其通過以下步驟形成a)將酸性發(fā)酵肉湯與有機(jī)萃取溶劑相接觸，并由此形成該化合物的有機(jī)萃取液；b)通過與堿性水溶液接觸來反萃取該有機(jī)萃取液，由此形成含水萃取液，和c)濃縮所述含水萃取液，由此形成富含該化合物的水溶液。
3.權(quán)利要求1的方法，其中，所述富含溶液是富含的有機(jī)溶液，其通過以下步驟形成a)將酸性發(fā)酵肉湯與有機(jī)萃取溶劑相接觸，并由此形成所述化合物的有機(jī)萃取液；b)通過與堿性水溶液接觸來反萃取該有機(jī)萃取液，由此形成所述化合物的含水萃取液，和c)通過與有機(jī)重萃取溶劑相接觸而從含水萃取液中重萃取所述化合物，由此形成富含該化合物的有機(jī)溶液。
4.權(quán)利要求2的方法，其中，含水萃取液通過真空蒸餾進(jìn)行濃縮。
5.權(quán)利要求2的方法，其中，將酸性發(fā)酵肉湯與有機(jī)萃取溶劑相接觸是在pH值為大約pH 1到大約pH 6之間進(jìn)行的。
6.權(quán)利要求2的方法，其中，用堿性水性溶液反萃取是在pH值為大約pH 7.0和大約pH 13.7之間進(jìn)行的。
7.權(quán)利要求2的方法，其中，有機(jī)萃取溶劑選自甲酸C2-C4烷基酯、C2-C4烷基羧酸的C1-C4烷基酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、四氯化碳和丁基甲基酮。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的有機(jī)萃取溶劑是乙酸酯。
9.權(quán)利要求3的方法，其中，將酸性發(fā)酵肉湯與有機(jī)萃取溶劑相接觸是在pH為大約pH 1和大約pH 6之間進(jìn)行的。
10.權(quán)利要求3的方法，其中，用堿性水溶液進(jìn)行反萃取是在pH為大約pH 7.0和大約pH 13.7之間進(jìn)行的。
11.權(quán)利要求3的方法，其中，用有機(jī)溶劑重萃取所述化合物是在pH為大約pH 1和大約pH 6之間進(jìn)行的。
12.權(quán)利要求3的方法，其中的有機(jī)萃取溶劑和有機(jī)重萃取溶劑各自獨(dú)立地選自甲酸C2-C4烷基酯、C2-C4烷基羧酸的C1-C4烷基酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、丁基甲基酮。
13.權(quán)利要求12的方法，其中的有機(jī)萃取溶劑和有機(jī)重萃取溶劑是乙酸酯。
14.權(quán)利要求13的方法，其中的有機(jī)萃取溶劑和有機(jī)重萃取溶劑是乙酸異丁酯。
15.權(quán)利要求1的方法，其中，獲得所述化合物的鹽是在溫度為大約-10℃到大約+60℃之間進(jìn)行的。
16.權(quán)利要求1的方法，其中，獲得該化合物的鹽包括通過向所述富含溶液中加入金屬鹽、氨、胺或銨鹽來沉淀所述化合物的鹽。
17.權(quán)利要求16的方法，其中，通過加入銨鹽使所述化合物的鹽沉淀。
18.權(quán)利要求17的方法，其中，銨鹽選自NH4Cl、NH4Br、NH4I、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)3PO4、(NH4)2S2O4、NH4OAc和NH4SCN。
19.權(quán)利要求18的方法，其中的銨鹽是NH4Cl。
20.權(quán)利要求16的方法，其中，通過加入氨氣來沉淀所述化合物的鹽。
21.權(quán)利要求16的方法，其中，通過加入氨氣和銨鹽來沉淀所述化合物的鹽。
22.權(quán)利要求16的方法，其中，通過加入金屬鹽來沉淀所述化合物的鹽。
23.權(quán)利要求22的方法，其中的金屬鹽選自鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銅鹽、鐵鹽、鎳鹽、錳鹽、錫鹽、鋅鹽和鋁鹽。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的金屬鹽選自含有Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+、Al3+金屬離子的鹽。
25.權(quán)利要求16的方法，其中，通過加入胺鹽沉淀所述化合物的鹽。
26.權(quán)利要求25的方法，其中的胺鹽具有的胺成分選自C1-C3伯、仲和叔烷基胺。
27.權(quán)利要求1的方法，其中，純化所述化合物鹽的步驟包括該化合物鹽的重結(jié)晶步驟。
28.權(quán)利要求27的方法，其中，所述化合物鹽的重結(jié)晶包括下列步驟a)將該化合物的鹽溶解于水中，由此形成該化合物鹽的水溶液；b)用逆溶劑稀釋該化合物鹽的水溶液；和c)加入含與該化合物鹽相同的金屬、銨、或者胺鎓(aminium)離子的鹽。
29.權(quán)利要求28的方法，其中的逆溶劑選自乙酸乙酯、乙酸異丁酯、異丁醇、丙酮、乙腈和乙醇。
30.權(quán)利要求28的方法，其中，含與化合物鹽相同的金屬、銨、或者胺鎓離子的鹽是銨鹽。
31.權(quán)利要求30的方法，其中的銨鹽選自NH4Cl、NH4Br、NH4I、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)3PO4、(NH4)2S2O4、NH4OAc和NH4SCN。
32.權(quán)利要求31的方法，其中的銨鹽是NH4Cl。
33.權(quán)利要求1的方法，其中，從所述化合物的鹽中解離出所述化合物的操作包括以下步驟a)將所述化合物的鹽溶于含水溶劑中，b)向含水溶劑中加入質(zhì)子酸，和c)將化合物從含水溶劑萃取至有機(jī)溶劑中，以形成所述化合物的有機(jī)溶液，另外，其中通過用氫氧化鈉水溶液反萃取所述化合物的有機(jī)溶液，而使該化合物與氫氧化鈉水溶液相接觸。
34.權(quán)利要求33的方法，其中萃取化合物是在pH為大約pH 1到大約pH 6之間進(jìn)行的。
35.權(quán)利要求33的方法，其中，有機(jī)溶劑選自甲酸C2-C4烷基酯、C2-C4烷羧酸的C1-C4烷基酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、四氯化碳和丁基甲基酮。
36.權(quán)利要求35的方法，其中，有機(jī)溶劑是乙酸異丁酯。
37.權(quán)利要求33的方法，其中，將化合物的有機(jī)溶液反萃取至氫氧化鈉水溶液中的操作是在pH為大約pH 6.5到大約pH 13.7之間進(jìn)行。
38.權(quán)利要求1的方法，其中，分離化合物鈉鹽的操作包括以下步驟a)濃縮化合物鈉鹽的水溶液，和b)用有機(jī)溶劑或者有機(jī)溶劑混合物稀釋該化合物鈉鹽的水溶液。
39.權(quán)利要求1的方法，其中，分離化合物鈉鹽的操作包括冷凍干燥該化合物鈉鹽的水溶液的步驟。
40.權(quán)利要求38的方法，其中，通過真空蒸餾來濃縮所述化合物鈉鹽的水溶液。
41.權(quán)利要求38的方法，其中濃縮所述化合物鈉鹽的水溶液通過毫微過濾進(jìn)行。
42.權(quán)利要求38的方法，其中，所述化合物鈉鹽的水溶液用丙酮稀釋。
43.權(quán)利要求38的方法，其中，所述化合物鈉鹽的水溶液用選自丙酮/乙腈混合物、乙醇/乙腈混合物和乙醇/乙酸乙酯混合物的有機(jī)溶劑混合物稀釋。
44.權(quán)利要求38的方法，其中，分離化合物鈉鹽是在大約-10℃到大約+60℃的溫度之間進(jìn)行的。
45.基本上不含帕伐他丁內(nèi)酯的帕伐他丁鈉。
46.權(quán)利要求45的帕伐他丁鈉，其中，總雜質(zhì)含量約為0.5重量％或者更少。
47.權(quán)利要求46的帕伐他丁鈉，其中，總雜質(zhì)含量約為0.2重量％或者更少。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的用于從發(fā)酵肉湯中回收化合物的方法，包含的步驟為通過萃取形成富含化合物的溶液，從該富含溶液中獲得所述化合物的鹽，純化該化合物的鹽及將其轉(zhuǎn)換鹽型至該化合物的金屬鹽。
文檔編號(hào)C07C69/33GK1433305SQ00818725
公開日2003年7月30日 申請(qǐng)日期2000年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月30日
發(fā)明者V·科里, L·迪克, I·福加斯, C·斯扎搏, E·A·納格伊內(nèi) 申請(qǐng)人:拜奧蓋爾藥廠有限公司