專利名稱：聚合物修飾的生物活性合成趨化因子及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚合物修飾的生物活性合成趨化因子，特別是趨化因子拮抗劑和激動劑，及其生產(chǎn)方法和用途。
對相關(guān)申請的交叉引用本申請是被收作本文參考的美國專利申請流水號60/217683(申請日為2000年7月12日)的部分后續(xù)申請。
背景技術(shù)：
趨化因子是參與白細(xì)胞運(yùn)輸和各種其他生物學(xué)過程的小蛋白(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3909-928和Wells等，InflammationRes.，1999，48353-362)。大多數(shù)趨化因子存在于炎癥位點(diǎn)，并且通過誘導(dǎo)趨化性和通常存在于炎癥位點(diǎn)的各種不同類型炎性細(xì)胞的細(xì)胞激活加重炎癥。某些趨化因子具有除了趨化性以外的其他特性，如誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的增殖和激活，調(diào)節(jié)造血祖細(xì)胞生長，將造血祖細(xì)胞運(yùn)入和運(yùn)出處于發(fā)炎狀態(tài)的骨髓，血管生成和腫瘤生長(例如，參見Baggiolini.等，Ann.Rev.Immunology，1997，15675-705；Zlotnik等，Critical Rev.Immunology，1999，19，11-4；Wang等，J.Immunological Methods，1998，220，1-21-17；和Moser等，Intl.Rev.Immunology，1998，16，3-4323-344)。
有很多趨化因子的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能是已知的。趨化因子的分子量大約為8-10kDa，并且在蛋白水平上表現(xiàn)出彼此之間具有大約20-50％的序列同源性。所述蛋白還具有共同的三級結(jié)構(gòu)。所有趨化因子都具有多個(gè)參與分子內(nèi)二硫鍵形成的保守的半胱氨酸殘基，利用這些殘基鑒定趨化因子并對趨化因子進(jìn)行分類，例如，具有前兩個(gè)半胱氨酸殘基被一個(gè)氨基酸隔開的趨化因子被稱為“C-X-C”趨化因子(又被稱為α趨化因子)。前兩個(gè)半胱氨酸相鄰的趨化因子被稱為“CC”趨化因子(又被稱為β趨化因子)?！癈”趨化因子與其他趨化因子的差別在于缺乏半胱氨酸殘基(又被稱為γ趨化因子)。C趨化因子與CC趨化因子的某些成員具有相似性，但是它喪失了CC和CXC趨化因子所特有的第一個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸殘基。前兩個(gè)半胱氨酸殘基被三個(gè)氨基酸隔開的趨化因子小組的成員，被稱為“CXXXC”趨化因子(又被稱為“CX3C”或δ趨化因子)。還存在趨化因子的亞型，例如，包括兩個(gè)額外的保守半胱氨酸殘基的CC趨化因子是已知的，并且有時(shí)候用術(shù)語“C6β”趨化因子表示該亞型。到目前為止所鑒定的大部分趨化因子是CC和CXC趨化因子類型的成員。
趨化因子與重要的疾病途徑有關(guān)，如哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、癌癥、病毒性疾病、粉瘤/動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和器官移植排斥。不過，很多趨化因子所存在的普遍問題及其作為治療劑的潛在用途，涉及它們所固有的促進(jìn)或加劇白細(xì)胞炎癥反應(yīng)和感染的特性。為此，業(yè)已對趨化因子進(jìn)行了多種修飾，以期制備相應(yīng)的野生型趨化因子的拮抗劑。Proudfoot(J.Biol.Chem.，1996，271，52599-2603)；Simmons等(Science276276-279)；Gong等(J.Biol.Chem.，1996，27110521-10527)；Baggiolini等(J.Exp.Med.，1997，186，81189-1191)；Polo等(Eur.J.Immunol.，2000，303190-3198)；Nibbs等(J.Immunol.，2000，1641488-1497)和Townson等(J.Biol.Chem.，2000，176，5039254-39261)報(bào)導(dǎo)了各種N-末端修飾的趨化因子。
一種典型的代表性例子是RANTES。在某些場合下，野生型RANTES能增強(qiáng)炎癥和HIV感染(Gordon等，J.Virol.，1999，73684-694；Czaplewski等，J.Biol.Chem.，1999，27416077-16084)。相反，對RANTES多肽鏈的26號位置(E26A)和66號位置(E66S)進(jìn)行取代，可以將該分子轉(zhuǎn)化成其非炎癥形式，并且提高其與它的受體競爭結(jié)合HIV的能力(Appay等，J.Biol.Chem.，1999，2743927505-27512；還可參見US6214540，該專利披露了能抑制HIV感染的趨化因子以及基于該趨化因子的方法)。不過，對RANTES的N-末端進(jìn)行的修飾產(chǎn)生了能抑制HIV-1干擾的拮抗劑，包括N-末端截短[RANTES 9-68]，添加甲硫氨酸(Met-RANTES)，氨基氧戊烷(AOP-RANTES)或壬?；?NNY-RANTES)(Arenzana-Seisdedos等，Nature，1996，383400；Mack，等，J.Exp.Med.，1998，1871215-1224；Proudfoot等，J.Biol.Chem.，1996，2712599-2603；Wells等，WO96/17935；Simmons等，Science，1997，276276-279；Offord等，WO99/11666；和Mosier等，J.Virology，1999，73，53544-3550)。US6168784披露了趨化因子類似物NNY-RANTES，并且建議用PEG鏈對該類似物的C-末端進(jìn)行修飾。Wilkin等(Curr.Opinion Biotech.1999，9412-426)對蛋白的化學(xué)合成進(jìn)行了綜述。
趨化因子的生物學(xué)活性是由受體介導(dǎo)的(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3909-928和Wells等，Inflammation Res.，1999，48353-362)。其中包括趨化因子特異性受體和具有重疊的配體特異性，能結(jié)合屬于CC趨化因子或CXC趨化因子的幾種不同趨化因子的受體。例如，CC趨化因子SDF-1α對CXCR4受體特異，而CXC趨化因子RANTES能結(jié)合CCR1、CCR3和CCR5受體。另一種例子是趨化因子Eotaxin，它是CCR3(又被稱為CKR3)受體的配體(例如，參見Cyster，J.G.，Science，1999，2862098-2102；Ponath等，J.Experimental Medicine，1996，183，62437-2448；Ponath等，J.Clinical Investigation，1996，97，3604-12；和Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Communications，1997，231，2365-368)。
趨化因子激活其關(guān)聯(lián)受體的能力，在很大程度上受對該趨化因子的N-末端區(qū)的修飾的影響。所述改變可以是由于蛋白水解加工、誘變或化學(xué)修飾所造成的(例如，參見Proudfoot，A.E.等，J.Biol.Chem.，1996，2712599；Grzegorzewski等，Cytokine，2001，13，4209-219；Clark-Lewis等，J.Biol.Chem.，1991，266，3423128-23134；Moser等，J.Biol.Chem.，1993，2687125-7128；Harrisson，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，9510896；Mack等，J.Exp.Med.，1998，1871215；Gong等，J.Biol.Chem.，1996，27110521；Struyf等，Eur.J.Immunol.，1998，281262；Weber等，J.Exp.Med.，1996，183631；Proot等，1998，J.Immunol.，1604034；Yang等，J.Virol.1999，73，64582-4589；Rusconi等，Antivir Ther.，2000，5，3199-204；Wyuts等，J.Immunol.，1999，163，116155-6613；Detheux等，J.Exp.Med.，2000，1921501-1508；Nibbs等，J.Immunol.，2000，1641488-1497；McCole等，J.Immunol.，1999，163，52829-2835；Nufer等，Biochemistry，1999，38，2636-642；和Wyuts等，Eur.J.Biochem.，1999，260，2421-429)。
上述很多修飾過的蛋白能在體外拮抗趨化因子受體介導(dǎo)的作用，能在若干動物模型中抑制病毒感染并明顯減輕炎癥。在某些場合下，它們保留了激活其受體的能力，并且在原代細(xì)胞中這種活性反映了受體表達(dá)的水平。對N-末端區(qū)的某些修飾還對趨化因子受體的運(yùn)輸有重大影響。因此，盡管所述修飾過的趨化因子能拮抗其受體和相應(yīng)的野生型趨化因子，但是作為拮抗劑、激動劑或其變異的分類可能不同。
盡管業(yè)已提出將趨化因子用作治療劑，潛在的主要缺陷之一是它在體內(nèi)的循環(huán)半衰期較差，通常只有幾分鐘。為了提高循環(huán)半衰期，已知可以將諸如PEG(聚乙二醇)等水溶性聚合物連接在蛋白上，但是所獲得的混亂的結(jié)果使得以受控制的方式和用戶所規(guī)定的精確度連接它們是困難的(Zalipsky，S.Bioconjugate Chemistry，1995，6150-165；Mehvar，R.，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，2000，3，1125-136；和Monfardini等，Bioconjugate Chemistry，1998，9418-450)。
在這一方面，開發(fā)了一種用于將PEG鏈以位點(diǎn)特異性形式連接到蛋白的N-末端殘基上的技術(shù)，并且在生長因子粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和趨化因子IL-8上得到了證實(shí)(Gaertner等，BioconjugateChemistry，1996，7，138-44)。這兩種因子都被報(bào)導(dǎo)保留了其大部分活性。不過，對于被用作拮抗劑的藥物來說，效力是特別重要的，如用作病毒感染的基于受體的抑制劑。因此，將PEG或其他水溶性聚合物連接到除了IL-8以外的趨化因子的N-末端殘基上，特別是趨化因子拮抗劑上，可能不適合提供N-末端殘基的敏感性及其對活性和效力的作用。公開的專利申請WO00/53223是大量趨化因子文獻(xiàn)的大部分的代表，該文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了新型趨化因子，并且報(bào)導(dǎo)了可以制備拮抗劑，以及可以連接PEG或其它水溶性聚合物，但是缺乏連接在何處或連接何種類型的鏈的特異性，也沒有與之相關(guān)的活性。
用野生型趨化因子作為治療劑的另一個(gè)潛在缺陷是，它具有在高濃度下聚集的傾向，并且混雜結(jié)合并有差異地激活趨化因子受體(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3909-928和Wells等，InflammationRes.，1999，48353-362)。聚集會對制備造成問題，并且在某些場合下會加重病理學(xué)(Czaplewski等，J.Biol.Chem.，1999，274，2316077-16084；Czaplewski等，“hMIP-1α的工程、生物學(xué)和臨床開發(fā)”，1999，參見Chemokinesin DiseaseBiology and ClinicalResearch，Ed.C.A.Herbert，Humana Press Inc.，Totwa，NJ.；Trkola等，J.Virol.，1999，73，86370-6379；Appay等，J.Virol.，1999，274，3927505-27512；Hunter等，Blood，1995，86，124400-4408；Lord等，Blood，1995，85，123412-3415；Lord等，Brit.J.Cancer.，1996，741017-1022)?；祀s結(jié)合是趨化因子的一種特征，并且在某些治療設(shè)計(jì)中可能是不理想的。不過，趨化因子很有可能用作治療劑(Murphy等，Pharmacological Rev.，2000，51，1145-176，Rollins，BJ.，Blood，1997，90，3909-928和Wells等，Inflammation Res.，1999，48353-362)。
盡管所述方法在某些場合下具有改善了的與拮抗劑相關(guān)的效力，在制備趨化因子拮抗劑時(shí)所遇到的一個(gè)挑戰(zhàn)是要提高效力同時(shí)又要改善諸如藥代動力學(xué)的其他藥物特性。另外，需要發(fā)現(xiàn)用于制備強(qiáng)效趨化因子抑制劑的策略和方法，以及相應(yīng)的趨化因子抑制劑化合物，及其在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥品方面的用途。
因此，需要具有包括改善了的循環(huán)半衰期和希望的活性和效力在內(nèi)的改善了的治療特性的新型趨化因子和修飾過的趨化因子，特別是需要能發(fā)揮抑制或拮抗天然存在的趨化因子的活性的新型趨化因子和修飾過的趨化因子。還需要提供具有改善了的循環(huán)半衰期和改變了的受體活性和效力的趨化因子和修飾過的趨化因子。本發(fā)明滿足了上述要求以及其他要求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及聚合物修飾的生物活性合成趨化因子，特別是涉及N-和/或C-末端修飾的趨化因子，并且涉及用于生產(chǎn)所述趨化因子的方法和用途。本發(fā)明的N-末端修飾的生物活性合成趨化因子包括在其N-末端用脂族鏈和一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生物進(jìn)行修飾的趨化因子多肽鏈。本發(fā)明的C-末端修飾的生物活性合成趨化因子包括在其C-末端用脂族鏈或多環(huán)修飾的趨化因子多肽鏈。本發(fā)明的N-和C-末端修飾的生物活性合成趨化因子還可以包括在N-和C-末端進(jìn)行組合修飾。還提供了生產(chǎn)和使用本發(fā)明的生物活性趨化因子的方法。本發(fā)明的價(jià)值在于它提供了一種用于制備作為相應(yīng)的天然存在的野生型趨化因子或其受體的強(qiáng)效拮抗劑的化合物的通用方法。
附圖簡述

圖1A-1E表示用于制備本發(fā)明的聚合物修飾的合成的生物活性蛋白的方法的示意圖。
圖2A-2C表示用于制備本發(fā)明的合成的生物活性蛋白的方法的示意圖。
圖3A-3B表示多片段連接方法的示意圖，該方法包括三個(gè)或三個(gè)以上非重疊肽片段的化學(xué)連接，即至少有一個(gè)片段是相當(dāng)于最終的全長連接產(chǎn)物的中間片段。
圖4A-4C表示所得到的側(cè)鏈硫醇的天然化學(xué)連接和化學(xué)修飾。
圖5A-5B表示用于制備本發(fā)明的水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和特殊的化學(xué)選擇功能官能團(tuán)(U)的固相方法。
圖6A-6D表示用于制備本發(fā)明的優(yōu)選的基本為非抗原性的水溶性聚酰胺-Polymer J*成分的固相方法，該成分用于隨后與U-B核心連接。
圖7表示用于偶聯(lián)U-B成分和Polymer-J*成分以便制備結(jié)構(gòu)式為U-B-Polymer-J*的本發(fā)明的優(yōu)選合成聚合物結(jié)構(gòu)的方法。
圖8表示精確連接水溶性聚合物和一種肽片段，用于連接并生產(chǎn)本發(fā)明的生物活性合成蛋白的另一種方法。
圖9是表示通過保守的半胱氨酸形式確定的四種類型天然存在的趨化因子及其相應(yīng)的N-末端、N-環(huán)和C-末端區(qū)的通用結(jié)構(gòu)的示意圖，其中，“C”是半胱氨酸的單字母代碼，而“X”表示除了半胱氨酸之外的任何氨基酸。
圖10A-10D表示各種趨化因子多肽鏈的天然存在的氨基酸序列的例子，包括所述趨化因子的相應(yīng)的N-末端、N-環(huán)和C-末端區(qū)。使用了20種遺傳編碼氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母氨基酸代碼。
圖11表示被命名為Rantes G1755-01的合成趨化因子，它是Rantes的聚合物修飾的類似物。
圖12表示被命名為Rantes G1755的合成趨化因子，它是Rantes的聚合物修飾的類似物。
圖13表示被命名為Rantes G1805的合成趨化因子，它是Rantes的聚合物修飾的類似物。
圖14表示被命名為Rantes G1806的合成趨化因子，它是Rantes的聚合物修飾的類似物。
圖15表示在還原性(R)和非還原性條件(N)下比較野生型Rantes和合成的趨化因子類似物Rantes G1806的相對分子量的代表性SDS-PAGE凝膠。相對分子量在每一塊凝膠的左側(cè)示出，它相當(dāng)于在同一塊凝膠上電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖16表示比較以每毫升特定Rantes類似物的皮克重量為單位(pg/ml)的血漿濃度與以分鐘為單位的時(shí)間的代表性藥代動力學(xué)曲線。在該圖中所示出的化合物是AOP-Rantes和Rantes G1755、G1806和G1805。
優(yōu)選實(shí)施方案的說明本發(fā)明涉及生物活性合成趨化因子，特別是N-和/或C-末端修飾的趨化因子分子。本發(fā)明的新型生物分子合成趨化因子優(yōu)選能抑制天然存在的趨化因子的活性，這種作用是通過合適的趨化因子生物測定確定的。所述分子可以通過拮抗與它結(jié)合的趨化因子受體的一種或多種特征(例如，抑制病毒感染、導(dǎo)致受體下調(diào)、導(dǎo)致受體內(nèi)化)并因此“拮抗”受體返回到細(xì)胞表面的正常循環(huán)而發(fā)揮作用。對于其他生物學(xué)反應(yīng)來說，所述分子可以起著受體拮抗劑的作用，例如，誘導(dǎo)鈣流通，啟動趨化性等。因此，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子可以起著拮抗劑的作用(包括部分拮抗)，不過還可以起著激動劑的作用(包括部分激動)或這兩種作用的混合。優(yōu)選具有至少一種拮抗特性的分子，即拮抗與它結(jié)合的趨化因子受體的一種或多種生物學(xué)特性的能力(例如，阻斷或部分阻斷(1)病毒感染，(2)趨化性，(3)受體循環(huán)等)。所述分子可以通過結(jié)合(或涉及)而不激活趨化因子受體的方式起作用，或者可以通過其他方式起作用。
A.本發(fā)明的N-和C-末端修飾的生物活性合成趨化因子本發(fā)明特別涉及能抑制相應(yīng)的天然存在的趨化因子活性的生物活性合成趨化因子。所述分子優(yōu)選具有N-和/或C-末端修飾。本發(fā)明的N-末端修飾的生物活性合成趨化因子包括在其N-末端用脂族鏈和一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生物修飾過的趨化因子多肽鏈。從N-末端到C-末端方向，本發(fā)明的N-末端修飾的生物活性合成趨化因子具有以下結(jié)構(gòu)式J1-X1-Z1-CHEMOKINE，其中J1是脂族鏈；X1是包括該趨化因子多肽鏈的N-末端氨基酸序列的0個(gè)或多個(gè)氨基酸的間隔區(qū)；Z1是氨基酸衍生物；CHEMOKINE是所述趨化因子多肽鏈的其余的氨基酸序列；而連線“-”表示共價(jià)鍵。將所述化合物設(shè)計(jì)成兼顧到所述多肽鏈的N-末端區(qū)的全長。因此，根據(jù)疏水性脂族鏈的長度和所述氨基酸衍生物的位置，相對天然存在的趨化因子多肽鏈而言，所述N-末端拮抗劑可以在其N-末端包括一個(gè)或多個(gè)取代、插入或缺失。
本發(fā)明C-末端修飾的生物活性合成趨化因子包括在其C-末端用脂族鏈或多環(huán)修飾的趨化因子多肽鏈。從N-末端到C-末端方向，該化合物具有以下結(jié)構(gòu)式CHEMOKINE-X2-J2，其中X2是包括該趨化因子多肽鏈的C-末端氨基酸序列的0個(gè)或多個(gè)氨基酸的間隔區(qū)；J2是脂族鏈或多環(huán)；CHEMOKINE是所述趨化因子多肽鏈的其余的氨基酸序列；而連線“-”表示共價(jià)鍵?？梢詫吇蜃拥腃-末端區(qū)進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修飾，包括插入、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或其他化學(xué)成分，以便與相應(yīng)的野生型分子相比延長該多肽鏈的C-末端，以及添加熒光標(biāo)記和生物相容的聚合物，并且與諸如小的有機(jī)分子、肽、和蛋白之類的其他化合物結(jié)合。
本發(fā)明的N-和C-末端修飾的生物活性合成趨化因子可以包括同時(shí)在N-和C-末端區(qū)進(jìn)行的修飾，在具體提到這些修飾時(shí)，可將其命名為N-和C-末端修飾的生物活性合成趨化因子。這種化合物具有以下結(jié)構(gòu)式J1-X1-Z1-CHEMOKINE-X2-J2，其中，J1、X1、Z1、CHEMOKINE、X2、J2和“-”的定義如上文所述。根據(jù)特定的最終用途，所述化合物以協(xié)同方式組合了N-和C-末端修飾的優(yōu)點(diǎn)。
“趨化因子多肽鏈”表示與天然存在的野生型趨化因子的多肽鏈基本上同源的多肽鏈?！癗-末端氨基酸序列”表示所述趨化因子多肽鏈的靠近天然存在的趨化因子多肽鏈的第一個(gè)二硫鍵形成半胱氨酸并且位于其N-端的氨基酸序列?！癈-末端氨基酸序列”表示所述趨化因子多肽鏈的靠近天然存在的趨化因子多肽鏈的最后一個(gè)二硫鍵形成半胱氨酸，并且位于其C-端的氨基酸序列。所述趨化因子多肽鏈、N-末端氨基酸序列、C-末端氨基酸序列和第一個(gè)和最后一個(gè)二硫鍵形成半胱氨酸，構(gòu)成了本發(fā)明的生物活性合成趨化因子基礎(chǔ)，并可以根據(jù)相應(yīng)的天然存在的趨化因子的氨基酸序列，以及通過與同一種類的其他趨化因子進(jìn)行同源性模擬，如比較被稱為C、CC、CXC和CXXXC趨化因子的氨基酸序列而方便地推測。
例如，下面是已知的天然存在的趨化因子的例子，其中的很多業(yè)已用不同的名稱披露過，并因此出現(xiàn)了若干次6Ckine，9E3，ATAC，ABCD-1，ACT-2，ALP，AMAC-1，AMCF-1，AMCF-2，AIF，ANAP，Angie，β-R1，β-血小板球蛋白，BCA-1，BLC，blr-1配體，BRAK，C10，CCF18，Ck-β-6，Ck-β-8，Ck-β-8-1，Ck-β-10，Ck-β-11，cCAF，CFF-4，CINC，C7，CKA-3，CRG-2，CRG-10，CTAP-3，DC-CK1，ELC，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-1，Exodus-2，ECIP-1，ENA-78，EDNAP，ENAP，F(xiàn)IC，F(xiàn)DNCF，F(xiàn)INAP，F(xiàn)ractalkine，G26，GDCF，GOS-19-1，GOS-19-2，GOS-19-3，GCF，GCP-2，類GCP-2，GRO1，GRO2，GRO3，GROα，GROβ，GROγ，H400，HC-11，HC-14，HC-21，HCC-1，HCC-2，HCC-3，HCC-4，H174，肝素中和蛋白，Humig，I-309，ILINCK，I-TAC，Ifi10，IL8，IP-9，IP-10，IRH，JE，KC，Lymphotactin，L2G25B，LAG-1，LARC，LCC-1，LD78α，LD78β，LD78γ，LDCF，LEC，Lkn-1，LMC，LAI，LCF，LA-PF4，LDGF，LDNAP，LIF，LIX，LUCT，Lungkine，LYNAP，Manchester抑制劑，MARC，MCAF，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，MDC，MIP-1α，MIP-1β，MIP-1δ，MIP-1γ，MIP-3，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，MIP-5，Monotactin-1，MPIF-1，MPIF-2，MRP-1，MRP-2，M119，MDNAP，MDNCF，巨核細(xì)胞刺激因子，MGSA，Mig，MIP-2，mob-1，MOC，MONAP，NC28，NCC-1，NCC-2，NCC-3，NCC-4N51，NAF，NAP-1，NAP-2，NAP-3，NAP-4，NAPS，NCF，NCP，Neurotactin，制癌蛋白A，P16，P500，PARC，pAT464，pAT744，PBP，類PBP，PBSF，PF4，類PF4，PF4-ALT，PF4V1，PLF，PPBP，RANTES，SCM-1α，SCI，SCY A26，SLC，SMC-CF，ST38，STCP-1，SDF-1α，SDF-1β，TARC，TCA-3，TCA-4，TDCF，TECK，TSG-8，TY5，TCF，TLSFα，TLSFβ，TPAR-1，TSG-1。
通過說明，而不是通過限定的方式，在圖10A-10D中示出了上述某些野生型趨化因子多肽鏈及其相應(yīng)的A-末端、N-環(huán)和C-末端氨基酸序列的例子?？梢岳斫獾氖牵渌内吇蜃佣嚯逆?zhǔn)且阎?，并且可以從很多不同的來源獲得，包括公眾可以進(jìn)入的數(shù)據(jù)庫，如基因組數(shù)據(jù)庫(約翰霍普金斯大學(xué)，馬里蘭州，美國)，蛋白數(shù)據(jù)庫(Brookhaven國家實(shí)驗(yàn)室&Rutgers大學(xué)，新澤西，美國)，Entrez(國家健康研究所，馬里蘭)，NRL3D(匹茨堡超級計(jì)算中心，卡耐基梅隆大學(xué)，賓夕法尼亞州，美國)，CATH(University College London，London，UK)，NIH Gopher Server(NIH，馬里蘭州，美國)，ProLink(波士頓大學(xué)，馬薩諸塞州，美國)，核酸數(shù)據(jù)庫(Rutgers大學(xué)，新澤西州，美國)，GenBank(國家醫(yī)學(xué)圖書館，馬里蘭州，美國)，Expasy(瑞士生物信息研究所，日內(nèi)瓦，瑞士)等。另外，通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行同源性和模式比較，可以鑒定新的趨化因子，如由各種基因和蛋白測序程序產(chǎn)生的趨化因子，包括用于實(shí)現(xiàn)該目的的數(shù)據(jù)庫和相關(guān)的工具。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，可以用諸如噬菌體展示或模塊混排的定向進(jìn)化技術(shù)制備具有較高的受體特異性的趨化因子。業(yè)已披露了在治療和預(yù)防HIV中利用噬菌體展示測定趨化因子衍生物或類似物結(jié)合趨化因子受體的能力(US6214540；DeVico等)。業(yè)已將噬菌體展示用于檢測或鑒定CXC趨化因子受體3(CXCR3)的受體蛋白配體、抑制劑或啟動子(US6140064，Loetscher等)，其特征是能選擇性結(jié)合一種或多種具有誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答能力的趨化因子(US6184358，Loetscher等)。業(yè)已披露了噬菌體展示在標(biāo)記和篩選分子(US6180336，Osbourn等)，標(biāo)記并且隨后純化特異抗原的結(jié)合分子(例如，參見WO92/01047)，以及在確定用于預(yù)防和治療HIV感染和免疫疾病的肽組合物(US6090388，Wang)方面的用途。
業(yè)已披露了與G蛋白偶聯(lián)的受體相關(guān)的噬菌體展示方法(例如，參見Doorbar，J.等，“通過噬菌體展示分離拮抗凝血酶受體的肽”，J.Mol.Biol.244361-9，1994)，具有用于在N-環(huán)區(qū)進(jìn)行定向進(jìn)化的優(yōu)選區(qū)域(Konigs，C，“對噬菌體展示隨機(jī)肽文庫進(jìn)行雙單克隆抗體篩選發(fā)現(xiàn)了趨化因子受體CCR5的模擬表位與所述受體的三級結(jié)構(gòu)以及HIV-1gp120的N-末端結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)”，Eur.J.Immunol.，2000，Apr；30，41162-71；Sidhu，S.S.等，“大型蛋白在用于功能性選擇篩選的噬菌體上的高拷貝展示”，J.Mol.Biol.2000，F(xiàn)eb，18；296，2；487-95；Fielding，A.K.等，“超融合長臂猿白血病外被糖蛋白通過配體展示對細(xì)胞毒性基因進(jìn)行定向”，Hum Gene Ther，2000，Apr，10；11，6817-26)，位于N-環(huán)和C-末端之間的部分，以及C-末端(Cain，S.A.等，“從完整分子隨機(jī)突變的C5a文庫中篩選新型配體”，Protein Eng，2001，Mar；14，3189-93；Heller，T.等，“從噬菌體文庫中篩選能減輕免疫復(fù)合疾病和缺血性/在灌注損傷的炎癥反應(yīng)的C5a受體拮抗劑”，J.Immunol.1999，Jul，15；163，2985-94；Chang，C.等，“用組合的肽文庫剖析LXXLL核受體共激活物相互作用雌激素受體α和β的肽拮抗劑的發(fā)現(xiàn)”，Mol Cell Biol1999，Dec；19，28226-39)。
J1和J2的合適的疏水性脂族鏈包括，但不限于長度為5(C5)-22(C22)個(gè)碳原子的疏水性脂族鏈。所述鏈可以是不飽和的和/或不分支的，或者可以具有不同程度的飽和和/或分支。所述疏水性脂族鏈的通式為Cn(Rm)-，其中，Cn是碳原子的數(shù)量，而Rm是選自氫、烷基、酰基、芳族基團(tuán)或其組合的取代基的數(shù)量，n和m可以相同或不同。J1和J2基團(tuán)可以通過任何合適的共價(jià)鍵與X1、X2連接或與所述趨化因子多肽鏈連接。合適共價(jià)鍵的例子包括，但不限于酰胺、酮、醛、酯、醚、硫醚、硫酯、噻唑烷(thiozolidine)，肟、噁唑烷(oxizolidine)，席夫堿和席夫堿類鍵(例如，酰肼)。所述鍵可以包括但不限于-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-NH-(CH2)-C(O)-；-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-ONH-C(O)-；-ONH-(CH2)-C(O)-；-ONH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)x-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C-(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-CH＝CH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)--S-C(O)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6ON-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6ON-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-；-C(O)-，或共價(jià)鍵，其中，x和y是2、3、4或更大，并且可以相同或不同。
適合鍵體系的化學(xué)方法是眾所周知的，并可用于本發(fā)明(例如，參見“蛋白結(jié)合和交聯(lián)的化學(xué)方法”，S.S.Wong，Ed.，CRC Press，Inc.，1993；Perspectives in Bioconjugate Chemistry，ClaudeF.Modres，Ed.，ACS，1993)。
除了將J1和J2連接到X1、X2或趨化因子多肽鏈上之外，還可選擇所采用的鍵體系，以便調(diào)節(jié)靶分子的物理-化學(xué)和/或生物學(xué)特性，其前提是所得到的分子保留其拮抗劑特性。例如，這一目的可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)摻入在一種類型的條件下比另一種條件下更穩(wěn)定(或更不穩(wěn)定)的鍵體系調(diào)節(jié)半衰期等，或摻入具有不同長度、剛性、電荷和/或手性的鍵體系調(diào)節(jié)效力、特異性等。將烴鏈與趨化因子多肽鏈連接在一起的鍵單位可以有很大不同，其前提是J1和/或J2之間的總體長度和空間填充最優(yōu)選近似于天然存在的趨化因子。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疏水性脂族鏈J1是長度為5個(gè)(C5)-10個(gè)(C10)碳原子的烴鏈，而所述疏水性脂族鏈J2是長度為12個(gè)(C12)-20個(gè)(C20)碳原子的脂類。J1 C5-C10烴鏈的例子包括，但不限于-C5H11，-C5H9，-C5H7，-C5H5，-C5H3，-C6H13，-C6H11，-C6H9，-C6H7，-C6H5，-C6H3，-C7H15，-C7H13，-C7H11，-C7H9，-C7H7，-C7H5，-C7H3，-C8H17，-C8H15，-C8H13，-C8H11，-C8H9，-C8H7，-C8H5，-C8H3，-C9H19，-C9H17，-C9H15，-C9H13，-C9H11，-C9H9，-C9H7，-C9H5，-C9H3，-C10H21，-C10H19，-C10H17，-C10H15，-C10H13，-C10H11，-C10H9，-C10H7，-C10H5，和-C10H3。
合適的J2脂類包括，但不限于脂肪酸衍生的脂類和多環(huán)甾族化合物衍生的脂類。脂肪酸包括，但不限于飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸的例子有月桂酸(C12)，豆蔻酸(C14)，棕櫚酸(C16)，硬脂酸(C18)和花生酸(C20)。不飽和脂肪酸的例子包括油酸(C18)，亞油酸(C18)、亞麻酸(C18)、桐油酸(C18)、和花生四烯酸(C20)。多環(huán)類包括，但不限于醛甾酮、膽甾烷醇、膽甾醇、膽酸、糞甾醇、皮質(zhì)甾醇、可的松、脫氫膽甾醇、去氫膽固醇、毛地黃毒苷配基、麥角甾醇、雌二醇、羥基皮質(zhì)甾醇、lathosterol，強(qiáng)的松、孕烯諾龍、黃體酮、睪酮、酵母甾醇等。所述脂肪酸通常是通過酸成分與所述趨化因子多肽鏈連接，因此產(chǎn)生了?；B接的部分，不過也可以采用其他鍵。將烴鏈連接在趨化因子多肽鏈上的鍵單位可以有很大不同，其前提是填充所述N-末端區(qū)的總體長度和空間填充近似于天然存在的趨化因子。在這一方面，業(yè)已發(fā)現(xiàn)C-末端區(qū)更靈活一些，因此，與N-末端區(qū)相比總體長度和空間填充可以有更大程度的波動。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，包括在本發(fā)明的生物活性合成趨化因子中的J1和J2成分包括C5-C20飽和的或不飽和的酰基鏈，如壬?；⑷上；?、氨基氧戊烷、十二?；⒍罐Ⅴ；⒆貦八?、月桂基、棕櫚?；⒍；?、油?；?、或膽酰基。例如，所述J1取代基可以是壬?；虬被跷焱椋鳭2取代基可以是飽和的或不飽和的脂肪酸，優(yōu)選C12-C20脂肪酸，或諸如膽甾醇的多環(huán)甾族脂類。
根據(jù)所述疏水性脂族鏈的性質(zhì)和長度，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子可以包括添加在所述多肽鏈上的，特別是添加在C-末端上的額外的氨基酸或其他成分，以便提供用于疏水性脂族成分的間隔基團(tuán)和/或各自的連接位點(diǎn)。
“氨基酸衍生物”表示除了20種遺傳編碼的天然存在的氨基酸以外的氨基酸或氨基酸樣化學(xué)。具體地講，氨基酸衍生物Z1是除了20種遺傳編碼的天然存在的氨基酸以外的氨基酸，并且具有結(jié)構(gòu)式-(N-CnR-CO)-，其中，Cn是1-22個(gè)碳，R是氫、烷基或芳族基團(tuán)，其中N和Cn，N和R，或Cn和R可以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另外，N、Cn和R根據(jù)所述氨基酸衍生物在其還原形式下可以各自具有一個(gè)或多個(gè)氫。所述烷基部分可以是取代的或未取代的，它可以是線性的、支化的、或環(huán)狀的，并且可以包括一個(gè)或多個(gè)雜原子。所述芳族基團(tuán)可以是取代的或未取代的，并且包括一個(gè)或多個(gè)雜原子。所述氨基酸衍生物可以是從頭制備的，或者從商業(yè)來源獲得(例如，參見Calbiochem-Novabiochem AG，Switzerland；Advanced Chemtech，Louisville，KY，USA；Lancaster Synthesis，Inc.，Windham，NH，USA；BachemCalifornia，Inc.，Torrance，CA，USA；Genzyme Corp.，Cambridge，MA，USA)。氨基酸衍生物的例子包括，但不限于氨基異丁酸(Aib)，羥基脯氨酸(Hyp)，1，2，3，4-四氫異喹啉-3-COOH(Tic)，二氫吲哚-2-羧酸(indol)，4-二氟脯氨酸(P(4，4DiF))，L-噻唑烷-4-羧酸(Thz)，L-高脯氨酸(HoP)，3，4-脫氫脯氨酸(ΔPro)，3，4-二羥基苯丙氨酸(F(3，4-DiOH))，pBz1-3，4-二羥基苯丙氨酸(F(3，4-DiOH)，pBzl)，二苯酮(p-Bz)，環(huán)己基丙氨酸(Cha)，3-(2-萘基)-丙氨酸(βNal)，環(huán)己基甘氨酸(Chg)，和苯基甘氨酸(Phg)。
就X1，CHEMOKINE和X2而言，所述成分的氨基酸序列與相應(yīng)的天然存在的野生型分子基本同源。本文所使用的術(shù)語“基本同源”包括與特定序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列同源性的氨基酸序列(優(yōu)選95-99％)。該術(shù)語可以包括，但不限于相對特定序列而言具有1-20，1-10或1-5個(gè)單一氨基酸缺失、插入或取代的氨基酸序列，只要所得到的多肽能起著相應(yīng)的天然存在的趨化因子拮抗劑的作用就行。
例如，本領(lǐng)域眾所周知的是，某些氨基酸可以用其他氨基酸所取代，而又不會導(dǎo)致多肽特征的明顯改變，包括但不限于氨基酸的保守性取代。所述可能性屬于本發(fā)明的范圍。還應(yīng)當(dāng)指出的是，還可以進(jìn)行不會明顯改變多肽特征的氨基酸缺失或插入。本發(fā)明包括這樣的缺失或插入(例如，缺失或插入的部分最多可達(dá)相應(yīng)天然存在的趨化因子的特異拮抗劑序列長度的10、20或50％)。另外，還可以對趨化因子進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修飾，包括混合和匹配不同的趨化因子多肽片段，以便產(chǎn)生額外的多樣性，如在WO99/11655中所披露的模塊‘交換’合成方法，該文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考。
除了N-和/或C-末端的改變之外，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子還可以包括出現(xiàn)在該多肽鏈上其他位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入或缺失，即在上述結(jié)構(gòu)式中用CHEMOLINE表示的多肽鏈。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，對所述趨化因子的N-環(huán)進(jìn)行改變，以便提高其對靶受體的特異性/選擇性。這樣，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子的N-環(huán)能抑制一種特定受體，同時(shí)降低對其他可能的共同受體的拮抗作用?！癗-環(huán)”表示相鄰于構(gòu)成一種特定趨化因子多肽鏈的N-末端區(qū)的第一個(gè)保守半胱氨酸模式并在其C-端的20-26個(gè)氨基酸序列區(qū)(參見圖9和10A-10D)。例如，從該趨化因子多肽鏈的N-末端到C-末端方向，CC趨化因子的N-環(huán)相鄰于第一個(gè)和第二個(gè)保守的半胱氨酸并在其C-端，并且相鄰于/第三個(gè)保守的半胱氨酸并在其N-末端，并且位于這兩者之間的氨基酸序列區(qū)。
在另一種實(shí)施方案中，所述取代和插入可以包括天然氨基酸以及氨基酸衍生物或用一種聚合物修飾過的氨基酸。聚合物結(jié)合的優(yōu)選位置位于趨化因子的C-末端部分。對于具有天然糖基化位點(diǎn)的趨化因子來說，聚合物可以連接在為了糖基化而編碼的一個(gè)或多個(gè)氨基酸上，例如，N-連接的糖基化位點(diǎn)的精氨酸。所述聚合物可以連接在天然存在的氨基酸、取代天然存在的氨基酸的氨基酸衍生物的側(cè)鏈上，或連接在與靶糖基化位點(diǎn)上的氨基酸側(cè)鏈連接的碳水化合物或其他成分上。適合上述目的的聚合物是生物相容性的，就是說它們對生物學(xué)系統(tǒng)來說是無毒的，并且其中很多種這樣的聚合物是已知的。所述聚合物在性質(zhì)上可以是疏水性的或親水性的，可生物降解的，不可生物降解的，或其組合。所述聚合物包括，但不限于天然聚合物，如膠原、明膠、纖維素、透明質(zhì)酸、多糖、和聚氨基酸，以及合成的聚合物，如聚酯、聚原酸酯、和聚酐等。疏水性不可生物降解的聚合物的例子包括聚二甲基硅氧烷，聚氨基甲酸酯，聚四氟乙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，和聚異丁烯酸甲酯。親水性不可生物降解的聚合物的例子包括聚(2-異丁烯酸羥基乙酯)，聚乙烯醇，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚亞烷基，聚丙烯酰胺，及其共聚物。優(yōu)選的聚合物包括具有以下結(jié)構(gòu)式的環(huán)氧乙烷的系列重復(fù)單位-(CH2-CH2-O-)n-，其中，n＝環(huán)氧乙烷單位的數(shù)量，優(yōu)選的含有環(huán)氧乙烷的聚合物的例子有聚乙二醇(PEG)，和聚酰胺環(huán)氧乙烷，如在下文和WO00/12587中所分別披露的。
例如，基于PEG的鏈?zhǔn)莾捎H性的，非免疫原性的，并且不易被蛋白水解酶裂解。由PEG或基于PEG的鏈修飾過的材料制劑具有較低的免疫原性和抗原性。例如，參見Abuchowski等，J.Biol.Chem.，1977，252，113578-3581；Tsutsumi等，Jpn.J.Cancer Res.，1994，859-12；聚乙二醇化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用，ACS Symposium Series680，J.M.Harris和S.Zalipsky，Eds.，American Chemical Society，1997；和聚乙二醇化學(xué)、生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，Topics in AppliedChemstry，J.M.Harris，Ed.，Plenum Press，New York，NY，1992)。PEG還可起到增加與它連接的材料的分子大小的作用，從而延長其生物學(xué)半衰期。PEG修飾過的材料的這種有利特征使得它非常適用于多種治療用途。因此，本發(fā)明還涉及改善本發(fā)明多肽的藥代動力學(xué)，包括在有可能使得該蛋白保留其內(nèi)在的生物學(xué)活性的位點(diǎn)上對所述多肽進(jìn)行修飾或“聚乙二醇化”。所述位點(diǎn)包括，但不限于所述多肽的C-末端。將PEG鏈或以PEG為基礎(chǔ)的鏈接枝到蛋白上的技術(shù)是已知的。例如，參見Zalipsky，US5122614，該專利披露了被轉(zhuǎn)化成它的N-琥珀酰亞胺碳酸酯衍生物的PEG。還已知用活性基團(tuán)對PEG鏈進(jìn)行修飾，以便有利于接枝到蛋白上。例如，參見Harris，US5739208，該專利披露了用一種砜成分激活的PEG衍生物，它用于選擇性地連接到分子和表面上的硫醇部分上，以及Harris等US5672662，該專利披露了具有單一的丙酸或丁酸部分的PEG酸的活性酯。Zalipsky對這方面作了廣泛的綜述，見Bioconjugate Chemistry，1995，6150-165。除了使用PEG之外，Wright在EP0605963A2中披露了含有水溶性聚合物的連接試劑，它能與蛋白上的醛基形成腙鍵。上面所述、提到的所有參考文獻(xiàn)都被收作本文參考。
B.本發(fā)明生物活性合成趨化因子的聚合物修飾本發(fā)明還涉及業(yè)已通過聚合物加合物修飾過的生物活性合成趨化因子，并且涉及其生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明特別涉及在其N-末端區(qū)具有一個(gè)或多個(gè)殘基改變的這樣的合成趨化因子。具有這樣的改變的修飾過的趨化因子通常是其相應(yīng)受體的強(qiáng)效拮抗劑。一般，迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的改變是疏水性質(zhì)的，例如，對每一種主要類型的趨化因子N-末端的甲硫氨酸(Met-)、氨基氧戊烷(AOP-)和壬?；?NNY-)修飾；效力的進(jìn)一步提高可以通過用氨基酸或疏水衍生物(例如，CC趨化因子，如Rantes，MCP，和MIP和CXC趨化因子，如SDF1和IL-8)取代N-末端區(qū)的野生型氨基酸進(jìn)一步提高效力(參見美國專利申請流水號60/217683，該專利以全文形式收作本文參考)。另外，向趨化因子的C-末端區(qū)導(dǎo)入疏水性修飾，能進(jìn)一步提高效力，這進(jìn)一步支持了N-和C-末端區(qū)的疏水性影響效力的觀點(diǎn)(參見美國專利申請流水號60/217683)。因此，連接水溶性聚合物預(yù)計(jì)一般能顯著降低甚至是破壞所述趨化因子的理想的拮抗活性，特別是下調(diào)所述聚合物修飾的趨化因子所結(jié)合的相應(yīng)受體，其前提是，所述下調(diào)可以通過增強(qiáng)特定趨化因子的N-和C-末端的疏水性而增強(qiáng)。Zalipsdy，S.(BioconjugateChemistry，1995，6150-165)，Mehvar，R.(J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，2000，3，1125-136)和Monfardini等(Bioconjugate Chem.，1998，9418-450)對各種水溶性聚合物，其與肽和蛋白的連接以及生物學(xué)作用進(jìn)行了綜述。
本發(fā)明的一個(gè)方面基于以下發(fā)現(xiàn)水溶性聚合物與生物活性合成趨化因子的連接不會像上述一般理論所預(yù)測的那樣影響其效力，相反，其效力和受體特異性可以根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)、所連接的聚合物的性質(zhì)以及要定向進(jìn)行聚合物修飾的前體趨化因子而進(jìn)行控制。本發(fā)明還基于以下發(fā)現(xiàn)通過系統(tǒng)地改善所希望的拮抗特性和循環(huán)半衰期之間的平衡，可以提高生物活性合成趨化因子的效力。這種優(yōu)化涉及三成分過程，當(dāng)這些成分被成功地組合在一起時(shí)能產(chǎn)生具有進(jìn)一步提高了的效力和循環(huán)半衰期的合成趨化因子。該方法通常適用于所有趨化因子，每一種成分同樣具有用于制備生物活性合成趨化因子的通用性，并且具有體外下調(diào)與合成趨化因子結(jié)合的相應(yīng)趨化因子受體的生物活性。在本文中，“下調(diào)趨化因子受體”表示導(dǎo)致一種趨化因子受體的正?；净钚缘臏p弱，其特征是在它與趨化因子或趨化因子類似物結(jié)合之后會表現(xiàn)出鈣信號傳遞、白血細(xì)胞趨化性和病毒感染中的一種或多種；可以包括從細(xì)胞表面清除受體的延長或增強(qiáng)。
第一種成分涉及用一種感興趣的水溶性聚合物對前體生物活性合成趨化因子的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行精確修飾，這種修飾保留了所述前體生物活性合成趨化因子的體外生物學(xué)活性。體外生物學(xué)活性是用于評估個(gè)各趨化因子功能的良好標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)測定，對于這種目的來說是眾所周知的(例如，參見Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，Acompendium of cytokines and other mediators of host defenseEds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001；和Cytokine Reference，Vol.2，Receptors，A compendium of cytokinesand other mediators of host defense Eds.J.J.Oppendheim andM.Feldmann，Acedemic Press，2001)。優(yōu)選的連接位點(diǎn)選自相當(dāng)于C-末端位點(diǎn)，聚集位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、和糖胺聚糖(GAG)結(jié)合位點(diǎn)的前體趨化因子的殘基。Kuschert等(Biochem.，1999，3812959-12968)、Koppman等(J.Immunol.，1999，1632120-2127)和Proudfoot等(J.Biol.Chem.，2001，276，1410620-10626)報(bào)導(dǎo)了GAG結(jié)合和趨化因子。
第二種成分涉及被連接的聚合物的性質(zhì)，它優(yōu)選具有結(jié)構(gòu)式U-B-Polymer-J，其中，U是連接在蛋白上的官能團(tuán)，B是具有三個(gè)或三個(gè)以上臂，并且可以存在或缺乏的支化核心，Polymer是基本上無抗原性的水溶性聚合物，其分子量等于或大于1000Da，而J是側(cè)基，它在生理學(xué)條件下具有選自負(fù)的、中性的或正的理想凈電荷。
針對本發(fā)明聚合物修飾的生物活性合成趨化因子的一種意外發(fā)現(xiàn)是，小到大約1000-1500Da的水溶性聚合物結(jié)構(gòu)就足于將所述前體趨化因子的血清循環(huán)半衰期提高大約10倍。另一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)是，小的線性聚合物結(jié)構(gòu)和更大的支化聚合物結(jié)構(gòu)在連接到相同位點(diǎn)上時(shí)，可能對效力和受體下調(diào)具有相似的作用。另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是，所述聚合物結(jié)構(gòu)上的側(cè)基J的性質(zhì)和數(shù)量，可能影響所述具有生物活性的合成的聚合物修飾的趨化因子的下調(diào)和受體特異性。
例如，使用具有多個(gè)可離子化側(cè)基J的支化聚合物結(jié)構(gòu)，能通過設(shè)計(jì)改變GAG和受體結(jié)合。舉例來說，類似于RANTES的合成趨化因子其中的支化聚合物具有帶負(fù)電荷的基團(tuán)(在生理學(xué)條件下)，偏向結(jié)合CCR5，CCR5具有呈中性的凈電表面，與CCR1相反，后者具有負(fù)的凈電表面。因此，具有包括多個(gè)帶負(fù)電荷的側(cè)基J的水溶性聚合物的聚合物修飾過的生物活性合成Rantes可以與具有凈的中性或凈的正電表面的受體優(yōu)先相互作用。類似地，由于GAGs通常具有凈的負(fù)電荷，可以對與它的相互作用進(jìn)行處理。當(dāng)然，如上文所述，可以利用所述聚合物的連接位點(diǎn)根據(jù)感興趣的生物活性合成聚合物修飾的趨化因子的特定最終用途微調(diào)受體元件和GAG結(jié)合。
第三種成分涉及制備具有最佳體外生物活性的聚合物修飾過的生物活性合成趨化因子，其特征是下調(diào)與它結(jié)合的趨化因子受體。其中包括選擇前體趨化因子(即選擇用于在它上面連接水溶性聚合物的天然或修飾過的趨化因子)，該前體趨化因子的效力比聚合物修飾的生物活性合成趨化因子的理想效力范圍高大約1-5倍，優(yōu)選大約5-10倍或更高(通過在基于體外細(xì)胞的相關(guān)測定中測定)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)所述前體趨化因子的選擇，能產(chǎn)生表現(xiàn)出效力和體內(nèi)血清循環(huán)半衰期之間的理想平衡的聚合物修飾過的生物活性合成趨化因子。術(shù)語“EC50”表示能引起位于劑量反應(yīng)(或濃度反應(yīng))曲線上的本底和最大反應(yīng)之間的一半的化合物濃度。例如，EC50可以作為效力指標(biāo)，其中，所測定的特定反應(yīng)的較小的EC50表示與具有較高EC50的化合物相比更有效的化合物。EC50通常又被稱作ED50或IC50，對于病毒感染來說，它是能抑制病毒產(chǎn)量的50％，病毒感染性的50％，或病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)的50％的有效濃度。
可以理解的是，提供了合成趨化因子，它可以來源于所述每一種成分(即聚合物結(jié)合位點(diǎn)、聚合物的性質(zhì)、和用于聚合物修飾的前體趨化因子的選擇)本身或組合。所述聚合物連接位點(diǎn)還可以重疊或者是相同，例如，聚集位點(diǎn)和GAG位點(diǎn)是相鄰的，或者位于相同的位點(diǎn)。另外，提供了在它上面結(jié)合了兩種或兩種以上聚合物的合成趨化因子。例如，本發(fā)明還包括生物活性合成趨化因子，它包括一個(gè)趨化因子多肽鏈，和連接在選自GAG位點(diǎn)的第一位點(diǎn)和選自聚合位點(diǎn)和C-末端位點(diǎn)的第二位點(diǎn)上的水溶性聚合物。本發(fā)明的這一方面使得人們特別是能夠提高分子量和水溶性(因此改善由水溶性聚合物所提供的循環(huán)半衰期和其他的特征)，同時(shí)消除了不理想的特征，如在聚合物連接位點(diǎn)上的聚集和特定類型的GAG結(jié)合。
1.聚合物連接位點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)選生物活性合成趨化因子可以通過用一種感興趣的水溶性聚合物在選自C-末端位點(diǎn)、聚集位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和GAG結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的殘基上對本發(fā)明的生物活性合成趨化因子蛋白進(jìn)行精確修飾制備而成。這些位點(diǎn)上的殘基可用于連接，只要它們具有適合聚合物連接的側(cè)鏈就行(即具有一種官能團(tuán)的氨基酸側(cè)鏈，例如，賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、脯氨酸等)。另外，上述位點(diǎn)上的殘基可以用具有適合聚合物連接的側(cè)鏈的不同氨基酸取代。另外，可以對所述遺傳編碼氨基酸的側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾，以便用于聚合物連接，或者可以使用具有合適側(cè)鏈官能團(tuán)的非天然氨基酸。連接的優(yōu)選方法采用肽合成和化學(xué)連接的組合。
本發(fā)明的所述生物活性合成趨化因子優(yōu)選是通過氨基酸殘基的縮合而合成的。所述氨基酸殘基可以是核酸編碼的，核糖體安裝的氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。在一種實(shí)施方案中，為本發(fā)明生物活性合成趨化因子的特定位點(diǎn)選擇的氨基酸序列可以是天然的，或者出現(xiàn)在所述蛋白序列的所述位置上的天然存在的氨基酸。在另一種實(shí)施方案中，所述選擇的氨基酸序列可以由這樣的多肽片段組成或由這樣的多肽片段構(gòu)建它可以含有一個(gè)代替位于存在于所述蛋白的天然序列上的氨基酸殘基的N-末端半胱氨酸殘基。由于包括所述殘基，使得能夠利用天然化學(xué)連接、肽合成和/或匯集合成的原理和方法，將所述多肽連接到另一種多肽上(修飾成含有一種羧基硫酯基團(tuán))(參見美國專利申請流水號60/231339，60/236377和09/097094，以上所有文獻(xiàn)被收作本文參考)，以上原理優(yōu)選被用于合成本發(fā)明的生物活性合成趨化因子。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成生物活性蛋白可以包括“不規(guī)則的”氨基酸殘基。在本文中，術(shù)語“不規(guī)則的氨基酸殘基”表示不是由RNA編碼的，并且不是由核糖體安裝的氨基酸。就此而言，本發(fā)明在設(shè)計(jì)和/或構(gòu)建合成的生物活性蛋白方面具有廣泛的可選擇性和靈活性。可用于本發(fā)明中的非核糖體安裝的氨基酸的例子包括D-氨基酸、β-氨基酸、假谷氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、高半胱氨酸、N-取代的氨基酸(R.Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992，899367-71；WO91/19735(Bartlett等)，US5646285(Baindur))，α-氨基亞甲基氧乙酸(氨基酸-Gly二肽等排物)，和α-氨基氧酸等?？梢允褂煤辛蝓０?、插烯酰胺、肼基、亞甲基氧、硫代亞甲基、亞磷酰胺、羥基酰胺、羥基亞乙基、還原的酰胺和取代的還原酰胺等排物和β-氨磺酰的肽類似物。
具體地講，使用假天然化學(xué)連接是有利的，因?yàn)镽鏈修飾可以將聚合物加合物連接到合成的蛋白上。同樣，可以使用N-末端Nα-取代的2或3碳鏈烷基或芳基硫醇氨基酸。根據(jù)本文所披露的延伸的天然化學(xué)連接的方法，可將所述殘基(其中存在于多肽的末端)優(yōu)選用于將所述多肽連接到具有羧基硫酯部分的多肽上。
肽合成優(yōu)選是基于在二十世紀(jì)六十年代早期開發(fā)的“Merrifield”-化學(xué)逐步固相肽合成方法，用標(biāo)準(zhǔn)自動化肽合成儀進(jìn)行的。肽連接步驟可以采用固相或液相連接方法?；瘜W(xué)連接涉及到在第一種化學(xué)成分和第二種化學(xué)成分之間形成選擇性的共價(jià)鍵。可以利用所述第一種和第二種成分上的獨(dú)特的、相互作用的官能團(tuán)使得所述連接反應(yīng)具有化學(xué)選擇性。例如，肽和多肽的化學(xué)連接包括相容的獨(dú)特的、相互作用的、C-末端和N-末端氨基酸殘基的肽或多肽片段的化學(xué)選擇反應(yīng)。
在一種實(shí)施方案中，所述合成生物活性蛋白的所有氨基酸殘基可以通過肽鍵(即酰胺鍵)連接在一起，或者通過非酰胺鍵(如硫酯鍵、肟鍵、硫醚鍵、定向二硫鍵、噻唑烷鍵、成腙連接、成噁唑烷連接等)。將兩個(gè)氨基酸殘基(或兩個(gè)肽的C-末端和N-末端)彼此連接在一起(Schnolzer，M.and Kent，S.B.H.，Science，1992，256221-225；Rose，K.J.Amer.Chem Soc.，1994，11630-33；Englebretsen，D.R.等，Tetrahedron Lett.368871-8874；Baca，M.等，J.Amer.Chem.Soc.，1995，1171881-1887；Liu，C.F.等，J.Amer.Chem.Soc.1994，1164149-4153；Liu，C.F.等，J.Amer.Chem.Soc.1996，118307-312；Dawson，P.E.等，1994，Science 266766-779；Gaertner等，Bioconj.Chem.1994，5，4333-338；Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.1998，95，169184-9189；Tam等，WO95/00846；US5589356)或采用其他方法(Yan，L.Z.和Dawson，P.E.，“通過天然化學(xué)連接與脫硫化組合合成沒有半胱氨酸殘基的肽和蛋白”，J.Amer.Chem.Soc.2001，123526-533，被收作本文參考；Gieselnan等，Org.Lett.2001，3，91331-1334；Saxon，E.等，“Traceless”Staudinger Ligation for theChemoselective Synthesis of Amide Bonds.Org.Lett.，2000，2，2141-2143)，因此，本發(fā)明可以對多種肽鍵修飾、取代和等排性替換，以便用于制備生物活性蛋白。
當(dāng)所述連接涉及到連接具有N-末端半胱氨酸殘基的多肽時(shí)，優(yōu)選使用天然化學(xué)連接方法(Dawson等，Science，1994，266776-779；Kent等，WO96/34878；Kent等，WO98/28434)。業(yè)已證實(shí)該方法是用于在連接位點(diǎn)產(chǎn)生天然酰胺鍵的可靠方法。天然化學(xué)連接涉及到具有C-末端α羧基硫酯部分的第一種肽或多肽片段和具有N-末端半胱氨酸殘基的第二種肽或多肽之間的化學(xué)選擇性反應(yīng)。硫醇交換反應(yīng)產(chǎn)生了一種最初的硫酯連接的中間產(chǎn)物，這種產(chǎn)物能自動重排，以便在連接位點(diǎn)形成天然酰胺鍵，同時(shí)重新產(chǎn)生半胱氨酸側(cè)鏈硫醇。在很多場合下，所述天然蛋白的序列包括適當(dāng)定位的半胱氨酸殘基，這樣就可以合成具有N-末端半胱氨酸殘基的多肽片段，并用于天然化學(xué)連接反應(yīng)。在其他場合下，可以進(jìn)行肽合成，以便為了上述目的而將半胱氨酸殘基導(dǎo)入一種多肽。
不過，當(dāng)為了在一種多肽的N-末端導(dǎo)入半胱氨酸殘基而對天然蛋白序列進(jìn)行修飾不方便或不理想時(shí)，可以用其N-末端業(yè)已被修飾成含有N-取代的，并且優(yōu)選N α-取代的2或3碳鏈氨基烷基或芳基硫醇的多肽對天然化學(xué)連接方法進(jìn)行延伸。所述“延伸的天然化學(xué)連接”披露于被收作本文參考的美國專利申請流水號60/231339和60/236377。
簡單地講，所述方法包括連接含有羧基硫酯，更優(yōu)選α-羧基硫酯的第一種成分和含有酸穩(wěn)定性N-取代的(優(yōu)選Nα-取代的2或3碳鏈氨基烷基或芳基硫醇)的第二種成分。第一種成分的羧基硫酯和第二種成分的N-取代的2或3碳鏈氨基烷基或芳基硫醇的硫醇之間的化學(xué)選擇性反應(yīng)通過一種硫酯連接的中間產(chǎn)物進(jìn)行，并且分解成最初的連接產(chǎn)物。更具體地講，發(fā)生在COSR硫酯成分和氨基烷基硫醇成分之間的硫醇交換產(chǎn)生了一種硫酯連接的中間連接產(chǎn)物，該產(chǎn)物隨后自動重排，根據(jù)氨基烷基硫醇成分是具有結(jié)構(gòu)式I或II通過五員環(huán)或六員環(huán)中間產(chǎn)物產(chǎn)生酰胺連接的第一種連接產(chǎn)物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 IJ1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II其中，J1是具有一個(gè)或多個(gè)任選被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽，或這種肽或多肽的部分，聚合物，染料，適當(dāng)官能化的表面，接頭或可檢測的標(biāo)記，或與化學(xué)肽合成或延伸的天然化學(xué)連接相容的任何其他化學(xué)成分；R1、R2和R3分別表示與C1連接的H或電子供給基團(tuán)；前提是，R1、R2和R3中的至少一種包括與C1連接的電子供給基團(tuán)；和J2是具有一個(gè)或多個(gè)選任被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽，或諸如肽或多肽的部分，聚合物，染料，適當(dāng)功能化的表面，接頭或可檢測的標(biāo)記，或與化學(xué)肽合成或延伸的天然化學(xué)連接相容的任何其他化學(xué)成分。
可以在肽相容條件下將連接位點(diǎn)上的N-取代的2或3碳鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]除去，而不破壞該產(chǎn)物，以便產(chǎn)生在連接位點(diǎn)具有天然酰胺鍵的具有結(jié)構(gòu)式III的最終連接產(chǎn)物J1-C(O)-HN-J2III其中，J1、J2、R1、R2和R3的定義如上文所述。
選擇R1、R2和R3基團(tuán)，以便有利于在肽相容裂解條件下裂解N-C1鍵。例如，電子供給基團(tuán)，特別是如果與C1連接時(shí)，可用于在C1上形成有利于裂解的共振穩(wěn)定化陽離子。所述化學(xué)連接反應(yīng)優(yōu)選包括作為賦形劑的硫醇催化劑，并且是在中性pH條件下在水或混合的有機(jī)-水條件下進(jìn)行的。第一種和第二種成分的化學(xué)連接可以通過五員環(huán)或六員環(huán)進(jìn)行，它能自動進(jìn)行重排，以便產(chǎn)生N-取代的酰胺連接的連接產(chǎn)物。其中，所述第一種和第二種成分是肽或多肽，N-取代的酰胺連接的連接產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)式IV或VJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IVJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2V其中，J1、J2和R1、R2、R3的定義如上文所述，而Z2是氨基酸側(cè)鏈或所述側(cè)鏈的衍生物。
N-取代的酰胺鍵連接產(chǎn)物的結(jié)合的電子供給基團(tuán)R1、R2或R3有利于裂解N-Cl鍵和從N-取代的酰胺連接的連接產(chǎn)物上除去2或3碳鏈烷基或芳基硫醇。在肽相容裂解條件下除去所述烷基或芳基硫醇鏈，產(chǎn)生在連接位點(diǎn)具有天然酰胺鍵的連接產(chǎn)物。當(dāng)所述第一種和第二種成分是肽或多肽時(shí)，連接產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)式J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 VI與C-末端位點(diǎn)連接的優(yōu)點(diǎn)是，它能降低與大部分趨化因子的已知功能區(qū)的最大間隔而導(dǎo)致的活性的潛在損失。連接具有一個(gè)或多個(gè)聚集位點(diǎn)的趨化因子的優(yōu)點(diǎn)是，所述水溶性聚合物能破壞聚集，同時(shí)又減少活性的潛在損失，并且改善處理/制劑化和體內(nèi)效力。連接糖基化位點(diǎn)具有模擬正常存在于所述位點(diǎn)的糖鏈的正面影響的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)通過在天然聚合物連接位點(diǎn)連接合成聚合物降低了活性的潛在損失。在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行聚合物修飾的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以使用包括一種可裂解的接頭的聚合物，以便以藥物前體形式提供合成的趨化因子，特別是當(dāng)糖基化位點(diǎn)位于或靠近N-末端藥效團(tuán)區(qū)時(shí)更是如此。與GAG結(jié)合位點(diǎn)連接的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以利用所述聚合物破壞該位點(diǎn)的GAG結(jié)合，并且在一些場合下破壞聚集，當(dāng)所述位點(diǎn)重疊時(shí)，同時(shí)又降低了活性的潛在損失，通過減弱與具有GAG部分的不希望的表面結(jié)合提高循環(huán)半衰期，以及改善處理/制劑化和體內(nèi)效力。另外，根據(jù)用于連接的水溶性，可以增強(qiáng)GAG結(jié)合，或增強(qiáng)特定類型的GAG的結(jié)合。當(dāng)然，根據(jù)用于修飾的靶趨化物，用于聚合物連接的位點(diǎn)可能比其他位點(diǎn)更優(yōu)選，例如，當(dāng)所有趨化因子都具有C-末端區(qū)和一個(gè)或多個(gè)GAG結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，并非所有的趨化因子都具有聚集位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)。
水溶性聚合物的連接是通過一種可生物降解的接頭進(jìn)行的，特別是位于蛋白的N-末端部分。所述修飾起著以前體(或藥物前體)形式提供蛋白的作用，這種前體在接頭降解之后，釋放出沒有聚合物修飾的蛋白。通過使用諸如酯鍵等可生物降解的鍵連接是眾所周知的，并且在下文作更詳細(xì)地說明。
a.C-末端位點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)選生物活性合成趨化因子具有連接在C-末端位點(diǎn)上的水溶性聚合物?！癈-末端位點(diǎn)”表示趨化因子多肽鏈的一個(gè)殘基，它在趨化因子的C-末端α螺旋的C-端。它包括具有游離的α-羧酸的C-末端側(cè)基，以及與它相鄰的殘基。所有趨化因子的突出的二級結(jié)構(gòu)特征是三鏈反平行β折疊，由它形成放置疏水性C-末端α螺旋的折疊平面。因此，C-末端α螺旋是趨化因子的便于識別的一致特征，識別方法為，例如，通過同源性模擬和比較識別，例如，通過比較已知趨化因子的一級序列和/或三維結(jié)構(gòu)，或通過分子取代和能量最低化程序推測的結(jié)構(gòu)(例如，參見Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，Acompendium of cytokines and other mediators of host defenseEds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。
優(yōu)選的C-末端位點(diǎn)是靠近聚合物修飾所針對的前體趨化因子的C-末端側(cè)基的位點(diǎn)。例如用于Rantes類似物的位點(diǎn)。野生型Rantes的C-末端殘基(1-68)是68號位置上的絲氨酸(即Ser68或S68)。水溶性聚合物與靠近諸如NNY-Rantes(2-68)的前體趨化因子的C-末端側(cè)基的殘基的連接包括67號位置上的甲硫氨酸(M67)，以及連接在相當(dāng)于M67和/或S68的殘基上的接頭部分。例如，添加用于將水溶性聚合物偶合在感興趣的趨化因子的C-末端的具有功能性側(cè)鏈的接頭或間隔成分，降低了對位于或靠近該位點(diǎn)的原始C-末端基團(tuán)功能的潛在影響。例如，在Rantes的S68號位置上添加接頭，如二肽接頭Lys69-Leu70得到了Rantes((1-68)(K69-L70))，并且提供了用于將聚合物連接在接頭部分Lys69的側(cè)鏈上的ε氮上的功能性偶合基團(tuán)，以及在新產(chǎn)生的C-末端的具有游離的α羧酸的氨基酸。還可以在相當(dāng)于67號位置的殘基上添加間隔基團(tuán)或接頭(例如，用Lys67取代Met67，并且將接頭連接在ε側(cè)鏈氨基上)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)這兩種趨化因子都保留了生物活性，并且這種設(shè)計(jì)似乎普遍適用于其他趨化因子。例如，SDF-1α或SDF-1β的類似地修飾可以產(chǎn)生保留了所需生物活性的聚合物修飾過的SDF-1類似物。在另一種例子中，當(dāng)所述合成趨化因子是MCP-1或Eotaxin的類似物時(shí)，并且當(dāng)水溶性聚合物連接在鄰近C-末端的殘基上時(shí)，所述聚合物連接位點(diǎn)包括分別相當(dāng)于MCP-1的D68或Eotaxin的D66的氨基酸。在這里，位于C-末端位點(diǎn)的鄰近所述位點(diǎn)的殘基可用于聚合物連接，如MCP-1的K69或Eotaxin的K68。另外，添加接頭或間隔成分，能夠獲得在C-末端或靠近C-末端添加其他成分的更大的靈活性，如諸如脂類或多環(huán)之類的疏水性成分。因此，本發(fā)明的其他優(yōu)選的聚合物修飾的生物活性合成趨化因子包括通過接頭或間隔部分的側(cè)鏈連接在C-末端位點(diǎn)的水溶性聚合物。
b.聚集位點(diǎn)特別感興趣的是具有連接在一個(gè)或多個(gè)聚集位點(diǎn)上的水溶性聚合物的合成趨化因子?！熬奂稽c(diǎn)”表示會導(dǎo)致蛋白單體自我締合的殘基。大多數(shù)趨化因子具有形成同二聚體的潛力，其中很多能夠形成四聚體，并且某些形成甚至更大的多聚體(Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of hostdefense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。趨化因子聚集位點(diǎn)通常存在于能夠在高濃度下形成二聚體和多聚體復(fù)合物的趨化因子上(Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of host defense，Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。例如，諸如Rantes和MIP1β的趨化因子在高濃度下通過單體的自我締合能形成聚集體，而諸如IL-8，SDF1α和vMIP的趨化因子不具有任何顯著程度的這種傾向。聚集位點(diǎn)可以通過多種已知方法鑒定，如同源性模擬，丙氨酸掃描，和在溶液中在不斷增加的濃度下比較活性化合物，用本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)監(jiān)測聚集、自我締合(例如，參見Czaplewski等，J.Biol.Chem.，1999，274，2316077-16084；Czaplewski等，“hMIP-1α的工程、生物學(xué)和臨床開發(fā)”，1999，參見Chemokines in DiseaseBiology and Clinical Research，Ed.C.A.Herbert，Humana Press Inc.，Totwa，NJ.；Trkola等，J.Virol.，1999，73，86370-6379；Appay等，J.Virol.，1999，274，3927505-25512；Hunter等，Blood，1995，86，124400-4408；Lord等，Blood，1995，85，123412-3415；Lord等，Brit.J.Cancer.，1996，741017-1022)。正如上文所指出的，很多趨化因子的聚集位點(diǎn)是已知的，并且用于鑒定推測的聚集位點(diǎn)的技術(shù)是眾所周知的(同樣可以參見Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of hostdefense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。因此，可以通過公開的信息、同源性模擬、通過篩選、或每一種技術(shù)的組合鑒定趨化因子的聚集位點(diǎn)。因此，本文所提供的例子是用于說明本發(fā)明的，而不是用于限定本發(fā)明的。
舉例來說，業(yè)已通過各種技術(shù)鑒定了多種趨化因子中的聚集位點(diǎn)，如上文所披露的技術(shù)。例如，野生型Rantes具有至少兩個(gè)參與聚集的殘基位于26號和66號位置上的谷氨酸殘基(即Glu26和Glu66；或E26和E66)。因此，當(dāng)合成的趨化因子是Rantes的類似物時(shí)，并且當(dāng)水溶性聚合物連接在聚集位點(diǎn)上時(shí)，所述聚集位點(diǎn)可以包括相當(dāng)于Rantes的選自E26和E66的殘基的氨基酸。例如，我們業(yè)已連接了鄰近Rantes的E66的水溶性聚合物，即位于相當(dāng)于甲硫氨酸67的位置上(即Met67或M67)。這種聚合物修飾破壞了聚集，并且改善了總體上的處理特性，這可能是因?yàn)橛善茐南噜彽墓劝彼釟埢木奂匦缘木酆衔镌斐傻拇蟮氖杷鈿ぁＲ虼?，對于本發(fā)明來說，Rantes上的聚集位點(diǎn)不僅相當(dāng)于E26和E66，而且相當(dāng)于鄰近它的氨基酸。因此，Rantes上的聚集位點(diǎn)包括相當(dāng)于Rantes的選自E26和E66的殘基的氨基酸，包括M67。
作為另一個(gè)例子，當(dāng)合成趨化因子是MIP1α的類似物，并且水溶性聚合物是連接在它的聚集位點(diǎn)時(shí)，所述聚集位點(diǎn)包括相當(dāng)于MIP1α的選自D26和E66的殘基的氨基酸。類似地，當(dāng)合成趨化因子是MIP1β的類似物，并且水溶性聚合物是連接在它的聚集位點(diǎn)時(shí)，所述聚集位點(diǎn)包括相當(dāng)于MIP1β的選自D27和E67的殘基的氨基酸。在另一種例子中，當(dāng)合成趨化因子是MCP1或Eoxtaxin的類似物，并且水溶性聚合物是連接在它的聚集位點(diǎn)時(shí)，所述聚集位點(diǎn)包括分別相當(dāng)于MCP-1的殘基P8和D68或Eoxtaxin的D66的氨基酸。在這里，鄰近所述位點(diǎn)的殘基同樣可用于聚合物連接，以便破壞聚集，如MCP-1的K69或Eoxtaxin的K68，因此，體現(xiàn)在本發(fā)明的生物活性合成趨化因子上的是在其聚集位點(diǎn)連接有水溶性聚合物，可以理解的是，聚集位點(diǎn)可以方便地識別，并且是聚合物修飾的優(yōu)選位點(diǎn)，并且可選擇用于通過篩選所需生物活性的方法進(jìn)行優(yōu)先連接。
在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將水溶性聚合物連接在位于感興趣的趨化因子的C-末端區(qū)的聚集位點(diǎn)。聚合物連接的一個(gè)更優(yōu)選的聚合位點(diǎn)在趨化因子的C-末端α螺旋的C端，如Rantes的E66和M67，MIP1α的E66，MIP1β的E67，MCP-1的D68或Eotaxin的D66。因此，本發(fā)明的優(yōu)選生物活性合成趨化因子包括具有連接在C-末端聚集位點(diǎn)的水溶性聚合物的趨化因子，所述聚集位點(diǎn)在該趨化因子的C-末端α螺旋的C端。本發(fā)明這一方面的最優(yōu)選的生物活性合成趨化因子是具有連接在C-末端聚集位點(diǎn)的水溶性聚合物的趨化因子，所述聚集位點(diǎn)在它的C-末端α螺旋的C端，并且該位點(diǎn)鄰近前體趨化因子的C-末端側(cè)基。
c.糖基化位點(diǎn)在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了具有連接在糖基化位點(diǎn)上的水溶性聚合物的本發(fā)明的生物活性合成趨化因子?！疤腔稽c(diǎn)”表示編碼碳水化合物(寡聚糖)鏈的酶促連接的殘基，如N-連接的和O-連接的糖基化位點(diǎn)。更優(yōu)選的糖基化位點(diǎn)是出現(xiàn)在趨化因子的C-末端區(qū)的糖基化位點(diǎn)。最優(yōu)選N-連接的糖基化位點(diǎn)。所述糖基化位點(diǎn)可以是天然位點(diǎn)或者是通過工程方法導(dǎo)入靶蛋白的位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^對糖及其連接位點(diǎn)存在的分析檢測、同源性比較，或者通過掃描基因和蛋白數(shù)據(jù)庫中的共有序列和/或結(jié)構(gòu)可以確定野生型分子上的糖基化位點(diǎn)。通過工程方法在靶蛋白上制造一個(gè)糖基化位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)是，可以鑒定用于聚合物連接的其他優(yōu)選位點(diǎn)，只要所述工程產(chǎn)生的位點(diǎn)不破壞感興趣的生物活性就行。
具體地講，通過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成的大部分蛋白含有碳水化合物(寡糖)的短鏈，并且被稱為糖蛋白(例如，參見Vanden Steen等，Critical Rev.Biochem.Mol.Biol.，1998，33，3151-208)。并且已知很多趨化因子是糖基化的，或者含有N-連接和/或O-連接的糖基化共有位點(diǎn)。實(shí)際上，很多天然產(chǎn)生的趨化因子是高度糖基化的。這使得趨化因子的糖基化位點(diǎn)對于聚合物修飾具有特別的作用。例如，糖蛋白決定蛋白的很多重要特征(例如，pI，分子大小，溶解度，穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)和靜電表面電荷)和真核細(xì)胞表面的很多重要特征(例如，細(xì)胞-細(xì)胞識別和粘附，抗“磨損和撕裂”的細(xì)胞表面電荷保護(hù)，血型特異性抗原，病毒，細(xì)菌和原生動物受體，移植(組織相容性)抗原，離子通道和很多其他特征)。水溶性聚合物在所述位點(diǎn)的連接可用于模擬有利的特征(例如，pI，大小，溶解度，穩(wěn)定性，減弱的抗原性，延長了的循環(huán)半衰期)，同時(shí)消除了其他特征(例如，異質(zhì)性，糖介導(dǎo)的清除和不希望的粘附)，以便產(chǎn)生具有改善了的特性的藥物化合物。
另外，將水溶性聚合物連接在一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)上，通常能減弱對生物活性的影響，并有可能提高其生物活性，因?yàn)檫x擇了用于連接大的水溶性聚合物的所述位點(diǎn)的性質(zhì)。將糖蛋白的碳水化合物部分(通常占總重量的50％或更高)共價(jià)連接在多肽上，因?yàn)楣烟莻?cè)鏈通常含有4-15個(gè)糖。在同一個(gè)多肽上可能存在若干個(gè)側(cè)鏈，并且這些側(cè)鏈可以是支化的。并且，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)，糖基化位點(diǎn)是適合聚合物連接的位點(diǎn)的良好指標(biāo)，特別適合連接具有較高分子量的支化水溶性聚合物，這種聚合物具有能模擬通過糖基化連接的寡糖鏈的凈電荷作用的帶電側(cè)基。
在鑒定糖基化位點(diǎn)時(shí)，糖蛋白的寡糖有兩種主要類型O-連接的和N-連接的。O-連接的寡糖通常通過與絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈的羥基之間的O-糖苷鍵連接于蛋白。N-連接的寡糖通常通過與天冬酰胺側(cè)鏈的氨基之間的O-糖苷鍵連接于蛋白，其中在天冬酰胺存在的序列中X是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸。
如上文所述，N-糖基化碳水化合物鏈結(jié)合在多肽上的Asn-X-Ser/Thr序列的Asn殘基上(X是除了Pro以外的任何氨基酸)。不過，很多蛋白都含有未糖基化Asn-X-Ser/Thr序列，并且該序列的存在并非總是導(dǎo)致在它上面添加碳水化合物鏈。不過，可以方便地檢測N-糖基化的存在或缺乏(Biller，M.等，J.Virol.Methods，1998，Dec；76，1-287-100；Taverna，M.等，J.Biotechnol.，1999，F(xiàn)eb，5；68，137-48；Friedman，Y.等，Anal Biochem，1995，Jul1；228，2221-5)。另一方面，將O-糖基化碳水化合物鏈連接在多肽上的Ser或Thr殘基上，但是與N-糖基化不同，對于糖基化所要求的氨基酸序列沒有限制。不過，已知當(dāng)Pro出現(xiàn)在附近，例如，出現(xiàn)在序列Pro-Thr/Ser、Thr/Ser-Pro和Thr/Ser-X1-3-Pro上時(shí)，糖基化的傾向增強(qiáng)(X是任何氨基酸)(Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，842021)。在這里，同樣可以方便地檢測O-連接的糖基化。
已知很多趨化因子是糖基化的，或者含有推測的糖基化位點(diǎn)(例如，參見Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium ofcytokines and other mediators of host defense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。因此趨化因子的糖基化位點(diǎn)可以從公開的信息中確定。對于推測的位點(diǎn)來說，證實(shí)N-和/或O-連接的糖基化位點(diǎn)的優(yōu)選方法是通過同源性比較(例如，使用適合這一目的的數(shù)據(jù)庫和模式匹配系統(tǒng)，例如，參見Xiang，Y.等，Virology，1999，Mayl0；257，2297-302；Hoops，T.C.等，J.Biol.Chem.，1991，Mar5；266，74257-63；Apweiler，R.等，Biochim Biophys Acta1999，Dec6；1473，14-8)，然后在酵母或哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中檢測前體趨化因子，并且進(jìn)行分析測定，以便鑒定糖的含量和連接位點(diǎn)。另外，通過同源性比較鑒定的推測位點(diǎn)，可以用感興趣的水溶性聚合物修飾，然后通過適合這一目的的標(biāo)準(zhǔn)方法在相關(guān)的體外生物測定中簡單地篩選感興趣的生物活性(例如，鈣流量，趨化性和/或?qū)Σ《救肭值囊种谱饔?。
舉例來說，同源性模擬鑒定了位于Rantes上的5號絲氨酸位置(即Ser5或S5)的推測的O-連接的糖基化位點(diǎn)，這一結(jié)論得到了其他研究的支持(Kameyoshi等，J.Exp.Med.1992，176，2587-592)，這些文獻(xiàn)證實(shí)糖基化形式具有2-10nM的趨化活性。對于作為拮抗劑的諸如NNY-Rantes類似物的Rantes類似物來說，將Rantes的5號位置上的絲氨酸換成諸如Glu或Lys的帶電荷的、可溶性基團(tuán)部分會減弱其效力，而導(dǎo)入諸如t-丁基丙氨酸(tBuA)的氨基酸部分能保留效力，所述效力是在病毒感染/融合的基于細(xì)胞的測定中測定的。因此，對于Rantes拮抗劑來說，將水溶性聚合物連接在相當(dāng)于野生型Rantes的S5號位置上的位點(diǎn)上，優(yōu)選是通過可生物降解的接頭完成，例如，連接在絲氨酸或類似基團(tuán)的側(cè)鏈羥基上的酯鍵，它能提供基本上為藥物前體形式的Rantes拮抗劑化合物。在體內(nèi)系統(tǒng)中降解并且從水溶性聚合物中釋放出Rantes類似物，然后產(chǎn)生活性形式。通過諸如酯鏈的可生物降解的鍵進(jìn)行的連接是眾所周知的，并且在下文作更詳細(xì)說明。
業(yè)已在諸如MIP-1α和MIP-1β的其他趨化因子上發(fā)現(xiàn)了類似情形，這兩種趨化因子具有一個(gè)或兩個(gè)潛在的O-連接的糖基化位點(diǎn)。例如，MIP-1α具有推測的糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)包括相當(dāng)于T7殘基的氨基酸，而對于MIP-1β來說，推測的糖基化位點(diǎn)包括相當(dāng)于S5殘基的氨基酸。這兩種例子與Rantes的類似之處在于，O-連接的糖基化位點(diǎn)是推測的，因此，對于MIP的拮抗劑類似物來說，優(yōu)選的連接是通過可生物降解的鍵實(shí)現(xiàn)的，以便能在體內(nèi)釋放出聚合物之后形成活性形式。
很多其他的趨化因子具有糖基化位點(diǎn)，并且可以是合成的，以及用本發(fā)明的一種或多種水溶性聚合物修飾。因此，本文所提供的例子是用于說明本發(fā)明的，不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限定。例如，lyphotactin是包括8個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn)的由93個(gè)殘基的趨化因子。該化合物是使用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-化學(xué)方法通過天然化學(xué)連接合成的，在每一個(gè)糖基化位點(diǎn)上摻入一個(gè)GalNAc殘基(Marcaurelle等，Chemistry，2001，7，51129-1132)。在諸如MCP-1的其他趨化因子中，糖基化位點(diǎn)包括相當(dāng)于MCP-1的T71殘基的氨基酸。盡管規(guī)范的N-糖基化序列出現(xiàn)在MCP-1的N14號位置上，但沒有可檢測的N-連接的糖。相反，將少量的唾液酸化的O-連接的碳水化合物添加到所述蛋白的C-末端(Zhang等，J.Biol.Chem.，1994，269“15918-15924)，推測的位點(diǎn)是T71。業(yè)已報(bào)導(dǎo)該糖基化形式在體外單細(xì)胞趨化性測定中的效力只比非糖基化的MCP-1低2-3倍(Proost等，J.Immunology，1998，1604034-4041)。另一種糖基化的趨化因子是HCC-1，它是迄今為止已知的唯一能以納摩爾的濃度在人體血漿中循環(huán)的CC-趨化因子(Richter等，Biochemistry，2000，39，3510799-10805)。HCC-1能以各種加工過的形式存在，74個(gè)氨基酸的全長形式具有位于7號位置(Ser7)上的O-糖基化，兩個(gè)N-乙酰神經(jīng)氨酸和二糖N-乙酰半乳糖胺半乳糖。
在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將水溶性聚合物連接在位于感興趣的趨化因子的C-末端區(qū)的糖基化位點(diǎn)上。用于聚合物連接的最優(yōu)選的糖基化位點(diǎn)是在趨化因子的C-末端α螺旋的C端的位點(diǎn)。例如，當(dāng)合成趨化因子是MCP-1時(shí)，優(yōu)選將水溶性聚合物連接在相當(dāng)于野生型MCP-1的T71殘基位置上的糖基化位點(diǎn)上。因此本發(fā)明的優(yōu)選生物活性合成趨化因子包括具有結(jié)合在C-末端糖基化位點(diǎn)上的水溶性聚合物的趨化因子，所述糖基化位點(diǎn)是在趨化因子的C-末端α螺旋的C端的位點(diǎn)。
d.GAG結(jié)合位點(diǎn)在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了具有連接在GAG結(jié)合位點(diǎn)上的水溶性聚合物的生物活性合成趨化因子?！癎AG結(jié)合位點(diǎn)”表示GAG結(jié)合的殘基；通常是具有伯胺或仲胺的殘基，如賴氨酸和精氨酸，并且有時(shí)候是組氨酸，它們能在蛋白表面形成正電荷團(tuán)。已知能結(jié)合GAGs的趨化因子包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素，這些物質(zhì)天然存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面上和胞外基質(zhì)中(例如，參見Wells等，Inflamm.Res.，1999，483353-3362，Lalani等，J.Virol.，1997，714356-4363；Rot，A.，Eur J Immunol.，1993，23303-306；Witt等，Curr Biol，1994，4394-400；Hoogewerf等，Biochem，1997，3613570-13578；Marquezini等，Cardiology，1995，86143-146；Wasty等，Diabetologia，1993，36316-322)。Kuschert等(Biochem.，1999，3812959-12968)，Koppman等(J.Immunol.，1999，1632120-2127)和Proudfoot等(J.Biol.Chem.，2001，276，1410620-10626)報(bào)導(dǎo)了GAG結(jié)合和趨化因子。
趨化因子的GAG結(jié)合能力盡管不是功能所必需的，但是業(yè)已報(bào)導(dǎo)這種結(jié)合能調(diào)節(jié)受體相互作用和具有受體的細(xì)胞在基質(zhì)蛋白和細(xì)胞表面上的haptotactic遷移(例如，參見Rot，A.，Eur J Immunol.，1993，23303-306；Witt等，Curr Biol，1994，4394-400；Hoogewerf等，Biochem，1997，3613570-13578；Marquezini等，Cardiology，1995，86143-146；Wasty等，Diabetologia，1993，36316-322；Kuschert等，Methods Enzymol.，1997，287369-387；Kuschert等，Biochem.，1998，3711193-11201；Kuschert等，Biochem.，1999，3812959-12968)。在大多數(shù)場合下，趨化因子與可溶性GAGs的結(jié)合抑制了趨化因子與其受體的結(jié)合(Kuschert等，Biochem.，1999，3812959-12968)。不過，業(yè)已報(bào)導(dǎo)了在少數(shù)情況下趨化因子與GAGs的相互作用能加強(qiáng)活性(Wbb等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，907158-7162；和Wagner等，Arteriosclerosis，1989，921-32)。因此，在其GAG結(jié)合位點(diǎn)上連接了水溶性聚合物的合成趨化因子可用于調(diào)節(jié)生物學(xué)功能?？梢愿鶕?jù)被選擇用于連接的位點(diǎn)及其預(yù)期的最終用途通過減弱GAG結(jié)合或偏向某些GAGs的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案涉及在GAG結(jié)合位點(diǎn)上連接了水溶性聚合物，并且具有下調(diào)與它結(jié)合的趨化因子受體的體外生物學(xué)活性的生物活性合成趨化因子。
如上文所述，所有已知的趨化因子都能結(jié)合肝素，不過具有不同的親和力，因此所有趨化因子都具有GAG結(jié)合位點(diǎn)。在選擇用于聚合物修飾的GAG位點(diǎn)時(shí)，有多種不同的技術(shù)適用于這一目的。例如，BBXB和BBBXXB基序，其中，B表示堿性殘基，業(yè)已證實(shí)它們是包括若干種趨化因子在內(nèi)的若干種蛋白的共同的肝素結(jié)合基序(例如，參見Cardin等，Arteriosclerosis，1989，921-32；Hileman等，Bioessays，1998，20，2156-167；和Proudfoot等，J.Biol.Chem.，2001，176，1410620-10626)。不過，GAG結(jié)合位點(diǎn)不局限于BBXB或BBBXXB基序。例如，Rantes(44RKNR47和55KKWVR59)、SDF-1(24KHLK27)、MIP-1α(45KRSR48)、和MIP-1β(45KRSK48)上的GAG結(jié)合位點(diǎn)具有BBXB基序，而IL-8(Lys20、Lys64和Arg68)和MIP-1(Lys59和Arg66)上的主要GAG結(jié)合殘基在空間上是分離的，但是在蛋白表面上形成了堿性電荷團(tuán)。因此，所述配體的堿性電荷導(dǎo)致了其肝素結(jié)合特性。
還可以通過堿性殘基(例如，Lys，His和Arg)的丙氨酸掃描鑒定GAG位點(diǎn)，NMR和GAG/肝素結(jié)合測定中的活性化合物比較，以及NMR研究適用于這一目的(Proudfoot等，J.Biol.Chem.，2001，176，1410620-10626；Trkola等，J.Virol.，1999，73，86370-6379；Appay等，J.Biol.Chem.，1999，274，3927505-27512；Hunter等，Blood，1995，86，124400-4408；Lord等，Blood，1995，85，123412-3415；Lord等，Brit.J.Cancer，1996，741017-1022)。正如上文所指出過的，很多趨化因子的GAG結(jié)合位點(diǎn)是已知的，并且鑒定推測的GAG位點(diǎn)的技術(shù)也是眾所周知的(還可參見Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokines and other mediators of hostdefense Eds.J.J.Oppendheim and M.Feldmann，Acedemic Press，2001)。因此，可以通過公開的信息、同源性模擬、通過篩選或上述各種方法的組合鑒定趨化因子的GAG結(jié)合位點(diǎn)。另外，由于參與GAG結(jié)合的殘基的至少一個(gè)側(cè)鏈位于分子的表面上，并且遠(yuǎn)離N-末端藥效團(tuán)部分，所述位點(diǎn)通常適合連接水溶性聚合物。
舉例來說，野生型Rantes具有至少兩個(gè)主要GAG結(jié)合位點(diǎn)，它包括相當(dāng)于Rantes的選自Lys44、Lys45、Arg47、Lys55、Lys56和Arg59(即K44、K45、R47、K55、K56和R59)的殘基的氨基酸。因此，當(dāng)所述合成趨化因子是Rantes的類似物，并且水溶性聚合物連接在它的GAG結(jié)合位點(diǎn)上時(shí)，所述GAG結(jié)合位點(diǎn)包括相當(dāng)于Rantes的選自K44、K45、R47、K55、K56和R59的殘基的氨基酸。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，水溶性聚合物連接在相當(dāng)于Rantes的選自K44、K45、R47的殘基的位點(diǎn)，以K45號位點(diǎn)為更優(yōu)選。在本實(shí)施方案中，連接在45號位置上的聚合物具有減弱所述合成的Rantes趨化因子類似物與CCR1受體結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)基本上保留了與CCR5的結(jié)合。
作為另一個(gè)例子，當(dāng)合成的趨化因子是MIP1α的類似物，并且水溶性聚合物連接在它的GAG結(jié)合位點(diǎn)上時(shí)，所述GAG結(jié)合位點(diǎn)包括相當(dāng)于MIP1α的選自R17、R45和R47的殘基的氨基酸。類似地，當(dāng)合成的趨化因子是MIP1β的類似物，并且水溶性聚合物連接在它的GAG結(jié)合位點(diǎn)上時(shí)，所述結(jié)合位點(diǎn)可以包括相當(dāng)于MIP1β的選自R18、R45和R46號位置的殘基的氨基酸。在這兩種例子中，聚合物連接的優(yōu)選位點(diǎn)是MIP1α的R45和MIP1β的R46。對Rantes來說，將上述修飾設(shè)計(jì)成使所述趨化因子類似物的結(jié)合偏向CCR5。
在另一種例子中，當(dāng)合成趨化因子是SDF1α的類似物，并且水溶性聚合物連接在GAG結(jié)合位點(diǎn)上時(shí)，所述GAG結(jié)合位點(diǎn)包括相當(dāng)于SDF1α的殘基K24、H25和K27的氨基酸。在這里，靠近所述位點(diǎn)的殘基同樣可用于聚合物連接，以便獲得基本上相同的結(jié)果，如N22或N30或N33，特別是N33，并因此體現(xiàn)在GAG結(jié)合位點(diǎn)上連接有水溶性聚合物的本發(fā)明的生物活性合成趨化因子上。
在另一種例子中，當(dāng)所述合成趨化因子是IL-8的類似物，并且水溶性聚合物連接在GAG結(jié)合位點(diǎn)上時(shí)，所述GAG結(jié)合位點(diǎn)包括相當(dāng)于IL-8的選自K20、R60、K64、K67和R68的殘基的氨基酸。IL-8的合成類似物的優(yōu)選的聚合物連接位點(diǎn)相當(dāng)于它的K64位置。另一個(gè)例子是MCP-1，因此當(dāng)所述合成趨化因子是MCP-1的類似物，并且水溶性聚合物連接在它的GAG位點(diǎn)上時(shí)，所述GAG位點(diǎn)包括相當(dāng)于MCP-1的選自K58和H66的殘基的氨基酸，優(yōu)選K58。
可以理解的是，GAG結(jié)合位點(diǎn)是便于識別的并且是聚合物修飾的優(yōu)選位點(diǎn)，并且可以通過常規(guī)篩選需要的生物活性選擇優(yōu)勢的連接。適用于這一目的的生物測定方法是眾所周知，并且在文獻(xiàn)中有大量報(bào)導(dǎo)(Cytokine Reference，Vol.1，Ligands，A compendium of cytokinesand other mediators of host defense Eds.J.J.Oppendheim andM.Feldmann，Acedemic Press，2001)。
2.水溶性聚合物將要連接在本發(fā)明的生物活性合成趨化因子上的本發(fā)明的聚合物修飾優(yōu)選是水溶性聚合物。在本文中，術(shù)語“水溶性聚合物”表示可溶于水的基本上無抗原性的聚合物結(jié)構(gòu)。生物學(xué)溶性聚合物的例子包括，但不限于(a)葡聚糖，硫酸葡聚糖，羧甲基糊精；(b)糖胺聚糖，如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素；(c)透明質(zhì)素和透明質(zhì)酸；(d)聚交酯和寡聚丙烯酸乳酰酯；(e)纖維素、甲基纖維素和羧甲基纖維素；(f)膠原；(g)明膠；(f)藻酸；和(i)淀粉。
本發(fā)明的水溶性聚合物可以是直鏈的、支化的或星形的，或所述構(gòu)形的混合形式，并且可以具有很大范圍的分子量，和聚合物亞基。所述亞基可以包括生物學(xué)聚合物、合成聚合物或其組合。
所述生物學(xué)水溶性聚合物的很多衍生物是已知的，并且可用于本發(fā)明中。合成水溶性聚合物的例子包括，但不限于(a)含有聚環(huán)氧烷、聚環(huán)氧乙烷、亞乙基/馬來酐共聚物及其衍生物的聚合物，包括它的均聚物和共聚物，如聚乙二醇，一甲氧基聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，乙二醇與丙二醇的共聚物及其衍生物，其中，所述均聚物或共聚物是未取代的，或者在一端用烷基基團(tuán)取代；(b)聚乙烯醇和聚乙烯乙醚；(c)聚乙烯吡咯烷酮；(d)聚氧乙烯化多元醇，包括pluronic多元醇；(e)聚酯，如聚(乙醇酸)；聚(L-乳酸)；聚(D-乳酸)；聚(DL-乳酸)；交酯/乙交酯共聚物；聚-1，3，6-三噁烷；聚-1，3-二噁烷；聚(對二噁烷)和共聚物；聚己內(nèi)酯；PEG-聚酯共聚物；聚(磷酸酯)；(f)聚(原酸酯)；(g)聚酐；(h)假-聚(氨基酸)(均聚物或無規(guī)共聚物)；(i)聚甘油；(j)葡聚糖，和羧甲基纖維素等。
上述水溶性聚合物是眾所周知的，并且業(yè)已用于多種連接化學(xué)、鍵體系和結(jié)構(gòu)，如用于連接肽、多肽和其他化合物的生物穩(wěn)定的，可生物降解的以及藥物前體結(jié)構(gòu)(例如，參見國際專利申請WO90/13540，WO92/00748，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28937，WO95/11924，WO96/00080，WO96/23794，WO98/07713，WO98/41562，WO98/48837，WO99/30727，WO99/32134，WO99/33483，WO99/53951，WO01/26692，WO95/13312，WO96/21469，WO97/03106，WO99/45964，和美國專利Nos.4,179,337；5；075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966).有關(guān)合適的聚合物的其他信息披露于以下文獻(xiàn)中Turnbull，W.B.et al.(Calbiochem(2000)，Towardthe Synthesis of Large Oligosaccharide-Based Dendrimers，”170-74)，vanDuijvenbode，R.C.et al.(Macromolecules(2000)“Synthesis and ProtonationBehavior of Carboxylate-Functionalized Poly(propyleneimine)Dendrimers，”3346-52)，Marcaurelle，L.A.(“Recent Advances in the Synthesis of Mucin-TypeGlycoproteins，”http//www.chem.unt.edu/acs/pdf/marcaur.pdf)，Domenek，S.(“TheHuman Genome ProjectChallenge for Society and Chemistry，”http//www.orgc.tugraz.at/orgc/hoegroup/chem ges/domenek.PDF)，Imperiali，B.etal.(“Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure，”Current Opinion in Chemical Biology 1999，3643-649)，Rudd，P.M.et al.(“Glycosylation and the Immune System，”Science(2000)2912370-2376)，Van denSteen，P.et al.(“Concepts and Principles of O-Linked Glycosylation，”CriticalReviews in Biochemistry and Molecular Biology，33(3)151-208(1998))，Knischka，R.et al.(“Star-Shaped Polymers Based On Polyglycerol CoresSynthesis，Characterization And Crosslinking，”http//www-ics.u-strasbg.fr/～equipe3/Poster4.pdf)，Rudd，P.M.et al.(“Roles for Glycosylation of CellSurface Receptors Involved in Cellular Immune Recognition，J.Mol.Biol.(1999)293，351-366)，and Davis，B.G.(“Recent developments in glycoconjugates，”J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1 1999，(22)，3215-3237).
本發(fā)明的水溶性聚合物優(yōu)選具有超過10000Da的有效流體動力學(xué)分子量，更優(yōu)選大約20000-500000Da，最優(yōu)選大約40000-300000Da?！坝行Я黧w動力學(xué)分子量”表示通過水基大小排阻層析(SEC)測定的聚合物鏈的有效水溶劑化大小。當(dāng)所述水溶性聚合物包括具有環(huán)氧乙烷重復(fù)單元的聚合物鏈時(shí)，優(yōu)選每一個(gè)鏈具有大約200-大約80000Da的原子分子量，優(yōu)選大約1500-大約42000Da，最優(yōu)選2000-大約20000Da。除非專門說明，分子量表示原子分子量。
所述水溶性聚合物可以包括生物穩(wěn)定的或可生物降解的聚合物鏈。例如，具有重復(fù)鍵的聚合物，這些聚合物在生理學(xué)條件下根據(jù)鍵的不穩(wěn)定性具有不同程度的穩(wěn)定性。具有所述鍵的聚合物可以根據(jù)低分子量類似物的已知水解速度通過在生物學(xué)條件下的相對水解速度進(jìn)行分類，例如，從較不穩(wěn)定到較穩(wěn)定的排列順序?yàn)榫厶妓狨?-O-C(O)-O-)＞聚酯(-C(O)-O-)＞聚氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)＞聚原酸酯(O-C((OR)(R’))-O-)＞聚酰胺(-C(O)-NH-)。類似地，將水溶性聚合物連接在靶分子上的鍵體系可以是生物穩(wěn)定的或可生物降解的，例如，從較不穩(wěn)定到較穩(wěn)定的順序?yàn)樘妓狨?-O-C(O)-O-)＞酯(-C(O)-O-)＞氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)＞原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞酰胺(-C(O)-NH-)。所述鍵是以舉例形式提供的，而不是要限定可用于本發(fā)明水溶性聚合物的聚合物鏈或鍵體系中的鍵的類型。如上文所述，可以通過改變與它連接的水溶性聚合物的性質(zhì)修飾本發(fā)明合成蛋白的生物活性。
用于這一目的的優(yōu)選水溶性聚合物具有以下結(jié)構(gòu)式U-B-Polymer-J其中，U是能夠被靶分子連接或連接在靶分子上的官能團(tuán)的殘基，B是具有三個(gè)或三個(gè)以上臂的分支核心，并且可以存在或缺乏。Polymer是分子量等于或大于1000Da的基本上無抗原性的水溶性聚合物，而J是在生理學(xué)條件下具有選自負(fù)的、中性或正的凈電荷的側(cè)基。所述聚合物包括披露于被以全文形式收作本文參考的美國專利申請流水號60/236377中的聚合物。
可以用一個(gè)或多個(gè)間隔或接頭部分將成分U、B、Polymer和J與水溶性聚合物的其他基團(tuán)隔開，因此，水溶性聚合物U-B-Polymer-J可以用以下結(jié)構(gòu)式表示U-s1-B-s2-Polymer-s3-J其中，S1、S2和S3是間隔部分或接頭部分，它們可以相同或不同，并且可以單獨(dú)存在或者是缺乏。優(yōu)選的間隔基或接頭包括直鏈或支化部分，包括用于水溶性聚合物中的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)單元，二氨基和或二酸單元，天然或非天然氨基酸或其衍生物，以及脂族部分，包括烷基、芳基、雜烷基，雜芳基，和烷氧基等，它們優(yōu)選含有多達(dá)18個(gè)碳原子或者甚至包括額外的聚合物鏈。
如上文所述，成分U是一個(gè)官能團(tuán)的殘基，它能夠被靶分子連接或者與諸如肽或多肽的靶分子連接。當(dāng)U是用于與靶分子結(jié)合的官能團(tuán)的殘基時(shí)，U包括一個(gè)親核基團(tuán)或親電子基團(tuán)，而所述靶分子分別包括相互起反應(yīng)的親電子基團(tuán)或親核基團(tuán)。
上述聚合物可用于生產(chǎn)包括以下結(jié)構(gòu)式的水溶性聚合物修飾的蛋白蛋白-W，其中，W是具有以下結(jié)構(gòu)式的水溶性聚合物基團(tuán)-s0-U-s1-B-s2-Polymer-s3-J；其中，U是與蛋白直接連接或通過s0連接的官能團(tuán)的殘基，而B是具有三個(gè)或三個(gè)以上臂的支化核，并且可以存在或缺乏，Polymer是分子量等于或大于1000Da的基本上無抗原性的水溶性聚合物，J是在生理學(xué)條件下具有選自負(fù)的、中性的或正的凈電荷的側(cè)基，而s0、s1、s2和s3是間隔或接頭部分，它們可以相同或不同，并且可以單獨(dú)存在或缺乏。
上述很多相互起反應(yīng)的官能團(tuán)是已知的，并且可以連接在肽和多肽所共有的側(cè)鏈官能團(tuán)上，或衍生的側(cè)鏈官能團(tuán)上(Zalipsky等，Bioconjugate Chemistry，1995，6150-165；“Perspectives inBioconjugate Chemistry”，C.F.，Meares，Ed.，ACS，1993；“Chemistryof protein conjugation and cross-linking”，S.S.Wong，Ed.，CRC Press，Inc.，1993)。官能團(tuán)的例子包括能夠與氨基起反應(yīng)的基團(tuán)，如(a)碳酸酯，如對硝基苯基，或琥珀酰亞胺基；(b)羰基咪唑；(c)二氫唑酮；(d)環(huán)酰亞胺硫酮；和(e)異氰酸酯或異硫氰酸酯。能夠與羧酸基團(tuán)和活性羰基基團(tuán)起反應(yīng)的官能團(tuán)的例子包括(a)伯胺；或(b)肼和酰肼官能團(tuán)，如乙酰肼、肼基甲酸酯，氨基甲酸酯，硫代肼基甲酸酯，氨基氧等。能夠與巰基或硫氫基起反應(yīng)的官能團(tuán)包括苯基乙二醛，馬來酰亞胺和鹵基。能夠與諸如羧酸的羥基基團(tuán)起反應(yīng)的官能團(tuán)或能夠與親電子的中心起反應(yīng)的其他親核基團(tuán)的例子包括羥基、氨基、羧基、硫醇基、和活性亞甲基等。
例如，可以制備水溶性聚合物，該聚合物具有作為用于結(jié)合靶分子的官能團(tuán)的成分U，其中，所述官能團(tuán)是丙烯酸酯、醛、酮、氨基氧基、胺、羧酸、酯、硫酯、鹵、硫醇、氰基乙酸酯，二棕櫚酰磷酯酰乙醇胺，二硬脂酰磷酯酰乙醇胺，環(huán)氧化物，酰肼，疊氮，異氰酸酯，馬來酰亞胺，甲基丙烯酸酯，硝基苯基碳酸酯，原吡啶基二硫化物，硅烷，硫氫基，乙烯基砜，琥珀酰亞胺基戊二酸酯，琥珀酰琥珀酸酯，琥珀酸，和tresylate等。U還能夠以可激活的形式提供，例如，能夠轉(zhuǎn)化成它的活性酯的羧酸，它能夠與諸如胺的親核基團(tuán)起反應(yīng)。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，U是一種特殊官能團(tuán)的殘基，它能與靶分子上的獨(dú)特官能團(tuán)選擇性地起反應(yīng)。本發(fā)明的這一方面體現(xiàn)了肽合成(保護(hù)基團(tuán)方法)和化學(xué)連接(部分或無保護(hù)基團(tuán)方法)的原理。對于保護(hù)基團(tuán)方法來說，除了U及其相互反應(yīng)的官能團(tuán)之外，存在于所述靶分子上的所有潛在反應(yīng)性官能團(tuán)都被合適的保護(hù)基團(tuán)封閉。有很多保護(hù)基團(tuán)是已知的，并且適用于這一目的(例如，參見“Protectinggroups in organic synthesis”，3rdedition，T.W.Greene andP.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley&Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog2000；“Synthetic peptides，a user’s guide”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman&Company，New York，NY，1992；“Advanced chemtechhandbook of combinatorial&solid phase organic chemistry”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.SaneII，Eds.，Advanced chemtech，1998；“principles of peptide synthesis，2nded.”，M.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1993；“the practice of peptidesynthesis，2nded.”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and“Protecting groups”，P.J.Kocienski，Ed.Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
因此，U可以表示多種官能團(tuán)的殘基，如上文所披露的官能團(tuán)。對于部分或不保護(hù)基團(tuán)方法來說，存在于靶分子上的U及其相互反應(yīng)的官能團(tuán)采用了一種化學(xué)選擇性反應(yīng)對，其中，其他官能團(tuán)可存在于該反應(yīng)系統(tǒng)中，但不起反應(yīng)。其中包括適用于胺捕獲方法(例如，通過半氨基形成，通過亞胺形成和通過Michael加合)，硫醇捕獲方法(例如，通過硫醇鹽形成、或二硫化物交換)，天然化學(xué)連接方法(例如，通過涉及到含有半胱氨酸或硫醇的側(cè)鏈氨基酸衍生物的硫酯交換)，和正交連接偶合方法(例如，通過噻唑烷形成、硫酯交換、硫酯形成、二硫化物交換以及通過酰胺形成)的U基團(tuán)(例如，參見Coltart，DM.，Tetrahedron，2000，563449-3491)。
優(yōu)選的U包括用于水相容性連接化學(xué)方法中的獨(dú)特官能團(tuán)的殘基，如天然化學(xué)連接(Dawson等，Scienee，1994，266776-779；Kent等，WO96/34878)，延伸的一般化學(xué)連接(Kent等，WO98/28434)，成肟化學(xué)連接(Rose等，J.Amer.Chem.Soc.，1994，11630-33)，成硫酯連接(Schnolzer等，Science，1996，256221-225)，成硫醚連接(Englebretsen等，Tet.Letts.，1995，36，488871-8874)，成腙連接(Gaertner等，Bioconj.Chem.，1994，5，4333-338)，和成噻唑烷連接和成噁唑烷連接(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，169184-9189；Tam等，WO95/00846)或通過其他方法(Yan，L.Z.和Dawson，P.E.，“Synthesisof peptides and proteins without cysteine residues by nativechemical ligation combined with desulfurization”，J.Amer.Chem.Soc.，2001，123，526-533，被收作本文參考；Gieselnan等，Org.Lett.2001，3，91331-1334；Saxon，E.等，“Traceless”Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of AmideBonds.Org.Lett.，2000，2，2141-243)。
對于上述各種連接化學(xué)方法來說，顯而易見的是，當(dāng)U是與靶分子結(jié)合的官能團(tuán)的殘基時(shí)，U可以包括選自碳酸酯、酯、氨基甲酸乙酯、原酸酯、酰胺、胺、肟、二酰亞胺、脲、硫脲、硫醚、硫氨基甲酸乙酯、硫酯、醚、噻唑烷、腙、和噁唑烷等的鍵的殘基。優(yōu)選的鍵是肟和酰胺鍵。
如上文所述，B是具有三個(gè)或三個(gè)以上臂的支化核心部分，并且可以存在或不存在。當(dāng)存在B時(shí)，有一個(gè)臂與U或者與U連接的間隔基或接頭連接，并且每一個(gè)其他的臂與聚合物或者與聚合物連接的間隔基或接頭連接。支化核心B的例子包括，但不限于氨基、酰胺、羧酸及其組合。其中包括賴氨酸和/或精氨酸的寡聚酰胺或其組合，或由鏈烷二胺和丙烯酸制備的寡聚體(聚酰胺型胺類)，后者提供了支化核心上的凈正電荷(例如，參見Zeng等，J.Pept.Sci.，1996，266-72；Rose等，Bioconjugate Chem.，1996，7，5552-556；NovoBichemcatalog and peptide synthesis handbook，Laufelfingen，2001，Wells等，Biopolymers，1998，47381-396；Mahajan等，1999，404909-49-12；Judson等，1998，391299-1302；Swali等，1997，624902-4903；US9532462，5919455，5643575，5681507)。由很多其他不同的支化核心可以使用，并且適用于這一目的，包括取代的二胺、取代的二酸，烷基酸，如甘油和其他具有三個(gè)或三個(gè)以上官能團(tuán)或可激活的基團(tuán)的其他部分，包括多價(jià)烷基、芳基、雜烷基、雜芳基和烷氧基部分等，以及寡糖(例如，Nierengarten等，TetrahedronLett.，1999，405681-5684；Matthews等，Prog.Polym.Sci.，1998，1-56；Suner等，Macromolecules，2000，33253；Fischer等，Angew.Chem.Iht.Ed.，1999，38884；Sunder等，Adv.Mater.，2000，12235；Mulders等，Tetrahedron Lett.，1997，38631-634；Mulders等，Tetrahedron Lett.，1997，3830-3088；和Turnbull等，Chembiocehm，2000，1，170-74。
優(yōu)選的支化核心是氨基、羧基，和混合的氨基酸和羧酸。另外，優(yōu)選的支化聚合物結(jié)構(gòu)是這樣的聚合物結(jié)構(gòu)，其中的分支來自單一的支化核心，如寡聚酰胺或聚酰胺核心。不過，可以采用其他類型的支化結(jié)構(gòu)，如蠕蟲樣結(jié)構(gòu)，其中，所述分支來自沿著聚合物主鏈分布的多個(gè)支化核心的序列(Schluter等，Chem.Int.Ed.，2000，39864)。根據(jù)聚合物主鏈的化學(xué)組成和/或體積以及重復(fù)單位，可以將所得到的蠕蟲樣結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)成水溶性的或容易誘導(dǎo)液晶組構(gòu)(Quali等，Macromolecules，2000，336185)，它又有利于輸送用途，作用的穩(wěn)定性和持久性。對于本發(fā)明的其他支化聚合物結(jié)構(gòu)來說，將所述蠕蟲樣結(jié)構(gòu)制備成含有一個(gè)包括U的功能側(cè)基。
結(jié)構(gòu)式U-B-Ploymer-J的水溶性聚合物的Ploymer包括上文所披露的水溶性聚合物，優(yōu)選的聚合物成分選自(a)含有聚環(huán)氧烷、聚環(huán)氧乙烷、亞乙基/馬來酐共聚物及其衍生物的聚合物，包括它的均聚物和共聚物，如聚乙二醇，一甲氧基聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，乙二醇與丙二醇的共聚物及其衍生物，其中，所述均聚物或共聚物是未取代過的，或者在一端用烷基基團(tuán)取代；(b)聚乙烯醇和聚乙烯乙醚；(c)聚乙烯吡咯烷酮；(d)聚氧乙烯化多元醇，包括pluronic多元醇；(e)聚酯，如聚(乙醇酸)；聚(L-乳酸)；聚(D-乳酸)；聚(DL-乳酸)；交酯/乙交酯共聚物；聚-1，3，6-三噁烷；聚-1，3-二噁烷；聚(對二噁烷)和共聚物；聚己內(nèi)酯；PEG-聚酯共聚物；聚(磷酸酯)；(f)聚(原酸酯)；(g)聚酐；(h)假-聚(氨基酸)(均聚物或無規(guī)共聚物)；和(i)聚甘油。其中優(yōu)選的聚合物包括聚環(huán)氧烷，特別是包括結(jié)構(gòu)式為(-CH2-CH2-O-)n或(O-CH2-CH2-)n的聚環(huán)氧乙烷的聚合物及其衍生物，其中，n是2或更大，包括它的均聚物或共聚物(例如，參見“聚(乙二醇)化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用”J.M.Harris Ed.，Plenum Press，New York，NY，1992；和“聚乙二醇化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用”，J.M.Harris和S.Zalipsky，Eds.，ACS，1997)。
更優(yōu)選的聚合物成分是這樣的聚合物，其中的水溶性聚合物U-B-Ploymer-J是通過逐步合成一起生產(chǎn)的。這意味著所述聚合物具有精確的分子量和確定的結(jié)構(gòu)，相反，正常的聚合物合成是一種聚合過程，會產(chǎn)生具有不同長度的鏈的混合物，并因此存在分子量和分子大小的分布，如果不能分離的話，這種分布是困難的?？刂品肿蛹兌鹊哪芰κ怯欣?，其優(yōu)點(diǎn)在于可以構(gòu)建在它上面結(jié)合有水溶性聚合物的合成蛋白，并且該蛋白是單一分布的。由此所產(chǎn)生的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是，可以避免雜合的混合物所產(chǎn)生的可變特征，并且能夠制備并比較容易地分離具有最優(yōu)選的特征的化合物。
最優(yōu)選的聚合物成分包括披露于WO00/12587中的結(jié)構(gòu)式為-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中，n是從1-100的正的整數(shù)，更優(yōu)選2-100，并且，其中的X和Y是具有通過諸如酰胺鍵的方式連接的精確結(jié)構(gòu)的生物相容性重復(fù)元件。X和Y可以是二價(jià)基團(tuán)等。X和Y可以相同或不同，并且可以是支化的或直鏈的。在高度優(yōu)選的例子中，X和Y中的至少一個(gè)包括水溶性聚合物重復(fù)單位。
X，Y的優(yōu)選水溶性重復(fù)單位包括聚環(huán)氧烷、聚環(huán)氧乙烷及其衍生物，包括它的均聚物和共聚物，其中，所述均聚物和共聚物可以是未取代的或取代的，直鏈的或支化的，并且可以包括烷基、芳基、芳烷基等在內(nèi)的側(cè)基，聚氧乙烯化的多元醇，包括pluronic多元醇，和C1-C18脂族側(cè)基?？梢岳斫獾氖?，微小的改變包括結(jié)構(gòu)式為-[C(O)-X-NHC(O)-Y-NH]n-或-[NH-Y-C(O)-NH-X-C(O)]n的聚酰胺。X’和Y’是X和Y的亞實(shí)施方案，其中，X＝X’-NH或NH-X’，而Y＝Y(jié)’-NH或NH-Y’。X’、Y’的更優(yōu)選的水溶性重復(fù)單位包括聚環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)(CH2-CH-O)n或(O-CH2-CH2-)n，其中，n是2-50，3-25，3-10，更優(yōu)選3-5。
正如上文所指出的，成分J可以是在生理學(xué)條件下具有選自中性、正的或負(fù)的凈電荷的任何基團(tuán)。其中包括烷基、芳基、芳烷基、?；⒑汪驶鶊F(tuán)。這些基團(tuán)是取代的或未取代的，及其鹽。所述基團(tuán)可以是氨基酸、核酸、脂肪酸、碳水化合物及其衍生物的一種成分，以及諸如殼多糖、脫乙酰殼多糖、肝素、磷酸乙酰肝素、軟骨素、硫酸軟骨素、皮膚素和硫酸皮膚素、環(huán)糊精、葡聚糖、透明質(zhì)酸、磷脂、和唾液酸等。J優(yōu)選包括可離子化的部分，選自羧基、氨基、硫醇、羥基、磷酰基、胍基、咪唑及其鹽。最優(yōu)選的J包括可離子化的羧化物部分，并且在生理學(xué)條件下具有凈的負(fù)電荷。
根據(jù)本發(fā)明，解決聚合物不均勻性、多樣性和不適用性的優(yōu)選方案包括生產(chǎn)新型生物相容性聚合物，該聚合物綜合了多肽(精確的長度、便于合成)和糖基化模擬基團(tuán)(糖模擬基團(tuán)，一種不容易受蛋白酶影響的柔性的、兩性的、非免疫原性的聚合物)的優(yōu)點(diǎn)，Rose，K.等(美國專利申請流水號09/379297，被收作本文參考)。
在優(yōu)選聚合物-[C(O)-X-NHC-(O)-Y-NH]n-或-[NH-Y-C(O)-NH-X-C(O)]n的優(yōu)選實(shí)施方案中，X和Y可以是缺乏活性官能團(tuán)的二價(jià)有機(jī)基團(tuán)，或者不存在，并且可以相同或不同，可以根據(jù)每一個(gè)重復(fù)單元(n)獨(dú)立改變。當(dāng)n＝2時(shí)，X或Y中的至少一個(gè)優(yōu)選選自取代的、未取代的、支化的或直鏈脂族基團(tuán)和芳族基團(tuán)。更優(yōu)選的是，所述二價(jià)有機(jī)基團(tuán)可以選自苯基、C1-C10亞烷基部分，C1-C10烷基基團(tuán)，含有雜原子的苯基、含有雜原子的C1-C10亞烷基部分，含有雜原子的C1-C10烷基基團(tuán)及其組合。
特別優(yōu)選的糖模擬部分可以用以下結(jié)構(gòu)式表示-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-其中，n優(yōu)選為1-100，更優(yōu)選為2-100；或者-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-其中，n優(yōu)選為1-50，更優(yōu)選為2-50。一種特別優(yōu)選的糖模擬基團(tuán)的n＝12，X是-(CH2)2-，而Y是-(CH2)3O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-。
本發(fā)明的糖模擬部分可以用多種方法中的任一種合成。不過，所述部分優(yōu)選通過各單元的逐步固相鏈組裝生產(chǎn)，而不是通過聚合方法生產(chǎn)。所述組裝方法的應(yīng)用使得一種制劑的組成部分具有確定的和均勻的結(jié)構(gòu)，如其長度，其X和Y取代基的性質(zhì)，分支點(diǎn)的位置(如果有的話)，以及長度，X和Y取代基，任何分支的位置。所述部分優(yōu)選是通過以下步驟合成的(a)用摩爾過量的結(jié)構(gòu)式為HOOC-X-COOH的二酸的衍生物對結(jié)構(gòu)式為Z-Q-支持物的化合物的氨基或羧基進(jìn)行?；?，其中Z是H2N-或HO-；Q是接頭或靶分子；而所述支持物是固相基質(zhì)或表面；(b)激活步驟(a)產(chǎn)物的游離羧基；(c)用摩爾過量的具有結(jié)構(gòu)式NH2-Y-NH2的二胺對步驟(b)的產(chǎn)物進(jìn)行氨基分解；和(d)任選用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重復(fù)步驟(a)-(c)，其中，X和Y是二價(jià)有機(jī)基團(tuán)或者不存在，并且是相同的或不同的，并且可以根據(jù)所述任選的重復(fù)單元而獨(dú)立改變，并且與用于前面的?；桶被纸獠襟E中的X和Y取代基相同或不同。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，采用了上述重復(fù)單元的6聚體、12聚體、18聚體和32聚體。如果需要的話，所述重復(fù)單元可以與賴氨酸的氨基基團(tuán)組合使用，以便形成分支的糖模擬結(jié)構(gòu)。所述糖模擬基團(tuán)可以通過多種化學(xué)方法連接在本發(fā)明的合成蛋白上，包括硫醚、肟和酰胺鍵形成。
在一種實(shí)施方案中，各單元的逐步固相鏈組裝包括步驟1將保護(hù)的或未保護(hù)的二酸連接在樹脂上的氨基上，以便在連接位點(diǎn)產(chǎn)生酰胺鍵(其中，PG是保護(hù)基團(tuán)，它根據(jù)所采用的二酸而存在或不存在)PG-OOC-X-COOH+NH2-Y-NH-樹脂步驟2除去樹脂上的保護(hù)基團(tuán)(PG，如果存在的話)HOOC-X-CO-NH-Y-NH-樹脂步驟3將保護(hù)的或未保護(hù)的二氨基連接在樹脂上的羧基上，以便在連接位點(diǎn)上產(chǎn)生酰胺鍵(其中，PG根據(jù)使用的二氨基而存在或不存在)PG-NH-Y-NH+HOOC-X-CO-NH-Y-NH樹脂步驟4除去樹脂上的保護(hù)基團(tuán)(PG，如果存在的話)-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-樹脂步驟5重復(fù)步驟1-4‘n’次，以便添加‘n’個(gè)單元，然后從樹脂上裂解-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-3.本發(fā)明的水溶性聚合物的合成本發(fā)明的水溶性聚合物可以通過多種方法中的任一種合成。圖1A-1E表示連接方法，包括在連接之前或之后或其組合將水溶性聚合物(U-B-Ploymer-J*，如本文所定義的)連接到部分或完全未保護(hù)的肽片段( )上。在圖1A-1D中，Yaa表示位于第一種肽片段上的C-末端氨基酸，它具有獨(dú)特的化學(xué)選擇部分(例如，具有α羧基硫酯的氨基酸)，用于與第二種肽片段連接，第二種肽片段具有獨(dú)特的和相互反應(yīng)的N-末端氨基酸Xaa(例如，氨基末端半胱氨酸)部分，該部分能夠與Yaa發(fā)生化學(xué)選擇性化學(xué)連接。Xaa和Yaa之間的化學(xué)選擇性反應(yīng)在它們之間產(chǎn)生了共價(jià)鍵(例如，酰胺鍵)。因此，Yaa和Xaa形成了化學(xué)選擇性連接的配對。在所述附圖中，Un-表示第二種獨(dú)特的化學(xué)選擇性部分，該部分業(yè)已摻入所述氨基酸側(cè)鏈上的確切用戶限定位點(diǎn)上，并且能選擇性地與水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的基團(tuán)U-相互起反應(yīng)。例如，當(dāng)Un是業(yè)已被修飾成具有酮基的側(cè)鏈時(shí)，水溶性聚合物U-Polymer-J*的U-是與酮起反應(yīng)的化學(xué)選擇性基團(tuán)，例如，能在它們之間產(chǎn)生肟鍵的氨基氧基團(tuán)。Un中的角標(biāo)n是氨基酸的數(shù)量，其側(cè)鏈被設(shè)計(jì)成具有化學(xué)選擇基團(tuán)U，例如，當(dāng)兩個(gè)特定的和用戶限定的位點(diǎn)要進(jìn)行聚合物修飾時(shí)，n＝2，它還可以表示成U2或Un＝2。在所有場合下，n是通過設(shè)計(jì)精確控制的正整數(shù)。因此Un和U表示第二種化學(xué)選擇連接配對，它們是相容的，并且不會與Xaa和Yaa的化學(xué)選擇基團(tuán)起反應(yīng)。圖1A和1B表示兩種不同的潛在反應(yīng)。在所示出的第一種反應(yīng)中，將具有Un官能性的多肽鏈連接到第二種多肽上，然后與U-B-Polymer-J*部分起反應(yīng)，以便獲得聚合物修飾的多肽。在所示出的第二種反應(yīng)中，讓具有Un官能性的多肽與U-B-Polymer-J*部分起反應(yīng)，以便獲得聚合物修飾的多肽，然后連接到第二種多肽上，以便獲得較大的聚合物修飾的多肽。以上附圖的差別在于，在圖1A中，具有Xaa殘基的多肽用于接受聚合物修飾，而在圖1B中，具有Yaa殘基的多肽用于接受聚合物修飾。圖1A表示本發(fā)明修飾多種多肽鏈的能力，這種修飾是在連接之前或之后進(jìn)行，以便形成更大的多肽。在圖1D中，PG和PG’表示保護(hù)基團(tuán)，其中PG’表示正交的保護(hù)基團(tuán)，即PG和PG’可以在不同的條件下去掉，并且可用于通過相同的化學(xué)作用將不同的水溶性聚合物連接到Un基團(tuán)上，或者可用于當(dāng)Un表示不希望用聚合物進(jìn)行修飾的側(cè)鏈官能團(tuán)(例如，具有反應(yīng)性-NH2或-SH的側(cè)鏈，其中，水溶性聚合物的U基團(tuán)被設(shè)計(jì)成只能與伯胺基或側(cè)鏈硫醇起反應(yīng))的情況下。圖1D表示可以利用保護(hù)基團(tuán)，以便保護(hù)按照本發(fā)明方法連接的多肽的需要的側(cè)鏈。
圖1E表示用于按照圖1A-1D的方法進(jìn)行連接和聚合物修飾的多肽片段上的可以存在或不存在的基團(tuán)的多樣性。
圖2A-2C表示用于制備本發(fā)明的合成生物活性蛋白的其他方法的示意圖。具體地講，圖2A-2B表示連接示意圖，包括將水溶性聚合物U-B-Polymer-J*連接到氨基末端基團(tuán)Xaa側(cè)鏈的連接位點(diǎn)上(例如，半胱氨酸的側(cè)鏈硫醇)。圖2C表示在圖2A-2B中的連接和聚合物修飾中使用的肽片段上的可以存在或不存在的基團(tuán)的多樣性。
圖3A-3B表示用于實(shí)現(xiàn)多片段連接的其他方法的示意圖，該方法包括三個(gè)或三個(gè)以上非重疊肽片段的化學(xué)連接，即，至少有一個(gè)片段是相當(dāng)于最終的全長連接產(chǎn)物的中間片段。用這種方法制備的肽可用于制備參與另一種連接反應(yīng)的肽片段，例如，在圖1A-1E、圖2A-2C和圖4A-4C中所示出的。一般，對多片段連接來說，中間片段具有受保護(hù)的Xaa基團(tuán)或受保護(hù)的Yaa基團(tuán)，以便避免所述肽根據(jù)所采用的連接化學(xué)作用產(chǎn)生環(huán)化或多聯(lián)體。為了進(jìn)行順序或系列連接，對中間片段的Xaa基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)(例如，Cys(Acm))，而Yaa基團(tuán)不進(jìn)行保護(hù)(例如，Yaa-COSR，其中，-COSR是α-羧基硫酯)。在這里，Yaa基團(tuán)是游離的，能夠與具有未保護(hù)的Xaa基團(tuán)的第二種肽起反應(yīng)，其中，第二種肽缺乏游離的Yaa基團(tuán)。在連接之后，將保護(hù)基團(tuán)除去，以便再生Xaa基團(tuán)，用于隨后的連接反應(yīng)。該過程可以根據(jù)需要持續(xù)進(jìn)行，因此產(chǎn)生了延長的多肽鏈。Yaa基團(tuán)的保護(hù)對于匯集化學(xué)連接來說是特別有用的，這種連接涉及到由四種或四種以上片段組成的最終連接產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，對于由四個(gè)片段連接產(chǎn)生的蛋白目的物來說(即三次連接反應(yīng))，相當(dāng)于所述蛋白的一個(gè)末端的兩個(gè)片段和相當(dāng)于所述蛋白的另一末端的兩個(gè)片段可以平行連接，這一點(diǎn)與順序連接相反，并且在最終的連接反應(yīng)中連接兩個(gè)末端。在美國專利申請流水號60/231339中披露了將所述匯集化學(xué)連接方法用于硫酯介導(dǎo)的化學(xué)連接反應(yīng)(例如，天然的和延伸的天然化學(xué)連接)，該專利被收作本文參考。在這里，在圖1E、2C和4C中同樣示出了可以在所述肽片段上存在或缺乏的基團(tuán)的多樣性。
圖4A-4C表示如何按照本發(fā)明的原理完成所得到的側(cè)鏈硫醇的天然化學(xué)連接和化學(xué)修飾，具體地講，圖4A-4B表示利用在所得到的半胱氨酸側(cè)鏈硫醇的連接位點(diǎn)上進(jìn)行天然化學(xué)連接和化學(xué)修飾以便通過硫代烷基化形成“假氨基酸”(用 Xaa表示)，并產(chǎn)生包括硫醚鍵的化學(xué)修飾的側(cè)鏈(用 表示)。在沒有示出的另一種實(shí)施方案中，可以通過脫硫化反應(yīng)將所述側(cè)鏈硫醇轉(zhuǎn)化成丙氨酸(Liang等，J.Amer.Chem.Soc.，2001，123，4526-533)。這兩種反應(yīng)的一個(gè)重要方面是，用合適的保護(hù)基團(tuán)(PG)對不希望轉(zhuǎn)化或修飾的任何其他側(cè)鏈硫醇進(jìn)行保護(hù)，或進(jìn)行多片段連接以及正交保護(hù)基團(tuán)(PG’)，其中，具有羧基末端Yaa基團(tuán)的片段包括一個(gè)受保護(hù)的氨基末端Xaa基團(tuán)，即PG-Xaa肽，在圖4B中以舉例形式提供。圖4C表示在圖4A-4B、以及圖1A-1E、圖2A-2C、和圖3A-3B的連接和聚合物修飾中使用的肽片段上的可以存在或不存在的基團(tuán)的多樣性。
圖5A-5B表示用于制備本發(fā)明的水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的支化核心(B)和獨(dú)特的化學(xué)選擇性官能團(tuán)(U)的固相方法。該方法可以在溶液中進(jìn)行，不過業(yè)已證實(shí)固相方法是優(yōu)選的。具體地講，圖5A表示具有反應(yīng)性基團(tuán)( )的正交保護(hù)的U-B前體部分，而所述結(jié)構(gòu)的基本幾何結(jié)構(gòu)用點(diǎn)表示，所述點(diǎn)通過鍵( )連接；這種基本幾何結(jié)構(gòu)并不是要限定所采用的化學(xué)鍵或基團(tuán)的類型，而僅僅是說明用于構(gòu)建結(jié)構(gòu)的相對幾何點(diǎn)，以及適用于產(chǎn)生本發(fā)明的U-B部分的化學(xué)修飾點(diǎn)。將正交保護(hù)的U-B前體偶合到含有合適的可裂解接頭和共同活性基團(tuán)( )的聚合物支持物/樹脂上，在激活之后，它能夠與U-B前體共價(jià)連接
該系統(tǒng)采用了聚合物支持的有機(jī)化學(xué)原理。在偶合之后，按所示方法對支化核心進(jìn)行修飾(僅僅示出了第一個(gè)分支點(diǎn)，不過可能存在或不存在其他的分化點(diǎn))，以便產(chǎn)生適用于隨后連接需要的聚合物成分的支化核心，所述聚合物成分如基本上無抗原性的、水溶性直鏈聚合物。還示出了U基團(tuán)，它可以作為正交保護(hù)的U-B前體的一部分在合成開始時(shí)提供，或者在修飾支化核心B期間或之后修飾。盡管聚合物成分的連接可以在樹脂上完成，即在裂解之前進(jìn)行，一種優(yōu)選方法是從聚合物支持物/樹脂上裂解U-B部分，以便產(chǎn)生能夠純化的U-B核心，該核心隨后連接所述聚合物成分。正如所說明的，構(gòu)建核心基團(tuán)B的側(cè)面分支點(diǎn)，以便包括一個(gè)官能團(tuán)(Func)，它們可以是相同的或不同的，并且可以進(jìn)行可恢復(fù)的保護(hù)(PG，PG’或PG”)或不進(jìn)行保護(hù)。在每一種情況下，連接聚合物成分的最終步驟都包括在側(cè)面分支點(diǎn)上產(chǎn)生官能團(tuán)(Func)，并且產(chǎn)生基團(tuán)U(參見圖7)。圖5B表示另一種方法，其中，將被保護(hù)的U-B前體用于與具有一個(gè)接頭的聚合物支持物結(jié)合，它能在裂解之后產(chǎn)生需要的保護(hù)的或未保護(hù)的U-基團(tuán)。圖5B還表示組裝前的分支核心B與聚合物支持物的連接，以及利用U-基團(tuán)產(chǎn)生樹脂制備U-B部分，用于隨后連接聚合物成分。
圖6A-6D表示用于制備本發(fā)明的優(yōu)選的基本上無抗原性的水溶性聚酰胺聚合物-J*成分的固相方法，該成分隨后用于結(jié)合U-B核心。盡管示出了作為優(yōu)選方法的固相方法，液相方法也可用于獲得相同的最終結(jié)果。在圖6A-6B中，利用固相有機(jī)化學(xué)原理偶合二酸和二氨基單位。可以任選摻入被保護(hù)的氨基-X’-酸和/或氨基-Y’-酸單位，以便在具有結(jié)構(gòu)式-[NH-Y-NHCO-X-CO]-的聚酰胺結(jié)構(gòu)的最終裂解產(chǎn)物上產(chǎn)生基團(tuán)X和Y的額外的多樣性。圖6A表示沿N-至C-末端方向進(jìn)行的合成，而圖6B表示沿C-至N-末端方向進(jìn)行的合成。在圖6C和6D中，用固相有機(jī)化學(xué)原理連接受保護(hù)的氨基X’-酸和/或氨基Y’-酸單位。圖6C表示沿N-至C-末端方向進(jìn)行的合成，而圖6D表示沿C-至N-末端方向進(jìn)行的合成。從圖6A-6D中可以看出，可以精確控制最終聚酰胺產(chǎn)物的性質(zhì)，這取決于為了合成而進(jìn)行的循環(huán)的次數(shù)。另外，可以將側(cè)基J*構(gòu)建成基本任何用戶確定的性質(zhì)。當(dāng)采用單分散性單元X、Y、X’和Y’時(shí)，可以精確地控制最終的聚酰胺產(chǎn)物的確切分子結(jié)構(gòu)。
在圖7中示出了用于將U-B成分連接到聚合物-J*成分上，以便產(chǎn)生本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)式U-B-Ploymer-J*的優(yōu)選合成聚合物結(jié)構(gòu)的優(yōu)選方法。正如所說明的，可以提供各種保護(hù)基團(tuán)，并且選擇性地取決于特定結(jié)構(gòu)的預(yù)期最終用途。還示出了生產(chǎn)需要的U-B-Ploymer-J*結(jié)構(gòu)的不同途徑，包括固相方法和液相方法。
圖8表示將水溶性聚合物精確連接在可用于連接并生產(chǎn)本發(fā)明的生物活性合成蛋白的肽片段上的另一種方法。第一個(gè)步驟采用了固相肽合成(SPPS)(例如，F(xiàn)moc或Boc SPPS)，其中，用正交保護(hù)基團(tuán)保護(hù)用于聚合物連接的氨基酸側(cè)鏈(例如，如果使用Fmoc SPPS，可以用Boc基團(tuán)保護(hù)聚合物連接位點(diǎn)，或者如果使用Boc SPPS，可以使用Fmoc基團(tuán)作為正交保護(hù)基團(tuán))。在肽合成之后，選擇性地除去正交保護(hù)基團(tuán)，而所述肽的其余部分仍然受到保護(hù)。由此提供了用于下一個(gè)步驟的單一連接位點(diǎn)-固相聚合物合成。一旦除去了正交保護(hù)基團(tuán)，就可以作為前體連接聚合物鏈。更優(yōu)選的是，采用圖6A-6D所示的方法通過連續(xù)輪次的聚合物合成構(gòu)建所述聚合物鏈。盡管示出了單一的聚合物連接位點(diǎn)，但可以提供一個(gè)以上的連接位點(diǎn)。
4.前體趨化因子與制備聚合物修飾的生物活性合成趨化因子相關(guān)的第三種成分具有最佳體外生物活性，其特征是能下調(diào)與它結(jié)合的趨化因子受體。其中包括前體趨化因子的選擇(即選擇用于在它上面連接水溶性聚合物的靶趨化因子)，該趨化因子的效力比所需要的聚合物修飾的生物活性合成趨化因子的理想效力范圍高大約1-5倍，優(yōu)選大約5-10倍或更高(其中，效力是通過相對基于體外細(xì)胞測定的EC50測定的)。
舉例來說，在鑒定包括具有用于抑制病毒感染的理想的ED50的聚合物修飾的Rantes的合成趨化因子時(shí)，合成了一組非聚合物修飾的前體類似物，并且通過細(xì)胞融合測定篩選HIV感染。將聚合物修飾形式的靶抗融合效力設(shè)定為10nM或比野生型Rantes更低，野生型Rantes大約為20nM或更高。在制備需要的前體Rantes趨化因子時(shí)，對以下部分進(jìn)行一系列修飾(1)N-末端殘基；(2)N-末端區(qū)內(nèi)部；和(3)C-末端區(qū)。發(fā)現(xiàn)了特別有效的前體類似物，其中，相當(dāng)于野生型Rantes的1號位置上的絲氨酸被n-壬酰基部分所取代，相當(dāng)于野生型Rantes的3號位置上的酪氨酸被L-環(huán)己基甘氨酸所取代，并且通過二肽(Lys69-Leu70)接頭部分將脂肪酸部分連接在所述C-末端殘基上；還發(fā)現(xiàn)了一種更有效的類似物，它同時(shí)包括上述改變和用L-硫代脯氨酸取代野生型Rantes的2號位置上的脯氨酸。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將直鏈或支化水溶性聚合物連接在含有一種或多種上述變化的所述Rantes類似物的C-末端位點(diǎn)上時(shí)，就可以獲得聚合物修飾形式的理想的靶抗融合效力。即獲得了包括Rantes類似物的一系列合成趨化因子，這些趨化因子抑制病毒感染的ED50在10nM范圍內(nèi)或更低。具體地講，將直鏈和支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)連接在C-末端位點(diǎn)上(67號位置，相當(dāng)于野生型Rantes的67號位置上的甲硫氨酸)，該位點(diǎn)鄰近野生型Rantes的聚集位點(diǎn)(66號位置，相當(dāng)于野生型Rantes的66號位置上的谷氨酸)。在所述位點(diǎn)上添加水溶性聚合物不僅會破壞不希望的聚合，聚合物修飾的形式具有在10nM和更低目標(biāo)范圍內(nèi)的效力范圍。這一觀察與以下發(fā)現(xiàn)吻合，即用于聚合物修飾的前體趨化因子的起始效力優(yōu)選比聚合物修飾的合成趨化因子的理想效力高大約1-5倍，優(yōu)選大約5-10倍或更高(其中，效力是相對基于體外細(xì)胞的測定通過EC50測定的)。另外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，Rantes的每一種聚合物修飾的類似物具有在諸如大鼠或小鼠的相關(guān)動物模型中測定的明顯改善了的循環(huán)半衰期。這種摻入能提高前體趨化因子效力的改變的系統(tǒng)方法普遍適用于其他趨化因子。因此，所述前體趨化因子的選擇可用于產(chǎn)生表現(xiàn)出效力和體內(nèi)血清循環(huán)半衰期之間的優(yōu)選平衡的聚合物修飾的生物活性合成趨化因子。
C.對本發(fā)明趨化因子進(jìn)行可檢測標(biāo)記本發(fā)明的生物活性合成趨化因子還可以包括可檢測標(biāo)記，如熒光團(tuán)和導(dǎo)入特定的選擇位點(diǎn)的其他取代基團(tuán)，所述標(biāo)記將分子轉(zhuǎn)化成與趨化因子作用、病毒抑制等相關(guān)的膜和細(xì)胞生物學(xué)事件的探針，以及用于監(jiān)測藥代動力學(xué)等。優(yōu)選將可檢測的標(biāo)記連接在本發(fā)明生物活性合成趨化因子的C-末端區(qū)上。可檢測標(biāo)記可以在所述趨化因子多肽鏈的合成期間或合成之后摻入。例如，可以在鏈組裝期間將可檢測的標(biāo)記摻入預(yù)連接的肽片段上。例如，可以在除去其他保護(hù)基團(tuán)并從樹脂上釋放出標(biāo)記過的肽之前，將熒光團(tuán)方便地結(jié)合在樹脂結(jié)合的肽上面的未保護(hù)的反應(yīng)性基團(tuán)上。含有可檢測標(biāo)記的氨基酸衍生物和用于將其摻入肽或多肽序列上的化學(xué)合成技術(shù)是眾所周知的，并且可用于這一目的。這樣，就可以將所得到的趨化因子多肽鏈連接產(chǎn)物設(shè)計(jì)成在選擇的預(yù)先規(guī)定的位置上含有一個(gè)或多個(gè)可檢測的標(biāo)記。另外，可以將可檢測標(biāo)記添加在反應(yīng)性基團(tuán)上，優(yōu)選存在于肽片段連接之前或者甚至是在連接之后的肽片段的特定氨基酸上的能夠進(jìn)行位點(diǎn)特異性連接的化學(xué)選擇性反應(yīng)性基團(tuán)，如酮或醛基團(tuán)。
適合這一目的的可檢測標(biāo)記包括光活性基團(tuán)，以及生色團(tuán)，包括熒光團(tuán)和其他染料，或諸如生物素的半抗原。所述標(biāo)記物被從很多不同的商業(yè)渠道獲得(例如，參見Molecular Probes，Oregon USA；Sigmaand affiliates，St.Louis MO，USA；等)。為了在樹脂上進(jìn)行標(biāo)記，熒光素、伊紅、Oregon綠、羅丹明綠、Rhodol綠、四甲基羅丹明、羅丹明紅、德克薩斯紅、香豆素和NBD熒光團(tuán)、dabcyl生色團(tuán)和生物素都對氟化氫(HF)，以及大多數(shù)的其他酸穩(wěn)定并因此適合通過固相合成摻入(Peled等，Biochemistry，1994，337211；Ben-Efraim等，Biochemistry，1994，33；6966)。除了香豆素之外，所述熒光團(tuán)對于用來對使用Fmoc化學(xué)方法合成的肽進(jìn)行脫保護(hù)的試劑來說是穩(wěn)定的(Strahilevitz等，Biochemistry，1994，3310951)。還可利用ε-dabcyl-L-賴氨酸的t-Boc和α-Fmoc衍生物將dabcyl生色團(tuán)摻入多肽片段的特定位點(diǎn)。Dabcyl生色團(tuán)具有寬的可見光吸收范圍，并可用作淬滅基團(tuán)。還可利用dabcyl琥珀酰亞胺基酯將Dabcyl基團(tuán)摻入N-末端(Maggiora等，J.Med.Chem.，1992，353727)。EDANS是用于在FRET實(shí)驗(yàn)中與Dabcyl淬滅基團(tuán)配對的常用熒光團(tuán)。該熒光團(tuán)可以在肽的自動合成期間利用5-((2-(t-Boc)-γ-谷氨酰氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸方便地導(dǎo)入(Maggiora等，J.Med.Chem.，1992，353727)。在化學(xué)合成期間，可以利用α-(t-Boc)-ε-丹酰-L-賴氨酸將α-(t-Boc)-ε-丹酰熒光團(tuán)摻入多肽(Gauthier等，Arch.Biochem.Biophys.，1993，306304)。與EDANS一樣，該熒光團(tuán)的熒光與Dabcyl的吸收重疊。肽的位點(diǎn)特異性生物素化可以利用t-Boc-保護(hù)的生物胞素的衍生物(Gealhen等，Anal.Biochem.，1992，20268)或諸如NHS生物素的其他公知生物素化衍生物等實(shí)現(xiàn)。在進(jìn)行t-Boc或Fmoc保護(hù)之后還將消旋二苯酮苯丙氨酸類似物摻入肽(Jiang等，Intl.J.Peptide Prot.Res.，1995，45106)。還可以在對產(chǎn)物進(jìn)行HPLC純化期間完成非對映體的分辨，還可以通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分辯未保護(hù)的二苯酮?？捎糜谶M(jìn)行樹脂標(biāo)記的氨基酸的其他例子包括用于肟連接的具有酮的氨基酸，疊氮/羥基色氨酸，biotyl賴氨酸和D-氨基酸?？梢岳斫獾氖?，可以按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過常規(guī)合成制備用于自動化肽合成的其他受保護(hù)氨基酸。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子可以包括結(jié)合在它上面的藥物(例如，參見WO00/04926)。
D.合成本發(fā)明的趨化因子并且連接水溶性聚合物還提供了生產(chǎn)本發(fā)明的生物活性合成趨化因子的方法，該方法包括(i)合成天然存在的趨化因子的類似物，它包括氨基酸序列基本上與天然存在的趨化因子同源的多肽鏈，其中，用選自脂族鏈和氨基酸衍生物的成分對所述多肽鏈上的N-末端、N-環(huán)和C-末端中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行修飾；和(ii)篩選與相應(yīng)的天然存在的趨化因子相比具有拮抗劑活性的趨化因子類似物。
具體地講，用于生產(chǎn)本發(fā)明的N-末端修飾的生物活性合成趨化因子的方法包括(i)合成天然存在的趨化因子的類似物，它包括氨基酸序列基本上與天然存在的趨化因子同源的多肽鏈，其中，用脂族鏈和一種或多種氨基酸衍生物對所述多肽鏈的N-末端進(jìn)行修飾；和(ii)篩選與相應(yīng)的天然存在的趨化因子相比具有拮抗劑活性的趨化因子類似物。用于生產(chǎn)本發(fā)明的C-末端修飾的生物活性合成趨化因子的方法包括(i)合成天然存在的趨化因子的類似物，它包括氨基酸序列基本上與天然存在的趨化因子同源的多肽鏈，其中，用脂族鏈或多環(huán)對所述多肽鏈的C-末端進(jìn)行修飾；和(ii)篩選與相應(yīng)的天然存在的趨化因子相比具有拮抗劑活性的趨化因子類似物。用于生產(chǎn)本發(fā)明的N-/C-末端修飾的生物活性合成趨化因子的方法包括(i)合成天然存在的趨化因子的類似物，它包括氨基酸序列基本上與天然存在的趨化因子同源的多肽鏈，其中，用脂族鏈和一種或多種氨基酸衍生物對所述多肽鏈的N-末端進(jìn)行修飾，并且用脂族鏈或多環(huán)對所述多肽鏈的C-末端進(jìn)行修飾；和(ii)篩選與相應(yīng)的天然存在的趨化因子相比具有拮抗劑活性的趨化因子類似物。
本發(fā)明生物活性合成趨化因子的合成是通過化學(xué)合成(即無核糖體的合成)，或生物學(xué)合成(即核糖體合成)和化學(xué)合成的組合完成的。對于化學(xué)合成來說，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子可以通過逐步鏈組裝或片段縮合技術(shù)完整地制備，如利用Fmoc和tBoc方法進(jìn)行的固相或液相肽合成，或通過化學(xué)連接完全由鏈組裝或鏈組裝和生物學(xué)生產(chǎn)的組合制備的肽片段。所述逐步鏈組裝或片段縮合以及連接技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知(例如，參見Kent，S.B.H.，Ann.Rev.Biochem.(1988)579557-989；Dawson et al.，Methods Enzymol.(1997)28734-45；Muir et al.，Methods Enzymol.(1997)289266-298；Wilken et al.，Current Opinion In Biotechnology(1998)9412-426；Ingenito et al.，J.Amer.Chem.Soc.(1999)121(49)11369-11374；and Muir et al.，Chemistry&Biology(1999)6R247-R256)對于化學(xué)連接來說，將具有N-末端官能團(tuán)的第一種肽片段連接到具有C-末端官能團(tuán)的第二種肽片段上，C-末端官能團(tuán)能與N-末端官能團(tuán)起反應(yīng)，在它們之間形成共價(jià)鏈。根據(jù)所選擇的官能團(tuán)，所述連接反應(yīng)產(chǎn)生了在連接位點(diǎn)上具有天然酰胺鍵或非天然共價(jià)鍵的產(chǎn)物。用于化學(xué)連接的第一種或第二種肽片段通常是通過逐步鏈組裝或片段縮合制備的。具體地講，當(dāng)本發(fā)明的生物活性合成趨化因子是通過連接肽片段制備的時(shí)，所述片段被制備成包括適應(yīng)于將要用于連接的化學(xué)選擇性反應(yīng)化學(xué)方法的化學(xué)選擇性活性側(cè)基。所述化學(xué)方法包括，但不限于天然化學(xué)連接(Dawson等，Science，1994，266776-779；Kent等，WO96/34878)，延伸的一般化學(xué)連接(Kent等，WO98/28434)，成肟化學(xué)連接(Rose等，J.Amer.Chem.Soc.，1994，11630-33)，成硫酯連接(Schnolzer等，Science，1992，256221-225)，成硫醚連接(Englebretsen等，Tet.Letts.，1995，36，488871-8874)，成腙連接(Gaertner等，Bioconj.Chem.，1994，5，4333-338)，和成噻唑烷連接和成噁唑烷連接(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，169184-9189；Tam等，WO95/00846)。
選擇特定連接化學(xué)方法的反應(yīng)條件，以便保持連接成分的理想的相互作用。例如，pH和溫度，所述肽和成分的水溶解度，肽的比例，含水量和每一種肽的組成可以改變，以便優(yōu)化連接。還可以通過添加或排除試劑將所述肽溶解到不同的程度，以便控制所需連接反應(yīng)的特異性和速度。還可以通過與一種或多種內(nèi)部和/或外部對照比較，分析所需要的化學(xué)選擇性反應(yīng)產(chǎn)物，以便方便地確定反應(yīng)條件。
Kent等在WO96/34878中披露了采用天然化學(xué)連接的化學(xué)合成的優(yōu)選方法，Offord在WO99/11666中披露了制備在N-和/或C-末端化學(xué)修飾的蛋白的方法，以上專利的內(nèi)容被收作本文的內(nèi)容。一般，讓含有C-末端硫酯的第一種肽與具有未氧化的巰基側(cè)鏈的N-末端半胱氨酸的第二種肽起反應(yīng)。在存在催化數(shù)量的硫醇，優(yōu)選芐基硫醇，硫代苯酚，2-硝基硫代苯酚，2-硫代苯甲酸，2-硫代吡啶等的條件下所述N-末端半胱氨酸的未氧化的巰基側(cè)鏈與C-末端的硫酯縮合。通過利用β-氨基硫酯鍵連接所述第一種和第二種肽產(chǎn)生了中間肽，中間肽重排產(chǎn)生包括通過酰胺鍵連接的所述第一種和第二種肽的肽產(chǎn)物。
對于化學(xué)和生物學(xué)生產(chǎn)的組合來說，一種肽片段是通過化學(xué)合成制備的，而另一種肽片段是利用重組方法制備的，然后通過化學(xué)連接連接所述片段，以便產(chǎn)生全長的產(chǎn)物。例如，可以利用intein表達(dá)系統(tǒng)通過intein蛋白剪接元件的誘導(dǎo)型自我裂解活性產(chǎn)生C-末端硫酯肽片段。具體地講，intein在存在諸如DTT、b-巰基乙醇或半胱氨酸的條件下能發(fā)生特異性自我裂解，由此產(chǎn)生了具有C-末端硫酯的肽片段(例如，參見Muir等，Chemistry&Biology，1999，6R247-R256；Chong，Gene，1997，192277-281；Chong等，Nucl.Acids Res.，1998，265109-5115；Evans等，Protein Science，1998，72256-2264；和Cotton等，Chemistry&Biology，1999，6，9247-256)。然后可以利用這種具有C-末端硫酯的肽連接具有N-末端硫酯反應(yīng)性官能性的第二種肽，如具有用于天然化學(xué)連接的N-末端半胱氨酸的肽片段。
可以在鏈組裝期間、鏈組裝之后或通過其組合時(shí)摻入疏水性脂族鏈和氨基酸衍生物。對于在鏈組裝期間進(jìn)行的摻入來說，通過逐步或片段縮合和/或連接鏈組裝方法摻入氨基酸衍生物和/或在它上面連接有脂族鏈的氨基酸。所述氨基酸可以通過逐步方式在肽合成期間添加到生長中的肽鏈上，以便組裝用于連接的肽片段，或者在某些場合下通過從聚合物支持物上裂解提供側(cè)面N-或C-末端修飾，以便由裂解產(chǎn)物產(chǎn)生需要的疏水性脂族鏈。對于鏈組裝后來說，在鏈組裝期間摻入具有反應(yīng)性官能團(tuán)的氨基酸或其衍生物(保護(hù)形式的或非保護(hù)形式的)，然后以它的非保護(hù)反應(yīng)性形式用于所需疏水性部分的連接，即肽合成后的連接反應(yīng)。鏈組裝后連接可以在變性的線性肽鏈上進(jìn)行，或在多肽鏈折疊后進(jìn)行。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，氨基酸衍生物是在肽合成期間添加到感興趣的氨基酸位點(diǎn)上的，而N-、C-和/或N-/C-末端疏水性脂族鏈?zhǔn)窃陔暮铣芍笸ㄟ^結(jié)合反應(yīng)添加的。根據(jù)所需要的共價(jià)連接，可以采用多種結(jié)合化學(xué)方法中的任一種(例如，參見Plaue，S.等，Biologicals.，1990，18，3147-57；Wade J.D.等，Australas Biotechnol.1993，3，6332-6；Doscher，M.S.等，MethodsEnzymol.，1977，47578-617；Hancock，D.C.等，Mol.Biotechnol.，1995，4，173-86；Albericio，F(xiàn).等，Methods Enzymol.，1997，289313-36)以及連接化學(xué)方法?？梢园凑毡绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明生物活性合成趨化因子的折疊，例如，參見WO99/11655；WO99/11666，Dawson等，Methods Enzymol.，1997，28734-45)。
為了篩選合成趨化因子化合物的拮抗劑活性，通過基于體內(nèi)或體外的測定方法檢驗(yàn)所述化合物，其特征是將趨化因子配體直接或間接連接到其相應(yīng)的受體上。趨化因子受體及其相應(yīng)的野生型趨化因子的例子包括CXXXCR1(Fractalkine)；XCR1(SCM-1)；CXCR2(GRO，LIX，MIP-2)；CXCR3(MIG，IP-10)；CXCR4(SDF-1)；CXCR5(BLC)；CCR1(MIP-1α，RANTES，MCP-3)；CCR2(MCP-1，MCP-3，MCP-5)；CCR3(Eotexin，RANTES，MIP-1α)；CCR4(MDC，TARC)；CCR5(RANTES，MIP-1α，MIP-1β)；CCR6(MIP-3α)；CCR7(SLC，MIP-3β)；CCR8(TCA-3)和CCR9(TECK)。所述系統(tǒng)的體內(nèi)和體外測定是眾所周知的，并且可以方便地獲得從頭制備。例如，參見US5652133；US5834419；WO97/44054；WO00/04926；和WO900/0492。例如，通常將能表達(dá)一種或多種趨化因子的受體的天然的、轉(zhuǎn)化的和/或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系用于監(jiān)測趨化因子誘導(dǎo)的趨化性或在接觸本發(fā)明的生物活性合成趨化因子時(shí)對該事件的抑制作用。例如，還可以用動物模型監(jiān)測與本發(fā)明的生物活性合成趨化因子治療組合時(shí)的反應(yīng)特征，或?qū)λ龌衔锏乃幋鷦恿W(xué)和藥物動態(tài)學(xué)特征進(jìn)行特征分析。為了作為病毒感染抑制劑分析本發(fā)明的化合物，可以采用利用靶細(xì)胞系和被膜細(xì)胞系的被膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合測定方法篩選本發(fā)明生物活性合成趨化因子的抑制HIV感染的能力。當(dāng)然，還可將無細(xì)胞病毒感染分析方法用于這一目的。
例如，為了評估趨化性的總體拮抗性，可以采用外周血白細(xì)胞，如按照業(yè)已完善的分離單核細(xì)胞的方法從正常供體中分離的T淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞?？梢詷?gòu)建一組C，CC，CCXXXC和CXC趨化因子受體表達(dá)測試細(xì)胞，并在接觸本發(fā)明的單一化合物的一系列稀釋液之后進(jìn)行評估?？梢杂锰烊悔吇蜃幼鲗φ?，例如，用編碼各種趨化因子受體的各種表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的一組細(xì)胞適用于這一目的。例如，可以利用表達(dá)CXCR4/融合體/SESTR，CCR3，CCR5，CXC4的轉(zhuǎn)化體篩選諸如RANTES，SDF-1α、SDF-1β和MIP的趨化因子的拮抗劑(所述細(xì)胞可以從各種商業(yè)和/或?qū)W術(shù)來源獲得，或者按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如，參見Risau等，Nature，387671-674，1997；Angiololo等，AnnalsNY Acad.Sci.，1996，795158-167；Friedlander等，Science，1995，8701500-1502)。所述結(jié)果能夠以趨化性指數(shù)(CI)形式表示，該指數(shù)表示與對照培養(yǎng)基相比由刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移增加的倍數(shù)，以及測定的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
還可以進(jìn)行受體結(jié)合測定，例如，評估競爭抑制作用與受體循環(huán)作用(參見，Signoret，N.et al.，Signoret，N.et al.，“Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5，”J Cell Biol.2000151(6)1281-94；Signoret，N.et al.，“Analysis of chemokine receptor endocytosisand recycling，”Methods Mol Biol.2000；138197-207；Pelchen-Matthews，A.et al.，“Chemokine receptor trafficking and viral replication，”Immunol Rev.1999Apr；16833-49；Daugherty，B.L.et al.，“Radiolabeled chemokine binding assays，”Methods Mol Biol.2000；138129-34；Mack，M.et al.“Downmodulation andrecycling of chemokine receptors，”Methods Mol Biol.2000；138191-5；所有文獻(xiàn)被收作本文參考)。該方法是眾所周知的，并且通常按照標(biāo)準(zhǔn)方法在存在濃度不斷增加的未標(biāo)記過的天然趨化因子的條件下使用標(biāo)記過的本發(fā)明的生物活性合成趨化因子。當(dāng)然，可以對任一種配體或兩種配體進(jìn)行標(biāo)記，在這種類型的測定中，可以對結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，例如，采用諸如LIGAND的計(jì)算機(jī)程序(P.Munson，Division ofcomputer researchs and technology，NIH，Bethesda，MD)，并且用“單一位點(diǎn)”和“雙位點(diǎn)”模型進(jìn)行Scatcsard曲線分析，與天然白細(xì)胞或能表達(dá)靶趨化因子受體的受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組進(jìn)行比較。然后通過以下公式計(jì)算未標(biāo)記過的配體競爭結(jié)合的速度％抑制＝1-(在存在未標(biāo)記過的趨化因子的條件下的結(jié)合/在僅存在培養(yǎng)基的情況下的結(jié)合)×100。
為了篩選所述化合物抑制或緩解病毒感染和疾病的能力，可以用一組能穩(wěn)定表達(dá)合適受體的接觸各種病毒菌株和對照的細(xì)胞篩選所述化合物。例如，可以將能表達(dá)CCR3、CCR5、CXC4或CXCR4受體的U87/CD4細(xì)胞用于篩選M-向性、T-向性和雙向性HIV菌株的感染。病毒感染的抑制作用可以通過相對趨化因子濃度和對照濃度的感染百分比表示。例如，參見McKnight等，Virology，1994，2018-18；和Mosier等，Science，1993，260689-692；Simmons等，Science，1997，276276-279；Wu等，J.Exp.Med.，1997，185168-169；和Trkola等，Nature，1996，384184-186。鈣轉(zhuǎn)移測定是用于篩選受體結(jié)合拮抗劑的另一種例子，例如，用于鑒定天然趨化因子的拮抗劑，這種拮抗劑對嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化性(Jose等，J.Exp.Med.，179881-887，1994)。作為另一種例子，本發(fā)明化合物的拮抗劑活性可以通過雞絨毛尿囊膜(CAM)測定評估(Oikawa等，Cancer Lett.，1991，5957-66)。
本發(fā)明的生物活性合成趨化因子具有很多用途，包括用作研究工具，診斷劑和治療劑。具體地講，業(yè)已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的生物活性合成趨化因子具有有價(jià)值的藥理學(xué)特征，并且業(yè)已證實(shí)能有效抑制與相關(guān)的野生型分子相關(guān)的炎性作用-所述野生型分子與各種疾病相關(guān)，包括哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、粉瘤/動脈粥樣硬化、器官移植排斥、和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。因此，可將其用于治療哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、粉瘤/動脈粥樣硬化、器官移植排斥、和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。例如，業(yè)已證實(shí)諸如RANTES和SDF-1α和SDF-1β拮抗劑的本發(fā)明的若干種生物活性合成趨化因子能抑制HIV-1感染，并且可將拮抗劑(例如，vMIP-II類似物)用于同一種目的。因此，本發(fā)明的RANTES或SDF-1α或SDF-1β拮抗劑和vVIP-II類似物可用于在哺乳動物抑制HIV-1。所述化合物用于抗HIV-1的潛在用途是通過披露于以下實(shí)施例中的方法確定的。所述化合物用于抗炎性作用的潛在用途是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法確定的。另外，可以理解的是，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子可以單獨(dú)使用，或者彼此組合使用，以及與其他能協(xié)同治療特定疾病的非趨化因子藥物組合使用。
舉例來說，而不是要進(jìn)行限定，以下是野生型趨化因子分子及其相關(guān)的生物學(xué)特性的某些具體例子，用于說明制備本發(fā)明的生物活性合成趨化因子的一般用途。例如，SCM-1是在脾臟中表達(dá)的C-趨化因子。它與CC和CXC-趨化因子顯著相關(guān)，主要的差別是，它僅具有在這種蛋白中保守的四個(gè)半胱氨酸中的第二個(gè)和第四個(gè)(Yoshida等，F(xiàn)EBLetters，1995，360，2105-159；Yoshida等，J.Biol.Chem.，1998，273，2616551-16554)。在人體中，存在兩種高度同源的SCM-1蛋白，SCM-1α和SCM-1β，這兩種蛋白的差別在于兩個(gè)氨基酸的取代，發(fā)現(xiàn)SCM-1與lymphotactin-鼠類淋巴細(xì)胞特異性趨化因子具有大約60％的相同性。因此，SCM-1和lymphotactin可以代表C-趨化因子或γ-趨化因子的人類或鼠類原型。在通過工程改造能表達(dá)孤獨(dú)受體GPR5的鼠L1.2細(xì)胞中，兩種SCM-1分子能特異性地誘導(dǎo)遷移，所述孤獨(dú)受體主要在胎盤中表達(dá)，并且能在各種人類組織的脾臟和胸腺中弱表達(dá)。因此，SCM-1的拮抗劑可用于抑制GPR4的正常功能。
作為另一種例子，F(xiàn)ractalkine的可溶形式，即一種76個(gè)氨基酸的CXXXC趨化因子是T細(xì)胞和單核細(xì)胞的有效趨化引誘物，但不是嗜中性粒細(xì)胞的趨化引誘物。在用TNF或IL-1刺激之后Fractalkine顯著增加。Fractalkine的人類受體被命名為CX3CR1。該受體能介導(dǎo)Fractalkine的粘性和遷移性功能。所述人類受體能夠在嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和包括大腦在內(nèi)的若干實(shí)體器官中表達(dá)。業(yè)已證實(shí)所述受體能與CD4一起作為來自HIV-1的一級分離物的被膜蛋白的共同受體。細(xì)胞-細(xì)胞融合測定證實(shí)，F(xiàn)ractalkine能有效地并且特異性地抑制融合(例如，參見Bazan等，Nature，1997，385，6617640-644；Combadiere等，J.Biol.Chem.，1998，273，3723799-23804；Rossi等，Genomics，1998，47，2163-170；和Faure等，Science，2000，2872274-2277)。因此，很顯然，F(xiàn)ractalkine的拮抗劑可用于治療與TNF或IL1途徑相關(guān)的各種關(guān)節(jié)疾病，如關(guān)節(jié)炎，以及用作HIV感染的阻斷劑。
Eotaxin是另一種例子，該蛋白的長度為74個(gè)氨基酸，并且由于其特有的半胱氨酸形式被歸入CC-趨化因子類型。業(yè)已在被用作過敏性炎癥模型的豚鼠的支氣管肺泡洗液中發(fā)現(xiàn)了這種蛋白，并且和與哮喘相關(guān)的疾病相關(guān)。在1-2pM的劑量下，Eotaxin能在皮膚內(nèi)誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的顯著積累，而不會到嗜中性粒細(xì)胞的積累產(chǎn)生顯著影響。在體外，Eotaxin是豚鼠和人類嗜酸性粒細(xì)胞的有效刺激物。所述因子似乎在豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞上擁有與RANTES相同的結(jié)合位點(diǎn)。Eotaxin能在正常人嗜酸性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)鈣流量反應(yīng)，但不能在嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞中誘導(dǎo)這種反應(yīng)。用其他CC-趨化因子對嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理不能對所述反應(yīng)脫敏化。在嗜堿性粒細(xì)胞中，Eotaxin能誘導(dǎo)比RANTES高的趨化反應(yīng)，但是它對組氨酸的釋放或白三烯C4產(chǎn)生僅有微弱的影響。它還在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的趨化性中發(fā)揮作用。Eotaxin的主要受體是CCR3(例如，參見Bartels等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1996，225，31045-51；Jose等，J.Exp.Med.，1994，179881-887；Ponath等，J.Clin.Investigation，1996，97，3604-612；Ponath等，J.Exp.Med.，1996，183，62437-2448；Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1997，231，2365-368)。因此，可以將Eotaxi的拮抗劑用作哮喘和其他與嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的過敏性疾病的有效調(diào)節(jié)劑。
RANTES是靶趨化因子的另一個(gè)例子，對它的拮抗劑是特別感興趣的。它是一種參與從炎癥、器官排斥到HIV感染的很多疾病的CC-趨化因子。RANTES的合成是由TNFα和IL1α誘導(dǎo)的，而不是由TGFβ、INFγ和IL-6誘導(dǎo)的。RANTES是由培養(yǎng)物中的循環(huán)T-細(xì)胞和T-細(xì)胞克隆生產(chǎn)的，而不是由至今為止任何測試的T細(xì)胞系產(chǎn)生的。在刺激T淋巴細(xì)胞之后抑制了RANTES的表達(dá)。RANTES對T細(xì)胞、人類嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞有趨化性，并且在將白細(xì)胞寡集到炎癥部位方面發(fā)揮積極作用。RANTES還能激活嗜酸性粒細(xì)胞，以便釋放，例如，嗜酸性陽離子型蛋白，它能改變嗜酸性粒細(xì)胞的密度，并且使得它們密度降低，這被認(rèn)為體現(xiàn)了普遍化的細(xì)胞激活狀態(tài)，并且經(jīng)常與諸如哮喘和過敏性鼻炎的疾病相關(guān)。RANTES還是氧化代謝的有效的嗜酸性粒細(xì)胞特異性激活物。RANTES能提高單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性。它能選擇性地支持能表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記CD4和UCHL1的單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞遷移。以上細(xì)胞被認(rèn)為能預(yù)刺激具有記憶T細(xì)胞功能的輔助T細(xì)胞。RANTES能激活來自某些特定嗜堿性粒細(xì)胞供體的人類嗜堿性粒細(xì)胞，并且導(dǎo)致組胺的釋放。另一方面，RANTES還能抑制由包括最有效的組胺誘導(dǎo)物之一MCAF的若干種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞的組胺釋放。
最近業(yè)已證實(shí)RANTES具有除了趨化性以外的生物學(xué)活性。它能夠誘導(dǎo)被稱作CHAK(CC-趨化因子激活的殺傷細(xì)胞)的殺傷細(xì)胞的增殖和激活，所述細(xì)胞類似于由IL2激活的細(xì)胞。RANTES是由人滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá)的，并且可能參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的持續(xù)性發(fā)炎過程相關(guān)。業(yè)已在人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系PHT-1中鑒定了RANTES的高親和力受體(大約700個(gè)結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞；Kd＝700pM)，在趨化性和鈣遷移測定中，所述細(xì)胞系對RANTES有反應(yīng)。通過用MCAF(單核細(xì)胞趨化性和激活因子)或MIP-1-α(巨噬細(xì)胞炎性蛋白)預(yù)培養(yǎng)，能明顯抑制THP-1細(xì)胞對RANTES的趨化反應(yīng)。MCAF和MIP-1-α能與RANTES競爭結(jié)合單核細(xì)胞。RANTES的受體是CCR1、CCR3和CCR5。RANTES的拮抗劑的臨床用途和價(jià)值是多方面的。例如，天然RANTES的抗體能顯著抑制與實(shí)驗(yàn)性系膜增殖性腎炎相關(guān)的細(xì)胞浸潤。另外，天然RANTES似乎在經(jīng)歷與腎臟移植排斥相關(guān)的細(xì)胞排斥的人腎臟異體移植物中高度表達(dá)(Pattison等，Lancet，1994，343，8891209-11，1994)。業(yè)已證實(shí)RANTES的化學(xué)修飾形式(氨基氧戊烷-RANTES或AOP-RANTES；和n-壬?；?RANTES或NNY-RANTES)起著趨化因子的CCR-5受體的拮抗劑的作用，并且具有抑制HIV-1感染的能力。因此，本發(fā)明的拮抗劑N-、C-和N-/C-末端修飾的RANTES類似物可用作治療諸如哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、粉瘤/動脈粥樣硬化、器官移植排斥、和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疾病的抗炎制劑。
趨化因子SDF-1α和β的拮抗劑是其他的例子，它們屬于趨化因子的CXC類。SDF-1β的不同在于在C-末端具有四個(gè)額外的氨基酸。這些趨化因子與其非人對應(yīng)體的相同性超過92％。SDF-1在除了血細(xì)胞之外的其他細(xì)胞是普遍表達(dá)的。SDF-1作用于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，但在體外不能作用于嗜中性粒細(xì)胞，并且在體內(nèi)是單核細(xì)胞的高效趨化劑。它還能在淋巴細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白聚合。SDF-1在體外和體內(nèi)都起著人造血祖細(xì)胞的趨化劑作用，產(chǎn)生混合類型的祖細(xì)胞和更原始的類型。SDF-1似乎還參與心室隔膜的形成。CD34+細(xì)胞的趨化性會針對SDF-1和IL-3的組合作用而增強(qiáng)。業(yè)已證實(shí)SDF還能誘導(dǎo)上述細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)鈣的瞬時(shí)提高。SDF-1的主要受體是CXCR4，它還起著HIV-1的主要T淋巴細(xì)胞共同受體的作用，例如，參見Aiuti等，J.Exp.Med.，1997，185，1111-120，1997；Bleul等，J.Exp.Med.，1996，184，31101-1109，1996；Bleul等，Nature，1996，382，6594829-833；D’Apuzzo等，European J.Immunol.，1997，27，71788-1793；Nagsawa等，Nature，1996，382635-638；Oberlin等，Nature，1996，382，6594833-835。因此，舉例來說，本發(fā)明的SDF-1α或SDF-1β拮抗劑可用作治療諸如哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、粉瘤/動脈粥樣硬化、器官移植排斥、和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疾病的抗炎制劑。另外，本發(fā)明的SDF-1α或SDF-1β拮抗劑可以單獨(dú)使用或者與諸如本發(fā)明的RANTES拮抗劑類似物的其他化合物組合使用用于阻斷哺乳動物中針對促炎細(xì)胞的寡集和/或激活的SDF-1、RANTES、MIP-1α和/或MIP-1β的作用，或治療或抑制HIV-1感染。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及治療需要治療的哺乳動物的藥物組合物和方法，包括給予治療有效量的含有本發(fā)明的一種或多種趨化因子或其可以藥用的鹽的化合物。“可以藥用的鹽”表示這樣的鹽，它保留了本發(fā)明多肽的生物學(xué)作用和特性，并且它在生物學(xué)方面或其他方面不是不理想的。所述鹽可以源于酸或堿。酸加成鹽來自無機(jī)酸，如氫氯酸、氫溴酸、硫酸(產(chǎn)生硫酸鹽和亞硫酸鹽)、硝酸、和磷酸等，以及有機(jī)酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、水楊酸、和p-對甲苯磺酸等。堿加成鹽可源于無機(jī)堿，包括鈉、鉀、鋰、銨、鈣、和錳鹽等。源于有機(jī)堿的鹽包括由伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺形成的鹽，包括天然存在的取代胺、和環(huán)化胺，包括異丙基胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、hydrabamine、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、和N-乙基哌啶等。優(yōu)選的有機(jī)堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、可可堿、和膽堿。
本文所使用的術(shù)語“治療”包括對哺乳動物特別是人的疾病的任何治療，并且包括(i)防止有患病的傾向但尚未診斷出患病的對象發(fā)病；(ii)抑制所述疾病，即阻止其發(fā)展；或(iii)緩解所述疾病，即導(dǎo)致所述疾病的恢復(fù)。
在本文中，術(shù)語“通過用本發(fā)明的生物活性合成趨化因子的治療而預(yù)防或緩解的哺乳動物疾病狀態(tài)”意在包括本領(lǐng)域普遍公知的所有疾病狀態(tài)，一般，這些疾病狀態(tài)可以用本發(fā)明的生物活性合成趨化因子治療，以及可以通過用本發(fā)明的特殊化合物治療而預(yù)防或緩解的疾病狀態(tài)。例如，所述疾病狀態(tài)包括，但不限于哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、粉瘤/動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和器官移植排斥。
在本文中，術(shù)語“治療有效量”表示在給予有需要的哺乳動物本發(fā)明的生物活性合成趨化因子時(shí)足以實(shí)施治療(如上文所定義的)的用量，例如，作為抗炎劑，抗哮喘制劑，免疫抑制劑，或抗自身免疫病制劑抑制哺乳動物的病毒感染。構(gòu)成“治療有效量”的用量會根據(jù)趨化因子衍生物、疾病狀態(tài)和嚴(yán)重程度、以及接受治療的哺乳動物，其體重、年齡等而變化，不過，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有的知識和本說明書通過常規(guī)方法確定治療有效量。在本文中，術(shù)語“q.s.”表示添加足以實(shí)現(xiàn)所聲稱的功能的用量，例如，將溶液調(diào)整到所需要的體積(例如，100毫升)。
本發(fā)明的趨化因子及其可以藥用的鹽，即活性成分是以治療有效劑量給藥的，即在給予有需要的哺乳動物時(shí)，這一用量足以實(shí)現(xiàn)上文所述的治療。本發(fā)明所披露的生物活性合成趨化因子的給藥可以通過起著類似作用的制劑的任何可接受的給藥方式進(jìn)行。在本文中，“本發(fā)明的生物活性合成趨化因子”、“本發(fā)明多肽的可以藥用的鹽”和“活性成分”可以交換使用。
本發(fā)明的生物活性合成趨化因子在一種制劑中的含量可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員所采用的整個(gè)范圍內(nèi)，例如，以總的制劑為基礎(chǔ)本發(fā)明的生物活性合成趨化因子的含量為大約0.01％至大約99.99％w，并且含有大約0.01％至大約99.99％w的賦形劑。更常見的是，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子的用量為大約0.5％-大約80％w。
盡管本發(fā)明生物活性合成趨化因子的人類劑量水平尚有待優(yōu)化，一般，每天的劑量為大約0.05-25毫克/千克體重/天，最優(yōu)選大約0.01-10毫克/千克體重/天。因此，在對70千克體重的人給藥時(shí)，劑量范圍為大約0.07毫克-3.5克/天，優(yōu)選3.5毫克-1.75克/天，最優(yōu)選大約0.7毫克-0.7克/天。當(dāng)然，拮抗劑的給藥量取決于接受治療的對象和要預(yù)防或緩解的疾病狀態(tài)，疾病的性質(zhì)或嚴(yán)重程度，給藥的方式和方案，以及處方醫(yī)生的判斷。這種用量的優(yōu)化屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識范圍。
給藥可以通過任何可以接受的全身或局部途徑進(jìn)行，例如，通過腸胃外、口服(特別適合嬰兒制劑)、靜脈內(nèi)、鼻腔、氣管吸入(即氣溶膠制劑)、經(jīng)皮或局部途徑，呈固體形式、半固體或液體或氣溶膠劑型，例如，片劑、丸劑、膠囊、粉劑、液體、溶液、乳液、可注射液體、懸浮液、栓劑、或氣溶膠等。本發(fā)明的生物活性合成趨化因子還可以以持續(xù)的或受控制的釋放劑型給藥，包括儲存注射液、滲透壓泵、丸劑、和經(jīng)皮(包括電轉(zhuǎn)移)貼劑等，以便以預(yù)定的速度長時(shí)間給予所述多肽，優(yōu)選以適合一次給予精確劑量的單位劑型給藥。所述組合物可以包含常規(guī)藥用載體或賦形劑以及本發(fā)明的生物活性合成趨化因子，此外，還可以包含其他醫(yī)用制劑、藥用制劑、載體、佐劑等。載體可以選自各種油類，包括石油、動物、植物、或合成來源的油類，例如，花生油、大豆油、礦物油、和芝麻油等。水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油是優(yōu)選的液體載體，特別適用于可注射的溶液。合適的藥用載體包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅凝膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、硬脂酸單甘油酯、氯化鈉、干燥的脫脂奶、甘油、丙二醇、水和乙醇等。其他合適的藥用載體及其制劑由E.W.Martin披露于“Remington’sPharmaceutical Sciences”中。
如果需要，所給予的藥用組合物還可以含有少量的無毒的輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑，以及pH緩沖劑等，例如，乙酸鈉、一月桂酸山梨聚糖、油酸三乙醇胺等。
盡管可能需要更多的活性成分，可以通過口服遞送本發(fā)明的生物活性合成趨化因子，使用常規(guī)的每日劑量方案，該劑量方案可以根據(jù)所需要的預(yù)防程度或疾病的緩解而調(diào)整。對于所述口服方案來說，可以通過摻入任何常用的賦形劑制備無毒組合物，例如，藥用級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、聚維酮、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、葡萄糖、明膠、蔗糖、和碳酸鎂等。所述制劑可采用溶液、懸浮液、可分散的片劑、丸劑、膠囊、粉末、和緩釋制劑等形式?？诜苿┨貏e適用于治療胃腸道疾病。通過采用能改善全身循環(huán)吸收的賦形劑可以調(diào)整為了一般全身目的的口服生物利用度，如含有乙酰化氨基酸的制劑。例如，參見US5935601和US5629020。
所述組合物可以采用膠囊、丸劑或片劑形式，因此，該組合物除了活性成分之外可以包括稀釋劑，如乳糖、蔗糖、和磷酸氫鈣等；分散劑，如交聯(lián)羧甲纖維素鈉、淀粉或其衍生物；諸如硬脂酸鎂之類的潤滑劑；以及粘接劑，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、金合歡膠、明膠、纖維素及其衍生物等。
例如，可以通過將本發(fā)明的生物活性合成趨化因子(大約0.5％-大約20％)和任選性的藥用佐劑溶解或分散在諸如水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇和防腐劑之類的載體中，以便形成液體或懸浮液，從而制備可以藥用的液體組合物。如果需要，被服用的藥用組合物還可以含有少量的無毒輔助物質(zhì)，如潤濕劑、懸浮劑、乳化劑或增溶劑、和pH緩沖劑等。例如，乙酸鈉、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、聚環(huán)氧乙烷、山梨聚糖一月桂酸酯或硬脂酸酯等。制備所述劑量形式的實(shí)際方法是公知的或者對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的；例如，參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvain。在任何情況下，所給予的組合物或制劑都含有一定量的活性成分，其用量能有效防止或緩解接受治療的對象的癥狀。為了給嬰兒服用，優(yōu)選液體制劑(如糖漿或懸浮液)。
對于含有液體的固體劑型來說，優(yōu)選將包含在諸如丙二醇碳酸酯、植物油或甘油三酯中的溶液或懸浮液膠囊化于明膠膠囊中。對于液體劑型來說，可以用足夠數(shù)量的諸如水的可以藥用的液體載體稀釋用諸如聚乙二醇制備的溶液，以便定量給藥。
另外，可以通過將活性成分溶解和分散在植物油、乙二醇、甘油三酯、聚丙二醇酯(例如丙二醇碳酸酯)等中制備液體或半固體形式的口服制劑，并且將所述溶液或懸浮液膠囊化于硬的或柔軟的明膠膠囊外殼中。
在將本發(fā)明的生物活性合成趨化因子用于治療上述癥狀時(shí)，本文所披露的活性成分的給藥優(yōu)選是通過腸胃外途徑給藥的。通常，腸胃外給藥的特征是注射，包括皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，并且可以包括皮內(nèi)或腹膜內(nèi)注射以及胸骨內(nèi)注射或輸液技術(shù)。注射液可以用常規(guī)方式制備，可以制成液體溶液或懸浮液形式，適合在注射之前在液體中溶解成溶液或懸浮液的固體形式，乳液或生物相容性聚合物基的微球(例如，脂質(zhì)體、聚乙二醇衍生物、聚(D，C)丙交酯等)。合適的賦形劑有，例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、或乙醇等。另外，如果需要，所給予的藥用組合物還可以含有少量的無毒輔佐物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、增溶劑、和蛋白載體等，例如，乙酸鈉、聚環(huán)氧乙烷、山梨聚糖單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、環(huán)糊精、血清白蛋白等。
本發(fā)明的生物活性合成趨化因子可以通過腸胃外途徑服用，例如，將所述分子溶解在合適的溶劑(如水或鹽水)中，或者摻入脂質(zhì)體制劑中，然后分散到可接受的輸液流體中。本發(fā)明多肽的典型的每日劑量可以通過一次輸液給藥，或者通過間隔一定時(shí)間的一系列輸液給藥。對于腸胃外給藥來說，具有可水溶形式的特別適合的活性成分的水溶液，例如，水溶性鹽形式，或含有增粘物質(zhì)的含水注射懸浮液，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖，并且如果需要的話含有穩(wěn)定劑。所述活性成分以及任選包括的賦形劑還可以是冷凍干燥物的形式，并且在腸胃外服用之前通過添加合適的溶劑制成溶液。
最近設(shè)計(jì)的腸胃外給藥的方法采用了植入緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)，以便保持穩(wěn)定水平的劑量。例如，參見US3710795，US5714166和US5041292，以上文獻(xiàn)被收作本文參考。
所述腸胃外組合物中所含的活性成分的百分比在很大程度上取決于它的特定性質(zhì)，以及所述多肽的活性和受治對象的需要。不過，活性成分在溶液中0.01％-10％的百分比是可以采用的，并且，如果該組合物是固體的話百分比可以更高。然后再將它稀釋到上述百分比。所述組合物在溶液中優(yōu)選含有0.02-8％的活性成分。
給予本發(fā)明生物活性合成趨化因子的另一種方法采用了藥團(tuán)注射或連續(xù)輸液方法。當(dāng)治療性處理是為了預(yù)防HIV-1感染時(shí)，這是特別優(yōu)選的方法。
氣溶膠給藥是將本發(fā)明的生物活性合成趨化因子直接輸送到呼吸道中的一種有效方法。這種方法的某些優(yōu)點(diǎn)是1)它避免了酶促降解作用，腸胃道的不良吸收，或由于肝臟首次通過效應(yīng)而導(dǎo)致的治療劑的損失；2)它可以給予那些通過其他方式給藥不能達(dá)到呼吸道的靶位點(diǎn)的活性成分，這是由于這種活性成分的分子大小、電荷或與肺以外的部位的親和力而造成的；3)它可以通過肺的肺泡將活性成分快速吸收到體內(nèi)；和4)它避免了讓其他器官系統(tǒng)接觸所述活性成分，當(dāng)這種接觸會導(dǎo)致不理想的副作用時(shí)是特別重要的。由于以上原因，氣溶膠給藥特別有利于治療哮喘、肺的局部感染、和肺和呼吸道的其他疾病或疾病狀態(tài)。
有三種類型的藥物吸入裝置，噴霧吸入器、定量吸入器和干粉吸入器。噴霧裝置能產(chǎn)生高速空氣流，它能導(dǎo)致趨化因子衍生物(業(yè)已制成液體形式)以霧狀形式噴射，它被攜帶到患者呼吸道中。定量吸入器通常具有由壓縮氣體包裝的制劑，在驅(qū)動時(shí)，通過壓縮氣體排除一定量的多肽，因此提供了一種服用定量制劑的可靠方法。干粉吸入器以自由流動的粉末形式服用所述多肽，在呼吸期間可以通過該裝置將粉末分散在患者吸入的空氣流中。為了獲得自由流動的粉末，用諸如乳糖的賦形劑配制趨化因子衍生物。將一定量的趨化因子衍生物儲存在膠囊形式中，并且通過每一次動作分散給患者。上述所有方法都可用于服用本發(fā)明的趨化因子。
基于脂質(zhì)體的藥用制劑也適用于本發(fā)明的趨化因子。例如，參見US5631018、US5723147和US5766627。據(jù)信，脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)是與組織分布和藥代動力學(xué)參數(shù)的有利變化相關(guān)，這種有利變化是由于脂質(zhì)體對藥物的捕獲而導(dǎo)致的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可將其用于本發(fā)明的多肽。還可以使用用于注射或口服的控制釋放脂質(zhì)體液體藥用制劑。
對于通過栓劑全身給藥來說，傳統(tǒng)的粘接劑和載體包括，例如聚乙二醇或甘油三酯，例如PEG1000(96％)和PEG4000(4％)。所述栓劑可以用含有活性成分的混合物制成，活性成分的含量為大約0.5％至大約10％(w/w)；優(yōu)選大約1％至大約2％(w/w)。
如上文所述，以及如下面的特定實(shí)施例中所進(jìn)一步說明的，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子可用作天然存在的趨化因子的拮抗劑。具體地講，本發(fā)明的生物活性合成趨化因子作為拮抗劑具有增強(qiáng)了的效力，可用于各種疾病狀態(tài)的分析和治療，如哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、病毒性疾病、粉瘤/動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和器官移植排斥。還可將本發(fā)明的生物活性合成趨化因子用于設(shè)計(jì)并篩選其關(guān)聯(lián)受體的小分子拮抗劑，例如，通過工程方法產(chǎn)生的本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)多樣性位于更合理的設(shè)計(jì)、篩選、和微調(diào)更好的小分子化合物，以便用作治療與趨化因子受體的天然活性相關(guān)的疾病的藥物。實(shí)施例提供下面的制劑和例子是為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更清楚地理解并且實(shí)施本發(fā)明，不應(yīng)當(dāng)將這些例子視為對本發(fā)明范圍的限定，而僅僅是作為對本發(fā)明的說明和代表。
縮略語DIEA 二異丙基乙胺DMF N，N-二甲基甲酰胺DNP 2，4-二硝基苯基GuHCl 鹽酸胍HBTU O-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-uronium六氟代磷酸鹽HF氟化氫TFA 三氟乙酸Aib 氨基異丁酸Hyp 羥基脯氨酸Tic 1，2，3，4-四氫異喹啉-3-COOHIndol 二氫吲哚-2-羧酸P(4，4DiF)4-二氟脯氨酸Thz L-噻唑烷-4-羧酸Hop L-高脯氨酸ΔPro 3，4-脫氫脯氨酸F(3，4-DiOH) 3，4二羥基苯丙氨酸F(3，4-DiOH，pBz1)pBc1，-3，4二羥基苯丙氨酸p-Bz 二苯酮Cha 環(huán)己基丙氨酸βNal 3-(2-萘基)丙氨酸Chg 環(huán)己基甘氨酸Phg 苯基甘氨酸HoF 高苯丙氨酸F(F)5 五氟苯丙氨酸t(yī)BuA 叔丁基丙氨酸F(4-Me) 4-甲基苯丙氨酸t(yī)L 叔亮氨酸CycP 1-氨基-1-環(huán)戊烷羧酸CycH 1-氨基-1-環(huán)己烷羧酸Nle 正亮氨酸氨基氧戊烷-RANTES(2-68) AOP-RANTESn-壬?；?RANTES(2-68)NNY-RANTES實(shí)施例1本發(fā)明趨化因子的通用合成方法本發(fā)明的生物活性合成趨化因子的肽是通過固相肽合成制備的。固相肽合成是在購自Applied Biosystems的專門改進(jìn)的430A肽合成儀上進(jìn)行的，采用原位中和/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基uronium六氟代磷酸鹽激活方法，實(shí)現(xiàn)逐步Boc化學(xué)鏈延伸(Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，1992，40180-192)。N-末端肽片段是在硫酯產(chǎn)生樹脂上合成的。在研究位點(diǎn)之前的殘基連接之后(從C到N-末端延伸)裂解所述樹脂，并且所述肽是以0.03mM的規(guī)模人工延伸的。每一個(gè)合成循環(huán)包括用純的TFA處理1-2分鐘除去Nα-Boc，用DMF沖洗1分鐘，在存在過量DIEA的條件下用1.0mM的預(yù)先激活的Boc-氨基酸偶合10-20分鐘，并用DMF進(jìn)行第二次沖洗。在存在過量DIEA(3mM)的條件下用1mM HBTU(0.5M，溶解在DMF中)將Nα-Boc-氨基酸(1.1mM)預(yù)先激活3分鐘。在每一個(gè)人工偶合步驟之后，通過茚三酮測定評估殘余的游離胺(Satin等，Anal.Biochem.，1981，117147-157)。在標(biāo)準(zhǔn)-O-CH2-苯乙酰胺甲基樹脂上合成包括氨基酸的C-末端。在鏈組裝完成之后，通過用5％對甲酚作清除劑用無水氟化氫在0℃下處理1小時(shí)對所述肽進(jìn)行脫保護(hù)并且從樹脂上裂解下來。在所有場合下，咪唑側(cè)鏈TNP保護(hù)基團(tuán)都保留在His殘基上，因?yàn)镈NP-去除方法與C-末端硫酯基團(tuán)不相容。不過，在連接反應(yīng)中，DNP逐漸被硫醇消除，產(chǎn)生了未保護(hù)的His。在裂解之后，用冰鎮(zhèn)的二乙醚沉淀這兩種肽，溶解在乙腈水溶液中，并且冷凍干燥。通過RP-HPLC，使用Waters公司的C18-柱，采用線性梯度的用緩沖液A(水/0.1％三氟乙酸)配置的緩沖液B(乙腈/10％水/0.1％三氟乙酸)純化所述肽，并且在214nm的波長下進(jìn)行UV檢測。用PlatformII儀器(Micromass，Manchester，England)通過電子噴射質(zhì)譜法分析樣品。將肽用于連接，通過天然化學(xué)連接制備全長的趨化因子多肽鏈(Dawson等，Science，1994，266776-779；Wilken等，Chem.Biol.，1999，643-51；和Camarero等，Current Protocolsin Protein Science，1999，18.4.1-18.4.21)。多肽鏈的折疊是在存在Cys-SH/(Cys-S)2的條件下通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成的(Wilken等，Chem.Biol.，1999，643-51)。實(shí)施例2合成NNY-RANTES、AOP-RANTES和SDF-1的N-、C-和N-/C-末端類似物按照實(shí)施例1所述方法制備RANTES類似物(1-68)和SDF-1β類似物(1-72)，并且在本文中用于說明制備本發(fā)明的CC和CXC趨化因子的一般方法。具體地講，N-、C-和N-/C-末端修飾的RANTES類似物是基于對趨化因子化合物CH3-(CH2)7-CHO-RANTES(2-68)(又被稱為n-壬酰-RANTES(2-68)或“NNY-RANTES”)進(jìn)行修飾，以及對趨化因子化合物CH3-(CH2)4-O-N＝CH-CO-RANTES(2-68)(又被稱為氨基氧戊烷RANTES或“AOP-RANTES”)進(jìn)行的修飾。在WO99/11666中披露用于這一目的的NNY-RANTES、AOP-RANTES和其他RANTES衍生分子，該文獻(xiàn)被收作本文參考。使用為了RANTES類似物而設(shè)計(jì)的相同的基本設(shè)計(jì)方法制備SDF-1的N-、C-和N-/C-末端類似物。
為了進(jìn)行對靶趨化因子進(jìn)行N-末端修飾，如對RANTES進(jìn)行的NNY和AOP修飾，按上述方法以及在WO99/11666和Wilken等，Chem.Biol.，1999，643-51中所披露的方法制備化學(xué)變體，在樹脂上對N-末端肽片段進(jìn)行修飾，以便用于連接產(chǎn)生側(cè)面N-末端修飾(例如NNY或AOP)，然后進(jìn)行裂解/脫保護(hù)，純化，并且在天然化學(xué)連接中使用未保護(hù)的N-末端修飾的肽α-硫酯，將其連接到C-末端肽片段上形成完整的產(chǎn)物。合成肽，在實(shí)施例1所述的肽合成期間摻入氨基酸取代，包括氨基酸衍生物。利用實(shí)施例1披露的天然化學(xué)連接制備線性產(chǎn)物，對于RANTES類似物來說，連接是在Lys31-Cys32位點(diǎn)上進(jìn)行的，而對于SDF-1類似物來說，連接是在Asn33-Cys34位點(diǎn)上進(jìn)行的。將等摩爾量的肽片段(2-2.5mM)溶解在6M GuHCl，100mM磷酸，pH7.5，1％芐基巰基乙醇和3％硫代苯酚中。所述反應(yīng)通常進(jìn)行一夜。按上述肽片段的純化和分析方法純化和分析所得到的多肽產(chǎn)物。為了制備折疊的蛋白，將NNY-RANTES的純化多肽鏈(大約0.5-1毫克/毫升)溶解在含有8mM半胱氨酸，1mM胱氨酸和10mM甲硫氨酸的2MGuHCl，100mM Tris，pH8.0中。在輕柔攪拌過夜之后，按上述方法通過RP-HPLC純化蛋白溶液。對于SDF-1類似物來說，采用其他折疊條件在室溫下，在存在空氣的條件下，在1M GuHCl，0.1M Tris，pH8.5中以0.5毫克/毫升的濃度氧化SDF-1和Met0-SDF-1。在攪拌過夜之后完成折疊。在相同的緩沖液中氧化AOP-、己?；?和NNY-SDF-1，不過是在存在2M M GuHCl的條件下進(jìn)行的。
為了將脂肪酸化學(xué)結(jié)合在特定的折疊蛋白上，采用兩個(gè)基本步驟。首先，通過氨基氧基將脂肪酸官能化。其次，將活性羰基基團(tuán)特異性導(dǎo)入該蛋白的羧基末端結(jié)構(gòu)域，該部位被認(rèn)為對于趨化因子的活性不重要。為此，通過C-末端Lys(Ser)Gly序列延伸合成了用于C-末端脂肪酸修飾的趨化因子類似物。因此，舉例來說，合成了NNY-RANTES(2-68)，以便在C-末端包括Lys(Ser)Gly序列延伸。通過用NaIO4處理重新折疊的蛋白產(chǎn)生活性羰基基團(tuán)，從而使得脂肪酸部分能夠通過穩(wěn)定的肟鍵進(jìn)行位點(diǎn)特異性連接。
對于脂肪酸官能化來說，在0.5毫升DMF/DCM混合物(1∶1，v∶v)中用等摩爾數(shù)量的DCC和HOAt激活0.2mM的脂肪酸(棕櫚酸、油酸、花生酸、膽酸)，并且添加到0.25mM Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2的0.5毫升DMF溶液中，并且用N-乙基嗎啉將表觀pH調(diào)整到pH8.0。在培養(yǎng)過夜之后在真空條件下除去揮發(fā)性物質(zhì)，通過快速層析或通過在C4柱上進(jìn)行制備HPLC分離產(chǎn)物。通過TFA處理除去Boc基團(tuán)，并且通過ESI-MS證實(shí)產(chǎn)物。
為了進(jìn)行蛋白氧化，將靶蛋白(2毫克/毫升)溶解在含有6M鹽酸胍的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中，并且添加甲硫氨酸使清除劑的摩爾數(shù)超過蛋白100倍。然后添加10倍過量的高碘酸鈉，并且在黑暗中將該溶液培養(yǎng)10分鐘。通過添加摩爾數(shù)超過高碘酸鈉1000倍的乙二醇終止該反應(yīng)，并且在室溫下將該溶液再培養(yǎng)15分鐘。然后用0.1％的乙酸透析該溶液，并最后進(jìn)行冷凍干燥。例如，C-末端側(cè)鏈絲氨酸的氧化被證實(shí)幾乎都是通過ESI-MS定量的，對于AOP-RANTES-K(S)G，獲得了8141.1±0.7Da的質(zhì)量，相當(dāng)于損失了31Da，以便形成乙醛酰衍生物，并且沒有觀察到相當(dāng)于原料的質(zhì)量的峰值。
脂肪酸與所述趨化因子的結(jié)合是在存在0.1％十二烷基肌氨酸鈉，20mM甲硫氨酸和超過蛋白20倍的功能化脂肪酸的條件下在0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.3中進(jìn)行的。在37℃下攪拌6-20小時(shí)之后，通過在脂肪酸的氨基-氧基團(tuán)和趨化因子醛之間形成的肟鍵產(chǎn)生的結(jié)合物用反向HPLC純化，并且通過ESI-MS鑒定該產(chǎn)物。對于所有類似物來說，氨基氧官能化脂肪酸與氧化蛋白的結(jié)合幾乎都是通過分析HPLC定量的。實(shí)施例3NNY和AOP-RANTES的N-末端類似物對于N-末端RANTES衍生物來說，對相當(dāng)于NNY-RANTES(2-68)或AOP-RANTES(2-68)的前8個(gè)氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的N-末端區(qū)進(jìn)行修飾，所述前8個(gè)氨基酸殘基的序列為-PYSSDTTP-。該序列相當(dāng)于圖10A-10D中所示出的野生型RANTES多肽鏈(即RANTES(1-68))的68個(gè)氨基酸殘基中的2-9號氨基酸殘基，因?yàn)樘烊淮嬖诘腞ANTES(1-68)的第一個(gè)殘基(Ser)被NNY-RANTES(2-68)中的n-壬酰取代基和AOP-RANTES(2-68)中的氨基氧戊烷所取代。因此，舉例來說，在NNY-RANTES(2-68)上的2號氨基酸位置上的取代可以用下面的通用化合物結(jié)構(gòu)式表示“NNY-P2X-RANTES(3-68)”，其中，NNY是n-壬?；?，X是用于取代NNY-RANTES(2-68)的2號位置上的脯氨酸(P)的氨基酸，而RANTES(3-68)表示NNY-RANTES(2-68)的其余66個(gè)氨基酸，閱讀方向?yàn)閺腘-末端到C-末端。作為另一種例子，對NNY-RANTES(2-68)上的3號位置的氨基酸的取代可以用以下通用化合物結(jié)構(gòu)式表示“NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)”，其中，NNY是n-壬?；?，X是用于取代NNY-RANTES(2-68)的3號位置上的酪氨酸(Y)的氨基酸，而RANTES(4-68)表示NNY-RANTES(2-68)的其余65個(gè)氨基酸，閱讀方向?yàn)閺腘-末端到C-末端。對于多次取代的NNY-RANTES類似物來說，下面的在NNY-RANTES(2-68)的2、3和9號氨基酸位置上進(jìn)行的3次取代的化合物結(jié)構(gòu)式可以通過以下通用化合物結(jié)構(gòu)式表示NNY-P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)；其中，NNY是n-壬?；?，X是取代NNY-RANTES(2-68)上的2號位置上的脯氨酸(P)，3號位置上的酪氨酸(Y)和9號位置上的脯氨酸(P)的相同或不同的氨基酸，SSDTT相當(dāng)于NNY-RANTES(2-68)的4-8號氨基酸，而RANTES(10-68)表示NNY-RANTES(2-68)的其余59個(gè)氨基酸，閱讀方向?yàn)閺腘-末端到C-末端。
下面是所制備的NNY-P2X-RANTES(3-68)類似物的例子。
化合物編號NNY-P2Aib-RANTES(3-68) 1NNY-P2Hyp-RANTES(3-68) 2NNY-P2Tic-RANTES(3-68) 3NNY-P2Indol-RANTES(3-68) 4NNY-P2P(4，4DiF)-RANTES(3-68)5NNY-P2Thz-RANTES(3-68) 6NNY-P2HoP-RANTES(3-68) 7NNY-P2ΔPro-RANTES(3-68) 8NNY-P2A-RANTES(3-68) 9下面是制備的NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)類似物的例子。
化合物編號NNY-P-Y3P-RANTES(4-68) 10NNY-P-Y3A-RANTES(4-68) 11NNY-P-Y3L-RANTES(4-68) 12NNY-P-Y3V-RANTES(4-68) 13NNY-P-Y3F(3，4-DiOH)-RANTES(4-68)14NNY-P-Y3F(3，4-DiOH，pBz1)-RANTES(4-68) 15NNY-P-Y3pBz-RANTES(4-68) 16NNY-P-Y3Cha-RANTES(4-68) 17NNY-P-Y3βNal-RANTES(4-68) 18NNY-P-Y3Chg-RANTES(4-68) 19NNY-P-Y3Phg-RANTES(4-68) 20
NNY-P-Y3Hof-RANTES(4-68) 21NNY-P-Y3F(F)5-RANTES(4-68) 22NNY-P-Y3tbuA-RANTES(4-68) 23NNY-P-Y3F(4-Me)-RANTES(4-68) 24NNY-P-Y3tL-RANTES(4-68)25NNY-P-Y3CycP-RANTES(4-68) 26NNY-P-Y3CycH-RANTES(4-68) 27NNY-P-Y3Nle-RANTES(4-68) 28下面是制備的NNY-PY-S4X-RANTES(5-68)類似物的例子。
化合物NNY-PY-S4A-RANTES(5-68)29NNY-PY-S4tbuA-RANTES(5-68) 30下面是制備的NNY-PYS-S5X-RANTES(6-68)類似物的例子。
化合物編號NNY-PYS-S5tbuA-RANTES(6-68)31下面是制備的NNY-PYSS-D6X-RANTES(7-68)類似物的例子。
化合物編號NNY-PYSS-D6tbuA-RANTES(7-68) 32下面是制備的NNY-PYSSD-T7X-RANTES(8-68)類似物的例子。
化合物編號NNY-PYSSD-T7tbuA-RANTES(8-68) 33下面是制備的NNY-PYSSDT-T8X-RANTES(9-68)類似物的例子。
化合物編號NNY-PYSSDT-T8tBuA-RANTES(9-68) 34下面是制備的NNY-PYSSDTT-P9X-RANTES類似物的例子。
化合物編號NNY-PYSSDTT-P9Hyp-RANTES(10-68) 35NNY-PYSSDTT-P9Aib-RANTES(10-68) 36NNY-PYSSDTT-P9ΔPro-RANTES(10-68) 37NNY-PYSSDTT-P9Thz-RANTES(10-68) 38以下化合物是所制備的雙取代的類似物NNY-P2X-Y3X-RANTES(4-68)和三取代的類似物NNY-P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)的例子化合物編號NNY-P2Hyp-Y3tButA-RANTES(4-68)39NNY-P2Thz-Y3tButA-RANTES(4-68)40NNY-P2Hyp-Y3Chg-RANTES(4-68) 41NNY-P2Thz-Y3Chg-RANTES(4-68) 42NNY-P2Thz-Y3Chg-SSDTT-P9Aib-RANTES(10-68) 43實(shí)施例4NNY-RANTES的N-末端、N-環(huán)類似物下面是用于說明其他NNY-取代的RANTES類似物的，其中，對N-環(huán)(RANTES的12-20號殘基)進(jìn)行修飾，以便增強(qiáng)針對CCY5的效力，而不影響通過CCY1和CCY3進(jìn)行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
對于N-末端、N-環(huán)RANTES類似物來說，對NNY-RANTES(2-68)的N-環(huán)進(jìn)行修飾，其中，所述N-環(huán)相當(dāng)于12-20號氨基酸。RANTES的N-環(huán)的氨基酸序列為-FAYIARPLP-(SEQ ID NO29)，因此，舉例來說，對NNY-RANTES(2-68)的12號位置上的氨基酸的取代具有以下通用化合物結(jié)構(gòu)式“NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68)”，其中，NNY是n-壬?；?，PYSSDTTPCC相當(dāng)于RANTES(1-68)的2-11號氨基酸，F(xiàn)12pBz表示用于取代RANTES(1-68)的12號位置上的苯丙氨酸(F)的氨基酸衍生物pBz，而RANTES(13-68)表示RANTES(1-68)的其余13-68號氨基酸殘基，閱讀方向?yàn)閺腘-末端到C-末端。
化合物編號NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68)44NNY-PYSSDTTPCC-F12Y-RNTES(13-68) 45NNY-PYSSDTTPCC-F12F(4-Me)-RANTES(13-68)46NNY-PYSSDTTPCC-F12(4-F)-RANTES(13-68) 47NNY-PYSSDTTPCCF-A13R-RANTES(14-68) 48NNY-PYSSDTTPCCF-A13S-RANTES(14-68) 49NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14F-RANTES(15-68)50NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14Cha-RANTES(15-68) 51NNY-PYSSDTTPCCFAY-I15tBuA-RANTES(16-68)52NNY-PYSSDTTPCCFAY-Il5S-RANTES(16-68) 53NNY-PYSSDTTPCCFAYI-A16S-RANTES(17-68) 54NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17A-RANTES(18-68) 55NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17H-RANTES(18-68) 56NNY-PYSSDTTPCCFAYAR-P18Thz-RANTES(19-68) 57NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19I-RANTES(20-68)58NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19Cha-RANTES(20-68) 59NNY-PYSSDTTPCCFAYARPL-P20Thz-RANTES(21-68) 60實(shí)施例5NNY-RANTES的N-末端RANTES類似物以下化合物是用于說明其他NNY-取代的-RANTES類似物的，其中，不同的疏水性脂族鏈被用于代替NNY取代基。
化合物編號CH2＝CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-RANTES(2-68) 61Nle-Met-RANTES(1-68) 62
化合物編號Dodecanoyl-RANTES(3-68)63月桂酰-Hyp-RANTES(3-68)64化合物編號肉豆蔻酰-RANTES(4-68) 65十二烷酰-Hyp-RANTES(4-68) 66實(shí)施例6NNY-和AOP-RANTES的C-末端和N/C-末端類似物制備了具有Lys-Gly C-末端延伸部分的AOP-和NNY-RANTES，Lys的ε氨基被絲氨酸殘基?；?。在對絲氨酸延伸部分進(jìn)行高碘酸鹽氧化之后，將衍生物與氨基氧乙酰基官能化的化合物結(jié)合，包括熒光團(tuán)(FITC、NBD、Ncy-5和BODIPY-F1)或脂類。這種C-末端標(biāo)記過的趨化因子保留了它的生物學(xué)特性，并且引入了諸如CH3-(CH2)14-CONH-(CH2)2-NHCO-CH2-O-NH2的脂族部分，業(yè)已證實(shí)該部分能提高該趨化因子的效力。為了尋找最有效的化合物，通過與Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2，隨后是除去了Boc的月桂酸、棕櫚酸、油酸、花生酸、膽酸和膽甾醇氯甲酸酯偶合，用氨基氧基團(tuán)對不同的脂肪酸和脂類進(jìn)行官能化。將所述一種或多種衍生物與氧化的NNY-RANTES-K(S)G或AOP-RANTES-K(S)G結(jié)合，其中，AOP類似物的例子如下化合物編號AOP-PANTES-K(月桂酰)-G67其中“(月桂酰)”是縮略語，表示乙醛酰＝AOA-乙二胺，月桂酸酯等AOP-PANTES-K(棕櫚酰)-G68AOP-PANTES-K(花生酰)-G69AOP-PANTES-K(油酰)-G 70AOP-PANTES-K(膽酰)-G 71AOP-PANTES-K(阻甾烯基)-G 72還可以通過另一種方法制備所述脂類部分的化學(xué)變體。所述化合物是通過在樹脂上對C-末端片段進(jìn)行修飾合成的，包括在裂解之前將脂肪酸連接在Fmoc脫保護(hù)的Boc-肽-Lys-Gly-樹脂上，純化并用于化學(xué)連接，以便形成全長的多肽。
在設(shè)計(jì)所述化合物時(shí)，采用脂類偶合有兩個(gè)主要原因。首先，現(xiàn)在有越來越多的證據(jù)表明RANTES化合物的抗HIV-1抑制活性與下調(diào)受體的能力相關(guān)。這意味著一旦將配體-受體復(fù)合物內(nèi)化，正常情況下它在早期內(nèi)體中發(fā)生解離，受體的再循環(huán)還可以與質(zhì)膜或某些細(xì)胞質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白相互作用。因此，對受體進(jìn)行的脂類修飾可以簡單地通過疏水性相互作用將所述復(fù)合物重新導(dǎo)向到特定細(xì)胞內(nèi)亞結(jié)構(gòu)域，并因此推遲所述受體的再循環(huán)。有一些涉及到細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸?shù)淖钚碌奈恼轮С诌@樣的觀點(diǎn)，即酰化是增強(qiáng)蛋白對洗滌劑抗性膜的親和力的共同機(jī)制，并且可能是不跨膜的蛋白的主要導(dǎo)向機(jī)制(例如參見Melkonian等，J.Biol.Chem.，1999，2743910-3917；Zlatkine等，J.Cell Sci.，1997，110673-679；Zhan等，CancerImmunol.Immunother.1998，4655-60)。其次，還可以進(jìn)行修飾，以便改變所述化合物的藥代動力學(xué)特性。有一些最新的論文支持這一觀點(diǎn)(例如，參見Honeycutt等，Pharm.Res.，1996，131373-1377；Kurtzhals等，J.Pharm.Sci.，1997，861365-1368；Markussen等，Diabetologia，1996，39281-288)。
正如在下面的例子中所證實(shí)的，活性的增強(qiáng)是另人吃驚的和出乎預(yù)料的，因?yàn)樗鲂揎椀哪康氖菫榱烁淖兯幋鷦恿W(xué)。希望的結(jié)果是減弱所述活性，但是所希望的藥代動力學(xué)的改善可能帶來可以接受的折衷。實(shí)施例7SDF-1β的N-末端類似物SDF-1α制備下面的N-末端SDF-1β(1-72)衍生物，以便說明制備本發(fā)明的XCX趨化因子的通用方法。舉例來說，對SDF-1β的N-末端進(jìn)行修飾，以便產(chǎn)生在N-末端具有疏水性脂族鏈的化合物。按上述方法制備RANTES化合物的還包括位于N-末端區(qū)的氨基酸衍生物和/或位于C-末端區(qū)的脂族鏈的化合物。例如，具體地講，制備并測定的合適的N-末端取代基包括，但不限于Lys、Met-Lys、己酰-Lys、CH3(CH2)7C(O)和CH3(CH2)4-O-NH-乙醛酰。下面的化合物是所制備的某些SDF-1α和SDF-1β類似物的例子。
化合物編號Lys-SDF-1(2-72) 73Met-Lys-SDF-1(2-72) 74己酰-Lys-SDF-1(2-72)75NNY-SDF-1(2-72) 76AOP-己醛酰-SDF-1(2-72) 77實(shí)施例8篩選測定通過基于HIV的測定方法篩選在實(shí)施例3-7中所制備的若干種RANTES和SDF類似物及其他類似物的拮抗劑活性，以便鑒定對使用RANTES和SDF-1的特定場合的抑制功能。一般，對所述化合物進(jìn)行初步篩選，篩選其抑制HIV被膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合能力。隨后檢測所述化合物中最有希望的化合物抑制無細(xì)胞病毒感染靶細(xì)胞系的能力。選擇這種測定方法是因?yàn)闃I(yè)已證實(shí)細(xì)胞融合測定方法和體外無細(xì)胞病毒感染測定方法可用作體內(nèi)效力的指示方法，這一點(diǎn)是在SCID小鼠模型上確定的(Mosier等，J.Virol.，1999，733544-3550)。另外，由于業(yè)已證實(shí)相對AOP-RANTES而言NNY-RANTES的抗病毒效力的增強(qiáng)是由于除了提高對CCR5的親和力以外的因素，對所述化合物在細(xì)胞融合測定中的活性進(jìn)行評估，而不是評估其對CCR5的親和力。實(shí)施例9被膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合測定利用通過工程方法改造成與具有CD4和CCR5并且含有一種受體系統(tǒng)的細(xì)胞發(fā)生病毒被膜蛋白融合的細(xì)胞測定實(shí)施例3-7中特定化合物組抑制CCR5依賴性細(xì)胞融合的能力。使用細(xì)胞系HeLa-P5L和HeLa-Env-ADA，基本上按Simmons等所披露的方法(Science，1997，276276-279)實(shí)施CCR5-向性病毒被膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合測定，以上兩種細(xì)胞系都是由M.Alizon實(shí)驗(yàn)室(巴黎)提供的。簡單地講，將HeLa-P5L細(xì)胞接種在96孔平板上(每孔104細(xì)胞，體積為100微升)。24小時(shí)之后，除去培養(yǎng)基，并且向每個(gè)孔中添加含有104HeLa-Env-ADA細(xì)胞的培養(yǎng)基和趨化因子(最終體積為200微升)。再培養(yǎng)24小時(shí)之后，用PBS洗滌細(xì)胞一次，并且在室溫下用50微升PBS/0.5％NP-40裂解15分鐘。添加50微升2×CPRG底物(10mM氯酚紅-β-D-半乳糖吡喃糖苷；120mM磷酸氫鈉，85mM磷酸二氫鈉，20mM氯化鉀，20mM硫酸鎂，和10mM β-巰基乙醇)，并且在室溫下遮光培養(yǎng)1-2小時(shí)，測定裂解物的β-半乳糖苷酶活性。然后在Labsystems微量平板讀數(shù)器上讀出575納米波長下的吸收值。通過以上值計(jì)算在每一種抑制劑濃度下的抑制百分比[100×(OD(測試)-OD(陰性對照))/(OD(陽性對照)-OD(陰性對照))]。通過融合抑制百分比與抑制劑濃度的曲線可以計(jì)算出每一種化合物的IC50值。
很顯然，相對野生型RANTES而言，測定的大部分化合物具有較大的效力。在下面的表1中示出了特定RANTES拮抗劑類似物的結(jié)果。
表1細(xì)胞-融合篩選N末端修飾的NNY-RANTES化合物編號平均相對效力19 723 740 442 2NNY-RANTES(對照) 18-25N-環(huán)修飾的NNY-RANTES化合物編號平均相對效力54 1557 1558 1359 14NNY-RANTES(對照) 18-25C末端修飾的AOP-RANTES化合物編號平均相對效力68 45AOP-RANTES(對照) 100在表1中，對于平均相對效力來說，在融合測定中IC50的絕對值在不同日子中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中有所波動，不過活性的等級級別保持穩(wěn)定。為了標(biāo)準(zhǔn)化有關(guān)結(jié)果，在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中都用AOP-RANTES作對照。因此，在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中的IC50是相對AOP-RANTES表達(dá)的，后者給出的是100的任意值。盡管相對野生型RANTES而言，所測定過的所有化合物的大部分都表現(xiàn)出較強(qiáng)的效力，不過諸如編號為19、23、40和42的化合物的某些化合物的效力是這樣的，即使是在系列稀釋的最低稀釋比例下也獲得了超過50％的抑制作用。實(shí)施例10無細(xì)胞病毒感染測定按照與被膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合測定相同的方法進(jìn)行無細(xì)胞病毒感染測定，所不同的是，在這里，被膜細(xì)胞系被活的R5向性病毒所取代。將HEK293-CCR5細(xì)胞(由T.Schwartz饋贈，哥本哈根)接種到24孔平板上(1.2×105細(xì)胞/孔)。在培養(yǎng)過夜之后，在4℃下使用12皮摩爾的[125I]MIP-1α(Amersham)和可變量的未標(biāo)記過的配體在0.5毫升的‘結(jié)合緩沖液’(50mM HEPES，pH7.4，添加了1mM氯化鈣，5mM氯化鎂，和0.5％(w/v)牛血清白蛋白)中在完整細(xì)胞上進(jìn)行競爭結(jié)合3小時(shí)。在培養(yǎng)之后，用冰冷的補(bǔ)充了0.5M氯化鈉的結(jié)合緩沖液快速洗滌細(xì)胞4次。在1毫升3M乙酸、8M尿素和2％NP-40中裂解細(xì)胞，用Beckmanγ4000閃爍記數(shù)器對裂解的材料進(jìn)行1分鐘的記數(shù)。重復(fù)進(jìn)行測定，并且IC50值是使用Prism軟件通過單相濃度抑制曲線獲得的。表2表示通過編號為19和13的化合物在初步篩選中證實(shí)的相對NNY-RANTES的效力的增強(qiáng)。
表2來自無細(xì)胞病毒感染測定的選定化合物的體外感染性數(shù)據(jù)

實(shí)施例11用抗CCR5和抗CXCR4化合物進(jìn)行聯(lián)合治療以下例子說明了聯(lián)合使用抗CCR5(例如NNY-RANTES)和抗CXCR4(例如SDF-1拮抗劑或AMD3100)對阻斷HIV感染和阻斷HIV的R5菌株向X4菌株潛在轉(zhuǎn)化的保護(hù)作用。將SCID小鼠模型用于這一目的。具體地講，用SCID小鼠測定了NNY-RANTES和AMD3100(一種小的有機(jī)分子抗X4制劑)的保護(hù)作用，按照披露于以下文獻(xiàn)中的方法繁殖人外周血白細(xì)胞并且用HIV-1刺激Mosier，Adv.Immunol.，1996，6379-125；Picchio等，J.Virol.，1997，717124-7127；Picchio等，J.Virol.，1998，722002-2009；和Offord等，WO99/11666。按照表X所示給予NNY-RANTES，并且以200毫克/毫升溶液形式使用AMD3100。除了AMD3100組之外，用R5HIV病毒進(jìn)行刺激。在聯(lián)合治療中沒有觀察到逃脫的突變，并且所有適當(dāng)處理的小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都保留無病毒狀態(tài)。這表明本發(fā)明的N-、C-和N-/C-RANTES衍生物可以與諸如AMD3100或SDF-1拮抗劑的抗X4菌株化合物聯(lián)合使用，用于抑制HIV對哺乳動物的感染，如本文所披露的。實(shí)施例12制備RANTES類似物G1755-01按以下方法合成在圖11中示出的RANTES類似物G1755-01。
1.制備AOP-[RANTES(2-33)]-硫酯序列氨基氧戊烷-咪唑基-PYSSDTTPCCFAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-硫酯(SEQ ID NO30)將RANTES(2-33)序列組裝在硫酯產(chǎn)生樹脂上(Hackeng等，PNAS，1999，9610068-10073)，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法通過將氨基氧戊烷-咪唑基肟部分[即CH3(CH2)4-O-N＝CHCOOH]直接偶合在所述樹脂上，對N-末端進(jìn)行修飾(Wilken等，Chemistry&Biology，1999Z6，143-51)，合成含有N-末端氨基氧戊烷-咪唑基肟部分(AOP)的N-末端肽片段AOP-[RANTES(2-33)]-α硫酯(硫酯又被表示為-C(O)SR)。用氫氟酸裂解所述肽樹脂，并且通過反向HPLC純化，以便產(chǎn)生α-羧基硫酯肽AOP-RANTES(2-33)-硫酯。觀察到的質(zhì)量＝4179.64Da；計(jì)算的質(zhì)量＝4178.57Da(平均同位素組成)。
2.制備[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70序列
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYINSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.31)其中，GP6結(jié)合在Lys69的εN上 a.固相肽和在{肽樹脂}上的水溶性聚合物合成通過傳統(tǒng)固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-樹脂上合成C-末端肽片段[RANTES(34-68)]-Lys69(Fmoc)-Leu70，對于Boc化學(xué)固相肽合成來說，使用Schnolzer等，Int.J.Pep.Protein Res.40180-193所披露的原位中和/HBTU激活方法。
在鏈組裝完成之后，在DMF處理中用20％的哌啶將Lys69的εN上的Fmoc基團(tuán)從受保護(hù)的肽樹脂上除去。然后在含有DIEA的DMF制備的HOBT(羥基苯并三唑)溶液中將琥珀酸酐(Succ)偶合到Lys69的εN上。在洗滌之后，通過添加溶解在DMF中的羰基二咪唑激活樹脂結(jié)合的琥珀酸上的游離羧基。在經(jīng)過另一輪洗滌之后，添加溶解在DMF中的0.5M HOBT中的50％(4，7，10)-三噁三癸烷-1，13二胺(TTD)。在洗滌之后，樹脂結(jié)合的聚合物就可用于下一輪琥珀酸酐偶合/CDI激活/TTD偶合。在6次循環(huán)之后，將琥珀酸酐偶合在HOBT/DMF＝DIEA溶液中的最后的TTD胺上，以便產(chǎn)生Lys69修飾過的化合物，該化合物具有酰胺連接的-(Succ-TTD)6-Succ-OH聚合物。
用氫氟酸將肽/線性水溶性聚合物樹脂從所述樹脂上裂解下來，并且通過反向制備HPLC純化產(chǎn)物，以便產(chǎn)生[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70。觀察到的質(zhì)量＝6253Da，計(jì)算的質(zhì)量＝6252Da(平均同位素組成)。
3.制備G1755-01序列氨基氧戊烷-咪唑基-PYSSDTTPCCFAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCANPEKKWVREY INSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.32)
通過Dawson等所披露的天然化學(xué)連接方法將上述N-末端和C-末端完全未保護(hù)的肽片段連接在一起(Science，266776-779，1994)。通過反向HPLC，使用線性梯度的乙腈與含有0.1％的三氟乙酸的水純化還原形式的全長的多肽產(chǎn)物。觀察到的質(zhì)量＝10060Da。
在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化還原對的含水緩沖液中折疊與GP6連接的全長的多肽，同時(shí)形成了2個(gè)二硫鍵，并且按照標(biāo)準(zhǔn)方法通過反向HPLC純化(Wilken等，Chemistry&Biology，1999，6，143-51)。折疊的產(chǎn)物在HPLC上是均勻的。觀察到的質(zhì)量＝10056Da；計(jì)算的質(zhì)量＝10058Da(平均同位素組成)。實(shí)施例13制備RANTES類似物G1755按以下方法合成在圖12中示出的G1755化合物。
1.制備n-壬酰-RANTES(2-33)序列n-壬酰-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGK-硫酯(SEQ ID NO.33)按上述方法在硫酯產(chǎn)生樹脂上合成n-壬酰-RANTES(2-33)，然后通過將n-壬酸直接偶合在所述樹脂上對其N-末端進(jìn)行修飾。用氫氟酸裂解所述肽樹脂，并且通過反向HPLC純化以便產(chǎn)生n-壬酰-RANTES(2-33)。觀察到的質(zhì)量＝4177Da；計(jì)算的質(zhì)量＝4177.62Da(平均同位素組成)。
2.制備RANTES(34-68)Lys69(GP6)-Leu70序列CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYINSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.34)a.固相肽和在{肽樹脂}上進(jìn)行的水溶性聚合物合成使用上文所述Boc化學(xué)固相肽合成的原位中和/HBTU激活方法通過常規(guī)固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-樹脂上合成RANTES(34-68)-Lys69(Fmoc)-Leu70。
在鏈組裝完成之后，除去保護(hù)的肽樹脂上的Lys69的εN上的Fmoc基團(tuán)，并且按上述方法在肽樹脂上合成GP6結(jié)構(gòu)。用氫氟酸裂解肽/線性水溶性聚合物樹脂，并且通過反向制備HPLC純化產(chǎn)物，以便得到[RANTES(34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70。觀察到的質(zhì)量＝6252.87Da，計(jì)算的質(zhì)量＝6252.24Da(平均同位素組成)。
3.制備G1755序列壬酰-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREYINSLEMSK(GP6)L(SEQ ID NO.35)a.通過天然化學(xué)連接組裝全長的多肽通過在實(shí)施例8中所披露的天然化學(xué)連接將N-末端和C-末端完全未保護(hù)的肽片段連接在一起。用線性梯度的乙腈和含有0.1％的三氟乙酸的水通過反向HPLC純化還原形式的全長的多肽。觀察到的質(zhì)量＝10060.74Da；計(jì)算的質(zhì)量＝10058.67Da(平均同位素組成)。
b.用水溶性聚合物修飾過的多肽的折疊和純化在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化還原對的含水緩沖液中折疊通過GP6連接的全長的多肽，同時(shí)形成了2個(gè)二硫鍵。折疊的產(chǎn)物在HPLC上是均勻的。觀察到的質(zhì)量＝15057.43Da；計(jì)算的質(zhì)量＝10054.67Da(平均同位素組成)。實(shí)施例14制備RANTES類似物G1805按以下方法制備圖13中示出的G1805化合物。
1.制備n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯序列壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGK-硫酯(SEQ ID NO.36)其中X＝L-環(huán)己基甘氨酸(Chg)按上述方法在硫酯產(chǎn)生樹脂上合成n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)，然后通過將n-壬酸直接偶合在所述樹脂上對其N-末端進(jìn)行修飾。用氫氟酸裂解所述肽樹脂，并且通過反向HPLC純化，以便產(chǎn)生n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)。觀察到的質(zhì)量＝4151.98Da；計(jì)算的質(zhì)量＝4152.6Da(平均同位素組成)。
2.制備RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69-Leu70序列CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYINSLEK(Lev)SKL(SEQ ID NO.37)使用上文所述Boc化學(xué)固相肽合成的原位中和/HBTU激活方法通過常規(guī)固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-樹脂上合成RANTES(34-68)-(Met67Lys)-Lys69(Fmoc)-Leu70。
在肽鏈組裝完成之后，用溶解在DMF中的20％的哌啶處理，將Lys67的εN上的Fmoc基團(tuán)從保護(hù)的肽樹脂上除去。用1，3-二異丙基碳二亞胺激活乙酰丙酸作為對稱的酸酐，并且與Lys67的εN偶合。用氫氟酸裂解肽-樹脂，并且通過反向制備HPLC純化產(chǎn)物，以便得到[RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69-Leu70。觀察到的質(zhì)量＝4433.22Da；計(jì)算的質(zhì)量＝4434.19Da(平均同位素組成)。
3.制備G1805序列壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREYINSLEK(Lev-GP29)SKL(SEQ ID NO.38)其中，X＝L-環(huán)己基甘氨酸(Chg)，而GP29＝在圖13和14中所示出的支化肟連接的水溶性聚合物結(jié)構(gòu)。
a.通過天然化學(xué)連接組裝全長的多肽通過上述天然化學(xué)連接將N-末端和C-末端完全未保護(hù)的肽片段連接在一起。用線性梯度的乙腈和含有0.1％的三氟乙酸的水通過反向HPLC純化還原形式的全長的多肽。觀察到的質(zhì)量＝8213.62Da；計(jì)算的質(zhì)量＝8216.64Da(平均同位素組成)。
b.合成水溶性聚合物GP29i.合成具有多個(gè)硫醇基團(tuán)的模板GRFNP17在酰胺產(chǎn)生(4-甲基)二苯甲基胺(MBHA)-樹脂上以0.4mM的規(guī)模人工合成支化核心模板GRFNP17。用標(biāo)準(zhǔn)連接方法連接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH-(Schonlzer，M.Int J.Pept.Protein Res.，1992，40180-93)。將2.1mM的氨基酸，10％DIEA溶解在3.8毫升的0.5M HBTU中；即5倍過量的氨基酸。在除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)之后，用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸連接方法連接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(將2.1mM的氨基酸，10％DIEA溶解在3.8毫升的0.5M HBTU中；即5倍過量的氨基酸)。在第二次除去Fmoc的步驟之后，用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸連接方法連接Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(將4.2mM的氨基酸，10％DIEA溶解在7.6毫升的0.5M HBTU中；即與游離胺相比氨基酸5倍過量)。在最后的Fmoc脫保護(hù)步驟之后，用溶解在DMS中的S-乙酰硫代乙醇酸五氟苯基酯(SAMA-oPfp)連接30分鐘。通過純的TFA進(jìn)行兩次批量洗滌除去C-末端賴氨酰殘基的t-Boc保護(hù)基團(tuán)，每次洗滌1分鐘。然后通過用DMF制備的10％的TIEV洗滌中和所述樹脂。將2mM Boc-氨基氧乙酸和2mM N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在3毫升DMF中。在添加2mM DIC(二異丙基碳二亞胺)之后，將所述酸激活30-60分鐘，將該溶液添加到所述中和樹脂中，并且連接1小時(shí)。最后，用溶解在DMF中的20％的哌啶用30分鐘時(shí)間除去S-連接的乙?；鶊F(tuán)。按照標(biāo)準(zhǔn)Boc-化學(xué)方法，在存在作為游離醛的清除劑的半胱氨酸的條件下用HF/p-甲酚對模板進(jìn)行脫保護(hù)并同時(shí)從樹脂支持物上裂解下來(Schnolzer，M.Int J.Pept.Protein Res.，1992，40180-93)。冷凍回收到50％B[即含有0.1％TFA的50％的乙腈水溶液](不含醛)的聚酰胺，并且冷凍干燥。為了進(jìn)行純化，將模板粗制產(chǎn)品溶解在2毫升50％B中，并且添加100毫升100％A[即用水配制的0.1％TFA]，以便稀釋樣品(避免添加鹽酸胍或乙酸胍，因?yàn)橐砑尤?。將所述模板加樣到在T＝40℃下用3％B平衡的C4制備反向HPLC柱上。等度洗脫鹽類，并且通過線性梯度純化需要的模板GRFNP17。通過ES-MS確定含有所需產(chǎn)品的級份，合并并且冷凍干燥。
ii.合成支化的水溶性聚合物GRFNP29通過對純化的含有硫醇的模板GRFNP17和線性聚合物GRFNP31、Br-乙酰-(TTD-Succ)12-羧酸酯進(jìn)行硫酯產(chǎn)生連接而合成GRFNP29，即一種分子量為15kD的支化(TTD-Succ)12聚合物，其中，GRFNP31是按照標(biāo)準(zhǔn)方法在Sasrin羧基產(chǎn)生樹脂上合成的(Rose，K.等，美國專利申請流水號09/379297；Rose，等，J.AM.Chem.Soc.，1999，1217034)，溴乙酰化并進(jìn)行純化。
將多出1.3倍摩爾數(shù)的(超出總硫醇的數(shù)量)純化的GRFNP31、Br-乙酰-(TTD-Succ)12和純化的含有硫醇的模板GRFNP17同時(shí)溶解在0.1M Tris/6M鹽酸胍，pH8.7中，濃度大約為10mM。在溶解之后，用0.1Mtris-HCl，pH8.7緩沖液將該溶液稀釋3倍(v/v)。在室溫下攪拌該連接混合物，并且通過反向HPLC和ES/MS監(jiān)測反應(yīng)。根據(jù)需要添加額外GRFNP31反應(yīng)劑，直到需要的反應(yīng)產(chǎn)物是主要產(chǎn)物為止。為了進(jìn)行制備，添加3倍(v/v連接混合物)0.1M乙酸/6M鹽酸胍，pH4，并將該溶液加樣到C4反向制備HPLC柱上，并且用線性梯度純化。通過ES-MS確定含有純的GRFNP29結(jié)構(gòu)的級份，合并并且冷凍干燥。
c.將GP29結(jié)合到連接的全長的多肽上將冷凍干燥的全長的多肽溶解在含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液中，并且與等摩爾數(shù)量的含有氨基氧乙酰基(AOA)的支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)GP29同時(shí)冷凍干燥。溶解干燥的粉末，并且通過反向HPLC純化，以便產(chǎn)生具有GP29的全長的多肽，GP29是通過肟鍵共價(jià)連接在67號位置上的賴氨酸的修飾過的側(cè)鏈上的酮官能團(tuán)上。通過制備梯度C4反向HPLC分離聚合物修飾過的肽和未修飾過的肽與未反應(yīng)的聚合物。通過ES-MS確定含有所需聚合物修飾過的產(chǎn)物的級份，并且合并。觀察到的質(zhì)量＝23835.92Da，計(jì)算的質(zhì)量＝23844.64Da(平均同位素組成)。另外，在折疊所述多肽之后共價(jià)連接GP29，不過，發(fā)現(xiàn)這樣做能得到較低的產(chǎn)量。
d.折疊并純化含有肟連接的GP29的多肽在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化還原對的含水緩沖液中折疊連接有GP29的全長的多肽，同時(shí)形成了2個(gè)二硫鍵，并且按照反向HPLC方法純化。折疊的產(chǎn)物在HPLC上是均勻的，觀察到的質(zhì)量＝23832Da，計(jì)算的質(zhì)量＝23840Da(平均同位素組成)。實(shí)施例15制備RANTES類似物G1806按以下方法合成在圖14中示出的RANTES類似物G1806。
1.制備n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯序列壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGK-硫酯(SEQ ID NO.39)其中，X＝L-環(huán)己基甘氨酸(Chg)按上述方法在硫酯產(chǎn)生樹脂上合成肽片段n-壬酰-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-硫酯(硫酯還被表示成-COSR，其中，R是烷基)。并且通過將n-壬酸直接偶合在所述樹脂上對其N-末端進(jìn)行修飾。用氫氟酸裂解所述肽樹脂，并且通過反向HPLC純化，以便產(chǎn)生n-壬酰-RANTES(2-33)Tyr3Chg。觀察到的質(zhì)量＝4151.98Da；計(jì)算的質(zhì)量＝4152.6Da(平均同位素組成)。
2.制備RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69(Palm)-Leu70序列CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYINSLEK(Lev)SK(Palm)L(SEQ ID NO.40)其中，K(lev)是野生型RANTES的Met67Lys改變的Lys67的乙酰丙酸修飾的εN。K(Palm)是通過氨基辛酸部分連接的棕櫚酸修飾的Lys69εN，具有以下結(jié)構(gòu)[ε氮Lys69]-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3其中，使用上述用于Boc化學(xué)固相肽合成的原位中和/HBTU激活方法通過常規(guī)固相肽合成在Boc-Leu-OCH2-Pam-樹脂上合成RANTES(34-68)(Met67Lys)-Lys69(Palm)-Leu70。在將Boc-Lys(Fmoc)-OH偶合到69號位置上之后，用溶解在DMF中的20％的哌啶除去Fmoc基團(tuán)。用HBTU/DIEA激活Fmoc-8-氨基辛酸，并且與Lys69的εN偶合。在除去Fmoc基團(tuán)之后，用1-羥基-7-疊氮苯并三唑(HATU)和1，3-二異丙基碳二亞胺激活棕櫚酸，并且與所述樹脂偶合。然后按照上文所述的標(biāo)準(zhǔn)Boc化學(xué)SPPS方法進(jìn)行鏈組裝。在鏈組裝之后用溶解在DMF中的20％的哌啶處理，除去Lys67的εN上的Fmoc基團(tuán)。用1，3-二異丙基碳二亞胺激活乙酰丙酸作為對稱的酸酐，并且與Lys67的εN連接。用氫氟酸裂解肽-樹脂，并且通過反向制備HPLC純化，以便得到RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69(棕櫚酸)-Leu70。觀察到的質(zhì)量＝4813.72Da；計(jì)算的質(zhì)量＝4813.81Da(平均同位素組成)。
3.制備G1806序列壬酰-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTSGKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK(Lev-GP29)SK(Palm)L(SEQ ID NO.41)其中，X＝L-環(huán)己基甘氨酸(Chg)，而棕櫚酸(Palm)脂肪酸連接是通過一個(gè)氨基辛酸部分實(shí)現(xiàn)的。
-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3a.通過天然化學(xué)連接組裝脂肪酸修飾的全長的多肽通過上述天然化學(xué)連接將N-末端和C-末端完全未保護(hù)的肽片段連接在一起。用線性梯度的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的水通過反向HPLC純化還原形式的全長的多肽。觀察到的質(zhì)量＝8598.21Da；計(jì)算的質(zhì)量＝8596.27Da(平均同位素組成)。
b.將水溶性聚合物GP結(jié)合在連接的脂肪酸修飾過的全長的多肽上溶解冷凍干燥的全長的多肽并且與等摩爾數(shù)量的含有AOA的聚合物GP29同時(shí)冷凍干燥。溶解干燥的粉末，并且通過反向HPLC純化，以便產(chǎn)生具有GP29的全長的多肽，GP29是通過肟鍵共價(jià)連接在67號位置上的賴氨酸的修飾過的側(cè)鏈上的酮官能團(tuán)上。觀察到的質(zhì)量＝24217Da；計(jì)算的質(zhì)量＝24224Da(平均同位素組成)。另外，還可以在折疊所述多肽之后共價(jià)連接GP29，不過，發(fā)現(xiàn)這樣做得到較低的產(chǎn)量。
c.折疊并純化含有肟連接的GP29和脂肪酸的多肽在含有半胱氨酸-胱氨酸氧化還原對的含水緩沖液中折疊連接有GP29的全長的多肽，同時(shí)形成了2個(gè)二硫鍵，并且通過上述反向HPLC方法純化。折疊的產(chǎn)物在HPLC上是均勻的。觀察到的質(zhì)量＝24210.10Da；計(jì)算的質(zhì)量＝24220.17Da(平均同位素組成)。
圖15表示代表最終折疊的、純化的合成RANTES類似物的分析數(shù)據(jù)。具體地講，在圖15中示出了在還原性(R)和非還原性條件(N)下比較野生型(Wt)RANTES與合成趨化因子類似物RANTES G1806的相對分子量的代表性SDS-PAGE凝膠。相對分子量在每一塊凝膠的左側(cè)示出，它相應(yīng)于在同一塊凝膠上電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)(未示出)。還示出了折疊的、純化的G1806產(chǎn)物的代表性RP-HPLC層析圖譜。圖中說明了與野生型天然RANTES相比精確聚合物修飾的結(jié)構(gòu)的純度和較大的相對分子量。實(shí)施例16G1755-01、G1755、G1805和G1806的細(xì)胞融合測定進(jìn)行細(xì)胞融合測定，以便檢驗(yàn)各種聚合物修飾的RANTES類似物抗HIV活性。采用在實(shí)施例9中所披露的方法。在下面的表3中示出了代表性結(jié)果。
表3HeLa-P4-CCR5/HeLa-Env-ADA細(xì)胞融合數(shù)據(jù)化合物 EC50AOP-RANTES(2-68) 1.81×10-9MNNY-RANTES(2-68) 3.23×10-10MRANTES G1755-01 11.00×10-9MRANTES G1755 1.87×10-9MRANTES G1805 1.40×10-9MRANTES G1806 2.98×10-10M以上結(jié)果表明，在用線性或支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾之后基本上保留了抗融合活性。這一結(jié)果所提供的驚人發(fā)現(xiàn)是當(dāng)諸如脂肪酸的疏水性部分連接在C-末端上時(shí)能增強(qiáng)各種RANTES類似物的活性，這一結(jié)果支持了以下假說，即提高RANTES類似物的疏水性質(zhì)一般會增強(qiáng)抗融合活性。相反，將水溶性聚合物，特別是支化水溶性聚合物(具有相當(dāng)高的親水性的并且?guī)в胸?fù)電荷)用于修飾，只會出現(xiàn)活性的很小的減弱，減弱以下的活性仍然在體內(nèi)活性所要求的目標(biāo)效力范圍內(nèi)。更出人意料的是，與較小的線性水溶性聚合物結(jié)構(gòu)相比，用大的帶負(fù)電荷的支化水溶性聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾在相當(dāng)程度上保留了RANTES類似物的活性，而小的線性和大的支化聚合物修飾的類似物對活性具有大體上相同的影響。相信后一種發(fā)現(xiàn)在一種程度上是由于設(shè)計(jì)成的當(dāng)水溶性聚合物修飾發(fā)生在野生型RANTES的C-末端側(cè)基的聚集部位內(nèi)部時(shí)的抗聚集特性的和/或水溶性聚合物局部的抗融合特性。
其他的效力增強(qiáng)變化彌補(bǔ)了相對AOP-RANTES和NNY-RANTES而言由于連接水溶性聚合物而導(dǎo)致的活性的小的損失。所述變化包括將一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸導(dǎo)入C-末端，以及在C-末端添加疏水性脂肪酸部分。以上結(jié)果表明，額外的變化與單分散聚酰胺亞乙基聚合物(或其他水溶性聚合物)的組合能提高NNY和NOP型修飾的趨化因子分子的總體效力，如在N-末端進(jìn)行了組合的Pro2Thz和Tyr3Chg改變和/或在C-末端添加了脂類部分的AOP-或NNY-RANTES。實(shí)施例17G1755、G1805和G1806的藥代動力學(xué)研究按以下方法用雄性Sprague-Dawley大鼠對聚合物修飾的RANTES聚合物進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。通過在即將注射之前用將冷凍干燥的蛋白原料溶解在pH7.0磷酸緩沖鹽溶液中將按上述方法制備的RANTES類似物G1755、G1805和G1806(同時(shí)用AOP-RANTES作對照)配制成靜脈(IV)注射液。制備所述制劑，以便給每一只實(shí)驗(yàn)動物提供等摩爾劑量的RANTES類似物[400微克/千克(AOP-RANTES)；510微克/千克(G1755)；1210微克/千克(G1805)和1225微克/千克(G1806)(微克類似物/千克動物)]。在必要時(shí)調(diào)整最終濃度，以便為每一只動物提供1毫克/千克的總的重量體積(即劑量體積保持穩(wěn)定)。在實(shí)驗(yàn)的第一天通過大鼠尾部靜脈給予每一種制備的類似物，并且每只動物只接受一個(gè)劑量。
在注射之后，在實(shí)驗(yàn)過程中在每一個(gè)樣品采集時(shí)間點(diǎn)從尾部靜脈/動脈中采集大約0.25毫升的血液，并且按照標(biāo)準(zhǔn)方法和國家健康動物研究所管理指南和推薦的檢測方法用EDTA作為抗凝劑制備血漿或血清樣品。根據(jù)所述采集的數(shù)據(jù)調(diào)整樣品采集時(shí)間，避免在3周內(nèi)從每一只動物上采集超過14份0.25毫升的樣品(根據(jù)國家衛(wèi)生動物管理指南確定)。每隔1周采集其他的樣品，其中，可檢測的血液含量保持超過所述原始樣品。按照生產(chǎn)商的說明用Quantikine_Elisa，人類RANTES免疫測定(R&D Systems產(chǎn)品目錄#DRN00)測定每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的每一種RANTES類似物的血漿濃度。在實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測所述動物的總體健康狀況，包括體重、進(jìn)食習(xí)性、排泄、外觀等，并且沒有觀察到明顯的副作用。在圖16中示出了代表性結(jié)果。
以上結(jié)果表明，通過將水溶性聚合物連接在各種前體RANTES類似物上明顯提高了循環(huán)半衰期，半衰期的表觀提高順序?yàn)镚1805＞G1806＞G1755＞AOP-RANTES。相對AOP-RANTES而言，G1805提高了大約40倍，G1806提高20倍，G1755提高10倍?？傊A(yù)計(jì)水溶性聚合物修飾過的RANTES的保留的高效力和明顯提高的循環(huán)半衰期之間的平衡能提高這種化合物在體內(nèi)使用時(shí)的治療效力，并且減少治療所需要的劑量次數(shù)和數(shù)量。
在本說明書中所提到的所有文獻(xiàn)和專利申請都以相同的程度收作本文參考，就如同每一份文獻(xiàn)或?qū)＠暾埍粚ｉT和單獨(dú)指明被收作參考一樣。
現(xiàn)在業(yè)已對本發(fā)明進(jìn)行了充分說明，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不超出所附權(quán)利要求書的精神或范圍的前提下可以對本發(fā)明作出多種改變和改進(jìn)。
序列表<110>格萊風(fēng)科學(xué)公司<120>聚合物修飾的生物活性合成趨化因子及其生產(chǎn)方法和用途<130>03504.270<140><141><150>60/217,683<151>2000-07-12<160>41<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>92<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys Val Ser Leu Thr Thr Gln1 5 10 15Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Gly Ser20 25 30Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg Gly Leu Lys Val Cys Ala35 40 45Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val Val Arg Ser Met Asp Arg50 55 60Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln Thr Lys Pro Thr Gly Thr65 70 75 80Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu Thr Gly85 90<210>2<211>68<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala1 5 10 15Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln35 40 45Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser50 55 60Leu Glu Met Ser65<210>3<211>74<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1 5 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70<210>4<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu1 5 10 15Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser20 25 30Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu35 40 45Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met50 55 60Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys65 70<210>5<211>76<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met50 55 60Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>6<211>76<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1 5 10 15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr20 25 30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp
35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met50 55 60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75<210>7<211>82<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Gly Pro Asp Ala Val Ser Thr Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Val Val1 5 10 15Lys Gln Lys Ile His Val Arg Lys Leu Lys Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Gln Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Arg Thr Ile Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Lys Asn Ser Ile50 55 60Asn His Leu Asp Lys Thr Ser Gln Thr Phe Ile Leu Glu Pro Ser Cys65 70 75 80Leu Gly<210>8<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser20 25 30Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser50 55 60Asp Leu Glu Leu Ser Ala65 70<210>9<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser20 25 30Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr50 55 60Asp Leu Glu Leu Asn65<210>10<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>10Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His1 5 10 15Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys20 25 30Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys35 40 45Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser50 55 60Lys Lys Val Lys Asn Met65 70<210>11<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>11Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro1 5 10 15Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp20 25 30Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln35 40 45Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg50 55 60Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser65 70 75<210>12<211>74<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>12Gly Asp Thr Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu1 5 10 15Gly Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr20 25 30Pro Thr Ser Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys35 40 45Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Lys Ser Lys Asp Trp Val Lys Lys50 55 60Leu Met Gln Gln Leu Pro Val Thr Ala Arg65 70<210>13<211>99<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu Pro1 5 10 15Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp20 25 30Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu35 40 45Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe50 55 60Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln65 70 75 80Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr85 90 95Arg Lys Asn<210>14<211>97<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>14Gln Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu1 5 10 15Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg20 25 30Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg35 40 45Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr50 55 60Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr65 70 75 80Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser85 90 95Gln<210>15<211>74<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>15Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys1 5 10 15Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp20 25 30Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile35 40 45Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val50 55 60Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn65 70<210>16<211>111<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys1 5 10 15Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu20 25 30Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln35 40 45Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met50 55 60Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys65 70 75 80Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser85 90 95Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro100 105 110<210>17<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr1 5 10 15Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr20 25 30Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu50 55 60Asn Lys Leu Ser Gln65<210>18<211>71<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys1 5 10 15Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp Tyr Gln Thr Ser Glu20 25 30Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr Val Gln Gly Arg Ala35 40 45Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr
50 55 60Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser65 70<210>19<211>127<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu Ala Tyr His Tyr Pro Ile Gly1 5 10 15Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr Tyr Arg Ile Gln Glu Val Ser20 25 30Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His35 40 45Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser Arg Glu Val Gln Arg Ala Met50 55 60Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val Phe Ala Lys Leu His His Asn65 70 75 80Met Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser85 90 95Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys Phe Ser Asn Pro Ile Ser Ser100 105 110Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile Ser Ala Asn Ser Gly Leu115 120 125<210>20<211>67<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser1 5 10 15His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro20 25 30Ala Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln35 40 45Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys50 55 60Ala Leu Asn Arg Phe Lys Met65 70<210>21<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn1 5 10 15Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala20 25 30Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys35 40 45Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu50 55 60Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Met Ser Lys Arg Ser Pro65 70 75<210>22<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys1 5 10 15Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val20 25 30Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu35 40 45Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln50 55 60Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser65 70 75<210>23<211>103<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln1 5 10 15Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro20 25 30Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly35 40 45Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile50 55 60Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly65 70 75 80Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg85 90 95Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr100<210>24<211>77<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg1 5 10 15Val Thr Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly Lys Leu Gln Val Phe20 25 30Pro Ala Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys
35 40 45Asn Gly Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys50 55 60Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn65 70 75<210>25<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1 5 10 15Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro Gly20 25 30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg35 40 45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile Glu50 55 60Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn65 70<210>26<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1 5 10 15Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly20 25 30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln35 40 45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu50 55 60Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn65 70<210>27<211>73<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1 5 10 15Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly20 25 30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys35 40 45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu50 55 60Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn65 70<210>28<211>76<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>28Gln His His Gly Val Thr Lys Cys Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr1 5 10 15Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala20 25 30Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu35 40 45Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His50 55 60Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly65 70 75<210>29<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>29Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro1 5<210>30<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>30Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30<210>31<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>31Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1 5 10 15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu20 25 30Glu Met Ser Lys Leu35<210>32<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>32Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val35 40 45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu50 55 60Glu Met Ser Lys Leu65<210>33<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>33Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30<210>34<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>34Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1 5 10 15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu20 25 30Glu Met Ser Lys Leu35<210>35<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>35Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val35 40 45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu50 55 60Glu Met Ser Lys Leu65<210>36<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>36Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30<210>37<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>37Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1 5 10 15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu20 25 30Glu Lys Ser Lys Leu35<210>38<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>38Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val35 40 45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu50 55 60Glu Lys Ser Lys Leu65<210>39<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>39Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30<210>40<211>37<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>40Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val1 5 10 15Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu20 25 30Glu Lys Ser Lys Leu35<210>41<211>69<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>41Pro Xaa Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val35 40 45Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu50 55 60Glu Lys Ser Lys Leu6權(quán)利要求
1.一種合成趨化因子，在它上面連接有水溶性聚合物，并且具有以下調(diào)與它結(jié)合的趨化因子受體為特征的體外生物活性。
2.如權(quán)利要求1的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子的體內(nèi)血清循環(huán)半衰期是缺乏所述水溶性聚合物的合成趨化因子的血清循環(huán)半衰期的10倍以上。
3.如權(quán)利要求1的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子進(jìn)行以下修飾，(A)用選自脂族鏈、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其N-末端進(jìn)行修飾；或(B)用選自脂族鏈、多環(huán)、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其C-末端進(jìn)行修飾；或(C)同時(shí)用選自脂族鏈、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其N-末端進(jìn)行修飾，并且用選自脂族鏈、多環(huán)、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其C-末端進(jìn)行修飾。
4.如權(quán)利要求3的合成趨化因子，其中，所述合成用趨化因子是用選自脂族鏈、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其N-末端進(jìn)行修飾。
5.如權(quán)利要求3的合成趨化因子，其中，所述合成用趨化因子是用選自脂族鏈、多環(huán)、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其C-末端進(jìn)行修飾。
6.如權(quán)利要求3的合成趨化因子，其中，所述合成用趨化因子是同時(shí)用選自脂族鏈、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其N-末端進(jìn)行修飾，并且用選自脂族鏈、多環(huán)、氨基酸、和氨基酸衍生物組成的一組基團(tuán)的成分在其C-末端進(jìn)行修飾。
7.如權(quán)利要求1或3中任意一項(xiàng)的合成趨化因子，其中，所述水溶性聚合物與所述合成趨化因子在選自C-末端位點(diǎn)、聚集位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和糖胺聚糖(GAG)結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)連接。
8.如權(quán)利要求1或3中任意一項(xiàng)的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是Rantes、MIP1α、MIP1β、SDF-1、IL-8或MCP-1的類似物。
9.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是Rantes的類似物，并且所述水溶性聚合物與C-末端位點(diǎn)連接。
10.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是Rantes的類似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位點(diǎn)連接。
11.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是Rantes的類似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位點(diǎn)連接。
12.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是Rantes的類似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位點(diǎn)連接。
13.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1α的類似物，并且所述水溶性聚合物與C-末端位點(diǎn)連接。
14.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1α的類似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位點(diǎn)連接。
15.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1α的類似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位點(diǎn)連接。
16.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1α的類似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位點(diǎn)連接。
17.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1β的類似物，并且所述水溶性聚合物與C-末端位點(diǎn)連接。
18.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1β的類似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位點(diǎn)連接。
19.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1β的類似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位點(diǎn)連接。
20.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MIP1β的類似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位點(diǎn)連接。
21.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是SDF-1的類似物，并且所述水溶性聚合物與C-末端位點(diǎn)連接。
22.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是SDF-1的類似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位點(diǎn)連接。
23.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是IL-8的類似物，并且所述水溶性聚合物與C-末端位點(diǎn)連接。
24.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是IL-8的類似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位點(diǎn)連接。
25.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MCP-1的類似物，并且所述水溶性聚合物與C-末端位點(diǎn)連接。
26.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MCP-1的類似物，并且所述水溶性聚合物在聚集位點(diǎn)連接。
27.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MCP-1的類似物，并且所述水溶性聚合物在糖基化位點(diǎn)連接。
28.如權(quán)利要求8的合成趨化因子，其中，所述合成趨化因子是MCP-1的類似物，并且所述水溶性聚合物在GAG位點(diǎn)連接。
29.如權(quán)利要求1的合成趨化因子，其中，所述水溶性聚合物具有下式U-B-Polymer-J其中U包括共價(jià)連接所述合成趨化因子的官能團(tuán)的殘基；B是具有三個(gè)或三個(gè)以上，并且可以存在或缺乏的支化核心；Polymer是基本上無抗原性的水溶性聚合物；并且而J是側(cè)基的殘基，它在生理學(xué)條件下具有選自負(fù)的、正的或中性的凈電荷。
30.如權(quán)利要求29的合成趨化因子，其中，用間隔基或接頭將U、B、Polymer和J中的一個(gè)或多個(gè)隔開；所述間隔基或接頭具有下式U-s1-B-s2-Polymer-s3-J其中，s1、s2和s3是間隔基或接頭部分，它們可以相同或不同，并且可以獨(dú)立存在或者缺乏。
31.如權(quán)利要求29的合成趨化因子，其中，U是選自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、醚、硫醚、酯、酰肼、噻唑烷、和噁唑烷的鍵的殘基。
32.如權(quán)利要求29的合成趨化因子，其中，B的一個(gè)臂與U連接，B的另一個(gè)臂與Polymer連接。
33.如權(quán)利要求29的合成趨化因子，其中，B包括4個(gè)或更多臂。
34.如權(quán)利要求33的合成趨化因子，其中，所述臂中的兩個(gè)或兩個(gè)以上包括選自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙胺、硫醚、酯、酰肼、噁唑烷、和噻唑烷的鍵的殘基。
35.如權(quán)利要求33的合成趨化因子，其中，B包括選自氨基、羧基、和混合的氨基-羧基的支化核心部分。
36.如權(quán)利要求29的合成趨化因子，其中，所述Polymer選自聚環(huán)氧烷和聚酰胺環(huán)氧烷。
37.如權(quán)利要求29的合成趨化因子，其中，所述Polymer是具有下式的聚酰胺-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-，其中，X和Y是二價(jià)基團(tuán)，可以相同或不同，并且可以是支化的或直鏈的，并且n是一個(gè)1-100的整數(shù)。
38.如權(quán)利要求37的合成趨化因子，其中，X和Y中的一個(gè)或兩個(gè)包括選自-(O-CH2-CH2-)n-和-(CH2-CH-O)n-的重復(fù)單元，其中，n是一個(gè)1-100的整數(shù)。
39.如權(quán)利要求29的合成趨化因子，其中，J是可離子化的基團(tuán)。
40.如權(quán)利要求39的合成趨化因子，其中，所述可離子化的基團(tuán)選自羧基、胺和羥基。
41.如權(quán)利要求39的合成趨化因子，其中，所述水溶性聚合物具有凈負(fù)電荷。
42.如權(quán)利要求39的合成趨化因子，其中，所述水溶性聚合物具有凈正電荷。
43.如權(quán)利要求39的合成趨化因子，其中，所述水溶性聚合物具有凈中性電荷。
44.一種生物活性合成趨化因子，該合成趨化因子包含與它連接的水溶性聚合物，并且它對包括病毒感染抑制作用在內(nèi)的生物學(xué)反應(yīng)的體外EC50等于或低于相應(yīng)的野生型趨化因子，所述EC50是在基于細(xì)胞的體外測定方法中測量的，該測定的特征在于讓所述生物活性合成趨化因子與它的一種或多種相應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合，其中，一種或多種所述受體是病毒感染的共同受體。
45.如權(quán)利要求44的生物活性合成趨化因子，其中，所述EC50低于選自下列一組的濃度1000nM、700nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、10nM和1nM。
46.一種生物活性合成趨化因子，該合成趨化因子包含與它連接的水溶性聚合物，并且(1)EC50等于或低于相應(yīng)的野生型趨化因子的EC50，所述EC50是在體外病毒感染測定方法中測量的，該測定的特征在于讓所述生物活性合成趨化因子與它的一種或多種相應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合，其中，一種或多種所述受體是病毒的共同受體；和(2)血清循環(huán)半衰期是缺乏所述水溶性聚合物的所述合成趨化因子的血清循環(huán)半衰期的10倍以上。
47.如權(quán)利要求46的生物活性合成趨化因子，其中，所述EC50低于選自下列一組的濃度1000nM、700nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、10nM和1nM。
全文摘要
本發(fā)明涉及聚合物修飾的生物活性合成趨化因子，并且涉及所述趨化因子的生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明的生物活性合成趨化因子包括一種聚合物修飾的多肽趨化因子主鏈。本發(fā)明的化合物和方法可用于治療與天然存在的趨化因子相關(guān)的疾病，如用于治療HIV和AIDS相關(guān)的疾病，以及用于治療哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、粉瘤/動脈粥樣硬化、器官移植排斥、和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
文檔編號C07K19/00GK1460023SQ01815247
公開日2003年12月3日 申請日期2001年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月12日
發(fā)明者G·科亨德菲爾, J·A·布拉德博尼 申請人:格萊風(fēng)治療公司