專利名稱：在番茄中花青苷突變體(ant1)的鑒定和表征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0002本發(fā)明涉及稱為花青苷1(ANT1)的植物表型，以及與此相關(guān)的DNA和多肽序列。
背景技術(shù)：
0003用于篩選缺失功能的突變體的發(fā)現(xiàn)基因的傳統(tǒng)方法，包括化學(xué)誘變、輻射和T-DNA插入有局限性。致突變的方法，例如這些，很少能鑒定在基因組中是多余的基因，并且基因表征是費時費力的。0004活化標(biāo)簽是一種方法，在該方法中在基因組水平隨機(jī)而有力地上調(diào)基因表達(dá)，之后篩選并選擇特定的表型。通過活化標(biāo)簽來分離突變體已有報道(Hayashi等人，1992)。允許在缺乏植物生長激素時生長的煙草細(xì)胞的培養(yǎng)中，活化的T-DNA標(biāo)簽構(gòu)件被用于活化基因(Walden等人，1994)。已從T-DNA標(biāo)簽兩側(cè)的植物基因組序列中分離到基因，并推定其負(fù)責(zé)植物生長激素應(yīng)答。(見，如Miklashevichs等人，1997，Harling等人，1997；Walden等人，1994；和Schell等人，1998，其討論了相關(guān)的研究)0005在擬南芥中，用活化標(biāo)簽的方法第一個被描述特征的基因是編碼參與細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組蛋白激酶的基因。通過質(zhì)粒援救從植物基因組DNA中分離到基因序列，通過重新引入擬南芥中確定了基因CKI1在植物的細(xì)胞分裂素應(yīng)答中的作用(Kakimoto，1996)。隨后，有通過使用帶有Ds轉(zhuǎn)座因子的相似方法獲得幾種顯性突變體如TINY、LHY和SHI的報道(Wilson等人，1996，Schaffer等人，1998，F(xiàn)ridborg等人，1999)。在更新的報道中，活化T-DNA標(biāo)簽和對早期開花表型的篩選導(dǎo)致FT基因的分離(Kardailsky等人，1999)。0006活化標(biāo)簽作為用于發(fā)現(xiàn)基因的高通量技術(shù)的潛在應(yīng)用在基于涉及光受體、油菜素類固醇、赤霉素和開花信號途徑，以及疾病抗性的幾種顯性突變基因篩選中已證實。(見，如Weigel等人，2000，Christensen等人，1998；Kardailsky等人，1999)。0007擬南芥已被廣泛地用作諸如蕓苔之類具有長角果型果實的植物的植物改良的模型。但是，擬南芥不能作為具有肉果的植物的模型。0008在PCT公開文本W(wǎng)O0053794中描述了基于在具果植物中修飾基因表達(dá)以鑒定和表征基因的方法。具果植物的矮化變種，特別是番茄的矮化變種在一種或多種天然植物基因的過表達(dá)以及將該過表達(dá)與特定表型相聯(lián)系中是有用的。0009矮化番茄以它的短節(jié)間為特征，使植物外形緊湊。微型的番茄(Lycopersicon esculentum)栽培種，Micro-Tom是按比例地矮化的植物，其能高密度生長(最大達(dá)1357株/平方米)，具有短的生活周期(從播種到果實成熟70-80天)，因此果實大小和葉大小在遺傳上減小了(Meissner等人，1997；Scott和Harbaugh，1989)。另外，Micro-Tom已顯示出對許多疾病的抗性，并能通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉轉(zhuǎn)化，以最高達(dá)80％的頻率被轉(zhuǎn)化(Meissner等人，1997)。與Micro-Tom相似，F(xiàn)lorida Petite(Fla.Agr.Expt.Sta.Circ.S-285)，Tiny Tim和Small Fly是番茄的具有短生活周期，并因此果實大小和葉大小在遺傳上減小的矮化變種。0010工業(yè)和學(xué)術(shù)界都正在進(jìn)行努力，發(fā)展與特定植物特征或特性相關(guān)的基因的鑒定方法，以便發(fā)展具有這些特征的改良植物。本發(fā)明提供與天然植物基因的修飾表達(dá)相關(guān)的植物表型。0011在Micro-Tom的活化標(biāo)簽篩選中，我們鑒定了參與色素產(chǎn)生的基因?；ㄇ嘬帐秦?fù)責(zé)植物中多種紅色和藍(lán)色的色素。在谷類、矮牽牛和金魚草中，已經(jīng)很好的描述了花青苷生物合成的遺傳基礎(chǔ)(Dooner等人，1991；Jayaram和Peterson，1990；QuattrocchioF等人，1999)。
發(fā)明概述0012本發(fā)明提供與植物中顯示為被修飾的葉、花或果實的顏色的花青苷1(“ANT1”)表型相關(guān)的核酸和氨基酸序列。0013一方面，發(fā)明提供一個或多個分離的ANT1核酸序列，包括編碼或互補(bǔ)于編碼與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有70％，80％，90％或更多的序列一致性的ANT1多肽的序列的核酸序列。0014另一方面，多核苷酸包括在高、中或低嚴(yán)格條件下與SEQID NO1的核酸序列或其片段，或其互補(bǔ)序列雜交的序列。0015在相關(guān)方面，在植物中，一個或多個這些ANT1多核苷酸的表達(dá)與ANT1表型相關(guān)聯(lián)。0016發(fā)明進(jìn)一步提供包含ANT1核酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體、植物細(xì)胞、植物部分和植物。0017在植物中，如此ANT1核酸序列的表達(dá)與ANT1表型相關(guān)聯(lián)，表現(xiàn)為葉、花或果實顏色被修飾的表型。0018在觀賞性植物、水果和蔬菜類植物、谷類植物、油類植物和干果類植物，以及其它農(nóng)作物植物中，ANT1核酸序列的表達(dá)可以被修飾，產(chǎn)生ANT1表型。0019在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供在植物中，通過引入ANT1核酸序列到植物祖先細(xì)胞中并使該細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，從而修飾ANT1表型的方法。
發(fā)明詳述定義0020除非另外說明，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的有相同含義。Sambrook等人，1989和Ausubel FM等人，1993特別針對專業(yè)人員給出了本領(lǐng)域的定義和術(shù)語?？梢岳斫?，本發(fā)明不被限制于所描述的特定方法學(xué)、流程和試劑，因為這些可能變化。0021為了描述和揭示可能在本發(fā)明使用的組合物和方法學(xué)，在此引用的和以下緊接實施例后列出的所有發(fā)表物，作為參考文獻(xiàn)被清楚地合并在此。所引用的所有專利、專利公開和參考網(wǎng)址中的序列和其它信息也在此作為參考文獻(xiàn)被引用。0022在此所用的術(shù)語“載體”是指設(shè)計在不同的宿主細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)件?！氨磉_(dá)載體”是指有能力在外源細(xì)胞中整合和表達(dá)異源DNA片段的載體。許多原核和真核表達(dá)載體可購買得到。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。0023 “異源”核酸構(gòu)件或序列具有一部分對它表達(dá)所在的植物細(xì)胞不是天然序列的序列。關(guān)于控制序列的異源是指在天然狀態(tài)下對同一個目前表達(dá)正受調(diào)控的基因沒有調(diào)控功能的控制序列(即啟動子或增強(qiáng)子)。一般地，異源核酸序列對它們所在的細(xì)胞或基因組部分不是同源的，并通過感染、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔或諸如此類的方法加入細(xì)胞中?！爱愒础焙怂針?gòu)件可以含有控制序列/DNA編碼序列的組合，這與在天然的植物中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列組合可以相同或不同。0024在此所用的術(shù)語“基因”是指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段，它可以包括或不包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如5’非翻譯(5’UTR)或“前導(dǎo)”序列和3’UTR或“尾隨”序列，以及在單個編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。0025 在此所用的關(guān)于目標(biāo)序列或目標(biāo)序列的規(guī)定部分的“序列一致性百分比(％)”，被定義為在序列比對并引入間隙(如果需要得到序列一致性的最大百分比)之后，候選衍生序列的核苷酸或氨基酸與目標(biāo)序列(或其規(guī)定部分)的核苷酸或氨基酸的一致性百分比，該比對方法可通過程序WU-BLAST-2.0a19(Altschul等人，J.Mol.Biol.(1997)215403-410；blast.wustl.edu/blast/README.htmlwebsite)將所有搜索參數(shù)設(shè)定為缺省值而進(jìn)行。HSP S和HSP S2參數(shù)是動態(tài)值，通過程序自身依賴特定序列的組成和目的序列搜索所對應(yīng)的特定數(shù)據(jù)庫的組成而設(shè)定。通過匹配的相同的核苷酸或氨基酸的數(shù)目除以被報告一致性百分比的序列的長度，確定一個一致性百分比值。通過做與確定氨基酸序列一致性百分比相同的計算確定“氨基酸序列相似性百分比(％)”，但計算中，除相同氨基酸外，還包括保守氨基酸的置換。0026術(shù)語“同源性百分比”在此與術(shù)語“一致性百分比”互換使用。0027核酸序列被認(rèn)為是與指定的核酸序列“選擇性雜交”，如果兩個序列在中等至高度嚴(yán)格雜交和洗脫條件下，特異地相互雜交。雜交條件以核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的熔解溫度(Tm)為基礎(chǔ)。例如，“最大嚴(yán)格”一般發(fā)生在大約Tm-5℃(低于探針的熔解溫度5℃)；“高度嚴(yán)格”在大約低于Tm 5至10℃；“中等嚴(yán)格”在大約低于探針Tm 10至20℃；“低等嚴(yán)格”在大約低于Tm 20至25℃。功能上，最大嚴(yán)格條件可以被用作鑒定與雜交探針有嚴(yán)格一致性或接近嚴(yán)格一致性的序列；而高度嚴(yán)格條件被用作鑒定與探針有大約80％或更多序列一致性的序列。0028中等和高度嚴(yán)格雜交條件在本領(lǐng)域是熟知的(見，例如Sambrook等人，1989，第9和11章，以及在Ausubel，F(xiàn).M.，等人，1993，在此作為參考文獻(xiàn)清楚地引用)。高度嚴(yán)格條件的實施例包括大約42℃在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml變性載體DNA中雜交，隨后室溫下在2×SSC和0.5％SDS中洗脫兩次，并42℃在0.1×SSC和0.5％SDS中再洗脫兩次。0029在此所用的“重組體”包括通過引入異源核酸序列而被修飾的細(xì)胞或載體或從被如此修飾的細(xì)胞中獲得的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞的天然形式(非重組)中并沒有發(fā)現(xiàn)相同形式的基因或表達(dá)異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因，作為一種蓄意的人類干涉的結(jié)果。0030在此所用的關(guān)于植物細(xì)胞的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”，“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”是指植物細(xì)胞具有整合入其基因組中，并保持兩代或更多代的非天然(異源)核酸序列。0031在此所用的術(shù)語“表達(dá)”是指基于基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。0032插入核酸序列到細(xì)胞中的情況下，術(shù)語“被引入”的意思是“轉(zhuǎn)染”，或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”以及包括核酸序列被真核或原核細(xì)胞的整合，其中核酸序列可能被整合到細(xì)胞的基因組中(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子，或被短暫表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。0033在此所用的“植物細(xì)胞”是指從植物中獲得的任何細(xì)胞，包括未分化組織的細(xì)胞(如愈傷組織)和植物種子、花粉、progagules和胚。0034在此所用的關(guān)于特定的植物特征或表型的術(shù)語“天然”和“野生型”是指其特征或表型在天然條件下的相同品種中也能發(fā)現(xiàn)的形式。0035在此所用的關(guān)于植物特征的術(shù)語“被修飾的”是指對于非轉(zhuǎn)基因植物天然條件下發(fā)現(xiàn)的表型在轉(zhuǎn)基因植物中的改變。0036在此所用的術(shù)語“T1”是指從T0植物的種子產(chǎn)生的這代植物。T1代是能通過使用選擇劑，如抗生素或除草劑，篩選的第一組轉(zhuǎn)化植物，對于這些選擇劑轉(zhuǎn)基因植物含有對應(yīng)的抗性基因。0037在此所用的術(shù)語“T2”是指，先前被選擇為轉(zhuǎn)基因的T1植物的花自花受精產(chǎn)生的一代植物。0038在此所用的術(shù)語“植物部分”包括任何植物器官或組織，無限制的包括種子、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子?？蓮娜魏沃参锲鞴倩蚪M織和從它們制備的培養(yǎng)物獲得植物細(xì)胞。一般的，可在本發(fā)明的方法中使用的一類植物與適合轉(zhuǎn)化技術(shù)的一類更高等的植物一樣廣泛，包括單子葉植物和雙子葉植物。0039在此所用的“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組中含有異源多核苷酸的植物。一般的，異源多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組中，以致多核苷酸傳遞到下一代。異源多核苷酸可以單獨或作為重組表達(dá)盒的一部分整合到基因組中。在此所用的“轉(zhuǎn)基因”包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，其基因型通過異源核酸的存在而改變，包括最初進(jìn)行如此改變的轉(zhuǎn)基因植物和從最初的轉(zhuǎn)基因植物通過有性雜交或無性繁殖產(chǎn)生的植物。0040因此，在其細(xì)胞中含有異源多核苷酸的植物在此稱為“轉(zhuǎn)基因植物”。異源多核苷酸可以穩(wěn)定地整合到基因組中，或位于染色體外。優(yōu)選的，本發(fā)明的多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組中，以便多核苷酸傳遞到下一代。異源多核苷酸可以單獨或作為重組表達(dá)盒的一部分整合到基因組中。在此所用的“轉(zhuǎn)基因”包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，其基因型通過異源核酸的存在而改變，包括最初進(jìn)行改變的轉(zhuǎn)基因植物和從最初的轉(zhuǎn)基因植物通過有性雜交或無性繁殖產(chǎn)生的植物。0041在其中引入了含有表達(dá)構(gòu)件的重組DNA構(gòu)件的植物細(xì)胞、組織、器官或植株被認(rèn)為是“被轉(zhuǎn)化的”、“被轉(zhuǎn)染的”、或“轉(zhuǎn)基因的”。轉(zhuǎn)基因的或被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植物也包括細(xì)胞或植物的后代和從使用如此的轉(zhuǎn)基因植物作為雜交親本的繁殖程序產(chǎn)生的、表現(xiàn)出由于重組核酸序列導(dǎo)致的變化的表型的后代。因此，本發(fā)明的植物將包括任何含有具有引入的核酸序列構(gòu)件的細(xì)胞的植物，不論序列是否是直接通過轉(zhuǎn)化方法引入，或通過直接轉(zhuǎn)化而得到構(gòu)件的祖先細(xì)胞的世代轉(zhuǎn)移方法引入。0042在此所用的術(shù)語“花青苷1”和“ANT1”包含天然花青苷1(ANT1)核酸和氨基酸序列、其同源物、變體和片段。0043“分離的”ANT1核酸分子是從至少一個與ANT1核酸的天然來源相關(guān)的污染物核酸分子中鑒定和分離的ANT1核酸分子。分離的ANT1核酸分子與天然發(fā)現(xiàn)的形式或背景不一樣。但是，分離的ANT1核酸分子包括正常表達(dá)ANT1的細(xì)胞中的ANT1核酸分子，在該細(xì)胞中，例如，核酸分子的染色體定位與天然的細(xì)胞中的不同。0044在此所用的術(shù)語“突變體”是指多核苷酸序列或基因與對應(yīng)的野生型多核苷酸序列或基因在序列或表達(dá)方面不同，其中這些不同導(dǎo)致了改變的植物表型或特征。對于植株或植物系，術(shù)語“突變體”是指具有被修飾的植物表型或特征的植株或植物系，其中被修飾的表型或特征與野生型多核苷酸序列或基因的修飾表達(dá)相關(guān)。0045一般的，“變體”多核苷酸序列編碼與參考多肽序列相比有一個或更多氨基酸改變的“變體”氨基酸序列。變體多核苷酸序列可以編碼具有“保守”或“非保守”替代的變體氨基酸序列。變體多核苷酸也可以編碼具有氨基酸插入或刪除或兩者都有的變體氨基酸序列。0046在此所用的術(shù)語“表型”可以與術(shù)語“特征”互換使用。該術(shù)語是指易于觀察或測定、并由植物的遺傳組成和發(fā)育環(huán)境相互作用產(chǎn)生的植物特征。這樣的表型包括由于增強(qiáng)的基因表達(dá)而導(dǎo)致的在植物組成上的化學(xué)變化，該增強(qiáng)的基因表達(dá)可能產(chǎn)生或不產(chǎn)生植物形態(tài)上的變化，但可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的分析技術(shù)測定。0047在此所用的術(shù)語“目的表型”當(dāng)涉及通過在此描述的方法產(chǎn)生的植物時，是指由T1和/或其后的后代植物證實的容易觀察到的或測量的表型，這些表型不被不具有如此轉(zhuǎn)化的植物(和/或非此種轉(zhuǎn)化植物的后裔)所展示，并代表在此植物中的一種改進(jìn)?！案倪M(jìn)”是指可以增強(qiáng)對一種植物物種的利用的特征或為該植物提供一種獨特品質(zhì)的變異。獨特的品質(zhì)是指一種新的特征或?qū)χ参镂锓N已有特征的改變，這是量的變化(增加或減少)或?qū)σ惶囟ㄌ卣骰蛱攸c的質(zhì)的改變。鑒定的ANT1表型和基因0048本發(fā)明的基因和表型使用活化標(biāo)簽篩選鑒定。活化標(biāo)簽是將含有核酸控制序列，如增強(qiáng)子的異源核酸構(gòu)件插入植物的基因組的方法。增強(qiáng)子序列的作用是增強(qiáng)一個或多個天然植物基因的轉(zhuǎn)錄(見，如Walden R等人，1994；Weigel D等人，2000)。0049簡要地，大量的番茄(Lycopersium esculentum)栽培種Micro-Tom植物被含有T-DNA(即來自于在土壤桿菌感染時轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞宿主中的根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumifaciens)的Ti質(zhì)粒的序列)、增強(qiáng)子元件和選擇性標(biāo)記基因的活化標(biāo)簽載體pSKI015的修飾形式轉(zhuǎn)化(Weigel等人，2000)。該構(gòu)件，pAG3202在實施例中被進(jìn)一步描述。pAG3202隨機(jī)的插入被轉(zhuǎn)化植物的基因組中后，增強(qiáng)子元件能產(chǎn)生T-DNA插入的相鄰區(qū)域的基因上調(diào)表達(dá)，一般在插入的5-10kilobase(kb)之內(nèi)。在T1代，植物暴露于選擇劑中，以便特異地發(fā)現(xiàn)那些因為含有活化標(biāo)簽載體的插入而表達(dá)選擇性標(biāo)記的植物。觀察轉(zhuǎn)化植物的目的表型，該目的表型一般在T1、T2和/或T3代被鑒定?？梢曰谛螒B(tài)學(xué)、生物化學(xué)篩選、除草劑耐受測試、除草劑靶標(biāo)鑒定、真菌或細(xì)菌抗性測試、昆蟲或線蟲抗性測試、逆境耐受篩選，例如干旱、鹽或抗生素耐受，和產(chǎn)量特征，如油、淀粉、色素或維生素組成來鑒定目的表型。分析T-DNA插入周圍的基因組序列，以便鑒定產(chǎn)生目的表型的基因。導(dǎo)致這些表型的基因作為農(nóng)業(yè)、食品、觀賞植物、和/或制藥產(chǎn)業(yè)的吸引人的目標(biāo)被鑒定。0050在大部分的例子中，可以認(rèn)識到，標(biāo)記基因的增強(qiáng)表達(dá)產(chǎn)生修飾的表型時，該表型是顯性的。在一些例子中，特定的天然植物基因或其片段的增強(qiáng)表達(dá)可能導(dǎo)致它的同源物或其它天然植物基因的表達(dá)減少或失活，從而產(chǎn)生目的表型。T-DNA插入也可能產(chǎn)生天然基因的斷裂(“失去功能”)，在這樣的例子中，表型一般是隱性的。0051本發(fā)明提供在ACTTAG Micro-Tom系中被鑒定的被修飾的葉、花或果實的顏色表型，其在愈傷組織階段觀察是紫色的和紫色的芽。從培養(yǎng)的紫色生莖(caulogenic)愈傷組織獲得紫色的植物。克隆的植物株(即來自于同一個紫色生莖愈傷組織的額外的芽，或那些從第一個紫色植株以組織培養(yǎng)或溫室插條繁殖得到的)以葉、萼片和花上有紫色而被鑒定。植物也可觀察到顯示出較野生型Micro-Tom植株更深的紅色的被修飾的果實顏色。該表型和相關(guān)的基因被稱為花青苷1(“ANT1”)。0052發(fā)明也提供通過分析T-DNA插入周圍的對應(yīng)于ANT1表型的基因組DNA序列而被最新鑒定和分離的核酸序列。特別地，申請人已鑒定和描述出ANT1基因的開放閱讀框的特點，開放閱讀框在具有ANT1表型的植物中特異的過表達(dá)，并在SEQ ID NO1中給出。實施例中給出分離和鑒定ANT1的詳細(xì)描述。發(fā)明的組合物ANT1核酸0053ANT1基因可以用在具有期望表型的轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展中。利用天然ANT1序列、變體ANT1序列或其同源物或片段可以完成這一點。0054本發(fā)明的ANT1核酸序列可以是來自基因組DNA、cDNA或mRNA的DNA或RNA序列。核酸序列可以被克隆，例如，通過從適當(dāng)來源中分離基因組DNA，并利用PCR擴(kuò)增和克隆目的序列。作為選擇，核酸序列可以被完全或部分合成，特別是當(dāng)期望提供植物優(yōu)選的序列時。因此，可以利用所選宿主的偏愛密碼子合成所有或部分期望的結(jié)構(gòu)基因(編碼多肽或蛋白質(zhì)的基因部分)。0055發(fā)明提供含有編碼或互補(bǔ)于編碼在SEQ ID NO2中列出其氨基酸序列的ANT1多肽的核酸序列的多核苷酸，以及在其全長上與SEQ ID NO1給出的ANT1核酸序列相同的多核苷酸序列。發(fā)明也提供成熟的ANT1多肽、其變體或片段的編碼序列，以及閱讀框中成熟多肽或其片段的編碼序列以及其它編碼序列，如編碼引導(dǎo)或分泌序列的pre-，pro-或prepro-蛋白質(zhì)序列。0056ANT1多核苷酸也可以包括非編碼序列，包括例如，但不限于，非編碼5’和3’序列，如轉(zhuǎn)錄、非翻譯序列、終止信號、核糖體結(jié)合位點、穩(wěn)定mRNA的序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化信號和編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可以包含標(biāo)記序列以方便純化融合多肽。本發(fā)明的多核苷酸也包括含有結(jié)構(gòu)基因和與其天然相關(guān)的、控制基因表達(dá)的序列的多核苷酸。0057當(dāng)本發(fā)明分離的多核苷酸包括兩側(cè)是非ANT1核酸序列的ANT1核酸序列時，組合的多核苷酸的全長一般小于25kb，并通常小于20kb，或15kb，在某些例子中小于10kb或5kb。0058除了在此描述的ANT1核酸和對應(yīng)的多肽序列外，預(yù)期能制備ANT1的變體。通過引入適當(dāng)?shù)暮怂嶙兓紸NT1核酸序列中、通過合成預(yù)期的ANT1多肽或通過改變ANT1基因在植物中的表達(dá)水平來制備ANT1變體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到氨基酸的改變可能改變ANT1多肽的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)目或位置，或改變膜定位特征。0059一方面，優(yōu)選的ANT1編碼序列包括含有編碼或互補(bǔ)于編碼與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多的序列一致性的ANT1多肽的核酸序列的多核苷酸。0060另一方面，優(yōu)選的變體包括在其全長上與SEQ ID NO1給出的ANT1核酸序列至少有50％至60％一致性的ANT1多核苷酸序列，以及與這樣的ANT1序列互補(bǔ)的核酸序列。更優(yōu)選的是ANT1多核苷酸序列包括一個與SEQ ID NO1的ANT1序列至少有70％，80％，85％，90％或95％或更多的序列一致性的區(qū)域。0061在相關(guān)的方面，優(yōu)選的變體包括與SEQ ID NO1給出的ANT1多核苷酸序列是“選擇性雜交的”多核苷酸。0062序列變體也包括其編碼的多肽與在此描述的ANT1多核苷酸序列編碼的多肽相同的核酸分子。因此，如果被鑒定的核酸分子的編碼框的位置是已知的，例如通過與已知基因的同源性或序列的延展，可以認(rèn)為作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，可產(chǎn)生大量的編碼序列。例如，三聯(lián)密碼子CGT編碼氨基酸精氨酸。精氨酸選擇性地被CGA，CGC，CGG，AGA和AGG編碼。因此認(rèn)為編碼區(qū)的這些替代屬于本發(fā)明覆蓋的序列變體。任何和所有這些序列變體能按在此描述的用于鑒定ANT1母本序列，SEQ ID NO1的方法使用。0063進(jìn)一步認(rèn)為這些序列變體可能或不可能選擇性的與母本序列雜交。例如，當(dāng)序列變體含有與母本核酸編碼的每一個氨基酸不同的密碼子時，這種情況是有可能的。但是，這樣的變體被特別考慮和包括在本發(fā)明中。根據(jù)本發(fā)明，也包括與簡并性得到的序列變體至少有70％一致的序列。0064雖然ANT1核酸序列變體優(yōu)選的是能在中度高等或高等嚴(yán)格條件下，與在此所述的核酸序列雜交，但在某些情況下，使用如上所述的基于密碼簡并性的變體有優(yōu)勢。例如，根據(jù)被特定的宿主生物體限定的最適密碼子利用，可以選擇密碼子，以增加在特定的原核或真核生物體中肽鏈的表達(dá)速度。作為選擇，可以期望產(chǎn)生具有比所述序列產(chǎn)生的mRNA更長的半衰期的RNA。0065在此描述的天然全長ANT1核酸序列的變體，可以使用本領(lǐng)域一般知道的用于保守性和非保守性突變的任何技術(shù)和指導(dǎo)、寡核苷酸介導(dǎo)的(定點)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變來產(chǎn)生。定點誘變(Kunkel TA等人，1991)；盒式誘變(Crameri A等人，1995)；限制選擇誘變(Haught C等人，1994)或其它已知技術(shù)能作用于克隆DNA以產(chǎn)生編碼ANT1變體的核酸序列。0066認(rèn)為與ANT1表型相關(guān)的基因序列可以被完全或部分合成，特別是當(dāng)期望提供宿主優(yōu)選的序列時。因此，可以使用所選宿主優(yōu)選的密碼子合成全部或部分期望的結(jié)構(gòu)基因(編碼蛋白質(zhì)的基因部分)。宿主優(yōu)選的密碼子可以通過，例如，來自期望的宿主物種的表達(dá)的蛋白質(zhì)中最常使用的密碼子來確定。0067優(yōu)選的是，ANT1多核苷酸編碼保留與SEQ ID NO1列出的多核苷酸編碼的成熟ANT1多肽相同生物功能或活性的ANT1多肽(即當(dāng)在植物中過表達(dá)時產(chǎn)生ANT1表型)。0068變體也包括能用于合成全長ANT1多核苷酸的本發(fā)明的ANT1多核苷酸片段，優(yōu)選的實施例包括編碼多肽變體的多核苷酸，其中本發(fā)明的ANT1多肽序列的5至10，1至5，1至3，2，1或沒有氨基酸殘基被替代、增加或刪除(以任何組合)。特別優(yōu)選的是，替代、增加和刪除是沉默的，以至它們不改變多核苷酸或多肽的性質(zhì)或活性。0069編碼ANT1多肽的多核苷酸序列也能用于構(gòu)建做進(jìn)一步遺傳分析用的雜交探針?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)程序和選定的探針對cDNA或基因組文庫進(jìn)行篩選(例如在Sambrook等人，1989中描述的)。在Sambrook等人，同上，中提供了包括中等嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件。0070探針或其部分也可以在PCR技術(shù)中使用，以產(chǎn)生一組用于鑒定與ANT1序列密切相關(guān)的序列的序列。當(dāng)有意將ANT1序列用作探針時，ANT1編碼序列的特定部分，例如編碼序列的高度保守部分可以被使用。0071例如，ANT1核酸序列可以用作雜交探針對cDNA文庫分離基因，例如，來自其它植物物種的、與SEQ ID NO1揭示的ANT1核酸序列具有相當(dāng)水平的序列一致性的天然發(fā)生的編碼ANT1的變體。作為示范的探針的長度大約是20至50個堿基對。0072在另一個示范性方法中，可以通過使用在此揭示的推測的氨基酸序列篩選選定的cDNA或基因組文庫獲得編碼ANT1多肽的核酸，如果需要，使用在Sambrook等人，同上，中描述的常規(guī)引物擴(kuò)展程序來檢測ANT1前體和還沒有被反轉(zhuǎn)錄成cDNA的mRNA的加工中間體。0073如上所述，本發(fā)明的核酸序列可以包括基因組，cDNA或mRNA序列?！熬幋a的”意思是序列在有義或反義方向?qū)?yīng)于特定氨基酸序列?！叭旧w外的”意思是序列在與其天然相關(guān)的植物基因組之外?！爸亟M的”意思是序列含有通過誘變、限制性酶和諸如此類的操作具有遺傳工程修飾。0074一旦獲得ANT1核酸序列、其同源物、變體或片段的期望形式，它可以通過多種方式被修飾。當(dāng)序列含有非編碼側(cè)翼區(qū)域時，該側(cè)翼區(qū)域可以被切除、誘變等。因此，轉(zhuǎn)換、顛換、刪除和插入可以在天然發(fā)生的序列中完成。0075有或沒有這樣的修飾，ANT1核酸序列、其同源物、變體或片段的期望形式可以整合到用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體中。ANT1多肽0076在一個優(yōu)選的實施例中，發(fā)明提供具有包含SEQ ID NO2給出的序列的天然成熟或全長ANT1多肽序列的ANT1多肽。本發(fā)明的ANT1多肽可以是成熟的ANT1多肽，融合蛋白質(zhì)的一部分或SEQ IDNO2給出的ANT1多肽序列的片段或變體。0077通常，本發(fā)明的ANT1多肽在其全長上具有與ANT1氨基酸序列至少50％至60％的一致性。更優(yōu)選的是，ANT1多肽序列包含一個與SEQ ID NO2的ANT1多肽序列至少有70％，80％，85％，90％或95％或更多序列一致性的區(qū)域。0078SEQ ID NO2的ANT1多肽序列的片段和變體也被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。片段是與前面描述的多肽的部分但不是全部氨基酸序列相同的變體多肽。示范性的片段至少包括10，20，30，40，50，75或100個SEQ ID NO2的相連氨基酸。片段可以是“自立的”或包含在該片段中以形成其一個部分或區(qū)域，最優(yōu)選的是作為一個連續(xù)區(qū)域。優(yōu)選的片段是能調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽的活性，在生物學(xué)上有活性的片段，包括那些有相似的活性或提高的活性或減少的活性的片段。也包括那些在動物特別是人類中具有抗原性或免疫源性的片段。0079本發(fā)明的ANT1多肽也包括不同于SEQ ID NO2的ANT1多肽序列的多肽。這些變體可以是替代、插入或刪除的變體。變體一般顯示與天然發(fā)生的類似物相同性質(zhì)的生物活性，但是如以下進(jìn)一步描述的，也可以選擇具有修飾特征的變體。0080一個或多個核苷酸或氨基酸分別被不同的核苷酸或氨基酸置換產(chǎn)生“替代”。0081“插入”或“增加”是與天然發(fā)生的序列相比，分別增加一個或多個核苷酸或氨基酸殘基導(dǎo)致核苷酸或氨基酸序列上的改變。0082“刪除”被定義為一個或多個核苷酸或氨基酸殘基分別缺失，引起在核苷酸或氨基酸序列上的變化。0083氨基酸替代一般是單個殘基；插入通常是約1至20個氨基酸，但是認(rèn)為可以忍受更大的插入。刪除范圍為大約1至20個殘基，但是在某些例子中刪除可以大得多。0084替代、刪除、插入或其任何組合可以被用于產(chǎn)生最后的變體。一般，這些改變發(fā)生在幾個氨基酸上，以便使分子的改變最小。但是，在某些環(huán)境下，可以忍受更大的改變。0085氨基酸替代可以是用另一個有結(jié)構(gòu)上和/或化學(xué)上的相似性質(zhì)的氨基酸置換一個氨基酸的結(jié)果，例如用絲氨酸置換亮氨酸，即保守氨基酸置換。插入或刪除可以選擇在1至5個氨基酸范圍內(nèi)。0086一般根據(jù)已知的“保守替代”產(chǎn)生替代?！氨Ｊ靥娲笔侵赣冒被釋ν活惏被岬奶娲?，其中的類通過共同的氨基酸側(cè)鏈物理化學(xué)性質(zhì)和在天然發(fā)現(xiàn)的同源蛋白質(zhì)中高度替代頻率來定義(例如通過標(biāo)準(zhǔn)Dayoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣確定)。(一般性參見Doolittle，R.F.，1986。)0087“非保守替代”是指用另一類氨基酸對一類氨基酸的替代。0088ANT1多肽變體一般顯示與天然發(fā)生的類似物相同的性質(zhì)上的生物活性，但是如果需要，可以選擇變體以修飾ANT1多肽的特征。例如，可以改變或除去糖基化位點和更特別的一個或多個O-連接或N-連接的糖基化位點。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到氨基酸的改變可能改變ANT1多肽的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)目或位置，或改變膜定位特征。0089可以使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生變體，例如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變。定點誘變Carter等人，1986；Zoller等人，1987；盒式誘變Wells等人，1985，限制選擇誘變Wells等人，1986或其它已知技術(shù)能作用于克隆DNA以產(chǎn)生編碼ANT1多肽的變體DNA。0090也包括在ANT1多肽定義范圍內(nèi)的是其它相關(guān)ANT1多肽。因此，探針或簡并的PCR引物序列可以用于發(fā)現(xiàn)其它相關(guān)的多肽。有用的探針或引物序列可以針對全部或部分的ANT1多肽序列，或編碼區(qū)外的序列而設(shè)計。如本領(lǐng)域通常所知的，優(yōu)選的PCR引物長度從大約15至大約35個核苷酸，優(yōu)選的為大約20至大約30個，并且如果需要可以含有次黃苷。在本領(lǐng)域，PCR反應(yīng)的條件通常是已知的。0091ANT1多肽的共價修飾也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明提供是成熟蛋白質(zhì)的ANT1多肽，并且該多肽可以含有額外的氨基端或羧基端氨基酸，或成熟多肽中的氨基酸(例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的成熟形式有多于一個的多肽鏈時)。這樣的序列可以在例如蛋白質(zhì)從前體分子到成熟形式的加工中發(fā)揮作用，實現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，減短或增長蛋白質(zhì)半衰期，或方便蛋白質(zhì)在測定或生產(chǎn)中的操作。認(rèn)為細(xì)胞酶可以用于從成熟蛋白質(zhì)中除去任何額外的氨基酸。見，例如Creighton，TE，1983。0092在一個優(yōu)選的實施例中，ANT1多肽或其變體的過表達(dá)與ANT1表型相關(guān)?？贵w0093本發(fā)明進(jìn)一步提供抗ANT1多肽的抗體。該抗體可以是多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的或異共軛的抗體。0094熟練的技術(shù)人員已知制備多克隆抗體的方法。這樣的多克隆抗體可在哺乳動物中生產(chǎn)，例如，一次或多次注射免疫試劑之后，優(yōu)選的是佐劑。一般的，免疫試劑和/或佐劑將通過一系列的皮下或腹膜內(nèi)注射到哺乳動物中。免疫試劑可以包括ANT1多肽或其融合蛋白質(zhì)。將抗原與對被免疫的哺乳動物有免疫源性的蛋白質(zhì)共軛可能是有用的。免疫流程可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員以標(biāo)準(zhǔn)流程或通過常規(guī)試驗方法為基礎(chǔ)來確定。0095作為選擇，抗ANT1多肽的抗體可以是單克隆抗體?？梢酝ㄟ^雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體，其中用免疫試劑免疫小鼠、倉鼠或其它適當(dāng)?shù)乃拗鲃游?，以得到產(chǎn)生或能產(chǎn)生特異性地結(jié)合免疫試劑的抗體的淋巴細(xì)胞Kohler等人，1975。單克隆抗體也能通過重組DNA的方法產(chǎn)生，例如在美國專利號4,816,567中描述的那些。0096本發(fā)明的抗ANT1多肽的抗體可以進(jìn)一步包括人源化抗體或人類的抗體。術(shù)語“人源化抗體”是指嵌合抗體、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2或其它抗體的抗原結(jié)合部分序列)的非人類(如鼠科的)抗體的人源化形式，該人源化的形式含有非人類抗體的部分序列。人源化非人類抗體的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，如在Jones等人，1986；Riechmann等人，1988；和Verhoeyen等人，1988中進(jìn)一步描述的。生產(chǎn)人類抗體的方法在本領(lǐng)域中也是已知的。見，如Jakobovits，A，等人，1995；Jakobovits，A，1995。0097在一個示范性的方法中，抗ANT1多克隆抗體被用于分離基因。蛋白質(zhì)印記雜交分析可以被用于確定特定植物物種的粗提物中存在ANT1或相關(guān)的蛋白質(zhì)。當(dāng)觀察到反應(yīng)性時，可以通過篩選代表特定植物物種的表達(dá)文庫分離編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的基因?？梢酝ㄟ^多種購買得到的載體構(gòu)件表達(dá)文庫，包括在Sambrook等人，1989中描述的lambda gt11。ANT1表型和基因的使用0098從上面的描述可以認(rèn)為ANT1核酸序列、蛋白質(zhì)序列和表型在調(diào)節(jié)ANT1蛋白質(zhì)的表達(dá)和與這些被調(diào)節(jié)的表達(dá)相關(guān)的非天然表型的發(fā)展中有作用。0099ANT1表型具有使突變體區(qū)別于野生型植物的特征，包括被修飾的葉的顏色、被修飾的花的顏色和被修飾的果實的顏色。00100已知花青苷對葉的顏色、花的顏色和果實的顏色有作用?；ㄇ嘬帐且唤M使葉和其它器官呈現(xiàn)粉紅色到紫色的水溶性的類黃酮(Harbone等人，1988)?；ㄇ嘬赵谥参镏信c許多重要的生理和發(fā)育功能相關(guān)，包括，但不限于(1)撲捉光的數(shù)量和質(zhì)量的修飾(Barker等人，1977)；(2)對UV-B輻射效應(yīng)的保護(hù)(Burger和Edwards，1996和Klaper等人，1996)；(3)對食草動物的防御(Coley和Kusar，1996)；(4)對光抑制的保護(hù)(Gould等人，1995和Dodd等人，1998)；以及(5)在逆境中對活性氧中間物的清除(Furuta等人；Sherwin等人，1998；和Yamasaki，1997)?；ㄇ嘬找扬@示出抗氧化劑的活性，暗示在防止癌癥、心血管和肝臟疾病中的作用(Kamei等人，1993；Suda等人，1997；和Wang等人，2000)。也見網(wǎng)址www.pslgroup.com/dg/39fb2.htm，www.wellweb.com/nutri/phytochemicals.htm，和www.nal.usda.gov/ttic/tektran/data/000007/19/0000071970.html.
考慮到這些，在此描述的ANT1表型不僅是彩色的，并且因此在加強(qiáng)觀賞植物、花和食品的裝飾價值中有用，當(dāng)ANT1表型在用作食品或食品添加劑的植物品種中表達(dá)時，它也提供對健康的潛在的作用。00102在一個方面，具有ANT1表型的植物的修飾的葉、花和果實的顏色在改良的觀賞植物、果實和/或插花的開發(fā)中有用。00103在另一個方面，具有ANT1表型的植物的修飾的花青苷含量在植物來源的食物和食物添加劑中有用。00104在另一個方面，如在實施例中進(jìn)一步描述的，ANT1基因可在遺傳操作的植物中作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。00105實施本發(fā)明時，ANT1表型和被修飾的ANT1表達(dá)一般可應(yīng)用于任何種類的植物，如以下進(jìn)一步詳述的。00106在此描述的方法一般可應(yīng)用于所有植物。雖然活化標(biāo)簽和基因鑒定在番茄中完成，鑒定了核酸序列和相關(guān)表型之后，選定的基因、其同源物、變體或片段可以在任何種植物中表達(dá)。一方面，本發(fā)明針對產(chǎn)果實和蔬菜的植物。00107本發(fā)明一般適用于生產(chǎn)肉果的植物；例如，但不限于，番茄(Lycopersicum)；葡萄(Vitas)；草莓(Fragaria)；懸鉤子、黑莓、羅苷莓(Rubus)；黑醋栗和醋栗樹(Ribes)；越橘、越桔、越橘樹(whortleberry)、酸果蔓(Vaccinium)；獼猴桃和中國醋栗樹(Actinida)；蘋果(Malus)；梨(Pyrus)；瓜(Cucumis sp.)，李屬的成員，如李、櫻桃(chery)、油桃和桃；山欖(Manilkara zapotilla)；芒果；鱷梨；杏；桃；櫻桃；菠蘿；番木瓜；西番蓮果；柑橘；海棗；香蕉；車前草和無花果。00108同樣的，本發(fā)明適用于蔬菜植物，包括，但不限于，糖用甜菜、青豆、椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜、芹菜、食用甜菜、黃瓜、茄子、胡椒、南瓜、大黃、筍瓜、summer squash、夏季南瓜、萵苣、蘿卜、胡蘿卜、豌豆、土豆、玉米、九里香(murraya)和香草。00109在相關(guān)的方面，本發(fā)明針對插花工業(yè)、谷類植物、油類植物和干果類植物，以及其它作物包括，但不限于，棉花(Gossypium)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、亞麻(Linumusitatissimum)，煙草(Nicotiana)，草坪草(Poaceaefamily)和其它草料作物。00110描述適合這些和其它植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)的參考文獻(xiàn)在專利申請系列號09/846,758中列出。00111熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識到本領(lǐng)域中有大量的轉(zhuǎn)化技術(shù)，并且不斷產(chǎn)生新技術(shù)。任何適合于目的宿主植物的技術(shù)能在本發(fā)明的范圍內(nèi)應(yīng)用。例如，構(gòu)件可以以多種形式引入，包括，但不限于作為質(zhì)粒中或人工染色體中的DNA鏈?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)，包括，但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、微注射、微彈轟擊、磷酸鈣DNA共沉淀或含有ANT1編碼序列的異源核酸構(gòu)件的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來完成構(gòu)件對目的植物細(xì)胞的引入。優(yōu)選的植物轉(zhuǎn)化是持久的，即，將被引入的表達(dá)構(gòu)件整合到宿主植物基因組中，以便被引入的構(gòu)件傳遞到下一代植物中。00112在實施例中，基于Ti的二元載體系統(tǒng)可以被用于轉(zhuǎn)移并確定被鑒定基因的增強(qiáng)表達(dá)與特定植物特征或表型間的聯(lián)系。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)桿菌二元載體，許多可以購買得到，如pBI121(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。00113用農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化植物的最優(yōu)程序?qū)㈦S著被轉(zhuǎn)化的植物種類而變化。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的示范性的方法包括來自滅菌的幼苗和/或小植株的下胚軸、芽尖、莖或葉組織的外植體的轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)化的植物可以通過有性或細(xì)胞或組織培養(yǎng)繁殖。前面已經(jīng)對大量的不同種植物描述了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，并且可以在科學(xué)文獻(xiàn)中找到這些轉(zhuǎn)化方法。00114依賴于特定的用途，可以制造含有與ANT1表型相關(guān)的核酸序列的異源核酸構(gòu)件，并且該異源核酸構(gòu)件編碼全長蛋白質(zhì)或其生物活性部分以用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。00115ANT1核酸序列或其同源物、變體或片段的表達(dá)可在組成性、可誘導(dǎo)的或可調(diào)節(jié)的啟動子的控制下完成。在某些例子中，ANT1核酸序列或其同源物、變體或片段的表達(dá)可以發(fā)育階段或組織相關(guān)或組織特異性的方式被調(diào)節(jié)。因此，可以在表達(dá)水平、表達(dá)發(fā)生的組織類型和/或表達(dá)的發(fā)育階段方面調(diào)節(jié)在此描述的核酸編碼序列的表達(dá)，產(chǎn)生廣泛的應(yīng)用，其中ANT1編碼序列的表達(dá)在植物中被調(diào)節(jié)。00116具有增強(qiáng)子的強(qiáng)啟動子可以導(dǎo)致表達(dá)的高水平。當(dāng)期望低水平的基礎(chǔ)活性時，弱啟動子可能是更好的選擇。ANT1核酸序列或其同源物、變體或片段的表達(dá)也可以在轉(zhuǎn)錄水平通過使用細(xì)胞種類特異性啟動子或在植物表達(dá)載體中的啟動子元件被控制。00117可以獲得無數(shù)對異源基因表達(dá)有用的啟動子。示范性的組成型啟動子包括懸鉤子E4啟動子(美國專利號5,783,393和5,783,394)，35S CaMV(Jones JD等人，1992)，CsVMV啟動子(Verdaguer B等人，1998)和瓜肌動蛋白啟動子。示范性的組織特異性啟動子包括番茄E4和E8啟動子(美國專利號5,859,330)和番茄2AII基因啟動子(Van Haaren MJJ等人，1993)。00118當(dāng)有意將ANT1序列用作探針時，ANT1編碼序列的特定部分，例如編碼序列的高度保守部分可以被使用。00119在另一個方面，在某些例子中，期望抑制內(nèi)源ANT1序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)。實施本發(fā)明的這個方面的示范性方法包括，但不限于反義抑制(Smith等人，1988)；共抑制(Napoli等人，1989)；核酶(PCT公開文本W(wǎng)O97/10328)；以及有義和反義的組合(Waterhouse等人，1998)。在宿主細(xì)胞中抑制內(nèi)源序列的方法一般利用待抑制序列的至少一部分序列的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些序列可以與內(nèi)源序列的編碼和非編碼區(qū)同源。在某些例子中，期望抑制ANT1核苷酸序列的表達(dá)。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常采用的程序，以及在此提供的ANT1核苷酸序列可以完成這些。00120標(biāo)準(zhǔn)分子和遺傳測試可以用于分析克隆基因和被觀察的表型之間的聯(lián)系。以下描述了對確定(預(yù)測或確認(rèn))基因或在植物中的基因產(chǎn)物的功能有用的大量其它技術(shù)。DNA/RNA分析00121從突變植物體中得到的DNA可以通過測序來在核苷酸水平上鑒定突變。通過野生型(WT)基因的過表達(dá)可以恢復(fù)突變體的表型。突變體和野生型植株中，階段性的和組織特異性的基因表達(dá)模式可以通過，例如原位雜交確定?？梢酝瓿苫蚣谆闆r的分析，特別是兩側(cè)的調(diào)控區(qū)域。其它合適的技術(shù)包括過表達(dá)、異常表達(dá)、在其它植物物種中的表達(dá)和基因敲除(反向遺傳學(xué)(reverse genetics)、靶定敲除、病毒誘導(dǎo)的基因沉默)(VIGS，見Baulcombe D，1999)。00122在優(yōu)選的應(yīng)用中，微陣列分析，也叫做表達(dá)圖譜或轉(zhuǎn)錄圖譜被用于同時測定在許多不同基因的表達(dá)中的差異或被誘導(dǎo)的改變。用于微陣列分析的技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的(Schena M等人，Science(1995)270467-470；Baldwin D等人，1999；Dangond F，Physiol Genomics(2000)253-58；van Hal NL等人，JBiotechnol(2000)78271-280；Richmond T和Somerville S，CurrOpin Plant Biol(2000)3108-116)?？梢酝瓿蓡蝹€標(biāo)記植物的微陣列分析，特別是其基因已被分離的植物。這樣的分析能鑒定作為目的基因過表達(dá)的后果而被協(xié)同調(diào)控的其它基因，這樣可能有助于確定在特定途徑中未知基因的位置?；虍a(chǎn)物分析00123基因產(chǎn)物的分析可以包括重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、抗血清的生產(chǎn)、免疫定位、催化或其它活性的生物化學(xué)測試、磷酸化情況的分析和通過酵母雙雜交試驗分析與其它蛋白質(zhì)的相互作用。途徑分析00124途徑分析包括以它的過表達(dá)表型或與相關(guān)基因的序列同源性為基礎(chǔ)，確定基因或基因產(chǎn)物在特定生物化學(xué)或信號途徑中的位置。作為選擇，分析可以包括與野生型植株和其它突變植株(產(chǎn)生雙重突變體)的遺傳雜交，以確定基因在途徑中的位置，或確定突變對途徑中下游的“報告子”基因的表達(dá)的效應(yīng)。其它分析00125可以完成其它分析以確定或確認(rèn)被分離的基因和它的產(chǎn)物參與特定代謝或信號途徑的情況，以幫助確定基因的功能。00126在此的所有發(fā)表物、專利和專利申請都被完整清楚地作為參考文獻(xiàn)引用。
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序列表<110>Exelixis Plant Sciences，Inc。<120>在番茄中花青苷突變體(ANT1)的鑒定和表征<130>EP01-002C<150>US 60/244,685<151>2000-10-30<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>825<212>DNA<213>番茄<400>1atgaacagta catctatgtc ttcattggga gtgagaaaag gttcatggac tgatgaagaa 60gattttcttc taagaaaatg tattgataag tatggtgaag gaaaatggca tcttgttccc120ataagagctg gtctgaatag atgtcggaaa agttgtagat tgaggtggct gaattatcta180aggccacata tcaagagagg tgactttgaa caagatgaag tggatctcat tttgaggctt240cataagctct taggcaacag atggtcactt attgctggta gacttcccgg aaggacagct300aacgatgtga aaaactattg gaacactaat cttctaagga agttaaatac tactaaaatt360gttcctcgcg aaaagattaa caataagtgt ggagaaatta gtactaagat tgaaattata420aaacctcaac gacgcaagta tttctcaagc acaatgaaga atgttacaaa caataatgta480attttggacg aggaggaaca ttgcaaggaa ataataagtg agaaacaaac tccagatgca540tcgatggaca acgtagatcc atggtggata aatttactgg aaaattgcaa tgacgatatt600gaagaagatg aagaggttgt aattaattat gaaaaaacac taacaagttt gttacatgaa660gaaatatcac caccattaaa tattggtgaa ggtaactcca tgcaacaagg acaaataagt720catgaaaatt ggggtgaatt ttctcttaat ttaccaccca tgcaacaagg agtacaaaat780gatgattttt ctgctgaaat tgacttatgg aatctacttg attaa825<210>2<211>274<212>PRT<213>番茄<400>2Met Asn Ser Thr Ser Met Ser Ser Leu Gly Val Arg Lys Gly Ser Trp1 5 10 15Thr Asp Glu Glu Asp Phe Leu Leu Arg Lys Cys Ile Asp Lys Tyr Gly20 25 30Glu Gly Lys Trp His Leu Val Pro Ile Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys35 40 45Arg Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro His Ile50 55 60Lys Arg Gly Asp Phe Glu Gln Asp Glu Val Asp Leu Ile Leu Arg Leu65 70 75 80His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro85 90 95Gly Arg Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Asn Leu Leu100 105 110Arg Lys Leu Asn Thr Thr Lys Ile Val Pro Arg Glu Lys Ile Asn Asn115 120 125Lys Cys Gly Glu Ile Ser Thr Lys Ile Glu Ile Ile Lys Pro Gln Arg
130 135 140Arg Lys Tyr Phe Ser Ser Thr Met Lys Asn Val Thr Asn Asn Asn Val145 150 155 160Ile Leu Asp Glu Glu Glu His Cys Lys Glu Ile Ile Ser Glu Lys Gln165 170 175Thr Pro Asp Ala Ser Met Asp Asn Val Asp Pro Trp Trp Ile Asn Leu180 185 190Leu Glu Asn Cys Asn Asp Asp Ile Glu Glu Asp Glu Glu Val Val Ile195 200 205Asn Tyr Glu Lys Thr Leu Thr Ser Leu Leu His Glu Glu Ile Ser Pro210 215 220Pro Leu Asn Ile Gly Glu Gly Asn Ser Met Gln Gln Gly Gln Ile Ser225 230 235 240His Glu Asn Trp Gly Glu Phe Ser Leu Asn Leu Pro Pro Met Gln Gln245 250 255Gly Val Gln Asn Asp Asp Phe Ser Ala Glu Ile Asp Leu Trp Asn Leu260 265 270Leu Asp<210>3<211>10078<212>DNA<213>pAG3202<400>3tccctttagt gagggttaat tccgagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 60tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa120gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct180ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga240ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 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1.分離的多核苷酸分子，其含有編碼或互補(bǔ)于編碼與SEQ IDNO2的氨基酸序列至少有70％序列一致性的ANT1多肽的序列的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，或其互補(bǔ)序列或片段，所述多核苷酸含有在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1的核酸序列雜交的核酸序列。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中ANT1多肽具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少80％的序列一致性。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中ANT1多肽具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少90％的序列一致性。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中ANT1多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，或其互補(bǔ)序列，所述多核苷酸含有SEQ ID NO1的核酸序列。
7.含有被分離的權(quán)利要求1的多核苷酸的植物轉(zhuǎn)化載體。
8.含有權(quán)利要求7的載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
9.在植物中產(chǎn)生ANT1表型的方法，所說的方法包括將根據(jù)權(quán)利要求7的植物轉(zhuǎn)化載體引入植物的祖先細(xì)胞，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的祖先細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的多核苷酸序列是表達(dá)的，所說的轉(zhuǎn)基因植物顯示ANT1表型。
10.通過權(quán)利要求9的方法獲得的植物。
11.從根據(jù)權(quán)利要求10的植株中獲得的植物部分。
12.選擇含有第一個多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物的方法，包括步驟(a)將含有第一個多核苷酸和根據(jù)權(quán)利要求1的ANT1多核苷酸的植物轉(zhuǎn)化載體引入植物的祖先細(xì)胞中，和(b)培養(yǎng)祖先細(xì)胞以產(chǎn)生顯示ANT1表型的植物，其中將顯示ANT1表型的植物作為也含有第一個多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物來選擇。
全文摘要
本發(fā)明針對稱為花青苷1(ANT1)的新的植物表型，在植物中表達(dá)以展示ANT1表型的核酸序列和對應(yīng)的氨基酸序列。也提供展示被修飾的ANT1表達(dá)的植物細(xì)胞。
文檔編號C07K14/415GK1473195SQ01818244
公開日2004年2月4日 申請日期2001年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月30日
發(fā)明者K·康納斯, H·V·馬修斯, A·劉, K 康納斯, 馬修斯 申請人:?？巳巳怪参锟茖W(xué)公司