專利名稱：用于分離分子和流體運(yùn)動的設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分離化合物、尤其是高分子化合物的方法和設(shè)備，其中液體的大量運(yùn)動可被控制。
背景技術(shù)：
基于隔膜的電泳法是一種新技術(shù)，其起初是為了分離例如蛋白質(zhì)、核苷酸和復(fù)糖等高分子而發(fā)展起來的。這種方法提供一種高純度、可量測的分離，與現(xiàn)有的高分子分離方法相比，這種分離更快、更經(jīng)濟(jì)并且具有更高的產(chǎn)量，并且提供了同時使高分子溶液凈化和解毒的可能性。
在一種形式中，在一個盒(cartridge)中實(shí)施這種技術(shù)，該盒包括多個容納在可通過電荷和/分子量使化合物分離的系統(tǒng)中的隔膜。同時，該系統(tǒng)還可進(jìn)行濃縮和脫鹽/滲析。該系統(tǒng)的多樣性使這種技術(shù)能夠用于很多其它領(lǐng)域，特別是用于生產(chǎn)醫(yī)用生物成分。隔膜的構(gòu)造可使得生物污染物在分離時同時被去除——目前生物技術(shù)工業(yè)中尚未提供這種作業(yè)，并且這種作業(yè)由于時間延遲以及作業(yè)的復(fù)雜性而使成本增加。
在電泳條件下，使液體通過多孔隔膜從一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個區(qū)域，就叫做電內(nèi)滲(EEO)。電內(nèi)滲是一種伴隨基于隔膜的電泳技術(shù)自然發(fā)生的現(xiàn)象，通過對其進(jìn)行控制可導(dǎo)致產(chǎn)品回收率的增加、運(yùn)行時間的減少和試樣的濃縮。通過在特定試樣流中控制大量液體轉(zhuǎn)移的程度而維持目標(biāo)分子的濃度，從而實(shí)現(xiàn)上述的改進(jìn)。實(shí)現(xiàn)電內(nèi)滲的一種方法為通過電滲，在這種方法中，利用外部電源改變正在進(jìn)行滲透或內(nèi)滲的系統(tǒng)的速度。大的體積增加對于系統(tǒng)按比例增加的應(yīng)用可能具有更大的影響。對電內(nèi)滲的控制會使成本顯著降低，而且還會提高工廠的維護(hù)效率。能夠濃縮試樣同時不對例如活度、功能性、數(shù)量等產(chǎn)生不利影響，將是非常有用的。
本發(fā)明開發(fā)出一種對基于隔膜的電泳技術(shù)的改進(jìn)，有助于控制大量液體的轉(zhuǎn)移/內(nèi)滲。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供一種電泳設(shè)備，包括(a)第一電極區(qū)域中的第一電極；(b)第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；(c)設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；(d)第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；其中第一隔膜與第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域中分離出來；以及其中至少一個隔膜是能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動的屏障隔膜；(e)適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域的裝置；和(f)適于將試樣組分傳遞到第一間隙體積的裝置；其中，施加電勢時，引起液體從試樣組分通過至少一個隔膜運(yùn)動到鄰近電極區(qū)域中，并且至少一個隔膜防止液體實(shí)質(zhì)上大量(bulk)移動到試樣中。
在使用中，將試樣裝在第一間隙體積內(nèi)(也稱為流1)，將緩沖劑或溶劑供給到電極區(qū)域，在電場區(qū)域施加電勢，使得水流出試樣而移動到鄰近的電極區(qū)域中。因此，通過使液體流出試樣而將試樣濃縮。形成屏障的隔膜實(shí)質(zhì)上防止了液體大量流入試樣，而且電泳過程引起水和鹽從試樣中出來。
也可以將試樣放置在一個(或兩個)電極區(qū)域中，并在施加電勢期間引起一種或多種化合物從試樣中移動進(jìn)入相鄰的間隙體積中。
該裝置還可包括適于將選定電勢施加到至少一個電場區(qū)域的裝置。在這種形式中，為設(shè)備設(shè)置電源，或?qū)㈦娫磁c設(shè)備形成一體。通常，設(shè)備通過任何合適的電連接設(shè)施連接到外部電源上。
根據(jù)第二個方面，本發(fā)明提供一種電泳設(shè)備，包括(a)第一電極區(qū)域中的第一電極；(b)第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；(c)設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；(d)第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；(e)第三隔膜，設(shè)置在第二電極區(qū)域與第一隔膜之間，從而在它們之間限定第二間隙體積；其中第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域中分離出來，第三隔膜將第二間隙體積從第二電極區(qū)域中分離出來，其中至少一個隔膜是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；(f)適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域、第二電極區(qū)域和第二間隙體積的裝置；和(g)適于將試樣組分傳遞到第一間隙體積的裝置；其中，施加電勢時，引起一種或多種成分從試樣組分通過至少一個隔膜運(yùn)動到鄰近電極區(qū)域或間隙體積中，并且至少一個隔膜防止液體實(shí)質(zhì)地大量移動到試樣中。
在一個優(yōu)選形式中，該設(shè)備還包括(h)適于去除設(shè)備中產(chǎn)生的熱量的裝置。
優(yōu)選的，試樣和液體穿過熱交換器從而去除電泳過程中設(shè)備所產(chǎn)生的熱量。
該設(shè)備還可包括適于將選定電勢施加到至少一個電場區(qū)域的裝置。在這種形式中，為設(shè)備設(shè)置電源，或?qū)㈦娫磁c設(shè)備形成一體。通常，設(shè)備通過任何合適的電連接裝置連接到外部電源上。
根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，本發(fā)明提供一種電泳系統(tǒng)，包括(a)第一電極區(qū)域中的第一電極；(b)第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加第一電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；(c)設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；(d)第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；(e)第三隔膜，設(shè)置在第二電極區(qū)域與第一隔膜之間，從而在它們之間限定第二間隙體積；(f)適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域、第二電極區(qū)域和第二間隙體積的裝置；(g)適于將試樣組分傳遞到第一或第二間隙體積其中一個的裝置；其中，施加第一電勢時，引起一種或多種成分從試樣組分通過至少一個隔膜運(yùn)動到鄰近的第一或第二間隙體積中；(h)第三電極區(qū)域中的第三電極；(i)第四電極區(qū)域中的第四電極，第三電極相對于第四電極設(shè)置，從而在第三電極和第四電極之間施加第二電勢時，適于在它們之間的第二電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；(j)設(shè)置在第二電場區(qū)域中的第四隔膜；(k)第五隔膜，設(shè)置在第三電極區(qū)域和第四隔膜之間，從而在它們之間限定第三間隙體積；其中第四和第五隔膜將第四間隙體積從第三和第四電極區(qū)域中分離出來，以及其中第四和第五隔膜中的至少一個是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；(l)適于將液體傳遞到第三電極區(qū)域和第四電極區(qū)域中的裝置；和(m)適于將試樣組分從第一或第二間隙體積傳遞到第三間隙體積的裝置；其中，施加第二電勢時，引起液體通過至少第四或第五隔膜從試樣組分中運(yùn)動到鄰近電極區(qū)域中；其中屏障隔膜防止液體實(shí)質(zhì)地大量移動到試樣中。
在一個優(yōu)選形式中，該設(shè)備還包括(n)適于去除設(shè)備中產(chǎn)生的熱量的裝置。
優(yōu)選的，試樣和液體穿過熱交換器從而去除電泳過程中設(shè)備所產(chǎn)生的熱量。
該設(shè)備還可包括適于將第一選定電勢施加到第一電場區(qū)域的裝置；和適于將第二選定電勢施加到第二電場區(qū)域的裝置。在這種形式中，為設(shè)備設(shè)置一個或多個電源，或?qū)㈦娫磁c設(shè)備形成一體。通常，設(shè)備通過任何合適的電連接裝置連接到外部電源上，這樣可施加兩個獨(dú)立的電勢。
優(yōu)選的，形成能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動的屏障的至少一個隔膜是可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜。
在另一優(yōu)選形式中，一些隔膜是電泳分離隔膜，另一些隔膜是具有限定孔隙尺寸的限制隔膜。優(yōu)選的，限制隔膜設(shè)置在電極區(qū)域和鄰近間隙體積之間。至少一個限制隔膜是可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜，其控制液體在電場影響下的大量移動。
電泳分離隔膜優(yōu)選由聚丙烯酰胺制成，其分子量截止值(cut-off)至少為約3kDa。隔膜分子量截止值取決于被處理試樣、試樣混合物中的其它分子，和所進(jìn)行的分離類型。
優(yōu)選的，至少一個限制隔膜由聚丙烯酰胺制成。隔膜分子量截止值取決于被處理試樣、試樣混合物中的其它分子，和所進(jìn)行的分離類型。
優(yōu)選的，可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜為三乙酸纖維素(CTA)隔膜?？梢岳斫獾氖牵烧T導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜可由例如與戊二醛交聯(lián)的聚(乙烯醇)(PVAl+glut)等任何其它適當(dāng)?shù)母裟げ牧现瞥伞?br> 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有名義分子量截止值為5、10或20kDa的CTA隔膜尤其適用于根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備?？梢岳斫獾氖?，其它分子量截止值也適用于本發(fā)明。
通過任何適當(dāng)?shù)谋醚b置，向陰極區(qū)域和陽極區(qū)域提供適當(dāng)?shù)碾娊庖夯蚓彌_溶液。待處理的試樣通過任何適當(dāng)?shù)谋醚b置直接提供到第一間隙體積或第二間隙體積(如果存在)中。
優(yōu)選的，所述區(qū)域和一個或多個間隙體積構(gòu)造成使得相應(yīng)液體/緩沖劑溶液和試樣溶液的流動能夠形成流。在這種形式中，可快速有效地處理較大的體積。通過適當(dāng)?shù)谋醚b置，溶液通常從相應(yīng)的容器中移動或再循環(huán)通過所述區(qū)域和一個或多個間隙體積。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，采用蠕動泵作為用于移動試樣、緩沖劑或液體的泵裝置。
電極緩沖劑或電解液以及試樣緩沖劑可為任何適當(dāng)?shù)木彌_劑或電解液。例如可包括但不限于Tris/硼酸鹽、Hepes/咪唑、伽馬氨基丁酸/醋酸和Hepes/組氨酸緩沖劑。
本發(fā)明適用于能夠具有電荷或限定分子量的任何混合物的分離或處理。例如可用于但不限于如肽、蛋白質(zhì)、核酸等的生物化合物。
在一個實(shí)施方案中，用適當(dāng)?shù)难b置將電極緩沖劑、其它緩沖劑和試樣溶液進(jìn)行冷卻，從而確保小分子、化合物、高分子或其它試樣成分在電泳過程中不會出現(xiàn)失活現(xiàn)象，并在設(shè)備使用中保持需要的溫度。
優(yōu)選的是，為了收集和/或濃縮試樣成分，收集含有任何分離的成分或分子的體積或流的至少一個中的液體并用適當(dāng)?shù)娜軇┐?，從而確保電泳過程能夠有效地進(jìn)行。
在使用中，將試樣裝在第一間隙體積內(nèi)(也稱為流1)，緩沖劑或溶劑供給到電極區(qū)域和第二間隙體積(流2)，向電場區(qū)域施加電勢，引起試樣中的至少一種成分移動到相鄰電極區(qū)域中的緩沖劑/溶液中，或移動到相鄰第二間隙體積中。形成屏障的隔膜實(shí)質(zhì)上防止液體流入到試樣中。
可以理解的是，間隙體積的順序可以顛倒，即將試樣裝在第二間隙體積(流2)內(nèi)，將緩沖劑或溶劑供給到電極區(qū)域和第一間隙體積中，將電勢施加到電極區(qū)域，引起試樣中的至少一種成分移動到相鄰電極區(qū)域或相鄰第一間隙體積(流1)中。
也可將試樣放置在一個(或兩個)電極區(qū)域中，在施加電勢期間，引起一種或多種成分移動進(jìn)入一個或多個間隙體積中。
第一隔膜優(yōu)選為由聚丙烯酰胺(PA)制成的電泳分離隔膜，并具有限定的分子量截止值。優(yōu)選的，電泳分離隔膜的限定分子量截止值為從約1kDa到約2000kDa。分離隔膜的分子量截止值的選擇取決于被處理試樣以及混合物中的其它分子。但是，可以理解的是，具有其它化學(xué)性質(zhì)或組成的隔膜也可用于本發(fā)明。
第二和第三隔膜中的至少一個為限制隔膜(restrictionmembrane)，其優(yōu)選由聚丙烯酰胺制成，并且其分子量截止值通常小于分離隔膜，優(yōu)選為從約1kDa到約1000kDa。限制隔膜的分子量截止值的選擇取決于待處理的試樣和待去除的高分子的尺寸。限制隔膜可與形成屏障的隔膜具有相同或不同的分子量截止值。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，形成第一和第二間隙體積的隔膜以筒或盒的形式設(shè)置，其位于設(shè)備電極區(qū)域之間。盒的構(gòu)型優(yōu)選為一個殼體，具有第一隔膜，第一隔膜位于第二隔膜與第三隔膜之間，從而形成所需的間隙體積。
優(yōu)選的，該筒或盒可從適于包含或容納該筒的電泳設(shè)備中拆除。
該盒可包括一個或多個電極。
電極間距對穿過隔膜的試樣成分的分離或運(yùn)動產(chǎn)生影響。電極間距越短，成分的電泳運(yùn)動就越快。研究發(fā)現(xiàn)約6毫米的距離適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的設(shè)備。對于按比例增加的設(shè)備，該距離取決于分離隔膜的數(shù)量和類型、試樣室的尺寸和體積、緩沖劑和分離的產(chǎn)品。優(yōu)選距離為從約6毫米到約10毫米。該距離還與施加到設(shè)備上的電壓有關(guān)。
電場的影響基于以下公式e＝V/d(e＝電場，V＝電壓，d＝距離)因此，電極間距越短，分離越快。優(yōu)選的，為增加電場強(qiáng)度應(yīng)縮短電極間距，從而進(jìn)一步提高通過隔膜的轉(zhuǎn)移速度。
試樣/緩沖劑/液體的流速對分離成分產(chǎn)生影響。從每分鐘幾毫升到每分鐘幾升的速度都可采用，其取決于設(shè)備的構(gòu)型以及待分離試樣的性質(zhì)和體積?，F(xiàn)在，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的設(shè)備中，優(yōu)選流速為大約20±5mL/min。但是，根據(jù)各種分離狀況，從約0mL/min到約50,000mL/min的流速都可采用。最大流速可更大，取決于泵裝置和設(shè)備的尺寸。流速的選擇取決于被轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品、轉(zhuǎn)移效率、與其它應(yīng)用的預(yù)定位及后定位。
對施加電壓和/或電流的選擇或應(yīng)用隨不同的分離而改變。通常采用最高可達(dá)幾千伏的電壓，但是電壓的選擇和改變?nèi)Q于設(shè)備的構(gòu)型、緩沖劑和待分離的試樣。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的設(shè)備中，優(yōu)選電壓為250V。但是，根據(jù)轉(zhuǎn)移、效率、按比例的增加和具體方法，從約0V到約5000V的電壓都可采用。還可采用更高的電壓，取決于處理的設(shè)備和試樣。
任選的，可定期地將電勢停止和/或反向，從而使得已經(jīng)進(jìn)入隔膜的成分移動回到其來源的空間或流，但幾乎不引起已經(jīng)完全穿過隔膜的成分穿過隔膜返回。
將電勢反向是一個可選的，另一可選對象為停止期。停止(在一段時間內(nèi)不施加電勢)為一個可選步驟，其可代替?zhèn)溥x的電勢反向步驟，或包括在備選的電勢反向步驟之前或之后。通常該停止技術(shù)可用于特定分離應(yīng)用中，作為電勢反向步驟的替換步驟或輔助步驟。
為方便起見，第一間隙體積或流叫做流1，第二間隙體積或流叫做流2。通常，試樣放置在流1中，移動的成分移動通過分離隔膜進(jìn)入流2。
在一個特定優(yōu)選實(shí)施方案中，電極由鍍鉑鈦網(wǎng)制成。但是，可以理解的是，其它材料和構(gòu)型也可采用。
在使用中，緩沖劑或其它合適的溶劑穿過電極區(qū)域循環(huán)，并且將液體試樣裝到第一和第二間隙體積的至少一個中。當(dāng)通過電極向設(shè)備施加電勢或電場時，會引起試樣中的一些成分移動穿過隔膜進(jìn)入相鄰間隙體積或電極區(qū)域內(nèi)。可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜防止或控制間隙體積與電極區(qū)域之間的液體實(shí)質(zhì)的大量移動，從而防止在分離過程中試樣或分離成分的不必要稀釋。
隔膜可形成為多層或夾層的結(jié)構(gòu)。隔膜的厚度可以影響化合物的分離或運(yùn)動。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，隔膜越薄，運(yùn)動越迅速和有效。
在本發(fā)明的第四個方面，本發(fā)明提供一種用于濃縮試樣的方法，該方法包括(a)提供根據(jù)本發(fā)明第一個方面的電泳設(shè)備；(b)向第一和第二電極區(qū)域中添加緩沖劑或電解液；(c)向第一間隙體積中添加試樣；(d)在電極之間施加電勢，引起試樣中的液體移動穿過隔膜進(jìn)入相鄰電極區(qū)域；以及可選地(f)獲得濃縮的試樣；其中屏障隔膜允許液體從試樣中大量移動出來。
根據(jù)本發(fā)明第五個方面，本發(fā)明提供一種用于從試樣中至少移動一種成分、并同時控制液體的大量移動的方法，該方法包括(a)提供根據(jù)本發(fā)明第二個方面的電泳設(shè)備；(b)向第一和第二電極區(qū)域添加緩沖劑或電解液；(c)向第一間隙體積添加試樣；(d)向第二間隙體積添加緩沖劑或液體；(e)在電極之間施加電勢，引起至少一種化合物從試樣中移動通過隔膜進(jìn)入鄰近電極區(qū)域或間隙體積；以及可選的
(f)收集從試樣中移動出來的成分；其中屏障隔膜控制液體的實(shí)質(zhì)的大量流入或流出一個或多個間隙體積。
根據(jù)第六個方面，本發(fā)明提供一種用于從試樣中至少移動一種成分、并同時控制液體的大量移動的方法，該方法包括(a)提供根據(jù)本發(fā)明第三個方面的電泳系統(tǒng)；(b)向第一、第二、第三和第四電極區(qū)域添加緩沖劑或電解液；(c)向第一間隙體積添加試樣；(e)在第一和第二電極之間施加電勢，引起至少一種化合物從試樣中移動穿過隔膜進(jìn)入第二間隙體積中；(f)將含有所述化合物的試樣從第一間隙體積或第二間隙體積傳遞到第三間隙體積中；(g)在第三和第四電極之間施加電勢，引起第三間隙體積中的液體從試樣中移動穿過隔膜進(jìn)入鄰近電場區(qū)域中，從而濃縮試樣中的所述化合物；以及任選地(h)收集濃縮的試樣；其中屏障隔膜控制液體的實(shí)質(zhì)的大量進(jìn)出第三間隙體積。
屏障隔膜能夠防止液體大量流入一個或多個間隙體積的大量移動，或能引起液體流出間隙體積。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，將兩個設(shè)備以這樣的方式連接，即，使得進(jìn)一步控制液體大量流入一個或多個間隙體積。第一設(shè)備根據(jù)本發(fā)明的第二個方面構(gòu)造，其具有或不具有屏障隔膜，起到分離一種或多種選定化合物的作用。第二設(shè)備可根據(jù)本發(fā)明的第一個方面構(gòu)造，其使得可以濃縮分離的成分。優(yōu)選的，施加到各設(shè)備上的電勢是單獨(dú)控制的。在一個優(yōu)選形式中，第一設(shè)備的第二間隙體積與第二設(shè)備的第一間隙體積流體連通。在使用中，當(dāng)待分離的化合物移動到第一設(shè)備的第二間隙體積后，其隨后被轉(zhuǎn)移到第二設(shè)備的第一間隙體積，第二設(shè)備使得不需要的液體從分離的化合物中流出。這種雙設(shè)備系統(tǒng)還起到試樣濃縮器的作用，基本不損失液體或試樣。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，兩設(shè)備以這樣的方式連接，即，使得進(jìn)一步控制或防止液體大量流入一個或多個間隙體積。第一設(shè)備根據(jù)本發(fā)明的第二個方面構(gòu)造，具有或不具有屏障隔膜，起到分離一種或多種選定化合物的作用。第二設(shè)備根據(jù)本發(fā)明的第一個方面構(gòu)造，使得可以在電泳的過程中濃縮試樣。優(yōu)選的，施加到各設(shè)備上的電勢是單獨(dú)控制的。在這種優(yōu)選形式中，包含試樣的第一設(shè)備的第一間隙體積與第二設(shè)備的第一間隙體積流體連通。在使用中，試樣在兩設(shè)備之間循環(huán)，從而去除或減少在第一設(shè)備中電泳過程中液體的積累。待分離的化合物向第二設(shè)備的第一間隙體積運(yùn)動，以便收集。該雙設(shè)備系統(tǒng)還起到試樣濃縮器的作用，基本不損失液體或試樣。
根據(jù)第七個方面，本發(fā)明還涉及在從試樣中分離一種或多種化合物的分離或電泳過程中，根據(jù)本發(fā)明第一或第二個方面的設(shè)備的使用。
根據(jù)第八個方面，本發(fā)明還涉及在從試樣中分離或一種或多種化合物的分離或電泳過程中，根據(jù)本發(fā)明第三或第四個方面的方法的使用。
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在本說明書中，“包括”一詞應(yīng)被理解為含有所述元素、整數(shù)或步驟、或元素組、整數(shù)組或步驟組，而不排除任何其它元素、整數(shù)或步驟或元素組、整數(shù)組或步驟組，除非上下文需要另外的理解。
本說明書所包括的任何文獻(xiàn)、法案、材料、裝置、制品等等的論述僅僅是為本發(fā)明提供提供上下文環(huán)境的目的。當(dāng)其在澳大利亞處于本申請的各權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期之前時，不應(yīng)將其部分或全部視為現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)，或本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的一般常識。
為了使本發(fā)明能夠被更清楚地理解，以下將參考附圖和實(shí)施例描述本發(fā)明的優(yōu)選形式。


圖1為本發(fā)明第一實(shí)施方案的示意圖。圖1A示出了電極、電極區(qū)域和間隙體積的布置。圖1B示出了兩個隔膜相對于電極的定位。
圖2是本發(fā)明第二實(shí)施方案的示意圖。圖2A示出了電極、電極區(qū)域和第一和第二間隙體積的布置。圖2B示出了三個隔膜相對于電極的定位。
圖3是本發(fā)明第三實(shí)施方案的示意圖。圖3A示出了電極、電極區(qū)域和第一、第二和第三間隙體積的布置。圖3B示出了五個隔膜相對于兩組電極的定位。
圖4示出了CTA標(biāo)定試驗(yàn)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。
圖5示出了采用CTA隔膜的內(nèi)滲速度。
圖6示出了CTA定向和內(nèi)滲速度的比較。
圖7示出了采用CTA隔膜的電內(nèi)滲引起的體積減小速度。
圖8示出了隨著電壓改變的牛血清蛋白(BSA)回收率。
圖9示出了采用PVA1隔膜的電內(nèi)滲引起的體積減小速度。
圖10示出了電內(nèi)滲引起的體積減小速度。
圖11示出了具有用于控制內(nèi)滲的流1濃縮機(jī)的兩設(shè)備的管路(plumbing)。
圖12示出了內(nèi)滲速度和血纖蛋白原百分比回收率的比較。
圖13示出了同時分離并濃縮牛腦組織均漿的牛蛋白感染素蛋白質(zhì)(PrP)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析，其中的分離和濃縮采用了基于隔膜的電泳技術(shù)和PVA1隔膜。A部分來源于電泳過程的試樣的SDS-PAGE；B部分來源于采用抗-PrP R029(Prionics，瑞士)的電泳過程的試樣的免疫印跡(Western blot)。S10為時間為0分鐘時的流1；S1180為時間為180分鐘時的流1；S20為時間為0分鐘時的流2；S2180為時間為180分鐘時的流2。
圖14示出了本發(fā)明的第一構(gòu)型，其使得能夠同時濃縮和部分凈化試樣。
圖15示出了部分凈化的喂入流的濃縮的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析。
圖16示出了包含去除的雜質(zhì)的流的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析。
圖17示出了本發(fā)明的第二構(gòu)型，其使得能夠同時濃縮和凈化目標(biāo)蛋白質(zhì)，同時將雜質(zhì)從喂入流中去除，并對喂入流的體積進(jìn)行EEO控制。
圖18示出了上述實(shí)驗(yàn)過程中濃縮的喂入流的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析，但同時去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)。通過使喂入流中的成分單純化，減少雜質(zhì)從而強(qiáng)化了目標(biāo)蛋白質(zhì)向產(chǎn)品流的轉(zhuǎn)移。
圖19示出了凈化和濃縮到流2中的目標(biāo)蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析。通過濃縮喂入流而維持向產(chǎn)品流中的轉(zhuǎn)移速度。如果喂入流體積不減小，隨著目標(biāo)蛋白質(zhì)在喂入流中的濃度降低，轉(zhuǎn)移速度變慢。除非喂入流中的雜質(zhì)也減少，否則這種體積減小會導(dǎo)致來自于增加的雜質(zhì)濃度的干擾。
圖20示出了本發(fā)明第三構(gòu)型的示意圖，第三構(gòu)型中目標(biāo)物轉(zhuǎn)移到第二流中，喂入流被濃縮。
圖21示出了本發(fā)明第四構(gòu)型示意圖，第四構(gòu)型使得產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到流1中，同時將流2濃縮并凈化到緩沖流或備選的第三流中，其中對流2的凈化是可選的。
圖22示出了本發(fā)明第五構(gòu)型的示意圖，第五構(gòu)型中在喂入流的任一側(cè)使用EEO隔膜從而強(qiáng)化濃縮效果，同時選擇EEO隔膜的MMCO使得雜質(zhì)轉(zhuǎn)移離開目標(biāo)蛋白質(zhì)，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)保留在中央喂入流中并在其中濃縮。
圖23示出了本發(fā)明第六構(gòu)型的示意圖，第六構(gòu)型采用兩個基于隔膜的電泳設(shè)備，用于分別進(jìn)行濃縮和凈化。
圖24示出了本發(fā)明第七構(gòu)型的示意圖，第七構(gòu)型中目標(biāo)蛋白質(zhì)保留在喂入流中并在其中濃縮。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及基于隔膜的電泳技術(shù)，有助于控制大量液體的轉(zhuǎn)移/內(nèi)滲。如圖1A所示，在一個實(shí)施方案中，電泳設(shè)備110由第一和第二電極區(qū)域111、112組成，其中第一和第二電極區(qū)域111、112各自包含電極113、114，第二電極區(qū)域112相對于第一電極區(qū)域111設(shè)置，從而在電極112、113之間施加選定電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域115中產(chǎn)生電場。設(shè)備110還包括第一間隙體積116，其由設(shè)置在電場區(qū)域115中的第一隔膜117和設(shè)置在第一電極區(qū)域111和第一個隔膜117之間的第二隔膜118限定。第一和第二隔膜117、118將第一間隙體積115從第一和第二電極區(qū)域111、112中分離出來。至少一個隔膜是屏障隔膜，其在電場的影響下能夠控制液體的大量流動。在圖1B中，將第一隔膜117作為屏障隔膜?？梢岳斫獾氖?，第二隔膜118可以形成為屏障隔膜。在圖1中僅為方便起見，將第一電極113作為陰極，將第二電極114作為陽極?？蓪㈦姌O的極性顛倒，即第一電極113為陽極，第二電極114為陰極。
設(shè)備110包括用于將多種流體傳遞到第一電極區(qū)域111、第二電極區(qū)域112和第一間隙體積116的裝置119、120、121，至少一種流體包含試樣組分。設(shè)備100還可包括用于將選定電勢施加到至少一個電場區(qū)域上的裝置。選定電勢的施加引起以下兩種現(xiàn)象中的至少一種試樣組分中任何液體的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入相鄰電極區(qū)域，和試樣組分的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入第一間隙體積內(nèi)。一個或多個屏障隔膜控制液體實(shí)質(zhì)地大量流入和流出第一間隙體積，這樣部分濃縮的產(chǎn)品就收集并且/或保留在第一間隙體積內(nèi)。
在使用中，試樣放置在第一間隙體積116(也稱為流1)內(nèi)，緩沖劑或溶劑供給到電極區(qū)域111、112，向電場區(qū)域施加電勢，引起水從試樣中移動出來進(jìn)入一個相鄰電極區(qū)域。因此，通過驅(qū)動液體從試樣中流出而濃縮試樣。屏障隔膜實(shí)質(zhì)上防止液體大量移動進(jìn)入試樣，電泳過程使得水和鹽從試樣中移動出來。
也可將試樣放置在一個(或兩個)電極區(qū)域中，在施加電勢期間使得一種或多種化合物從試樣中移動出來進(jìn)入相鄰間隙體積內(nèi)。
如圖2A所示，在另一實(shí)施方案中，電泳設(shè)備210由第一和第二電極區(qū)域211、212組成，其中第一和第二電極區(qū)域211、212各自包含一個電極213、214。第二電極區(qū)域212相對于第一電極區(qū)域211設(shè)置，從而在電極213、214之間施加選定電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域215中產(chǎn)生電場。設(shè)備210還包括第一和第二間隙體積216、226。第一間隙體積216由設(shè)置在電場區(qū)域215中的第一隔膜217和設(shè)置在第一電極區(qū)域211和第一個隔膜217之間的第二隔膜218限定。第二間隙體積226由第二隔膜218和設(shè)置在第二電極區(qū)域212和第一隔膜217之間的第三隔膜219限定。第二隔膜218將第一間隙體積216從第一電極區(qū)域211分開，第三隔膜219將第二間隙體積226從第二電極區(qū)域212分開。第一、第二和第三隔膜217、218、219中的至少一個是屏障隔膜，其在電場的影響下能夠?qū)嵸|(zhì)上控制液體的大量流動。在圖2B中，將第二隔膜218作為屏障隔膜。可以理解的是，可將第一隔膜217或第三隔膜219形成為屏障隔膜。在圖2中僅為方便起見，將第一電極213作為陰極，將第二電極214作為陽極。可將電極的極性顛倒，即第一電極213為陽極，第二電極214為陰極。
該設(shè)備包括用于將多種流體傳遞到電極區(qū)域211、212和間隙體積216、226的裝置219、220、221，其中至少一種流體包含試樣組分。設(shè)備200還可包括用于將選定電勢施加到至少一個電場區(qū)域上的裝置。選定電勢的施加引起以下兩種現(xiàn)象中的至少一種試樣組分中任何液體的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入相鄰電極區(qū)域，和試樣組分的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入至少一個間隙體積內(nèi)。一個或多個屏障隔膜實(shí)質(zhì)上控制液體大量流入和流出間隙體積，這樣部分濃縮的產(chǎn)品就收集起來和/或保留在至少一個間隙體積內(nèi)。
在使用中，試樣放置在第一間隙體積(也稱為流1)內(nèi)，緩沖劑或溶劑供給到電極區(qū)域和第二間隙體積(流2)，向電場區(qū)域施加電勢，引起試樣中的至少一種成分移動到相鄰電極區(qū)域中的緩沖劑/溶劑中，或移動到相鄰的第二間隙體積內(nèi)。屏障隔膜實(shí)質(zhì)上防止液體移動進(jìn)入試樣。
可以理解的是，間隙體積的順序可以顛倒，即試樣放置在第二間隙體積(流2)內(nèi)，緩沖劑或溶劑供給到電極區(qū)域和第一間隙體積，向電場區(qū)域施加電勢，引起試樣中的至少一種成分移動到相鄰電極區(qū)域內(nèi)，或移動到相鄰的第一間隙體積(流1)內(nèi)。
也可將試樣放置在一個(或兩個)電極區(qū)域中，在施加電勢期間使得一種或多種成分進(jìn)入一個或多個間隙體積內(nèi)。
如圖3所示，在另一實(shí)施方案中，電泳設(shè)備300由第一和第二電極區(qū)域311、312組成，其中第一和第二電極區(qū)域311、312各自包含一個電極313、314，第二電極區(qū)域312相對于第一電極區(qū)域311設(shè)置，從而在電極311、312之間施加選定電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場。設(shè)備300還包括第一和第二間隙體積316、326。第一間隙體積316由設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜317和設(shè)置在第一電極區(qū)域311和第一個隔膜317之間的第二隔膜318限定。第二間隙體積326由第一隔膜317和設(shè)置在電場區(qū)域312和第一隔膜317之間的第三隔膜319限定。第二隔膜318將第一間隙體積315從第一電極區(qū)域311分開，第三隔膜319將第二間隙體積326從第二電極區(qū)域312分開。
該設(shè)備包括用于將多種流體傳遞到電極區(qū)域和間隙體積的裝置，其中至少一種流體包含試樣組分。該設(shè)備還可包括用于將選定電勢施加到至少一個電場區(qū)域上的裝置。選定電勢的施加引起以下兩種現(xiàn)象中的至少一種試樣組分中任何液體的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入相鄰電極區(qū)域，和試樣組分的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入至少一個間隙體積內(nèi)。一個或多個屏障隔膜控制液體實(shí)質(zhì)的大量流入和流出間隙體積，這樣部分濃縮的產(chǎn)品就收集起來和/或保留在至少一個間隙體積內(nèi)。
設(shè)備300還包括第三電極區(qū)域331和第四電極區(qū)域332，其中第三和第四電極區(qū)域331、332各自包含一個電極323、324。第四電極區(qū)域332相對于第三電極區(qū)域331設(shè)置，從而在電極之間施加選定電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場。設(shè)備300還包括第三間隙體積336，其由設(shè)置在電場區(qū)域中的第四隔膜327和設(shè)置在第三電極區(qū)域331和第四隔膜327之間的第五隔膜328限定。第四隔膜327和第五隔膜328將第三間隙體積336從第三和第四電極區(qū)域331、332分開。至少一個隔膜是屏障隔膜，其在電場的影響下能夠控制液體的大量流動。
在圖2中僅為方便起見，將第一電極313作為陰極，將第二電極314作為陽極，第三電極323作為陰極，第四電極324作為陽極?？蓪㈦姌O的極性顛倒，即第一和第三電極313、323為陽極，第二和第四電極314、324為陰極。同樣，也可將第一和第四電極313、324作為陽極，第二和第三電極314、323作為陰極。
如圖3A所示，兩個設(shè)備連接起來形成根據(jù)本發(fā)明第三個方面的設(shè)備。第一設(shè)備承擔(dān)某種形式的試樣凈化或分離，第二設(shè)備將部分凈化的試樣濃縮。也可根據(jù)本發(fā)明的第二方面構(gòu)造第一設(shè)備，其中第一、第二或第三隔膜中的至少一個也為屏障隔膜，其能夠在電場的影響下控制液體的大量移動。在這種形式中，能夠控制液體流入或流出試樣。
該設(shè)備包括用于將多種流體傳遞到第三電極區(qū)域、第四電極區(qū)域，和第三間隙體積的裝置，其中至少一種流體包含來自于第一和第二間隙體積中至少一個的、部分濃縮的產(chǎn)品。該設(shè)備還可包括用于將選定電勢施加到至少一個電場區(qū)域上的裝置。選定電勢的施加引起以下兩種現(xiàn)象中的至少一種試樣組分中任何液體的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入相鄰電極區(qū)域，和第一部分濃縮產(chǎn)品的至少一部分移動通過至少一個隔膜進(jìn)入第三間隙體積內(nèi)。一個或多個屏障隔膜控制液體的實(shí)質(zhì)的大量流入和流出第三間隙體積，這樣第二部分濃縮的產(chǎn)品就收集起來和/或保留在第三間隙體積內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果使液體穿過多孔隔膜從一個區(qū)域進(jìn)入另一區(qū)域，該過程叫做內(nèi)滲。內(nèi)滲的要點(diǎn)是基于隔膜的電泳技術(shù)，并且通過對其進(jìn)行控制可提高產(chǎn)品回收率、縮短運(yùn)行時間并使試樣濃縮。用于控制內(nèi)滲的一種方法是通過電滲，在這種方法中，外部電源改變正在經(jīng)歷滲透或內(nèi)滲的系統(tǒng)的速度。
為確定生物相容性隔膜，將三乙酸纖維素(CTA)隔膜用于一系列滲析試驗(yàn)，在這些試驗(yàn)中，CTA被確定為高內(nèi)滲隔膜。由于CTA的高內(nèi)滲速度，因此對其在控制內(nèi)滲中的作用進(jìn)行研究。還要做其它工作來研究PVA1隔膜的內(nèi)滲速度。
需要對以下參數(shù)進(jìn)行研究i)CTA內(nèi)滲是否與電壓相關(guān)；ii)PVA1內(nèi)滲是否與電壓相關(guān)；iii)CTA內(nèi)滲是否與pH值相關(guān)；以及iv)CTA被引入基于隔膜的電泳技術(shù)是否可以提高產(chǎn)量、凈化速度，和/或充當(dāng)濃縮器。
材料由澳大利亞Gradipore有限公司生產(chǎn)的基于隔膜的電泳設(shè)備分子量截止值為5kDa、500kDa、700kDa和1500kDa的聚丙烯酰胺(PA)隔膜(Gradipore)5kDa、10kDa和20kDa三乙酸纖維素(CTA)隔膜(Sartorius)5％聚乙烯醇(PVA1)隔膜(Gradipore有限公司)67kDa pI～5的牛血清蛋白(BSA)，45kDa pI4.2的卵清蛋白，14kDapI4.7的胰蛋白酶抑制劑，和330kDa pI5.5血纖蛋白原。
CTA隔膜的分子量截止值標(biāo)定確定10kDa和20kDa的CTA隔膜的分子量截止值，以用于基于隔膜的電泳技術(shù)中。10kDa和20kDa的CTA隔膜用于分離凈化操作，在該操作中，將3mg/mL蛋白質(zhì)混合物(在pH值為8.0的TB中的BSA、卵清蛋白和胰蛋白酶抑制劑各1mg/mL)放置在流1中，并在250V電壓下分離45分鐘進(jìn)入流2。運(yùn)行0分鐘流1和45分鐘流2的非還原(non-reduced)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，從而確定10kDa和20kDa的CTA隔膜的分子量截止值(圖4)。
CTA標(biāo)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖4)顯示CTA隔膜的實(shí)際截止值對于10kDa隔膜為14kDa，對于20kDa CTA隔膜為45kDa。10kDa CTA隔膜的14kDa分子量截止值是從聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中確定出來的，其中在45分鐘電泳操作期間，穿過10kDa CTA隔膜后，僅觀察到胰蛋白酶抑制劑(14kDa)。20kDa CTA隔膜的45kDa分子量截止值是從聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中確定出來的，其中在45分鐘電泳操作期間，胰蛋白酶抑制劑(14kDa)、卵清蛋白(45kDa)和少量BSA(67kDa)穿過20kDa CTA隔膜。
CTA隔膜定向CTA隔膜是不對稱的，因此為使用CTA隔膜進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，就需要分析5kDa、10kDa和20kDa CTA隔膜的定向(亮面朝上或朝下)和內(nèi)滲速度。分別在雙流和單流設(shè)備構(gòu)型中對這些參數(shù)進(jìn)行研究，以便確定哪種構(gòu)型具有最高的內(nèi)滲速度。在上述研究中，每隔5分鐘記錄體積的改變，并將BSA的初始量(1mg/mL)與BSA最終量進(jìn)行比較。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與其它CTA隔膜相比，在標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)型和單流構(gòu)型中，5kDa CTA隔膜的內(nèi)滲速度是最低的(見圖5)。10kDa和20kDa隔膜的內(nèi)滲速度相對較高，并且單流構(gòu)型表現(xiàn)出比雙流構(gòu)型更高的內(nèi)滲速度(見圖5)。與5kDa和20kDa CTA隔膜相比，10kDa CTA隔膜在兩種構(gòu)型中的內(nèi)滲速度最高。
因CTA隔膜是不對稱的(亮面和暗面)，因此需要對不同的定向進(jìn)行比較。結(jié)果顯示5kDa CTA隔膜亮面朝上的內(nèi)滲速度高于亮面朝下的內(nèi)滲速度(圖6)。但是對于10kDa和20kDa CTA隔膜，亮面朝下的性能比亮面朝上的性能稍好。總之，10kDa CTA隔膜具有較高的內(nèi)滲速度。
總之，采用10kDa CTA隔膜的基于隔膜的電泳技術(shù)單流構(gòu)型，在各種對稱定位中產(chǎn)生的內(nèi)滲速度最高。這就為采用CTA隔膜的以下試驗(yàn)過程提供了基礎(chǔ)。為一致起見，以下所有CTA試驗(yàn)都采用單流構(gòu)型、10kDa隔膜，且亮面朝上。
采用CTA隔膜的內(nèi)滲與電壓為確定內(nèi)滲是否與電壓有關(guān)，準(zhǔn)備了一系列試驗(yàn)，在這些實(shí)驗(yàn)中，體積隨電滲而改變。為研究CTA內(nèi)滲是否與電壓有關(guān)，以單流構(gòu)型的形式裝配一個電泳設(shè)備，其中緩沖罐中具有pH值為9.0的冷TB，并具有一個盒，該盒包括聚丙烯酰胺(PA)限制隔膜和頂部CTA分離隔膜，或體積控制屏障隔膜。50mL的1mg/mL BSA在設(shè)備的流2中經(jīng)過所述盒運(yùn)行30分鐘。每隔5分鐘測量體積的改變，用分光光度測定法(A280)確定出初始和最終的流2的濃度。從0V到300V(1A，300W)以50V的增量重復(fù)上述試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著電壓的升高，體積減少的速度成線性增加(圖7)。結(jié)果表明，結(jié)合作為體積控制屏障的CTA，內(nèi)滲速度可以通過改變用于該過程的電壓而進(jìn)行控制，其中該過程的結(jié)果是大量液體的轉(zhuǎn)移。但是隨著電壓的增加，回收的BSA的量減少了(圖8)。BSA回收率的減小是由于增加的電壓強(qiáng)制BSA進(jìn)入PA限制隔膜中而造成的。
采用PVA1隔膜的內(nèi)滲與電壓為確定采用PVA1隔膜的內(nèi)滲是否與電壓有關(guān)，就需要進(jìn)行采用上一部分中介紹的、用于CTA隔膜的方法的試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著電壓的增加，體積減小的速度也在增加(圖9)。但是這種關(guān)系的線性特性不如采用CTA隔膜所達(dá)到的那樣明顯。通過在一個具有BSA的單流構(gòu)型的設(shè)備上采用200V電壓，來比較CTA和PVA1的內(nèi)滲速度，結(jié)果當(dāng)采用PVA1時與采用CTA時相比，電內(nèi)滲的速度增加了4倍。當(dāng)采用PA隔膜時，電內(nèi)滲速度沒有變化。
采用CTA隔膜的內(nèi)滲與pH值為確定電滲是否與pH值有關(guān)，將一系列試驗(yàn)進(jìn)行比較，其中體積由于電內(nèi)滲而減小。為研究CTA內(nèi)滲隔膜是否與電壓有關(guān)，以單流構(gòu)型的形式裝配一個電泳設(shè)備，其中緩沖罐中具有pH值為9.0的冷TB，并具有一個盒，該盒包括底部PA限制隔膜和頂部CTA分離隔膜和/或體積控制屏障隔膜。50mL的1mg/mL BSA在250V的電壓下(1A，300W)，在設(shè)備的流2中穿過所述盒運(yùn)行30分鐘。每隔5分鐘測量體積的改變，用分光光度測定法(A280)確定出初始和最終的流2的濃度。從pH值4.0到pH9.0，以0.5的pH值增量重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，隨著pH值的增加，體積減小的速度增加(圖10)。但是，各個緩沖劑具有自己的變化，這表明與pH值有關(guān)的內(nèi)滲速度需要在個別的應(yīng)用和緩沖劑體系中確定。
內(nèi)滲控制與血纖蛋白原的分離為測試是否能對具有充電隔膜的內(nèi)滲的速度進(jìn)行控制，對具有高內(nèi)滲速度的過程進(jìn)行研究。所述具有高內(nèi)滲速度的過程為從冷凝蛋白質(zhì)中分離血纖蛋白原的過程。從冷凝蛋白質(zhì)中分離血纖蛋白原的過程通常導(dǎo)致流1的體積增加5到8倍，同時在凈化過程中將流體從流2中抽吸過來。為測試改變流1中流體積累的效果，采用四種不同的方法從庫存冷凝蛋白質(zhì)(制備1∶3稀釋冷凝蛋白質(zhì)庫存溶液，并作為所有三種方法的開始材料)中分離血纖蛋白原。
方法1在250V電壓下(1A，300W)，采用具有700-1500-700kDaPA隔膜盒的電泳設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)血纖蛋白原分離。將含有pH值為9.0的冷TB、30ml 1∶3稀釋冷凝蛋白質(zhì)庫存溶液的緩沖罐放置在流1中，并將含有10mL pH值為9.0的TB放置在流2中。每隔15分鐘記錄流1中體積的改變，同時記錄流2的分光光度測定(OD280)讀數(shù)。每隔30分鐘對流2進(jìn)行收集，更換緩沖劑，并將電壓反向2分鐘(用于清理隔膜)。
方法2除了將頂部限制隔膜(700kDa PA隔膜)用10kDa CTA體積控制屏障隔膜代替以外，同方法1。
方法3采用兩個基于隔膜的電泳設(shè)備，兩設(shè)備具有獨(dú)立的電源，并且如圖11所示連接在一起。如在方法1中描述的那樣準(zhǔn)備并運(yùn)行設(shè)備1(注意用500kDa限制隔膜代替700kDa限制隔膜)，但是，設(shè)備2構(gòu)造為具有5kDa PA隔膜(底部)和10kDa CTA隔膜(頂部)的單流結(jié)構(gòu)。通過用獨(dú)立的電源控制內(nèi)滲速度，將設(shè)備2連接到設(shè)備1的流1上，并且設(shè)備2起到流1濃縮器的作用。根據(jù)從上述與電壓有關(guān)的試驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)，選擇與方法1的內(nèi)滲速度相匹配的電壓。設(shè)備2的電壓為250V(1A，300W)。
方法4除了用PVA1隔膜代替頂部限制隔膜以外，同方法1。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在血纖蛋白原分離過程中采用CTA將內(nèi)滲的量(圖12)減少了2(方法2)到6(方法3)倍。通過采用獨(dú)立的電源和具有濃縮器盒的設(shè)備，不必改變電壓(將電壓設(shè)置成常量250V)就可將流1的內(nèi)滲速度維持在較低的程度。與方法3不同，需要對方法1和2中流2的體積進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測并將其連續(xù)地加滿。
從庫存冷凝蛋白質(zhì)溶液中，方法1分離出34.8％的血纖蛋白原，而方法2分離出42.6％的血纖蛋白原，方法3分離出53.5％的血纖蛋白原(圖12)?？傊?，由于具有較高的百分比回收率和較小的內(nèi)滲速度，因此方法2和3具有較高的商業(yè)適用性。
在血纖蛋白原分離過程中采用PVA1使得設(shè)備中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的速度增加了4倍(表1)。采用PVA1作為頂部限制隔膜以便減少電內(nèi)滲，使得蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率從44.7％增加到77.3％。這些結(jié)果也表明了使用PVA1可減少或改善回收時間。當(dāng)采用PA隔膜時，120分鐘后可回收32.5mg血纖蛋白原，而采用PVA1可在30分鐘內(nèi)回收36.1mg血纖蛋白原。因此使用PVA1在四分之一的時間內(nèi)可回收更多的血纖蛋白原。
表1 血纖蛋白原分離過程中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的比較。該表將在血纖蛋白原分離過程中采用PAM和PVA1的結(jié)果進(jìn)行比較。

采用PVA1薄膜同時分離并濃縮牛腦組織均漿的牛蛋白感染素蛋白質(zhì)(PrP)基于隔膜的電泳法的另一應(yīng)用包括采用PVA1隔膜作為將流1從第一電極區(qū)域分離出來的頂部限制隔膜，同時進(jìn)行分離和濃縮牛腦組織均漿的牛蛋白感染素蛋白質(zhì)(PrP)的應(yīng)用。通常在包括PrP的分離試驗(yàn)中，電內(nèi)滲會引起開始材料體積的增加。但是通過引入PVA1作為頂部限制隔膜，電內(nèi)滲速度就會降低。
在圖13中，提供了典型PrP分離和采用PVA1的PrP分離及濃縮的比較。圖13中的A部分，來自于兩個電泳試驗(yàn)的試樣SDS-PAGE說明了蛋白質(zhì)從流1轉(zhuǎn)移到流2。圖13的B部分是與抗-PrP R029(Prionics，瑞士)雜交的試樣相對應(yīng)的免疫印跡(western blot)。通常，PrP分離采用一個盒，并采用pH值為9.0的Tris硼酸鹽緩沖劑(A部分，泳道1-4)，在250V電壓下運(yùn)行3個小時，其中該盒具有200kDa分離隔膜和兩個5kDa限制隔膜，在上述條件下，PrP保持在流1中(B部分，泳道1-4)。當(dāng)采用相同的條件，但用PVA1隔膜代替所述定限制隔膜時，就能從牛腦組織均漿中同時分離并濃縮PrP。
采用PVA1在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時會導(dǎo)致流1的體積減少5倍，從而如由免疫印跡(Western blot)上的PrP帶的強(qiáng)度增加(B部分)所檢測出來的那樣，導(dǎo)致PrP濃度顯著增加。
結(jié)論采用具有10kDa CTA隔膜的單流構(gòu)型電泳設(shè)備，在各種對稱定位中，都能夠產(chǎn)生最高的內(nèi)滲速度。通過確定具有最高內(nèi)滲速度的構(gòu)型就能在試驗(yàn)中控制該速度。通過分析內(nèi)滲是否與電壓有關(guān)，說明隨著電壓的增加，體積減小的速度線性地增加。因此，通過電滲，增加系統(tǒng)電壓可減小內(nèi)滲的影響。pH值與內(nèi)滲之間的關(guān)系表明各個緩沖體系具有其自身的變量，而且需要在個別應(yīng)用的基礎(chǔ)上對pH值進(jìn)行研究，從而獲得最好的分離和/或濃縮。
為測試內(nèi)滲速度是否能夠通過充電隔膜(CTA)進(jìn)行控制，研究了具有高內(nèi)滲速度的過程。該具有高內(nèi)滲速度的過程為從冷凝蛋白質(zhì)中分離血纖蛋白原的過程。用三個實(shí)驗(yàn)來研究內(nèi)滲速度。第一個實(shí)驗(yàn)是對照，其確定出標(biāo)準(zhǔn)血纖蛋白原分離過程的內(nèi)滲速度。第二個試驗(yàn)通過用CTA替換頂部PA限制隔膜來降低內(nèi)滲速度。最后一個實(shí)驗(yàn)采用具有單流構(gòu)型(CTA頂部隔膜和PA底部隔膜)的第二設(shè)備，其控制第一設(shè)備流1的體積。各設(shè)備具有自己的電源。因此，通過改變電壓(與電滲速度相匹配)能夠控制設(shè)備2中的電滲速度。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，能夠控制流1的電滲速度，從而增加血纖蛋白原的總回收率并加快凈化。
對內(nèi)滲速度的控制也可應(yīng)用到對包括PrP的研究中。采用PVA1說明了用于同時濃縮并分離PrP的一種方法。這種方法也可用于與蛋白感染素檢測和診斷一起的產(chǎn)品凈化。
用于單克隆抗體/重組體凈化/濃縮的電內(nèi)滲設(shè)備構(gòu)型本發(fā)明尤其適用于蛋白質(zhì)的同時凈化和濃縮，其中所述蛋白質(zhì)通過重組體或組織培養(yǎng)方法培育，并在較大的液體體積中以稀釋的形式生產(chǎn)。使用根據(jù)本發(fā)明的方法和設(shè)備可采用多種可同時進(jìn)行凈化和濃縮/體積控制的構(gòu)型。
凈化過程可采取以下兩種一般形式中的一種·將目標(biāo)蛋白質(zhì)從保留在喂入流(試樣)中的雜質(zhì)中轉(zhuǎn)移出來·將雜質(zhì)從保留在喂入流(試樣)中的目標(biāo)蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)移出來在第一種形式中，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度降低時，目標(biāo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的速度也會降低，導(dǎo)致凈化變慢。內(nèi)滲的影響也會增加喂入流的體積，使凈化進(jìn)一步變慢。對喂入流體積的濃縮/控制使得目標(biāo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移維持在可能的最高速度。
在第二種形式中，當(dāng)喂入流中的雜質(zhì)濃度降低時，凈化也會變慢，從而延長凈化時間。通過維持從目標(biāo)蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)移雜質(zhì)的速度，同時傳送濃縮的目標(biāo)蛋白質(zhì)，使喂入流濃縮可加快凈化的速度，其中產(chǎn)品在喂入流中積累。
這些技術(shù)可用于以低濃度存在于喂入流中的任何蛋白質(zhì)(或其它化合物)，特別是通常在濃度為5到100μg/mL的組織培養(yǎng)基中培育的重組體和單克隆抗體(MAb)蛋白質(zhì)。
可用基于隔膜的電泳設(shè)備的幾種構(gòu)型來影響產(chǎn)品的同時凈化和濃縮，所述產(chǎn)品以較低的濃度存在于較大的體積中。
應(yīng)用構(gòu)型1濃縮和部分凈化同時進(jìn)行(圖14)。
在具有一個試樣流(流1)和一個分離流(流2)的單一設(shè)備中，采用具有電滲特性的頂部限制隔膜從大量稀釋喂入流中抽吸水分。選擇條件來滿足將某些、或最好是所有的雜質(zhì)轉(zhuǎn)移到第二流中，而目標(biāo)蛋白質(zhì)(也可能是某些殘留雜質(zhì))通過電內(nèi)滲在喂入流中濃縮。
在這種方法的一例中，130mL喂入流在180分鐘內(nèi)濃縮到10mL(13倍濃縮)，而大量白蛋白和鐵傳遞蛋白雜質(zhì)被清除到第二流中。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析的結(jié)果顯示在圖15和圖16中。在該實(shí)施例中，目標(biāo)部分凈化且產(chǎn)品顯著濃縮。在所給出的例子中，組織培養(yǎng)上層清液中包含10％FCS。這種構(gòu)型尤其適用于無血清培養(yǎng)基，在這種培養(yǎng)基中，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中占有顯著的比例?？赏ㄟ^改變分離隔膜和緩沖條件、以及電內(nèi)滲隔膜的截止值而改進(jìn)該方法。
在3小時內(nèi)，抗體濃度增加了10多倍。在這期間內(nèi)，通過將雜質(zhì)轉(zhuǎn)移到第二流中而使雜質(zhì)的相對濃度降低(圖16)。
圖15和16中的數(shù)據(jù)表明雜質(zhì)被從喂入流中選擇性清除，而不損失目標(biāo)蛋白質(zhì)，這表明目標(biāo)蛋白質(zhì)的部分凈化。
構(gòu)型2隨著喂入流中的雜質(zhì)去除，將目標(biāo)蛋白質(zhì)同時濃縮和凈化，以及對喂入流的體積進(jìn)行電內(nèi)滲控制(圖17)。
采用兩個設(shè)備，一個設(shè)備構(gòu)造成從保留在喂入試樣中的雜質(zhì)中將目標(biāo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到分離的產(chǎn)品流中。在一個獨(dú)立的設(shè)備中，采用一個具有電內(nèi)滲的頂部限制隔膜的盒來濃縮喂入試樣流，從而維持第一分離的設(shè)備中目標(biāo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移速度。在以下給出的例子中，第二設(shè)備也構(gòu)造成為允許雜質(zhì)從喂入流轉(zhuǎn)移到第二設(shè)備的緩沖流中，從而去除喂入流中的雜質(zhì)。
在這種方法的一例中，130mL喂入流在180分鐘內(nèi)濃縮到100mL，而白蛋白和鐵傳遞蛋白雜質(zhì)被清除到第二設(shè)備的緩沖流中。這使得目標(biāo)蛋白質(zhì)能夠很好地凈化，并通過將產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到小的流體積中而使產(chǎn)品顯著濃縮，并凈化和濃縮喂入流從而加快目標(biāo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。在所給出的例子中，組織培養(yǎng)上層清液中包含10％胎牛血清(FCS)。這種方法可通過以下方法進(jìn)行改進(jìn)采用使得更大量的液體轉(zhuǎn)移的電內(nèi)滲隔膜，或采用能夠向正電極抽吸液體的電內(nèi)滲隔膜。
圖18示出以上試驗(yàn)結(jié)果的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析。喂入流在實(shí)驗(yàn)過程中濃縮，但同時也損失雜質(zhì)蛋白質(zhì)。通過使喂入流中的成分單純化，去除雜質(zhì)，從而強(qiáng)化了目標(biāo)蛋白質(zhì)向產(chǎn)品流的轉(zhuǎn)移。
圖19示出了上述試驗(yàn)最終凈化結(jié)果的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。目標(biāo)蛋白質(zhì)被凈化并濃縮到產(chǎn)品流中。通過濃縮喂入流而維持向產(chǎn)品流的轉(zhuǎn)移速度。隨著喂入流中的目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度的降低轉(zhuǎn)移速度變慢，除非喂入流體積減小。這種體積減小會導(dǎo)致來自于增加的雜質(zhì)濃度的干擾，除非喂入流中的雜質(zhì)也去除。
下面介紹幾種可替換構(gòu)型，在這些構(gòu)型中，可采用電內(nèi)滲來從稀釋的原材料中凈化并濃縮目標(biāo)蛋白質(zhì)。
構(gòu)型3將目標(biāo)轉(zhuǎn)移到第二流中，濃縮喂入流。
構(gòu)造如圖20所示的單個設(shè)備，其具有一個包含待處理試樣的試樣流(流1)，以及選定成分通過電泳轉(zhuǎn)移到其中的分離流(流2)。采用具有電內(nèi)滲特性的頂部限制隔膜從試樣流中抽吸水分。選擇條件來滿足部分、或理想的是全部選定化合物轉(zhuǎn)移到第二流中，而試樣在喂入流中通過電內(nèi)滲濃縮，從而維持產(chǎn)品流的流量。
構(gòu)型4將產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到流1中，同時濃縮并可選地凈化流2，其中雜質(zhì)轉(zhuǎn)移到緩沖劑流或可選的第三流中。
構(gòu)造如圖21所示的單個設(shè)備，其具有一個包含待處理試樣的試樣流(流1)，以及選定成分通過電泳轉(zhuǎn)移到其中的分離流(流2)。采用具有電內(nèi)滲特性的頂部限制隔膜從試樣流中通過第三隔膜抽吸水分。選擇條件來滿足部分、或理想的是全部選定化合物轉(zhuǎn)移到第二流中，而試樣在喂入流中通過電內(nèi)滲濃縮，從而維持試樣流中混合物的流量。
構(gòu)型5在喂入流的任一側(cè)采用電內(nèi)滲隔膜從而加強(qiáng)濃縮效果，選擇分子量截止值使得雜質(zhì)從目標(biāo)蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)移出來，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)保留在中央喂入流中并在其中濃縮。
構(gòu)造如圖22所示的單個設(shè)備，其具有一個包含待濃縮和凈化試樣的試樣流(流1)，以及水和不需要的雜質(zhì)通過電泳轉(zhuǎn)移到其中的上部流和下部流(流2和3)。兩個具有電內(nèi)滲特性的頂部限制隔膜形成試樣流，并用于將水分從試樣流推向上部流和下部流。選擇條件來滿足部分、或理想的是全部雜質(zhì)轉(zhuǎn)移到第二或第三流中，而試樣在喂入流中通過電內(nèi)滲濃縮。
構(gòu)型6采用兩個電泳設(shè)備分別進(jìn)行濃縮和凈化。
本例采用兩個設(shè)備，如圖23所示。一個設(shè)備構(gòu)造成將目標(biāo)蛋白質(zhì)從保留在試樣流中的雜質(zhì)中轉(zhuǎn)移到分離的產(chǎn)品流中。在一個獨(dú)立的設(shè)備中，用一個具有電內(nèi)滲頂部限制隔膜的盒形成兩個流，用于濃縮試樣流、去除雜質(zhì)并維持第一分離設(shè)備中的目標(biāo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移速度。
構(gòu)型7構(gòu)造如圖24所示的單個設(shè)備，其具有一個包含待濃縮和凈化試樣的試樣流(流1)。采用具有電內(nèi)滲特性的限制隔膜將水分從試樣流推向一個電極區(qū)域，從而形成濃縮試樣。
根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)和喂入流雜質(zhì)的構(gòu)成，采用不同的沿需要的方向抽吸大量液體的隔膜化學(xué)性質(zhì)和緩沖劑組合，將隔膜分子量截止值調(diào)節(jié)到可獲得雜質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)的最優(yōu)轉(zhuǎn)移，很多其它構(gòu)型都可采用。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的是，在沒有離開如廣泛描述的本發(fā)明精神和范圍的情況下，可對如特定例中示出的本發(fā)明進(jìn)行多種改變和/或修改。因此，以上例子應(yīng)被視為是說明性而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種電泳設(shè)備，包括(a)第一電極區(qū)域中的第一電極；(b)第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；(c)設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；(d)第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；其中第一隔膜與第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域中分離出來，其中至少一個隔膜是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；(e)適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域的裝置；和(f)適于將試樣組分傳遞到第一間隙體積的裝置；其中，施加電勢時，引起液體從試樣組分通過至少一個隔膜運(yùn)動到鄰近電極區(qū)域中，并且至少一個隔膜防止液體實(shí)質(zhì)地大量移動到試樣中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，還包括(g)適于去除設(shè)備中產(chǎn)生的熱量的裝置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，其中形成能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動的屏障的至少一個隔膜是可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的設(shè)備，其中可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜選自三乙酸纖維素、聚乙烯醇，和與戊二醛交聯(lián)的聚(乙烯醇)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的設(shè)備，其中可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜具有限定的孔隙尺寸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的設(shè)備，其中隔膜的限定孔隙尺寸為從約5到約1000kDa。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，其中屏障隔膜鄰近第一或第二電極區(qū)域的其中一個。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，其中一個或多個隔膜為具有限定孔隙尺寸的電泳分離隔膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的設(shè)備，其中電泳分離隔膜由聚丙烯酰胺制成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的設(shè)備，其中隔膜的限定孔隙尺寸為從約1到約2000kDa。
11.一種電泳設(shè)備，包括(a)第一電極區(qū)域中的第一電極；(b)第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；(c)設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；(d)第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；(e)第三隔膜，設(shè)置在第二電極區(qū)域與第一隔膜之間，從而在它們之間限定第二間隙體積；其中第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域中分離出來，第三隔膜將第二間隙體積從第二電極區(qū)域中分離出來，其中至少一個隔膜是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；(f)適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域、第二電極區(qū)域和第二間隙體積的裝置；和(g)適于將試樣組分傳遞到第一間隙體積的裝置；其中，施加電勢時，引起一種或多種成分從試樣組分通過至少一個隔膜運(yùn)動到鄰近電極區(qū)域或間隙體積中，并且至少一個隔膜實(shí)質(zhì)上防止液體大量移動到試樣中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的設(shè)備，還包括(h)適于去除設(shè)備中產(chǎn)生的熱量的裝置。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的設(shè)備，其中形成能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動的屏障的至少一個隔膜是可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的設(shè)備，其中可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜選自三乙酸纖維素、聚乙烯醇，和與戊二醛交聯(lián)的聚(乙烯醇)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的設(shè)備，其中可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜具有限定的孔隙尺寸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的設(shè)備，其中隔膜的限定孔隙尺寸為從約5到約1000kDa。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的設(shè)備，其中屏障隔膜鄰近第一或第二電極區(qū)域的其中一個。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的設(shè)備，其中一個或多個隔膜為具有限定孔隙尺寸的電泳分離隔膜。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的設(shè)備，其中電泳分離隔膜由聚丙烯酰胺制成。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的設(shè)備，其中隔膜的限定孔隙尺寸為從約1到約2000kDa。
21.一種電泳系統(tǒng)，包括(a)第一電極區(qū)域中的第一電極；(b)第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加第一電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生第一電場；(c)設(shè)置在第一電場區(qū)域中的第一隔膜；(d)第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；(e)第三隔膜，設(shè)置在第二電極區(qū)域與第一隔膜之間，從而在它們之間限定第二間隙體積，其中第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域中分離出來，第三隔膜將第二間隙體積從第二電極區(qū)域中分離出來；(f)適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域、第二電極區(qū)域和第二間隙體積的裝置；(g)適于將試樣組分傳遞到第一或第二間隙體積的其中一個的裝置；其中，施加第一電勢時，引起一種或多種成分從試樣組分通過至少一個隔膜運(yùn)動到鄰近的第一或第二間隙體積中；(h)第三電極區(qū)域中的第三電極；(i)第四電極區(qū)域中的第四電極，第三電極相對于第四電極設(shè)置，從而在第三電極和第四電極之間施加第二電勢時，適于在它們之間的第二電場區(qū)域中產(chǎn)生第二電場；(j)設(shè)置在第二電場區(qū)域中的第四隔膜；(k)第五隔膜，設(shè)置在第三電極區(qū)域和第四隔膜之間，從而在它們之間限定第三間隙體積；其中第四和第五隔膜將第四間隙體積從第三和第四電極區(qū)域中分離出來，以及其中第四和第五隔膜中的至少一個是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；(l)適于將液體傳遞到第三電極區(qū)域和第四電極區(qū)域中的裝置；和(m)適于將試樣組分從第一或第二間隙體積傳遞到第三間隙體積的裝置；其中，施加第二電勢時，引起液體通過第四或第五隔膜的至少一個隔膜從試樣組分中運(yùn)動到鄰近電極區(qū)域中；其中屏障隔膜防止液體實(shí)質(zhì)地大量移動到試樣中。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的系統(tǒng)，還包括(n)適于去除設(shè)備中產(chǎn)生的熱量的裝置。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中形成能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動的屏障的至少一個隔膜是可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜選自三乙酸纖維素、聚乙烯醇，和與戊二醛交聯(lián)的聚(乙烯醇)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中可誘導(dǎo)的電內(nèi)滲隔膜具有限定的孔隙尺寸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的系統(tǒng)，其中隔膜的限定孔隙尺寸為從約5到約1000kDa。
27.根據(jù)權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中屏障隔膜鄰近多個電極區(qū)域的其中一個。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中一個或多個隔膜為具有限定孔隙尺寸的電泳分離隔膜。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的系統(tǒng)，其中電泳分離隔膜由聚丙烯酰胺制成。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其中隔膜的限定孔隙尺寸為從約1到約2000kDa。
31.一種用于濃縮試樣的方法，該方法包括(a)提供一種電泳設(shè)備，該設(shè)備包括第一電極區(qū)域中的第一電極；第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；其中第一隔膜與第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域中分離出來，其中至少一個隔膜是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域的裝置；和適于將試樣組分傳遞到第一間隙體積的裝置；(b)向第一和第二電極區(qū)域中添加緩沖劑或溶劑；(c)向第一間隙體積中添加試樣；(d)在電極之間施加電勢，引起試樣中的液體移動穿過一個隔膜進(jìn)入相鄰電極區(qū)域；以及可選地(f)獲得濃縮的試樣；其中屏障隔膜使得液體從試樣中大量移動出來。
32.一種用于從試樣中移動至少一種成分、并同時控制液體的大量移動的方法，該方法包括(a)提供一種電泳設(shè)備，包括第一電極區(qū)域中的第一電極；第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；第三隔膜，設(shè)置在第二電極區(qū)域與第一隔膜之間，從而在它們之間限定第二間隙體積；其中第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域中分離出來，第三隔膜將第二間隙體積從第二電極區(qū)域中分離出來；其中至少一個隔膜是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域、第二電極區(qū)域和第二間隙體積的裝置；和適于將試樣組分傳遞到第一間隙體積的裝置；(b)向第一和第二電極區(qū)域添加緩沖劑或溶劑；(c)向第一間隙體積添加試樣；(d)向第二間隙體積添加緩沖劑或液體；(e)在電極之間施加電勢，引起至少一種成分從試樣中移動通過隔膜進(jìn)入鄰近電極區(qū)域或間隙體積；以及可選地(f)收集從試樣中移動出來的成分；其中屏障隔膜控制液體的實(shí)質(zhì)地大量流入或流出一個或多個間隙體積。
33.一種用于從試樣中移動至少一種成分、并同時控制液體的大量移動的方法，該方法包括(a)提供一種電泳系統(tǒng)，包括第一電極區(qū)域中的第一電極；第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加第一電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生第一電場；設(shè)置在第一電場區(qū)域中的第一隔膜；第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；第三隔膜，設(shè)置在第二電極區(qū)域與第一隔膜之間，從而在它們之間限定第二間隙體積；適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域、第二電極區(qū)域和第二間隙體積的裝置；適于將試樣組分傳遞到第一或第二間隙體積的其中一個的裝置；第三電極區(qū)域中的第三電極；第四電極區(qū)域中的第四電極，第三電極相對于第四電極設(shè)置，從而在第三電極和第四電極之間施加第二電勢時，適于在它們之間的第二電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；設(shè)置在第二電場區(qū)域中的第四隔膜；第五隔膜，設(shè)置在第三電極區(qū)域和第四隔膜之間，從而在它們之間限定第三間隙體積；其中第四和第五隔膜將第四間隙體積從第三和第四電極區(qū)域中分離出來，其中第四和第五隔膜中的至少一個是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；適于將液體傳遞到第三電極區(qū)域和第四電極區(qū)域中的裝置；和適于將試樣組分從第一或第二間隙體積傳遞到第三間隙體積的裝置；(b)向第一、第二、第三和第四電極區(qū)域添加緩沖劑或電解液；(c)向第一間隙體積添加試樣；(d)向第二間隙體積添加緩沖劑或液體；(e)在第一和第二電極之間施加電勢，引起至少一種成分從試樣中移動穿過隔膜進(jìn)入第二間隙體積中；(f)將含有來自第一間隙體積或第二間隙體積的化合物的試樣傳遞到第三間隙體積中；(g)在第三和第四電極之間施加電勢，引起第三間隙體積中的液體從試樣中移動穿過隔膜進(jìn)入鄰近電場區(qū)域中，從而濃縮試樣中的化合物；以及可選地(h)收集濃縮的試樣；其中屏障隔膜控制液體實(shí)質(zhì)地大量移動進(jìn)入第三間隙體積。
全文摘要
一種電泳設(shè)備，包括(a)第一電極區(qū)域中的第一電極；(b)第二電極區(qū)域中的第二電極，第一電極相對于第二電極設(shè)置，從而在第一電極和第二電極之間施加電勢時，適于在它們之間的電場區(qū)域中產(chǎn)生電場；(c)設(shè)置在電場區(qū)域中的第一隔膜；(d)第二隔膜，設(shè)置在第一電極區(qū)域和第一隔膜之間，從而在它們之間限定第一間隙體積；其中第一隔膜與第二隔膜將第一間隙體積從第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域中分離出來，以及其中至少一個隔膜是屏障隔膜，能夠在電場的影響下控制液體的實(shí)質(zhì)的大量移動；(e)適于將液體傳遞到第一電極區(qū)域和第二電極區(qū)域的裝置；和(f)適于將試樣組分傳遞到第一間隙體積的裝置；其中，施加電勢時，引起液體從試樣組分通過至少一個隔膜運(yùn)動到鄰近電極區(qū)域中，并且至少一個隔膜防止液體大量移動到試樣中。
文檔編號C07K1/26GK1482939SQ01821131
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月21日
發(fā)明者菲利普·約翰·勒斯, 史蒂文·安東尼·博托, 本杰明·約翰·柯利, 舍尼切利·哈里哈蘭·奈爾, 安東尼 博托, 約翰 柯利, 利 哈里哈蘭 奈爾, 菲利普 約翰 勒斯 申請人:格拉迪普有限公司