專利名稱：利用水禽制備多株抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一件分案申請，原申請的申請日為1999年07月01日；申請?zhí)枮?9109616.9；發(fā)明創(chuàng)造名稱為利用水禽制備多株抗體的方法。
本發(fā)明涉及一種利用水禽制備多株抗體的方法，其包括(a)以純化的抗原(免疫原)注射至水禽；(b)再以不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)反應(yīng)；(c)5-15天后，水禽的產(chǎn)蛋中即有多株抗體產(chǎn)生。
在本發(fā)明所述的利用水禽制備多株抗體的方法中，其中所述的注射包括肌肉、皮下、皮內(nèi)、血管注射等方法；所述的水禽選自母鴨、母鵝；所述的抗原包括人體免疫球蛋白；在本發(fā)明所述的利用水禽制備多株抗體的方法中，其中所述的抗原選自(a)來自哺乳類動(dòng)物的蛋白質(zhì)、荷爾蒙；(b)各種病毒；(c)細(xì)菌；(d)以基因工程制備得到的重組蛋白、合成肽(syntheticpeptide)；
(e)各種治療用藥、藥物濫用藥品的蛋白質(zhì)結(jié)合物。
本發(fā)明涉及一種多株抗體，其特征在于，它是利用包括上述步驟(a)-(c)的方法所制備。
本發(fā)明還涉及所述的多株抗體的用途，其應(yīng)用于各種臨床免疫檢測試劑及研究用免疫試劑的制備以及食品飼料中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種自水禽產(chǎn)蛋中純化多株抗體的方法，其包括(1)以水為溶劑，自該產(chǎn)蛋的蛋黃中粗分離IgY，可使用自來水、純化蒸餾水、去離子水，或?yàn)镻H≥5.1的微酸或含0.05％以下的非離子洗滌劑(non-ionic detergent)水溶液或0.15-1.0M食鹽水溶液，磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris-buffer)等；(2)添加硫酸銨，使達(dá)30-50％的飽和度，或添加硫酸鈉，使達(dá)14-20％(W/V)的濃度，在其濃度下重復(fù)進(jìn)行鹽析；(3)使用含疏水基膠體(hydrophobic ligand coupled to matrices)進(jìn)行層析IgY(a)所述的疏水基膠體選自丁基瓊脂糖(Butyl sepharose)、辛基瓊脂糖(Octyl sepharose)、苯基瓊脂糖(Phenyl sepharose)、烷基瓊脂糖(Alkyl sepharose)、甲基丙烯酸甲酯(Methyl methacrylate)和甲基丙烯酸丁基酯(T-Butylmethacrylate)；(b)層析管柱的操作條件(i)管柱平衡緩沖液在PH7.0-8.0；(ii)平衡緩沖液為1.0M的硫酸銨或硫酸鈉，其電導(dǎo)度為110-200ms/ml；(iii)洗脫方式可用梯度洗脫或單液洗脫梯度洗脫A液為前述b(ii)，B液為不帶鹽的緩沖液，單液洗脫預(yù)先將A液及B液混合并調(diào)整其電導(dǎo)度為45-80ms/ml。
在本發(fā)明所述的自水禽產(chǎn)蛋中純化多株抗體的方法中，其中所述的產(chǎn)蛋為新鮮的產(chǎn)蛋或經(jīng)4℃保存的冷藏蛋。
在

圖1中①-⑨的意義如下①鹽析沉淀，100倍稀釋，未還原狀態(tài)。
②鹽析沉淀，10倍稀釋，還原狀態(tài)。
③鹽析沉淀，10倍稀釋，未還原狀態(tài)。
④膠體層析，第二波峰頂端收集物，還原狀態(tài)。
⑤膠體層析，第二波峰頂端收集物，未還原狀態(tài)。
⑥濃縮成品，還原狀態(tài)。
⑦濃縮成品，未還原狀態(tài)。
⑧濃縮成品，還原狀態(tài)。
⑨標(biāo)準(zhǔn)分子量試劑(Molecular Marker)，29～200kda圖2酶免疫分析法測定抗體稀釋能力。
在圖2中縱坐標(biāo)OD450的意義為在450nm波長下測得的光密度(optical density，OD)。
圖3瓊脂免疫電泳圖。此測定抗體的特異性及純度。
在圖3中各標(biāo)記的意義如下Ab1→鴨對抗人IgG(全分子)的IgY抗體Ab2→鴨對抗人IgG(全分子)的IgY抗體Ab3→兔對抗鴨IgG(W)的抗體Ag1→人IgG(w)Ag2→人白蛋白Ag3→人全血清Ag4→兔全血清Ag5→其為Ab1Ag6→人IgG(w)
實(shí)施例1多株抗體的制備蛋鴨為水禽類，在生物種差上與哺乳類有非常顯著的差異，故以哺乳類來源的蛋白質(zhì)為抗原時(shí)，較易獲得良好的免疫反應(yīng)(Immuneresponse)而得到更理想的抗體。取健康的蛋鴨(如菜鴨、北京鴨、番鴨及改鴨等)用已預(yù)先純化完成的人體免疫球蛋白(human IgG)與完全佐劑(Complete Freund’s adjuvant)以1∶1的比例混合為抗原，以肌肉注射方式注射，以誘發(fā)抗體生成。之后，再以不完全佐劑(IncompleteFreund’s adjuvant)以1∶1的比例進(jìn)行加強(qiáng)反應(yīng)(booster dose)。約十后天，鴨蛋中即有抗體生成。
實(shí)施例2抗體單離及純化蛋黃約占鴨1/3重，而其主要成分為脂蛋白，約占85％。蛋黃內(nèi)所含的蛋黃免疫球蛋白(Yolk Immunologlobulin；IgY)屬水溶性，因此可利用此特性，以水為溶劑，將IgY自蛋黃中單離出來。取鴨蛋一枚，此鴨蛋為新鮮的產(chǎn)蛋或經(jīng)4℃保存的冷藏蛋，打破以取出蛋黃加入其體積約6-20倍的水，利用一般攪拌器或磁性攪拌器(magnetic stirrer)將其混合均勻。而后以冷凍高速離心機(jī)于4℃及5000rpm的狀態(tài)下，予以分離，并收集富含IgY的上清液。
實(shí)施例3鹽析加入硫酸銨(Ammonium sulfate(NH4)2SO4)或硫酸鈉(sodiumsulfate Na2SO4)于富含IgY的上清液中，使達(dá)30-50％硫酸銨飽和度，或14-20％(w/v)硫酸鈉的濃度，以進(jìn)行鹽析。經(jīng)充分均勻攪拌后，同樣利用冷凍高速離心機(jī)于4℃及5000rpm的狀態(tài)下，予以分離，并收集其沉淀。一般而言，重復(fù)進(jìn)行鹽析及離心兩個(gè)步驟，可有效提高產(chǎn)品純度。不同分子量的蛋白質(zhì)在不同濃度的環(huán)境下，與帶疏水基(hydrophobicligand)的膠體會有不同的結(jié)合能力。疏水基膠體選自下列物質(zhì)丁基瓊脂糖、辛基瓊脂糖、苯基瓊脂糖、烷基瓊脂糖、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁基酯。
將鹽析沉淀物通過以疏水基膠體填充而成的管柱(column)，然后以帶鹽(如硫酸銨或硫酸鈉等)及不帶鹽兩種緩沖液以梯度方式交替洗滌，洗脫方式可用梯度洗脫或單液洗脫。梯度洗脫A液即帶1.0M至1.5M的硫酸銨或硫酸鈉，其電導(dǎo)度為110-200ms/ml，B液即為不帶鹽的緩沖液。而單液洗脫即預(yù)先將A液及B液混合并調(diào)整其電導(dǎo)度為45-80ms/ml。收集洗滌液的第二波峰，以磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline)透析脫鹽。待脫鹽完成后，以濃縮膜(ultrafiltration membrane)將透析液濃縮成內(nèi)含1.0mg/ml蛋白質(zhì)溶液，此為純化后的抗體。
實(shí)施例4純度測定與抗體能力測定IgY的分子量為170,000(170kDa)左右，去除Fc端后其分子量為110,000(110kDa)。電泳技術(shù)為目前用以決定分子量大小及分析純度方面的最常使用的方法。因此本發(fā)明利用SDS-丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)配合庫馬西蘭為染料，將各種抗體樣品經(jīng)電泳分析后的膠體染色判讀結(jié)果如圖1。圖1中第9行的樣品為標(biāo)準(zhǔn)分子量29-200kDa試劑。
實(shí)施例5抗體稀釋能力及抗體特異性的測定利用酶免疫分析法(enzyme immuno assay；EIA)分析抗體的稀釋能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。圖2中的符號表示在不同的時(shí)間根據(jù)本發(fā)明的方法所得到的抗體。
實(shí)施例6瓊脂雙向擴(kuò)散分析(gel double diffusion)(3a)抗體稀釋能力以人IgG為抗原時(shí)測得的抗體稀釋能力大于或等于32倍。
(3b)抗體特異性以瓊脂免疫電泳分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。以兔IgG，山羊IgG及鼠IgG為抗原時(shí)，均無沉淀線出現(xiàn)，此顯示此種多株抗體對人類IgG的特異性極佳。
實(shí)施例7多株抗體的用途根據(jù)本發(fā)明的方法(實(shí)施例1)，利用不同結(jié)構(gòu)的抗原，可制備出具有相對應(yīng)特異性的多株抗體，這些抗體便可用于臨床免疫檢測試劑、研究用免疫試劑，或加入食品、飼料中使食用者具有免疫力。
權(quán)利要求
1.一種自水禽產(chǎn)蛋中純化多株抗體的方法，其包括(1)以水為溶劑，自該產(chǎn)蛋的蛋黃中粗分離IgY可使用自來水、純水蒸餾水、去離子水，或?yàn)閜H≥5.1的微酸或含0.05％以下的非離子洗滌劑水溶液或0.15-1.0M食鹽水溶液，磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液；(2)添加硫酸銨，使達(dá)30-50％的飽和度，或添加硫酸鈉，使達(dá)14-20％(w/v)的濃度，在其濃度下重復(fù)進(jìn)行鹽析；(3)使用含疏水基膠體進(jìn)行層析IgY(a)所述的疏水基膠體選自下列物質(zhì)丁基瓊脂糖、辛基瓊脂糖、苯基瓊脂糖、烷基瓊脂糖、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁基酯；(b)層析管柱的操作條件(i)管柱平衡緩沖液在pH7.0-8.0；(ii)平衡緩沖液為1.0M的硫酸銨或硫酸鈉，其電導(dǎo)度為110-200ms/ml；(iii)洗脫方式可用梯度洗脫或單液洗脫梯度洗脫A液為前述b(ii)，B液為不帶鹽的緩沖液，單液洗脫預(yù)先將A液及B液混合并調(diào)整其電導(dǎo)度為45-80ms/ml。
2.如權(quán)利要求1所述的自水禽產(chǎn)蛋中純化多株抗體的方法，其中所述的產(chǎn)蛋為新鮮的產(chǎn)蛋或經(jīng)4℃保存的冷藏蛋。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用水禽制備多株抗體的方法，其是將蛋鴨經(jīng)肌肉注射抗原誘發(fā)抗體后收取所產(chǎn)鴨蛋，取出蛋黃后經(jīng)一系列蛋白質(zhì)純化步驟再經(jīng)疏水基膠體層析及透析、脫鹽、濃縮等過程再以SDS－丙烯酰胺膠體電泳，分析可得純度為96％以上之高純度且不含F(xiàn)c端的蛋黃免疫球蛋白。經(jīng)分析，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種抗體制備方法不但可制成具高特異性及稀釋能力的多株抗體，更可有效避免以往常存在以哺乳類為中間宿主所制成的多株抗體所產(chǎn)生的假陽性反應(yīng)。
文檔編號C07K1/00GK1439650SQ0210619
公開日2003年9月3日 申請日期2002年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日
發(fā)明者邱義能 申請人:邱義能