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      一段脲解支原體dna序列(2)特異性的確定及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:3547734閱讀:356來源:國知局
      專利名稱:一段脲解支原體dna序列(2)特異性的確定及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一段脲解支原體(Ureaplasma urealyticum)DNA序列(2)特異性的確定及其應(yīng)用,屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域。
      背景技術(shù)
      脲解支原體是一種人類生殖器經(jīng)常感染的病原物,可引發(fā)許多泌尿生殖道疾病,準確的診斷是進行即時而可靠的治療的依據(jù),目前只能根據(jù)臨床指征進行診斷。PCR和基因芯片診斷是一種快速而準確的檢測方法。而這一類的診斷方法依賴于獲得特異的核酸序列。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明在于通過生物信息學和分子生物學技術(shù),確定了一段脲解支原體特異核苷酸序列及其PCR引物。該序列和相應(yīng)的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法進行脲解支原體的診斷。
      本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明利用現(xiàn)有的方法確定了長度為288bp的一段脲解支原體特異DNA序列(2)及其PCR引物,用引物進行PCR擴增,其序列如下taatccagct gttgcgtttg ctttattagc tatgcattta aaaatagatt taaaaactgc 60tttatatacg catctttact ctacagttgc cgcattaacg caaaactgtg tacgtgcaat 120tccattagga caagttaagg gacaaaaaat aatttatcaa cttaaacatg tttattttga 180tgatattgtt aataaagtct ttacattgga ttttaaaaca gatttttgca aaaatatacc 240aggccttgaa attgcacaaa tggaacacga ggacacacct gttcgctt 288引物序列為1.5’-taatccagctgttgcgtttg-3’2.5’-aagcgaacaggtgtgtcctc-3’上述脲解支原體的特異DNA序列(2)用于診斷脲解支原體的基因芯片的探針序列,并通過上述的引物序列進行PCR擴增,標記后進行雜交檢測或直接用于PCR診斷。
      用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低等優(yōu)點。


      圖1為臨床標本的PCR擴增圖譜。
      圖2、圖2續(xù)是測序圖。其中圖2是測定的序列、圖2續(xù)是原始測序圖譜。
      圖3是用Blast軟件對PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果與預計序列的比較分析。
      圖4、圖4續(xù)(1)、圖4續(xù)(2)、圖4續(xù)(3)是基因數(shù)據(jù)庫中Blast搜索結(jié)果。
      圖5為基因芯片雜交結(jié)果。
      具體實施例方式首先以脲解支原體為關(guān)鍵詞,在基因數(shù)據(jù)庫中搜索脲解支原體的核苷酸序列。共獲得數(shù)條關(guān)系較密切的核苷酸序列,將這些核苷酸序列用NCBI網(wǎng)上的Blast在線使用軟件比對基因數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列(nr),排出非特異性的核苷酸序列,獲得了1Kb特異性的核苷酸序列。以這段序列設(shè)計了20余對PCR引物,以臨床標本提取DNA,進行PCR擴增,篩選到一對適合進行PCR擴增的序列及引物,PCR擴增獲得的產(chǎn)物與預計大小一致(見圖1,圖中序號為1.標準分子量DNA,分子量大小從上至下分別為622,527,404,309,242/238,217,201,190,180,160+160,147+147,123;2.4.5臨床陰性標本,沒有擴增產(chǎn)物;3.臨床陽性標本,擴增產(chǎn)物很純,大小290左右,與預計大小一致。圖譜結(jié)果顯示用本發(fā)明中的引物能特異的擴增臨床樣品),然后用T-vector進行克隆,并測序(測序報告見圖2、圖2續(xù),圖中從55位開始,到342位,共288bp為克隆序列,其余序列為克隆載體序列),序列為288bp,通過Blast軟件比對預計序列,顯示與預計的序列一致(見圖3,圖中除第48位、119位、143位、154位由c改變?yōu)閠,第61位、68位由g改變?yōu)閠,第62、70、121、140位由t改變?yōu)閏,第65位由c改變?yōu)間,第67、88位由a改變?yōu)間外,其余均與預計序列一致),表明該序列可以被特異性的擴增,可用于脲解支原體PCR檢測。序列用NCBI網(wǎng)站的Blast搜索基因數(shù)據(jù)庫的DNA(包含cDNA)序列,該序列只與脲解支原體的序列一致,而與其它的物種序列沒有同源性見圖4、圖4續(xù)(1)、圖4續(xù)(2)圖4續(xù)(3),圖中搜尋結(jié)果表明,只有脲解支原體的質(zhì)粒DNA序列與本序列同源,并且是完全配對。而其它的序列,由于沒有引物與之配對,故在檢測中不會被檢測到。用這一序列標記后作為探針與含有9種泌尿生殖道感染病原物的45個基因位點的基因芯片雜交,只有本發(fā)明序列與此有雜交信號,而其它所有序列與此無雜交信號(見圖5,圖中是四個重復,每個重復含9種泌尿生殖道感染性疾病病原物共45個不同的位點和4個對照位點。雜交結(jié)果表明只有本序列有特異信號,而其它均無雜交信號),表明該序列為脲解支原體的特異序列。
      本發(fā)明可用于PCR方法或基因芯片方法進行脲解支原體的臨床檢測。用本發(fā)明提供的序列進行PCR擴增,根據(jù)PCR方法獲得產(chǎn)物是否出現(xiàn)和大小判斷是否為脲解支原體感染。也可用本序列為探針,作為基因芯片中的一個檢測位點,然后用本發(fā)明中的PCR引物序列擴增臨床標本,并標記后進行雜交檢測。
      說明書序列表SEQUENCE LISTING&lt;110&gt;昆明寰基生物芯片開發(fā)有限公司&lt;120&gt;一段脲解支原體DNA序列(2)特異性的確定及其應(yīng)用&lt;130&gt;
      &lt;140&gt;02133342.4&lt;141&gt;2002-06-20&lt;160&gt;1&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;288&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;脲解支原體(Ureaplasma urealyticum)&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;gene&lt;222&gt;(1)..(288)&lt;223&gt;
      &lt;400&gt;1taatccagct gttgcgtttg ctttattagc tatgcattta aaaatagatt taaaaactgc 60tttatatacg catctttact ctacagttgc cgcattaacg caaaactgtg tacgtgcaat120tccattagga caagttaagg gacaaaaaat aatttatcaa cttaaacatg tttattttga180tgatattgtt aataaagtct ttacattgga ttttaaaaca gatttttgca aaaatatacc240aggccttgaa attgcacaaa tggaacacga ggacacacct gttcgctt 288
      權(quán)利要求
      1.一段脲解支原體DNA序列(2)特異性的確定,其特征在于該序列的長度為288bp,序列及PCR引物如下taatccagct gttgcgtttg ctttattagc tatgcattta aaaatagatt taaaaactgc 60tttatatacg catctttact ctacagttgc cgcattaacg caaaactgtg tacgtgcaat 120tccattagga caagttaagg gacaaaaaat aatttatcaa cttaaacatg tttattttga 180tgatattgtt aataaagtct ttacattgga ttttaaaaca gatttttgca aaaatatacc 240aggccttgaa attgcacaaa tggaacacga ggacacacct gttcgctt 288引物序列為1.5’-taatccagctgttgcgtttg-3’2.5’-aagcgaacaggtgtgtcctc-3’
      2.一段脲解支原體DNA序列(2)特異性的應(yīng)用,其特征在于該序列用于診斷脲解支原體的基因芯片的探針序列,并通過上述的引物序列進行PCR擴增,標記后進行雜交檢測或直接用于PCR診斷。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一段脲解支原體DNA序列(2)特異性的確定及其應(yīng)用,屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因數(shù)據(jù)庫資料的搜尋和分析,確定了一段脲解支原體DNA序列(2)的特異性及PCR擴增引物,該序列長度為288bp。通過對人類生殖道脲解支原體感染標本的PCR擴增,克隆,獲得該序列,測序證明與預計序列一致。再經(jīng)生物信息學方法分析,基因芯片雜交分析,結(jié)果證實了該序列對于脲解支原體的特異性。本發(fā)明作為基因芯片診斷的探針及PCR擴增檢測序列,用于脲解支原體的診斷。用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準確、操作簡便、成本低等優(yōu)點。
      文檔編號C07H21/04GK1514015SQ0213334
      公開日2004年7月21日 申請日期2002年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
      發(fā)明者譚德勇, 朱寶生 申請人:昆明寰基生物芯片開發(fā)有限公司
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