專利名稱：天然的抗hiv病毒抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中和人類免疫缺陷病毒的抗體。上述抗體存在于正常個體的血清中，能夠用來預(yù)防HIV感染或者延遲血清呈陽性的病人病情的發(fā)作。本發(fā)明還涉及含有上述抗體的藥物制劑以及它們在進(jìn)行HIV感染的被動免疫治療中的用途。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)有效的針對HIV-1的免疫應(yīng)答經(jīng)常由于任何候選疫苗都不能引發(fā)抗體的產(chǎn)生，以中和感染者原發(fā)HIV分離物的感染性而受到限制(1，2)。另一方面，從對受感染者血清進(jìn)行的分析表明，對原發(fā)病毒的中和較弱且是零星的(3，4)。然而，盡管培養(yǎng)抗體較難，或者在感染時或者通過實驗疫苗，但是的確存在單克隆抗體，比如IG1b12，2F5和2G12(5-7)，它們能夠中和原發(fā)性亞型A-E病毒。上述抗體來自亞型B感染的個體且不是通過接種培養(yǎng)所得(8)。
最早可檢測到的HIV-1特異抗體是IgG的同種型(12)，表明是非常規(guī)的初次應(yīng)答(13)。此外，有發(fā)現(xiàn)表明，HIV-1抗原和預(yù)先存在的所有抗體組成成分反應(yīng)(14)。報道存在識別HIV-1包膜的交叉反應(yīng)抗體(15)。
有人提議HIV-1感染中強(qiáng)烈的早期體液應(yīng)答可能沒有益處(16)，因為這將形成單克隆和多克隆抗體群而不是正常的多克隆應(yīng)答(13)。有人提議抗特應(yīng)型抗體1F7可能擴(kuò)寬對HIV抗原的免疫應(yīng)答(17)。
在申請人以前的研究中，預(yù)測HIV包膜蛋白和IgG可變蛋白具有同源性(18，19)。然而，最近的數(shù)據(jù)表明，HIV-1 gp120免疫顯性表位和天然存在的IgG抗體的一部分結(jié)構(gòu)互補(bǔ)(20，21)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)正常的、未HIV感染的個體血清中存在一組抗體，它們能夠中和HIV病毒。
抗體的活性組分通過親和層析從正常個體的血清中分離純化出來，層析采用Sepharose樹脂，其上結(jié)合人全I(xiàn)gG。觀察證明，這種抗IgG抗體組分能夠中和PBMC中HIV-1感染。用各種濃度的、得自商業(yè)的血清標(biāo)本的不同的抗IgG制劑重復(fù)實驗，利用親和純化的全I(xiàn)gG抗體作為陰性對照，HIVIG和mAb4117C抗體作為陽性對照。已證明后者對92HT593B無活性。

圖1所示的中和曲線涉及用HIV-1主要分離物92HT593B和SF162WT以及重組NLHX-ADA病毒所做的代表性實驗。已證明抗IgG抗體對92HT593B和NLHX-ADA有活性，50％的抑制濃度范圍為小于1微克/毫升到7微克/毫升。
所觀察到的抗IgG抗體制劑的中和效果是由于從正常血清中共同純化出的趨化因子所致的可能性很小，因為這些物質(zhì)的濃度不會超過20納克/毫升血清，并且通過PAGE表明，沒有特定帶。此外，通過對抗體制劑的透析，已經(jīng)將分子量低于50kDa的分子去除了。對抗IgG制劑進(jìn)行PAGE分析發(fā)現(xiàn)，主要為IgG以及痕量的污染蛋白。
所觀察結(jié)果的一個可能的解釋是，HIV-1抗原決定簇和屬于免疫網(wǎng)絡(luò)的天然抗體可變區(qū)有互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)(9，23)，但這個和其他解釋決非限制本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的第一個方面涉及抗人IgG全組分的、能中和HIV-1的人抗體制劑。上述制劑可通過將正常的、未HIV感染者的血清進(jìn)行親和層析得到，其中樹脂與人全I(xiàn)gG組分結(jié)合。分離的抗IgG抗體的終濃度優(yōu)選范圍為0.1-1000微克/毫升，更優(yōu)選的范圍為0.1-100微克/毫升。起始物質(zhì)為正常人體的混和血清(pool of sera)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明制劑在預(yù)防或治療HIV的感染、優(yōu)選HIV-1感染中的用途。
在用于治療時，最好將本發(fā)明的制劑與藥物學(xué)上接受的賦形劑一起配制。所述賦形劑包括緩沖劑、穩(wěn)定劑、助溶劑、稀釋劑、等滲劑等等。制劑優(yōu)選通過胃腸外途經(jīng)給藥，優(yōu)選通過靜脈、皮內(nèi)或者肌內(nèi)途徑給藥。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，本制劑將用于HIV-1感染的被動免疫治療。
附圖內(nèi)容圖1用抗IgG抗體中和HIV-1主要分離物92HT593B和SF162WT以及重組NL-HX-ADA病毒。每條滴定曲線代表單個實驗的數(shù)據(jù)。對于在1000和3333微克/毫升之間的全I(xiàn)gG以及對于HIVIG(10000毫克/毫升)，各個實驗中采用的抗IgG的濃度分別為109.7、12.3和80.0微克/毫升?？笽gG和全I(xiàn)gG制劑用下面描述的方法得到。HIVIG從HIV感染者的血清中制得。
圖2SDS-PAGE分離親和純化的抗體?？笽gG和全I(xiàn)gG制劑用下面描述的方法得到。對抗IgG抗體的電泳分離發(fā)現(xiàn)主要成分為IgG。此外，盡管其電泳帶很弱，還是存在高分子量的蛋白帶。
實施例1-抗IgG抗體的制備通過親和層析從兩種正常人混和血清中制備抗IgG抗體，層析采用Sepharose珠(CNBr活化過的Sepharose 4B)，其上結(jié)合有人全I(xiàn)gG(用GammaBind Sepharose 4B親和柱純化)。原則上，使用5-7毫克IgG抗體/0.5-0.6克Sepharose珠。按照廠家的說明進(jìn)行結(jié)合。對柱子用5×PBS平衡，然后將熱滅活血清(1毫升)上柱并用5×PBS稀釋到1∶1。在室溫下孵育1小時或者在4℃過夜。用30毫升5×PBS洗滌后，結(jié)合的抗體用0.1摩爾/升、pH＝2.5的檸檬酸鹽(緩沖液)洗脫至含TRIS堿的試管中。將收集的洗脫液離心，透析(Centricon YM，截留值為分子量30000)并用10％SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)主要為IgG帶(圖2)。
實施例2-用抗IgG抗體中和HIV-1分離物按照以前發(fā)表的方法(22)，在PBMC中進(jìn)行病毒中和評價。中和分析用5組獨立的實驗，每組4個不同的抗體制劑進(jìn)行。
表1總結(jié)了針對兩個HIV主要分離物(92HT593B，SF162WT)和一個重組NL-HX-ADA病毒的中和數(shù)據(jù)。
HIVIG和mAb4117C用作陽性對照；蛋白-G IgG用作陰性對照。
在該試驗中證明，所有抗IgG抗體制劑都能夠抑制92HT593B和NL-HX-ADA對PBMC的感染，但是沒有觀察到對SF162WT的中和活性。
表從HIV-1感染的(a)和正常(b)實驗對象血清中純化的Ig病毒中和效價主要分離物重組病毒92HT 593B SF162 WTNLHX-ADA抗體制劑分析 微克/毫升 ％neut 微克/毫升 ％neut 微克/毫升 ％neut陰性對照1508.3 150 2.9 150 -6.8蛋白GIgGb)50 1.1 50 -0.5 50 -4.416.7 2.2 16.7 2.7 16.7 -4.4陽性對照10016.1 100 100 100 98.7mAb4117C a) 33.3 9.0 33.3 100 33.3 96.011.1 5.2 11.1 100 11.1 55.03.70.4 3.7 80.4 3.7 23.21.2 -0.6 1.2 57.4 1.2 -8.6陽性對照HIVIG a) 10088.0 100 57.4 100 93.433.3 62.0 33.3 39.9 33.3 94.811.1 44.4 11.1 2.1 11.1 92.43.739.4 3.7 -14.4 3.7 87.21.23 22.2 1.23 0.7 1.23 69.20.41 8.3 0.41-3.7 0.41 54.5抗IgG b) 11 1.87 57.40.62 37.6NA ND0.21 6.1抗IgG b) 12 1.23 71.80.41 48.9NA ND0.14 14.4抗IgG b) 21 8.00 42.08.00 60.32.67 24.1NA 2.67 14.60.89 5.7 0.89 1.3抗IgG b) 31 2.17 46.40.72 27.1NA ND0.24 3.3抗IgG b) 41 10.97 39.810.97 68.73.66 - NA 3.66 54.01.22 - 1.22 45.0文獻(xiàn)1.Mascola，JR，Snyder，SW，Weislow，OS.Belay，SM，Belshe，RB，Schwartz，DH，Clements，ML，Dolin，R，Graham，BS，Gorse，GJ，Keefer，MC，McElrath，MJ，Walker，MC，Wagner，KF，McNeilJG，McCutchan，F(xiàn)E，and Burke，DS用包膜亞單位疫苗產(chǎn)品免疫引起針對實驗室適應(yīng)的但非原初人免疫缺陷病毒1型分離物的中和性抗體。J Infect Dis 1996；173340-348。2.Montefiori，DC，and Evans，TG一個能夠產(chǎn)生有效的、廣泛交叉反應(yīng)中和抗體的HIV1型疫苗。AIDS Res Hum Retroviruses1999；15689-698；3.Moore，JP，Coa，Y，Leu，Qin，L，Korber，B，and Ho，DD中間和內(nèi)部中和人免疫缺陷病毒1型遺傳進(jìn)化枝不和中和血清型相對應(yīng)但和gp120抗原血清型部分對應(yīng)。J Virol 1996；70427-444；4.Weber，J，F(xiàn)enyo，EM，Beddows，S，Kaleeby，P，Bjorndal，A，and the WHO Network for HIV Isolation andCharacterizationHIV-1區(qū)分離物中和血清型沒有被遺傳亞型所預(yù)測。J Virol 1996；707827-7832；5.Burton，DR，Pyati，J，Koduri，R，Sharp，SJ，Thornton，GB，Parren，PWHI，Sawyer，LSW，Hendry，RM，Dunlop，N，Nara，PL，Lamacchia，M，Garratty，E，Stiehm，ER，Bryson，YJ，Cao，Y，Moore，JO，Ho，DD，and Barbas III，CF通過重組人單克隆抗體有效中和HIV-1主要分離物。Science 1994；2661024-1027；6.Mascola，JR，Louder，MK，VanCott，TC，Sapan，CV，Lambert，JS，Muenz，LR，Bunow，B，Birx，DL，and Robb，ML通過高免疫的抗HIV免疫球蛋白和單克隆抗體2F5與2G12有效、協(xié)同的中和人免疫缺陷病毒(HIV)1型主要分離物。J Virol1997；717198-7206；7.Trkola，A，Pomales，AB，Yuan，H，Kober，B，Maddon，PJ，Allaway，GP，Katinger，H，Barbas III，CF，Burton，DR，Ho，DD，and Moore，JP通過人單克隆抗體和四聚體CD4-IgG交叉進(jìn)化枝中和人免疫缺陷病毒1型主要分離物。J Virol1995；696609-6617；8.Moore，JP，and Trkola，AJIV 1型共受體，中和血清型和疫苗的開發(fā)。AIDS Res Human Retroviruses 1997；13733-736；9.Coutinho A克隆選擇和網(wǎng)絡(luò)遠(yuǎn)景。Immunological Reviews1989；11063-67；10.Avrames，S天然自身抗體從“horror autotexicus”到”gnothiseauton”。Immunol Today 1991；12154-159；11.Moller，G抗免疫球蛋白血清對B淋巴細(xì)胞功能的影響。Scand J Immunol 1978；8469-474；12.Race，EM，Ramsey，KM，Lucia，HL，and Cloyd，MW人免疫缺陷病毒引發(fā)不能用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測出的抗體；對診斷學(xué)和病毒免疫學(xué)的暗示。Virology 1991；184716-722；13.Nara，PL，and Garrity，R假印記與疫苗有關(guān)的通用策略。Vaccine 1998；161780-1787；14.Zubler，RH，Perrin，LH，Doucet，A，Zhang，X，Huang，YP，andMiescher，PAHIV反應(yīng)性B細(xì)胞在血清陽性和血清陰性個體中的出現(xiàn)率。Clin Exp Immunol 1991；8731-36；15.Davis，D，Chaudhri，B，Stephens，DM，Carne，CA，Willers，C，and Lachmann，PJ人免疫缺陷病毒1型的跨膜蛋白(gp41)的主要免疫表位可能由宿主以前暴露于不相關(guān)抗原的相似表位決定。J Gen Virol 1990；711975-1983；16.Velijovic，V，Metlas，R，Khler，H，Urnovitz，HB，Prljic，J，Velikovic，N，Johnson，E，and Müller，S艾滋病在3000年初的流行病學(xué)新艾滋病疫苗策略出現(xiàn)的時間。Vaccine 2000；19；1855-1863；17.Wang，QL，Wang，HT，Blalock，E，Moller，S，and K”hlerm H鑒定在免疫缺陷病毒1感染的個體中被自身抗體識別的特應(yīng)性肽。Idiotype-specific autoantibodies in AIDS 1995；96775-780；18.Veljkovic，V，and Metlas，R鑒定HIV-1包膜基因中的免疫球蛋白重組成分。Immunol Lett 1991；3111-14；19.Metlas，R，Veljkovic，V，Paladini，DR，and Pongor，S人免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp120 V3環(huán)和免疫球蛋白可變區(qū)的蛋白和DNA序列的同源性。Biochem Biophys Res Commun1991；1791056-1062；20.Metlas，R.Skerl，V，Veljkovic，V，Colombatti，A，and Pongor，SHIV1-1包膜糖蛋白gp120的類免疫球蛋白區(qū)編碼假定的某些普通人蛋白的內(nèi)部圖像。Viral immunol 1994；7215-219；21.Metlas，R，Traj kovic，D，Srdic，T，Veljkovic，V，andColombatti，A正常個體的抗V3和抗IgG抗體有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。JAIDS 1999；21266-270；22.Pinter，A，Honnen，WJ，Tilley，SA構(gòu)象改變影響人免疫缺陷病毒1型gp120和包膜加工以及配基與這些位點結(jié)合相關(guān)的V3和V4結(jié)合域。J Virol1993；675692-5697；23.Holmberg，D，Andersson，A，Carlsson，L，and Forsgren，SB細(xì)胞連接的建立和功能含義。Immunological Reviews 1989；11089-103；24.Ochsenbein，AF，and Zinkernagel，RM天然抗體和先天的互補(bǔ)鏈與獲得免疫性。Immunol Today 2000；21624-629；25.Fearon，DT，and Locksley，RM先天免疫性在獲得性免疫應(yīng)答中的指導(dǎo)作用。Science 1996；27250-54。
權(quán)利要求
1.抗人IgG全組分的人抗體，該抗體能夠中和HIV-1。
2.權(quán)利要求1中的抗體，通過采用與人IgG全組分結(jié)合的樹脂對正常的、未HIV感染對象的血清進(jìn)行親和層析得到。
3.含權(quán)利要求1-2的抗體的藥物制劑。
4.權(quán)利要求1和2中的抗體在制備用于預(yù)防或治療HIV感染的藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1和2中的抗體在制備用于HIV-1感染的被動免疫治療的藥物中的用途。
全文摘要
能中和HIV－1病毒的人抗體制劑以及它的使用以治療HIV感染。
文檔編號C07K16/42GK1494554SQ02806063
公開日2004年5月5日 申請日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月9日
發(fā)明者R·梅特拉斯, R 梅特拉斯 申請人:戴法姆有限公司