專利名稱：馬西尼羅熱病毒抗體的檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測馬西尼羅熱病毒抗體的ELISA試劑盒，是醫(yī)學免疫學檢測領域。
背景技術：
西尼羅熱病毒(West nile virus，WNV)是1937年12月從非洲烏干達西尼羅地區(qū)一例發(fā)熱女患者的血液標本中首先分離的，并因此而得名(Smith，et al.，1940)。最初，人們只認為它是非洲的一種地方病，直到1957年以色列發(fā)生WNV腦膜腦炎爆發(fā)后，才真正認識到該病毒的危害。此后WNV感染波及非洲、歐洲、中東、西亞、中亞、大洋州和北美洲等廣大地區(qū)，流行呈擴大趨勢(Adernson，et al.，1999；Hubalek，et al.，1999)。
馬屬于易感染動物，感染后的死亡率達35％，但至今還未見報道馬WNV的檢測方法。我國雖至今尚未發(fā)現(xiàn)本病，但我國每年有大量馬的進口或出口，加之隨著對外交流的不斷擴大，使多邊商業(yè)貿(mào)易、旅游等人、物流不斷擴大，這會大大增加傳入WNV這種外來病原的機會。
因此當前迫切需要一種高效、快速、適于推廣的診斷試劑盒，以應用于馬WNV的監(jiān)控，防止該病毒從國外傳入及進一步的傳播。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應用ELISA技術對馬血清中的西尼羅熱病毒抗體進行檢測的試劑盒。
本發(fā)明的試劑盒組成如下(1)96孔酶標板2塊，已包被馬西尼羅熱病毒E蛋白抗原；(2)樣品洗滌液1瓶，其為10倍濃度的pH7.4的PBST溶液；(3)稀釋液1瓶，其為含0.1％牛血清白蛋白的PBST溶液；(4)酶標抗體工作液1瓶，其含辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗馬的二抗；(5)顯色底物1瓶，其為加H2O2的OPD(鄰苯二胺)溶液；
(6)終止液1瓶，其為2M的H2SO4溶液；(7)標準品兩瓶，其為馬西尼羅熱病毒標準陰性和陽性血清。
本發(fā)明的試劑盒用于馬西尼羅熱病毒抗體的檢測，其操作步驟如下(1)加樣取出已包被好的ELISA酶標板，用稀釋液1∶100稀釋樣品，同時設陰陽對照，陰、陽性血清與樣品做相同的稀釋，每孔100μl；(2)溫育將加好樣的酶標板在37℃作用60min；(3)洗滌棄去反應孔中的溶液，用每孔約300μl的樣品洗滌液充分洗滌3次，3～5min/次，最后一次拍干；(4)加酶標抗體每孔加100μl酶標抗體工作液；(5)溫育37℃作用60min；(6)洗滌棄去反應孔中的溶液，用每孔約300μl的樣品洗滌液充分洗滌3次，5min/次，最后一次拍干；(7)顯色每孔加100μl顯色底物(即加有H2O2的鄰苯二胺)溶液，避光作用15min；(8)終止反應每孔加50μl終止液；(9)比色用酶標比色儀測讀波長490nm處OD值，讀出樣品(S)、陽性對照(P)和陰性對照(N)的OD值。
(10)結果判定當測得ODs/ODN≥2.1時，判斷樣品為陽性。
本發(fā)明的試劑盒具備快速、高效、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，可以同時檢測多份馬血清樣品，另外還可大量生產(chǎn)，降低了檢測成本，適于推廣。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
各實施例所用材料DH5α，本實驗室保存；pMD18-T載體，購自寶生物工程(大連)有限公司；表達載體pET-32a(+)，本實驗室保存；大腸桿菌BL21，本實驗室保存；His·BindPurification Kit，購自Novagen公司；96孔酶標扳，購自南京大治生物有限公司；辣根過氧化酶標記的羊抗馬的酶標二抗，購自Southern Biotechnology有限公司；OPD(鄰苯二胺)，購自南京大治生物有限公司。
實施例1、馬西尼羅熱病毒(WNV)抗體重組E蛋白的制備(1)WNV的RNA提取參照TRIZOL說明書進行總RNA的提取。具體操作如下取200μl的滅活的WNV疫苗，加入800μL TRIZOL，振蕩混勻，室溫放置5min，加入200μl氯仿，劇烈振搖15s，室溫放置2-3min后，12,000rpm離心15min(4℃)；吸上層水相于另一新Ep管中，加入0.5ml異丙醇，充分混勻，-20℃放置15-30min后，12,000rpm離心10min(4℃)；棄去上清，加75％乙醇1ml，振搖混勻，充分洗滌沉淀，7,500rpm離心5min(4℃)；棄去上清，室溫自然干燥至管壁上無水珠，溶于10μl DEPC處理水中，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)引物的合成根據(jù)馬西尼羅熱病毒(WNV)的E蛋白抗原決定簇基因的cDNA序列(GenBankIDAY426741)，設計并合成引物。
上游引物P1(5’-ACTGAATTCACGTGACCCGGCTCCCCG-3’)下游引物P2(5’-CGGGATCCGCCGGTAGATGCGATTCC-3’)(3)RT-PCR擴增馬西尼羅熱病毒E蛋白抗原決定簇基因以病毒基因組RNA為模板，用上述引物，通過RT-PCR擴增獲得馬西尼羅熱病毒(WNV)的E蛋白抗原決定簇基因。
(4)表達載體的構建將RT-PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體用T4 DNA連接酶進行連接，然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌(DH5α)，提取轉(zhuǎn)化重組子質(zhì)粒，用EcoRI和HindIII進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，可切出318bp和2690bp的一大一小兩條帶，表明RT-PCR產(chǎn)物已克隆入中間載體pMD18-T Vector中，克隆載體pMD-E構建完成。
將表達載體pET 32a(+)、重組克隆載體pMD-E分別用EcoRI和HindIII酶切，回收兩種酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，提取轉(zhuǎn)化重組子質(zhì)粒，用EcoRI和HindIII進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，可切出318bp和5900bp的一大一小兩條帶，與所設計的大小相符，原核表達載體pET-E構建完成。
(5)表達質(zhì)粒的誘導表達將鑒定好的原核表達載體pET-E取10μl轉(zhuǎn)化入200μl大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，然后進行涂布LB瓊脂平板(含Amp抗生素50μg/ml)、挑菌、擴大培養(yǎng)、酶切鑒定等一系列操作。將鑒定好的含pET-E的BL21菌液按1∶100的比例加入含有Amp(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2h左右至OD值0.4-0.6，加入IPTG至終濃度1.0mmol/L，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-4h，同時設pET-32a(+)/BL21誘導對照，BL21誘導對照和未誘導的pET-E/BL21對照。各取出1ml，12000rpm離心30s，棄上清，沉淀加100μl 1×SDS-PAGE凝膠電泳上樣緩沖液(pH6.8的50mmol/L，50mmol/L DTT，2％SDS，0.1溴酚藍，10％甘油)重懸，100℃變性3min，備用。
經(jīng)IPTG誘導表達后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白，與對照相比，pET32a-E菌多一條蛋白帶，該蛋白分子量約32KD，與預期的分子量相同。
(6)表達產(chǎn)物純化和SDS-PAGE分析收集上步誘導表達得到的pET32a-E菌液，使用His·Bind純化試劑盒對表達產(chǎn)物進行純化。純化后取小量進行SDS-PAGE，表達產(chǎn)物只有一條特異的條帶。
實施例2試劑盒的制備(一)ELISA酶標板的包被和封閉(1)ELISA酶標板的包被①包被緩沖液的配制Na2CO30.4779gNaHCO30.4620g調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至100ml。
②將純化好的抗原馬西尼羅熱病毒抗體重組E蛋白用0.05mmol/L(pH9.6)的包被緩沖液稀釋至8.6μg/mL，然后加于96孔酶標板孔中，每孔100μl，4℃孵育過夜。包被過的96孔酶標板孔可以在-20℃條件下保存6個月。
(2)ELISA酶標板的封閉①封閉液的配制牛血清白蛋白(BSA)0.1g，加1×洗滌液至100ml。
②用洗滌液洗滌，洗滌時用洗滌液加滿各孔，室溫放置3min，棄掉，如此3次。洗滌后，每孔加封閉液(牛血清白蛋白0.1g，加洗滌液至100ml)200μl，37℃孵育2h。然后洗滌同前，拍干后即為包被好的酶標板條。
每個試劑盒裝有2塊經(jīng)0.1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封閉的板條，以包裝袋密封凍干保存于-20℃保存。
(二)洗滌液(20×)的配制洗滌液為含1％ Tween-20的20×PBS緩沖液(pH 7.4)KH2PO44gKCl 4gNa2HPO4·12H2O 58gNaCl160gTween-2010ml加雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)pH值至7.4。
(三)稀釋液的配制牛血清白蛋白(BSA) 0.1g加1×PBST洗滌液至100ml。
(四)底物溶液的配制(1)底物緩沖液(pH5.0)的配制Na2HPO41.8408g檸檬酸 0.5106g調(diào)pH至5.0，加水定容至100ml。
(2)底物溶液的配制底物緩沖液10mlOPD(鄰苯二胺) 4mg溶解后避光存放，臨用前加30％H2O215μl。
(五)終止液的配制終止液為2mol/L的H2SO4溶液，取雙蒸水178.3ml，滴加濃硫酸(98％)21.7ml。
實施例3抗原、血清的最佳稀釋度的確定按以下步驟(1)抗原包被將馬西尼羅熱病毒重組E蛋白經(jīng)His·BindPurificationKit純化的蛋白抗原用0.05mmol/L(pH9.6)的碳酸鹽緩沖液作倍比稀釋，將96孔板從左向右(1～6排)稀釋，始稀釋度分別為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200；7～12排與1～6排作相同的稀釋，倍數(shù)分別為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200，然后加于聚苯乙烯板孔中，每孔100μl，4℃孵育過夜。
(2)洗滌棄去孔內(nèi)溶液，再用洗滌液加滿各孔，室溫放置3min，棄掉，如此3次。
(3)封閉洗滌后，每孔加封閉液(牛血清白蛋白0.1g，加洗滌液至100ml)200μl，37℃孵育2h。然后洗滌(同步驟(2))。
(4)陽性血清與靶抗原反應將陽性血清用稀釋液從上往下(A～H)作倍比稀釋，起始稀釋度為1∶10，其中1～6加陽性血清，7～12加陰性血清，然后加于板孔中，每孔100μl，37℃孵育1h。然后洗滌(同步驟(2))。
(5)加酶標二抗將酶標羊抗馬的二抗按說明書推薦用PBS-Tween作1∶5000稀釋，然后加于板孔中，每孔100μl，37℃孵育1h。然后洗滌(同步驟(2))。
(6)加底物加OPD底物，每孔加入100μl新鮮配制的底物溶液，37℃反應15～30min。
(7)終止反應和讀數(shù)每孔加50uL終止液，用波長為490nm讀數(shù)；(8)結果表明，抗原的最佳稀釋為8.6μg/mL，血清的最佳稀釋度為1∶100。
實施例4使用試劑盒檢測馬血清樣品測試樣品北京出入境檢驗檢疫局提供的進口500份馬血清、南京農(nóng)業(yè)大學提供的50份馬血清和山東出入境檢驗檢疫局提供的450份血清。
測試步驟如下(1)加樣取出已包被好的ELISA酶標板，用稀釋液1∶100稀釋樣品，同時設陰陽對照，陰、陽性血清與樣品做相同的稀釋，每孔100μl(每塊板的加樣模式見表1)；(2)溫育將加好樣的酶標板在37℃作用60min；(3)洗滌棄去反應孔中的溶液，用每孔約300μl的樣品洗滌液充分洗滌3次，3～5min/次，最后一次拍干；(4)加酶標抗體每孔加100ul酶標抗體工作液；
(5)溫育37℃作用60min；(6)洗滌棄去反應孔中的溶液，用每孔約300μl的樣品洗滌液充分洗滌3次，5min/次，最后一次拍干；(7)顯色每孔加100ul加H2O2的OPD(鄰苯二胺)溶液，避光作用15min；(8)終止反應每孔加50ul終止液；(9)比色用酶標比色儀測讀波長490nm處OD值，讀出標品(S)、陽性對照(P)和陰性對照(N)的OD值。
(10)結果判定判斷標準為ODs/ODN≥2.1時，判斷樣品為陽性。本例中測得樣品的OD平均值為0.256，按判斷標準計算全為陰性。
表1每塊酶標板的血清加樣模式

注+為陽性；-為陰性；S1、S2、…SN為檢測樣品。
權利要求
1.一種馬西尼羅熱病毒抗體的定性檢測試劑盒，其組成如下(1)96孔酶標板2塊，已包被有馬西尼羅熱病毒E蛋白抗原；(2)樣品洗滌液1瓶，其為10倍濃度的pH7.4的PBST溶液；(3)稀釋液1瓶，其為含0.1％牛血清白蛋白的PBST溶液；(4)酶標抗體工作液1瓶，其含辣根過氧化酶標記的羊抗馬的二抗；(5)顯色底物1瓶，其為加H2O2的鄰苯二胺溶液；(6)終止液1瓶，其為2M H2SO4溶液；(7)標準品兩瓶，其為馬西尼羅熱病毒標準陰性和陽性血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于馬西尼羅熱病毒抗體檢測的試劑盒，屬醫(yī)學免疫學檢測技術領域，本發(fā)明制備重組馬西尼羅熱病毒E蛋白作為抗原，經(jīng)過滴定確定稀釋濃度后，包被到ELISA板條上，同時再配制洗滌液、稀釋液、底物溶液、終止液、辣根過氧化物酶(HRP)酶標記的羊抗馬的二抗、馬西尼羅熱病毒標準陰、陽性血清。本試劑盒用于對馬血清樣品進行西尼羅熱病毒抗體的檢測，具有高度的特異性、敏感性，可大量生產(chǎn)，大大降低了檢測成本，適于推廣。
文檔編號G01N33/543GK101042400SQ20071002171
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權日2007年4月26日
發(fā)明者姜焱, 張常印, 陶宏錦, 張敬友, 侯玉峰, 張鶴曉, 柯家法, 王凱民, 陳國強, 唐泰山, 鄧娟仙, 張揚 申請人:中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局