專利名稱：制備取代的2-氨基-3-(2-氨基-苯硫基)-丙酸的酶催化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備式I化合物的新的酶催化方法， 其中R1是氫或烷基；R2是氨基保護基團；每個R3獨立地是鹵素、羧基、烷氧羰基、鏈烯氧基羰基或芐氧基羰基；n是1或2。
在EP0407033A中描述了將不是2-鹵素丙酸的2-取代的酸的酯外消旋混合物經(jīng)酶催化的立體選擇性地水解成相應的對映異構酸。在皺落假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶同工酶、有機溶劑(例如甲苯)和還原劑的存在下進行該反應。該方法對立體選擇性地生產(chǎn)S-酮洛芬、S-布洛芬、S-非諾洛芬、S-2-苯基丙酸和S-吲哚洛芬尤其有用。
在EP0178553中描述了用胰凝乳蛋白酶通過選擇性水解相應的烷基酯制備芳族取代的L-氨基酸的方法。
在DE2804892中描述了用絲氨酸蛋白酶、特別是枯草蛋白酶Carlsberg水解N-?；?DL-蘇氨酸酯制備光學純的N-?；?L-蘇氨酸的方法。
但是，迄今為止，文獻中還沒有描述過制備式I化合物的酶催化反應方法。
通過化學水解合成式I化合物的嘗試導致低產(chǎn)量和起始物質的分解。
所以，本發(fā)明的目的是提供一種新的、創(chuàng)造性的制備取代的2-氨基-3-(2-氨基-苯硫基)-丙酸的方法。
可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)式I化合物，本發(fā)明提供了一種新的制備式I的取代的2-氨基-3-(2-氨基-苯硫基)-丙酸的方法， 其中R1是氫或烷基；R2是氨基保護基團；每個R3獨立地是鹵素、羧基、烷氧羰基、鏈烯氧基羰基或芐氧基羰基；n是1或2，該方法包括在含有一種有機共溶劑的含水體系中使式II化合物與蛋白酶反應， 其中R1、R2、R3和n如上所定義，R4是烷基或芐基。
使用本文描述的酶催化方法使得在溫和的反應條件下選擇性地水解酯成為可能。
在本文所給的結構式中，楔形鍵 表示取代基在紙平面的上方。
本文所用術語“烷基”表示含有1到12個碳原子、任選取代的直鏈或支鏈的烴殘基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基，包括它們的不同異構體。
烷基鏈的適宜的取代基可以是選自1-3個鹵素原子(如氟或氯)和C1-4-烷氧基(如甲氧基或乙氧基)。取代的烷基的實例是2-氯乙基、2-氟乙基、2，2，2-三氟乙基或2-甲氧基乙基。
R1中烷基如上定義并且優(yōu)選是含有1到7個碳原子的直鏈或支鏈烴殘基。R1中烷基更優(yōu)選甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基或叔丁基。
R4中烷基如上定義并且優(yōu)選是含有1到7個碳原子的任選取代的直鏈或支鏈烴殘基。烷基鏈的適宜取代基可以選自1-3個鹵素原子(如氟或氯)和C1-4-烷氧基(如甲氧基或乙氧基)。取代的烷基的實例是2-氯乙基、2-氟乙基、2，2，2-三氟乙基或2-甲氧基乙基。R4中烷基更優(yōu)選是含有1到7個或1到4個碳原子的直鏈烴殘基。其實例是甲基、乙基、丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基。優(yōu)選的實例是甲基、乙基或丙基。R4中最優(yōu)選的烷基是甲基。
本文所用術語“氨基保護基團”指如在“有機合成中的保護基團”(GreenT.Protective Groups in Organic Synthesis，第5章，John Wiley和Sons，Inc.(1981)，218-287頁)中所描述的肽化學中所用的那些基團，如烯丙氧基羰基基團(ALLOC)、低級烷氧基羰基基團(例如叔丁氧基羰基(t-BOC))、取代的低級烷氧基羰基基團(例如三氯乙氧基羰基)、任選取代的芳氧基羰基基團(例如對-硝基芐氧基羰基、芐氧基羰基(Z)或苯氧基羰基)、烷酰基基團(例如甲?；⒁阴；?、芳?；鶊F(例如苯甲?；?、鹵代烷?；鶊F(例如三氟乙?；?或甲硅烷基保護基團(例如叔丁基二甲基甲硅烷基)。優(yōu)選的氨基保護基團是芐氧基羰基、叔丁氧基羰基、烯丙氧基羰基或苯甲酰基，特別優(yōu)選的氨基保護基團是叔丁氧基羰基。
術語“烷氧基羰基”表示連接到羰基基團(＞C＝O)的C1-7-烷氧基。烷氧基的實例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、1-仲丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基和庚氧基，包括它們的不同異構體。烷氧基羰基基團的實例是甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、叔丁氧基羰基等。優(yōu)選的低級烷氧基羰基是叔丁氧基羰基。
術語“鏈烯氧基羰基”表示連接到羰基基團(＞C＝O)的鏈烯氧基。本文所用術語“鏈烯基”表示具有2到8個碳原子、優(yōu)選2到4個碳原子并且具有至少一個烯烴雙鍵的未取代或取代的烴鏈基，包括它們的不同異構體。實例是乙烯基、烯丙基或異丙烯基。
R3的優(yōu)選的“鏈烯氧基羰基”是烯丙氧基羰基或異丙烯氧基羰基，更優(yōu)選的是烯丙氧基羰基。
術語鹵素表示氟、氯、溴或碘。優(yōu)選的鹵素是溴。
數(shù)字n可以是1或2，優(yōu)選數(shù)字n是1。
取代基R3可以在任何可能的位置連接到苯環(huán)。如果n是1，R3可以在苯環(huán)的3、4、5或6位。優(yōu)選地，R3取代基處于4位。如果n是2，兩個R3取代基可以相互獨立地位于苯環(huán)的3、4、5或6位。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是一種制備式I化合物的方法，其特征是式II化合物是 其中R1、R2、R3、R4和n如上定義。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，R1是氫或烷基。
更優(yōu)選R1是氫；R2是氨基保護基團。
更優(yōu)選R2是氨基保護基團；每個R3獨立地是鹵素、羧基或鏈烯氧基羰基；R4是烷基或芐基。
更優(yōu)選R4是烷基；n是1或2。
更優(yōu)選n是1。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，在含有有機共溶劑的含水體系中，在pH 4.0-10、優(yōu)選6.0-8.5下用蛋白酶實施該方法。
在將式II的底物酶催化水解后，通過酸化和隨后萃取分離對映體純的式I產(chǎn)物。
式II化合物可用于L或D對映異構體的任何可能的混合物中。優(yōu)選用外消旋混合物或者只含有L-異構體的混合物完成轉化。
當使用異構體混合物時，在酸化反應介質之前通過萃取步驟除去未反應的D-酯并隨后萃取L-酸。
催化反應的適宜的酶是蛋白酶，優(yōu)選微生物來源的廉價散裝蛋白酶，更優(yōu)選為芽孢桿菌蛋白酶(象Novo Nordisk生產(chǎn)的Savinase)或枯草蛋白酶例如Novo Nordisk的枯草蛋白酶Carlsbeg(Alkalase)或者Solvay生產(chǎn)的枯草蛋白酶(蛋白酶-L)或者曲霉蛋白酶(象Amano的Prozyme 6)或者Tritachium蛋白酶(Fluka的Proteinase K)。該反應的作為催化劑的最優(yōu)選的酶是枯草蛋白酶Carlsberg(例如Norvo Nordisk的Alcalase)。
作為備選方案，這些酶可以以固定的形式使用。
反應在含有有機共溶劑如不水混溶的溶劑或者水可混合的有機共溶劑的含水體系中進行。水不混溶的溶劑可以以任何比例用于水相中，優(yōu)選的比例是25-75％(v/v)。水混溶的有機共溶劑的用量可以高至酶的耐受量，通常是5-25％(v/v)，但是不能超過50％(v/v)，例如對于枯草蛋白酶Carlsberg就是如此。
反應的反應溫度為0℃到50℃，優(yōu)選反應溫度是15℃到40℃之間，最優(yōu)選的反應溫度是15℃到25℃之間。
對于水相，可以使用本領域進行生化轉化的常用緩沖溶液，例如最高1M，優(yōu)選約5mM到50mM的磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液。這種緩沖溶液還可以含有一種常用鹽如氯化鈉或氯化鉀，以及LiSCN、Na2SO4或一種多羥基醇例如糖；該鹽濃度最高1M。
適宜的有機共溶劑是技術上常用的溶劑。實例是醚(例如四氫呋喃(THF)、二噁烷或叔丁基甲基醚(TBME))、低級醇、酯(例如乙酸乙酯)、極性非質子溶劑(例如二甲亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮)。優(yōu)選的有機共溶劑是四氫呋喃(THF)、叔丁基甲基醚(TBME)和乙酸乙酯。
本文所用術語“低級醇”指具有一個羥基基團、含有1到8個碳原子的直鏈或支鏈烷基殘基，例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇、己醇、庚醇或辛醇，優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇，更優(yōu)選的醇是甲醇或乙醇。
底物適于應用的總濃度為0.1-25％(w/w)的溶液。更優(yōu)選的總濃度是1-10％。
加入酶后，在劇烈攪拌下，通過可控地加入堿使反應混合物的pH保持在選定的pH值。優(yōu)選的堿是水性NaOH或KOH溶液。
終止反應后，首先進行相分離，然后通過用適宜的酸酸化、隨后用適宜的有機溶劑萃取來對式I的對映異構純的產(chǎn)物進行處理。
根據(jù)本發(fā)明合成高對映異構純的式I化合物，高對映異構純指對映體過量90％或更高，優(yōu)選對映體過量95％或更高。
根據(jù)下面的反應方案或者本領域技術人員已知的常用方法制備式II化合物。
反應方案1 其中R1、R2、R3和R4如式I和式II化合物所描述的。
在反應方案1中，式a)的取代的2-硝基氟代芳香族化合物和式b)的受保護的半胱氨酸(例如BOC-半胱氨酸-甲基酯)反應，得到相應的式c)的硝基-苯基取代的受保護的半胱氨酸。通常在堿性條件下(含有一種二異丙胺，例如乙基二異丙胺)，合適的有機溶劑(如己烷、二異丙基醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、DMF或DMSO)中進行該反應。反應溫度優(yōu)選在-30℃到+150℃之間。最優(yōu)選地，在110℃的溫度下、在乙基二異丙胺存在下、于乙醇中與BOC-半胱氨酸-甲基酯進行該反應。
式a)化合物和式b)的受保護的半胱氨酸(例如BOC-半胱氨酸-甲基酯)可通過商業(yè)途徑得到或者按照有機化學教科書(例如J.March(1992)，“Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，andStructure”，第四版，John Wiley & Sons)中已知的方法合成。
進行該反應的第二步，在該步驟中式c)的硝基-苯基取代的受保護的半胱氨酸的硝基被還原成相應的式II的氨基-苯基取代的受保護的半胱氨酸。根據(jù)本領域中已知的方法例如有機化學教科書(例如J.March(1992)，“Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，and Structure”，第四版，John Wiley & Sons)中已知方法進行還原反應。優(yōu)選在含有有機溶劑(如己烷、二異丙基醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、DMF或DMSO，優(yōu)選甲醇)的酸性介質中與合適的還原劑(例如鋅和任選的NH4Cl)進行該反應。反應溫度優(yōu)選在-30℃到+150℃之間。
可以用R1Hal烷基化式II的氨基-苯基取代的受保護的半胱氨酸化合物的NH2-基團，其中R1如上定義，Hal為氯或溴。
式II-a和II-b化合物(見下面)是新的中間產(chǎn)物，因此也是本發(fā)明的主題。
或
式I化合物是合成1，5-苯并硫氮雜類的通用結構單元。這種苯并硫氮雜骨架被用作各種酶(蛋白酶、白介素-1β-轉化酶、彈性蛋白酶或血管緊張肽-轉化酶抑制劑，但是也作為GPCR拮抗劑(縮膽囊素、血管緊張肽II受體)中的受限二肽模擬物?？赡艿牟煌猛驹贕.C.Morton等，Tet.Lett.，41(2000)3029-3033中描述。
根據(jù)反應方案2制備苯并硫氮雜類 其中，R1、R2、R3、R4和n如式I和式II化合物所描述的。
加熱或者在適當試劑的存在下(例如在G.C.Morton等，Tet.Lett.，41(2000)3029-3033中所描述的)進行式I化合物的環(huán)化反應以得到式III的苯并硫氮雜類。優(yōu)選在合適的溶劑如己烷、二甲苯、二異丙基醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、DMF或DMSO中，用碳二亞胺進行該反應。反應溫度優(yōu)選-30℃到+150℃。優(yōu)選在EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)的存在下、在DMF中、于室溫下進行該反應。
在下面的實施例中所用的縮寫具有下面的含義。
ISP-MS 離子噴霧陽性質譜ISN-MS 離子噴霧陰性質譜EI-MS 電子沖擊質譜
SFC超臨界液相色譜NMR核磁共振譜IR 紅外光譜HV 高真空min分鐘實施例1(起始物質的制備)(S)-3-(4-溴-2-硝基-苯硫基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲基酯 按照M.K.Schwarz等(J.Org.Chem.1999，64，2219-2231)描述的方法進行反應。向市售BOC-半胱氨酸-甲基酯(27.38g，116.35mmol，1eq)和N-乙基二異丙基胺(DIPEA)(4.4mL，25.75mmol，2.5eq)的EtOH(310ml)溶液加入5-溴-2-氟硝基苯(25.62g；116.45mmol；1eq)并在110℃下加熱3h。通過HPLC監(jiān)視反應的進程。蒸發(fā)溶劑得到紅褐色油狀物，其在水(600ml)和乙酸乙酯(3×300ml)之間分配。干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)得到粗產(chǎn)物，用環(huán)己烷將其重結晶得到黃色晶體(38.75g，77％)。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.430(s，9H，O(CH3))；3.350(dd，1H，H(4′)，J4’-4″＝5.2Hz，J4′-5＝14.4Hz)；3.500(dd，1H，H(4″)，J4″-4′＝5.2Hz，J4″-5＝14.4Hz)；3.755(s，3H，OCH3)；4.621(m，1H，H(5))；5.301(d，1H，H(6)，J6-5＝6.4Hz)；7.449(d，1H，H(1)，J1-2＝8.8Hz)；7.670(dd，1H，H(2)，J1-2＝8.8Hz，J2-3＝2.0Hz)；8.278(d，1H，H(3)，J2-3＝2Hz).IR3353cm-1(NH)；1765cm-1(酯-C＝O)；1686cm-1(氨基甲酸酯-C＝O)；1546cm-1(酰胺-C＝O)；1460和1329cm-1(NO2)；1220cm-1(酯).MSm/z＝452.3[M+NH4+]，用79Br；m/z＝454.3[M+NH4+]，用81Br；m/z＝457.3[M+Na+]，用79Br；m/z＝459.3[M+Na+]，用81Br。Rf＝0.38，在乙酰乙酯/己烷(1∶2)中，在SiO2上。
實施例2(S)-3-(2-氨基-4-溴-苯硫基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲基酯 按照J.Slade等(J.Slade et.al.，J.Med.Chem.1985，28，1571-1521)所描述的方法進行反應。加入上面硝基化合物(40.34g，92.6mmol，1eq)和NH4Cl(19.81g，370.6mmol，4eq)的混合物并且將置于MeOH(950mL)中的Zn(79.37g，1.204mmol，13eq)回流加熱16h，所得混合物通過硅藻土過濾并用沸騰的MeOH洗滌。濃縮后，粗產(chǎn)物在乙酸乙酯和NaHCO3(aq.)之間分配。層析(用乙酸乙酯/己烷/3％三乙胺)所得油得到產(chǎn)物(21.11g，56％)。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.395(s，9H，O(CH3)；3.185(d，2H，H(4)，J4-5＝4Hz)；3.617(s，3H，OCH3)；4.446(s，2H，H(7))；4.528(m，1H，H(5))；5.502(d，1H，H(6)，J6-5＝8Hz)；6.793(dd，1H，H(3)，J3-2＝2Hz，J3-1＝8.4Hz)；6.868(d，1H，H(3)，J3-2＝2Hz)，7.225(d，1H，H(1)，J1-2＝8.4Hz).IR3356cm-1(-NH2，-NH)；1744cm-1酯-C＝O)；1707cm-1(氨基甲酸酯-C＝O)；1540cm-1(酰胺)；1250cm-1(酯).MSm/z＝405.3[M+H+]，用79Br；m/z＝407.3[M+H+]，用81Br。Rf＝0.47，在乙酰乙酯/己烷(1∶2)中，在SiO2上。
實施例3.1(大規(guī)模酶促水解)(S)-3-(2-氨基-4-溴-苯硫基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸
將19.9g(48.02mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(2-氨基-4-溴苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(97.8％)溶于750ml TBME中并在劇烈攪拌下在3L緩沖液(0.1M氯化鈉，20mM磷酸鈉，pH 7.5)中乳化。加入12.0ml Alcalase 2.4L和30mg枯草蛋白酶A[兩種酶制劑都是Novo Nordisk生產(chǎn)的枯草蛋白Carlsberg]并通過可控地加入1.0N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.5(pH-恒定)。7天后，消耗掉44.75ml 1.0N氫氧化鈉溶液，轉化率＞99％(HPLC分析)。分離兩相反應混合物。迅速用1LTBME洗滌水相以便分離少量親脂性雜質和痕量剩余底物。用pH 7.6的1×250ml 0.1M磷酸鉀緩沖液萃取合并的有機相。用32％鹽酸將合并的水相酸化到pH 2并用1.5L乙酸乙酯萃取。通過攪拌下加入10％Dicalite并過濾分離所得乳液。用2×1L乙酸乙酯萃取水相。經(jīng)無水硫酸鈉干燥合并的乙酸乙酯相并蒸發(fā)。將所得殘渣溶于二氯甲烷、蒸發(fā)并在HV中干燥得到灰黃色固態(tài)18.79g N-叔丁氧基羰基-3-(2-氨基-4-溴苯硫基)-L-丙氨酸(產(chǎn)率81.8％)。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.399(s，9H，OC(CH3))；3.184(dd，1H，SCH2，J＝14.2Hz，J＝6.6Hz)；3.235(dd，1H，SCH2，J＝14.2Hz，J＝6.6Hz)；4.515(m，1H，COCHNH)；5.517(d，1H，CONHCH，J＝6.8Hz)；6.796(dd，1H，arom.，J＝2Hz，J＝8.4Hz)；6.876(d，1H，arom.，J＝2Hz)；7.250(d，1H，arom.，J＝8.4Hz)。IR(ATR-IR)3445和3355cm-1(-NH，-NH2)；2978和2929cm-1寬峰(-COOH)；1693cm-1(COOH-C＝O，氨基甲酸酯-C＝O)；1508cm-1(酰胺-CO-NH)；1247和1157cm-1(COOH)。MS(ESI-陽性離子化)m/z＝391.1[M+H+]，用79Br；m/z＝393.1[M+H+]，用81Br；m/z＝413.2[M+Na+]，用79Br；m/z＝415.2[M+Na+]，用81Br。OR[α]D＝+53.3°(CHCl3；c＝1.0).HPLC分析柱子ABZ+plus；流動相A0.1％TFA水溶液；BMeCN；梯度B30-80％0-15min，80-30％15-16min，30％16-19.5min；流速1ml/min；壓力50-80巴；檢測UV，300nm；保留時間12.1min(產(chǎn)物-酸)13.5min(底物-酯)。
實施例3.2(小規(guī)模酶促水解)(S)-3-(2-氨基-4-溴-苯硫基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸將1.65g(3.99mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(2-氨基-4-溴苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(98％)溶于65ml TBME并在劇烈攪拌下將其在240緩沖液中(0.1M氯化鈉；20mM磷酸鈉，pH 7.5)乳化。加入0.75ml Alcalase2.4L[NovoNordisk生產(chǎn)的一種枯草蛋白酶Carlsberg]并通過可控地加入1.0N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.5(pH-恒定)。33h后消耗4.23ml 1.0N氫氧化鈉溶液，轉化率＞99％(HPLC分析)。用32％的鹽酸酸化反應混合物到pH 2，在Decalite上過濾。相分離后用3×275ml乙酸乙酯萃取水相。合并的有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥并蒸發(fā)。將殘渣溶解于二氯甲烷、蒸發(fā)并在HV中干燥得到1.56g灰黃色固態(tài)N-叔丁氧基羰基-3-(2-氨基-4-溴苯硫基)-L-丙氨酸(產(chǎn)率99.8％)。
實施例3.3(用不同溶劑酶促水解)(S)-3-(2-氨基-4-溴-苯硫基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸劇烈攪拌下將100mg(0.242mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(2-氨基-4-溴苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(98％)加入到由20％有機共溶劑(見下表)和80％緩沖溶液(0.1M氯化鈉；3mM磷酸鈉，pH 7.5)組成的系統(tǒng)中。加入100μlAlcalase 2.4L[一種Novo Nordisk生產(chǎn)的枯草蛋白酶Carlsberg]并通過可控地加入0.1N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.5(pH-恒定)。反應結束時用HPLC測定轉化率。
a轉化從300nm處HPLC分析的峰面積計算。
實施例3.4(用其他酶酶促水解)(S)-3-(2-氨基-4-溴-苯硫基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸劇烈攪拌下將200mg(0.493mmol)N-叔丁氧基-3-(4-溴-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(93.8％)加到由5ml TBME和20ml緩沖液(0.1M氯化鈉；3mM磷酸鈉，pH 7.0)組成的系統(tǒng)中。加入酶[見下表]并通過可控地加入0.1N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.0(pH-恒定)。終止反應后將反應混合物用25ml TBME洗滌兩次，用25％HCl酸化到pH 2.5并用3×25ml乙酸乙酯萃取。在硫酸鈉上干燥合并的有機相，蒸發(fā)溶劑并在高真空中干燥殘渣。
實施例4(S)-(7-溴-4-氧代-2，3，4，5-四氫-苯并[b][1，4]硫氮雜-3-基)-氨基甲酸叔丁基酯
按照G.C.Morton等(G.C.Morton et.al，Tet.Lett.，41(2000)3029-3033)所描述的方法進行反應。將酶水解產(chǎn)物(15.2g，38.8mmol，1eq)和EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(7.44g，38.8mmol，1eq)的DMF(500mL)溶液在室溫下攪拌16h，濃縮并將殘渣溶解于乙酸乙酯(500ml)中并用NaHCO3(1M)水溶液(500mL)和水(500mL)萃取。干燥(Na2SO4)并濃縮得到產(chǎn)物(14.5g，定量的)。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.409(s，9H，O(CH3))；2.939(t，1H，H(4′)，J＝11.6Hz)；3.794(dd，1H，H(4″)，J4″-5＝11Hz，J4″-4′＝6.4Hz)；4.439(m，1H，H(5))；5.567(d，1H，H(6)，J6-5＝8Hz)；7.306(d，1H，H(2)，J2-1＝8Hz，J2-3＝2Hz)；7.337(d，1H，H(3)，J3-2＝2Hz)；7.748(d，1H，H(1)，J1-2＝8Hz)；8.042(s，1H，H(7))。IR3284和3184cm-1(-NH)；1729cm-1(氨基甲酸酯-C＝O)；1678cm-1(酰胺-C＝O)；1574cm-1(酰胺)；1251cm-1(酯)。MSm/z＝373.3[M+H+]，用79Br；m/z＝375.3[M+H+]，用81Br；m/z＝395[M+Na+]，用79Br；m/z＝397[M+Na+]，用81Br。Rf＝0.23，在乙酸乙酯/己烷(1∶2)中，在SiO2上。
實施例5(S)-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-甲氧基羰基-乙硫基)-3-硝基-苯甲酸烯丙基酯 將4-氟-3-硝基苯甲酸(49.95g，269.8mmol，1eq)溶于甲醇(350mL)，加入Cs2CO3(44.06g，135.2mmol，0.5eq)并蒸發(fā)溶劑。然后將Cs鹽溶于DMF，加熱到50℃并用烯丙基溴(22.8mL，269.8mmol，1eq)處理。5分鐘后蒸發(fā)溶劑并將所得固體在Et2O中研磨。過濾并蒸發(fā)得到定量的粗烯丙基酯。根據(jù)M.K.Schwarz等(M.K.Schwarz et al.，J.Org.Chem.1999，64，2219-2231)描述的方法進行下一步。將烯丙基酯(30g，133.2mmol，1eq)、BOC-半胱氨酸-甲基酯(31.35g，133.2mmol，1eq)和DIPEA(68.3mL，399.6mmol，3eq)緩慢加入EtOH中(觀察到放熱反應)并在室溫攪拌3小時，濃縮得到固體，將其用二異丙基醚(46.16g，79％)重結晶。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.443(s，9H，O(CH3))；3.401(dd，1H，H(7′)，J7′-7″＝2.4Hz，J7’-8＝6Hz)；3.506(dd，1H，H(7″)，J7″-7′＝2.4Hz，J7″-8＝6Hz)；3.777(s，3H，OCH3)；4.608(m，1H，H(8))；4.860(dt，2H，H(3′，3″)，J3-2＝5.6Hz；J3-1＝1.6Hz)；5.322(q，1H，H(1′)，J＝0.8Hz)；5.347(t，1H，H(1″)，J＝0.8Hz)；5.406(d，1H，H(9)，J9-8＝1.6Hz)；6.032(m，1H，H(2))；7.625(d，1H，H(5)，J5-4＝8.4Hz)；8.201(dd，1H，H(4)，J4-5＝8.4Hz，J4-6＝1.6Hz)；8.830(d，1H，H(6)，J6-4＝1.6Hz).IR3350cm-1(-NH)；1742cm-1(酯-C＝O)；1719cm-1(Conj.酯-C＝O)；1686cm-1(氨基甲酸酯-C＝O)；1523和1334cm-1(-NO2)；1245cm-1(酯).MSm/z＝441.3[M+H+]；m/z＝458.4[M+NH4+]；m/z＝463.2[M+Na+].Rf＝0.40，在乙酸乙酯/己烷(1∶2)中，在SiO2上.
實施例6(S)-3-氨基-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-甲氧基羰基-乙硫基)-苯甲酸烯丙基酯 按照J.Slade等(J.Slade et.al.，J.Med.Chem.1985，28，1517-1521)描述的方法進行反應。將上面產(chǎn)物(506mg，1.15mmol，1eq)含水NH4Cl(20mL)和Zn(976mg，14.9mmol，13eq)在DME(15mL)中攪拌，將其在80℃下加熱16h。蒸發(fā)溶劑并將殘渣溶解于乙酸乙酯(250mL)并用(含水)NaHCO3(1M)(3×50mL)萃取。用Na2SO4干燥有機相并蒸發(fā)得到黃色油，其在幾天后結晶(276mg，60％)。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.380(s，1H，O(CH3))；3.283(d，2H，H(7′，7″)，J7-8＝4.4Hz)；3.579(s，3H，OCH3)；4.445(s，2H，H(10′，10″))；4.554(m，1H，H(8))；4.787(ddd，2H，H(2′，2″)，J＝1.2Hz)；5.283(dd，1H，H(1′)，J1’-2＝10.6Hz，J1’-1”＝1.2Hz)；5.390(dd，1H，H(1″)，J1”-2＝17.8Hz，J1”-1’＝1.2Hz)；5.506(d，1H，H(9)，J9-8＝7.6Hz)；6.015(m，1H，H(8))；7.360(dd，1H，H(2)，J4-5＝8Hz，J4-6＝1.6Hz)；7.398(d，1H，H(6)，J6-4＝1.6Hz)；7.425(d，1H，H(5)，J5-4＝8Hz).IR3378cm-1(-NH，-NH2)；1751cm-1(酯-C＝O)；1713cm-1(Conj.酯-C＝O)；1685cm-1(氨基甲酸酯-C＝O)；1511cm-1(-酰胺)；1220cm-1(酯).MSm/z＝411.3[M+H+]；m/z＝433.3[M+Na+].Rf＝0.27，在乙酸乙酯/己烷(1∶2)中，在SiO2上。
實施例7.1(大規(guī)模酶促水解)(S)-3-氨基-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-羧基-乙硫基)-苯甲酸烯丙基酯 將6.4g(15.658mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(4-烯丙氧基羰基-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(99％)溶解于480ml TBME并在劇烈攪拌下在1.5升緩沖液(0.1M氯化鈉；160mM磷酸鈉，pH 7.5)中乳化。加入12.0ml Alcalase 2.4L[Novo Nordisk的一種枯草蛋白酶Carlsberg]并通過可控地加入1.0N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.5(pH-恒定)。48.5h后消耗16.6ml1.0N氫氧化鈉溶液，轉化率＞97％(HPLC分析)。相分離后用1l TBME萃取水相。用2×0.4L 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH 7.6)萃取合并的TBME相。用32％鹽酸酸化合并的水相到pH 2并用3×0.5l乙酸乙酯萃取。如果形成穩(wěn)定的乳液，則通過在Dicalite上過濾完成相分離。經(jīng)無水硫酸鈉干燥合并的乙酸乙酯相并蒸發(fā)。將殘渣溶于二氯甲烷、蒸發(fā)、HV中干燥得到5.85g黃色高粘性油狀N-叔丁氧基羰基-3-(4-烯丙氧基羰基-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸(產(chǎn)率94.6％)。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(DMSO，400MHz)1.338(s，9H，OC(CH3))；3.077(dd，1H，SCH2，J＝12.8Hz，J＝6.8Hz)；3.238(dd，1H，SCH2，J＝13.8Hz，J＝4.6Hz)；3.867(m，1H，COCHNH)；4.753(d，2H，COOCH2，J＝5.2Hz)；5.526(d，1H，CH＝CH2，J＝10Hz)；5.538(d，1H，CH＝CH2，J＝17.6Hz)；5.595(m，2H，NH2)；6.018(ddtr，1H，CH2CH＝CH2，J＝16.6Hz，J＝10.6Hz，J＝5.6Hz)；6.519(m，1H，CONHCH)；6.876(d，1H，arom.CSCH，J＝8.4Hz)；7.330(d，1H，arom.CSCHCH，J＝8.4Hz)；7.338(s，1H，arom.CHCNH2).IR(ATR-IR)3420和3355cm-1(-NH，-NH2)；2980和2935cm-1寬峰(-COOH)；1705cm-1(COOH-C＝O，氨基甲酸酯-C＝O)；1510cm-1(酰胺-CO-NH)；1486cm-1aromate；1229和1160cm-1(COOH)；982和932cm-1(乙烯基，-C＝CH2).MS(ESI-陽性離子化)m/z＝397.1[M+H+]；m/z＝419.4[M+Na+].OR[α]D＝+16.16°(CHCl3；c＝1.0).HPLC分析柱子ABZ+plus；流動相A0.1％TFA水溶液；BMeCN；梯度B30-80％0-15min，80-30％15-16min，30％16-19.5min；流速1ml/min；壓力50-80巴；檢測UV，300nm；保留時間11.2min(產(chǎn)物-酸)；12.7min(底物-酯)。
實施例7.2(小規(guī)模酶促水解)(S)-3-氨基-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-羧基-乙硫基)-苯甲酸烯丙基酯將0.769g(1.658mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(4-烯丙氧基羰基-2-氨基苯基-硫代)-L-丙氨酸甲基酯溶于40ml TBME并在劇烈攪拌下在220ml 0.1M氯化鈉溶液、3mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中乳化。加入0.1ml Alcalase2.4L[Novo Nordisk的一種枯草蛋白酶Carlsberg]并通過可控地加入1.0N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.5(pH-恒定)。45.4h后消耗23.6ml1.0N氫氧化鈉溶液，轉化率＞97％(HPLC分析)。用100ml TBME萃取反應混合物。相分離后用32％鹽酸酸化合并的水相到pH2.3并用3×250ml乙酸乙酯萃取。如果形成穩(wěn)定的乳液，則通過在Dicalite上過濾完成相分離。經(jīng)無水硫酸鈉干燥合并的乙酸乙酯相并蒸發(fā)。將殘渣溶于二氯甲烷、蒸發(fā)、HV中干燥得到604mg灰黃色固態(tài)N-叔丁氧基羰基-3-(4-烯丙氧基羰基-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸(產(chǎn)率93.9％，純度95％)。
實施例7.3(用不同溶劑的酶促水解)(S)-3-氨基-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-羧基-乙硫基)-苯甲酸烯丙基酯將200mg(0.487mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(4-烯丙氧基羰基-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(96.7％)在劇烈攪拌下加入到由2到5ml有機共溶劑(見下表)和20ml緩沖液(0.1M氯化鈉；3mM磷酸鈉，pH 7.0)組成的系統(tǒng)中。加入Alcalase 2.4L[Novo Nordisk的一種枯草蛋白酶Carlsberg，用量見下表]并通過可控地加入0.1N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.5(pH-恒定)。通過滴定劑的消耗監(jiān)控反應，用HPLC確定產(chǎn)物的形成。
實施例7.4(用其他酶的酶促水解)(S)-3-氨基-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-羧基-乙硫基)-苯甲酸烯丙基酯將200mg(0.487mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(4-烯丙氧基羰基-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(96.7％)在劇烈攪拌下加入到由5ml TBME和20ml緩沖液(0.1M氯化鈉；3mM磷酸鈉，pH 7.0)組成的系統(tǒng)中。加入酶[見下表]并通過可控地加入0.1N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.0(pH-恒定)。通過滴定劑的消耗監(jiān)控反應，用HPLC確定產(chǎn)物的形成。
實施例7.5(較高溫度的酶促水解)
(S)-3-氨基-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-羧基-乙硫基)-苯甲酸烯丙基酯40℃下將200mg(0.487mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(4-烯丙氧基羰基-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯(96.7％)在劇烈攪拌下加入到由5ml TBME和20ml緩沖液(0.1M氯化鈉；3mM磷酸鈉，pH 7.0)組成的系統(tǒng)中。加入100μl Alcalase 2.4L[Novo Nordisk的一種枯草蛋白酶Carlsberg]并通過可控地加入(pH-恒定)0.1N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下于40℃保持pH在7.0。消耗5.44ml滴定劑(理論值的112％；17.4h后)后，將反應混合物用25mlTBME洗滌，用1N HCl酸化到pH 2.5并用3×25ml乙酸乙酯萃取。經(jīng)無水硫酸鈉干燥合并的有機相，蒸發(fā)溶劑并將殘渣在高真空中干燥得到190mg(0.479mmol；98％)94.5％HPLC-純(面積-％)的產(chǎn)物酸。
實施例8(S)-3-叔丁氧基羰基氨基-4-氧代-2，3，4，5-四氫-苯并[b][1，4]硫氮雜-7-羧酸烯丙基酯 按照G.C.Morton等(G.C.Morton et al.，Tet.Lett.，41(2000)3029-3033)描述的方法進行反應。將酶水解產(chǎn)物(5.6g，14.1mmol，1eq)溶于DMF(75ml)并用EDAC(2.70g，14.1mmol，1eq)處理并在室溫下攪拌16h。濃縮后，將殘渣溶于乙酸乙酯(500mL)中并用(含水的)NaHCO3(1M)(3×150mL)和水(3×150mL)萃取。干燥有機相(Na2SO4)并蒸發(fā)得到黃色油。用乙酸乙酯/己烷(1∶2)層析后得到黃色晶體(4.96g，93％)。分析數(shù)據(jù)1H-NMR(CDCl3，400MHz)1.400(s，1H，O(CH3))；3.014(t，1H，H(7′或7″)，J＝12Hz)；3.815(dd，1H，H(7′或7″)，J7-8＝12Hz，J7’-7”＝6.4Hz)；4.466(m，1H，H(8))；4.835(d，2H，H(3′，3″)，J3-2＝5.7Hz)；5.316(dd，1H，H(1′)，J1′-2＝10.5Hz，J1′-1″＝1.2Hz)；5.413(dd，1H，H(1″)，J1″-2＝17.2Hz，J1″-1′＝1.2Hz)；5.581(d，1H，H(9)，J9-8＝8Hz)；6.013(m，1H，H(8))；7.338(d，1H，H(5)，J5-4＝11.1Hz)；7.704(s，1H，H(10))；7.751(d，1H，H(6)，J6-4＝1.8Hz)；7.338(dd，1H，H(2)，J4-5＝11.1Hz，J4-6＝1.8Hz).IR3206cm-1(-NH)；1720cm-1(氨基甲酸酯-C＝O)；1671cm-1(酰胺-C＝O)；1500cm-1(酰胺-CONH)；1209cm-1(酯)。MSm/z＝379.3[M+H+]；m/z＝401.4[M+Na+].Rf＝0.36，在乙酸乙酯/己烷(1∶2)中，在SiO2上.
實施例9(S)-3-氨基-4-(2-叔丁氧基羰基氨基-2-羰基-乙硫基)-苯甲酸 將200mg(0.540mmol)N-叔丁氧基羰基-3-(4-羧基-2-氨基苯硫基)-L-丙氨酸甲基酯加入由5ml TBME和20ml緩沖液(0.1M氯化鈉；3mM磷酸鈉，pH 7.0)組成的系統(tǒng)中。加入100μl Alcalase 2.5L[Novo Nordisk的一種枯草蛋白酶Carlsberg]并通過可控地加入0.1N氫氧化鈉溶液在劇烈攪拌下保持pH在7.0(pH-恒定)。消耗5.847ml滴定劑(理論值的108％；1.5h后)后，將反應混合物用25ml TBME洗滌兩次，用25％HCl酸化到pH 2.5并用3×25ml乙酸乙酯萃取。經(jīng)無水硫酸鈉干燥合并的有機相，蒸發(fā)溶劑并將殘渣在HV中干燥得到187mg(0.479mmol)黃色晶體的N-叔丁氧基羰基-3-(2-氨基-4-羧基苯硫基)-L-丙氨酸(產(chǎn)率93.4％)。分析數(shù)據(jù)HPLC純度96.4％(面積％).1H-NMR(DMSO，400MHz)1.378(s，9H，OC(CH3))；2.982(dd，1H，SCH2，J＝13.2Hz，J＝9.6Hz)；3.150(dd，1H，SCH2，J＝13.2Hz，J＝4.4Hz)；3.950(m，1H，COCHNH)；5.542(m，2H，-NH2)；7.067(dd，1H，CONHCH，J＝8.0Hz，J＝1.6Hz)；7.201(d，1H，arom.SCCH，J＝8.0Hz)；7.298(d，1H，arom.SCCHCH，J＝8.0Hz)；7.323(d，1H，arom.CHCNH2，J＝1.6Hz)；12.73(bs，2H，2-COOH).IR3445和3347cm-1(-NH，-NH2)；2977和2930cm-1寬峰(-COOH)；1720和1692cm-1(COOH-C＝O，氨基甲酸酯-C＝O)；1608cm-1(-COO-)；1509cm-1(酰胺-CO-NH)；1486cm-1(aromate)；1247和1163cm-1(COOH).ISN-MSm/z＝355.1[M-H+].OR[α]D＝+13.00°(EtOH；c＝1.0)。
權利要求
1.一種制備式I化合物的方法 其中R1是氫或烷基；R2是氨基保護基團；每個R3獨立地是鹵素、羧基、烷氧羰基、鏈烯氧基羰基或芐氧基羰基；n是1或2，該方法包括在含有一種有機共溶劑的水性系統(tǒng)中，使式II化合物與一種蛋白酶反應 其中R1、R2、R3和n如上定義，R4是烷基或芐基。
2.一種根據(jù)權利要求1的方法，其特征是式II化合物是 其中R1、R2、R3、R4和n如權利要求1所定義。
3.一種根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征是R1是氫或烷基；R2是氨基保護基團；每個R3獨立地是鹵素、羧基或鏈烯氧基羰基；R4是烷基或芐基；n是1或2。
4.一種根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法，其特征是R1是氫；R2是氨基保護基團；R3是鹵素、羧基或鏈烯氧基羰基；R4是烷基；n是1。
5.一種根據(jù)權利要求1-4中任一項的方法，其特征是在6.0-8.5的pH下進行反應。
6.一種根據(jù)權利要求1-5中任一項的方法，其特征是用芽孢桿菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、曲霉蛋白酶或Tritachium蛋白酶進行反應。
7.一種根據(jù)權利要求1-6中任一項的方法，其特征是所述有機共溶劑是四氫呋喃、二噁烷、叔丁基甲基醚、C1-8-醇、乙酸乙酯、二甲亞砜、二甲基乙酰胺或丙酮。
8.下式的化合物 或
9.一種根據(jù)權利要求1-7中任一項的方法，其特征是式I化合物被進一步處理成式III的苯并硫氮雜 其中R1、R2、R3、R4和n如式I和式II所描述的。
全文摘要
式(I)化合物可用于制備1，5－苯并硫氮雜類，1，5－苯并硫氮雜類可用作酶(如蛋白酶、白介素－1β－轉化酶、彈性蛋白酶或血管緊張肽－轉化酶)抑制劑，或者GPCR拮抗劑(縮膽囊素、血管緊張肽II受體)。本發(fā)明涉及一種制備式(I)化合物(其中R
文檔編號C07C323/63GK1553959SQ02817772
公開日2004年12月8日 申請日期2002年9月19日 優(yōu)先權日2001年9月25日
發(fā)明者K·布萊謝爾, S·博思威克, H·伊丁, M·羅杰斯-埃文斯, S·施密德, H·M·佟, B·沃茲, K 布萊謝爾, 佟, 紀, 艿, 芩 埃文斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司, 弗 哈夫曼-拉羅切有限公司