專利名稱：一種硫酸多糖類物質(zhì)911寡糖片段的制造方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硫酸多糖類物質(zhì)911寡糖片段的制造方法及其在抗艾滋病毒方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硫酸多糖類物質(zhì)911(Sulfated Polymannuroguluronate，以下簡稱911)是從褐藻中提取分離并經(jīng)化學(xué)修飾得到的一種聚陰離子直鏈硫酸多糖，平均分子量為10000Da，其在體內(nèi)外高效低毒的抗免疫缺陷病毒活性使其成為抗艾滋病毒的候選藥物，并且發(fā)現(xiàn)，911抗艾滋病毒活性與其同gp120分子、CD4分子、TAT蛋白、CypA分子結(jié)合有關(guān)。為了從911的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上研究其與上述蛋白分子作用的機制，以911為母體化合物，通過部分降解制備系列寡糖，尤其是獲得具有活性的最小寡糖片段是十分必要的。但911是半合成的聚糖醛酸類硫酸多糖，到目前還沒有可利用的降解酶，常用的酸水解又由于條件過于劇烈，極易引起重要活性基團硫酸根的丟失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供911寡糖片段的制備方法及應(yīng)用，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點。
一種硫酸多糖類物質(zhì)911的寡糖片段的制造方法，其特征是采用Fenton試劑進行降解反應(yīng)，經(jīng)超聲處理，離心去沉淀，凝膠柱分離，獲得911寡糖片段組分。
海洋硫酸多糖類物質(zhì)911寡糖片段，用于艾滋病毒感染抑制劑。
本發(fā)明的優(yōu)點是提供了一種硫酸多糖類物質(zhì)911寡糖片段的制造方法，確定了它的最小活性片段，它們的功能和活性能得到廣泛的應(yīng)用。


及
具體實施例方式附圖1為911降解組分對艾滋病毒gp120分子與911結(jié)合的抑制作用圖。
附圖2為911降解組分5的MALDI-TOF-MS譜圖。
附圖3為911降解組分6的MALDI-TOF-MS譜圖。
具體實施例方式稱取911 100mg加入反應(yīng)瓶中，加5mL 2mM FeSO4水溶液使之全溶，再加入5mL1％H2O2水溶液，搖勻，迅速用1M NaOH水溶液調(diào)pH到7.0，于37℃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)進行到1.5h時，加Na2S2O3終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物經(jīng)超聲處理10min，離心去沉淀，減壓濃縮至2mL，用Sephadex G-10柱(1.6×90cm)分離，用pH6.5的0.5M碳酸氫鈉水溶液洗脫，流速為4mL/h，分步收集，2mL/管。用咔唑比色法檢測，收集各組分，將外水組分濃縮，繼續(xù)用Sephadex G-15柱分離，其余組分濃縮凍干。經(jīng)Sephadex G-15柱分離的外水組分再用Sephadex G-25柱分離，收集，共獲得17個組分，各組分凍干保存。
確定海洋硫酸多糖類物質(zhì)911抗艾滋病的最小活性片段911最小活性片段是通過SPR技術(shù)和細胞水平的活性檢測確定的。方法為SPR技術(shù)的檢測是將911通過己二胺與生物素連接；同時將鏈霉親和素偶聯(lián)于生物傳感芯片；利用生物素和鏈霉親和素的高親和性將生物素化的911連到生物傳感芯片。然后，采用競爭性抑制的方法，利用生物傳感芯片技術(shù)(SPR)檢測911各降解組分與抗病毒活性有關(guān)的靶點gp120分子、CD4分子、TAT蛋白、CypA分子的結(jié)合情況。即將1ug/ml的911各降解組分分別與一定濃度的gp120(3ug/ml)、CD4(17nM)、TAT蛋白(41nM)、CypA(5ug/ml)共同孵育3分鐘，將孵育混合物依次流過芯片表面，流速5ul/min，進樣量10ul，記錄其反應(yīng)值，觀察911各降解組分對gp120、CD4、TAT蛋白、CypA與芯片911結(jié)合的抑制作用。結(jié)果表明911降解組分1-4對gp120分子與911結(jié)合的抑制率較低，組分5的抑制率則極顯著增加，組分6進一步增加，隨后各組分抑制作用緩慢增加，至組分15后不再有明顯增加，基本達到原911的抑制水平(附圖1)。911各降解組分對CD4分子、TAT蛋白、CypA分子與911的結(jié)合具有相似的抑制情況，說明組分5為911與gp120、CD4、TAT蛋白、CypA等分子結(jié)合所需的最小寡糖片斷。
對最小活性單位進行MALDI-TOF-MS分析為了進一步對911最小活性寡糖片段進行分析鑒定，利用MALDI-TOF-MS測定了其分子量，并據(jù)此確定糖醛酸與硫酸根的數(shù)目。質(zhì)譜圖見附圖2，該圖中主要分子離子峰的m/z為1543.7，相當(dāng)于[M+H]+，因而，911最小活性寡糖片段的分子量為1542.7，是一個由六個六糖醛酸與六個硫酸根組成的末端還原的六糖，其分子式為(HexA)6(OSO3H)6。此外，還測定了911高活性六糖單位的分子量，見附圖3。同樣確定其分子式為(HexA)7(OSO3H)8。
應(yīng)用Fenton試劑法對911進行降解所獲得的最小活性片段可以更好地對海洋硫酸多糖911抗艾滋病的分子機制進行研究。
為了進一步確定911各降解組分的活性，利用HIV感染細胞測定了911各降解組分的抗病毒活性。方法為取體外傳代對數(shù)期生長的MT4細胞，顯微鏡下計數(shù)，取500萬個細胞與10000TCID50HIV-1孵育90min，離心洗滌兩次，調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml，96孔培養(yǎng)板中每孔100μl與5ug/ml的911各降解組分100μl共同培養(yǎng)，每濃度設(shè)三個復(fù)孔，同時設(shè)陰性對照孔，培養(yǎng)六天，取上清按照P24核心抗原Mieroelisa檢測試劑盒方法測定P24核心抗原量，計算藥物對病毒生長的抑制率。結(jié)果表明，其抑制率與其抑制gp120同911結(jié)合的情況相一致。即911降解組分1-4幾乎沒有任何抑制作用，組分5的抑制率則極顯著增加，組分6進一步增加，隨后各組分抑制作用緩慢增加，至組分15后不再有明顯增加，基本達到原911的抑制水平。說明組分5為911抑制病毒感染所需的最小寡糖單位。
權(quán)利要求
1.一種硫酸多糖類物質(zhì)911的寡糖片段的制造方法，其特征是采用Fenton試劑進行降解反應(yīng)，經(jīng)超聲處理，離心去沉淀，凝膠柱分離，獲得911寡糖片段組分。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征是能夠抑制艾滋病毒感染細胞所需的最小糖單位的分子式為(HexA)6(OSO3H)6和(HexA)7(OSO3H)8。
3.將海洋硫酸多糖類物質(zhì)911寡糖片段用于艾滋病毒感染抑制劑。
全文摘要
一種硫酸多糖類物質(zhì)911寡糖片段的制造方法，其特征是采用Fenton試劑進行降解反應(yīng)，經(jīng)超聲處理，離心去沉淀，凝膠柱分離，獲得各寡糖片段組分。并通過SPR技術(shù)和病毒感染細胞模型確定了其具有艾滋病毒抑制劑的作用；確定了抗艾滋病毒所需的兩個最小活性寡糖片段，其分子式為(HexA)
文檔編號C07H3/00GK1513859SQ03138970
公開日2004年7月21日 申請日期2003年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月4日
發(fā)明者耿美玉, 管華詩, 辛現(xiàn)良, 李靜, 李福川 申請人:中國海洋大學(xué)