專利名稱：一種半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于醫(yī)藥范疇，更確切說是一種半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
經(jīng)初步檢索，未查到以冬蟲夏草或發(fā)酵法制得的冬蟲夏草菌絲體(以下統(tǒng)稱“蟲草原料”)為原料，采用乙醇分級(jí)沉淀、離子交換柱層析和分子篩層析相結(jié)合的復(fù)合分離純化技術(shù)，分離得到層析純和電泳純半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種以“蟲草原料”為原料，采用乙醇分級(jí)沉淀、離子交換柱層析和分子篩層析相結(jié)合的復(fù)合純化技術(shù)，分離得到層析純和電泳純半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品。本發(fā)明的產(chǎn)品是一種治療腫瘤的注射用藥物?，F(xiàn)參照說明書附圖將本發(fā)明內(nèi)容敘述如下一、原料準(zhǔn)備(1)、蟲草原料要求無雜質(zhì)，水份含量≤8％，蟲草多糖含量≥6.0％。
(2)、水蒸餾水，無離子水。
(3)、乙醇無水乙醇，95％乙醇。
(4)、丙酮分析純或分析純以上。
二、蟲草多糖I的制取將合格的“蟲草原料”裝入提取裝置中，然后再按蟲草原料∶水＝1∶10-20之比例(重量比)往提取設(shè)備中加入蒸餾水。料加完，安裝好設(shè)備，將原料置于80°-100℃和有攪拌的條件下進(jìn)行蒸餾提取1-2小時(shí)，停止提取。料溫降至40℃以下時(shí)，將提取物料進(jìn)行過濾，濾液保存。殘?jiān)砂瓷鲜龇椒ㄔ偬崛?次后再棄掉殘?jiān)纱翁崛∫航y(tǒng)一裝入一個(gè)蒸餾設(shè)備中，在減壓下，溫度在60 o±5℃下進(jìn)行濃縮。當(dāng)提取液內(nèi)的固形物≥10％時(shí)，在濃縮液中加入相當(dāng)濃縮液3倍體積的95％乙醇，攪拌10分鐘后靜置沉淀4小時(shí)以上，再進(jìn)行離心分離后收集沉淀物。在沉淀物中加入丙酮脫水，然后再進(jìn)行離心分離，分離出的沉淀物在45℃-60℃的溫度下進(jìn)行干燥，干燥后的產(chǎn)品即是蟲草多糖I。蟲草多糖I的質(zhì)量要求糖含量≥32.5％，蛋白含量≥45.2％。
三、蟲草多糖II的制取將合格的“蟲草多糖I”放入容器中，加入無離子水并攪拌，至蟲草多糖I的濃度達(dá)4-6％時(shí)，在常溫(15℃-30℃)下向已配制好的含5％蟲草多糖I的溶液中加入無水乙醇，同時(shí)攪拌，至乙醇在溶液中含量≥40％時(shí)止，稍靜置后進(jìn)行分離，去掉沉淀。在分離后的溶液中再加入無水乙醇，至乙醇在溶液中含量達(dá)63-67％時(shí)止，同時(shí)攪拌，當(dāng)沉淀析出完全后進(jìn)行分離，收集沉淀。在沉淀物中加入丙酮進(jìn)行脫水干燥，得到的產(chǎn)品是蟲草多糖II。蟲草多糖II的質(zhì)量要求糖含量≥49.3％，蛋白含量≥23.9％。
四、半乳甘露聚糖肽的制取將符合質(zhì)量要求的“蟲草多糖II”置于容器中，在常溫和攪拌下加入無離子水，將其配成0.8-1.2％濃度的水溶液。對(duì)上述0.8-1.2％蟲草多糖II溶液進(jìn)行DEAE-SaphedexG-50柱層析，然后進(jìn)行洗脫，即(1)、第一次洗脫用無離子水洗脫，至無紫外吸收峰出現(xiàn)止。(2)、第二次洗脫用0.1MNaCL溶液洗脫至沒有紫外吸收峰出現(xiàn)止。洗脫完畢將洗脫物收集一起并放入濃縮裝置中進(jìn)行濃縮，至固形物含量≥10％時(shí)，再進(jìn)行saphedexG-50柱層析，以280nm波長(zhǎng)檢測(cè)流出物。這時(shí)得到兩個(gè)洗脫峰，收集前一個(gè)洗脫峰進(jìn)行冷凍干燥，得到半乳甘露聚糖肽干粉。產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(1)、糖含量45-48％，(2)、蛋白含量48-46％，(3)、水分7-6％，(4)、甘露糖∶半乳糖(摩爾比)＝1∶0.73。
五、半乳甘露聚糖肽的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)該產(chǎn)品在動(dòng)物試驗(yàn)中，對(duì)試驗(yàn)小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率為51％。由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的產(chǎn)品是一種可用于治療腫瘤病的注射用藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)、本發(fā)明是以“蟲草原料”為原料制取半乳甘露聚糖肽，這為生產(chǎn)半乳甘露聚糖肽增加了另一種原料，也為“蟲草原料”的應(yīng)用開辟了另一條途徑。
(2)、本發(fā)明以“蟲草原料”為原料，經(jīng)過采用乙醇分級(jí)沉淀、離子交換柱層析和分子篩層析相結(jié)合的復(fù)合分離純化方法，分離得到一種層析純和電泳純的半乳甘露聚糖肽，此方法為半乳甘露聚糖肽的制取找到了另一種制取方法。
(3)、半乳甘露聚糖肽制品在對(duì)小鼠進(jìn)行試驗(yàn)中證明(A)、對(duì)試驗(yàn)小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用；(B)、對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率達(dá)51％。故制成半乳甘露聚糖肽注射劑后也為醫(yī)藥領(lǐng)域增加了一個(gè)新品種。


說明書附圖是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式例1(1)、把符合質(zhì)量要求，發(fā)酵法制得的冬蟲夏草菌絲體和其他原料水、乙醇、丙酮、全部備齊待用。
(2)、制取蟲草多糖I(A)、將冬蟲夏草菌絲體1公斤置于提取裝置內(nèi)，再加入10公斤蒸餾水，然后將提取裝置安裝無誤，再在85℃±2℃和攪拌下蒸餾提取1小時(shí)停機(jī)，常溫下過濾，濾液保留。
(B)、在濾渣中再加入5公斤蒸餾水，在85°±2℃和攪拌下提取1小時(shí)，停止提取，過濾，濾后殘?jiān)鼦壢?。本次濾液與上次濾液合并，在60℃±5℃溫度下進(jìn)行減壓濃縮至固形物含量達(dá)6.0％時(shí)，停止?jié)饪s，在濃縮后的濾液中，按濾液∶乙醇＝1∶3(體積比)，加入95％乙醇，攪10分鐘，靜置沉淀5小時(shí)，裝入離心機(jī)以5000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心沉淀10分鐘，停機(jī)，收集沉淀物。
(C)、在沉淀物中加入分析純丙酮進(jìn)行脫水，再離心分離，收集沉淀物在52℃±2℃下進(jìn)行干燥，當(dāng)沉淀物干燥結(jié)束時(shí)達(dá)到糖33.5％，蛋白45.3％。干燥后的這物質(zhì)即為合格的蟲草多糖I(共85克)。
(3)、制取蟲草多糖II(A)、在已制取好的85克蟲草多糖I中加入無離子水170ml并攪拌30分鐘，使蟲草多糖I溶于水中，然后向蟲草多糖I溶液中加1133ml無水乙醇并攪拌10分鐘至均勻，停攪，靜置沉淀5小時(shí)，放入離心機(jī)內(nèi)以5000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心分離10分鐘，停機(jī)，收取清液，沉淀?xiàng)墶?br> (B)、在分離得到的清液中加入2024ml無水乙醇，攪均，再靜置沉淀5小時(shí)后，放入離心機(jī)內(nèi)以5000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心分離，收集沉淀物，再在沉淀物中加入丙酮脫水，再干燥后，當(dāng)提取物質(zhì)量達(dá)到糖含量49.3％，蛋白含量23.9％時(shí)，得到55g物質(zhì)即為蟲草多糖II。
(4)、半乳甘露聚糖肽的制取(A)、將制得的55克蟲草多糖II加入到5445克無離子水中，常溫下攪拌30分鐘，制成1％水溶液。
(B)、利用由250克DEAE-SaphedexG-50裝成的層析柱進(jìn)行吸附層析，用無離子水洗脫，將非吸附物棄去。再用0.1MNaCL溶液將吸附物洗脫，用280nm紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物，收集洗脫峰，所得液體在60°±2℃下進(jìn)行減壓濃縮至500ml，然后將濃縮液分5次進(jìn)行由200克SaphedexG-50裝成的層析柱進(jìn)行層析，以280nm紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物，得到兩個(gè)洗脫峰，收集第一個(gè)洗脫峰的液體。將5次洗脫的第一個(gè)洗脫峰液體合并后，在60°±2℃減壓濃縮至500ml進(jìn)行冷凍干燥，得到半乳甘露聚糖肽凍干粉1.5克。該產(chǎn)品的質(zhì)量是(甲)、糖含量48％，(乙)、蛋白含量46％，(丙)、甘露糖∶半乳糖(摩爾比)＝1∶0.73，(丁)、水分6％。
(5)、半乳甘露聚糖肽的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)本產(chǎn)品在動(dòng)物試驗(yàn)中表明對(duì)試驗(yàn)小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用；對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率為51％。
例2(1)、把符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的冬蟲夏草、水、乙醇和丙酮、全部原料備齊待用。
(2)、制取蟲草多糖I稱取1公斤冬蟲夏草放入提取設(shè)備中，再加入20公斤無離子水，在85℃±2℃和攪拌條件下蒸餾提取2小時(shí)，停機(jī)過濾，棄去濾渣。收集濾液于57°±3℃進(jìn)行減壓濃縮至固形物含量達(dá)10％，再加入相當(dāng)濃縮液3倍體積的95％乙醇，攪拌5分鐘，攪均后靜置沉淀5小時(shí)，棄去上清液，將沉淀物裝入離心機(jī)以5000轉(zhuǎn)/分分離，收集的沉淀物為未干燥的蟲草多糖I。
(3)、制取蟲草多糖II在未干燥的蟲草多糖I中加入1700毫升無離子水，常溫下攪拌溶解30分鐘，之后再加入無水乙醇1133毫升，攪拌均勻，靜置沉淀5小時(shí)，裝入離心機(jī)離心沉淀，清液保存待用。在離心得的清液中再加入無水乙醇1133毫升，攪均后靜置沉淀5小時(shí)，離心去沉淀，在濾液中再加入2024毫升無水乙醇，攪均，靜置沉淀5小時(shí)，傾掉上清液，再以5000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心分離，收集沉淀物為未干燥的蟲草鞋多糖II。把分離得的未干燥的蟲草多糖II加入到5000毫升無離子水中，攪拌30分鐘，制成溶液備用。
(4)、半乳甘露聚糖肽的制取利用由10公斤，D301大孔弱堿性苯乙烯陰離子交換樹脂裝成的離子交換柱進(jìn)行吸附配制的蟲草多糖II溶夜中的一些成分。用無離子水洗脫掉未吸咐的成分棄去。然后收集以0.1MNaCL溶液洗脫交換柱上的吸附物，用280nm紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)收集的洗脫物，洗脫物在NaCL溶液中已溶解，再在60°±2℃下進(jìn)行減壓液縮至500毫升停止。將濃縮液分成5份，分5次進(jìn)行由200克SaphedexG-50裝成的層析柱進(jìn)行層析。以280nm紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)洗脫物，得到兩個(gè)洗脫峰，收集第一個(gè)洗脫峰的液體，合并在一起后，在60°±2℃下進(jìn)行減壓濃縮至500毫升，停止?jié)饪s。將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到1.65克半乳甘露聚糖肽凍干粉。
該產(chǎn)品的質(zhì)量為糖45％，蛋白48％，甘露糖∶半乳糖(摩爾比)＝1∶0.73，水分7％。
(5)、半乳甘露聚糖肽的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)本次制得的半乳甘露聚糖肽用于試驗(yàn)小鼠有免疫調(diào)節(jié)作用；對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率為51％。
權(quán)利要求
1.一種半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品，包括；原料準(zhǔn)備、有用成分提取、濃縮、離心分離、復(fù)合分離純化及冷凍干燥、制得本發(fā)明產(chǎn)品，其特征在于本發(fā)明的制取方法是<一>、原料準(zhǔn)備(1)、蟲草原料無雜質(zhì)、水份≤8％、蟲草多糖≥6.0％；(2)、水蒸餾水、無離子水；(3)、乙醇無水乙醇、95％乙醇；(4)、丙酮分析純或純度高于分析純；<二>蟲草多糖I的制取將蟲草原料裝入提取裝置中，再按蟲草原料∶水＝1∶10-20之比例(重量比)，往提取設(shè)備中加入蒸餾水，裝完料，安好設(shè)備，開始提??；在80℃-100℃和攪拌條件下，提取1-2小時(shí)，停止；待料溫降至40℃以下，開始過濾；濾液保存，殘?jiān)稍侔吹谝淮翁崛l件再提取1次后，棄殘?jiān)?，將提取液全部裝入蒸餾設(shè)備中，在60°±5℃條件下進(jìn)行濃縮，當(dāng)提取液內(nèi)固形物≥10％時(shí)，停止?jié)饪s，在濃縮液中加入相當(dāng)濃縮液3倍體積的95％乙醇，攪拌均勻，靜置沉淀≥4小時(shí)，進(jìn)行分離，收集沉淀物；在沉淀物中加入丙酮脫水，再分離，收集分離出的沉淀物在45℃-60℃條件下進(jìn)行干燥，得到糖含量≥32.5％，蛋白蛋≥45.2％的蟲草多糖I；<三>蟲草多糖II的制取將合格的蟲草多糖I放入容器中，加入無離子水并攪拌，至蟲草多糖I的濃度達(dá)4-6％時(shí)，在15℃-30℃條件下向已配制好的5％蟲草多糖I的溶液中加入無水乙醇，同時(shí)攪拌至乙醇在溶液中含量≥40％時(shí)止，稍靜置后進(jìn)行分離，去掉沉淀，在濾液中加入無水乙醇，同時(shí)攪拌，至乙醇在濾液中含量在63-67％時(shí)停，靜置到沉淀析出完全時(shí)，進(jìn)行分離，收集沉淀；在沉淀物中加入丙酮進(jìn)行脫水干燥，得到蟲草多糖II產(chǎn)品，產(chǎn)品的質(zhì)量要求糖含量≥49.3％，蛋白含量≥23.9％；<四>、半乳甘露聚糖肽的制取將制取合格的蟲草多糖II置于容器中，在常溫和攪拌下加入無離子水，將其配成0.8-1.2％濃度的水溶液，攪均；對(duì)上述0.8-1.2％濃度水溶液進(jìn)行DEAE-Saphedex dex G-50柱層析，然后進(jìn)行洗脫；第一次洗脫用無離子水洗脫，洗至沒有紫外吸收峰出現(xiàn)止；第二次洗脫用0.1MNaCL溶液洗脫，洗至沒有紫外吸收峰出現(xiàn)止；洗脫畢，將洗脫物收集一起并裝入濃縮裝置中進(jìn)行濃縮，至固形物含量≥10％時(shí)，再進(jìn)行Saphedex G-50柱層析，以254nm波長(zhǎng)檢測(cè)流出物，這時(shí)得到兩個(gè)洗脫峰，收集前一個(gè)洗脫峰進(jìn)行冷凍干燥，得到半乳甘露聚糖肽凍干粉，該種凍干粉是本發(fā)明最終產(chǎn)品。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品，其特征在于本發(fā)明的制取方法中的一、原料準(zhǔn)備中的(1)蟲草原料是指冬蟲夏草和發(fā)酵法制得的冬蟲夏草菌絲體。
3.一種半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品，其特征在于本發(fā)明的最終產(chǎn)品一半乳甘露聚糖肽的主要組成是<1>、糖 含 量(％)45-48；<2>、蛋白含量(％)48-46；<3>、水 (％)7-6；<4>、甘露糖∶半乳糖(摩爾比)＝1∶0.73。
全文摘要
一種半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品屬于醫(yī)藥范疇。本發(fā)明是以“蟲草原料”為原料，采用乙醇分級(jí)沉淀，離子交換柱層析和分子篩層析相結(jié)合的復(fù)合分離純化技術(shù)，分離出層析純和電泳純半乳甘露聚糖肽的制取方法及產(chǎn)品。本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)試驗(yàn)小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)小鼠S
文檔編號(hào)C07K1/00GK1482144SQ0313891
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者程顯好, 高先領(lǐng), 隋曉春, 侯永勤, 賀連智, 張友軍, 劉剛 申請(qǐng)人:山東智靈生物工程有限公司