專利名稱：哺乳動(dòng)物epo模擬ch1缺失模擬體、組合物、方法和用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及對(duì)生物學(xué)上的活性蛋白、片段或配體具有特異性的哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體，EPO模擬CH1缺失模擬體編碼核酸和互補(bǔ)核酸、宿主細(xì)胞，及其制備和使用方法，包括治療配方、施用和裝置。
相關(guān)技術(shù)重組蛋白是一類新興的治療劑。這種重組體療法在蛋白質(zhì)配方和化學(xué)修飾方面已取得進(jìn)展。這種修飾可潛在地增強(qiáng)治療性蛋白質(zhì)的治療效用，例如通過延長(zhǎng)半衰期(例如，通過阻礙其暴露于蛋白水解酶)，增強(qiáng)生物活性或減少有害副作用。一種這樣的修飾是利用被融合至受體蛋白，如enteracept的免疫球蛋白片段。人們也曾利用Fc區(qū)構(gòu)建治療性蛋白質(zhì)，試圖提供較長(zhǎng)的半衰期或整合諸如Fc受體結(jié)合、A蛋白結(jié)合和補(bǔ)體結(jié)合的功能。
哺乳動(dòng)物造血系統(tǒng)的一個(gè)特殊且重要的作用是生成紅細(xì)胞，該紅細(xì)胞可將氧轉(zhuǎn)運(yùn)至動(dòng)物體內(nèi)的多個(gè)組織。生成紅細(xì)胞的過程(“紅細(xì)胞生成”)不間斷地發(fā)生在動(dòng)物的整個(gè)一生中，以彌補(bǔ)被破壞的紅細(xì)胞。典型的紅細(xì)胞具有相對(duì)短的壽命，通常為100-120天。紅細(xì)胞生成是一個(gè)被精確控制的生理學(xué)機(jī)制，因而可以生成足量的紅細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)恰當(dāng)?shù)慕M織氧合，但不會(huì)多至阻礙循環(huán)。
目前，已知紅細(xì)胞生成主要受一種酸性糖蛋白，即多肽促紅細(xì)胞生成素(EPO)的控制。促紅細(xì)胞生成素的生成是位于哺乳動(dòng)物染色體中的單拷貝基因表達(dá)的結(jié)果。重組人類EPO(“rHuEPO”)的氨基酸序列基本上與獲得自人尿來源的EPO的氨基酸序列一致。但rHuEPO的糖基化與尿EPO和人類血清EPO的糖基化不同。
在健康哺乳動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)組織被現(xiàn)有數(shù)量的循環(huán)紅細(xì)胞充分氧合時(shí)，EPO在血漿中的濃度非常低。EPO的存在刺激了新的紅細(xì)胞的生成，以替代那些在老化過程中損失的紅細(xì)胞。另外，EPO的生成在低氧條件下被促進(jìn)，其中，盡管血液足以充滿組織，但對(duì)肌體組織的供氧仍然低于正常生理水平。低氧可能是出血、輻射誘發(fā)的紅血球破壞、各種貧血、高海拔或長(zhǎng)期無意識(shí)造成的。與之相反，循環(huán)中的紅細(xì)胞數(shù)量超過正常組織氧合所需數(shù)量時(shí)，EPO的生成便減少了。
不過，某些疾病狀態(tài)涉及異常紅細(xì)胞生成。許多國(guó)家在治療中利用了重組人類EPO(rHuEPO)。在美國(guó)，美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)了rHuEPO在治療與末期腎病相關(guān)的貧血方面的應(yīng)用。為治療該病癥而接受血液透析的患者典型地患有嚴(yán)重貧血，這是透析治療所導(dǎo)致的紅細(xì)胞破裂和成熟前死亡造成的。EPO也被應(yīng)用在其它類型貧血的治療中。例如，可采用EPO治療化學(xué)療法誘發(fā)的貧血、與脊髓發(fā)育不良相關(guān)的貧血、與多種先天性失調(diào)相關(guān)的貧血、AIDS相關(guān)貧血和與早熟相關(guān)的貧血。此外，EPO在其它領(lǐng)域也可發(fā)揮作用，如促進(jìn)骨髓移植患者、準(zhǔn)備自體輸血的患者和鐵過載失調(diào)患者體內(nèi)更快地恢復(fù)正常血細(xì)胞比容。
促紅細(xì)胞生成素(EPO)是由165個(gè)氨基酸和4條糖鏈組成的糖蛋白激素，且通過與紅細(xì)胞前體細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，對(duì)紅細(xì)胞生成發(fā)揮了主要調(diào)節(jié)因子的作用。該結(jié)合表明它們將增殖并分化為成熟紅細(xì)胞。促紅細(xì)胞生成素受體是對(duì)促紅細(xì)胞生成素具有高親和性，且含有484個(gè)氨基酸的糖蛋白。對(duì)該促紅細(xì)胞生成素受體而言，配體誘發(fā)的均二聚化可能是控制活化的關(guān)鍵事件之一。
促紅細(xì)胞生成素具有相對(duì)短的半衰期。靜脈內(nèi)施用的促紅細(xì)胞生成素的清除率符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其在CRF患者體內(nèi)的循環(huán)半衰期約為3-4小時(shí)。在治療劑量范圍內(nèi)，血漿促紅細(xì)胞生成素的可檢測(cè)水平被維持至少24小時(shí)。皮下施用促紅細(xì)胞生成素后，5-24小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值血清水平，并在之后緩慢降低。促紅細(xì)胞生成素施用后的Cmax和t1/2分別為1.80±0.7U/mL和19.0±5.9小時(shí)。
促紅細(xì)胞生成素的起始劑量范圍是50-150U/kg，每周三次。促紅細(xì)胞生成素的劑量必須針對(duì)不同個(gè)體施用，以使血細(xì)胞比容維持在上述建議目標(biāo)范圍內(nèi)。對(duì)外科患者而言，促紅細(xì)胞生成素的推薦劑量為在手術(shù)前皮下注射10天、手術(shù)當(dāng)天和手術(shù)后皮下注射4天的300U/kg/天，或可選的每周一次皮下注射600U/kg(手術(shù)前21、14和7天)，外加手術(shù)當(dāng)天第四次施用該劑量。
若干研究小組通過從任意噬菌體展示肽文庫中篩選出對(duì)促紅細(xì)胞生成素受體具有親和性的肽，從而鑒定出促紅細(xì)胞生成素的小肽模擬物。其序列與促紅細(xì)胞生成素?zé)o同源性。在功能性試驗(yàn)中，有若干種上述肽顯示了活性，但僅為重組促紅細(xì)胞生成素的活性的1/100,000。盡管人們通過制備肽模擬物的共價(jià)二聚體或多聚體，為提高上述肽的效價(jià)進(jìn)行了若干嘗試，但上述化合物的活性按摩爾計(jì)仍然比促紅細(xì)胞生成素低1,000-10,000倍。
促紅細(xì)胞生成素來源的肽序列也已被權(quán)利要求為是增效的。也有報(bào)導(dǎo)表明包含多個(gè)或全部天然促紅細(xì)胞生成素序列的二聚化序列的活性被提高了。這些化合物具有很低或者無口服生物利用率，且其活性也使其在目前的商業(yè)上不具有可行性。
因此，需要提供EPO治療性蛋白質(zhì)的改良和/或修飾版本，以克服上述一個(gè)或多個(gè)難題，以及本領(lǐng)域已知的其它難題。
發(fā)明概述如此處所描述和/或?qū)嵺`的方法，并結(jié)合本領(lǐng)域所已知的方法，本發(fā)明提供了分離的人類EPO模擬CH1缺失模擬體，包括修飾的免疫球蛋白、裂解產(chǎn)物和其它特定部分及其變體，也提供了EPO模擬CH1缺失模擬體組合物、編碼或互補(bǔ)核酸、載體、宿主細(xì)胞、組合物、配方、裝置、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物，及其制備和應(yīng)用方法。
本發(fā)明也提供了如此處所描述和/或本領(lǐng)域已知的至少一種分離EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。該EPO模擬CH1缺失模擬體可任選地包含至少一個(gè)CH3區(qū)，該CH3區(qū)與至少一個(gè)CH2區(qū)直接相連，該CH2區(qū)與至少一個(gè)鉸鏈區(qū)或其片段直接相連，該鉸鏈區(qū)或其片段與至少一個(gè)部分V區(qū)直接相連，該部分V區(qū)與任意接頭序列直接相連，該接頭序列與至少一個(gè)治療性肽直接相連，該治療性肽則任選地進(jìn)一步與至少一個(gè)可變抗體序列的至少一個(gè)部分直接相連。在一對(duì)具有任選N末端抗體序列的CH3-CH2-鉸鏈-部分J序列-接頭-治療性肽的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，是任選地通過締合或共價(jià)鍵，例如，但不僅限于Cys-Cys二硫鍵連接成對(duì)。一種實(shí)施方案中，EPO模擬CH1缺失模擬體包括分子式(I)(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為至少一個(gè)具有生物活性的EPO模擬多肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選取向和結(jié)合特性，從而提供了結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHtinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH 3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可為1-10中的整數(shù)，模擬不同類型的免疫球蛋白分子，例如，但不僅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE等，或其組合。
因此，本發(fā)明的EPO模擬CH1缺失模擬體在保持固有特性和功能的情況下，模擬了抗體或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)或功能的至少一個(gè)部分，同時(shí)還提供了一種治療性肽及其體外、體內(nèi)或原位所固有或獲得的特性或活性。采用此處描述的方法，并結(jié)合本領(lǐng)域已知的方法，可改變本發(fā)明抗體的多個(gè)部分和至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體的治療性肽部分。
本發(fā)明一方面提供了包含特定多核苷酸的分離核酸分子，與該特定多核苷酸互補(bǔ)的分離核酸分子，與該特定多核苷酸具有顯著同一性的分離核酸分子或與其雜交的分離核酸分子，其中該特定多核苷酸編碼特定模擬體或其特定部分或變體，并包括其至少一個(gè)特定序列、區(qū)域、部分或變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含至少一種上述分離EPO模擬CH1缺失模擬體核酸分子的重組載體、含上述核酸和/或重組載體的宿主細(xì)胞，以及上述EPO模擬CH1缺失模擬體核酸、載體和/或宿主細(xì)胞的制備和/或應(yīng)用方法。
本發(fā)明的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體模擬了該模擬體Pep部分與至少一個(gè)配體的結(jié)合，或者具有至少一種蛋白質(zhì)、亞單位、片段、部分或其任意組合的至少一種生物學(xué)活性。
本發(fā)明也提供了此處所描述和/或本領(lǐng)域已知的至少一種分離EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，其中EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體具有至少一種活性，例如，但不僅限于與分子式為I的Pep部分對(duì)應(yīng)的至少一種具有生物活性的肽或多肽的已知生物活性。因此，根據(jù)已知方法可篩選出具有相應(yīng)活性的EPO模擬CH1缺失模擬體，該相應(yīng)活性諸如針對(duì)一種蛋白質(zhì)或其片段的至少一種中和活性。
本發(fā)明也提供了至少一種組合物，該組合物包含了(a)編碼此處所描述的核酸和/或EPO模擬CH1缺失模擬體的至少一種分離EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體；和(b)一種合適的載體或稀釋劑。根據(jù)已知方法，該載體或稀釋劑可任選地為制藥學(xué)可接受載體或稀釋劑。該組合物可任選地進(jìn)一步包含至少一種其它的化合物、蛋白質(zhì)或組合物。
本發(fā)明也提供了至少一種用于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的方法，包括在特定條件下培養(yǎng)此處所描述和/或本領(lǐng)域已知的宿主細(xì)胞，在該條件下，至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體以可檢測(cè)和/或可回收的量被表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了特定方法或組合物中的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體，當(dāng)以治療有效量施用該EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體時(shí)，可根據(jù)多種不同情況，例如，但不僅限于在本領(lǐng)域已知的相關(guān)疾病或治療條件之前、之后或期間的需要用于調(diào)節(jié)、治療或緩解下述至少一種癥狀，包括骨和關(guān)節(jié)失調(diào)、心血管失調(diào)、齒或口失調(diào)、皮膚失調(diào)、耳、鼻或咽喉失調(diào)、內(nèi)分泌或代謝失調(diào)、腸胃失調(diào)、婦科失調(diào)、肝或膽失調(diào)、產(chǎn)科失調(diào)、血液失調(diào)、免疫或變應(yīng)性失調(diào)、傳染病、肌骨骼失調(diào)、腫瘤失調(diào)、神經(jīng)失調(diào)、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、眼科失調(diào)、兒科失調(diào)、中毒失調(diào)、精神病學(xué)失調(diào)、腎失調(diào)、肺失調(diào)或其它任何已知的失調(diào)(見例如被完整引入作為參考的TheMerck Manual，17thed.，Merck Research Laboratories，MerckandCo.，Whitehouse Station，NJ(1999))。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了特定方法或組合物中的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體，當(dāng)以治療有效量施用該EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體時(shí)，可用于調(diào)節(jié)、治療或緩解細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者中的至少一種免疫、心血管、傳染性、惡性和/或神經(jīng)疾病癥狀，和/或根據(jù)多種不同情況，例如，但不僅限于在本領(lǐng)域已知和/或此處所描述的相關(guān)疾病或治療條件之前、之后或期間的需要而施用。
本發(fā)明也提供了至少一種用于送遞治療或預(yù)防有效量的至少一種本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的組合物、裝置和/或方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了針對(duì)本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體的至少一種抗獨(dú)特型抗體。該抗獨(dú)特型抗體包括含有特定分子的任意蛋白質(zhì)或肽，該特定分子包含免疫球蛋白分子的至少一個(gè)部分，例如，但不僅限于重或輕鏈的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架區(qū)，或其任意部分，且該免疫球蛋白分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體的EPO受體結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的獨(dú)特型抗體可包括或來源于任何哺乳動(dòng)物，例如，但不僅限于人類、小鼠、兔、大鼠、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等的獨(dú)特型抗體。
本發(fā)明也提供了至少一種包含特定多核苷酸的分離核酸分子、與該特定多核苷酸互補(bǔ)的分離核酸分子，或與該特定多核苷酸雜交的分離核酸分子，其中該特定多核苷酸編碼至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體抗獨(dú)特型抗體，并包括其至少一個(gè)特定序列、區(qū)域、部分或變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含上述EPO模擬CH1缺失模擬體抗獨(dú)特型抗體編碼核酸分子的重組載體、含上述核酸和/或重組載體的宿主細(xì)胞，以及上述抗獨(dú)特型抗體核酸、載體和/或宿主細(xì)胞的制備和/或應(yīng)用方法。
本發(fā)明也提供了至少一種用于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或EPO模擬CH1缺失模擬體抗獨(dú)特型抗體的方法，該方法包括在特定條件下培養(yǎng)此處描述的宿主細(xì)胞，其中在該條件下，至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或抗獨(dú)特型抗體以可檢測(cè)和/或可回收的量被表達(dá)。
本發(fā)明也提供了至少一種組合物，該組合物包含(a)此處描述的分離EPO模擬CH1缺失模擬體編碼核酸和/或EPO模擬CH1缺失模擬體；和(b)一種合適的載體或稀釋劑。根據(jù)已知的載體或稀釋劑，該載體或稀釋劑可任選為制藥學(xué)可接受載體或稀釋劑。該組合物可任選地進(jìn)一步包含至少一種其它的化合物、蛋白質(zhì)或組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體方法或組合物，可施用治療有效量以調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者中的至少一種蛋白質(zhì)相關(guān)狀況，和/或施用于本領(lǐng)域已知和/或此處所描述的相關(guān)狀況之前、之后或期間。
本發(fā)明也提供了至少一種用于送遞治療或預(yù)防有效量的至少一種本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體的組合物、裝置和/或方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體方法或組合物，可用于診斷細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者中的至少一種EPO相關(guān)狀況，和/或應(yīng)用于本領(lǐng)域已知和/或此處所描述的相關(guān)狀況之前、之后或期間。
本發(fā)明也提供了至少一種用于送遞本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體以進(jìn)行診斷的組合物、裝置和/或方法。
一方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體，該模擬體包含至少一個(gè)Pep(n)區(qū)，該區(qū)域包含如下表1所示SEQ ID NO1-42中至少一個(gè)序列的至少一個(gè)部分，或者任選地具有此處所描述或本領(lǐng)域已知的一個(gè)或多個(gè)替代、缺失或插入部分。另一方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體，其中該EPO模擬CH1缺失模擬體可與特定的至少一個(gè)表位特異性結(jié)合，或任選地具有此處所描述或本領(lǐng)域已知的一個(gè)或多個(gè)替代、缺失或插入部分，其中上述表位包含至少1-3個(gè)至少一種配體或結(jié)合區(qū)，而該配體可與下表1所示SEQ ID NO1-42中至少一個(gè)序列的至少一個(gè)部分結(jié)合。
上述至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體可任選地進(jìn)一步包含至少一種結(jié)合蛋白，該結(jié)合蛋白具有選自至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M之一的親和性；基本上中和了至少一種蛋白質(zhì)或其部分的至少一種活性。本發(fā)明也提供了編碼至少一種分離哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體的分離核酸；包含該分離核酸的分離核酸載體，和/或包含該分離核酸的原核或真核宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可任選地至少為選自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞，或上述細(xì)胞的任意衍生、無限增殖化或轉(zhuǎn)化細(xì)胞之一的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了用于生成至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體的方法，該方法包括在體外、體內(nèi)或原位條件下翻譯EPO模擬CH1缺失模擬體編碼核酸，使該EPO模擬CH1缺失模擬體以可檢測(cè)或可回收的量被表達(dá)。
本發(fā)明也提供了包含至少一種分離哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體和至少一種制藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的組合物。該組合物可任選地進(jìn)一步包含有效量的至少一種特定化合物或蛋白質(zhì)，該特定化合物或蛋白質(zhì)選自至少一種可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道分子、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于體液或電解液平衡的藥物、血液藥物、抗腫瘤藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、眼、耳或鼻用藥、局部用藥、營(yíng)養(yǎng)藥、TNF拮抗藥、抗風(fēng)濕藥物、肌肉松弛劑、麻醉劑、非類固醇抗炎癥藥物(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉藥、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉藥、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗菌劑、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、促紅細(xì)胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長(zhǎng)激素、激素取代藥物、放射性藥物、抗抑郁藥、抗精神病藥、興奮劑、氣喘藥、β增效劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了可與本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體或片段。
本發(fā)明也提供了用于診斷或治療細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物中的疾病癥狀的方法，包括(a)使細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物接觸或?qū)ζ涫┯冒行Я康谋景l(fā)明至少一種分離哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體的組合物。該方法可任選地進(jìn)一步包括采用每公斤細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物重量施用0.001-50mg的有效量。該方法可任選地進(jìn)一步包括通過至少一種選自腸胃外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、藥團(tuán)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮的方式接觸或施用。該方法可任選地進(jìn)一步包括在(a)接觸或施用之前、同時(shí)或之后施用至少一種組合物，該組合物含有有效量的至少一種特定化含物或蛋白質(zhì)，該化合物或蛋白質(zhì)選自至少一種可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道分子、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于體液或電解液平衡的藥物、血液藥物、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)藥物、眼、耳或鼻用藥、局部用藥、營(yíng)養(yǎng)藥、TNF拮抗藥、抗風(fēng)濕藥物、肌肉松弛劑、麻醉劑、非類固醇抗炎癥藥物(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉藥、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗菌劑、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、促紅細(xì)胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長(zhǎng)激素、激素取代藥物、放射性藥物、抗抑郁藥、抗精神病藥、興奮劑、氣喘藥、β增效劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。
本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明至少一種分離的哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體的醫(yī)學(xué)裝置，其中該裝置適合通過至少一種選自腸胃外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、藥團(tuán)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮的方式接觸或施用至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體。
本發(fā)明也提供了用于人類藥物或診斷用途的制品，包括包裝材料和含有溶液或凍干形式的本發(fā)明至少一種分離哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體的容器。該制品可任選地包括將容器作為腸胃外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、藥團(tuán)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮送遞裝置或系統(tǒng)的一個(gè)組成部分。
本發(fā)明也提供了用于制備本發(fā)明至少一種分離哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體的方法，該方法包括提供能夠表達(dá)可回收量的EPO模擬CH1缺失模擬體的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過上述方法制備的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體。
本發(fā)明也提供了至少一種用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或抗獨(dú)特型抗體的方法，該方法包括在特定條件下培養(yǎng)此處所描述的宿主細(xì)胞，在該條件下，至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體以可檢測(cè)和/或可回收的量被表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了此處所描述的任何發(fā)明。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了分離的、重組的和/或合成的模擬體或特定部分或變體，以及包含至少一種特定多核苷酸的組合物和編碼核酸分子，該特定多核苷酸編碼至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體。上述本發(fā)明模擬體或特定部分或變體包含了特定的EPO模擬CH1缺失模擬體序列、區(qū)域、片段及其特定變體，且本發(fā)明也提供了上述核酸和模擬體或特定部分或變體的制備和應(yīng)用方法，包括治療性組合物、方法和裝置。
本發(fā)明也提供了此處所描述和/或本領(lǐng)域已知的至少一種分離的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。該EPO模擬CH1缺失模擬體可任選地包含至少一個(gè)CH3區(qū)，該CH3區(qū)與至少一個(gè)CH2區(qū)直接相連，該CH2區(qū)與至少一個(gè)鉸鏈區(qū)或其片段直接相連，該鉸鏈區(qū)或其片段與至少一個(gè)部分V區(qū)直接相連，該部分V區(qū)與任意接頭序列直接相連，該任意接頭序列與至少一個(gè)治療性肽直接相連，該治療性肽則任選地進(jìn)一步與至少一個(gè)可變抗體序列的至少一個(gè)部分直接相連。
一種優(yōu)選實(shí)施方案中，EPO模擬CH1缺失模擬體包含分子式(I)(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選取向和結(jié)合特性，從而提供了結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可為1-10中的整數(shù)，模擬不同類型的免疫球蛋白分子，例如，但不僅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE等，或其組合。m＝1時(shí)的單體可通過締合或共價(jià)鍵，例如，但不僅限于Cys-Cys二硫鍵與其它單體相連。因此，本發(fā)明的EPO模擬CH1缺失模擬體模擬了具有抗體固有特性和功能的抗體結(jié)構(gòu)，同時(shí)提供了一種治療性肽及其在體外、體內(nèi)或原位所固有或獲得的特性或活性。采用此處所描述的方法，并結(jié)合本領(lǐng)域已知的方法，可改變本發(fā)明抗體的多個(gè)部分和至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體的治療性肽部分。
此處所用的“EPO模擬CH1缺失模擬體”、“EPO模擬CH1缺失模擬體部分”、或“EPO模擬CH1缺失模擬體片段”和/或“EPO模擬CH1缺失模擬體變體”和類似模擬物，均具有或刺激至少一種蛋白質(zhì)，例如，但不僅限于SEQ ID NO1-1110中至少一種蛋白質(zhì)的至少一種配體結(jié)合或至少一種生物活性，諸如體外、原位和/或優(yōu)選的體內(nèi)的配體結(jié)合或活性。例如，合適的本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體特定部分或變體可結(jié)合至少一種蛋白質(zhì)配體，并包括至少一種蛋白質(zhì)配體、受體、可溶性受體等。合適的EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體也可調(diào)節(jié)、提高、改變、活化至少一種蛋白質(zhì)受體的發(fā)信號(hào)或其它可測(cè)定或可檢測(cè)活性。
在本發(fā)明方法和組合物中有用的模擬體的特征在于具有與蛋白質(zhì)配體或受體結(jié)合的合適親和性，并任選和優(yōu)選地具有低毒性。具體而言，具有下述情況的EPO模擬CH1缺失模擬體在本發(fā)明中均有用，即其中的獨(dú)立組分，諸如可變區(qū)、恒定區(qū)(無CH1部分)和框架部分，或其任意部分(例如可變重或輕鏈的J、D或V區(qū)的一部分；鉸鏈區(qū)、恒定重鏈或輕鏈等)獨(dú)立和/或共同任選和優(yōu)選地具有低免疫原性?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的模擬體任選的特征在于其具有可長(zhǎng)期治療患者，并可從良好到極佳地緩解癥狀，且毒性低的能力。低免疫原性和/或高親和性，以及其它未明特性均可能對(duì)其可實(shí)現(xiàn)的治療效果起作用?！暗兔庖咴浴痹诖颂幈欢x為在少于大約75％，或優(yōu)選地少于大約50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2和/或1％經(jīng)過治療的患者中出現(xiàn)顯著的HAMA、HACA或NAHA應(yīng)答，和/或在經(jīng)過治療的患者中出現(xiàn)低的滴度(采用雙抗原酶免疫測(cè)定法測(cè)定為少于大約300，優(yōu)選地少于大約100)(見例如Elliott et al.，Lancet3441125-1127(1994))。
效用本發(fā)明的分離核酸可被用于生成至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體、片段或其特定變體，該EPO模擬CH1缺失模擬體、片段或其特定變體可被用于在細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物和人類)中起作用，以調(diào)節(jié)、治療、緩解至少一種蛋白質(zhì)相關(guān)狀況，幫助預(yù)防其發(fā)病，或減少其癥狀，該蛋白質(zhì)相關(guān)狀況選自，但不僅限于，至少一種免疫失調(diào)或疾病、心血管失調(diào)或疾病、傳染病、惡性病和/或神經(jīng)失調(diào)或疾病、貧血；免疫/自身免疫；和/或癌癥/傳染病，以及其它已知或特定的蛋白質(zhì)相關(guān)狀況。
該方法可包括對(duì)需要上述調(diào)節(jié)、治療、緩解、預(yù)防或減少癥狀、影響或機(jī)制的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者施用有效量的特定組合物或藥物組合物，該組合物包含至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。該有效量可包括單次或多次施用大約0.0001-500mg/kg的量，或單次或多次施用使血清濃度達(dá)0.0001-5000ug/ml血清的量，或任意有效范圍或其中的數(shù)值，其施用和濃度測(cè)定方法均為此處所描述或相關(guān)領(lǐng)域已知的方法。
引證此處所引用的全部出版物或?qū)＠捎隗w現(xiàn)了與本發(fā)明同時(shí)的本領(lǐng)域現(xiàn)狀，和/或提供了本發(fā)明的描述和實(shí)施方法，因而被完整引入作為參考。出版物指任何學(xué)術(shù)或?qū)＠霭嫖铮蚩梢匀我饷浇楦袷奖惶峁┑钠渌魏钨Y料，包括所有的記錄、電子或打印格式。下述參考文獻(xiàn)均被完整引入作為參考Ausubel，et al.，ed.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.，NY，NY(1987-2002)；Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Mannual，2ndEdition，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow and Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，NY(1989)；Colligan，et al.，eds.，Current Protocolsin Immunology，John Wiley &Sons，Inc.，NY(1994-2002)；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science，JohnWiley &Sons，NY，NY，(1997-2002)。
本發(fā)明的模擬體EPO模擬CH1缺失模擬體可包含至少一個(gè)CH3區(qū)，該CH3區(qū)與至少一個(gè)CH2區(qū)直接相連，該CH2區(qū)與至少一個(gè)鉸鏈區(qū)或其片段直接相連，該鉸鏈區(qū)或其片段與至少一個(gè)部分V區(qū)直接相連，該部分y區(qū)與一個(gè)任選接頭序列直接相連，該任選接頭序列與至少一個(gè)治療性肽直接相連，該治療性肽則任選地進(jìn)一步與至少一個(gè)可變抗體序列的至少一個(gè)部分直接相連。一種優(yōu)選實(shí)施方案中，一對(duì)具有任選N末端抗體序列的CH3-CH2-鉸鏈-部分J序列-接頭-治療性肽是通過締合或共價(jià)鍵，例如，但不僅限于Cys-Cys二硫鍵連接成對(duì)的。因此，本發(fā)明的EPO模擬CH1缺失模擬體模擬了具有抗體固有特性和功能的抗體結(jié)構(gòu)，同時(shí)提供了一種治療性肽及其在體外、體內(nèi)或原位所固有或獲得的特性或活性。采用此處描述的方法，并結(jié)合本領(lǐng)域已知的方法，可改變本發(fā)明抗體的多個(gè)部分和至少一種EP0模擬CH1缺失模擬體的治療性肽部分。
因此，本發(fā)明的模擬體提供了至少一種可與已知蛋白質(zhì)相比的合適特性，例如，但不僅限于，延長(zhǎng)的半衰期、提高的活性、更為特異的活性、提高的親和力、提高或降低的清除率、特選或更為合適的活性亞型、較小的免疫原性、至少一種預(yù)期治療效果被提高的質(zhì)量或延長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間、較少的副作用等特性中的至少一種。
式(I)的模擬體的片段可通過本領(lǐng)域已知和/或此處所描述的酶裂解、合成或重組技術(shù)制備。利用特定抗體基因也可制備多種截短形式的模擬體，該特定抗體基因中的一個(gè)或多個(gè)終止密碼子已被導(dǎo)入天然終止位點(diǎn)的上游。模擬體的多個(gè)部分可通過常規(guī)技術(shù)被化學(xué)連接在一起，或者通過利用遺傳工程技術(shù)被制備為鄰接蛋白。例如，可表達(dá)編碼人類抗體鏈中至少一個(gè)恒定區(qū)的核酸，以生成可應(yīng)用在本發(fā)明模擬體中的鄰接蛋白。見例如，Ladner et al.，U.S.Patent No.4,946,778和Bird，R.E.et al.，Science，242423-426(1988)，有關(guān)單鏈抗體的部分。
此處所用的術(shù)語“人類模擬體”指一種抗體，其中該蛋白質(zhì)的每一部分(例如EPO模擬肽、框架、CL、CH區(qū)(例如CH2、CH3)、鉸鏈、(VL、VH))基本上均被要求在人類中基本無免疫原性，且僅具有較少的序列變化或變異。相對(duì)于未修飾的人類抗體或本發(fā)明模擬體而言，該變化或變異任選并優(yōu)選地在人類中保留或降低了免疫原性。因此，人類抗體和相應(yīng)的本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體與嵌合或人源化抗體截然不同。應(yīng)指出的是，人類抗體和EPO模擬CH1缺失模擬體可由非人類的動(dòng)物或細(xì)胞生成，該非人類的動(dòng)物或細(xì)胞在功能上能夠表達(dá)重排的人類免疫球蛋白(例如重鏈)基因。
針對(duì)合適的配體，例如分離的和/或EPO蛋白質(zhì)受體或配體，或其一部分(包括合成分子，例如合成肽)，可設(shè)計(jì)出特異于至少一種蛋白質(zhì)配體或其受體的人類模擬體。利用可鑒定并表征至少一種蛋白質(zhì)或其部分的配體結(jié)合區(qū)或序列的已知技術(shù)，可制備上述模擬體。
一種優(yōu)選實(shí)施方案中，EPO模擬CH1缺失模擬體包含分子式(I)(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為至少一個(gè)具有生物活性的EPO模擬肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選取向和結(jié)合特性，從而提供了結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可為1-10中的整數(shù)，模擬了不同類型的免疫球蛋白分子，例如，但不僅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE等，或其組合。m＝1時(shí)的單體可通過締合或共價(jià)鍵，例如，但不僅限于Cys-Cys二硫鍵與其它單體相連。
一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體由至少一種細(xì)胞系、混合細(xì)胞系、無限增殖化細(xì)胞，或無限增殖化和/或培養(yǎng)細(xì)胞的克隆群體生成。采用合適的方法便可獲得無限增殖化的蛋白質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞。優(yōu)選地，該至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體是通過提供特定核酸或載體而得以制備的，該核酸或載體含有來源自至少一個(gè)人類免疫球蛋白位點(diǎn)的DNA，或者具有與該至少一個(gè)人類免疫球蛋白位點(diǎn)基本上相似的序列，其中上述至少一個(gè)人類免疫球蛋白位點(diǎn)被功能重排或可接受功能重排，上述核酸或載體可進(jìn)一步包含此處所描述的模擬體結(jié)構(gòu)，例如，但不僅限于分子式(I)，其中如本領(lǐng)域所已知的，C-和N-末端可變區(qū)部分可被用作V1和V2，鉸鏈區(qū)可被用作pHinge，CH2可被用作CH2，CH3可被用作CH3。
此處所用的術(shù)語“功能重排”指來源于特定免疫球蛋白位點(diǎn)的核酸片段，其中該免疫球蛋白位點(diǎn)已經(jīng)歷V(D)J重組，從而生成了編碼免疫球蛋白鏈(例如重鏈)或其任何部分的免疫球蛋白基因。功能重排的免疫球蛋白基因可通過采用下述合適方法直接或間接地得到鑒定，合適的方法例如，核苷酸測(cè)序、利用可退火至基因片段之間的編碼結(jié)合處的探針?biāo)M(jìn)行的雜交(例如蛋白質(zhì)印跡、RNA印跡)或采用可退火至基因片段之間的編碼結(jié)合處的引物對(duì)免疫球蛋白基因所進(jìn)行的酶擴(kuò)增(例如聚合酶鏈反應(yīng))。細(xì)胞是否生成了EPO模擬CH1缺失模擬體或其部分或變體也可通過合適的方法得到確定，其中該EPO模擬CH1缺失模擬體或其部分或變體包含了特定的可變區(qū)或含特定序列(例如，至少一個(gè)Pep序列)的可變區(qū)。
本發(fā)明的模擬體、特定部分和變體也可通過下述方法制備，即利用至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體編碼核酸，以獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或哺乳動(dòng)物，例如山羊、奶牛、馬、綿羊等，使其在乳汁中生成上述模擬體或特定部分或變體。采用與應(yīng)用于抗體編碼序列的方法類似的已知方法便可獲得上述動(dòng)物。見，例如，但不僅限于美國(guó)專利No.5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362；5,304,489等，這些專利均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明的模擬體、特定部分和變體也可另外通過下述方法制備，即利用至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體編碼核酸，以獲得轉(zhuǎn)基因植物和培養(yǎng)的植物細(xì)胞(例如，但不僅限于煙草和玉蜀黍)，使其在植物部分或從中所培養(yǎng)的細(xì)胞中生成上述模擬體或特定部分或變體。一個(gè)非限制性實(shí)例，即表達(dá)重組蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草葉已被成功地用于提供大量的重組蛋白，例如，利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。見，例如Cramer et al.，Curr.Top.Microbol.Immunol.24095-118(1999)及其引用的參考文獻(xiàn)。同樣，轉(zhuǎn)基因玉蜀黍或谷物也已被用于以工業(yè)生產(chǎn)水平表達(dá)生物學(xué)活性等同于由其它重組系統(tǒng)生成或由天然來源純化所得蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。見，例如Hood etal.，Adv.Exp.Med.Biol.464127-147(1999)及其引用的參考文獻(xiàn)。包括抗體片段，例如單鏈模擬體(scFv’s)在內(nèi)的抗體也已被大量地從包括煙草種子和馬鈴薯塊莖在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物種子中生成。見，例如Conrad et al.，Plant Mol.Biol.38101-109(1998)及其引用的參考文獻(xiàn)。因此，本發(fā)明的模擬體、特定部分和變體也可根據(jù)已知方法，利用轉(zhuǎn)基因植物而得以制備。也見，例如Fischer etal.，Biotechnol.Appl.Biochem.3099-108(1999年10月)，Maet al.，Trends Biotechnol.13522-7(1995)；Ma et al.，PlantPhysiol.109341-6(1995)；Whitelam et al.，Biochem.Soc.Trans.22940-944(1994)；及上述文中所引用的參考文獻(xiàn)。上述參考文獻(xiàn)均被完整引入在此作為參考。
本發(fā)明的模擬體可以廣泛的親和性(KD)結(jié)合人類蛋白質(zhì)配體。一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明至少一種人類EPO模擬CH1缺失模擬體可任選地以高親和性結(jié)合至少一種蛋白質(zhì)配體。例如，本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體可以等于或小于大約10-7M的KD，或更為優(yōu)選的，等于或小于大約0.1-9.9(或任意范圍或其中的數(shù)值)X10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12或10-13M，或任意范圍或其中的數(shù)值的KD結(jié)合至少一種蛋白質(zhì)配體。
EPO模擬CH1缺失模擬體對(duì)至少一種蛋白質(zhì)配體的親和性或親和力可通過采用任何合適方法得以實(shí)驗(yàn)測(cè)定，例如用于測(cè)定抗體-抗原結(jié)合親和性或親和力的方法。(見，例如Berzofsky，et al.，在Fundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven PressNewYork，NY(1984)中的“Antibody-Antigen Interaction”；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and CompanyNew York，NY(1992)；及其描述的方法)。不同條件(例如鹽濃度、pH)下所測(cè)定的特定EPO模擬CH1缺失模擬體-配體相互作用的親和性不同。因此，優(yōu)選采用EPO模擬CH1缺失模擬體和配體的標(biāo)準(zhǔn)溶液，和諸如此處所描述的標(biāo)準(zhǔn)緩沖劑測(cè)定親和性及其它配體結(jié)合參數(shù)(例如KD、Ka、Kd)。
核酸分子利用此處提供的資料，采用此處描述或本領(lǐng)域已知的方法，可獲得諸如編碼SEQ ID NO1-42中至少一個(gè)序列的至少90-100％連續(xù)氨基酸以及特定抗體的至少一個(gè)部分的核苷酸序列，其中上述序列被作為分子式(I)的Pep序列插入，可獲得本發(fā)明的EPO模擬CH1缺失模擬體，進(jìn)一步包括其特定片段、變體或一致序列，或者可獲得包含了至少一種上述序列的沉積載體，和編碼至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的本發(fā)明核酸分子。
本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式，諸如mRNA、hnRNA、tRNA或其它任何形式，或者是DNA形式，包括，但不僅限于cDNA和通過克隆或合成所獲的基因組DNA，或其任意組合。該DNA可為三鏈、雙鏈或單鏈，或三種鏈形式的任意組合。DNA或RNA的至少一條鏈的任意部分均可為編碼鏈，也是通常所說的有義鏈，或者可以是非編碼鏈，也被稱為反義鏈。
本發(fā)明的分離核酸分子可包括含有一個(gè)可讀框(ORF)，并任選地具有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的核酸分子，含有EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的編碼序列的核酸分子；和含有與上述核苷酸序列基本上不同的核苷酸序列，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，仍然編碼此處所描述和/或本領(lǐng)域已知的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體的核酸分子。當(dāng)然，該遺傳密碼是本領(lǐng)域熟知的。因此，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，制備編碼本發(fā)明特定EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的上述簡(jiǎn)并核酸變體是常規(guī)工作。見，例如上述Ausubel，et al.，且上述核酸變體也被包括在本發(fā)明中。
如此處所指出的，包含編碼EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的核酸的本發(fā)明核酸分子可包括，但不僅限于，自身編碼EPO模擬CH1缺失模擬體片段的氨基酸序列的核酸分子；完整EPO模擬CH1缺失模擬體或其部分的編碼序列；EPO模擬CH1缺失模擬體、片段或部分的編碼序列，以及其它序列，諸如至少一種信號(hào)前導(dǎo)或融合肽的編碼序列，具有或不具有上述其它編碼序列，諸如至少一個(gè)內(nèi)含子，連同其它非編碼序列，包括但不僅限于非編碼5’和3’序列，諸如在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工，包括剪接和多腺苷酸化信號(hào)中發(fā)揮作用(例如-mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性)的轉(zhuǎn)錄、非翻譯序列；編碼其它氨基酸，諸如可提供其它功能性的氨基酸的其它編碼序列。因此，編碼EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的序列可被融合至標(biāo)記序列，諸如編碼特定肽的序列，該肽有助于純化含有EPO模擬CH1缺失模擬體片段或部分的融合EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。
與此處所描述的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸本發(fā)明提供了可在選擇性雜交條件下與此處公開的多核苷酸或包括其特定變體或部分的其它多核苷酸雜交的分離核酸。因此，該實(shí)施方案的多核苷酸可被用于分離、檢測(cè)和/或定量含有該多核苷酸的核酸。
低或中等嚴(yán)格性雜交條件典型地，但并不專有地應(yīng)用于與互補(bǔ)序列相比序列同一性被降低的序列。中等和高嚴(yán)格性條件可任選地被用于較高同一性的序列。低嚴(yán)格性條件可實(shí)現(xiàn)具有大約40-99％序列同一性的序列的選擇性雜交，并可被用于鑒定直向同源或共生同源序列。
任選地，本發(fā)明的多核苷酸可編碼由此處描述的多核苷酸所編碼的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的至少一個(gè)部分。本發(fā)明的多核苷酸包含了可被用于與編碼本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的多核苷酸選擇性雜交的核酸序列。見，例如，上述Ausubel；上述Colligan，均被完整引入此處作為參考。
核酸的構(gòu)建本發(fā)明的分離核酸可采用本領(lǐng)域熟知的(a)重組方法、(b)合成技術(shù)、(c)純化技術(shù)，或集中方法的組合而得以制備。
該核酸可方便地包含除本發(fā)明多核苷酸之外的序列。例如，可將包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)切核酸酶限制位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)插入該核酸中，以助于分離該多核苷酸。同樣，可將可翻譯序列插入該核酸中，以助于分離本發(fā)明的翻譯多核苷酸。例如，六組氨酸標(biāo)記序列提供了純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的常規(guī)途徑。本發(fā)明核酸除可作為編碼序列外，任選地還可作為用于克隆和/或表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的載體、接合體或接頭。
其它序列也可被加入上述克隆和/或表達(dá)序列，以優(yōu)化其在克隆和/或表達(dá)方面的功能、以助于分離本發(fā)明多核苷酸，或促使本發(fā)明多核苷酸被導(dǎo)入細(xì)胞?？寺≥d體、表達(dá)載體、接合體和接頭的用途均是本領(lǐng)域熟知的。見，例如上述Ausubel；或上述Sambrook。
構(gòu)建核酸的重組法利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種克隆方法，均可從生物學(xué)來源中獲得本發(fā)明的分離核酸組合物，諸如RNA、cDNA、基因組DNA或其任意組合。某些實(shí)施方案中，采用了在合適的嚴(yán)格性條件下可與本發(fā)明多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針，以在cDNA或基因組DNA文庫中鑒定所需要的序列。RNA的分離、cDNA和基因組文庫的構(gòu)建均是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。(見，例如上述Ausubel；或上述Sambrook)。
用于構(gòu)建核酸的合成法本發(fā)明的分離核酸也可通過已知的直接化學(xué)合成法制備(見，例如上述Ausubel，et al.)?；瘜W(xué)合成通常生成單鏈寡核苷酸，通過與互補(bǔ)序列雜交，或通過以該單鏈為模板，采用DNA聚合酶進(jìn)行聚合，可將該單鏈寡核苷酸轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。本領(lǐng)域任何一位技術(shù)人員均會(huì)認(rèn)識(shí)到，雖然DNA的化學(xué)合成可被局限于大約100個(gè)或更多堿基的序列，較長(zhǎng)序列可通過較短序列的連接獲得。
重組表達(dá)組件本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明核酸的重組表達(dá)組件。本發(fā)明的核酸序列，例如編碼本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的cDNA或基因組序列，可被用于構(gòu)建特定重組表達(dá)組件，該組件可被導(dǎo)入至少一種理想的宿主細(xì)胞中。重組表達(dá)組件將典型地包含被可操作連接至特定轉(zhuǎn)錄起動(dòng)調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明多核苷酸，其中該轉(zhuǎn)錄起動(dòng)調(diào)節(jié)序列將引導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸在指定宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。異源和非異源(即內(nèi)源)啟動(dòng)子均可被用于引導(dǎo)本發(fā)明核酸的表達(dá)。
在某些實(shí)施方案中，充當(dāng)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它元件的分離核酸可被導(dǎo)入本發(fā)明非異源形式多核苷酸的合適位置上(上游、下游或內(nèi)含子中)，以正或負(fù)調(diào)節(jié)本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)。例如，如本領(lǐng)域已知，內(nèi)源啟動(dòng)子可通過突變、缺失和/或替代在體內(nèi)或體外被改變。本發(fā)明多核苷酸可按指定的有義或反義方向被表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)有義或反義方向基因表達(dá)的控制可直接影響可觀測(cè)特征。抑制的另一種方法是有義抑制。導(dǎo)入被設(shè)定為有義方向的核酸已被證明是阻斷目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的一種有效途徑。
載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明分離核酸分子的載體、經(jīng)由該重組載體遺傳改造的宿主細(xì)胞，以及通過本領(lǐng)域所熟知的重組技術(shù)對(duì)至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的制備。見，例如上述Sambrook，et al.；上述Ausubel，et al.，均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明多核苷酸可任選地被連接至特定載體，該載體含有用于在宿主內(nèi)增殖的可選擇標(biāo)記。通常，采用合適的已知方法，諸如電穿孔等方法將質(zhì)粒載體導(dǎo)入細(xì)胞，其它已知方法包括利用可作為沉淀物的載體，如磷酸鈣沉淀物，或與帶電荷脂質(zhì)形成復(fù)合體。如果該載體為病毒，可采用合適的包裝細(xì)胞系將其體外包裝，并隨后將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
DNA插入應(yīng)被操作性地連接至合適啟動(dòng)子。該表達(dá)構(gòu)建體可進(jìn)一步含有任選用于至少一種轉(zhuǎn)錄起始、終止，且位于轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)，以及用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該構(gòu)建體所表達(dá)成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分將優(yōu)選地包括開始的翻譯起動(dòng)和適當(dāng)?shù)匚挥诖gmRNA末端的終止密碼子(例如，UAA、UGA或UAG)，以及優(yōu)選用于哺乳動(dòng)物或真核細(xì)胞表達(dá)的UAA和UAG。
表達(dá)載體可優(yōu)選，但也可任選地包括至少一種可選擇標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括，例如，但不僅限于對(duì)真核細(xì)胞培養(yǎng)而言的氨甲喋呤(MTX)、二氫葉酸還原酶(DHFR，US Pat.Nos.4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨芐青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS、US Pat.Nos.5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性，和用于在大腸桿菌和其它細(xì)菌或原核生物中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因(上述專利均被完整引入此處作為參考)。用于上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。合適的載體應(yīng)是熟練技術(shù)人員熟知的。將載體構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、侵染或其它已知方法實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域諸如上述Sambrook，1-4和16-18章；上述Ausubel，1、9、13、15、16章中描述了這些方法。
本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體均可以修飾形式被表達(dá)，諸如融合蛋白質(zhì)，并且可以不僅包括分泌信號(hào)，還包括其它異源功能區(qū)。例如，一個(gè)區(qū)域的附加氨基酸，尤其是帶電荷氨基酸可被加入EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的N末端，從而改善該EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體在宿主細(xì)胞中、純化期間或后續(xù)處理和保存期間的穩(wěn)定性和持久性。同樣，本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體也可加入肽部分，從而有助于其純化。最終制備EPO模擬CH1缺失模擬體或其至少一個(gè)片段之前，可將上述區(qū)域除去。許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，諸如上述Sambrook，17.29-17.42和18.1-18.74章；上述Ausubel，16、17和18章中均描述了上述方法。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知可用于表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸的諸多表達(dá)系統(tǒng)。
對(duì)本發(fā)明模擬體、特定部分或其變體的制備有用的細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)例是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)通常為單層細(xì)胞形式，但也可采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液或生物反應(yīng)器，。本領(lǐng)域已發(fā)展出可表達(dá)完整糖基化蛋白的大量合適宿主細(xì)胞系，包括COS-1(例如ATCC CRL1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCCCRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610，DG-44)和BSC-1(例如ATCCCRL-26)細(xì)胞系、hepG2細(xì)胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等，均可容易地從例如，American Type CultureCollection(美國(guó)典型菌種保藏中心)，Manassas，Va獲得。優(yōu)選宿主細(xì)胞包括淋巴來源的細(xì)胞，諸如骨髓瘤和淋巴瘤細(xì)胞。尤其優(yōu)選的宿主細(xì)胞為P3X63Ag8.653細(xì)胞(ATCC編號(hào)CRL-1580)和SP2/0-Ag14細(xì)胞(ATCC編號(hào)CRL-1851)。
用于上述細(xì)胞的表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)下述表達(dá)控制序列，例如，但不僅限于復(fù)制起點(diǎn)；啟動(dòng)子(例如末期或早期SV40啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子(例如美國(guó)專利Nos.5,168,062；5,385,839)、HSV tk啟動(dòng)子、pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子、EF-1α啟動(dòng)子(例如美國(guó)專利No.5,266,491)，至少一種人類免疫球蛋白啟動(dòng)子)；增強(qiáng)子和/或加工信息位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)(例如SV40大T Ag聚腺苷酸加入位點(diǎn))，和轉(zhuǎn)錄終止子序列。見，例如，上述Ausubel et al.；上述Sambrook，et al.。對(duì)本發(fā)明核酸或蛋白質(zhì)的制備有用的其它細(xì)胞均是已知的，和/或可從，例如American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines andHybridomas(美國(guó)典型菌種保藏中心細(xì)胞系和雜交瘤目錄)(www.atcc.org)或其它已知或商業(yè)來源獲得。
應(yīng)用真核宿主細(xì)胞時(shí)，是將聚腺苷酸化或轉(zhuǎn)錄終止序列典型地整合進(jìn)上述載體中。終止序列的一個(gè)實(shí)例是牛生長(zhǎng)激素基因來源的聚腺苷酸化序列。也可包括用于準(zhǔn)確剪接轉(zhuǎn)錄物的序列。剪接序列的一個(gè)實(shí)例是SV40來源的VP1內(nèi)含子(Sprague，et al.，J.Virol.45773-781(1983))。另外，如本領(lǐng)域已知，可將控制宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的基因序列整合進(jìn)上述載體中。
EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或其變體的純化EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可通過熟知的方法，包括，但不僅限于A蛋白純化、硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水作用色譜、親和色譜、羥磷灰石色譜和凝集素色譜，從重組細(xì)胞中得以回收及純化。也可應(yīng)用高效液相色譜(“HPLC”)進(jìn)行純化。見，例如Colligan，CurrentProtocols in Immunology，或Current Protocols in ProteinScience，John Wiley &Sons，NY，NY，(1997-2002)，例如1、4、6、8、9、10章，均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明的模擬體或特定部分或變體包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成操作的產(chǎn)物，和通過重組技術(shù)從真核細(xì)胞，包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得的產(chǎn)物。根據(jù)重組制備操作中應(yīng)用的宿主，本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可以是糖基化或非糖基化的，優(yōu)選糖基化的。許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，諸如上述Sambrook，17.37-17.42節(jié)；上述Ausubel，10、12、13、16、18和20章，上述Colligan，Protein Science，12-14章中均描述了上述方法，均被完整引入此處作為參考。
模擬體、特定片段和/或變體本發(fā)明的分離模擬體包括由此處更完整論述的本發(fā)明任意一種多核苷酸編碼的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，或任何分離或制備的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或其變體。
優(yōu)選的EPO模擬CH1缺失模擬體或配體結(jié)合部分或變體結(jié)合了至少一個(gè)EPO蛋白配體或受體，并從而提供了相應(yīng)蛋白質(zhì)或其片段的至少一種EPO生物學(xué)活性。多種在治療或診斷方面具有重要作用的蛋白質(zhì)均是本領(lǐng)域熟知的，且該蛋白質(zhì)的合適測(cè)定方法或生物學(xué)活性也是本領(lǐng)域熟知的。
對(duì)本發(fā)明而言，合適的EPO模擬肽的非限制性實(shí)例見下表1。這些肽可通過已公開和/或本領(lǐng)域已知的方法制備。大部分情況中采用了單字母氨基酸縮寫。這些序列中(以及通篇該說明書中，在特定實(shí)例中如無另外指明)的X指20種天然存在的氨基酸中的任意一種，或已知的氨基酸殘基或其可能存在的已知衍生物，或其任何已知的修飾氨基酸。這些肽中的任意幾種均可在有或無接頭的情況下串聯(lián)相連(即連續(xù)地)，且該表中提供了幾個(gè)串聯(lián)相連的實(shí)例。接頭被列為“A”，并可為此處描述的任一接頭。串聯(lián)重復(fù)和接頭由破折號(hào)分開以清晰顯示。含有半胱氨酰殘基的任何肽均可任選地與另一個(gè)含半胱氨酸的肽交聯(lián)，其中一個(gè)或二者均可被連接至一個(gè)載體上。該表中提供了幾個(gè)交聯(lián)實(shí)例。任何具有一個(gè)以上半胱氨酸殘基的肽均可形成肽內(nèi)二硫鍵；見，例如，表1中的EPO模擬肽。該表中列出了由肽內(nèi)二硫鍵連接的肽的若干實(shí)例。這些肽中的任意一種均可通過此處所描述的方法被衍生化，該表中提供了若干衍生化實(shí)例。對(duì)羧基末端可被氨基基團(tuán)加蓋的衍生物而言，加蓋氨基基團(tuán)被表示為-NH2。對(duì)氨基酸殘基被非氨基酸殘基部分替代的衍生物而言，該替代被表示為δ，代表本領(lǐng)域已知的任何部分，例如被完整引入此處作為參考的Bhatnagar et al.，(1996)，J.Med.Chem.393814-9和Cuthbertson et al.(1997)，J.Med.Chem.402876-82中描述的部分。在被完整引入此處作為參考的美國(guó)專利No.5,608,035、5,786,331和5,880,096中定義了J替代基和Z替代基(Z5、Z6，....Z40)。對(duì)EPO模擬序列(表1)而言，被完整引入作為參考的WO 96/40772定義了取代基X2-X11和整數(shù)“n”。粗體顯示的殘基為D-氨基酸，但也可任選地是L-氨基酸。如無另外指出，所有肽均通過肽鍵連接?？s寫詞列于本說明書的結(jié)束部分。在“SEQ ID NO.”欄中，“NR”指對(duì)該特定序列而言無需序列列表。
表1-EPO-模擬肽序列序列/結(jié)構(gòu)；SEQ ID NOYXCXXGPXTWXCXP 1YXCXXGPXTWXCXP-YXCXXGPXTWXCXP2YXCXXGPXTWXCXP-A-YXCXXGPXTWXCXP 3 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 5GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG 6GGVYACRMGPITWVCSPLGG 7VGNYMCHPGPITWVCRPGGG 8GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG 9GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-10GGTYSCHPGPLTWVCKPQGG-Δ-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 11GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK 12GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK 13GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK 14GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-Δ-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(-Δ-生物素)16CX4X5GPX6TWX7C 17GGTYSCHGPLTWVCKPQGG 18VGNYMAHMGPITWVCRPGG 19GGPHHVYACRMGPLTWIC 20GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 21GGLYACHMGPMTWVCQPLRG 22TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 23YSCHFGPLTWVCK24YCHFGPLTWVC 25
X3X4X5GPX6TWX7X826YX2X3X4X5GPX6TWX7X827X1YX2X3X4X5GPX6X7X8X9X10X1128X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X1129GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG 30GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 31GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG 32VGNYMCHFGPITWVCRPGGG 33GGVYACRMGPITWVCSPLGG 34VGNYMAHMGPITWVCRPGG 35GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 36GGLYACHMGPMT％AIVCQPLRG 37TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 38YSCHFGPLTWVCK39YCHFGPLTWVC 40SCHFGPLTWVCK 41(AX2)nX3X4X5GPX6TWX7X842EPO生物學(xué)活性是本領(lǐng)域熟知的。見，例如Anagnostou A等人在Proceedings of the National Academy of Science(USA)875978-82(1990)中的Erythropoietin has a mitegenic andpositive chemotactic effect on endothelial cells.(促紅細(xì)胞生成素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和正趨化性作用)；Fandrey J和Jelkman WE在Annals of the New York Academy of Science628250-5(1991)中的Interleukin 1and tumor necrosisfactor-alpha inhibit eryt hropoietin production in vitro.(白細(xì)胞間介素和腫瘤壞死因子-α抑制體外促紅細(xì)胞生成素的生成)；Geissler K等人在Contrib.Nephrol.871-10(1990)中的Recombinant human erythropoietinA multipotentialhemopoietic growth factor in vivo and in vitro.(重組人類促紅細(xì)胞生成素體內(nèi)和體外的多潛能造血生長(zhǎng)因子)；Gregory CJ在Journal of Cellular Physiology 89289-301(1976)中的Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in thehemopoietic system.Studies of three erythropoietic colonyresponses in culture.(在造血系統(tǒng)中作為分化標(biāo)記的促紅細(xì)胞生成素敏感性。對(duì)培養(yǎng)中的三種促紅細(xì)胞生成素集落應(yīng)答的研究。)Jelkman W等人在Life Sci.50301-8(1992)中的Monokinesinhibiting erythropoietin production in human hepatomacultures and in isolated perfused rat kidneys.(抑制人類肝細(xì)胞瘤培養(yǎng)物和分離灌流大鼠腎中生成促紅細(xì)胞生成素的單核因子)；Kimata H等人在Clinical and Experimental Immunology85151-6(1991)中的Human recombinant erythropoietindirectlystimulates Bcell immunoglobulin production and proliferationin serum-free medium.(人類重組促紅細(xì)胞生成素直接刺激B細(xì)胞免疫球蛋白在無血清培養(yǎng)基中的生成和增殖)；Kimata H等人在Clin.Immunology Immunopathol.59495-501(1991)中的Erythropoietin enhances immunoglobulin production andproliferation by human plasma cells in a serum-free medium.(促紅細(xì)胞生成素在無血清培養(yǎng)基中提高了人類漿細(xì)胞的免疫球蛋白產(chǎn)量和增生)；Kimata H等人在Clinical and ExperimentalImmunology 83483-7(1991)中的Effect of recombinant humanerythropoietin on human IgE production in vitro.(重組人類促紅細(xì)胞生成素對(duì)體外人類IgE生成的影響)；Koury MJ和BondurantMC在Science 248378-81(1990)中的Erythropoietin retards DNAbreakdown and prevents programmed cell death in erythroidprogenitor cells.(促紅細(xì)胞生成素延遲了DNA分解，并阻止了紅細(xì)胞祖細(xì)胞中的程序性細(xì)胞死亡)；Lim VS等人在KidneyInternational 37131-6(1990)中的Effect of recombinant humanerythropoietin on renal function in humans.(重組人類促紅細(xì)胞生成素對(duì)人體腎功能的影響)；Mitjavila MT等人在Journal ofClinical Investigation 88789-97(1991)中的Autocrinestimulation by erythropoiet in and autonomous growth of humanerythroid leukemic cells in vitro.(促紅細(xì)胞生成素的自分泌刺激和人類紅細(xì)胞白血病細(xì)胞在體外的自主生長(zhǎng))；Andre M等人在Clinical Chemistry 38758-63(1992)中的Performance of animmunoradiometric assay of erythropoietin and results forspecimens from anemic and polycythemic patients.(免疫放射分析促紅細(xì)胞生成素的表現(xiàn)和對(duì)貧血和紅細(xì)胞增多患者來源樣本的分析結(jié)果)；Hankins WD等人在Annals of the New York Academy ofScience 55421-8(1989)中的Erythropoietin-dependent anderythropoietin-producing cell lines.Implications forresearch and for leukemia therapy.(促紅細(xì)胞生成素依賴性和促紅細(xì)胞生成素生成細(xì)胞系。對(duì)研究和白血病治療的意義)；Kendall RGT等人在Clin.Lab.Haematology 13189-96(1991)中的Storage andpreparation of samples for erythropoietin radioimmunoassay.(用于促紅細(xì)胞生成素放射免疫分析的樣本的保存和制備)；KrumviehD等人在Dev.Biol.Stand.6915-22(1988)中的Comparison ofrelevant biological assays for the determination ofbiological active erythropoietin.(測(cè)定具有生物活性的促紅細(xì)胞生成素所用相關(guān)生物學(xué)測(cè)定方法的比較)；Ma DD等人在BritishJournal of Haematology 80431-6(1992)中的Assessment of anEIA for measuring human serum erythropoietin as compared withRIA and an in-vitro bioassay.(與RI A和體外生物測(cè)定相比，對(duì)測(cè)定人類血清促紅細(xì)胞生成素的EIA的評(píng)估)；Noe G等人在BritishJournal of Haematology 80285-92(1992)中的A sensitivesandwich ELISA for measuring erythropoietin in human serum.(一種用于測(cè)定人類血清中促紅細(xì)胞生成素的靈敏夾心ELISA法)；Pauly JU等人在Behring Institut Mitteilungen 90112-25(1991)中的Highly specific and highly sensitive enzyme immunoassaysfor antibodies to human interleuk in 3(IL3)and humanerythropoietin(EPO)in serum.(針對(duì)血清中人類白細(xì)胞間介素3(IL3)和人類促紅細(xì)胞生成素(EPO)的抗體的高特異性和高靈敏性酶免疫測(cè)定法)；Sakata S和Enoki Y在Ann.Hematology 64224-30(1992)中的Improved microbioassay for plasma erythropoietinbased on CFU-E colony formation.(基于CFU-E集落形成對(duì)血漿促紅細(xì)胞生成素的改良微生物測(cè)定法)；Sanengen T等人在Acta Physiol.Scand.13511-6(1989)中的Immunoreactive erythropoietin anderythropoiesis stimulating factor(s)in plasma fromhypertransfused neonatal and adult mice.Studies with aradioimmunoassay and a cell culture assay for erythropoietin.(高度輸液新生和成熟小鼠來源血漿中的免疫反應(yīng)性促紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞生成刺激因子。采用放射免疫測(cè)定和針對(duì)促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定進(jìn)行的研究)；WidnessJA等人在Journal of Lab.Clin.Med.119285-94(1992)中的A sensitive and specificerythropoietin immunoprecipitation assayapplication topharmacokinetic studies.(一種靈敏和特異性促紅細(xì)胞生成素免疫沉淀分析法在藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用)；其它資料也參見個(gè)別生物測(cè)定中采用的個(gè)別細(xì)胞系。上述參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考。通過應(yīng)用可應(yīng)答該因子的細(xì)胞系，諸如HCD57、NFS-60、TF-1和UT-7，可測(cè)定EPO。通過在集落形成試驗(yàn)中測(cè)定骨髓細(xì)胞來源CFU-E的量，也可評(píng)定EPO活性。一種可選且完全不同的檢測(cè)法是細(xì)胞因子的RT-PCR定量法。
EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或其變體可結(jié)合特定蛋白質(zhì)或片段配體，并從而提供至少一種活性，該活性是通過使蛋白質(zhì)與至少一種蛋白質(zhì)配體或受體結(jié)合，或通過其它蛋白質(zhì)依賴或介導(dǎo)機(jī)制而被另外介導(dǎo)的，上述EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或其變體部分地或基本上優(yōu)選地提供了至少一種上述特定蛋白質(zhì)或片段的至少一種生物活性。此處所用的術(shù)語“EPO模擬CH1缺失模擬體活性”指可根據(jù)測(cè)定方法以大約20-10,000％，優(yōu)選地以至少大約60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000％或更高比例調(diào)節(jié)或引起至少一種蛋白質(zhì)依賴活性。
EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可提供至少一種蛋白質(zhì)依賴活性的能力優(yōu)選地通過此處所描述和/或本領(lǐng)域已知的至少一種合適的蛋白質(zhì)生物學(xué)測(cè)定而得以評(píng)定。本發(fā)明的人類EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可與任何種類的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM等)或同種型相似，并可包含至少一個(gè)部分的k或λ輕鏈。一種實(shí)施方案中，人類EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體包含了IgG重鏈可變片段、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3，例如，至少一種同種型，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體結(jié)合了對(duì)至少一種蛋白質(zhì)、亞單位、片段、部分或這幾項(xiàng)的任意組合具有特異性的至少一種特定配體。本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體的至少一種EPO模擬肽可任選地結(jié)合該配體的至少一個(gè)特定配體表位。該結(jié)合表位可包含至少一種特定氨基酸序列的任意組合，該特定氨基酸序列所含至少1-3個(gè)氨基酸，及其連續(xù)氨基酸的完整特定部分選自蛋白質(zhì)配體，諸如EPO受體或其部分之一。
該模擬體可通過下述方法制備，即采用已知技術(shù)將式(I)的EPO模擬CH1缺失模擬體的不同部分連接在一起，通過采用已知的重組DNA技術(shù)或其它任何合適方法，諸如化學(xué)合成法制備并表達(dá)編碼該EPO模擬CH1缺失模擬體的至少一種(即一種或多種)核酸分子。
采用合適方法，諸如噬菌體展示(Katsube，Y.，et al.，Int.JMol.Med，1(5)863-868(1998))或本領(lǐng)域已知和/或此處所描述的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，可制備與人類蛋白質(zhì)配體或受體結(jié)合，并包含確定重或輕鏈可變區(qū)的模擬體。通過利用EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體在合適宿主細(xì)胞中的編碼核酸或其部分便可表達(dá)該EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或變體。
優(yōu)選地，該模擬體或其配體結(jié)合片段可與人類EPO配體或受體高親和性地結(jié)合(例如，小于或等于大約10-7M的KD)。與此處所描述序列基本相同的氨基酸序列包括含有保守氨基酸置換，以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置換指第一個(gè)氨基酸被具有與其相似的化學(xué)和/或物理特性(例如電荷、結(jié)構(gòu)、極性、疏水性/親水性)的第二個(gè)氨基酸置換。保守置換包括在下組氨基酸范圍內(nèi)，一種氨基酸被另一種氨基酸置換，即賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
氨基酸密碼組成本發(fā)明模擬體或特定部分或變體的氨基酸通常被縮寫。通過由氨基酸的單字母代碼、三字母代碼、名稱或本領(lǐng)域熟知的三個(gè)核苷酸密碼子標(biāo)明該氨基酸，便可表示出該氨基酸名稱(見Alberts，B.，et al.，Molecular Biology of The Cell，Third Ed.，GarlandPublishing，Ino.，New York，1994)
本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可包括此處所定義的來源于自然突變或人為操縱的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失或添加。
當(dāng)然，熟練技術(shù)人員應(yīng)根據(jù)包括上述因素在內(nèi)的許多因素確定氨基酸置換的數(shù)量。一般來說，對(duì)至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體而言的氨基酸置換、插入或缺失數(shù)量不應(yīng)超過40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè)氨基酸，如此處指定的1-30或其中的任意范圍或數(shù)值。
在本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體中，對(duì)功能而言必不可少的氨基酸可通過本領(lǐng)域已知的方法而得以鑒定，諸如定位誘變或丙氨酸掃描誘變(例如上述Ausubel，8、15章；Cunninghamand Wells，Science 2441081-1085(1989))。后一種操作在分子中的每一個(gè)殘基上均導(dǎo)入了單丙氨酸突變。隨后，檢驗(yàn)所獲突變分子的生物活性，例如，但不僅限于此處說明或本領(lǐng)域已知的至少一種蛋白質(zhì)相關(guān)活性。對(duì)EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體結(jié)合而言的關(guān)鍵位點(diǎn)也可通過諸如結(jié)晶、核磁共振或光親和標(biāo)記的結(jié)構(gòu)分析法而得以鑒定(Smith，et al.，J.Mol.Biol.224899-904(1992)和de Vos，et al.，Science 255306-312(1992))。
本發(fā)明模擬體或特定部分或變體可包含分子式(I)中的Pep部分，但不僅限于SEQ ID NO1-42中至少一個(gè)序列的至少一個(gè)部分、序列或選自SEQ ID NO1-42中3個(gè)序列到所有序列的組合?？稍鰪?qiáng)或保持至少一種上述活性的非限制性變體包括，但不僅限于，任一上述多肽，進(jìn)一步包含至少一種突變，該突變與不顯著影響本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體的合適生物活性或功能的至少一種置換、插入或缺失對(duì)應(yīng)。
EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可進(jìn)一步任選地包含作為分子式(I)中Pep部分的至少一種多肽的至少一個(gè)功能部分，該功能部分與SEQ ID NOS1-42中至少一個(gè)序列具有90-100％的同一性”)。EPO模擬CH1缺失模擬體可進(jìn)一步任選地包含可作為分子式(I)中的Pep部分，并選自SEQ ID NO2-41中的一個(gè)或多個(gè)序列的氨基酸序列。
一種實(shí)施方案中，Pep氨基酸序列或其部分與SEQ ID NO1-42中至少一個(gè)序列的相應(yīng)部分的相應(yīng)氨基酸序列具有大約90-100％同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任意范圍或數(shù)值)。優(yōu)選地，利用本領(lǐng)域已知的合適計(jì)算機(jī)算法確定90-100％氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或任意范圍或其中的數(shù)值)。
本發(fā)明模擬體或特定部分或變體可包含來源于本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的任意數(shù)量連續(xù)氨基酸殘基，其中該數(shù)量選自由EPO模擬CH1缺失模擬體中連續(xù)殘基數(shù)量的10-100％組成的整數(shù)群之一。任選地，連續(xù)氨基酸的子序列在長(zhǎng)度上至少含有大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多氨基酸，或含有其中任意范圍或數(shù)值的氨基酸。此外，該子序列的數(shù)量可為選自1-20的任意整數(shù)，諸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整數(shù)。
技術(shù)人員應(yīng)理解的是，本發(fā)明包括至少一種具有生物活性的本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。具有生物活性的模擬體或特定部分或變體的特定活性為天然(非合成)、內(nèi)源或相關(guān)和已知的插入或融合蛋白或特定部分或變體的活性的至少20％、30％或40％，優(yōu)選為至少50％、60％或70％，最為優(yōu)選的是至少80％、90％或95％-100％。分析并定量測(cè)定酶活性和底物特異性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
另一方面，本發(fā)明涉及此處所描述通過共價(jià)附著有機(jī)部分而被修飾的人類模擬體和配體結(jié)合片段。該修飾可產(chǎn)生具有改良藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性(例如延長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期)的EPO模擬CH1缺失模擬體或配體結(jié)合片段。有機(jī)部分可以是線型或分支親水聚合基團(tuán)、脂肪酸基團(tuán)或脂肪酸酯基團(tuán)。特定實(shí)施方案中，親水聚合基團(tuán)可具有大約800-大約120,000道爾頓的分子量，并可為聚鏈烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、糖聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)可包含大約8-大約40個(gè)碳原子。
本發(fā)明的修飾模擬體和配體結(jié)合片段可包含一個(gè)或多個(gè)與EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體直接或間接地共價(jià)結(jié)合的有機(jī)部分。與本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或配體結(jié)合片段結(jié)合的各有機(jī)部分均可獨(dú)立為親水聚合基團(tuán)、脂肪酸基團(tuán)或脂肪酸酯基團(tuán)。此處所用的術(shù)語“脂肪酸”包括單羧基酸和雙羧基酸。此處所用的術(shù)語“親水聚合基團(tuán)”指在水中比在辛烷中更易溶的有機(jī)聚合物。例如，聚賴氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，本發(fā)明包括通過共價(jià)附著聚賴氨酸而得以修飾的EPO模擬CH1缺失模擬體。適用于修飾本發(fā)明模擬體的親水聚合物可為線型或分支狀，且包括，例如聚鏈烷二醇(例如PEG、單甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、糖類(例如葡聚糖、纖維素、寡糖、多糖等)、親水氨基酸的聚合物(例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚環(huán)氧鏈烷(例如聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。優(yōu)選地，修飾本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體的親水聚合物為單分子實(shí)體形式時(shí)，具有大約800-大約150,000道爾頓的分子量。例如，可采用PEG2500、PEG5000、PEG7500、PEG9000、PEG10000、PEG12500、PEG1500和PEG20,000，其中下標(biāo)為該聚合物的道爾頓平均分子量。
親水聚合基團(tuán)可被1至大約6個(gè)烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)置換。被脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)置換的親水聚合物可通過應(yīng)用合適的方法制備。例如，包含胺基團(tuán)的聚合物可被偶聯(lián)至脂肪酸或脂肪酸酯的羧基上，且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如經(jīng)由N，N-羰基二咪唑活化)可被偶聯(lián)至聚合物上的羥基基團(tuán)。
適用于修飾本發(fā)明模擬體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和或可含有一個(gè)或多個(gè)不飽和單位。適用于修飾本發(fā)明模擬體的脂肪酸包括，例如，n-十二烷酸(C12，月桂酸)、n-四癸酸(C14，肉豆蔻酸)、n-八癸酸(C18，硬脂酸)、n-二十烷酸(C20，廿烷酸)、n-二十二烷酸(C22，山崳酸)、n-三十烷酸(C30)、n-四十烷酸(C40)、順-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)、所有順-Δ5，8，11，14-eicosatetraenoate(C20，花生四烯酸)、辛二酸、四癸二酸、八癸二酸、二十二烷二酸等。合適的脂肪酸酯包括含有線型或分支低級(jí)烷基基團(tuán)的二羧酸的單酯。較低級(jí)烷基基團(tuán)可包括1至大約12個(gè)，優(yōu)選的1至大約6個(gè)碳原子。
修飾的人類模擬體和配體結(jié)合片段可采用諸如，通過與一種或多種修飾劑反應(yīng)的合適方法制備。此處所用的術(shù)語“修飾劑”指包含活化基團(tuán)的合適有機(jī)基團(tuán)(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基團(tuán)”指可在適當(dāng)條件下與第二化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)，從而在上述修飾劑與第二化學(xué)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵的化學(xué)部分或功能基團(tuán)。例如，胺反應(yīng)性活化基團(tuán)包括親電子基團(tuán)，諸如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、鹵化(氯、溴、氟、碘)、N-羥琥珀酰亞胺酯(NHS)等?？膳c硫醇反應(yīng)的活化基團(tuán)包括，例如馬來酰亞胺、碘乙酰、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫羥-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能基團(tuán)可被偶聯(lián)至含有胺-或酰肼的分子上，且疊氮基團(tuán)可與三價(jià)磷基團(tuán)反應(yīng)，從而形成氨基磷酸酯或磷酰胺鍵。將活化基團(tuán)導(dǎo)入分子的合適方法是本領(lǐng)域已知的(見，例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，AcademicPressSan Diego，CA(1996))?；罨鶊F(tuán)可被直接結(jié)合至有機(jī)基團(tuán)(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通過接頭部分，例如二價(jià)C1-C12基團(tuán)實(shí)現(xiàn)結(jié)合，其中一個(gè)或多個(gè)碳原子可被諸如氧、氮或硫的雜原子取代。合適的接頭部分包括，例如四乙二醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。包含接頭部分的修飾劑可通過下述方法制備，即使單Boc(叔丁基)-烷基二胺(例如單Boc-乙烯二胺、單Boc-二氨基己烷)在1-乙基-3-(3-雙甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)的存在條件下與脂肪酸反應(yīng)，從而在自由胺與脂肪酸羧酸之間形成酰胺鍵。通過下述方法可從產(chǎn)物中除去Boc保護(hù)基團(tuán)，即采用三氟乙酸(TFA)處理，以暴露可與所述另一羧酸偶聯(lián)，或可與馬來酸酐反應(yīng)的伯胺，并使所獲產(chǎn)物環(huán)化，生成該脂肪酸被活化的馬來酰亞胺衍生物(見，例如Thompson，et al.，WO92/16221，其完整內(nèi)容被引入此處作為參考)。
本發(fā)明的修飾模擬體可通過使人類EPO模擬CH1缺失模擬體或配體結(jié)合片段與修飾劑反應(yīng)而得以生成。例如，通過應(yīng)用胺反應(yīng)性修飾劑，例如PEG的NHS酯，可以無位點(diǎn)特異性方式將有機(jī)部分結(jié)合至EPO模擬CH1缺失模擬體。修飾的人類模擬體或配體結(jié)合片段也可通過還原EPO模擬CH1缺失模擬體或配體結(jié)合片段的二硫鍵(例如鏈內(nèi)二硫鍵)而得以制備。隨后，可使還原的EPO模擬CH1缺失模擬體或配體結(jié)合片段與硫醇反應(yīng)性修飾劑反應(yīng)，以獲得本發(fā)明的修飾EPO模擬CH1缺失模擬體。通過采用合適方法，諸如反向蛋白水解(Fisch et al.，Bioconjugate Chem.，3147-153(1992)；Werlen et al.，Bioconjugate Chem.，5411-417(1994)；Kumaran et al.，ProteinSci.6(10)2233-2241(1997)；Itoh et al.，Bioorg.Chem.，24(1)59-68(1996)；Capellas et al.，Biotechnol.Bioeng.，56(4)456-463(1997))和Hermanson，G..T.，BioconjugateTechniques，Academic PressSan Diego，CA(1996)所描述的方法，可制備含有特定有機(jī)部分的修飾人類模擬體和配體結(jié)合片段，其中該特定有機(jī)部分被結(jié)合至本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的特定位點(diǎn)。
EPO模擬CH1缺失模擬體組合物本發(fā)明也提供了至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物，該組合物包含了此處所描述和/或本領(lǐng)域已知，以非天然存在組合物、混合物或形態(tài)被提供的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或更多模擬體或特定部分或其變體。該組合物的比例通過重量、體積、濃度、摩爾濃度，或本領(lǐng)域已知或此處所描述的液體或速干劑、混合物、懸液、乳劑或膠體形式的摩爾濃度表示。
該組合物可包括0.00001-99.9999％的重量、體積、濃度、摩爾濃度或本領(lǐng)域已知或此處所描述的液體、氣體或速干劑、混合物、懸液、乳劑或膠體形式的摩爾濃度，或其中的任意范圍或數(shù)值”，例如，但不僅限于0.00001、0.00003、0.00005、0.00009、0.0001、0.0003、0.0005、0.0009、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。因此，本發(fā)明的該組合物包括，但不僅限于0.00001-100mg/ml和/或0.00001-100mg/g。
該組合物可任選地進(jìn)一步包括選自至少一種抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于體液或電解液平衡的藥物、血液藥物、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)藥物、眼、耳或鼻用藥、局部用藥、營(yíng)養(yǎng)藥等藥物的有效量的至少一種化合物或蛋白質(zhì)。上述藥物均是本領(lǐng)域熟知的，包括此處所列各藥物的配方、適應(yīng)癥、劑量和施用(見，例如Nursing 2001Handbook of Drugs，21stedition，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001；HealthProfessional’s Drug Guide 2001，ed.，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，NJ；PharmcotherapyHandbook，Wells et al.，ed.，Appleton &Lange，Stamford，CT，均被完整引入此處作為參考)。
抗感染藥物可為選自殺阿米巴藥或至少一種抗原生動(dòng)物藥、驅(qū)腸蟲藥、抗真菌藥、抗瘧藥、抗結(jié)核藥或至少一種抗麻風(fēng)藥、氨基糖苷類藥、青霉素、頭孢菌素、四環(huán)素、磺胺、氟喹諾酮、抗病毒藥、大環(huán)內(nèi)酯抗感染藥、綜合性抗感染藥中的至少一種藥物。CV藥物可為選自變力性藥、抗心律不齊藥、防心絞痛藥、抗高血壓藥、抗血脂藥、綜合性心血管藥物中的至少一種藥物。CNS藥物可為選自非麻醉性鎮(zhèn)痛藥的至少一種藥物，或選自退熱劑、非類固醇抗炎癥藥物、麻醉藥中的至少一種藥物，或至少一種阿片樣鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜-催眠藥、抗驚厥藥、抗抑郁藥、抗焦慮藥、抗精神病藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激劑、抗帕金森病藥、綜合性中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物。ANS藥物可為選自膽堿能藥物(擬副交感神經(jīng)藥)、抗膽堿能藥、腎上腺素能藥(擬交感神經(jīng)藥)、腎上腺素能阻斷劑(抗交感神經(jīng)藥)、骨骼肌松弛藥、神經(jīng)肌肉阻斷劑中的至少一種藥物。呼吸道藥物可為選自抗組胺劑、支氣管舒張藥、祛痰劑中的至少一種藥物或至少一種鎮(zhèn)咳藥、綜合性呼吸藥物。GI道藥物可為選自抗酸劑的至少一種藥物，或至少一種吸附劑，或至少一種抗氣脹藥、消化酶或至少一種膽結(jié)石增溶劑、止瀉藥、輕瀉藥、止吐劑、抗?jié)兯帯＜に厮幬锟蔀檫x自皮質(zhì)激素類、雄激素中的至少一種藥物，或至少一種促同化激素類、雌激素或至少一種孕酮、促性腺激素、抗糖尿病藥物或至少一種胰高血糖素、甲狀腺激素類、甲狀腺激素類拮抗劑、垂體激素、類甲狀旁腺藥物。用于平衡體液和電解液的藥物可為選自利尿劑、電解質(zhì)中的至少一種藥物或至少一種置換溶液、酸化劑或至少一種堿化劑。血液藥物可為選自補(bǔ)血藥、抗凝血藥、血液衍生物、溶栓酶中的至少一種藥物?？鼓[瘤藥物可為選自烷基化藥物、抗代謝物、抗菌素抗腫瘤藥物、可改變激素平衡的抗腫瘤藥物、綜合性抗腫瘤藥物中的至少一種藥物。免疫調(diào)節(jié)藥物可為選自免疫抑制劑、疫苗中的至少一種藥物，或至少一種類毒素、抗毒素或至少一種抗蛇毒素、免疫血清、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物。眼、耳和鼻用藥可為選自眼科抗感染藥、眼科抗炎癥藥、縮瞳藥、擴(kuò)瞳藥、眼部血管收縮劑、綜合性眼、耳、鼻用藥中的至少一種藥物。局部用藥可為選自局部抗感染藥、抗疥螨劑中的至少一種藥物或至少一種抗虱劑、局部皮質(zhì)激素類。營(yíng)養(yǎng)藥可為選自維生素、礦物質(zhì)或熱質(zhì)中的至少一種藥物。見，例如上述Nursing 2001Drug Handbook中的內(nèi)容。
上述至少一種殺阿米巴藥或抗原生動(dòng)物藥可為選自阿托伐醌、鹽酸氯奎、磷酸氯奎、甲硝基羥乙唑、鹽酸甲硝基羥乙唑、戊烷脒羥乙基磺酸鹽中的至少一種藥物。上述至少一種驅(qū)腸蟲藥可為選自甲苯咪唑、雙羥萘酸喹嘧啶、噻苯咪唑中的至少一種藥物。上述至少一種抗真菌劑可為選自兩性霉素B、兩性霉素B膽固醇基硫酸鹽復(fù)合物、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合物、兩性霉素B脂質(zhì)體、氟康唑、氟胞嘧啶、微小尺寸灰黃霉素、超微小尺寸灰黃霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素、鹽酸特比萘芬中的至少一種藥物。上述至少一種抗瘧藥可為選自鹽酸氯奎、磷酸氯奎、強(qiáng)力霉素、硫酸羥化氯奎、鹽酸甲氟奎、磷酸伯氨喹、息瘧定、含周效磺胺的息瘧定中的至少一種藥物。上述至少一種抗結(jié)核藥或抗麻風(fēng)藥可為選自氯苯吩嗪、環(huán)絲氨酸、氨苯砜、鹽酸乙胺丁醇、異煙肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福噴汀、硫酸鏈霉素中的至少一種藥物。上述至少一種氨基糖苷類藥物可為選自硫酸丁胺卡那霉素、硫酸艮他霉素、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、硫酸妥布霉素中的至少一種藥物。上述至少一種青霉素可為選自阿莫西林/棒酸鉀、三水合阿莫西林、氨芐青霉素、氨芐青霉素鈉、三水合氨芐青霉素、氨芐青霉素鈉/舒巴坦鈉、鄰氯苯甲異惡唑青霉素鈉、二氯苯甲異惡唑青霉素鈉、美洛西林鈉、乙氧萘青霉素鈉、甲苯異惡唑青霉素鈉、芐星青霉素G、青霉素G鉀、青霉素G普魯卡因、青霉素G鈉、青霉素V鉀、氧哌嗪青霉素鈉、氧哌嗪青霉素鈉/他唑巴坦鈉、羧噻吩青霉素二鈉、羧噻吩青霉素二鈉/棒酸鉀中的至少一種。上述至少一種頭孢菌素可為選自至少一種氯頭孢菌素、頭孢羥氨、頭孢鈉素、頭孢地尼、鹽酸頭孢吡肟、頭孢克肟、氰唑甲氧頭孢鈉素、頭孢尼西鈉、氧哌羥苯唑頭鈉、頭孢噻肟鈉、頭孢雙硫唑甲氧二鈉、噻吩甲氧頭孢鈉素、頭孢泊肟酯、頭孢丙烯、頭孢噻甲羧肟、頭孢布坦、頭孢唑肟鈉、頭孢三嗪噻肟鈉、頭孢呋辛酯、頭孢呋辛鈉、鹽酸頭孢氨芐、一水合頭孢氨芐、頭孢環(huán)已烯、氯碳頭孢中的至少一種。上述至少一種四環(huán)素可為選自鹽酸地美環(huán)素、強(qiáng)力霉素鈣、doxycycline hyclate、doxycycline hydrochloride、一水合強(qiáng)力霉素、鹽酸米諾環(huán)素、鹽酸四環(huán)素中的至少一種。上述至少一種磺胺可為選自增效磺胺甲基異惡唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺二甲異惡唑、磺胺乙酰異惡唑中的至少一種。上述至少一種氟喹諾酮可為選自甲磺酸阿拉曲伐沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、左氧氟沙星、鹽酸洛美沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、司帕沙星、甲磺酸曲伐沙星中的至少一種。上述至少一種抗病毒藥物可為選自硫酸阿巴卡韋、無環(huán)鳥苷鈉、鹽酸金剛烷胺、安普那韋、西多福韋、甲磺酸地拉維定、去羥肌苷、依非韋倫、泛昔洛韋、福米韋生鈉、磷甲酸鈉、更昔洛韋、硫酸茚地那韋、拉米呋啶、拉米呋啶/齊多呋啶、甲磺酸奈非那韋、內(nèi)維拉平、磷酸奧司他韋、三氮唑核苷、鹽酸金剛乙胺、利托那韋、沙奎那維、甲磺酸沙奎那維、司他呋啶、鹽酸伐昔洛韋、扎西他濱、扎納米韋、齊多呋啶中的至少一種。上述至少一種大環(huán)內(nèi)酯抗感染藥可為選自阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素基質(zhì)、無味紅霉素、琥珀酸乙酯紅霉素、乳糖酸紅霉素、硬脂酸紅霉素中的至少一種。上述至少一種綜合抗感染藥可為選自氨曲南、桿菌肽、琥珀酸鈉氯霉素、鹽酸氯潔霉素、鹽酸氯潔霉素棕櫚酸酯、氯潔霉素磷酸酯、亞胺培南。和西司他丁鈉，、美羅培南、呋喃妥因大晶體、呋喃妥因微晶體、奎奴普丁/達(dá)福普汀、鹽酸壯觀霉素、三甲氧芐二氨嘧啶、鹽酸萬古霉素中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Drug Handbook中的24-214頁)。
上述至少一種變力性藥物可為選自乳酸氨聯(lián)吡啶酮、地高辛、乳酸米立農(nóng)中的至少一種。上述至少一種抗心律失常藥可為選自腺苷、鹽酸乙胺碘呋酮、硫酸阿托品、甲苯磺酸溴芐胺、鹽酸硫氮酮、雙異丙吡胺、磷酸雙異丙吡胺、鹽酸艾司洛爾、乙酸哌氟酰胺、富馬酸伊布利特、鹽酸利多卡因、鹽酸麥西雷丁、鹽酸莫雷西嗪、苯妥英、苯妥英鈉、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸普羅帕酮、鹽酸普奈洛爾、酸式硫酸奎尼定、葡萄糖酸奎尼定、聚半乳糖醛酸奎尼定、硫酸奎尼定、梭達(dá)羅、鹽酸妥卡尼、鹽酸異搏定中的至少一種。上述至少一種防心絞痛藥可為選自苯磺酸氨氯地平、亞硝酸戊酯、鹽酸芐普地爾、鹽酸硫氮酮、二硝酸異山梨醇酯、一硝酸異山梨醇酯、萘羥心安、鹽酸尼卡地平、硝苯吡啶、硝酸甘油、鹽酸心得安、異搏定、鹽酸異搏定中的至少一種。上述至少一種抗高血壓藥可為選自鹽酸醋丁酰心安、苯磺酸阿姆羅赫、氨酰心安、鹽酸貝那普利、鹽酸貝他洛爾、富馬酸比索洛爾、坎地沙坦酯、卡托普利、鹽酸山羊豆苷、卡維地洛、可樂寧、鹽酸可樂寧、二氮嗪、鹽酸硫氮酮、甲磺酸多沙唑嗪、依那普利拉、馬來酸依那普利、甲磺酸依普羅沙坦、非洛地平、甲磺酸非諾多泮、福辛普利鈉、醋酸氯壓胍、硫酸胍那決爾、鹽酸谷氨法新、鹽酸肼苯噠嗪、厄貝沙坦、伊拉地平、鹽酸柳胺芐心定、賴諾普利、氯沙坦鉀、甲基多巴、鹽酸甲基多巴鹽、琥珀酸美多心安、酒石酸美多心安、長(zhǎng)壓定、鹽酸莫昔普利、萘羥心安、鹽酸尼卡地平、硝苯吡啶、乳鏈菌肽、硝普鹽鈉、硫酸環(huán)戊丁心安、perindopril erbumine、甲磺酸芬托拉明、心得靜、鹽酸哌唑嗪、鹽酸普奈洛爾、鹽酸喹那普利、雷米普利、替米沙坦、鹽酸特拉唑嗪、馬來酸噻嗎心安、群多普利、纈沙坦、鹽酸異搏定中的至少一種。上述至少一種抗血脂藥可為選自阿托伐他汀鈣、西立伐他汀鈉、膽苯烯胺、鹽酸考來替泊、非諾貝特(微粉化)、氟伐他丁鈉、吉非貝齊、洛伐他汀、煙酸、普伐他汀鈉、辛伐他汀中的至少一種。上述至少一種綜合性CV藥物可為選自阿昔單抗.、前列地爾、鹽酸阿布他明、西洛他唑、二硫酸氯吡格雷、雙嘧哌胺醇、埃替非巴肽、鹽酸甲氧胺福林、己酮可可堿、鹽酸噻氯匹定、鹽酸替羅非班中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Drug Handbook中的215-336頁)。
上述至少一種非麻醉性鎮(zhèn)痛藥或退熱劑可為選自醋氨酚、阿司匹林、三水楊酸膽堿鎂、二氟苯水楊酸、水楊酸酶中的至少一種。上述至少一種非甾族抗炎癥藥物可為選自塞來昔布、環(huán)氟拉嗪鉀、環(huán)氟拉嗪鈉、伊托多雷、苯氧苯丙酸鈣、氟聯(lián)苯丙酸、異丁苯丙酸、茚甲新、三水合茚甲新鈉、酮丙酸、酮咯酸氨丁三醇、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸鈉、丙嗪、吡氧噻嗪、羅非昔布、舒林酸中的至少一種。上述至少一種麻醉藥或阿片樣鎮(zhèn)痛藥可為選自鹽酸阿芬太尼、鹽酸丁丙諾啡、酒石酸布托啡諾、磷酸可待因、硫酸可待因、枸櫞酸芬太尼、芬太尼經(jīng)皮系統(tǒng)、芬太尼跨粘膜、鹽酸二氫嗎啡酮、度冷丁、鹽酸美沙酮、鹽酸嗎啡、硫酸嗎啡、酒石酸嗎啡、鹽酸環(huán)丁甲羥氫嗎啡、鹽酸羥基二氫可待因酮、梳狀1，4-羥基二氫可待因酮、鹽酸氧嗎啡酮、鹽酸鎮(zhèn)痛新、鹽酸鎮(zhèn)痛新和鹽酸納絡(luò)酮、乳酸鎮(zhèn)痛新、鹽酸丙氧吩、萘磺酸丙氧吩、鹽酸瑞芬太尼、檸檬酸舒芬太尼、鹽酸曲馬多中的至少一種。上述至少一種鎮(zhèn)痛藥-催眠藥可為選自水合氯醛、三唑氮、鹽酸氟胺安定、戊巴比妥、戊巴比妥鈉、苯巴比妥鈉、司可巴比妥鈉、雙香豆素、三唑苯二氮、扎萊普隆、酒石酸唑吡坦中的至少一種。上述至少一種抗驚厥藥可為選自醋唑磺胺鈉、卡馬西平、氯硝安定、氯氮二鉀、安定、雙丙戊酸鈉、乙琥胺、磷苯妥英鈉、加巴噴丁、拉莫三嗪、硫酸鎂、苯巴比妥、苯巴比妥鈉、苯妥英、苯妥英鈉、苯妥英鈉(稀釋)、普里米酮、鹽酸替加賓、托吡酯、丙戊酸鈉、丙戊酸中的至少一種。上述至少一種抗抑郁藥可為選自鹽酸阿米替林、雙羥萘酸阿米替林、氯哌氧、鹽酸丁氨苯丙酮、氫溴酸西酞普蘭、鹽酸氯米帕明、鹽酸脫甲丙咪嗪、鹽酸多慮平、鹽酸氟西汀、鹽酸丙咪嗪、雙羥萘酸丙咪嗪、米氮平、鹽酸奈法唑酮、鹽酸去甲替林、鹽酸帕羅西汀、硫酸苯乙肼、鹽酸舍曲林、硫酸反苯環(huán)丙胺、馬來酸三甲丙咪嗪、鹽酸萬拉法新中的至少一種。上述至少一種抗焦慮藥可為選自阿普唑侖、鹽酸丁螺旋酮、甲氨二氮、鹽酸甲氨二氮、氯氮二鉀、安定、鹽酸多慮平、雙羥萘酸羥嗪、鹽酸羥嗪、雙羥萘酸羥嗪、氯羥安定、mephrobamate、鹽酸咪達(dá)唑侖、去甲羥安定中的至少一種。上述至少一種抗精神病藥可為選自鹽酸氯丙嗪、氯氮平、癸酸氟非那嗪、庚酸氟非那嗪、鹽酸氟非那嗪、氟哌啶醇、癸酸氟哌啶醇、乳酸氟哌啶醇、鹽酸克塞平、琥珀酸克塞平、苯磺酸甲砜噠嗪、鹽酸莫林酮、奧氮平、奮乃靜、哌迷清、普魯氯嗪、富馬酸喹硫平、利培酮、鹽酸甲硫噠嗪、氨砜噻噸、鹽酸氨砜噻噸、鹽酸三氟啦嗪中的至少一種。上述至少一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激劑可為選自硫酸安非他明、咖啡堿、硫酸右旋安非他明、鹽酸嗎吡啉酮、鹽酸脫氧麻黃堿、鹽酸利他林、莫達(dá)非尼、佩默林、鹽酸苯丁胺中的至少一種。上述至少一種抗帕金森病藥可為選自鹽酸金剛胺、甲磺酸苯托品、鹽酸比哌立登、乳酸比哌立登、甲磺酸溴麥角環(huán)肽、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、左旋多巴、甲磺酸培高利特、二鹽酸普拉克索、鹽酸羅匹尼羅、鹽酸司來吉蘭、托卡朋、鹽酸三己芬迪中的至少一種。上述至少一種綜合性中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物可為選自鹽酸丁氨苯丙酮、鹽酸多奈哌齊、達(dá)哌啶醇、馬來酸氟伏沙明、碳酸鋰、檸檬酸鋰、鹽酸納雷曲坦、nicotine polacrilex(一種戒煙口香糖的活性成分)、煙堿經(jīng)皮系統(tǒng)、異丙酚、苯甲酸利扎曲普坦、鹽酸西布曲明、琥珀酸舒馬普坦、鹽酸塔克林、佐米曲普坦中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Drug Handbook中的337-530頁)
上述至少一種膽堿能藥(例如擬副交感神經(jīng)藥)可為選自氯化氨甲酰甲膽堿、氯化滕西隆、溴化新斯的明、甲基硫酸新斯的明、水楊酸毒扁豆堿、溴化3-二甲氨基甲酰氧基-1甲基吡啶中的至少一種。上述至少一種抗膽堿能藥可為選自硫酸阿托品、鹽酸雙環(huán)胺、胃長(zhǎng)寧、茛菪堿、硫酸茛菪堿、溴化丙胺太林、東茛菪堿、丁基溴化東茛菪堿、氫溴化東莨菪堿中的至少一種。上述至少一種腎上腺素能藥(擬交感神經(jīng)藥)可為選自鹽酸多巴酚丁胺、鹽酸多巴胺、酸式酒石酸間羥胺、酸式酒石酸去甲腎上腺素、鹽酸苯腎上腺素、鹽酸假麻黃堿、硫酸假麻黃堿中的至少一種。上述至少一種腎上腺素能阻斷劑(抗交感神經(jīng)藥)可為選自甲磺酸雙氫麥角胺、酒石酸麥角胺、馬來酸二甲麥角新堿、鹽酸普奈洛爾中的至少一種。上述至少一種骨骼肌松弛劑可為選自氯苯氨丁酸、肌安寧、氯羥苯唑、鹽酸環(huán)苯扎林、硝苯呋海因鈉、氨甲酸愈甘醚酯、鹽酸替扎尼定中的至少一種。上述至少一種神經(jīng)肌肉阻斷劑可為選自苯磺酸阿曲庫銨、苯磺酸順阿曲庫銨、多庫氯銨、米庫氯銨、泮庫溴銨、哌庫溴銨、雷庫溴銨、羅庫溴銨、氯琥珀膽堿、氯化筒箭毒堿、維庫溴銨中的至少一種。(見，例如Nuring 2001DrugHandbook中的531-84頁)。
上述至少一種抗組胺劑可為選自馬來酸溴苯吡胺、鹽酸西替利嗪、馬來酸氯苯吡胺、富馬酸鐵線蓮?fù)?、鹽酸二苯環(huán)庚啶、鹽酸苯海拉明、鹽酸非索非那定、氯雷他定、鹽酸異丙嗪、茶異丙嗪、鹽酸丙吡咯啶中的至少一種。上述至少一種支氣管擴(kuò)張藥可為選自舒喘寧、硫酸舒喘寧、氨茶堿、硫酸阿托品、硫酸麻黃堿、腎上腺素、酒石酸氫腎上腺素、鹽酸腎上腺素、異丙托溴銨、異丙基腎上腺素、鹽酸異丙基腎上腺素、硫酸異丙基腎上腺素、鹽酸左旋沙丁胺醇、硫酸異丙喘寧、膽茶堿、醋酸吡布特羅、羥萘甲酸沙美特羅、硫酸特普他林、茶堿中的至少一種。上述至少一種祛痰劑或鎮(zhèn)咳藥可為選自退咳露、磷酸可待因、硫酸可待因、氫溴酸右美沙芬、鹽酸苯海拉明、愈創(chuàng)木酚甘油醚、鹽酸二氫嗎啡酮中的至少一種。上述至少一種綜合性呼吸藥物可為選自乙酰半胱氨酸、二丙酸氯地米松、beractant、布地奈德、calfactant、色甘酸鈉、鏈道酶α、前列腺環(huán)素鈉、9-去氟膚輕松、丙酸氟替卡松、孟魯司特鈉、奈多羅米鈉、帕利珠單抗、丙炎松、扎魯司特、齊留通中的至少一種。(見Nursing 2001Drug Handbook中的585-642頁)上述至少一種抗酸劑、吸附劑或抗氣脹藥可為選自碳酸鋁、氫氧化鋁、碳酸鈣、氫氧化鎂鋁、氫氧化鎂、氧化鎂、二甲基硅油、碳酸氫鈉中的至少一種。上述至少一種消化酶或膽結(jié)石增溶劑可為選自胰酶、胰脂肪酶、脫氧熊膽酸中的至少一種。上述至少一種止瀉藥可為選自硅鎂土、堿式水楊酸鉍、聚卡波非鈣、鹽酸氰苯哌酯或硫酸阿托品、洛哌丁胺、醋酸奧曲肽、阿片酊、阿片酊(含樟腦)中的至少一種。上述至少一種抗糖尿病藥或胰高血糖素可為選自阿卡波糖、氯磺丙脲、谷胱甘肽、格列甲嗪、胰高血糖素、優(yōu)降糖、胰島素、鹽酸甲福明二甲雙胍、米格列醇、鹽酸吡咯列酮、瑞格列奈、馬來酸羅格列酮、曲格列酮中的至少一種。上述至少一種甲狀腺激素可為選自左旋甲狀腺素鈉、碘甲腺氨酸鈉、復(fù)方甲狀腺素、干甲狀腺粉中的至少一種。上述至少一種甲狀腺激素拮抗劑可為選自甲疏咪唑、碘化鉀、碘化鉀(飽和溶液)、丙硫尿嘧啶、放射性碘(碘化鈉131I)、濃碘溶液中的至少一種。上述至少一種垂體激素可為選自促腎上腺皮質(zhì)激素、α1-24促腎上腺皮質(zhì)激素、desmophressin acetate、乙酸亮脯利特、長(zhǎng)效促腎上腺皮質(zhì)激素、人蛋氨生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)激素、加壓素中的至少一種。上述至少一種類甲狀旁腺藥物可為選自骨化二醇、降鈣素(人類)、降鈣素(鮭魚)、鈣三醇、二氫速甾醇、依替膦酸鈉中的至少一種。(見，例如Nursing 20001Drug Handbook中的696-796頁)上述至少一種利尿劑可為選自乙酰唑(磺)胺、乙酰唑(磺)胺鈉、鹽酸氨氯吡脒、丁苯氧酸、氯噻酮、利尿酸鈉、利尿酸、利尿磺胺、雙氫氯噻嗪、茚磺苯酰胺、甘露醇、美拉托宗、安體舒通、托拉塞米、三氨苯蝶啶、脲中的至少一種。上述至少一種電解質(zhì)或置換溶液可為選自乙酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、磷酸鈣(二元)、磷酸鈣(三元)、葡聚糖(高分子量)、萄聚糖(低分子量)、羥乙基淀粉、氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鉀、碳酸氫鉀、氯化鉀、葡萄糖酸鉀、Ringer氏注射液、Ringers氏注射液(乳酸化)、氯化鈉中的至少一種。上述至少一種酸化劑或堿化劑可為選自碳酸氫鈉、乳酸鈉、氨基丁三醇中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Drug Handbook中的797-833頁)上述至少一種補(bǔ)血藥可為選自富馬酸鐵、葡萄糖酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸亞鐵(干燥)、右旋糖酐鐵、山梨醇鐵、多糖-鐵復(fù)合物、葡萄糖酸鐵鈉復(fù)合物中的至少一種。上述至少一種抗凝血?jiǎng)┛蔀檫x自阿地肝素鈉.、達(dá)肝素鈉、達(dá)那肝素鈉、依諾肝素鈉、肝素鈣、肝素鈉、芐丙酮香豆素鈉中的至少一種。上述至少一種血液衍生物可為選自白蛋白5％、白蛋白25％、抗血友病因子、抗抑制劑促凝劑復(fù)合物、抗凝血酶III(人類)、IX因子(人類)、IX因子復(fù)合物、血漿蛋白組分中的至少一種。上述至少一種溶血栓藥可為選自阿替普酶、阿尼鏈酶、瑞替普酶(重組)、鏈激酶、尿激酶中的至少一種。(見，例如Nursing2001Drug Handbook中的834-66頁)上述至少一種烷基化藥物可為選自白消安、卡鉑、卡氮芥、苯丁酸氮芥、順氯氨鉑、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、環(huán)己亞硝脲、鹽酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、鹽酸苯丙氨酸氮芥、鏈脲霉素、替莫唑胺、硫替派中的至少一種。上述至少一種抗代謝物可為選自卡培他濱、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟苷、磷酸氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、羥基脲、巰基嘌呤、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤鈉、硫鳥嘌呤中的至少一種。上述至少一種抗生素抗腫瘤藥物可為選自硫酸博萊霉素、放線菌素D、檸檬酸柔紅霉素脂質(zhì)體、鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、鹽酸阿霉素脂質(zhì)體、鹽酸表柔比星、鹽酸伊達(dá)比星、絲裂霉素、戊糖苷、普卡霉素、valrubicin中的至少一種。上述至少一種可改變激素平衡的抗腫瘤藥物可為選自阿那曲唑、比卡魯胺、雌二醇氮芥磷酸鈉、依西美坦、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、來曲唑、乙酸亮脯利特、醋酸甲地孕酮、尼魯米特、檸檬酸三苯氧胺、睪內(nèi)脂、枸櫞酸托瑞米芬中的至少一種。上述至少一種綜合性抗腫瘤藥物可為選自天冬酰胺酶、桿菌Calmette-Guerin(BCG)(活體膀胱內(nèi))、氮烯咪胺、多烯紫杉醇、鬼臼乙叉苷、磷酸鬼臼乙叉苷、鹽酸吉西他濱、鹽酸伊立替康、鄰氯苯對(duì)氯苯二氯乙烷、鹽酸米托蒽醌、紫杉醇、培加帕酶、卟吩姆鈉、鹽酸甲基下肼、利妥昔單抗、替尼泊甙、鹽酸拓?fù)涮婵?、曲妥珠單抗、全反維生素A酸、硫酸長(zhǎng)春花堿、硫酸長(zhǎng)春花新堿、酒石酸長(zhǎng)春瑞賓，中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Drug Handbook中的867-963頁)上述至少一種免疫抑制劑可為選自硫唑嘌呤、巴利昔單抗、環(huán)孢霉素、達(dá)克珠單抗、淋巴細(xì)胞免疫球蛋白、莫羅單抗-CD3、霉酚酸嗎啉乙酯、鹽酸霉酚酸嗎啉乙酯、西羅莫司、他克莫司中的至少一種。上述至少一種疫苗或類毒素可為選自BCG疫苗、霍亂疫苗、白喉和破傷風(fēng)類毒素(吸附型)、白喉和破傷風(fēng)類毒素和非細(xì)胞百日咳疫苗吸附型、白喉和破傷風(fēng)類毒素和全細(xì)胞百日咳疫苗、b型嗜血桿菌結(jié)合疫苗、甲型肝炎疫苗(滅活)、乙型肝炎疫苗(重組)、流感病毒疫苗1999-2000三聯(lián)型A&B(純化的表面抗原)、流感病毒疫苗1999-2000三聯(lián)型A&B(亞病毒體或純化的亞病毒體)、流感病毒疫苗1999-2000三聯(lián)型A&B(全病毒體)、日本腦炎病毒疫苗(滅活)、Lyme氏疏螺旋體病疫苗(重組OspA)、麻疹和腮腺炎和風(fēng)疹病毒疫苗(活)、麻疹和腮腺炎和風(fēng)疹病毒疫苗(減活)、麻疹病毒疫苗(減活)、腦膜炎雙球菌多糖菌苗、腮腺炎病毒疫苗(活)、鼠疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多聯(lián))、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(滅活)、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(活、口服、三聯(lián))、狂犬病疫苗(吸附型)、狂犬病疫苗(人類二倍體細(xì)胞)、風(fēng)疹和腮腺炎病毒疫苗(活)、風(fēng)疹病毒疫苗(活、減活)、破傷風(fēng)類毒素(吸附型)、破傷風(fēng)類毒素(液體)、傷寒疫苗(口服)、傷寒疫苗(腸胃外施用)、傷寒Vi多糖疫苗、水痘病毒疫苗、黃熱病疫苗中的至少一種。上述至少一種抗毒素或抗蛇毒素可為選自黑寡婦蜘蛛抗蛇毒素、響尾蛇科抗蛇毒素(多聯(lián))、白喉抗毒素(馬)、金黃珊瑚蛇毒血清)中的至少一種。上述至少一種免疫血清可為選自巨細(xì)胞病毒免疫球蛋白(靜脈內(nèi))、乙型肝炎免疫球蛋白(人類)、免疫球蛋白肌肉內(nèi)、免疫球蛋白靜脈內(nèi)、狂犬病免疫球蛋白(人類)、呼吸道合胞病毒免疫球蛋白靜脈內(nèi)(人類)、Rho(D)免疫球蛋白(人類)、Rho(D)免疫球蛋白靜脈內(nèi)(人類)、破傷風(fēng)免疫球蛋白(人類)、水痘-帶狀皰疹免疫球蛋白中的至少一種。上述至少一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物可為選自阿地流津、依泊艾汀α、非拉司汀、注射用glatiramer acetate、干擾素alfacon-1、干擾素α-2a(重組)、干擾素α-2b(重組)、干擾素β-1a、干擾素β-1b(重組)、干擾素γ-1b、鹽酸左旋四咪唑、重組人白介素11、沙格司亭中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Drug Handbook中的964-1040頁)上述至少一種眼科抗感染藥可選自桿菌肽、氯霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、紅霉素、硫酸艮他霉素、吡啶羧酶0.3％、硫酸多粘菌素B、磺胺醋酰鈉10％、磺胺醋酰鈉15％、磺胺醋酰鈉30％、托普霉素、阿糖腺苷中的至少一種。上述至少一種眼科抗炎癥藥可為選自地塞米松、地塞米松磷酸鈉、二氯苯胺苯乙酸鈉0.1％、氯甲龍、氟比洛芬鈉、酮咯酸氨丁三醇、醋酸強(qiáng)的松龍(懸液)、強(qiáng)的松龍磷酸鈉(溶液)中的至少一種。上述至少一種縮瞳劑可為選自氯乙酰膽堿、氨甲酰膽堿(眼內(nèi))、氨甲酰膽堿(局部)、依可碘酯、毛果蕓香堿、鹽酸毛果蕓香堿、硝酸毛果蕓香堿中的至少一種。上述至少一種擴(kuò)瞳劑可為選自硫酸阿托品、鹽酸環(huán)戊通、鹽酸腎上腺素、硼酸腎上腺素、氫溴酸后馬托品、鹽酸苯腎上腺素、氫溴酸東莨菪堿、托品酰胺中的至少一種。上述至少一種眼血管收縮劑可為選自鹽酸萘唑啉、鹽酸羥間唑啉、鹽酸四氫萘唑啉中的至少一種。上述至少一種綜合性眼藥可為選自鹽酸阿可樂定、鹽酸倍他洛爾、酒石酸溴莫尼定、鹽酸山羊豆苷、鹽酸地匹福林、鹽酸杜塞酰胺、富馬酸依美斯汀、熒光素鈉、延胡索酸甲哌噻庚酮、拉坦前列素、鹽酸左布諾洛爾、鹽酸美替卜拉格、氯化鈉(高滲)、馬來酸噻嗎心安中的至少一種。上述至少一種耳用藥可為選自硼酸、過氧化氫脲、氯霉素、油酸三乙醇胺多肽-冷凝液中的至少一種。上述至少一種鼻用藥可為選自二丙酸氯地米松、布地奈德、硫酸麻黃堿、鹽酸腎上腺素、9-去氟膚輕松、丙酸氟替卡松、鹽酸萘唑啉、鹽酸羥間唑啉、鹽酸苯腎上腺素、鹽酸四氫萘唑啉、丙炎松、鹽酸丁芐唑啉中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Drug Handbook中的1041-97頁)上述至少一種局部抗感染藥可為選自無環(huán)鳥苷、兩性霉素B、壬二酸乳脂、桿菌肽、硝酸布康唑、磷酸氯林肯霉素、克霉唑、硝酸益康唑、紅霉素、硫酸艮他霉素、酮康唑、醋酸高磺胺、甲硝基羥乙唑(局部)、硝酸霉抗唑、莫匹羅星、鹽酸萘替芬、硫酸新霉素、硝基糖腙、制霉菌素、磺胺嘧啶銀、鹽酸特比奈酚、特康唑、鹽酸四環(huán)素、噻康唑、發(fā)癬退中的至少一種。上述至少一種抗疥螨劑或抗虱劑可為選自克羅他米通、林丹、芐氯菊脂、除蟲菊酯中的至少一種。上述至少一種局部皮質(zhì)類固醇可為選自雙丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯氟美松、丙縮羥強(qiáng)龍、去氧米松、地塞米松、地塞米松磷酸鈉、.雙醋二氟松、丙酮膚輕松、氟新諾龍酯、氟氫縮松、丙酸氟替卡松、halcionide、氫化可的松、醋酸氫化可的松、丁酸氫化可的松、戊酸氫化可的松、糠酸莫美他松、丙炎松中的至少一種。(見，例如Nursing2001Drug Handbook中的1098-1136頁)
上述至少一種微生物或礦物質(zhì)可為選自維生素A、復(fù)合維生素B、氰鈷胺素、葉酸、羥鈷胺素、甲酰四氫葉酸鈣、煙酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素C、維生素D、膽鈣化醇、麥角鈣化醇、維生素D類似物、度骨化醇、帕利骨化醇、維生素E、維生素K類似物、維生素K1、氟化鈉、氟化鈉(局部)、痕量元素、鉻、銅、碘、錳、硒、鋅中的至少一種。上述至少一種熱質(zhì)可為選自氨基酸浸劑(晶狀)、右旋糖中的氨基酸浸劑、含電解質(zhì)的氨基酸浸劑、右旋糖中含電解質(zhì)的氨基酸浸劑、針對(duì)肝衰竭的氨基酸浸劑、針對(duì)高代謝壓力的氨基酸浸劑、針對(duì)腎衰竭的氨基酸浸劑、右旋糖、脂肪乳濁液、中鏈脂肪酸甘油三酯中的至少一種。(見，例如Nursing 2001DrugHandbook中的1137-63頁)本發(fā)明CH1缺失模擬體抗體或多肽組合物可進(jìn)一步包含任何合適的和/或有效量的特定組合物或藥物組合物中的至少一種，該特定組合物或藥物組合物包含了對(duì)需要上述調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者施用的至少一種CH1缺失模擬體蛋白或抗體，該特定組合物或藥物組合物任選地進(jìn)一步包含了選自至少一種TNF拮抗劑(例如，但不僅限于TNF化學(xué)或蛋白質(zhì)拮抗劑、TNF單克隆或多克隆抗體或片段、可溶TNF受體(例如p55、p70或p85)或片段、其融合多肽，或小分子TNF拮抗劑，例如TNF結(jié)合蛋白I或II(TBP-1或TBP-II)、nerelimonmab、英利昔單抗、enteracept、CDP-571、CDP-870、阿非莫單抗、來那西普.等)、抗風(fēng)濕藥(例如，氨甲蝶呤、醋硫葡金、金硫代葡萄糖、硝基咪唑硫嘌呤、依那西普、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥基氯奎、來氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛劑、麻醉藥、非類固醇抗炎癥藥物(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗菌劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生蟲藥、抗病毒藥物、氨基甲酰、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺、四環(huán)素、其它抗菌劑)、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、糖尿病相關(guān)藥物、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、甲狀腺藥物、維生素、鈣相關(guān)激素、止瀉藥、鎮(zhèn)咳藥、止吐劑、抗?jié)兯?、輕瀉劑、抗凝血?jiǎng)?、促紅細(xì)胞生成素(例如依泊艾汀α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗、環(huán)胞多肽、達(dá)克珠單抗)、生長(zhǎng)激素、激素取代藥物、雌激素受體調(diào)節(jié)物、擴(kuò)瞳劑、睫狀肌麻痹藥、烷基化藥物、抗代謝物、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑郁藥、抗躁狂劑、抗精神病藥、抗焦慮藥、催眠藥、擬交感神經(jīng)藥、興奮劑、多奈哌齊、塔克林、哮喘藥、β增效劑、吸入型類固醇、白細(xì)胞三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸、腎上腺素或類似物、鏈球菌DNA酶α(Pulmozyme)、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑中的至少一種。上述細(xì)胞因子的非限制性實(shí)例包括，但不僅限于IL-1-IL-23中的任意一種。合適劑量是本領(lǐng)域熟知的。見，例如Wells etal.，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2ndEdition，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，LomaLinda，CA(2000)，上述參考文獻(xiàn)均被完整引入此處，作為參考。
上述組合物也可包括與本發(fā)明至少一種抗體或多肽締合、結(jié)合、協(xié)同配制或協(xié)同施用的毒素分子。該毒素可任選地起選擇性殺死病理細(xì)胞或組織的作用。該病理細(xì)胞可為癌細(xì)胞或其它細(xì)胞。該毒素可以是，但不僅限于包含了特定毒素的至少一個(gè)功能性細(xì)胞毒素區(qū)的純化或重組毒素或毒素片段，該特定毒素選自例如，至少一種蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或細(xì)菌毒素之一。術(shù)語毒素也包括由任何可在人類和其它哺乳動(dòng)物中引起包括中毒性休克在內(nèi)的病理狀況，并可導(dǎo)致死亡的天然存在、突變或重組細(xì)菌或病毒所生成的內(nèi)毒素和外毒素。該毒素可包括，但不僅限于產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)、熱穩(wěn)定腸毒素(ST)、志賀菌細(xì)胞毒素、氣單胞菌腸毒素、中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌腸毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、鏈球菌腸毒素等。上述細(xì)菌包括，但不僅限于產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)、致腸出血大腸桿菌(例如血清型0157H7的菌株)、葡萄球菌種(例如金黃色葡萄球菌、釀膿葡萄球菌)、志賀菌種(例如志賀氏痢疾桿菌、福氏志賀桿菌、波伊德氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏桿菌)、沙門氏菌種(例如傷寒桿菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌)、梭狀芽胞桿菌種(例如產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌、艱難桿菌、肉毒桿菌)、彎曲桿菌種(例如空腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌)、螺桿菌種(例如幽門螺桿菌)、氣單胞菌種(例如，溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌)、類志賀鄰單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、弧菌種(例如霍亂弧菌、副溶血性弧菌)、克雷白桿菌種、銅綠假單胞菌和鏈球菌。見，例如Stein，ed.，INTERNAL MEDICINE，3rded.，pp1-13，Little，Brown and Co.，Boston，(1990)；Evanset al.，eds.，Bacterial Infections of Humans；Epidemiology andControl，2d.Ed.，pp 239-254，Plenum Medical Book Co.，New York(1991)；Mandell et al.，Principles and Practice of InfectiousDiseases，3d.Ed.，Churchill Livingstone，New York(1990)；Berkow et al.，eds.，The Merck Manual，16thedition，Merck andCo.，Rahway，N.J.，1992；Wood et al.，F(xiàn)EMS MicrobiologyImmunology，76121-134(1991)；Marrack et al.，Science，248705-711(1990)，上述參考文獻(xiàn)的內(nèi)容均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物可進(jìn)一步包括至少一種任意的合適輔助物，例如，但不僅限于稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、鹽、親脂溶劑、防腐劑、佐劑等。藥物學(xué)可接受輔助物是優(yōu)選的。上述無菌溶液的非限制性實(shí)例及制備方法均是本領(lǐng)域熟知的，例如，但不僅限于Gennaro，Ed.，Remington’sPharmaceutical Sciences，18thEdition，Mack Publishing Co.(Eas ton，PA)1990。通過本領(lǐng)域熟知和/或此處描述的常規(guī)方法可選擇出與EPO模擬CH1缺失模擬體組合物的施用方式、溶解度和/或穩(wěn)定性相配的藥物學(xué)可接受載體。
在本發(fā)明組合物中有用的藥物賦形劑和添加劑包括，但不僅限于可單獨(dú)或以組合形式存在，包括單獨(dú)或在組合中以1-99.99％重量或體積比例存在的蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)和糖類(例如，糖、包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，諸如糖醇、糖醛酸、酯化糖等；多糖或糖類聚合物)。蛋白質(zhì)賦形劑的實(shí)例包括血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白(HSA)、重組人類白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等。也可發(fā)揮緩沖作用的代表性氨基酸/EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰苯丙氨酸甲酯等。一種優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸。
適用于本發(fā)明的糖類賦形劑包括，例如，單糖，諸如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，諸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，諸如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，諸如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等。適用于本發(fā)明的優(yōu)選糖類賦形劑為甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
EPO模擬CH1缺失模擬體組合物也可包括緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑；典型的緩沖劑是從有機(jī)酸或堿制備而得的鹽。代表性緩沖劑包括有機(jī)酸鹽，諸如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的鹽；Tris、鹽酸三羥甲基氨基甲烷或磷酸鹽緩沖劑。適用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選緩沖劑為有機(jī)酸鹽，諸如檸檬酸鹽。
另外，本發(fā)明的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物可包括聚合的賦形劑/添加劑，諸如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(一種聚合糖)、葡萄糖結(jié)合劑(例如環(huán)糊精，諸如2-羥丙基-β環(huán)糊精)、聚乙二醇、調(diào)味劑、抗菌劑、甜味劑、抗氧劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如聚山梨醇酯，諸如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂質(zhì)(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)和螯合劑(例如EDTA)。
適用于本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體組合物的上述及其它已知藥物賦形劑和/或添加劑均是本領(lǐng)域已知的，例如在“RemingtonTheScience&Practice of Pharmacy”，19thed.，Williams&Williams，(1995)，和在“Physician’s Desk Reference”，52nded.，MedicalEconomics，Montvale，NJ(1998)中所列出的藥物賦形劑和/或添加劑，上述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均被完整引入此處作為參考。優(yōu)選的載體或賦形劑材料為糖類(例如糖類和糖醇)和緩沖劑(例如檸檬酸鹽)或聚合劑。
配方如上所述，本發(fā)明提供了穩(wěn)定配方，該配方可優(yōu)選地包括含鹽水或特定鹽的合適緩沖劑，和任選的含有防腐劑，以及適合藥用或獸醫(yī)用途的多用途防腐配方的防腐溶液和配方，并包含了藥物學(xué)可接受配方形式的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。防腐配方含有至少一種已知的防腐劑，或選自下列的任選防腐劑，即至少一種苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氨丁醇、氯化鎂(例如六水合物)、烷基對(duì)羥基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、殺藻胺、氯化芐乙氧銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或上述物質(zhì)在水性稀釋劑中的混合物?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的知識(shí)應(yīng)用任意合適的濃度或混合物，諸如0.001-5％，或其中的任意范圍或數(shù)值，例如，但不僅限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任意范圍或數(shù)值。非限制性實(shí)例包括，非代表性的0.1-2％m-甲酚(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005、0.01％)、0.001-2.0％苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％烷基對(duì)羥基苯甲酸(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上所述，本發(fā)明提供了一種制品，該制品包括包裝材料和至少一個(gè)含有特定溶液的小瓶，該特定溶液含有至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體和上述緩沖劑和/或防腐劑，并任選地為水性稀釋液形式，其中上述包裝材料包括標(biāo)示了上述溶液可保存超過1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間段的標(biāo)簽。本發(fā)明進(jìn)一步包括一種制品，該制品包括包裝材料、含至少一種凍干EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的第一個(gè)小瓶，和含有上述緩沖劑或防腐劑的水性稀釋液的第二個(gè)小瓶，其中上述包裝材料包括一個(gè)標(biāo)簽，可向患者說明如何將至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體重新混入水性稀釋液中，并從而形成可保存超過24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間段的溶液。
根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可通過重組途徑，包括從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因制品中制備，或者可從此處所描述或本領(lǐng)域已知的其它生物學(xué)來源純化獲得。
在本發(fā)明的產(chǎn)品中，至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的數(shù)量范圍包括在濕/干體系中的情況下，在復(fù)原基礎(chǔ)上可獲得大約1.0ug/ml-大約1000mg/ml濃度的量，但較低和較高濃度也是可行的，并取決于特定送遞載體，例如溶液配方不同于經(jīng)皮藥帖、肺、跨粘膜，或滲透或微量泵法。
優(yōu)選地，上述水性稀釋液任選地進(jìn)一步包括藥物學(xué)可接受防腐劑。優(yōu)選的防腐劑包括選自下列的防腐劑，即苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、殺藻胺、氯化芐乙氧銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或上述物質(zhì)的混合物。應(yīng)用在本發(fā)明配方中的防腐劑濃度是足以產(chǎn)生抗微生物效果的濃度。該濃度取決于所選防腐劑，且技術(shù)人員可容易地測(cè)定該濃度。
其它賦形劑，例如等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐增強(qiáng)劑，均可被任選和優(yōu)選地加入上述稀釋液中。等滲劑，如甘油，通常采用其已知濃度。生理可耐受緩沖劑被優(yōu)選加入，以改善pH控制。本發(fā)明配方可覆蓋大范圍的pH，諸如大約pH4-大約pH10，優(yōu)選的范圍是大約pH5-大約pH9，最為優(yōu)選的范圍是大約pH6.0-大約pH8.0。本發(fā)明配方的優(yōu)選pH值在大約6.8-大約7.8之間。優(yōu)選的緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑，最為優(yōu)選的是磷酸鈉，尤其是磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
其它添加劑，諸如藥物學(xué)可接受增溶劑，如Tween 20(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯)、Tween 40(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐單棕櫚酸酯)、Tween 80(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、Fluronic F68(聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯20或80或聚羥亞烴184或188，Pluronicpolyls、其它嵌段共聚物，和諸如EDTA和EGTA的螯合劑，均可被任選地加入本發(fā)明配方或組合物中，以減少凝聚。當(dāng)采用泵或塑料容器施用本發(fā)明配方時(shí)，上述添加劑尤其有效。藥物學(xué)可接受表面活性劑的存在減低了蛋白質(zhì)凝聚的傾向。
本發(fā)明配方可通過特定方法制備，該方法包括將至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體與選自下列之一的防腐劑混合，即苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、殺藻胺、氯化芐乙氧銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或上述物質(zhì)在水性稀釋液中的混合物。將至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體與防腐劑混合在水性稀釋液中，是采用常規(guī)溶解和混合操作實(shí)現(xiàn)的。為制備合適配方，例如，將緩沖液中精確量的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體與緩沖液中的指定防腐劑按特定量值配伍，該特定量值足以提供蛋白質(zhì)和防腐劑的指定濃度。本領(lǐng)域任何一位普通技術(shù)人員均應(yīng)認(rèn)可該方法的改動(dòng)形式。例如，加入組分的順序，是否采用其它添加劑，制備該配方的溫度和pH，是可被優(yōu)化從而適用于所采用濃度和施用途徑的全部因素。
本發(fā)明所要求權(quán)利的配方可作為清液或雙瓶形式被提供給患者，其中在雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍干的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，可利用含有水、防腐劑和/或賦形劑，優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑和/或鹽水和特定鹽，并形成水性稀釋液的另一小瓶將其復(fù)原。需復(fù)原的單溶液瓶或雙瓶均可被重復(fù)利用多次，并足以滿足對(duì)患者的單次或多循環(huán)治療需要，因而可提供比現(xiàn)有通用治療方案更為便利的治療方法。
本發(fā)明所要求權(quán)利的制品適用于從立即到24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間段跨度的施用。相應(yīng)地，本發(fā)明所要求權(quán)利的制品為患者提供了顯著的益處。本發(fā)明配方可任選地在大約2-大約40℃的溫度下安全保存，并長(zhǎng)時(shí)間地保持蛋白質(zhì)的生物活性，因而可在包裝標(biāo)簽上標(biāo)示該溶液可在6、12、18、24、36、48、72或96小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間段跨度上被保存和/或使用。如采用防腐稀釋劑，該標(biāo)簽可包括直至1-12個(gè)月中的至少一個(gè)月數(shù)、半年、一年半和/或兩年的使用期。
在本發(fā)明中，至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的溶液可通過特定方法制備，該方法包括將至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體混合在水性稀釋液中。該混合是采用常規(guī)溶解和混合操作實(shí)現(xiàn)的。為制備合適的稀釋液，例如，以在水或緩沖液中，以特定量值配伍精確量的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，該量值足以提供蛋白質(zhì)和任選防腐劑或緩沖劑的指定濃度。本領(lǐng)域任何一位普通技術(shù)人員均應(yīng)認(rèn)可該方法的改動(dòng)形式。例如，加入組分的順序，是否采用其它添加劑，制備本發(fā)明配方的溫度和pH，是可被優(yōu)化從而適用于所采用濃度和施用途徑的全部因素。
本發(fā)明所要求權(quán)利的產(chǎn)品可作為清液或雙瓶形式被提供給患者，其中在雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍干的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，可利用含水性稀釋液的另一小瓶將其復(fù)原。需復(fù)原的單溶液瓶或雙瓶均可被重復(fù)利用多次，并足以滿足對(duì)患者的單次或多循環(huán)治療需要，因而可提供比現(xiàn)有通用治療方案更為便利的治療方法。
通過向藥房、診所或其它類似機(jī)構(gòu)和設(shè)施提供本發(fā)明所要求權(quán)利的清液或雙瓶形式的產(chǎn)品，可將其間接提供給患者，其中在雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍干的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，可利用含水性稀釋液的另一小瓶將其復(fù)原。該情況中的清液可達(dá)一升或更大體積，因而需提供一種大的儲(chǔ)液器，由其分一次或多次地將較少量的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體溶液轉(zhuǎn)移進(jìn)較小的瓶中，該儲(chǔ)液器可由藥房或診所向其顧客和/或患者提供。
包含上述單瓶體系的公認(rèn)裝置包括用于送遞溶液的筆式-注射器裝置，諸如Huma ject、NovaPen、B-DPen、AutoPen和OptiPen。包含雙瓶體系的公認(rèn)裝置包括可用于將凍干藥物在藥筒中復(fù)原，并送遞該復(fù)原溶液的筆式-注射器裝置，諸如HumatroPen。
本發(fā)明所要求權(quán)利的產(chǎn)品包括包裝材料。除管理機(jī)構(gòu)所要求的信息外，該包裝材料還提供了應(yīng)用該產(chǎn)品的條件。本發(fā)明的包裝材料向患者提供了說明書，講述了在產(chǎn)品為雙瓶，濕/干形式時(shí)，水性稀釋劑中復(fù)原至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，形成溶液的方法，以及在超過2-24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間段的跨度上使用該溶液的方法。對(duì)單瓶溶液產(chǎn)品而言，標(biāo)簽標(biāo)示了該溶液可被使用超過2-24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間段。本發(fā)明所要求權(quán)利的產(chǎn)品在人類藥物產(chǎn)品用途方面有用。
本發(fā)明配方可通過特定方法制備，該方法包括將至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體與特定緩沖劑，優(yōu)選含鹽水或特定鹽的磷酸鹽緩沖劑混合。將至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體與緩沖劑混合在水性稀釋液中，是采用常規(guī)溶解和混合操作實(shí)現(xiàn)的。為制備合適配方，例如，將水或緩沖劑中準(zhǔn)確量的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體與水中的指定緩沖劑按特定量值配伍，該量值足以提供蛋白質(zhì)和緩沖劑的指定濃度。本領(lǐng)域任意一位普通技術(shù)人員均應(yīng)認(rèn)可該方法的變動(dòng)形式。例如，加入組分的順序，是否采用其它添加劑，制備本發(fā)明配方的溫度和pH，是可被優(yōu)化從而適用于所采用濃度和施用途徑的全部因素。
本發(fā)明所要求權(quán)利的穩(wěn)定或防腐配方可以清液或雙瓶形式被提供給患者，該雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍干的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，可利用含水性稀釋液形式的防腐劑或緩沖劑和賦形劑的另一小瓶將其復(fù)原。需復(fù)原的單溶液瓶或雙瓶均可被重復(fù)利用多次，并足以滿足對(duì)患者的單次或多循環(huán)治療需要，因而可提供比現(xiàn)有通用治療方案更為便利的治療方法。
根據(jù)本發(fā)明，此處所描述的穩(wěn)定或防腐配方或溶液中的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可通過多種送遞方法被施用給患者，包括SC或IM注射；經(jīng)皮、肺、跨粘膜、移植、滲透泵、藥筒、微量泵或本領(lǐng)域熟知，并被熟練技術(shù)人員理解的其它途徑。
治療應(yīng)用就模擬體而言，本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者貧血的方法，該貧血包括，但不僅限于任何貧血中的至少一種，癌癥治療相關(guān)貧血、放射治療或化學(xué)治療相關(guān)貧血、病毒或細(xì)菌感染治療相關(guān)貧血、腎貧血、早熟相關(guān)貧血、兒科和/或成人癌癥相關(guān)貧血，與淋巴瘤、骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的貧血、AIDS相關(guān)貧血，該方法包括對(duì)具有下列情況的患者進(jìn)行的伴隨治療，即存在或不存在自體捐血情況下等候選擇性手術(shù)的患者，在對(duì)手術(shù)而言的手術(shù)前和手術(shù)后，接受了自體捐血或輸血、牙周炎治療，患有周期性中性白細(xì)胞減少癥或Kostmann綜合征(先天粒性白細(xì)胞缺乏癥)、末期腎病、與透析相關(guān)的貧血、慢性腎機(jī)能不全、原發(fā)性造血病，諸如先天再生不良性貧血、重型地中海貧血或鐮狀細(xì)胞(貧血)病、鐮狀細(xì)胞(貧血)病的血管閉塞并發(fā)癥的患者。Furman et al.，Pediatrics 1992；90716-728，Goldberg Science.1988；2421412-1415；Paul et al.，Exp Hematol.1984；12825-830；Erslev et al.，Arch Intern Med.1968；122230-235；Ersley et al.，Ann Clin Lab Sci.1980；10250-257；Jacobs et al.，Nature.1985；313806-810；Linet al.，Proc Natl Acad Sci USA.1985；827580-7584；Law et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1986；836920-6924；Goldwasser et al.，J Biol Chem.1974；2494202-4206；Eaves et al.，Blood.1978；521196-1210；Sawyer et al.，Blood.1989；74103-109；Winearls et al.，Lancet.1986；21175-1178；Eschbach et al.，N Engl J Med.1987；31673-78；Eschbach et al.，Ann Intern Med.1989；111992-1000，上述參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明模擬體也可被應(yīng)用于由例如，慢性傳染病、炎癥過程、放射治療和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)藥物治療所誘發(fā)的非腎形式的貧血，并且在非腎貧血患者中所取得的令人鼓舞的結(jié)果已被報(bào)導(dǎo)。見，例如Abels RI和Rudnick SA在Experimental Hematology 19842-50(1991)中的Erythropoietinevolving clinical appliactions.(促紅細(xì)胞生成素發(fā)展中的臨床應(yīng)用)；Graber SE和Krantz SB在Hematology/Oncol.Clin.North Amer.3369-400(1989)中的Erythropoietinbiology and clinical use.(促紅細(xì)胞生成素生物學(xué)和臨床用途)；Jelkman W和Gross AJ(eds)Erythropoietin.Springer，Berlin 1989；Koury MJ和Bondurant MC在EuropeanJournal of Biochemistry 210649-63(1992)中的The molecularmechanism of erythropoietin action.(促紅細(xì)胞生成素作用的分子機(jī)制)；Krantz SB在Blood 77419-34(1991)中的Erythropoietin(促紅細(xì)胞生成素)；Tabbara IA在Archivesf Intemal MedicineI53298-304(1993)中的Erythropoietin.Biology and clinicalapplications.(促紅細(xì)胞生成素，生物學(xué)和臨床應(yīng)用)，上述參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者貧血或血細(xì)胞相關(guān)狀況的方法，其中上述貧血或血細(xì)胞相關(guān)狀況與下述至少一種疾病相關(guān)，包括，但不僅限于至少一種免疫相關(guān)病、心血管病、傳染病、惡性和/或神經(jīng)病。該方法可任選地包括將至少一種有效量的特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。
本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者癌癥/傳染病的方法，這些疾病包括，但不僅限于至少一種急性或慢性細(xì)菌傳染、急性和慢性寄生或傳染過程，包括細(xì)菌、病毒和真菌傳染，HIV傳染/HIV神經(jīng)病、腦膜炎、肝炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、肺炎、會(huì)厭炎、大腸桿菌0157:h7、溶血性尿毒癥綜合征/溶栓性血小板減少性紫癲、瘧疾、登革熱出血熱、利什曼病、麻風(fēng)病、中毒性休克綜合征、鏈球菌肌炎、氣性壞疽、結(jié)核分支桿菌、鳥結(jié)核分支桿菌細(xì)胞內(nèi)、間質(zhì)性漿細(xì)胞肺炎、盆腔炎、睪丸炎/附睪炎、軍團(tuán)桿菌、拉姆病、A型流行性感冒、埃-巴二氏病毒、與重要器官相關(guān)的血液吞噬細(xì)胞綜合征、致命腦炎/無菌性腦膜炎等；(ii)白血病、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、B-細(xì)胞、T-細(xì)胞或FAB ALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血癥(CML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、毛細(xì)胞白血病、骨髓發(fā)育不良綜合征、淋巴瘤、何杰金氏病、惡性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡波濟(jì)肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺痛、鼻咽癌、惡性組織細(xì)胞增生癥、腫瘤伴隨綜合征/惡性高鈣血癥、實(shí)體瘤、腺癌、肉瘤、惡性黑素瘤等；或(iii)神經(jīng)退化病、多發(fā)性硬化、偏頭痛、AIDS癡呆復(fù)合征、脫髓鞘病，諸如多發(fā)性硬化和急性橫貫性脊髓炎；錐體外和小腦失調(diào)，諸如皮層脊髓系統(tǒng)的損害；基底神經(jīng)節(jié)的失調(diào)或小腦失調(diào)；運(yùn)動(dòng)過度性運(yùn)動(dòng)障礙，諸如亨廷頓氏舞蹈病和老年性舞蹈病；藥物誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙，諸如由封閉CNS多巴胺受體的藥物所誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙；運(yùn)動(dòng)功能減退性運(yùn)動(dòng)障礙，諸如帕金森氏病；進(jìn)行性supranucleo麻痹；小腦的結(jié)構(gòu)性損害；脊髓小腦變性，諸如脊髓性共濟(jì)失調(diào)、弗里德賴希氏共濟(jì)失調(diào)、小腦皮層退化、多發(fā)性系統(tǒng)退化(Mencel，Dejerine-Thomas，Shi-Drager和Machado-Joseph)；系統(tǒng)性失調(diào)(雷弗素姆氏病、無β脂蛋白血癥、共濟(jì)失調(diào)、毛細(xì)管擴(kuò)張和線粒體多系統(tǒng)失調(diào))；脫髓鞘核失調(diào)，諸如多發(fā)性硬化、急性橫貫性脊髓炎；和運(yùn)動(dòng)單位失調(diào)，諸如神經(jīng)性肌肉萎縮(前角細(xì)胞退化，諸如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、嬰兒脊髓性肌萎縮和少年脊髓性肌萎縮)；阿爾茨海默??；中年唐氏綜合征；彌散型路易氏體?。宦芬资象w型老年性癡呆；Wernicke-Korsakoff綜合征；慢性醇中毒；Creutzfeldt-Jakob?。粊喖毙杂不匀X炎、Hallerrorden-Spatz病；和拳擊員癡呆等。該方法可任選地包括將有效量的特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種TNF抗體或特定部分或變體。見，例如the Merck Manual，16thEdition，Merck &Company，Rahway，NJ(1992)。
該方法可任選地包括將有效量的至少一種特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。
本發(fā)明也提供了調(diào)節(jié)或治療細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者至少一種心血管病的方法，該心血管病包括，但不僅限于，至少一種心臟暈厥綜合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中風(fēng)、局部缺血性中風(fēng)、出血、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病動(dòng)脈硬化性疾病、高血壓、動(dòng)脈性高血壓、腎血管性高血壓、暈厥、休克、心血管系統(tǒng)的梅毒、心力衰竭、肺源性心臟病、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、心律失常、房性異位搏動(dòng)、心房撲動(dòng)、心房纖維性顫動(dòng)、(持續(xù)或陣發(fā)性)、紊亂性或多病灶房性心動(dòng)過速、規(guī)律性狹窄QRS心動(dòng)過速、特殊心律失常、心室纖顫、His束心律失常、房室傳導(dǎo)阻滯、束支性傳導(dǎo)阻滯、心肌局部缺血性失調(diào)、冠心病、心絞痛、心肌梗塞、心肌病、擴(kuò)張充血性心肌病、限制性心肌病、瓣膜性心臟病、心內(nèi)膜炎、心包疾病、心臟腫瘤、主動(dòng)脈和周圍動(dòng)脈動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈解剖、主動(dòng)脈炎癥、腹主動(dòng)脈及其分枝的閉塞、外周血管失調(diào)、閉塞性動(dòng)脈失調(diào)、外周動(dòng)脈粥樣硬化病、血栓閉塞性脈管炎、功能性外周動(dòng)脈失調(diào)、雷諾氏現(xiàn)象和疾病、肢端發(fā)紺癥、紅斑性肢痛癥、靜脈病、血栓靜脈炎、曲張靜脈、動(dòng)靜脈瘺、淋巴水腫、脂肪水腫、不穩(wěn)定心絞痛、再灌注損傷、泵后綜合征、局部缺血-再灌注損傷等。該方法可任選地包括將有效量的特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。
本發(fā)明的任一方法均可包括將有效量的特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。該方法可任選地進(jìn)一步包括針對(duì)治療上述免疫病的協(xié)同施用或聯(lián)合治療，其中上述至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或其變體的施用進(jìn)一步包括在其之前、同時(shí)和/或之后，施用選自下列的至少一種藥物，即至少一種TNF拮抗劑(例如，但不僅限于TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、其融合蛋白或小分子TNF拮抗劑)、抗風(fēng)濕藥、肌肉松弛劑、麻醉藥、非類固醇抗炎癥藥物(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗菌劑(例如，氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生蟲藥、抗病毒藥、氨基甲酰、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺、四環(huán)素、其它抗菌劑)、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成類固醇、糖尿病相關(guān)藥物、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物、甲狀腺藥物、維生素、鈣相關(guān)激素、止瀉藥、鎮(zhèn)咳藥、止吐劑、抗?jié)兯?、輕瀉劑、抗凝血?jiǎng)?、促紅細(xì)胞生成素(例如依泊艾汀α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗、環(huán)孢霉素、達(dá)克珠單抗)、生長(zhǎng)激素、激素取代藥物、雌激素受體調(diào)節(jié)物、擴(kuò)瞳藥、睫狀肌麻痹藥、烷基化劑、抗代謝物、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑郁藥、抗躁狂劑、抗精神病藥、抗焦慮藥、催眠藥、擬交感神經(jīng)藥、興奮劑、多奈哌齊、塔克林、哮喘藥、β增效劑、吸入類固醇、白細(xì)胞三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸、腎上腺素或類似物、鏈道酶α(Pulmozyme)、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。合適的劑量是本領(lǐng)域熟知的。見，例如Wells et al.，eds.，PharmacotherapyHandbook，2ndEdition，Appleton and Lange，Starnford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，DeluxeEdition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，各參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考。
模擬物也可被應(yīng)用于體外，諸如自體骨髓培養(yǎng)。簡(jiǎn)言之，在化學(xué)治療之前，從患者體內(nèi)取出骨髓，并采用TPO和/或EPO處理，任選地結(jié)合模擬體，任選地結(jié)合一種或多種其它細(xì)胞因子。隨后，將經(jīng)過處理的骨髓返還給經(jīng)過化學(xué)治療的患者，以加速骨髓的恢復(fù)。另外，TPO可單獨(dú)應(yīng)用和與EPO模擬體和/或EPO聯(lián)合應(yīng)用，也可被用于體外擴(kuò)展骨髓或外周血祖細(xì)胞(PBPC)。在化學(xué)治療之前，可采用干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，以將早期祖細(xì)胞釋放進(jìn)外周循環(huán)中。任選地，從外周血中收集并濃縮這些祖細(xì)胞，并隨后采用TPO和模擬體處理其培養(yǎng)物，任選地結(jié)合一種或多種其它細(xì)胞因子，包括，但不僅限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11，使其分化并增生為高密度巨核細(xì)胞培養(yǎng)物，隨后將其任選地返還給經(jīng)過高劑量化學(xué)治療后的患者體內(nèi)。用于體外處理骨髓的TPO劑量范圍應(yīng)為100pg/ml-10ng/ml，優(yōu)選的為500pg/ml-3ng/ml。模擬體的劑量應(yīng)在活性上等同于EPO，可采用的劑量范圍是0.1個(gè)單位/ml-20個(gè)單位/ml，優(yōu)選地是0.5個(gè)單位/ml-2個(gè)單位/ml，或其中的任意范圍或數(shù)值。
適用于本發(fā)明組合物、聯(lián)合治療、協(xié)同施用、裝置和/或方法(進(jìn)一步包括本發(fā)明至少一種抗體、特定部分或其變體)的TNF拮抗劑包括，但不僅限于抗TNF抗體、其配體結(jié)合片段，和與TNF特異性結(jié)合的受體分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF釋放或其對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的作用的化合物，諸如反應(yīng)停、替尼達(dá)普、磷酸二酯酶抑制劑(例如己酮可可堿和咯利普蘭)、A2b腺苷受體拮抗劑和A2b腺苷受體增強(qiáng)劑；阻止和/或抑制TNF受體發(fā)信號(hào)的化合物，諸如促分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制劑；阻滯和/或抑制膜TNF裂解的化合物，諸如金屬蛋白醇抑制劑；阻滯和/或抑制TNF活性的化合物，諸如血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑(例如卡托普利)；和阻滯和/或抑制TNF生成和/或合成的化合物，諸如MAP激酶抑制劑。
此處所用“腫瘤壞死因子抗體”、“TNF抗體”、“TNFα抗體”或片段等降低、阻滯、抑制、消除或干擾了體外、原位和/或優(yōu)選體內(nèi)的TNFα活性。例如，合適的本發(fā)明TNF人類抗體可結(jié)合TNFα，并包括抗TNF抗體、其抗原結(jié)合片段，和特定突變體或其與TNFα特異性結(jié)合的區(qū)域。合適的TNF抗體或片段也可降低、阻滯、消除、干擾、阻止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白質(zhì)合成、TNF釋放、TNF受體發(fā)信號(hào)、膜TNF裂解、TNF活性、TNF生成和/或合成。
嵌合抗體cA2由高親和性中和小鼠抗人TNFαIgG1抗體，即A2的抗原結(jié)合可變區(qū)和人類IgG1，即K免疫球蛋白的恒定區(qū)組成。該人類IgG1Fc區(qū)改善了同種異型抗體效應(yīng)子功能，延長(zhǎng)了該抗體的循環(huán)血清半衰期，并降低了其免疫原性。嵌合抗體cA2的親和力和表位特異性來源于鼠科動(dòng)物抗體A2的可變區(qū)。一種特定實(shí)施方案中，對(duì)編碼該鼠科動(dòng)物抗體A2可變區(qū)的核酸而言，優(yōu)選的來源是A2雜交瘤細(xì)胞系。
嵌合A2(cA2)以劑量依賴方式中和了天然和重組人類TNFα二者的細(xì)胞毒效應(yīng)。從嵌合抗體cA2與重組人類TNFα的結(jié)合試驗(yàn)中，推算出嵌合抗體cA2的親和常數(shù)為1.04×1010M-1。通過競(jìng)爭(zhēng)抑制測(cè)定單克隆抗體特異性和親和力的優(yōu)選方法可參考Harlow，et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1988；Colligan etal.，eds.，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience，New York.(1992-2002)；Kozbor et al.，Immunol.Today，472-79(1983)；Ausubel et al.，eds.Current Protocolsin Molecular Biology，Wiley Interscience，New York(1987-2002)；和Muller，Meth.Enzymol.，95589-601(1983)，這些參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考。
一種特定實(shí)施方案中，鼠科動(dòng)物單克隆抗體A2由被命名為c134A的細(xì)胞系生成。嵌合抗體cA2由被命名為c168A的細(xì)胞系生成。
本領(lǐng)域已描述了可應(yīng)用于本發(fā)明的其它單克隆抗TNF抗體實(shí)例(見，例如美國(guó)專利No.5,231,024；Mller，A.et al.，Cytokine2(3)162-169(1990)；美國(guó)申請(qǐng)No.07/943,852(1992年9月11日提交)；Rathjen et al.，International Publication No.WO91/02078(1991年2月21日出版)；Rubin etal.，EPO PatentPublication No.0218868(1987年4月22日出版)；Yone et al.，EPO Patent Publication No.0288088(1988年10月26日)；Liang，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854(1986)；Meager，et al.，Hybridoma 6305-311(1987)；Fendly et al.，Hybridoma 6359-369(1987)；Bringman，et al.，Hybridoma6489-507(1987)；和Hirai，et al.，J.Immunol.Meth.9657-62(1987)，這些參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考)。
TNF受體分子本發(fā)明優(yōu)選采用的TNF受體分子是那些與TNFα高親和力結(jié)合(見，例如Feldmann et al.，International Publication No.WO92/07076(1992年4月30日出版)；Schall et al.，Cell 61361-370(1990)；和Loetscher et al.，Ce1161351-359(1990)，這些參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考)，并任選地具有低免疫原性的TNF受體分子。55kDa(p55TNF-R)和75kDa(p75TNF-R)TNF細(xì)胞表面受體在本發(fā)明中尤其有用。這些受體的截短形式包括該受體的胞外域(ECD)或其功能部分(見，例如Corcoran et al.，Eur.J.Biochem.223831-840(1994))，在本發(fā)明中也有用。在尿和血清中已檢測(cè)到該TNF受體包含ECD的截短形式，即30kDa和40kDa的TNFα抑制結(jié)合蛋白(Engelmann，H.et al.，J.Biol.Chem.2651531-1536(1990))。TNF受體多聚體分子和TNF免疫受體融合分子，及其衍生物和片段或部分，是可應(yīng)用于本發(fā)明方法和組合物的其它TNF受體分子實(shí)例?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的TNF受體分子的特征在于其具有長(zhǎng)期治療患者，并可良好到極好地緩解癥狀的能力，且毒性低。低免疫原性和/或高親和力，以及其它未明確的特征，均可能對(duì)所獲的治療效果起作用。
在本發(fā)明中有用的TNF受體多聚體分子包括經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)多肽接頭或其它非肽接頭，諸如聚乙二醇(PEG)，連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)TNF受體的ECD的全部或一個(gè)功能部分。該多聚體分子可進(jìn)一步包括分泌性蛋白的信號(hào)肽，以引導(dǎo)該多聚體分子的表達(dá)。美國(guó)申請(qǐng)No.08/437,533(1995年5月9日提交)中描述了這些多聚體分子及其制備方法，該參考文獻(xiàn)的內(nèi)容被完整引入此處作為參考。
在本發(fā)明方法和組合物中有用的TNF免疫受體融合分子包括一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白分子的至少一個(gè)部分，和一個(gè)或多個(gè)TNF受體的全部或一個(gè)功能部分。這些免疫受體融合分子可被裝配為單體，或異源多聚體或同源多聚體。該免疫受體融合分子也可為單價(jià)或多價(jià)。這種TNF免疫受體融合分子的一個(gè)實(shí)例是TNF受體/IgG融合蛋白。本領(lǐng)域已描述了TNF免疫受體融合分子及其制備方法(Lesslauer et al.，Eur.J.Immunol.212883-2886(1991)；Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810535-10539(1991)；Peppel et al.，J.Exp.Med.1741483-1489(1991)；Kolls et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219(1994)；Butler et al.，Cytokine 6(6)；616-623(1994)；Baker et al.，Eur.J.Immunol.242040-2048(1994)；Beutler et al.，美國(guó)專利No.5,447,851；和美國(guó)申請(qǐng)No.08/442,133(1995年5月16日提交)，這些參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考)。制備免疫受體融合分子的方法也可參考Capon et al.，美國(guó)專利No.5,116,964；Capon et al.，美國(guó)專利No.5,225,538；和Capon et al.，Nature 337525-531(1989)，這些參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考。
TNF受體分子的功能等價(jià)物、衍生物、片段或區(qū)指該TNF受體分子的特定部分，或該TNF受體分子序列中編碼TNF受體分子的部分，其尺寸和序列足以使其在功能上與可應(yīng)用于本發(fā)明的TNF受體分子相似(例如，與TNFα高親和力地結(jié)合，并具有低免疫原性)。TNF受體分子的功能等價(jià)物也包括在功能上與可應(yīng)用于本發(fā)明的TNF受體分子相似(例如，與TNFα高親和力地結(jié)合，并具有低免疫原性)的修飾TNF受體分子。例如，TNF受體分子的功能等價(jià)物可含有“SILENT”密碼子或一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失或添加(例如將一個(gè)酸性氨基酸置換為另一個(gè)酸性氨基酸；或?qū)⒁粋€(gè)編碼相同或不同疏水氨基酸的密碼子置換為另一個(gè)編碼疏水氨基酸的密碼子)。參見Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience，New York(1987-2002)。
細(xì)胞因子包括，但不僅限于所有已知的細(xì)胞因子。見，例如CopewithCytokines.com。細(xì)胞因子拮抗劑包括，但不僅限于任何抗體、片段或模擬體、任何可溶受體、片段或模擬體、任何小分子拮抗劑，或上述物質(zhì)的任意組合。
本發(fā)明的任何方法均可包括用于治療蛋白質(zhì)介導(dǎo)的失調(diào)的方法，該方法包括將有效量的特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。該方法可任選地進(jìn)一步包括針對(duì)治療免疫病的協(xié)同施用或聯(lián)合治療，其中上述至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體、特定部分或其變體的施用進(jìn)一步包括在其之前、同時(shí)和/或之后，施用選自至少一種其它細(xì)胞因子，諸如IL-3、-6和-11；干細(xì)胞生長(zhǎng)因子；G-CSF和GM-CSF中的至少一種物質(zhì)。
典型地，對(duì)病理情況的治療是通過施用有效量或劑量的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體組合物實(shí)現(xiàn)的，即根據(jù)該組合物所含的特定活性，每一劑量的范圍共計(jì)平均為，每公斤患者體重施用至少大約0.01-500毫克的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，優(yōu)選地是每公斤患者體重單次或多次施用至少大約0.1-100毫克EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。可選地，有效血清濃度可包括單次或多次施用所獲的0.1-5000ug/ml血清濃度。合適的劑量是醫(yī)師已知的，并當(dāng)然地取決于特定疾病狀況、所施用組合物的特定活性和正接受治療的特定患者。某些情況下，為獲得指定治療量，有必要進(jìn)行重復(fù)施用，即以特定監(jiān)控劑量或計(jì)量劑量的重復(fù)單獨(dú)施用，且在獲得指定日劑量或效果之前重復(fù)該單獨(dú)施用。
優(yōu)選劑量可任選地包括每次施用0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30mg/kg，或其中的任意范圍、數(shù)值或分?jǐn)?shù)，或通過單次或多次施用獲得0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000ug/ml血清濃度，或其中的任意范圍、數(shù)值或分?jǐn)?shù)。
可選地，可根據(jù)已知因素，諸如特定藥劑的藥效特性，及其施用模式和途徑；接受者的年齡、健康情況和體重；癥狀的性質(zhì)和程度、合并治療的種類、治療的頻率和預(yù)期效果改變施用劑量。通常，有效成分的劑量可為每公斤體重施用大約0.1-100毫克。普通劑量為0.1-50，優(yōu)選劑量為每公斤體重每次施用0.1-10毫克，或通過續(xù)釋放形式有效地獲得預(yù)期效果。
一個(gè)非限制性實(shí)例是，對(duì)人類或動(dòng)物的治療可通過一次性或周期性地施用0.0-100mg/kg的本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體劑量，諸如采用單一、輸注或重復(fù)劑量，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或可選地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一個(gè)周期內(nèi)的每一天，或上述天數(shù)和周數(shù)的任意組合周期內(nèi)的每一天施用0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg的本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。
適合內(nèi)部施用的劑量形式(組合物)通常每單位或每個(gè)容器含有大約0.0001毫克-大約500毫克有效成分。在這些藥物組合物中，有效成分的量通常按重量計(jì)算應(yīng)為該組合物總重量的大約0.5-95％。
對(duì)腸胃外施用而言，EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體可與藥物學(xué)可接受的腸胃外賦形劑一起或以分別提供的方式被配制為溶液、懸液、乳濁液或凍干粉。該賦形劑的實(shí)例是水、鹽水、Ringer氏溶液、葡萄糖溶液和5％人類血清白蛋白。也可采用脂質(zhì)體和非水性賦形劑，諸如不揮發(fā)油。賦形劑或凍干粉可含有維持等滲性(例如氯化鈉、甘露糖醇)和化學(xué)穩(wěn)定性(例如緩沖劑和防腐劑)的添加劑。該配方通過已知或合適的技術(shù)滅菌。
合適的藥物載體在該領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)，即Remington’sPharmaceutical Sciences，A.Osol的最新版本中均有所描述。
治療性施用根據(jù)本發(fā)明，可采用許多已知和已研發(fā)的施用模式，用于施用治療有效量的本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。雖然下述內(nèi)容中采用了肺部施用，仍然可根據(jù)本發(fā)明采用其它施用模式，并獲得合適效果。
本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體可在載體內(nèi)形成溶液、乳濁液、膠體或懸液，或以粉末形式，通過利用多種適用于吸入或此處所描述或本領(lǐng)域其它已知模式施用的裝置和方法中的任意一種，而得以送遞。
腸胃外配方和施用用于腸胃外施用的配方可含有常用賦形劑，無菌水或鹽水、諸如聚乙二醇的聚烷撐二醇、植物來源的油、氫化萘等。根據(jù)已知方法，可通過采用合適的乳化劑或增濕劑和懸浮劑制備注射用的水性或油性懸液。注射用的藥劑可以是無毒、不可口服的稀釋劑，諸如在溶劑中形成的水性溶液或無菌可注射溶液或懸液。有效的賦形劑或溶劑可采用水、Ringer氏溶液、等滲鹽水等；普通溶劑或懸浮溶劑則可采用無菌不揮發(fā)油。就這些用途而言，可采用任何種類的不揮發(fā)油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的甘油單酯或二酯或三酯。腸胃外施用是本領(lǐng)域已知的，包括，但不僅限于，常規(guī)注射途徑，美國(guó)專利No.5,851,198中描述的氣壓式無針注射裝置，和美國(guó)專利No.5,839,446中描述的激光穿孔器裝置，這兩項(xiàng)專利均被完整引入此處作為參考。
可選送遞本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、藥丸、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮途徑施用至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。蛋白質(zhì)、EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物可被制備用于腸胃外(皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))施用，尤以液體溶液或懸液形式為佳；用于陰道或直腸施用時(shí)，則尤以半固體形式，諸如膏狀物和栓劑為佳；口腔或舌下施用時(shí)，則尤以片劑或膠囊形式為佳；鼻內(nèi)施用時(shí)，尤以粉末、滴鼻劑或氣霧劑或特定藥劑形式為佳；經(jīng)皮施用則尤以凝膠劑、軟膏劑、洗劑、懸液形式為佳，或含有可改變皮膚結(jié)構(gòu)或提高經(jīng)皮藥帖中藥物濃度的化學(xué)增強(qiáng)劑，諸如二甲亞砜(Junginger，et al.，在“Drug PermeationEnhancement”；Hsieh，D.S.，Eds.，pp59-90(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，完整引入此處作為參考))，或含有可使含蛋白質(zhì)和肽配方應(yīng)用于皮膚的氧化劑(WO 98/53847)，或可施加電場(chǎng)，而造成短暫送遞途徑，諸如電穿孔，或可提高帶電荷藥物穿過皮膚的遷移率，諸如離子電滲療法，或可應(yīng)用超聲波，諸如超聲波導(dǎo)入法(美國(guó)專利No.4,309,989和4,767,402)的藥帖送遞系統(tǒng)(上述出版物和專利均被完整引入此處作為參考)。
肺/鼻部施用對(duì)肺部施用而言，優(yōu)選地送遞顆粒大小的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物，以使其有效地抵達(dá)肺或竇下部的呼吸道。根據(jù)本發(fā)明，可通過本領(lǐng)域已知用于吸入式施用治療藥劑的多種吸入或鼻用裝置中的任意一種送遞至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。這些可使霧化配方沉積于患者竇腔或肺泡中的裝置包括計(jì)量劑量吸入器、霧化器、干粉發(fā)生器、噴霧器等。適用于引導(dǎo)EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體肺或鼻部施用的其它裝置也是本領(lǐng)域已知的。上述所有裝置均可應(yīng)用適合施用的配方，以使EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體分配在氣溶膠中。該氣溶膠可由溶液(水性和非水性)或固體顆粒組成。計(jì)量劑量吸入器，如Yentolion計(jì)量劑量吸入器，典型地采用推進(jìn)氣，并需在吸氣期間開動(dòng)(見，例如WO 94/16970，WO 98/35888)。干粉吸入器，如TurbuhalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics經(jīng)銷的裝置，和Spinhaler粉末吸入器(Fisons)，均通過呼吸活動(dòng)吸入混合粉末(US4668218Astra，EP 237507Astra，WO 97/25086Glaxo，WO 94/08552Dura，US 5458135Inhale，WO 94/06498Fisons，完整引入此處作為參考)。霧化器如AERxTMAradigm、Ultravent霧化器(Mallinckrodt)，和Acorn II霧化器(Marquest MedicalProducts)(US 5404871Aradigm，WO 97/22376)，可由溶液生成氣溶膠，而計(jì)量劑量吸入器、干粉吸入器等吸入器則可產(chǎn)生小顆粒氣溶膠，上述參考文獻(xiàn)均被完整引入此處作為參考。商業(yè)可提供吸入裝置的上述特定實(shí)例僅為適用于實(shí)踐本發(fā)明的特定裝置的代表，并不對(duì)本發(fā)明范疇構(gòu)成限制。優(yōu)選地，通過干粉吸入器或噴霧器送遞包含至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的組合物。適用于施用本發(fā)明至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的吸入裝置具有若干令人滿意的特征。例如，通過吸入裝置送遞的優(yōu)勢(shì)在于可靠、可重現(xiàn)和準(zhǔn)確。該吸入裝置可任選地送遞小的干顆粒，例如對(duì)良好的可吸入性而言，該顆粒小于大約10μm，優(yōu)選地為大約1-5μm。
以噴霧形式施用EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物包括EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的噴霧可通過迫使至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的懸液或溶液在壓力下通過噴嘴而得以制備。該噴嘴的尺寸和構(gòu)型、應(yīng)用壓力和液體進(jìn)料速率均可選擇以獲得預(yù)期的輸出量和顆粒尺寸。電噴霧可通過，例如電場(chǎng)及毛細(xì)管或噴嘴進(jìn)料獲得。通過噴霧器送遞至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白顆粒的優(yōu)勢(shì)在于，顆粒尺寸小于大約10μm，優(yōu)選范圍是大約1um-大約5μm，最為優(yōu)選的范圍是大約2μm-大約3μm。
適用于噴霧器的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白配方典型地包括水性溶液形式的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白，其濃度為每毫升溶液含有大約1mg-大約20mg的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白。該配方可包括諸如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑，和優(yōu)選的鋅。該配方也可包括用于使EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白穩(wěn)定的賦形劑或試劑，諸如緩沖劑、還原劑、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、魚精蛋白等。可用于配制EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的典型糖類包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。該EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白配方也可包括表面活性劑，可減少或預(yù)防由溶液形成氣溶膠時(shí)的霧化所導(dǎo)致的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的表面誘導(dǎo)性凝聚。多種常規(guī)表面活性劑均可被應(yīng)用，諸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其應(yīng)用量范圍通常應(yīng)為配方重量的0.001-14％。對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用而言尤其優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制諸如模擬體或特定部分或變體的蛋白質(zhì)的其它試劑是本領(lǐng)域已知的，也被包括在配方內(nèi)。
通過霧化器施用EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白可通過霧化器，諸如噴射霧化器或超聲波霧化器而得以施用。典型地，在噴射霧化器中，采用壓縮空氣源以通過噴嘴形成高速空氣噴射流。當(dāng)氣體從噴嘴擴(kuò)散出時(shí)，形成了低壓區(qū)，將EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的溶液吸入，并使其通過與貯液器相連的毛細(xì)管。來源自毛細(xì)管的液流離開該毛細(xì)管時(shí)，被剪切為不穩(wěn)定的絲狀體和液滴，便形成了氣溶膠?？蓱?yīng)用一系列的構(gòu)造、流速和導(dǎo)流片類型，以從特定噴射霧化器中獲得預(yù)期的性能特征。在超聲波霧化器中，采用高頻電能以形成震蕩的機(jī)械能，典型地應(yīng)用壓電式轉(zhuǎn)換器。該能量直接或借助于偶聯(lián)液被傳輸給EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白配方，便形成了包含該EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的氣溶膠。通過霧化器送遞EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白顆粒的優(yōu)勢(shì)在于，顆粒尺寸小于大約10μm，優(yōu)選范圍是大約1μm-大約5μm，最為優(yōu)選的范圍是大約2μm-大約3μm。
適用于噴射或起聲波型霧化器的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體配方典型地包括水性溶液形式的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白，其濃度為每毫升溶液含有大約1mg-大約20mg的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體蛋白。該配方可包括諸如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑，和優(yōu)選的鋅。該配方也可包括用于使至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白穩(wěn)定的賦形劑或試劑，諸如緩沖劑、還原劑、填充蛋白或碳水化合物?？捎糜谂渲浦辽僖环NEPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、魚精蛋白等?？捎糜谂渲浦辽僖环NEPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的典型糖類包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。該至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體配方也可包括表面活性劑，可減少或預(yù)防由溶液形成氣溶膠時(shí)的霧化所導(dǎo)致的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的表面誘導(dǎo)性凝聚。多種常規(guī)表面活性劑均可被應(yīng)用，諸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其應(yīng)用量范圍通常應(yīng)為配方重量的0.001-4％。對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用而言尤其優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制諸如至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體蛋白質(zhì)的其它試劑是本領(lǐng)域已知的，也被包括在配方內(nèi)。
通過計(jì)量劑量吸入器施用EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物在計(jì)量劑量吸入器(MDI)中，推進(jìn)劑，至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，和任意賦形劑或其它添加劑均被包容在金屬罐內(nèi)，形成了包括液化壓縮氣體在內(nèi)的混合物。計(jì)量閥的開動(dòng)將該混合物以氣溶膠形式釋放，該氣溶膠優(yōu)選地含有尺寸范圍小于大約10um的顆粒，優(yōu)選的尺寸范圍是大約1μm-大約5μm，最為優(yōu)選的尺寸范圍是大約2μm-大約3μm。通過應(yīng)用由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法，包括噴射研磨、噴霧干燥、臨界點(diǎn)冷凝等方法制備的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物蛋白配方，可獲得理想的氣溶膠顆粒尺寸。優(yōu)選的計(jì)量劑量吸入器包括由3M或Glaxo生產(chǎn)的計(jì)量劑量吸入器，并應(yīng)用了氫化氟代烴推進(jìn)劑。
適用于計(jì)量劑量吸入器裝置的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體配方通常包括含有至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，并可在非水性介質(zhì)中形成懸液的微細(xì)粉末，例如，借助于表面活性劑懸浮在推進(jìn)劑中。該推進(jìn)劑可以是可用于該用途的任何常規(guī)材料，諸如氯氟代烴、氫化氯氟代烴、氫化氟代烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a氫氟烷-134a”))、HFA-227氫氟代烷-227等。優(yōu)選的推進(jìn)劑為氫化氟代烴?？蛇x擇表面活性劑，以穩(wěn)定該推進(jìn)劑中懸浮形式的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體，以保護(hù)該活性劑不被化學(xué)降解等。合適的表面活性劑包括山梨糖醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。某些情況中，溶液氣溶膠優(yōu)選地采用諸如乙醇的溶劑。本領(lǐng)域已知可用于配制蛋白質(zhì)，諸如本發(fā)明蛋白質(zhì)的其它試劑也可被包括在本發(fā)明配方中。
本領(lǐng)域任何一位普通技術(shù)人員均應(yīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明方法可借助此處未描述的裝置通過肺部施用至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體組合物而得以實(shí)現(xiàn)。
粘膜配方和施用對(duì)經(jīng)由粘膜表面的吸收而言，至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的組合物和施用方法包括含有大量超微末微粒、粘膜附著大分子、具有生物活性的肽和水性連續(xù)相的乳濁液，可通過實(shí)現(xiàn)該乳濁液顆粒的粘膜附著促進(jìn)其經(jīng)由粘膜表面的吸收(美國(guó)專利No.5,514,670)。適合應(yīng)用本發(fā)明乳濁液的粘膜表面可包括角膜、結(jié)膜、口腔、舌下、鼻、陰道、肺、胃、腸和直腸的施用途徑。用于陰道或直腸施用的配方，例如栓劑，可含有賦形劑，例如聚烷撐二醇、凡士林、可可脂等。用于鼻內(nèi)施用的配方可為固體，并含有賦形劑，例如乳糖，或者可以是滴鼻劑的水性或油性溶液。對(duì)口服而言，賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預(yù)糊化淀粉等(美國(guó)專利No.5,849,695)。
口服配方和施用用于口服的配方依賴于佐劑的協(xié)同施用(例如間苯二酚和非離子性表面活性劑，諸如聚氧乙烯油醚和n-十六烷基聚乙烯醚)，以人為提高腸壁的通透性，該配方也依賴于酶抑制劑的協(xié)同施用(例如胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶)，以抑制酶降解。用于口服的固體類型劑型的活性組成化合物可與至少一種添加劑混合，該添加劑包括蔗糖、乳糖、纖維素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麥芽糖醇、葡聚糖、淀粉、瓊脂、精氨酸、殼多糖、脫乙酰殼多糖、果膠、黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、明膠、膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物，和甘油酯。這些劑型也可含有其它類型的添加劑，例如不活潑稀釋劑、潤(rùn)滑劑，諸如硬脂酸鎂、對(duì)羥基苯甲酸、諸如山梨酸、抗壞血酸、α-生育酚的防腐劑，諸如半胱氨酸的抗氧化劑、崩解劑、粘合劑、稠化劑、緩沖劑、甜味劑、調(diào)味劑、加香劑等。
片劑和丸劑可被進(jìn)一步加工進(jìn)腸溶包衣制劑中。用于口服的液體制劑包括乳劑、糖漿、酏劑、混懸劑和可用于醫(yī)學(xué)用途的溶液制劑。這些制劑可含有常用于該領(lǐng)域的不活潑稀釋劑，如水。脂質(zhì)體也曾被描述為是胰島素和肝素的藥物送遞系統(tǒng)(美國(guó)專利No.4,239,754)。更為新近的是，混合氨基酸人工聚合物的微球體(類蛋白)曾被用于送遞藥物(美國(guó)專利No.4,925,673)。此外，美國(guó)專利No.5,879,681和美國(guó)專利No.5,5,871,753中描述的載體化合物被用于口服送遞本領(lǐng)域已知的生物活性劑。
經(jīng)皮配方和施用對(duì)經(jīng)皮施用而言，該至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體被密封于送遞裝置中，諸如脂質(zhì)體或聚合毫微粒、微粒、微膠囊或微球體(如無另外指出，可被共同稱為微粒)。有許多合適的裝置是已知的，包括由合成聚合物，如多羥基酸，如聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酸酐和聚聚磷腈，和天然聚合物，諸如膠原蛋白、聚氨基酸、白蛋白及其它蛋白質(zhì)、海藻酸鹽及其它多糖，以及上述物質(zhì)的組合制成的微粒(美國(guó)專利No.5,814,599)。
長(zhǎng)期施用和配方某些時(shí)候，使本發(fā)明化合物跨越較長(zhǎng)的時(shí)間段再施用于患者是理想的，例如，從單次施用開始一周至一年的時(shí)間段?？衫枚喾N緩釋、貯存或移植劑型。例如，劑型可含有特定化合物的藥物學(xué)可接受的無毒鹽，該化合物在體液中具有低溶解度，例如，(a)具有多元酸，諸如磷酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、鞣酸、雙羥萘酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸或萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等酸的酸加成鹽；(b)具有多價(jià)金屬陽離子，諸如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等，或具有由例如N，N’-二苯基-乙二胺或乙二胺形成的有機(jī)陽離子的鹽；(c)(a)與(b)的組合，例如鞣酸鋅鹽。另外，本發(fā)明化合物，或優(yōu)選的，相對(duì)不溶性鹽，如上述鹽，可被配制成凝膠，例如適用于注射，并含有例如，芝麻油的一硬脂酸鋁凝膠。尤其優(yōu)選的鹽是鋅鹽、鞣酸鋅鹽、雙羥萘酸鹽等。注射用的其它類型緩釋貯存配方應(yīng)含有被分散以密封于緩慢降解、無毒、非抗原性多聚物，諸如美國(guó)專利No.3,773,919所描述的聚乳酸/聚羥基乙酸聚合物中的化合物或鹽。該化合物或，優(yōu)選的相對(duì)不溶性鹽，如上述鹽也可被配制在膽固醇基質(zhì)硅酮丸中，尤其應(yīng)用于動(dòng)物。其它緩釋、貯存或移植配方，例如氣體或液體脂質(zhì)體可參見本領(lǐng)域參考文獻(xiàn)(美國(guó)專利Nos.5,770,222和“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”(持續(xù)和控釋藥物送遞系統(tǒng))，J.R.Robinson ed.，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。
上文已概述了本發(fā)明，通過下述實(shí)例將更容易理解本發(fā)明，且下述實(shí)例僅用于例證，對(duì)本發(fā)明不構(gòu)成限制。
實(shí)施例1EPO模擬CH1缺失模擬體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆化和表達(dá)典型哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含有至少一個(gè)可介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子元件，EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體編碼序列，以及轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物聚腺苷酸化所需要的信號(hào)。其它元件包括增強(qiáng)子、Kozak序列和兩側(cè)伴有RNA剪切供體和受體位點(diǎn)的間插序列。高效轉(zhuǎn)錄可通過采用SV40來源的早期和晚期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒，如RSV、HTLVI、HIVI來源的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTRS)和巨細(xì)胞病毒(CMV)來源的早期啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。但也可采用細(xì)胞元件(例如人類肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的合適表達(dá)載體包括，例如，pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN，或pLNCX(Clonetech Labs，PaloAlto，CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3，1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可被采用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人類Hela 293、H9和Jurkat細(xì)胞、小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞、Cos1、Cos7和CV1、鵪鶉QC1-3細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞和中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
可選地，基因可被表達(dá)于特定的穩(wěn)定細(xì)胞系中，該細(xì)胞系含有被整合進(jìn)入其染色體中的上述基因。具有可選標(biāo)記，諸如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素的共轉(zhuǎn)染可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定和分離。
轉(zhuǎn)染基因也可被擴(kuò)增，以表達(dá)大量編碼的EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記有助于開發(fā)攜帶了所關(guān)心基因的數(shù)百或甚至數(shù)千個(gè)拷貝的細(xì)胞系。其它有用的選擇標(biāo)記為谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy，et al.，Biochem.J.227277-279(1991)；Bebbington，et al.，Bio/Technology 10169-175(1992))。利用這些標(biāo)記，可在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含有被整合進(jìn)入其染色體中的擴(kuò)增基因。中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞通常被用于生成EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。
表達(dá)載體pC1和pC4含有勞斯肉瘤病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子(LTR)(Cu11enet al.，Molec.Cell.Biol.5438-447(1985))，外加CMV-增強(qiáng)子的一個(gè)片段(Boshart，et al.，Cell 41521-530(1985))。多克隆位點(diǎn)，例如具有限制酶裂解位點(diǎn)BamHI、XbaI和Asp718，有助于所關(guān)心基因的克隆化。該載體除含有3’內(nèi)含子外，還含有大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化和終止信號(hào)。
在CHO細(xì)胞中的克隆化和表達(dá)載體pC4被用于表達(dá)EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體。質(zhì)粒pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr的衍生物(ATCC編號(hào)為No.37146)。該質(zhì)粒含有受SV40早期啟動(dòng)子控制的小鼠DHFR基因。通過在補(bǔ)充有化學(xué)治療劑氨甲蝶呤的選擇性培養(yǎng)基(例如α負(fù)型MEM，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中培養(yǎng)細(xì)胞，可篩選出由這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并缺乏二氫葉酸活性的中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞或其它細(xì)胞。許多參考文獻(xiàn)均記錄了DHFR基因在對(duì)氨甲蝶呤(MTX)具有抗性的細(xì)胞中的擴(kuò)增(見，例如F.W.Alt，etal.，J.Biol.Chem.2531357-1370(1978)；J.L.Hamlin和C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta1097107-143(1990)；和M.J.Pa ge 和M.A.Sydenham，Biotechnology 964-68(1991))。在遞增濃度MTX中生長(zhǎng)的細(xì)胞通過因擴(kuò)增DHFR基因所導(dǎo)致目標(biāo)酶DHFR的過度產(chǎn)生，從而產(chǎn)生了對(duì)藥物的抗性。如果將第二基因連接至該DHFR基因，則該第二基因通常被共同擴(kuò)增并過度表達(dá)。本領(lǐng)域已知該方法可被用于開發(fā)攜帶了超過該擴(kuò)增基因1,000個(gè)拷貝的細(xì)胞系。隨后，當(dāng)提取出氨甲蝶呤時(shí)，可獲得含有擴(kuò)增基因的細(xì)胞系，該擴(kuò)增基因已被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)染色體中。
質(zhì)粒pC4含有用于表達(dá)所關(guān)心基因的勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的強(qiáng)啟動(dòng)子(Cullen，et al.，Molec.Cell.Biol.5438-447(1985))，外加分離自人類巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因增強(qiáng)子的一個(gè)片段(Boshart，et al.，Cell 41521-530(1985))。該啟動(dòng)子的下游是可實(shí)現(xiàn)上述基因整合的BamHI、XbaI和Asp718限制酶裂解位點(diǎn)。在這些克隆位點(diǎn)后，該質(zhì)粒含有3’內(nèi)含子和大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化位點(diǎn)。其它高效啟動(dòng)子也可被用于表達(dá)，例如人類b-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、SV40早期或晚期啟動(dòng)子或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，如HIV和HTLVI來源的長(zhǎng)末端重復(fù)序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)和類似系統(tǒng)可被用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以可調(diào)節(jié)途徑表達(dá)EPO(M.Gossen，和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551(1992))。對(duì)mRNA的聚腺苷酸化而言，也可采用其它信號(hào)，例如來自人類生長(zhǎng)激素或球蛋白基因的信號(hào)。在采用可選標(biāo)記，諸如gpt、G418或潮霉素共同轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，也可選擇出攜帶了所關(guān)心基因的穩(wěn)定細(xì)胞系，該基因已被整合進(jìn)其染色體中。首先采用1種以上可選標(biāo)記是有優(yōu)勢(shì)的，例如G418外加氨甲蝶呤。
通過本領(lǐng)域已知的操作方法，采用限制酶消化質(zhì)粒pC4，并隨后采用小牛腸內(nèi)磷酸酶脫磷酸化。隨后從1％瓊脂糖凝膠中分離出該載體。
根據(jù)已知方法步驟，采用編碼完整EPO模擬CH1缺失模擬體或特定部分或變體的DNA序列，例如SEQ ID NOS13、14、15、16、17、18所示序列，該DNA序列與本發(fā)明EPO模擬CH1缺失模擬體的HC和LC可變區(qū)對(duì)應(yīng)。該構(gòu)建體(如載體p1351中提供的)中也可采用編碼合適人類恒定區(qū)(即HC和LC區(qū))的分離核酸。
隨后使編碼DNA的分離可變和恒定區(qū)和脫磷酸化載體與T4DNA連接酶連接。隨后，轉(zhuǎn)染大腸桿菌HB101或XL-1Blue細(xì)胞，并采用，例如限制酶分析法鑒定質(zhì)粒pC4中含有上述插入片段的細(xì)菌。
采用缺乏活性DHFR基因的中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。采用轉(zhuǎn)染試劑lipofectin，由0.5ug質(zhì)粒pSV20-neo共轉(zhuǎn)染5μg表達(dá)質(zhì)粒pC4。質(zhì)粒pSV2neo含有顯性選擇標(biāo)記，和來源于Tn5的neo基因，該基因編碼可使其對(duì)一組抗生素，包括G418具有抗性的酶。將該細(xì)胞接種進(jìn)補(bǔ)充有1ug/ml G418的α負(fù)型MEM中。2天后，胰蛋白酶消化該細(xì)胞，并接種進(jìn)雜交瘤克隆化平板(Greiner，Germany)中，該平板已加入了補(bǔ)充有10、25或50ng/ml氨甲蝶呤外加1ug/ml G418的α負(fù)型MEM。大約10-14天后，胰蛋白酶消化單個(gè)克隆，并隨后接種進(jìn)含有不同濃度氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的6孔培養(yǎng)皿或10ml搖瓶中。隨后，將最高濃度氨甲蝶呤條件下生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)移至含有還要高濃度氨甲蝶呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新6孔平板中。重復(fù)相同步驟直至獲得可于100-200mM濃度條件下生長(zhǎng)的克隆為止。分析預(yù)期基因產(chǎn)物的表達(dá)，例如，通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡，或通過反相HPLC分析。
實(shí)施例2本發(fā)明CH1缺失模擬體的非限制性實(shí)例背景EMP-1(EPO模擬肽-1)是有20個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽，與人類促紅細(xì)胞生成素(HuEPO)不具有序列同源性，但其具有活化EPO受體的能力(作為二聚體)(Wrighton et al.，1996，Science，vol.273，458-463)。不過，其相對(duì)低的活性(比HuEPO低10,000-100,000倍)和短的半衰期(50％血清中的體外半衰期為8小時(shí)，體內(nèi)半衰期未知)限制了其在治療方面的效用。因此，需要一種可賦予該肽較長(zhǎng)半衰期，不干擾其效價(jià)，并可能促進(jìn)其效價(jià)的方法。為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，人們作出若干嘗試，通過穩(wěn)定該肽的二聚化，以提高EMP-1的活性，或通過將該肽整合進(jìn)較大結(jié)構(gòu)中，以延長(zhǎng)其半衰期。Wrighten等人(1997，Nature Biotechnology，vol.15，1261-65)將生物素標(biāo)記EMP-1與鏈霉抗生物素蛋白聯(lián)合，從而使二聚化穩(wěn)定。他們?cè)隗w外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)活性提高了100倍。他們也采用了抗生物素抗體，以穩(wěn)定該肽二聚體，但發(fā)現(xiàn)活性僅提高了10倍。他們還制備了在化學(xué)上被定義為二聚體的EMPP-1。該情況中，所觀測(cè)到的體內(nèi)活性提高了100倍。另一研究小組試圖通過使EMP-1與聚乙二醇(PEG)共價(jià)連接，以提高EMP-1的活性(Johnson et al.，1997，Chem.&Bio.，vol.4(12)，939-50)。他們報(bào)導(dǎo)的效價(jià)提高了高達(dá)1000倍，但發(fā)現(xiàn)該構(gòu)建體在小鼠中具有免疫原性(該抗體針對(duì)該肽)(Dana Johnson，Personalcommunications)。Kuai等人(2000，J.Peptide Res.，vol.56，59-62)將EMP-1肽插入纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)的序列中。發(fā)現(xiàn)EMP-1被插入該支架結(jié)構(gòu)中后，既可穩(wěn)定二聚化，也可延長(zhǎng)半衰期。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，該構(gòu)建體的效價(jià)被發(fā)現(xiàn)比EMP-1本身高2500倍。應(yīng)當(dāng)指出的是，上述研究中采用了不同的體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)模型，且所報(bào)導(dǎo)效價(jià)彼此之間或與此處所介紹結(jié)果不可比較。
本發(fā)明的EMP-1CH1缺失模擬體本發(fā)明的一個(gè)特定非限制性實(shí)例是EMP-NfusCG1構(gòu)建體，其中V是天然存在抗體的最初三個(gè)氨基酸，Pep是具有生物活性的EMP-1肽的單拷貝，F(xiàn)lex是Gly-Gly-Gly-Ser柔性接頭的串聯(lián)重復(fù)，V2是天然存在IgG的J區(qū)，pHinge是完整IgG1鉸鏈區(qū)，而CH2&CH3屬于IgG1同種型亞類。該結(jié)構(gòu)被認(rèn)為將約束EMP-1肽，但也具有足夠的柔性，可使作為該裝配同型二聚體一部分的肽的二聚化穩(wěn)定。體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，EMP-NfusCG1的活性比EMP-1肽約高了550倍，且僅比重組HuEPO(rHuEPO)低4-6倍，從而證實(shí)了上述觀點(diǎn)。另外，該構(gòu)建體的半衰期被認(rèn)為應(yīng)是rHuEPO或EMP-1肽本身半衰期的許多倍，并與I gG的半衰期近似。與此一致，經(jīng)由EMP-Nfus CG1處理的正常小鼠與經(jīng)由rHuEPO處理的小鼠相比，前者獲得了顯著較高的最大血細(xì)胞比容，當(dāng)?shù)然钚詥挝灰欢〞r(shí)，上升水平被維持了較長(zhǎng)時(shí)間。該構(gòu)建體被有效地從細(xì)胞中分泌，并似乎被適當(dāng)折疊；克服了與第一代模擬體相關(guān)的難題。
除上述基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)外，本文也描述了具有潛在有利生物學(xué)特征的變體。這些變體包括自聯(lián)接傾向可能降低、免疫效應(yīng)子功能減弱或免疫原性降低的構(gòu)建體。本發(fā)明也展望了其它可賦予特定特征，諸如可改善具有生物活性的肽的構(gòu)型，和可跨越血腦屏障的修飾。該建議變體和修飾可以任何方式組合，以獲得具有特定活性的構(gòu)建體。
利用重組DNA法，將EMP-1肽插入中間載體中，位于免疫球蛋白信號(hào)肽與人類J序列之間。該操作采用了互補(bǔ)合成寡核苷酸，其末端與該載體中的BstI 107I和KpnI限制位點(diǎn)相容(5’TACAGGCCCAGATCCAGGGCGGTACCTACAGCTGCCACTTCGGGCCCCTCACGTGGGTGTGCAAGCCCCAGGGCGGCGGAAGCGGGGGAGGCTCCGGTAC3’(SEQ IDNO43)和3’CGGAGCCTCCCCCGCTTCCGCCGCCCTGGGGCTTGCACACCCACGTGAGGGGCCCGAAGTGGCAGCTGTAGGTACCGCCCTGGATCTGGGCCTGTA5’)(SEQID NO44)。這些寡核苷酸含有信號(hào)肽酶共有位點(diǎn)的編碼序列、EMP-1肽和由兩個(gè)Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)組成的柔性接頭。含有上述功能元件的XbaI限制片段隨后被轉(zhuǎn)移進(jìn)表達(dá)載體中。該載體含有抗CD4免疫球蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、人類IgG1鉸鏈區(qū)的編碼序列、HC恒定區(qū)2(CH2)和恒定區(qū)3(CH3)，也含有對(duì)細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒復(fù)制和篩選，以及對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)子的篩選而言所必需的元件。
該質(zhì)粒被線型化，并通過電穿孔被導(dǎo)入NSO小鼠骨髓瘤細(xì)胞系中。篩選抗性細(xì)胞，并通過ELISA分析培養(yǎng)上清液，鑒定EMP-NfusCG1的高表達(dá)子。通過標(biāo)準(zhǔn)A蛋白親和色譜從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化獲得該構(gòu)建體。在變性和還原條件下，使純化產(chǎn)物通過含SDS的聚丙烯酰胺凝膠，以證實(shí)該純化產(chǎn)物具有預(yù)期尺寸。通過質(zhì)譜分析和N末端測(cè)序進(jìn)一步鑒定該純化蛋白。
EMP-NfusCG1的氨基酸序列如下所示。功能域?yàn)樯鲜鲭牡木幋a序列。三個(gè)氨基酸信號(hào)肽共有序列與天然存在的免疫球蛋白的最初三個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)。這些氨基酸被認(rèn)為通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的信號(hào)肽酶從而促成了對(duì)信號(hào)肽的有效去除。EMP-1編碼序列直接位于該序列后。EMP-l序列的2個(gè)C末端氨基酸與鄰接的6個(gè)氨基酸結(jié)合，形成了特征為Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)的柔性接頭。人類連接(J)區(qū)序列緊跟其后。J序列被認(rèn)為可提供更大的柔性，使EMP-1二聚體呈現(xiàn)正確構(gòu)型，并使該二聚體從免疫球蛋白的球形結(jié)構(gòu)中突出，并深入至兩個(gè)EPO受體之間的裂口中。該構(gòu)建體也包括HC鉸鏈區(qū)，J區(qū)直接位于其后。IgG1鉸鏈區(qū)(被突出顯示部分)中含有三個(gè)半胱氨酸。第一個(gè)半胱氨酸通常與免疫球蛋白輕鏈(LC)配對(duì)，另外兩個(gè)半胱氨酸則參與了兩個(gè)HC之間的鏈間鍵。該序列的剩余部分由CH2&CH3區(qū)組成，構(gòu)成了該蛋白的填充部分。免疫球蛋白被認(rèn)為具有長(zhǎng)血清半衰期的原因之一是其與FcRn結(jié)合的能力，該FeRn可通過將胞飲免疫球蛋白恢復(fù)至胞外間隙，從而延長(zhǎng)血清半衰期。FeRn的結(jié)合位點(diǎn)與CH2和CH3區(qū)的連接處重疊(Sheilds et al.，2O01，J.Bio.Chem.，vol.276(9)，6591-6604)。
BMP-NfusCG1的肽序列顯示了重要的功能域。
信號(hào)肽酶共有序列J區(qū)～～～接頭～～～～～～～～EMP-1肽～～～～～～huG1鉸鏈～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～1QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPIgG1CH261SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSIgG1CH2～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～I(xiàn)gG1CH3～～～～～～～～～～～～～～～～～TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDIgG1CH3～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～181TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQIgG1CH3～～～～～～～～～～～～～～～241QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO50)
眾所周知，兩條IgG重鏈在細(xì)胞加工期間通過鉸鏈區(qū)中兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫鍵而被裝配在一起，形成了同型二聚體。人們認(rèn)為該現(xiàn)象也可發(fā)生在修飾肽之間，從而形成裝配的EMP-NfusCG1構(gòu)建體。另外，人們認(rèn)為EMP-1肽中的兩個(gè)半胱氨酸之間也將形成鏈間二硫鍵。EMP-NfusCG1的預(yù)期結(jié)構(gòu)含有兩個(gè)EMP-1肽。該肽在N末端的空間排列，以及鄰接序列的柔性使該肽形成了具有生物活性的二聚體。
首先在體外生物活性測(cè)定中檢驗(yàn)EMP-NfusCG1的活性。對(duì)該測(cè)定而言，采用了急性成巨核細(xì)胞白血病患者來源的EPO依賴性UT-7/EPO細(xì)胞系(Komatsu et al.，1993，Blood，vol.82(2)，456-464)。從補(bǔ)充有rHuEPO的培養(yǎng)基中取出這些細(xì)胞48-72小時(shí)后，它們便開始經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡。已在rHuEPO缺乏條件下被培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞如果經(jīng)過rHuEPO或EPO增效劑的處理，便可被挽救。將EMP-NfusCG1加入在無rHuEPO條件下饑餓的細(xì)胞中，并在采用四氮唑化合物MTS(CellTiter 96Aqueous One Solution，Promega)處理后48小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞活力，其中該四氮唑化合物MTS可被活細(xì)胞代謝，并產(chǎn)生可測(cè)定吸光度的產(chǎn)物。典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示摩爾基礎(chǔ)EMP-NfusCG1的效價(jià)比EMP-1肽高500倍，比rHuEPO低5倍。另外，采用EMP-NfusCG1刺激上述相同細(xì)胞，并通過使細(xì)胞裂解物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以目測(cè)酪氨酸磷酸化模式。EMP-NfusCG1所顯示的模式與rHuEPO相似，說明EMP-NfusCG1作用于上述細(xì)胞的機(jī)制與rHuEPO相似。
在正常小鼠中進(jìn)行體內(nèi)研究，比較EMP-NfusCG1與rHuEPO二者的半衰期，并比較二者對(duì)紅細(xì)胞生成的影響。初步研究表明對(duì)小鼠施用連續(xù)兩天的劑量而非單劑量時(shí)，對(duì)rHuEPO的應(yīng)答更為顯著。在初步研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rHuEPO劑量為2000U/kg時(shí)，小鼠的血細(xì)胞比容在第4天升至最大值，第7天則跌至基線水平附近。為比較EMP-NfusCG1與rHuEPO二者的效果差異，以體外生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)所測(cè)定活性為基礎(chǔ)，歸一化EMP-NfusCG1的劑量；由于該實(shí)驗(yàn)中EMP-NfusCG1的活性低于5倍，因而給予約5倍多量的EMP-NfusCG1。也考慮到了分子量上的差異(rHuEPO＝30,400道爾頓，EMP-NfusCG1＝62,200道爾頓)。當(dāng)基于上述考慮，對(duì)小鼠施用相同劑量時(shí)，EMP-NfusCG1引發(fā)了較高的最大應(yīng)答，且與rHuEPO相比，該應(yīng)答被延長(zhǎng)了。
通過ELISA測(cè)定rHuEPO和EMP-NfusCG1的血清濃度。在對(duì)低至2.5mU/ml的rHuEPO濃度靈敏的測(cè)定中，從第4天開始，在以1∶8稀釋的樣本中未發(fā)現(xiàn)正信號(hào)。該結(jié)果與rHuEPO在嚙齒類動(dòng)物中被預(yù)期的2-8小時(shí)半衰期一致。(PRI Export，Part IC2T0xico-Pharmacologica1Documentation)。與之相比，第4天所檢測(cè)到的EMP-NfusCG1水平高達(dá)1.5ug/mL，且該高水平保持至研究結(jié)束。圖6中清除率分布圖的線性異常?？赡苁怯捎诘谝粋€(gè)時(shí)間點(diǎn)在最后一次注射后3天，在取第一個(gè)樣本之前便已達(dá)最大濃度(Cmax)，因此未觀測(cè)到指數(shù)曲線的峰值。另一種解釋是該新構(gòu)建體的吸收和清除特征使其清除率分布圖呈現(xiàn)線性?；谠摂?shù)據(jù)，可計(jì)算其半衰期約為10.8天，為rHuEPO半衰期的若干倍。
除了EMP-NfusCG1外，本發(fā)明還制備了三個(gè)類似的構(gòu)建體，三者在鉸鏈CH2和CH3區(qū)的同種型，或在可使EMP-1肽具有柔性的元件數(shù)量方面存在差異。其中一個(gè)構(gòu)建體被稱為EMP-NfusCG4，除其鉸鏈和恒定區(qū)屬于G4亞型外，該構(gòu)建體其余部分均與EMP-NfusCG1一致。特定地，將用于構(gòu)建EMP-NfusCG1表達(dá)質(zhì)粒的XbaI限制片段轉(zhuǎn)移進(jìn)特定載體中，該載體提供了抗CD4免疫球蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、人類IgG4鉸鏈區(qū)的編碼序列、CH2和CH3，以及對(duì)細(xì)茵內(nèi)質(zhì)粒復(fù)制和篩選，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)子的篩選而言所必需的元件。該質(zhì)粒的表達(dá)和純化方式與EMP-NfusCG1相似。EMP-NfusCG4的編碼序列如下所示。
HuG4鉸鏈與BMP-NfusCG1一致的序列～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～l QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFIgG4CH2～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～61LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOFNSTYRIgG4CH3IgG4CH2～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～12l WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNIgG4CH3～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～181QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNIgG4CH3～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～24l VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO51下文顯示了CH1缺失模擬體若干實(shí)例之間的比較結(jié)果
QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTH-TCPPCPAPELLMG1---......................------------.....................
CG4......................................S.YGPP----..S.....F.
MG4---......................------------.S.YGPP----..S.....F.
muCG2a.......................................RGPTIKPCPPCK....N..
IgG1與IgG4亞型之間的重要差異在于鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)量。與G1亞型類似，IgG4鉸鏈中存在兩個(gè)參與了重鏈之間二硫鍵的半胱氨酸。G4鉸鏈中不含有通常涉及與LC的二硫鍵結(jié)合的半胱氨酸；該半胱氨酸位于上述構(gòu)建體所缺乏的G4CH1區(qū)中。IgG4鉸鏈區(qū)不如IgG1鉸鏈柔韌，這可能影響EMP-NfusCG1二聚體的潛在構(gòu)型(Dangl et al.，1997，EMBO Journal，vol 7(7)，1989-94)。另外，兩個(gè)同種型在其介導(dǎo)補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴型細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)的能力方面存在差異。G1亞型是互補(bǔ)級(jí)聯(lián)的強(qiáng)誘導(dǎo)物，而G4亞型幾乎無活性(Dangl et al.，1997，EMBO Journal，vol 7(7)，1989-94)。另外，G1亞型與Fc受體以高親和力結(jié)合，從而促成了細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而G4亞型的結(jié)合力微弱(Allan &Seed，1989，Science，vol.423，378-80)。由于需要使目標(biāo)細(xì)胞增殖，因此G4亞型在活化效應(yīng)子功能方面的相對(duì)無效是理想的。FcRn清除劑受體的結(jié)合位點(diǎn)存在于IgG4上，并且由于其在結(jié)合方面似乎并不存在任何IgG亞類差異，因此其藥物代謝動(dòng)力學(xué)被認(rèn)為與G1亞型相似(West etal.，2000，Biochem.，vol 39，9698-9708)。
與G1的情況一樣，構(gòu)建體EMP-NfusCG4被認(rèn)為可借助于鉸鏈區(qū)中的兩個(gè)半胱氨酸從而形成同型二聚體。如上所述，G4鉸鏈中不含第三個(gè)半胱氨酸，從而否定了兩條鏈之間形成第三個(gè)二硫鍵的可能性。EMP-1二聚體的構(gòu)型也可能由于鉸鏈區(qū)的尺寸和柔性上的差異而不同?？紤]到上述差異，EMP-NfusCG4的通用結(jié)構(gòu)被認(rèn)為與EMP-NfusCG4相似。
如前所述，在體外生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)EMP-NfusCG4。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，結(jié)果相似。該測(cè)定中，EMP-NfusCG4的效價(jià)比EMP-NfusCG1低13倍，但平均差異約為10倍。由于EMP-NfusCG1的效價(jià)比rHuEPO低5倍，因此EMP-NfusCG4與rHuEPO之間的差異被認(rèn)為應(yīng)為大約50倍。該實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際差異為60倍。該實(shí)驗(yàn)中EMP-NfusCG4與EMP-1之間的差異為40倍，但由于EMP-1的EC50數(shù)值比歷史平均值低2倍，所以EMP-NfusCG4與EMP-1之間的實(shí)際差異可能更大。EMP-NfusCG4被觀測(cè)到的活性較低，可歸因?yàn)殂q鏈區(qū)中的差異，該差異使EMP-1二聚體不能形成最佳構(gòu)型。迄今仍未在體內(nèi)檢驗(yàn)過EMP-NfusCG4的活性。
另外兩種構(gòu)建體被設(shè)計(jì)用于研究活性所必需的功能域。因此，在EMP-1序列與鉸鏈區(qū)之間忽略了人類J區(qū)和一個(gè)Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)。上述“完整”版本與這些最小版本之間的差異在于鉸鏈區(qū)的同種型亞類(G1對(duì)比G4)、CH2和CH3區(qū)。
信號(hào)肽酶共有序列J區(qū)～～～接頭～～～～～～～～EMP-1肽～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～完整QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSS..HingeSEQ ID NO52最小QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGS..HingeSEQ ID NO53對(duì)被指定為EMP-NfusMG1和EMP-NfusMG4的最小版本而言，表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是通過將合成寡核苷酸插入中間載體而得以實(shí)現(xiàn)，其方法與構(gòu)建針對(duì)EMP-NfusCG1和EMP-NfusCG4的表達(dá)質(zhì)粒的方法相同(5’TACAGGCCCAGGGCGGTACCTACAGCTGCCACTTCGGGCCCCTCACGTGGGTGTGCAAGCCCCAGGGCGGCGGATCAGGTAAGTT3’(SEQ ID NO45)和3’CTAGAACTTACCTGATCCGCCGCCCTGGGGCTTGCACACCCACGTGAGGGGGCCCGAAGTGGCAGCTGTAGGTACCGCCCTGGGCCTGTA5’)(SEQIDNO46)。上述合成寡核苷酸含有信號(hào)肽酶共有位點(diǎn)的編碼序列、EMP-1肽和單個(gè)Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)。不過，在該情況中，寡核苷酸的3’末端與XbaI限制位點(diǎn)相容，與被用于構(gòu)建完整版本的寡核苷酸不同。通過克隆進(jìn)位于中間載體J區(qū)下游的Xba I位點(diǎn)，忽略了J區(qū)的編碼序列。最終表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是采用如針對(duì)EMP-NfusCG1和EMP-NfusCG4所描述的方法實(shí)現(xiàn)的。由于技術(shù)問題，迄今，僅EMP-NfusMG4已獲得表達(dá)和純化。EMP-NfusMG4的結(jié)構(gòu)被認(rèn)為具有EMP-1肽從該蛋白質(zhì)球形結(jié)構(gòu)形成的突出，該突出被認(rèn)為不如EMP-NfusCG4情況中的突出顯著，由于該原因，EMP-1肽二聚體可能不能深入至EPO受體之間的裂口中。另外，有助于EMP-1肽形成最佳二聚體構(gòu)型的柔性可能被降低。該現(xiàn)象在Livnah等人的觀測(cè)結(jié)果中尤為重要(1998，Nat.Strust.Biol.，vol.5，993-1004)。他們發(fā)現(xiàn)肽(EMP-33)可使兩個(gè)EPO受體二聚化，但不能活化該受體。通過比較EMP-33/EPO受體復(fù)合體與EMP-1/EPO受體復(fù)合體二者的晶體結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)在二聚化受體取向上的微小差異使該肽在活化其受體能力上存在差異。因此，如果EMP-1二聚體不能形成最佳構(gòu)型，它也可能不能使EPO受體二聚化，或者不能將受體帶入活化構(gòu)型中。
在UT7體外生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)EMP-NfusMG4構(gòu)建體的活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如

圖12所示。該實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了一次，由于生物活性測(cè)定的易變性，因此其結(jié)果應(yīng)被認(rèn)為是初步結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)中，EMP-NfusMG4的效價(jià)比rHuEPO低227倍，比EMP-1肽高44倍。但該實(shí)驗(yàn)中rHuEPO的EC50比歷史平均值低3倍，所以EMP-NfusMG4與rHuEPO之間的差異可能顯著地更低。該實(shí)驗(yàn)未在EMP-NfusCG4與EMP-NfusMG4之間進(jìn)行直接對(duì)比?；贓MP-NfusCG4的平均EC50，即3.5×10-10，與該實(shí)驗(yàn)中所觀測(cè)到EMP-NfusMG4的EC50之間的對(duì)比，可知差異為2倍。雖然上述結(jié)果是初步結(jié)果，但說明人類J序列和一個(gè)Gly-Gly-Gly-SeT重復(fù)的缺乏基本上不會(huì)降低EMP-NfusMG4構(gòu)建體的效價(jià)。尚未知該觀測(cè)結(jié)果是否可被延伸至EMP-NfusMG1構(gòu)建體。
為避免不合需要的活性，目前已研究表達(dá)了存在單個(gè)或多個(gè)氨基酸變化的其它構(gòu)建體。這些變化可被單獨(dú)表達(dá)，或者以多種變化組合的形式存在于單個(gè)構(gòu)建體中。通常參與HC與LC之間二硫鍵的半胱氨酸將被轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?。雖然該半胱氨酸可能通過形成第三個(gè)二硫鍵，從而涉及構(gòu)建體的穩(wěn)定化，但其也有可能與構(gòu)建體中的其它半胱氨酸異常地形成二硫鍵，或者在兩個(gè)構(gòu)建體之間形成二硫鍵。通過移除該半胱氨酸，可加強(qiáng)正確的折疊和裝配，并減小自連接的可能性。
已有研究表明，在IgG1較低鉸鏈區(qū)中，從兩個(gè)賴氨酸(L)殘基，L234&L235到丙氨酸(A)的突變將消除免疫球蛋白介導(dǎo)補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴型細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)的能力(Hezerehetal.，2001，J.Virol.，vol.75(24)，12161-68)。初步研究顯示EMP-NfusCG1不能介導(dǎo)可表達(dá)EPO受體的細(xì)胞的補(bǔ)體裂解。這可能是紅細(xì)胞系祖細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)存在的受體數(shù)量低所致。另外，通過血細(xì)胞比容的顯著提高所證實(shí)的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增說明免疫效應(yīng)子功能可能不具有功能相關(guān)性。不過，雖然未觀測(cè)到與效應(yīng)子功能相關(guān)的影響，仍然可將上述突變介紹為應(yīng)預(yù)防的步驟。
可導(dǎo)致免疫效應(yīng)子功能的介導(dǎo)作用降低的另一種修飾是移除糖基化附著位點(diǎn)。該修飾可通過使297位上的天冬酰胺(N297)突變?yōu)楣劝滨０?Q)而得以實(shí)現(xiàn)。其它變化可任選地包括將蘇氨酸(T)取代為可選氨基酸，以減少或修飾O-糖基化作用，例如，已知具有IgG1亞類的糖基化版本的T34或T47是免疫效應(yīng)子功能的弱中介體(Jefferis et al.，1998，Immol.Rev.，vol.163，50-76)。
以上為EMP-NfusCG1鉸鏈和CH2編碼序列中的建議突變。(SEQ ID NO47)目前正被研究的另一種修飾是將EMP-NfusCG1的IgG1CH2和CH3區(qū)取代為I gG4亞型的相同區(qū)域，同時(shí)保留G1鉸鏈區(qū)。如前所述，IgG4亞類介導(dǎo)免疫效應(yīng)子功能的能力遠(yuǎn)低于G1亞類。也如前所述，據(jù)推理，兩個(gè)IgG亞類中鉸鏈區(qū)柔性之間的差異可能是EMP-NfusCG1與EMP-NfusCG4之間存在活性差異的原因。因此該構(gòu)建體可能保持了EMP-NfusCG1的活性，而未涉及潛在的免疫效應(yīng)子功能。
其它被展望的修飾是可降低該構(gòu)建體潛在免疫原性的修飾。免疫原性的一個(gè)重要決定因素是蛋白質(zhì)來源的肽被MHC分子有效結(jié)合并呈遞至T細(xì)胞，并激發(fā)以細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫應(yīng)答或有助于抗體應(yīng)答的T細(xì)胞的能力。利用通用的針對(duì)MHC結(jié)合，并以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的算法(SYFPETHI，Ramensee et al.，1999，Immunogenetics，vol.50，213-19和BIMAS)，分析EMP-NfusCG1中含EMP-1的N末端區(qū)域內(nèi)的潛在MHC結(jié)合表位。可降低一種或多種肽的預(yù)測(cè)免疫原性的突變可被評(píng)價(jià)為對(duì)免疫原性的體內(nèi)影響。
(SEQ ID NO48)被預(yù)測(cè)與MHC I類分子結(jié)合的肽QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCIQGGTYSCHFGTYSCHFGPLTYSCHFGPLYSCHFGPLTWCHFGPLTWVGSGGGSGTLSGGGSGTLVGGGSGTLVTVGGSGTLVTVTLVTVSSEPKLVTVSSEPKSSEPKSCDKTSSEPKSCDK被預(yù)測(cè)與MHC II類分子結(jié)合的肽(SEQ ID NO49)QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCFGPLTWVCKPQGGGSLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDSCHFGPLTWVCKPQGGGGSGTLVTVSSEPKGTLVTVSSEPKSCDKVTVSSEPKS其它序列的非限制性實(shí)例包括無QIQ(SEQ ID NO62)GGTYSCHPGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLEMP1中兩個(gè)半胱氨酸的突變(SEQ ID NO63)(QVQ)GGTYSSHFGPLTWVSKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAALeu56和Leu57的突變
(SEQ ID NO64)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAA(SEQ ID NO65)(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAA(SEQ ID NO66)(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPELA(SEQ ID NO67)(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAL(SEQID NO68)(QVQ)GGTYSCHPGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPELE具有IgG1鉸鏈區(qū)的IgG4(SEQ ID NO69)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEFL具有不同接頭長(zhǎng)度的G1-G4IgG4(SEQ ID NO70)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL(SEQ ID NO71)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL(SEQ ID NO72)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGGGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL(SEQ ID NO73)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL具有截短鉸鏈區(qū)的IgG1(SEQ ID NO74)(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSCPPCPAPELL(SEQ ID NO75)(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSTHTCPPCPAPELL(SEQ ID NO76)(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSAKDTHTCPPCPAPELLO-糖基化位點(diǎn)被敲除的IgG1(SEQ ID NO77)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHACPPCPAPELL(SEQ ID NO78)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVAVSSEPKSADKTHTCPPCPAPELL(SEQ ID NO79)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKAHTCPPCPAPELL(SEQ ID NO80)(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVAVSSEPKSADKTHACPPCPAPELL優(yōu)勢(shì)新構(gòu)建體，即上述EMP-NfusCG1提供了一條展示具有生物活性的肽EMP-1的可選途徑。該構(gòu)建體的活性在rHuEPO的范圍內(nèi)，且其體內(nèi)半衰期與IgG的半衰期近似。另外，建議修飾被認(rèn)為可組合在一起，并外加EMP-NfusCG1的新特征，從而增強(qiáng)EMP-NfusCG1構(gòu)建體的效用。
應(yīng)當(dāng)清楚的是，可采用與上述說明和實(shí)例中具體描述方法不同的其它方法實(shí)踐本發(fā)明。
根據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化均是可能的，因而也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
序列表<110>Heaver，George A.；Knight，David M.；Ghrayeb，John；Scallon，Bernard J.；Nesspor，Thomas C.；Centocor，Inc.
<120>哺乳動(dòng)物EPO模擬CH1缺失模擬體、組合物、方法及用途<130>CEN0311<140>10/609,783<141>2003-06-30<150>60/412,144<151>2002/09/12<160>80<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(4)..(5)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(11)..(11)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(13)..(13)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>1Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro1 5 10<210>2<211>28<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(4)..(5)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(11)..(11)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(13)..(13)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(16)..(16)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(18)..(19)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(22)..(22)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(25)..(25)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(27)..(27)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>2Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro Tyr Xaa1 5 10 15Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro20 25<210>3<211>28<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(4)..(5)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(11)..(11)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(13)..(13)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(16)..(16)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(18)..(19)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(22)..(22)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(25)..(25)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(27)..(27)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>3Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro Tyr Xaa1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro20 25<210>4<211>28<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(4)..(5)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(11)..(11)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(13)..(13)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(16)..(16)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(18)..(19)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>綜合特征<222>(22)..(22)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(25)..(25)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(27)..(27)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>4Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro Tyr Xaa1 5 10 15Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro20 25<210>5<211>20<212>PRT<213>人<400>5Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly20<210>6<211>20<212>PRT<213>人<400>6
Gly Gly Asp Tyr His Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Leu Gly Gly20<210>7<211>20<212>PRT<213>人<400>7Gly Gly Val Tyr Ala Cys Arg Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Ser1 5 10 15Pro Leu Gly Gly20<210>8<211>20<212>PRT<213>人<400>8Val Gly Asn Tyr Met Cys His Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg1 5 10 15Pro Gly Gly Gly20<210>9<211>20<212>PRT<213>人<400>9Gly Gly Leu Tyr Leu Cys Arg Phe Gly Pro Val Thr Trp Asp Cys Gly1 5 10 15
Tyr Lys Gly Gly20<210>10<211>20<212>PRT<213>人<400>10Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly20<210>11<211>40<212>PRT<213>人<400>l1Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr20 25 30Trp Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly35 40<210>12<211>23<212>PRT<213>人<400>12Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15
Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys20<210>13<211>23<212>PRT<213>人<400>13Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys20<210>14<211>23<212>PRT<213>人<400>14Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys20<210>15<211>46<212>PRT<213>人<400>15Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly
20 25 30Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys35 40 45<210>16<211>23<212>PRT<213>人<400>16Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys20<210>17<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(2)..(3)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(6)..(6)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(9)..(9)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>17
Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys1 5 10<210>18<211>19<212>PRT<213>人<400>18Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro1 5 10 15Gln Gly Gly<210>19<211>19<212>PRT<213>人<400>19Val Gly Asn Tyr Met Ala His Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg1 5 10 15Pro Gly Gly<210>20<211>18<212>PRT<213>人<400>20Gly Gly Pro His His Val Tyr Ala Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Ile Cys
<210>21<211>18<212>PRT<213>人<400>21Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln<210>22<211>20<212>PRT<213>人<400>22Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln1 5 10 15Pro Leu Arg Gly20<210>23<211>22<212>PRT<213>人<400>23Thr Ile Ala Gln Tyr Ile Cys Tyr Met Gly Pro Glu Thr Trp Glu Cys1 5 10 15Arg Pro Ser Pro Lys Ala20<210>24<211>13
<212>PRT<213>人<400>24Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10<210>25<211>11<212>PRT<213>人<400>25Tyr Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys1 5 10<210>26<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(1)..(3)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(6)..(6)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(9)..(10)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>26Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Xaa
1 5 10<210>27<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(2)..(5)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(11)..(12)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>27Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Xaa1 5 10<210>28<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(1)..(1)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征
<222>(3)..(6)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(9)..(14)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>28Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>29<211>16<212>PRT<213>人工的<220>
<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(1)..(1)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(3)..(3)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(5)..(6)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(9)..(9)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(12)..(12)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>綜合特征<222>(14)..(16)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>29Xaa Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa1 5 10 15<210>30<211>20<212>PRT<213>人<400>30Gly Gly Leu Tyr Leu Cys Arg Phe Gly Pro Val Thr Trp Asp Cys Gly1 5 10 15Tyr Lys Gly Gly20<210>31<211>20<212>PRT<213>人<400>31Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly20<210>32<211>20<212>PRT<213>人<400>32
Gly Gly Asp Tyr His Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Leu Gly Gly20<210>33<211>20<212>PRT<213>人<400>33Val Gly Asn Tyr Met Cys His Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg1 5 10 15Pro Gly Gly Gly20<210>34<211>20<212>PRT<213>人<400>34Gly Gly Val Tyr Ala Cys Arg Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Ser1 5 10 15Pro Leu Gly Gly20<210>35<211>19<212>PRT<213>人<400>35Val Gly Asn Tyr Met Ala His Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg1 5 10 15
Pro Gly Gly<210>36<211>18<212>PRT<213>人<400>36Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln<210>37<211>21<212>PRT<213>人<400>37Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Ala Ile Val Cys1 5 10 15Gln Pro Leu Arg Gly20<210>38<211>22<212>PRT<213>人<400>38Thr Ile Ala Gln Tyr Ile Cys Tyr Met Gly Pro Glu Thr Trp Glu Cys1 5 10 15Arg Pro Ser Pro Lys Ala20
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<223>肽<220>
<221>綜合特征<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>綜合特征<222>(4)..(6)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(9)..(9)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<220>
<221>綜合特征<222>(12)..(13)<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸<400>42Ala Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Xaa1 5 10<210>43<211>100<212>DNA<213>人<400>43tacaggccca gatccagggc ggtacctaca gctgccactt cgggcccctc acgtgggtgt60gcaagcccca gggcggcgga agcgggggag gctccggtac 100<210>44<211>96<212>DNA<213>人<400>44cggagcctcc cccgcttccg ccgccctggg gcttgcacac ccacgtgagg ggcccgaagt60ggcagctgta ggtaccgccc tggatctggg cctgta 96<210>45<211>85<212>DNA
<213>人<400>45tacaggccca gggcggtacc tacagctgcc acttcgggcc cctcacgtgg gtgtgcaagc60cccagggcgg cggatcaggt aagtt 85<210>46<211>89<212>DNA<213>人<400>46ctagaactta cctgatccgc egccctgggg cttgcacacc cacgtgaggg gcccgaagtg60gcagctgtag gtaccgccct gggcctgta 89<210>47<211>35<212>PRT<213>人<400>47Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr20 25 30Arg Val Val35<210>48<211>51<212>PRT<213>人<400>48Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Gys50<210>49<211>51<212>PRT<213>人<400>49Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys50<210>50<211>269<212>PRT<213>人<400>50Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu50 55 60Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu65 70 75 80Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys85 90 95Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys100 105 110Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu115 120 125Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys130 135 140Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys145 150 155 160Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser165 170 175Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys180 185 190Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln195 200 205Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
210 215 220Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln225 230 235 240Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn245 250 255His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys260 265<210>51<211>266<212>PRT<213>人<400>51Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys35 40 45Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro50 55 60Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys65 70 75 80Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp85 90 95Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu100 105 110
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu115 120 125His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn130 135 140Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly145 150 155 160Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu165 170 175Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr180 185 190Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn195 200 205Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe210 215 220Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn225 230 235 240Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr245 250 255Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys260 265<210>52<211>37<212>PRT<213>人<400>52
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser35<210>53<211>25<212>PRT<213>人<400>53Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser20 25<210>54<211>102<212>PRT<213>人<400>54Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser1 5 10 15Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp20 25 30Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn35 40 45Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
50 55 60Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu65 70 75 80Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys85 90 95Thr Ile Ser Lys Ala Lys100<210>55<211>107<212>PRT<213>人<400>55Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Aspl 5 10 15Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly65 70 75 80Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105
<210>56<211>20<212>PRT<213>人<400>56Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe1 5 10 15Leu Gly Gly Pro20<210>57<211>102<212>PRT<213>人<400>57Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser1 5 10 15Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp20 25 30Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn35 40 45Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val50 55 60Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu65 70 75 80Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys85 90 95
Thr Ile Ser Lys Ala Lys100<210>58<211>107<212>PRT<213>人<400>58Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu1 5 10 15Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly65 70 75 80Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys100 105<210>59<2ll>102<212>PRT<213>人<400>59Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser1 5 10 15
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp20 25 30Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn35 40 45Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val50 55 60Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu65 70 75 80Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys85 90 95Thr Ile Ser Lys Ala Lys100<210>60<2ll>107<212>PRT<213>人<400>60Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu1 5 10 15Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly65 70 75 80Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys100 105<210>61<211>4<212>PRT<213>人<400>61Gly Gly Gly Ser1<210>62<211>54<212>PRT<213>人<400>62Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys1 5 10 15Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val20 25 30Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys35 40 45Pro Ala Pro Glu Leu Leu50<210>63
<211>57<212>PRT<213>人<400>63Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Ser His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Ser Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala50 55<210>64<211>57<212>PRT<213>人<400>64Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala50 55<210>65<211>57<212>PRT
<213>人<400>65Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala50 55<210>66<211>57<212>PRT<213>人<400>66Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala50 55<210>67<211>57<212>PRT<213>人
<400>67Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu50 55<210>68<211>57<212>PRT<213>人<400>68Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu50 55<210>69<211>57<212>PRT<213>人<400>69
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu50 55<210>70<211>50<212>PRT<213>人<400>70Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser20 25 30Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu35 40 45Phe Leu50<210>71<211>54<212>PRT<2l3>人<400>71Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys35 40 45Pro Ala Pro Glu Phe Leu50<210>72<211>56<212>PRT<213>人<400>72Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly20 25 30Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro35 40 45Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu50 55<210>73<211>58<212>PRT<213>人<400>73Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly20 25 30Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro35 40 45Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu50 55<210>74<211>47<212>PRT<213>人<400>74Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu35 40 45<210>75<211>50<212>PRT<213>人<400>75Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu35 40 45
Leu Leu50<210>76<211>53<212>PRT<213>人<400>76Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro35 40 45Ala Pro Glu Leu Leu50<210>77<211>57<212>PRT<213>人<400>77Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Ala Cys35 40 45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu50 55<210>78<211>57<212>PRT<213>人<400>78Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Ala Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu50 55<210>79<211>57<212>PRT<213>人<400>79Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Ala His Thr Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu50 55
<210>80<211>57<212>PRT<213>人<400>80Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp1 5 10 15Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu20 25 30Val Ala Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Ala Cys35 40 45Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu50 55140
權(quán)利要求
1.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體核酸，包含編碼SEQ ID NO50-51中至少一種氨基酸序列的至少一種多核苷酸，或與其互補(bǔ)的多核苷酸。
2.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體核酸，包含編碼SEQ ID NO62-80中至少一種氨基酸序列的至少一種多核苷酸，或與其互補(bǔ)的多核苷酸。
3.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體核酸，包含編碼式(I)的多肽的至少一種多核苷酸(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為至少一個(gè)具有生物活性的EPO模擬肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可以是1-10中的整數(shù)。
4.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包含SEQ ID NO50-51中的所有連續(xù)氨基酸。
5.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包含SEQ ID NO62-80中的所有連續(xù)氨基酸。
6.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為QIQ，Pep為選自SEQ ID NOS1-42中的至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex包括GGGS(SEQ ID NO61)，V2為GTLVTVSS(SEQ ID NO52)，pHinge為EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO53)，CH2為SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO54)，CH3為GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO55)，n和m為1-10中的整數(shù)。
7.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為QIQ，Pep為選自SEQ ID NOS1-42中的至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex包括GGGS，V2為GTLVTVSS(SEQ ID NO52)，pHinge為ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO56)，CH2為SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO57)，CH3為GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO58)，n和m為1-10中的整數(shù)。
8.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為人類可變區(qū)的N末端部分，Pep為選自SEQ ID NOS1-42中的至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO54)，CH3為GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO55)，n和m為1-10中的整數(shù)。
9.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為人類可變區(qū)的N末端部分，Pep為選自SEQ ID NOS1-42中的至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO59)，CH3為GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO60)，n和m為1-10中的整數(shù)。
10.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為QIQ，P8p為選自SEQ ID NOS1-42中的至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m為1-10中的整數(shù)。
11.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為至少一個(gè)具有生物活性的EPO模擬肽，F(xiàn)lex包括GGGS(SEQ ID NO61)，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m為1-10中的整數(shù)。
12.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為至少一個(gè)具有生物活性的EPO模擬肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為GTLVTVSS(SEQ ID NO52)，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可為1-10中的整數(shù)。
13.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V 1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為至少一個(gè)具有生物活性的EPO模擬肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO53)，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可為1-10中的整數(shù)。
14.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為選自SEQ IDNOS1-20的至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可為1-10中的整數(shù)。
15.至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1為免疫球蛋白可變區(qū)N末端的至少一個(gè)部分，Pep為選自SEQ IDNOS21-42中的至少一個(gè)具有生物活性的肽，F(xiàn)lex為通過使模擬體具有可選的取向和結(jié)合特性，從而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，V2為免疫球蛋白可變區(qū)C末端的至少一個(gè)部分，pHinge為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個(gè)部分，n和m可為1-10中的整數(shù)。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)中的EPO模擬CH1缺失模擬體核酸或EPO模擬CH1缺失模擬體多肽，其中該多肽具有至少一種Pep多肽的至少一種活性。
17.一種抗獨(dú)特型單克隆或多克隆抗體，融合蛋白，或其片段，可與權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)中的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽特異性結(jié)合。
18.編碼權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽或EPO模擬CH1缺失模擬體抗體的EPO模擬CH1缺失模擬體核酸。
19.包含權(quán)利要求18的至少一種分離核酸的EPO模擬CH1缺失模擬體載體。
20.包含權(quán)利要求18的分離核酸的EPO模擬CH1缺失模擬體宿主細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的EPO模擬CH1缺失模擬體宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞為選自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、NSO、DG44CHO、CHO K1、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞，或上述細(xì)胞的任意衍生、無限增殖化或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的至少一種細(xì)胞。
22.一種生成至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽或EPO模擬CH1缺失模擬體抗體的方法，包括在體外、體內(nèi)或原位條件下，翻譯權(quán)利要求18的核酸，使EPO模擬CH1缺失模擬體或抗體以可檢測(cè)或可回收的數(shù)量被表達(dá)。
23.一種組合物，包含至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體核酸、EPO模擬CH1缺失模擬體多膚，或權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中的EPO模擬CH1缺失模擬體抗體。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中該組合物進(jìn)一步包含至少一種藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑。
25.權(quán)利要求23的組合物，進(jìn)一步包括至少一種組合物，該組合物含有治療有效量的至少一種化合物、組合物或多肽，該化合物、組合物或多肽選自可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道分子、TNF拮抗劑、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于平衡體液或電解液的藥物、血液藥物、抗腫瘤藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、眼、耳或鼻用藥、局部用藥、營(yíng)養(yǎng)藥、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑中的至少一種。
26.權(quán)利要求23的組合物，其形式為選自液體、氣體或干燥物、溶液、混合物、懸液、乳濁液或膠體、凍干制劑或粉末中的至少一種。
27.一種診斷或治療細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物中的EPO配體相關(guān)狀況的方法，包括(a)使細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物接觸或?qū)ζ涫┯靡环N組合物，該組合物含有有效量的權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體核酸、多肽或抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述有效量為每公斤上述細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物施用0.001-50mg的EPO模擬CH1缺失模擬體抗體；0.000001-500mg的上述EPO模擬CH1缺失模擬體；或0.0001-100μg的上述EPO模擬CH1缺失模擬體核酸。
29.權(quán)利要求27的方法，其中上述接觸或施用是通過選自腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、病變內(nèi)、藥團(tuán)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮途徑中的至少一種模式實(shí)現(xiàn)的。
30.權(quán)利要求27的方法，進(jìn)一步包括在上述(a)接觸或施用之前、同時(shí)或之后，施用至少一種組合物，該組合物含有治療有效量的至少一種化合物或多肽，該化合物或多肽選自可檢測(cè)標(biāo)記或受體、TNF拮抗劑、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于平衡體液或電解液的藥物、血液藥物、抗腫瘤藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、眼、耳或鼻用藥、局部用藥、營(yíng)養(yǎng)藥、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑中的至少一種。
31.一種裝置，含有權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中的至少一種分離的EPO模擬CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸，其中該裝置適用于通過選自腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、病變內(nèi)、藥團(tuán)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮途徑中的至少一種模式，接觸或施用上述至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸。
32.一種用于人類藥物或診斷用途的制品，包括包裝材料和容器，該容器含有權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中的至少一種分離的EPO模擬CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸。
33.權(quán)利要求34的制品，其中上述容器為腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、病變內(nèi)、藥團(tuán)、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內(nèi)或經(jīng)皮送遞裝置或系統(tǒng)的一個(gè)組成部分。
34.一種用于生成權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)中的至少一種分離的EPO模擬CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸的方法，該方法包括提供至少一種能夠以可檢測(cè)或可回收的量表達(dá)上述多肽、抗體或核酸的宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞。
35.由權(quán)利要求34的方法所生成的至少一種EPO模擬CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少一種新的EP0人CH1缺失模擬體或特定部分或變體，包括編碼至少一種CH1缺失模擬體或特定部分或變體的分離核酸、CH1缺失模擬體或特定部分或變體、載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物，及其制備和使用方法，包括治療組合物、方法和裝置。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1735433SQ03820110
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者G·A·希納, D·M·奈特, J·格拉耶, B·J·斯卡倫, T·C·內(nèi)斯珀?duì)? K·A·庫托洛斯基 申請(qǐng)人:森托科爾公司