專利名稱：一種治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體地，涉及一種治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤疾病的方法。
背景技術(shù)：
細胞分裂和細胞增殖速率加快會導(dǎo)致癌癥的發(fā)病幾率提高。近年來的臨床研究表明，胰島素樣生長因子與多種常見癌癥(如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等)的發(fā)病有直接關(guān)系。胰島素樣生長因子在有絲分裂中發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的作用，它不僅刺激細胞酶原還抑制細胞凋亡，這對腫瘤的產(chǎn)生有直接影響。胰島素樣生長因子的效果是通過胰島素樣生長因子受體來介導(dǎo)的。胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II通過結(jié)合到胰島素樣生長因子受體來介導(dǎo)其效果。
在多種癌細胞中胰島素樣生長因子受體的表達高于臨近的正常組織，并在癌細胞凋亡的過程中介導(dǎo)其增殖和轉(zhuǎn)移。胰島素樣生長因子結(jié)合到胰島素樣生長因子受體上，激活酪氨酸激酶使細胞的增殖增強，并通過包括PI3激酶/ Akt的信號通路和MAPK途徑介導(dǎo)細胞的生存。阻止胰島素樣生長因子與胰島素樣生長因子受體的結(jié)合可使細胞增殖所需的信號介導(dǎo)被抑制，從而降低或者消除癌癥的發(fā)病幾率。所以，在本領(lǐng)域中，有必要發(fā)展阻止胰島素樣生長因子與胰島素樣生長因子受體結(jié)合的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是提供一種治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤疾病的方法。通過將具有本申請所記載的特定氨基酸序列的抗體的藥物作用于哺乳動物本體，可以阻止胰島素樣生長因子與胰島素樣生長因子受體結(jié)合，從而減少或者消除哺乳動物體內(nèi)的腫瘤疾病。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下
一種治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤疾病的方法，它包括給藥物至哺乳動物主體；所述的藥物包括抗體，所述的抗體中含有 SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8中記載的氨基酸序列；所述的抗體特異性地結(jié)合到胰島素樣生長因子I上，能減少或消除哺乳動物體內(nèi)的腫瘤疾病。所述的抗體特異性地結(jié)合到胰島素樣生長因子I上，能減少或消除哺乳動物體內(nèi)的腫瘤疾病。所述的抗體也可以特異性地結(jié)合到胰島素樣生長因子II上。所述的腫瘤疾病是固體腫瘤、血液惡性腫瘤、白血病、大腸癌、良性或惡性乳腺癌、子宮癌、子宮肌瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、多囊卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大癥、腦垂體癌、子宮腺肌病、腺癌、腦膜瘤、黑色素瘤、骨腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、膠質(zhì)瘤或星形母細胞癌。具體地，所述的腫瘤疾病是指所述的哺乳動物體內(nèi)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。
具體地，所述的腫瘤疾病是指所述的哺乳動物體內(nèi)的乳腺癌轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明將具有特定氨基酸序列的抗體的藥物作用于哺乳動物本體，抗體與胰島素樣生長因子特異性結(jié)合，阻止胰島素樣生長因子與胰島素樣生長因子受體結(jié)合，抑制胰島素樣生長因子在體內(nèi)或體外表達細胞增殖的能力，從而減少或者消除哺乳動物體內(nèi)的腫瘤疾病。


圖I展示了 AC112、AC113和AC122結(jié)合到胰島素樣生長因子I的情況 圖2展示了 AC112、AC113和AC122結(jié)合到胰島素樣生長因子II的情況
圖3展示了 AC122和AC122-1結(jié)合到胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II的情況示 圖4展示了 AC122-1在MCF-7乳腺癌細胞中對胰島素樣生長因子受體磷酸化的抑制 圖5展示了 AC122-1對MCF-7乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，本發(fā)明的保護范圍不僅限于下述實施例。實施例I :
目前，大部分可用的胰島素樣生長因子抗體都不是來自人類，而是來自鼠類。發(fā)明人利用包含101°個不同噬菌體展示的人源性Fab庫開發(fā)出針對胰島素樣生長因子的單克隆抗體。通過酶聯(lián)免疫吸附法，利用胰島素樣生長因子I作為靶抗原，經(jīng)過三輪篩選，得到200個隨機個體噬菌體克隆。對能明顯結(jié)合到胰島素樣生長因子I的單克隆抗體進行測序，其中3個單克隆抗體具有獨特的序列，它們在噬菌體內(nèi)以可溶性Fab表達。其中一個單克隆抗體AC122在上述的酶聯(lián)免疫吸附法檢測中，對胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II都顯示出較強的結(jié)合特異性，另外兩個單克隆抗體，AC112和AC113則只對胰島素樣生長因子I顯示出結(jié)合特異性。人源性Fab庫作為打亂庫中特異性抗體輕鏈可變區(qū)基因VL全部組成部分的來源。在從人源性Fab庫進行噬菌體的制備時，首先用Nco I和Spe I進行酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，以去除所有的特異性抗體重鏈可變區(qū)基因VH。對單克隆抗體AC122的VH區(qū)的基因編碼進行擴增，引入隨機突變，然后與CHI的基因片段相融合。融合片段通過Nco I和Spe I進行酶切，然后將其從凝膠中純化出來，并連接到純化的主體載體，得到打亂庫中特異性抗體輕鏈可變區(qū)基因VL的全部組成部分。從打亂庫中得到2X IO8個獨立的單克隆抗體，所述單克隆抗體為AC122的變異體。通過針對胰島素樣生長因子I共軛珠的兩輪篩選，并通過酶聯(lián)免疫吸附法進行第二輪篩選后得到200個單克隆抗體。對能明顯結(jié)合到胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II的單克隆抗體進行測序，其中5個單克隆抗體AC122-1具有獨特的序列，他對胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II都顯示出很強的結(jié)合特異性。其中，AC112的特異性抗體重鏈可變區(qū)基因VH包含SEQ ID NO 1中記載的氨基酸序列，AC112的特異性抗體輕鏈可變區(qū)基因VL包含SEQ ID NO 2中記載的氨基酸序列；AC113的特異性抗體重鏈可變區(qū)基因VH包含SEQ ID NO :3中記載的氨基酸序列，AC113的特異性抗體輕鏈可變區(qū)基因VL包含SEQ ID NO 4中記載的氨基酸序列；
AC122的特異性抗體重鏈可變區(qū)基因VH包含SEQ ID NO :5中記載的氨基酸序列，AC122的特異性抗體輕鏈可變區(qū)基因VL包含SEQ ID NO 6中記載的氨基酸序列；
AC122-1的特異性抗體重鏈可變區(qū)基因VH包含SEQ ID NO 7中記載的氨基酸序列，AC122-1的特異性抗體輕鏈可變區(qū)基因VL包含SEQ ID NO 8中記載的氨基酸序列。上述4種抗體與胰島素樣生長因子I或胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II特異性結(jié)合，抗體與胰島素樣生長因子受體存在競爭關(guān)系，從而阻止胰島素樣生長因子與胰島素樣生長因子受體結(jié)合，使得細胞增殖所需的信號介導(dǎo)被抑制。如圖I和圖2所示，通過酶聯(lián)免疫吸附法測試，ACl 12和ACl 13與胰島素樣生長因子I特異性結(jié)合，并不與胰島素樣生長因子II結(jié)合，AC122與胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II特異性結(jié)合，并且其結(jié)合能力優(yōu)于AC112和AC113。 如圖3所示，通過酶聯(lián)免疫吸附法測試，隨著抗體濃度的提高，抗體與胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II的結(jié)合量逐漸增大，在濃度相同的情況下，AC122-1的結(jié)合能力優(yōu)于AC122的結(jié)合能力。從中可以看出，AC122-1是本發(fā)明的一個較佳實施方式。實施例2:
本實施例以MCF-7乳腺癌細胞為例進行說明。MCF-7細胞以I. OX 106每孔接種到一個6孔板的完全生長培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)后，用無血清DMEM培養(yǎng)液沖洗細胞，然后在無血清DMEM培養(yǎng)6小時，其中的MCF-7細胞會因為缺乏營養(yǎng)物質(zhì)而死亡。用不同濃度的重組Fab或IgG培養(yǎng)細胞30分鐘，然后加入I. 5nM含有AC122-1的胰島素樣生長因子I或者IOnM含有AC122-1的胰島素樣生長因子II至培養(yǎng)基中。20分鐘后，將細胞置于冰上冷卻，用冷聚丁二酸丁二脂進行沖洗，用 Iml 裂解緩沖液[50mmol/L HEPES (pH 7. 4), 150mmol/L NaCl,10%甘油，l%Triton X-100,1. 5mmol/L MgC12，2mmol/L釩酸鈉和蛋白酶抑制劑]進行裂解。裂解液置于冰上30分鐘，再于17，000X g下離心30分鐘。收集上清液用于免疫沉淀，胰島素樣生長因子被免疫析出。經(jīng)過深入的洗滌后，免疫沉淀在4% 12%的預(yù)支蛋白膠上展開，轉(zhuǎn)移到聚偏~■氣乙纟布I旲，并用抗憐Ife化抗體4610涂抹。在免疫沉丨疋中，I旲被剝尚，并用C-20多克隆抗體或C-19重新檢測總的胰島素樣生長因子受體。如圖4所示，AC122-1在MCF-7乳腺癌細胞中，可以有效抑制胰島素樣生長因子受體的磷酸化，減少了胰島素樣生長因子受體的信息介導(dǎo)作用，使MCF-7乳腺癌細胞的細胞增殖活動減弱甚至消失。實施例3
本實施例以MCF-7乳腺癌細胞為例進行說明。使用8μπι孔徑的聚碳酸酯膜的Transwell培養(yǎng)板，其底部的井中包含2. 6ml有5%胎牛血清和不同濃度AC122-1的DMEM。用含5%胎牛血清的DMEM和無血清的DMEM分別作為陽性和陰性對照。頂端插入包含O. 5 X IO6 MCF-7乳腺癌細胞單細胞懸浮液的無血清DMEM 1.5ml。細胞在37°C的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。四小時后，用棉簽擦掉附著在細胞膜上側(cè)的細胞。對附著在細胞膜下側(cè)的細胞進行染色。將聚碳酸酯膜從transwell上拆除，安裝到顯微鏡的幻燈片上，并在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。如圖5所示，AC122-1對于癌細胞的轉(zhuǎn)移具有抑制作用，40 nmol/L濃度的AC122-1可抑制5%胎牛血清的培養(yǎng)基中40%的MCF-7乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明所述的治療哺乳動物體內(nèi)的腫瘤疾病的方法，其原理并不針對于某一特定腫瘤疾病。使用本發(fā)明所述方法即可實現(xiàn)對腫瘤疾病的治療。說明書中以MCF-7乳腺癌細胞為例已足以說明本發(fā)明對腫瘤疾病的治療效果。未針對其它腫瘤疾病進行說明并不能視為本發(fā)明的公開不充分。 ·
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤疾病的方法，其特征在于，它包括 給藥物至哺乳動物主體； 所述的藥物包括抗體，所述的抗體中含有SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 8 中記載的氨基酸序列； 所述的抗體特異性地結(jié)合到胰島素樣生長因子I上，能減少或消除哺乳動物體內(nèi)的腫瘤疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的抗體特異性地結(jié)合到胰島素樣生長因子II上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的腫瘤疾病是固體腫瘤、血液惡性腫瘤、白血病、大腸癌、良性或惡性乳腺癌、子宮癌、子宮肌瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、多囊卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大癥、腦垂體癌、子宮腺肌病、腺癌、腦膜瘤、黑色素瘤、骨腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、膠質(zhì)瘤或星形母細胞癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的腫瘤疾病是指所述的哺乳動物體內(nèi)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的腫瘤疾病是指所述的哺乳動物體內(nèi)的乳腺癌轉(zhuǎn)移。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤疾病的方法，它包括給藥物至哺乳動物主體；所述的藥物包括抗體，所述的抗體中含有SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7或SEQIDNO8中記載的氨基酸序列；所述的抗體特異性地結(jié)合到胰島素樣生長因子I上，所述的抗體也可以特異性地結(jié)合到胰島素樣生長因子II上。本發(fā)明將具有特定氨基酸序列的抗體的藥物作用于哺乳動物本體，抗體與胰島素樣生長因子特異性結(jié)合，阻止胰島素樣生長因子與胰島素樣生長因子受體結(jié)合，從而減少或者消除哺乳動物體內(nèi)的腫瘤疾病。
文檔編號A61P35/00GK102793922SQ201210287859
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者丁兆, 朱仲玉 申請人:四川匯宇制藥有限公司