載體克隆表達(dá)區(qū)基因和蛋白分泌型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因重組和蛋白表達(dá)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種蛋白分泌型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表 達(dá)載體克隆表達(dá)區(qū)基因的設(shè)計(jì)及其應(yīng)用，構(gòu)建成一種新型的蛋白分泌型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 載體 pcDNA3. 1-secreting。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，大量哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白都是糖蛋白，這類蛋白在表達(dá)過(guò)程中需要翻 譯后修飾。因此，如以基因工程技術(shù)來(lái)大量制備此類蛋白，原核宿主細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞等是不 適合的。由于這個(gè)原因，研究者開發(fā)了利用高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）的蛋白表達(dá)系 統(tǒng)。然而，以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白，其生產(chǎn)和回收技術(shù)存在的主要問題是這些蛋白主要 被表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而不能分泌到細(xì)胞外空間，因此后續(xù)對(duì)這些蛋白的純化必須先裂解細(xì) 胞，然后經(jīng)幾步程序使所表達(dá)的目的蛋白與其它胞內(nèi)蛋白分離。解決這個(gè)問題的方法之一 是使表達(dá)的重組蛋白能夠分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。這樣可以較為容易而有效地進(jìn)行純 化。此外，分泌產(chǎn)生的重組蛋白的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可避免被蛋白酶水解并且蛋白質(zhì)正確折疊 的機(jī)會(huì)更大。蛋白質(zhì)的成功分泌要求蛋白質(zhì)能有效穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞膜。這就需要在要 表達(dá)的目的蛋白氨基端連接一段附加的肽序列，此附加序列可使其后融合的目的蛋白分子 進(jìn)入分泌通路。此附加肽序列被稱為信號(hào)肽序列。
[0003] 載體pcDNA3. 1載體是一種可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體，其高 效的CMV啟動(dòng)子，可在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被高效激活，用于多種真核生物蛋白的表達(dá)。但 是pcDNA3. 1載體缺乏有效信號(hào)肽序列，不能將表達(dá)的蛋白質(zhì)分子分泌到細(xì)胞外，這對(duì)于后 續(xù)對(duì)表達(dá)的蛋白的提取和分離造成嚴(yán)重不便。本發(fā)明在大量生物信息學(xué)模擬分析，多種序 列組合的設(shè)計(jì)和實(shí)際生物學(xué)活性篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)pcDNA3. 1載體進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)并合 成一種載體克隆表達(dá)區(qū)基因，構(gòu)建了一種新型表達(dá)載體pcDNA3. Ι-secreting,該載體可使 編碼基因連接于多克隆位點(diǎn)處的外源蛋白在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中以胞外分泌的形式表達(dá) 出來(lái)，分泌于細(xì)胞培養(yǎng)液中，便于收集和純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一種蛋白分泌型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體克隆表達(dá)區(qū)基因及 其應(yīng)用，獲得一種能夠有效的將外源蛋白分泌表達(dá)到細(xì)胞外培養(yǎng)基中的新型哺乳動(dòng)物細(xì)胞 表達(dá)載體 pcDNA3. 1-secreting。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 設(shè)計(jì)并合成載體克隆表達(dá)區(qū)基因，其具有序列表SEQ ID NO :1中堿基序列；
[0007] SEQ ID NO ： 1
[0008] GGCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGC 40
[0009] TTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGCAAGCTT 72
[0010] 利用限制性核酸內(nèi)切酶Nhe I和Hind III的酶切連接技術(shù)，將合成的載體克隆表 達(dá)區(qū)基因(序列表SEQ ID NO :1中堿基序列）整合入表達(dá)載體pcDNA3. 1克隆表達(dá)區(qū)，構(gòu)建成 新型表達(dá)載體pcDNA3. Ι-secreting。該載體可使編碼基因連接于多克隆位點(diǎn)處的外源蛋白 在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中以胞外分泌的形式表達(dá)出來(lái)，分泌于細(xì)胞培養(yǎng)液中，便于收集和純 化。
[0011] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0012] 1.本發(fā)明構(gòu)建的新型表達(dá)載體pcDNA3. Ι-secreting,在緊鄰啟動(dòng)子下游區(qū)添加 了高效的分泌信號(hào)肽序列，可使克隆于下游的外源編碼基因表達(dá)的蛋白分子分泌到細(xì)胞外 培養(yǎng)基中，既方便了后續(xù)的純化提取，省略了細(xì)胞破碎的過(guò)程；又避免表達(dá)的外源蛋白在細(xì) 胞內(nèi)被胞內(nèi)蛋白酶水解，因此可以顯著提高蛋白表達(dá)效率。
[0013] 2.本發(fā)明構(gòu)建的新型表達(dá)載體pcDNA3. Ι-secreting,在啟動(dòng)子下游和多克隆位 點(diǎn)上游添加了 ATG起始密碼子和Kozak序列，Kozak序列可以極大提商基因轉(zhuǎn)錄后的蛋白 翻譯效率。因此以本發(fā)明所構(gòu)建的載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中行進(jìn)外源蛋白表達(dá)時(shí)，無(wú)需再于 編碼基因中額外添加 ATG和Kozak序列，大大的簡(jiǎn)化了外源基因片段亞克隆至本載體的過(guò) 程。
[0014] 3.本發(fā)明構(gòu)建的新型表達(dá)載體pcDNA3. Ι-secreting,盡可能地保留了原載體的 pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)區(qū)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，方便外源基因片段的連接和插入。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)檢測(cè)的原有pcDNA3. 1(+)載體和本發(fā)明中的 pcDNA3. Ι-secreting載體在HEK293細(xì)胞中表達(dá)重組人IL-6 (rhIL-6)蛋白片段的結(jié)果， 白框部分為細(xì)胞培養(yǎng)基中的rhIL-6含量，灰框部分為細(xì)胞破碎后細(xì)胞質(zhì)中的rhIL-6含量。 由圖可知，以pcDNA3. 1 (+)載體在HEK293細(xì)胞中表達(dá)的rhIL-6,基本分部于細(xì)胞質(zhì)中，而培 養(yǎng)基中含量極低；而以本發(fā)明中構(gòu)建的新型表達(dá)載體pcDNA3. Ι-secreting在HEK293細(xì)胞 中表達(dá)的rhIL-6,可以被有效的分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，便于后續(xù)的分離與純化。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 載體克隆表達(dá)區(qū)基因的制備，其具有序列表SEQ ID NO : 1中所不的喊基序列：
[0018] (I) SEQ ID NO. 1的信息（參見序列表）
[0019] (a)序列特征：
[0020] *長(zhǎng)度：72堿基對(duì)
[0021] *類型：核酸
[0022] *鏈型：雙鏈
[0023] *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性
[0024] (b)分子類型：寡聚核苷酸鏈
[0025] (C)假設(shè)：否
[0026] (d)反義：否
[0027] (e)最初來(lái)源：設(shè)計(jì)并人工合成
[0028] (2)載體克隆表達(dá)區(qū)基因的制備
[0029] 1)載體克隆表達(dá)區(qū)基因的設(shè)計(jì)合成：
[0030] 根據(jù)構(gòu)建新型表達(dá)載體的預(yù)期目的，設(shè)計(jì)并合成兩條寡聚核苷酸鏈：正向鏈P-F:
[0031] 5 ' -GCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGC A-3,；
[0032] 反向鏈 p-R:
[0033] 5 ' -AGCTTGCACCTCACCCCGGGAAGCCACAAAAGCAGCAAGCCCAGAAATTGAGGAGGAACTCTCAT
[0034] 2)寡聚核苷酸鏈的退火：
[0035] IOX退火雜交緩沖液（SSC)成分：1. 5mol/LNaCl
[0036] 0· 3M 檸檬酸三鈉· 2H20，
[0037] 以 HCl 調(diào) pH 至 7. 0
[0038] 退火反應(yīng)體系：
[0039] 10XSSC buffer 1 μ I
[0040] 正反寡聚核苷酸鏈各5pmol
[0041] 無(wú)菌超純水 補(bǔ)齊體