專利名稱：釀酒酵母erg4突變體在表達哺乳動物來源的葡萄糖轉運蛋白中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能夠功能性表達人GLut4和GLut1轉運蛋白的酵母菌株。
背景技術：
多數(shù)異養(yǎng)細胞經(jīng)由特定的轉運蛋白將葡萄糖轉運到細胞內。不同的生物發(fā)展出不同的介導葡萄糖轉運的機制，如特別是質子協(xié)同運輸系統(tǒng)、Na+葡萄糖轉運蛋白、結合蛋白依賴的系統(tǒng)、磷酸轉移酶系統(tǒng)和用于易化擴散的系統(tǒng)。在真核生物中，由哺乳動物體內GLUT基因(GLUT＝葡萄糖轉運蛋白)編碼和由釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中HXT基因(HXT＝己糖轉運蛋白)編碼的葡萄糖轉運蛋白家族介導經(jīng)由易化擴散的葡萄糖攝取。所述轉運蛋白屬于更大的糖轉運蛋白家族。它們的特征在于存在12個跨膜螺旋和多個保守氨基酸殘基。葡萄糖轉運在與葡萄糖穩(wěn)態(tài)缺陷相關的紊亂(如糖尿病或Fanconi-Bickel綜合癥)中扮演重要的角色。因此，哺乳動物體內的葡萄糖轉運已成為許多研究的主題。到目前為止，已鑒定了13種葡萄糖轉運蛋白樣蛋白質(GLUT1到GLUT12、HMIT-H-肌醇轉運蛋白)。所述轉運蛋白在以下方面扮演著關鍵的角色，包括將葡萄糖攝取進各種組織、葡萄糖在肝臟中的儲存、肌細胞和脂肪細胞對葡萄糖的胰島素依賴性攝取以及胰腺β-細胞對葡萄糖的測量。
GLUT1介導將葡萄糖轉運進紅細胞并通過血腦屏障，但GLUT1也表達于許多其它組織，而GLUT4限于胰島素依賴性組織，主要是肌肉和脂肪組織。在所述胰島素依賴性組織中，控制GLUT4轉運蛋白的胞內區(qū)室或質膜區(qū)室定向是一種重要的調節(jié)葡萄糖攝取的機制。在胰島素存在下，胞內GLUT4重分布穿過質膜，以便促進葡萄糖攝取。GLUT1同樣表達于所述胰島素依賴性組織，并且其在細胞內的分布同樣受胰島素影響，雖然影響強度并不如GLUT4。此外，GLUT1或GLUT4催化糖轉運的相對效率不僅被各轉運蛋白導向細胞表面的程度所決定，還受它們的動力學特性所決定。
不同的葡萄糖轉運蛋白同種型被共表達的事實以及迅速的葡萄糖代謝已經(jīng)使有關胰島素依賴性組織中各種葡萄糖轉運蛋白同種型的作用和確切性質的研究變得復雜。為了解決這些難題，使用了如非洲爪蟾屬(Xenopus)卵母細胞、組織培養(yǎng)細胞、昆蟲細胞和酵母細胞之類的異源表達系統(tǒng)。但是，出現(xiàn)了一些看來與這些系統(tǒng)有關的困難異源表達的轉運蛋白的活性太低、所述系統(tǒng)自身的葡萄糖轉運蛋白、相當比例的轉運蛋白滯留在胞內或甚至產(chǎn)生無活性的轉運蛋白。
可以在特定的條件下，在釀酒酵母菌株中以功能方式表達天然哺乳動物GLUT4蛋白質，特別是人的GLUT4蛋白質。
酵母細胞是單細胞真核生物。因此，它們比細菌系統(tǒng)更適合表達某些蛋白質，特別是涉及進行鑒定藥物活性物質的篩選試驗時。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及純化和分離的多核苷酸，其含有編碼GLUT4V85M蛋白質的DNA序列。
所述蛋白質在人GLUT4蛋白質氨基酸鏈的85位置含有由纈氨酸到甲硫氨酸的氨基酸交換。這一改變的GLUT4V85M蛋白質為表達有功能的GLUT4蛋白質提供了另外的可選方案。如果自身葡萄糖轉運蛋白完全失活(＝hxt(-))的釀酒酵母菌株在表達所述GLUT4蛋白質之后能夠被觀測到存在葡萄糖的攝取，則應該認為就釀酒酵母而言GLUT4蛋白質是有功能的?？梢酝ㄟ^對放射性標記葡萄糖的轉運測量或通過以葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長來測定葡萄糖攝取。
在一個優(yōu)選的實施方案中，純化和分離的包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸可以包括或含有以下序列a)根據(jù)Seq ID No.1的核苷酸序列，b)在嚴緊性條件下與Seq ID No.1的序列雜交并編碼GLUT4V85M蛋白質的核苷酸序列。
純化和分離的多核苷酸優(yōu)選編碼具有Seq ID No.2的氨基酸序列的GLUT4V85M蛋白質。
純化和分離的含有如先前討論的編碼GLUT4V85M蛋白質的DNA序列的多核苷酸可以與啟動子操作性連接(operationally link)。合適的啟動子尤其是原核或真核啟動子，如Lac-、trp-、ADH-或HXT7啟動子。如果細菌或真核生物在載體的協(xié)助下通過所述啟動子產(chǎn)生能夠被翻譯成GLUT4V85M蛋白質的mRNA，則編碼GLUT4V85M蛋白質的多核苷酸部分精確地與啟動子操作性連接。這種載體的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)載體。可以通過所述載體在酵母細胞中表達GLUT4V85M蛋白質。
在一個優(yōu)選的實施方案中，以上描述的含有編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸適于在酵母細胞中復制，或適于在酵母細胞中表達編碼GLUT4V85M蛋白質的多核苷酸部分以提供GLUT4V85M蛋白質。來自釀酒酵母的酵母細胞特別合適。為了在酵母細胞中復制和表達，含有編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸以酵母載體的形式存在。編碼GLUT4V85M蛋白質的多核苷酸區(qū)域可以與酵母細胞特異的啟動子操作性連接，所述啟動子如ADH啟動子(醇脫氫酶啟動子)或HXT7啟動子(己糖轉運蛋白啟動子)。酵母載體是開發(fā)用于在酵母中克隆DNA的一組載體。
本發(fā)明還涉及來自釀酒酵母的酵母細胞，其中所有的葡萄糖轉運蛋白不再具有功能(＝hxt(-))并且不含有功能性Erg4蛋白質。優(yōu)選的這種酵母細胞是作為釀酒酵母DSM 15187保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick，Germany))的酵母細胞。
本發(fā)明還涉及其所有的葡萄糖轉運蛋白不再具有功能并且不含有功能性Fgy1和功能性Erg4蛋白質的酵母細胞。Erg4蛋白質或Fgy1蛋白質的缺乏尤其可以由相應的基因組編碼區(qū)域的中斷或所述基因組編碼區(qū)域的部分或完全去除而引起。
對于不含有功能性葡萄糖轉運蛋白、功能性Fgy1蛋白質和功能性Erg4蛋白質的酵母細胞，優(yōu)選使用以釀酒酵母DSM 15184保藏于DSMZ的酵母細胞。
如上所述的酵母細胞優(yōu)選用于表達哺乳動物GLUT1蛋白質或哺乳動物GLUT4蛋白質，特別是來自大鼠、小鼠、兔、豬、?；蜢`長類的蛋白質。一個優(yōu)選的實施方案使用酵母細胞表達人GLUT4或GLUT1蛋白質。
其全部葡萄糖轉運蛋白及Erg4蛋白質不再具有功能的釀酒酵母細胞可以含有本發(fā)明多核苷酸，其中該多核苷酸含有編碼GLUT4V85M蛋白質的DNA序列。所述酵母細胞也可以表達GLUT4V85M蛋白質并因此含有該蛋白質。
優(yōu)選保藏于DSMZ的釀酒酵母DSM 15185酵母菌株作為這種含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸的酵母菌株。
可以通過下述方法制備其全部葡萄糖轉運蛋白及Erg4蛋白質不再具有功能并且含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸的酵母細胞a)提供其全部葡萄糖轉運蛋白及Erg4蛋白質不再具有功能的酵母細胞，b)提供可以在酵母細胞中復制的分離并純化的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼GLUT4V85M蛋白質的DNA序列，c)用來自b)的多核苷酸轉化來自a)的酵母細胞，d)選擇轉化的酵母細胞，e)適當時表達GLUT4V85M蛋白質。
分離并純化的含有編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸優(yōu)選是能夠在酵母細胞中復制的載體，其中所述DNA序列被克隆在此載體中。這種載體的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)。
本發(fā)明還涉及其全部葡萄糖轉運蛋白及Fgy1和Erg4蛋白質不再具有功能的酵母細胞，其中該酵母細胞含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸。所述酵母細胞也可以表達GLUT4V85M蛋白質并因此含有該蛋白質。這種酵母菌株優(yōu)選為保藏于DSMZ的釀酒酵母DSM15186。
可以通過下述方法制備其全部葡萄糖轉運蛋白及Fgy1和Erg4蛋白質不再具有功能并且含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸的酵母細胞a)提供其全部葡萄糖轉運蛋白及Fgy1和Erg4蛋白質不再具有功能的酵母細胞，b)提供可以在酵母細胞中復制的分離并純化的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼GLUT4V85M蛋白質的DNA序列，c)用來自b)的多核苷酸轉化來自a)的酵母細胞，d)選擇轉化的酵母細胞，e)適當時表達GLUT4V85M蛋白質。
上述分離并純化的含有編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸優(yōu)選是能夠在酵母細胞中復制的載體，其中所述DNA序列被克隆在此載體中。這種載體的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)。
本發(fā)明還涉及其全部葡萄糖轉運蛋白不再具有功能的酵母細胞，其中所述酵母細胞含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸。
所述酵母細胞也可以表達GLUT4V85M蛋白質并因此含有該蛋白質。優(yōu)選的這種酵母菌株是保藏于DSMZ的釀酒酵母DSM 15188菌株。
可以通過下述方法制備其全部葡萄糖轉運蛋白不再具有功能并且含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸的酵母細胞a)提供其全部葡萄糖轉運蛋白不再具有功能的酵母細胞，b)提供可以在酵母細胞中復制的分離并純化的多核苷酸，該多核苷酸含有編碼GLUT4V85M蛋白質的DNA序列，c)用來自b)的多核苷酸轉化來自a)的酵母細胞，d)選擇轉化的酵母細胞，e)適當時表達GLUT4V85M蛋白質。
分離并純化的含有編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸優(yōu)選是能夠在酵母細胞中復制的載體，其中所述DNA序列被克隆在此載體中。這種載體的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)。
本發(fā)明還涉及具有根據(jù)Seq ID No.2的氨基酸序列的蛋白質。該蛋白質是人GLUT4蛋白質，其中在氨基酸鏈85位置的纈氨酸已經(jīng)被甲硫氨酸所替代。
本發(fā)明還涉及鑒定刺激GLUT4蛋白質活性的化合物的方法，其包括步驟a)提供其全部葡萄糖轉運蛋白及Erg4蛋白質不再具有功能并含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列的多核苷酸的酵母細胞，b)提供化學化合物，c)將a)的酵母細胞與b)的化學化合物接觸，d)測定c)的酵母的葡萄糖攝取，e)將d)的葡萄糖攝取檢測值和未與b)中所述的化學化合物相接觸的a)中所述酵母細胞的葡萄糖攝取檢測值相比，導致d)中所述酵母細胞的葡萄糖攝取量增加的化合物刺激所述GLUT4蛋白質的活性?？梢韵氲酱碳LUT4V85M蛋白質活性的化合物也刺激GLUT4活性。
本發(fā)明也涉及含有以上述方法鑒定的化合物以及用于配制藥物的添加劑和賦形劑的藥物。此外，本發(fā)明涉及以上述方法鑒定的化合物在生產(chǎn)用于治療I型和/或II型糖尿病的藥物中的用途。
本發(fā)明也涉及含有上述方法鑒定的化合物以及用于配制藥物的添加劑和賦形劑的藥物。此外，本發(fā)明涉及上述方法鑒定的化合物在生產(chǎn)用于治療糖尿病的藥物中的用途。
本發(fā)明此外還涉及上述方法鑒定的化合物在生產(chǎn)用于治療糖尿病的藥物中的用途。本發(fā)明也包括鑒定抑制Erg4基因編碼之蛋白質的化合物的方法，其包括步驟a)提供其全部葡萄糖轉運蛋白不再具有功能的酵母細胞，其中該酵母細胞含有包含編碼GLUT4V85M蛋白質之DNA序列并能夠在酵母細胞中復制的多核苷酸，b)提供化學化合物，c)將a)的酵母與b)的化學化合物接觸，d)測定c)的酵母的葡萄糖攝取，e)將d)的葡萄糖攝取檢測值和未與b)中所述化學化合物相接觸的a)中所述酵母細胞的葡萄糖攝取檢測值比較，導致d)中所述酵母的葡萄糖攝取量增加的化合物抑制Erg4蛋白質的活性。
本發(fā)明此外還涉及鑒定抑制Fgy1基因之相應蛋白質的化合物的方法，其包括步驟a)提供其全部葡萄糖轉運蛋白及Erg4蛋白質不再具有功能并且含有GLUT4蛋白質的酵母細胞，b)提供化學化合物，c)將a)的酵母與b)的化學化合物接觸，d)測定c)的酵母的葡萄糖攝取，e)將d)的葡萄糖攝取檢測值和未與b)中所述化學化合物相接觸的a)中所述酵母細胞的葡萄糖攝取檢測值比較，導致d)中所述酵母的葡萄糖攝取量增加的化合物抑制Fgy1蛋白質的活性。
本發(fā)明還涉及含有上述方法鑒定的化合物以及用于配制藥物的添加劑和賦形劑的藥物。
以下就技術細節(jié)更詳細的說明本發(fā)明。
雜交是指具有互補堿基序列的兩條核酸單鏈裝配成雙鏈。雜交可以在兩條DNA鏈、一條DNA鏈和一條RNA鏈以及兩條RNA鏈之間進行。原則上，通過加熱最初可能是雙鏈形式的有關核酸，可以制備雜交分子，例如在水浴中煮沸10分鐘，直到它們分解成不具有二級結構的單鏈分子。隨后，可以緩慢冷卻它們。在冷卻階段，互補鏈配對形成雙鏈雜交分子。在實驗室條件下，通常在雜交濾膜的協(xié)助下進行雜交，其中通過印跡或電泳將單鏈或變性的多核苷酸加樣于雜交濾膜上?？梢允褂眠m當?shù)幕パa多核苷酸分子，通過將待雜交的該多核苷酸分子加上放射性熒光標記來顯示雜交。嚴緊性描述特定條件下匹配或對齊的程度。高嚴緊性在匹配上比低嚴緊性具有更高的要求。根據(jù)應用和目的，設定用于核酸雜交的具有不同嚴緊性的特定條件。在高嚴緊性下，設定的雜交反應條件使得只有匹配得非常好的互補分子才能夠彼此雜交。低嚴緊性使具有相對大的非配對或錯誤配對堿基部分的分子也能部分雜交。
特別是，如果在含2xSSC的水溶液中68℃雜交至少兩小時，隨后于室溫下2xSSC/0.1％SDS中進行為時5分鐘的第一次洗滌，然后在68℃于1xSSC/0.1％SDS中洗滌1小時，然后在68℃于0.2％SSC/0.1％SDS中再洗滌1小時，則該雜交條件被認為是嚴緊的。
通過適當稀釋20xSSC溶液而制備2xSSC、1xSSC或0.2xSSC溶液。20xSSC溶液含有3mol/l NaCl和0.3mol/l檸檬酸鈉。pH為7.0。技術人員熟悉在嚴緊性條件雜交多核苷酸的方法。適當?shù)闹笇Э梢娪趯I(yè)手冊，特別是如《Current Protocols in Molecular Biology》(Wiley Interscience；編者Frederich M.Ausubel、Roger Brant、Robert E.Kingston、David J.Moore、J.G.Seidmann、Kevin Struhl；ISBN0-471-50338-X)。
酵母載體可以被分成不同的亞組。YIp載體(酵母整合型質粒)基本上相應于用于在細菌中克隆的載體，但是含有選擇性酵母基因(如URA3、LEU2)。
在引入所述載體后，只有當外源DNA整合進酵母染色體中，這些序列才與染色體一同復制，并隨著克隆的形成穩(wěn)定地傳遞給所有的子代細胞。
基于這一方法，衍生出由于真核ORI(復制起點)而能自主復制的質粒。這種酵母載體被稱為YRp載體(酵母復制型質粒)或ARS載體(自主復制序列)。此外，還有衍生自酵母2μm質粒并含有選擇性標記基因的YEp載體(酵母附加型質粒)。YAC(酵母人工染色體)類載體的行為如同獨立的染色體。
通過轉化的方式將含有要表達基因的酵母載體引入酵母，以便能夠表達所述基因。適合這一目的的方法的例子是電穿孔或與載體DNA一起孵育感受態(tài)細胞。技術人員知道合適的酵母表達啟動子，例子是SOD1(超氧化物歧化酶)啟動子、ADH(醇脫氫酶)啟動子、酸性磷酸酶基因的啟動子、HXT2(葡萄糖轉運蛋白2)啟動子、HXT7(葡萄糖轉運蛋白7)啟動子、GAL2(半乳糖轉運蛋白)啟動子和其它。為了表達目的，含有酵母表達啟動子和要表達的基因(如GLUT4V85M)的構建體是酵母載體的一部分。為了實現(xiàn)表達，所述酵母載體可以是獨立于酵母基因組的自復制微?；蛘呖梢苑€(wěn)定整合進酵母基因組。原則上，合適的酵母載體是任何可以在酵母中增殖的多核苷酸序列。可以使用的酵母載體尤其是酵母質?；蚪湍溉斯と旧w。酵母載體通常含有復制起點(2μ，ars)或起始復制過程的起點和通常包含輔源營養(yǎng)標記或抗生素抗性基因的選擇性標記。技術人員知道的酵母載體的例子是pBM272、pCS19、pEMBCYe23、pFL26、pG6、pNN414、pTV3、p426MET25、p4H7和其它。
根據(jù)本發(fā)明，細胞的選擇是指通過選擇性標記(如抗生素抗性或生長于特殊基本培養(yǎng)基上的能力)和進一步的分離及隨后的培養(yǎng)(在瓊脂平板上對其進行培養(yǎng)或者是深層培養(yǎng))而對它進行的特定濃縮。
培養(yǎng)、轉化以及轉化的酵母細胞的選擇，還有蛋白質在酵母細胞中的表達屬于技術人員常規(guī)使用的方法。關于所述方法的說明可見于標準的教科書，如Walker Graeme M.《Yeast Physiology and Biotechnology》(Wileyand Sons，ISBN0-471-9446-8)或《Protein Synthesis and Targeting inYeast》(Alistair J.P.Brown，Mick F.Fruite和John E.G.Mc Cartly編；Springer Berlin；ISBN3-540-56521-3)或“《Methods in Yeast Genetics》，1997A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual；Adams Alison(編輯)；Cold Spring Harbor Laboratory；ISBN0-87969-508-0”。
釀酒酵母具有17種已知的己糖轉運蛋白和3種已知的麥芽糖轉運蛋白，在表達足夠高的情況下，所述麥芽糖轉運蛋白能夠將己糖轉運進所述酵母。在一種已知的菌株中，通過缺失去掉了所有適合于己糖攝取的轉運蛋白。該菌株只含有兩種同源于麥芽糖轉運蛋白質的基因MPH2和MPH3。當培養(yǎng)基中存在葡萄糖時，MPH2和MPH3兩基因受到抑制。Wieczorke等人(FEBS Lett.464，123-128(1999))描述了此酵母菌株的制備和特征。該菌株不能在含有葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上繁殖?？梢云鹗加谙鄳d體選擇功能性表達GLUT1的該菌株突變體(hxt fgy1-1菌株)。如果使用攜帶酵母啟動子控制下的GLUT4基因的質粒載體轉化hxt fgy1-1酵母菌株，仍然只有非常少量的葡萄糖被轉運。對于這一酵母菌株而言，需要進一步調整功能性GLUT4表達，以便實現(xiàn)通過GLUT4手段的顯著的葡萄糖轉運?？梢栽诰哂衅咸烟亲鳛槲ㄒ惶荚吹呐囵B(yǎng)基上分離這種其細胞通過單一GLUT4葡萄糖轉運蛋白攝取葡萄糖的酵母菌株。為了這一目的，用處于酵母啟動子功能性控制下的GLUT4基因轉化hxt fgy1-1菌株。將這些以這一方式轉化的酵母細胞加于含有葡萄糖作為唯一碳源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，并在其上孵育。在例如30℃孵育幾天后，觀察單菌落的生長。分離這些菌落中的一個。從所述菌落中去掉酵母質粒阻止在含有葡萄糖作為唯一碳源的營養(yǎng)培養(yǎng)基上的繁殖。如果用攜帶處于酵母啟動子功能性控制下的GLUT4基因的酵母載體再次轉化這一不再含有載體質粒的菌株，那么所述菌株能夠再次在含有葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上繁殖。
以上提及的酵母菌株是提交于2002年2月9日的國際申請PCT/EP02/01373的主題，該申請要求2002年2月14日的DE 10106718.6的優(yōu)先權。
自身全部的己糖轉運蛋白(葡萄糖轉運蛋白)已不再具有功能的酵母菌株已于更早的日期與國際申請PCT/EP02/01373相關以保藏號DSM14035、DSM 14036或DSM 14037保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)。
GLUT4的多核苷酸和氨基酸序列可以例如，經(jīng)由以下條目取得GeneBankM20747(cDNA；人)、EMBLD28561(cDNA；大鼠)、EMBLM23382(cDNA；小鼠)、SwissprotP14672(蛋白質；人)、SwissprotP19357(蛋白質；大鼠)和SwissprotP14142(蛋白質；小鼠)。
GLUT1的多核苷酸序列和氨基酸序列在以下所示的數(shù)據(jù)庫代碼下被公開EMBLM20653(cDNA；人)、EMBLM13979(cDNA；大鼠)、EMBLM23384(cDNA；小鼠)、SwissprotP11166(蛋白質；人)，SwissprotP11167(蛋白質；大鼠)和SwissprotP17809(蛋白質；小鼠)。
藥物是治療人和動物疾病或身體機能障礙的藥理學活性物質的劑形?？诜委煹膭┝啃问降睦邮巧?、顆粒劑、片劑、藥丸、錠劑、糖衣片劑、膠囊劑、流浸膏劑、酊劑和糖漿劑。用于外用的例子是氣霧劑、噴霧劑、凝膠劑、軟膏劑或粉末。使用小瓶、瓶或預灌裝注射器，可注射或可輸注的溶液可以進行胃腸道外投藥。對于藥物技術領域的技術人員而言，這些和其它藥物是熟知的。
用于配制藥物的賦形劑使得可以制備活性物質以便為特定應用優(yōu)化活性成分的施用、分布和作用。這類賦形劑的例子是填充劑、粘合劑、崩解劑或助流劑，如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纖維素、淀粉、磷酸氫鈣、聚乙二醇、藻酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮、羧基甲基纖維素、滑石粉或二氧化硅。
由于是胰島素缺乏或胰島素作用降低導致的慢性代謝疾病，糖尿病表現(xiàn)為葡萄糖隨尿液排出以及血液葡萄糖水平異常增高(高血糖癥)。胰島素作用的缺乏或降低導致細胞對攝取進血液的葡萄糖的吸收和轉化不足。在脂肪組織中，胰島素拮抗激素具有增加脂解作用的效果，伴隨血液中游離脂肪酸水平的增加。
多脂(肥胖)是攝取熱量過多導致的能量失衡引起的體重異常增加，肥胖對健康構成威脅。
可以通過攝取研究的手段，使用放射性標記的葡萄糖測定由所提供的酵母菌株(如剛在前文描述的)攝取的己糖量。為此目的，將特定濃度的酵母細胞懸浮于如100μl緩沖液中(例如以每毫升60mg濕重的濃度)，并混合入確定量的14C-或3H-標記的葡萄糖作為唯一的碳源。孵育細胞，并在特定時間取出確定量的細胞。在LSC(液體閃爍計數(shù)器)的幫助下測定攝取的葡萄糖量。然而，也可以通過在含有葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長實驗來測定由所提供的并且如剛在前文描述的酵母菌株攝取的己糖量。為此目的，在加入化合物之后測定菌株的生長速率(例如每隔一定時間在600nm測量培養(yǎng)物的光密度)，并且將這一值與對照菌株(如酵母野生型菌株)的生長速率相比較。
提供化合物，特別是通過化學方式合成或通過從生物有機體中分離化學物質。也可以以自動的方式進行化學合成?？梢詫⑼ㄟ^合成或分離獲得的化合物溶解于合適的溶劑。合適的溶劑尤其是含有特定比例的有機溶劑(如DMSO(二甲基亞砜))的水溶液。
對于用化合物處理酵母菌株以便鑒定根據(jù)前述發(fā)明的化合物而言，特別可以在為此提供的自動實驗室系統(tǒng)中進行。此系統(tǒng)可以包括特定制備的具有凹坑的小室或微量滴定板、Eppendorf管或實驗室玻璃器皿。自動實驗室系統(tǒng)通常為高通量速率設計。因此，在自動實驗室系統(tǒng)協(xié)助下進行的方法，例如上述方法也被稱為HTS(高流通量篩選)。
Seq ID No.1公開了含有GLUT4V85M蛋白質編碼區(qū)的多核苷酸序列。Seq ID No.2公開了GLUT4V85M蛋白質的氨基酸序列。Seq ID No.3公開了p4H7GLUT4V85M載體的多核苷酸序列。
實施例酵母菌株的使用這里描述的所有酵母菌株都來自菌株CEN-PK2-1C(MATa leu2-3、112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8CSUC2)。己糖轉運蛋白(HXT)基因缺失的酵母菌株的制備已由Wieczorke等人描述(FEBS Lett.464，123-128(1999)EBY-18ga(MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2-3，112 ura3-52trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8CSUC2)，EBY.VW4000(MATa Δhxt1-17 Δgal2Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2-3，112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8CSUC2))。培養(yǎng)基基于1％的酵母提取物和2％的蛋白胨(YP)，而基本培養(yǎng)基由無氨基酸的0.67％的Difco酵母氮源(YNB)組成，并含有輔源營養(yǎng)所需的添加劑和不同的碳源。酵母細胞于30℃、有氧條件下生長于旋轉振蕩器或瓊脂平板上。通過在600nm測量光密度(OD600)或測定酵母菌落的直徑來監(jiān)控細胞生長。
葡萄糖攝取的測定以對D-[U-14C]-葡萄糖(Amersham)的攝取來測量葡萄糖轉運，并從Eadie-Hofstee圖測定動力學參數(shù)。離心移走細胞，用磷酸緩沖液洗滌，并以每毫升60mg濕重的濃度重懸浮于磷酸緩沖液。針對0.2到100mM的葡萄糖濃度測定葡萄糖的攝取，并且底物的比活力介于0.1到55.5kBqμmol-1。在30℃對細胞和葡萄糖溶液預孵育5分鐘。通過向細胞加入放射性葡萄糖而起始葡萄糖攝取。孵育5秒鐘后加入10ml冰冷卻的終止緩沖液(0.1M KiPO4，pH6.5，500mM葡萄糖)并通過在玻璃纖維濾器(Φ＝24mm，Whatman)上過濾而迅速移出細胞。用冰冷卻的緩沖液迅速洗滌濾器3次，使用液體閃爍計數(shù)器測量摻入的放射性。細胞在抑制劑存在下或在僅有溶劑存在下孵育15分鐘后，使用50mM或100mM放射性葡萄糖在15秒的攝取試驗中測量細胞松弛素B(終濃度20μM，溶解于乙醇中)的阻礙作用。
已發(fā)展出異源表達哺乳細胞來源的葡萄糖轉運蛋白的新系統(tǒng)。此系統(tǒng)基于釀酒酵母菌株，在所述菌株中，通過破壞編碼基因，已經(jīng)去掉了所有的內源葡萄糖轉運蛋白。該菌株不再能夠經(jīng)由質膜攝取葡萄糖并不再能夠以葡萄糖作為唯一碳源生長。為了將人或其它哺乳動物的異源葡萄糖轉運蛋白GLUT1和GLUT4以活性形式整合進酵母質膜，必須對酵母菌株引入額外的突變。GLUT1只有在fgy1-1突變菌株中才有活性，GLUT4只有在fgy1-1 fgy4-x雙突變菌株中才有活性。
已經(jīng)克隆了FGY1基因。它是釀酒酵母ORF YMR212c。就功能而言，結果表明Fgy1或Fgy1生成的產(chǎn)物抑制人葡萄糖轉運蛋白的活性或涉及GLUT轉運小泡與質膜的融合。
與GLUT1相反并相似于哺乳動物細胞，酵母中大比例的GLUT4蛋白質定位于細胞內結構中。總共分離了9種隱性突變體(fgy4-1到fgy4-9)，其中GLUT4此時被進一步指引到質膜，并且在伴隨fgy1-1突變的情況下，在那里具有活性。
Bruns等人描述的插入基因庫(Genes Dev.1994；81087-105)被用于互補分析。先用GLUT4質粒，然后用移動的插入基因庫轉化hxt fgy1-1菌株。在此之后是篩選能夠在葡萄糖培養(yǎng)基上生長的轉化體。結果，在一個研究的突變體中ERG4基因已被破壞。ERG4編碼麥角固醇生物合成的酶(氧化還原酶)。此酶(固醇-C-24(28)-還原酶)催化麥角固醇生物合成的最后步驟，將麥角甾-5，7，22，24，(28)-四烯醇轉變?yōu)榻K產(chǎn)物麥角固醇。Erg4蛋白質目前含有8個跨膜域并定位于內質網(wǎng)。因為麥角固醇前體摻入酵母質膜可以彌補麥角固醇的喪失，因此erg4突變體可以存活。
通過在hxt fgy1-1菌株中特異性缺失erg4而確證了Erg4對GLUT4功能的抑制性影響。產(chǎn)生的菌株(hxt fgy1-1 Δerg4)被稱為SDY022。
在Split-Ubiquitin系統(tǒng)協(xié)助下的蛋白質相互作用試驗顯示人GLUT4直接與酵母Erg4相互作用。因此，可以推定內質網(wǎng)中的酵母Erg4蛋白質或直接阻止GLUT4的進一步移位，或以對于移位和/或功能而言是重要的某種方式修飾GLUT4。
同樣也證實在Δhxt菌株中，僅ERG4缺失(即，盡管FGY1具有功能)也可以激活GLUT1，但不激活GLUT4。生長試驗的結果總結于表1。
為了排除麥角固醇自身對GLUT4施以負面影響，于厭氧條件下在含有麥角固醇的瓊脂平板上進行生長試驗。在這些條件下，任何用GLUT4轉化的酵母菌株都不能生長(表2)。與有氧生長相反，在缺氧情況下hxtfgy1-1菌株中的GLUT1轉化體沒有表現(xiàn)出在葡萄糖中生長。只有在缺失ERG4后，GLUT1轉化體才能夠生長。
通過體外誘變進行的Val85與Met的交換使得GLUT4獨立于fgy1-1突變，并產(chǎn)生了即使是在hxt erg4菌株中也具功能的GLUT4V85M。這一觀察表明Fgy1直接或間接作用于這一位置，該位置定位于GLUT轉運蛋白的第二個跨膜螺旋中。
表3展示與本專利申請相關保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)-Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick，Germany的酵母菌株的說明。
表1GLUT1和GLUT4轉化體在葡萄糖培養(yǎng)基上的生長。

表2GLUT1和GLUT4轉化體于缺氧情況下在具有或不具有麥角固醇的葡萄糖培養(yǎng)基上的生長。

表3保藏的酵母菌株(釀酒酵母)的特征

基礎培養(yǎng)基0.67％的無氨基酸酵母氮源(Difco)；pH6.2。
輔源營養(yǎng)補充亮氨酸(0.44mM)、色氨酸(0.19mM)、組氨酸(0.25mM)、尿嘧啶(0.44mM)。麥芽糖可以為1-2％。
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序列表<110>安萬特醫(yī)藥德國有限公司(Aventis Pharma Deutschland GmbH)<120>釀酒酵母ERG4突變體在表達哺乳動物來源的葡萄糖轉運蛋白中的用途<130>2002/0065<140>
<141>
<150>10242763.1<151>2002-09-14<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1530<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgccgtcgg gcttccaaca gataggctcc gaagatgggg aaccccctca gcagcgagtg 60actgggaccc tggtccttgc tgtgttctct gcggtgcttg gctccctgca gtttgggtac 120aacattgggg tcatcaatgc ccctcagaag gtgattgaac agagctacaa tgagacgtgg 180ctggggaggc aggggcctga gggacccagc tccatccctc caggcaccct caccaccctc 240tgggccctct ccatggccat cttttccgtg ggcggcatga tttcctcctt cctcattggt 300atcatctctc agtggcttgg aaggaaaagg gccatgctgg tcaacaatgt cctggcggtg 360ctggggggca gcctcatggg cctggccaac gctgctgcct cctatgaaat gctcatcctt 420ggacgattcc tcattggcgc ctactcaggg ctgacatcag ggctggtgcc catgtacgtg 480ggggagattg ctcccactca cctgcggggc gccctgggga cgctcaacca actggccatt 540gttatcggca ttctgatcgc ccaggtgctg ggcttggagt ccctcctggg cactgccagc 600ctgtggccac tgctcctggg cctcacagtg ctacctgccc tcctgcagct ggtcctgctg 660cccttctgtc ccgagagccc ccgctacctc tacatcatcc agaatctcga ggggcctgcc 720agaaagagtc tgaagcgcct gacaggctgg gccgatgttt ctggagtgct ggctgagctg 780aaggatgaga agcggaagct ggagcgtgag cggccactgt ccctgctcca gctcctgggc 840agccgtaccc accggcagcc cctgatcatt gcggtcgtgc tgcagctgag ccagcagctc 900tctggcatca atgctgtttt ctattattcg accagcatct tcgagacagc aggggtaggc 960cagcctgcct atgccaccat aggagctggt gtggtcaaca cagtcttcac cttggtctcg 1020gtgttgttgg tggagcgggc ggggcgccgg acgctccatc tcctgggcct ggcgggcatg 1080tgtggctgtg ccatcctgat gactgtggct ctgctcctgc tggagcgagt tccagccatg 1140agctacgtct ccattgtggc catctttggc ttcgtggcat tttttgagat tggccctggc 1200cccattcctt ggttcatcgt ggccgagctc ttcagccagg gaccccgccc ggcagccatg 1260gctgtggctg gtttctccaa ctggacgagc aacttcatca ttggcatggg tttccagtat 1320gttgcggagg ctatggggcc ctacgtcttc cttctatttg cggtcctcct gctgggcttc 1380ttcatcttca ccttcttaag agtacctgaa actcgaggcc ggacgtttga ccagatctca 1440gctgccttcc accggacacc ctctctttta gagcaggagg tgaaacccag cacagaactt 1500gagtatttag ggccagatga gaacgactga 1530<210>2<211>509<212>PRT<213>智人<400>2Met Pro Ser Gly Phe Gln Gln Ile Gly Ser Glu Asp Gly Glu Pro Pro1 5 10 15
Gln Gln Arg Val Thr Gly Thr Leu Val Leu Ala Val Phe Ser Ala Val20 25 30Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Ile Gly Val Ile Asn Ala Pro35 40 45Gln Lys Val Ile Glu Gln Ser Tyr Asn Glu Thr Trp Leu Gly Arg Gln50 55 60Gly Pro Glu Gly Pro Ser Set Ile Pro Pro Gly Thr Leu Thr Thr Leu65 70 75 80Trp Ala Leu Ser Met Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Ser Ser85 90 95Phe Leu Ile Gly Ile Ile Ser Gln Trp Leu Gly Arg Lys Arg Ala Met100 105 110Leu Val Asn Asn Val Leu Ala Val Leu Gly Gly Ser Leu Met Gly Leu115 120 125Ala Asn Ala Ala Ala Ser Tyr Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Leu130 135 140Ile Gly Ala Tyr Ser Gly Leu Thr Ser Gly Leu Val Pro Met Tyr Val145 150 155 160Gly Glu Ile Ala Pro Thr His Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu Asn165 170 175Gln Leu Ala Ile Val Ile Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Leu Gly Leu180 185 190Glu Ser Leu Leu Gly Thr Ala Ser Leu Trp Pro Leu Leu Leu Gly Leu195 200 205Thr Val Leu Pro Ala Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Pro Phe Cys Pro210 215 220Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Tyr Ile Ile Gln Asn Leu Glu Gly Pro Ala225 230 235 240Arg Lys Ser Leu Lys Arg Leu Thr Gly Trp Ala Asp Val Ser Gly Val245 250 255Leu Ala Glu Leu Lys Asp Glu Lys Arg Lys Leu Glu Arg Glu Arg Pro260 265 270Leu Ser Leu Leu Gln Leu Leu Gly Ser Arg Thr His Arg Gln Pro Leu275 280 285Ile Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn290 295 300Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Thr Ala Gly Val Gly305 310 315 320Gln Pro Ala Tyr Ala Thr Ile Gly Ala Gly Val Val Asn Thr Val Phe325 330 335Thr Leu Val Ser Val Leu Leu Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu
340 345 350His Leu Leu Gly Leu Ala Gly Met Cys Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr355 360 365Val Ala Leu Leu Leu Leu Glu Arg Val Pro Ala Met Ser Tyr Val Ser370 375 380Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Ile Gly Pro Gly385 390 395 400Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg405 410 415Pro Ala Ala Met Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe420 425 430Ile Ile Gly Met Gly Phe Gln Tyr Val Ala Glu Ala Met Gly Pro Tyr435 440 445Val Phe Leu Leu Phe Ala Val Leu Leu Leu Gly Phe Phe Ile Phe Thr450 455 460Phe Leu Arg Val Pro Glu Thr Arg Gly Arg Thr Phe Asp Gln Ile Ser465 470 475 480Ala Ala Phe His Arg Thr Pro Ser Leu Leu Glu Gln Glu Val Lys Pro485 490 495Ser Thr Glu Leu Glu Tyr Leu Gly Pro Asp Glu Asn Asp500 505<210>3<211>7809<212>DNA<213>釀酒酵母<400>3cgtaggaaca atttcgggcc cctgcgtgtt cttctgaggt tcatctttta catttgcttc 60tgctggataa ttttcagagg caacaaggaa aaattagatg gcaaaaagtc gtctttcaag 120gaaaaatccc caccatcttt cgagatcccc tgtaacttat tggcaactga aagaatgaaa 180aggaggaaaa tacaaaatat actagaactg aaaaaaaaaa agtataaata gagacgatat 240atgccaatac ttcacaatgt tcgaatctat tcttcatttg cagctattgt aaaataataa 300aacatcaaga acaaacaagc tcaacttgtc ttttctaaga acaaagaata aacacaaaaa 360caaaaagttt ttttaatttt aatcaaaaaa tgccgtcggg cttccaacag ataggctccg 420aagatgggga accccctcag cagcgagtga ctgggaccct ggtccttgct gtgttctctg 480cggtgcttgg ctccctgcag tttgggtaca acattggggt catcaatgcc cctcagaagg 540tgattgaaca gagctacaat gagacgtggc tggggaggca ggggcctgag ggacccagct 600ccatccctcc aggcaccctc accaccctct gggccctctc catggccatc ttttccgtgg 660gcggcatgat ttcctccttc ctcattggta tcatctctca gtggcttgga aggaaaaggg 720ccatgctggt caacaatgtc ctggcggtgc tggggggcag cctcatgggc ctggccaacg 780ctgctgcctc ctatgaaatg ctcatccttg gacgattcct cattggcgcc tactcagggc 840tgacatcagg gctggtgccc atgtacgtgg gggagattgc tcccactcac ctgcggggcg 900ccctggggac gctcaaccaa ctggccattg ttatcggcat tctgatcgcc caggtgctgg 960gcttggagtc cctcctgggc actgccagcc tgtggccact gctcctgggc ctcacagtgc 1020tacctgccct cctgcagctg gtcctgctgc ccttctgtcc cgagagcccc cgctacctct 1080acatcatcca gaatctcgag gggcctgcca gaaagagtct gaagcgcctg acaggctggg 1140ccgatgtttc tggagtgctg gctgagctga aggatgagaa gcggaagctg gagcgtgagc 1200ggccactgtc cctgctccag ctcctgggca gccgtaccca ccggcagccc ctgatcattg 1260cggtcgtgct gcagctgagc cagcagctct ctggcatcaa tgctgttttc tattattcga 1320
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權利要求
1.純化和分離的多核苷酸，其含有編碼GLUT4V85M蛋白質的DNA序列。
2.權利要求1的多核苷酸，其含有來自下組之任一的序列a)根據(jù)Seq ID No.1的核苷酸序列b)在嚴緊條件下與Seq ID No.1序列雜交并編碼GLUT4V85M蛋白質的核苷酸序列。
3.權利要求1或2的多核苷酸，其中GLUT4V85M蛋白質具有根據(jù)Seq ID No.2的氨基酸序列。
4.權利要求1到3的多核苷酸，其中GLUT4V85M蛋白質的編碼區(qū)與啟動子操作性連接。
5.權利要求1到4的多核苷酸，其可以在酵母細胞中復制。
6.權利要求5的多核苷酸，其可用于在酵母細胞中表達蛋白質。
7.來自釀酒酵母的酵母細胞，其中所有的葡萄糖轉運蛋白不再具有功能并且不含有功能性Erg4蛋白質。
8.來自釀酒酵母的酵母細胞，其中所有的葡萄糖轉運蛋白不再具有功能并且不含有功能性Fgy1蛋白質和功能性Erg4蛋白質。
9.權利要求7或8的酵母細胞，其中ERG4基因被完全或部分缺失。
10.權利要求7的酵母細胞，其作為釀酒酵母DSM 15187保藏。
11.權利要求8或9的酵母細胞，其作為釀酒酵母DSM 15184保藏。
12.權利要求15到18的酵母細胞在表達哺乳動物GLUT1蛋白質或GLUT4蛋白質中的用途。
13.權利要求12的用途，用于表達人GLUT1蛋白質或人GLUT4蛋白質。
14.權利要求7的酵母細胞，其含有權利要求1到6的多核苷酸。
15.權利要求14的酵母細胞，其含有GLUT4V85M蛋白質。
16.權利要求14或15的酵母細胞，其作為釀酒酵母DSM 15185保藏。
17.制備權利要求14到16的酵母細胞的方法，其包括步驟a)提供權利要求7的酵母細胞，b)提供權利要求5或6的多核苷酸，c)用b)的多核苷酸轉化a)的酵母細胞，d)選擇轉化的酵母細胞，e)適當時表達GLUT4V85M蛋白質。
18.權利要求8或9的酵母細胞，其含有權利要求1到6的多核苷酸。
19.權利要求18的酵母細胞，其含有GLUT4V85M蛋白質。
20.權利要求18或19的酵母細胞，其作為釀酒酵母DSM 15186保藏。
21.制備權利要求18到20的酵母細胞的方法，其包括步驟a)提供權利要求8或9的酵母細胞，b)提供權利要求5或6的多核苷酸，c)用b)的多核苷酸轉化a)的酵母細胞，d)選擇轉化的酵母細胞，e)適當時表達GLUT4V85M蛋白質。
22.其全部葡萄糖轉運蛋白不再具有功能的酵母細胞，其含有權利要求1到6的多核苷酸。
23.權利要求22的酵母細胞，其含有GLUT4V85M蛋白質。
24.權利要求22或23的酵母細胞，其作為釀酒酵母DSM 15188保藏。
25.制備權利要求22到24的酵母細胞的方法，其包括步驟a)產(chǎn)生其全部葡萄糖轉運蛋白不再具有功能的酵母細胞，b)提供權利要求5或6的多核苷酸，c)用b)的多核苷酸轉化a)的酵母細胞，d)選擇轉化的酵母細胞，e)適當時表達GLUT4V85M蛋白質。
26.具有葡萄糖轉運蛋白的功能活性的蛋白質，其由權利要求1到3中任一項的多核苷酸序列編碼。
27.權利要求13的蛋白質，其含有根據(jù)Seq ID No.2的氨基酸序列。
28.鑒定刺激GLUT4蛋白質活性的化合物的方法，其包括步驟a)提供權利要求14到17中一項或多項的酵母細胞，b)提供化學化合物，c)將a)的酵母與b)的化學化合物接觸，d)測定c)的酵母的葡萄糖攝取，e)將d)的葡萄糖攝取檢測值和未與b)中所述化學化合物相接觸的a)中所述酵母細胞的葡萄糖攝取檢測值相比較，導致d)中所述酵母的葡萄糖攝取量增加的化合物刺激所述GLUT4蛋白質的活性。
29.含有權利要求28的方法所鑒定的化合物以及用于配制藥物的添加劑和賦形劑的藥物。
30.權利要求28的方法所鑒定的化合物在制備用于治療I型和/或II型糖尿病的藥物中的用途。
31.鑒定抑制Fgy1基因的相應蛋白質的化合物的方法，其包括步驟a)提供權利要求7到10中一項或多項的酵母細胞，該酵母細胞含有GLUT4蛋白質，b)提供化學化合物，c)將a)的酵母與b)的化學化合物接觸，d)測定c)的酵母的葡萄糖攝取，e)將d)的葡萄糖攝取檢測值和未與b)中所述化學化合物相接觸的a)中所述酵母細胞的葡萄糖攝取檢測值相比較，導致d)中所述酵母的葡萄糖攝取量增加的化合物抑制Fgy1蛋白質的活性。
32.含有權利要求31的方法所鑒定的化合物以及用于配制藥物的添加劑和賦形劑的藥物。
33.權利要求31的方法所鑒定的化合物在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。
34.鑒定抑制ERG4基因編碼之蛋白質的化合物的方法，其包括步驟a)提供權利要求22到25中一項或多項的酵母細胞，b)提供化學化合物，c)將a)的酵母與b)的化學化合物接觸，d)測定c)的酵母的葡萄糖攝取，e)將d)的葡萄糖攝取檢測值和未與b)中所述化學化合物相接觸的a)中所述酵母細胞的葡萄糖攝取檢測值相比較，導致d)中所述酵母的葡萄糖攝取量增加的化合物抑制Erg4蛋白質的活性。
35.含有權利要求34的方法所鑒定的化合物以及用于配制藥物的添加劑和賦形劑的藥物。
36.權利要求34的方法所鑒定的化合物在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠功能性表達人GLUT4轉運蛋白或人GLUT1轉運蛋白的酵母菌株以及特別是能夠在酵母菌株中特別容易地功能性表達的GLUT4轉運蛋白。
文檔編號C07K14/62GK1694960SQ03825148
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月4日 優(yōu)先權日2002年9月14日
發(fā)明者G·米勒, S·德盧蓋伊, D·福斯, E·博爾斯 申請人:安萬特醫(yī)藥德國有限公司