專利名稱：一種抑制白細胞介素-4，刺激g干擾素的免疫調(diào)節(jié)劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)、化學(xué)和免疫藥理學(xué)的交叉研究領(lǐng)域，更具體涉及一種抑制白細胞介素-4刺激γ干擾素的免疫調(diào)節(jié)劑，在臨床上增強細胞免疫的抗胞內(nèi)菌，抗病毒和寄生蟲的感染的藥物或作為抗移植排斥反應(yīng)藥物。同時涉及該免疫調(diào)節(jié)劑的制備方法。
背景技術(shù)：
N-五氟芐基-1-脫氧野尻霉素(5F-DNM)是一種結(jié)構(gòu)清楚的小分子免疫調(diào)節(jié)劑，與當(dāng)今使用的抗排斥反應(yīng)藥物和免疫調(diào)節(jié)劑在結(jié)構(gòu)上無任何相似性。目前現(xiàn)有的免疫調(diào)節(jié)劑或是化學(xué)合成的，或是微生物制劑，生物制劑或中草藥等成分提取物，成分復(fù)雜，機制不清楚。按照WHO的標(biāo)準(zhǔn)，選擇一種化合物作為免疫調(diào)節(jié)劑的基本條件是①化學(xué)成分明確；②易于降解；③無致癌或制突變性；④免疫調(diào)節(jié)作用適中；⑤無毒副作用。已知現(xiàn)有的免疫抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporinA，CYA)(一種真菌提取物)相比，環(huán)孢素A有較大的毒副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種抑制白細胞介素-4刺激γ干擾素的免疫調(diào)節(jié)劑，此調(diào)節(jié)劑分子量小(MW342.25)，具有對細胞無毒，能有效地降低免疫分子白細胞介素-4的分泌，刺激γ干擾素的分泌，對CD8T淋巴細胞有一定增強作用和對CD4T淋巴細胞有一定抑制作用。
本發(fā)明的另一目的涉及該免疫調(diào)節(jié)劑的制備方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明的小分子免疫調(diào)節(jié)劑的合成方法是將5mg～18mg的脫氧野尻霉素(DNM，1-deoxynojirimycin)與25～35mg的五氟芐基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF4～9mL試劑中。此混合物于20-30℃下攪拌20分鐘至50分鐘，然后加于10～30mg，碳酸銫(CsCO3)。將混合物于25～35℃攪伴16至25小時，用TLC/紫外線監(jiān)測。混合物靜置反應(yīng)40分鐘至90分鐘，待出現(xiàn)白色沉淀，過濾去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固體。進一步用C-18柱子純化，溶劑為異丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1，20-30℃蒸干溶劑，即得到純化的產(chǎn)品。采用該化合物的結(jié)構(gòu)式是
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果其結(jié)構(gòu)清楚，分子量小，對細胞無毒。效果是可抑制白細胞介素-4的分泌，增強γ干擾素的產(chǎn)生，因而能用作臨床上增強細胞免疫的抗胞內(nèi)菌，抗病毒和寄生蟲的感染和抗移植物的排斥的藥物。


圖1新型小分子免疫調(diào)節(jié)劑(5F-DNM)對小鼠脾臟細胞分泌白細胞介素-4(IL-4)的抑制，并且隨著藥物濃度的增大，抑制能力增強，呈劑量依賴關(guān)系。分離小鼠脾臟細胞，調(diào)整至5×106/ml。以每孔加5×105細胞至96孔板中，然后加不同濃度的5F-DNM藥物至每空孔中，于37℃下，5％CO2溫育72h。收集上清，2000g離心5min，檢測上清，用IL-4試劑盒檢測(晶酶公司)。
圖2新型小分子免疫調(diào)節(jié)劑(5F-DNM)刺激小鼠脾臟細胞分泌γ干擾素，并且隨著藥物濃度的增大，刺激能力增強，呈劑量依賴關(guān)系。分離小鼠脾臟細胞，調(diào)整至5×106/ml。以每孔加5×105細胞至96孔板中，然后加不同濃度的5F-DNM藥物至每空孔中，于37℃下，5％CO2溫育72h。收集上清，2000g離心5min，檢測上清，用γ干擾素試劑盒檢測(晶酶公司)。
圖3流式細胞儀分析藥物5F-DNM與環(huán)孢素A，以及陰性對照分別對正常人淋巴細胞CD4T和CD8T的作用比較。新鮮分離的人外周血單個核細胞100μl(1×106/ml)經(jīng)用藥不同處理，與5μlFITC-CD4抗體與5μlPE-CD8抗體在室溫暗處反應(yīng)20分鐘，上樣檢測，收集2000個細胞分析。流式細胞儀為ALTRA EPICS(COULTER)。
其中圖3A對照組正常人淋巴細胞圖3B 10μM 5F-DNM作用后的人淋巴細胞圖3C 10μM環(huán)孢素A作用后的淋巴細胞具體實施方式
根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)式，其具體步驟如下將10mg的脫氧野尻霉素DNM(1-deoxynojirimycin)與32mg的五氟芐基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF(5mL)試劑中。此混合物于30℃下攪拌30分鐘，然后加于21mg碳酸銫(CsC03)。將混合物于30℃攪伴18小時，用TLC/紫外線監(jiān)測?；旌衔镬o置反應(yīng)60分鐘，待出現(xiàn)白色沉淀，過濾去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固體。進一步用C-18柱子(溶劑為異丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1)純化，25℃蒸干溶劑，即得到純化的產(chǎn)品。合成免疫調(diào)節(jié)劑的化合物，稱為5-氟地恩們，或化學(xué)名稱N-五氟芐基-1-脫氧野尻霉素(5F-DNM)。
取小鼠脾臟浸泡于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并用鋼絲網(wǎng)碾磨。再用200目的尼龍網(wǎng)過濾。濾液2000g離心10min，然后棄上清。沉淀溶于5ml pH7.2 Tris-NH4Cl，并于37℃反應(yīng)6～10min以裂解細胞，然后離心2000g，10min，將細胞沉淀溶解于含有10μg/ml，10％新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。數(shù)細胞數(shù)，調(diào)整細胞濃度至5×106/ml。以每孔加5×105細胞至96孔板中，然后加不同濃度的5F-DNM藥物至每空孔中，于37℃下，5％CO2溫育72h。收集上清，2000g離心5min，上清待檢測。
將上述得到的上清用IL-4和IFN-γ試劑盒檢測(晶酶公司)。按照試劑盒步驟，96孔板用孔板用anti-IL-4或anti-IFN-γ包被，不同濃度的樣品和IL-4或IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品(500、250、125、62.5、31.25、15.63pg/ml)加入至每孔中，20-25℃溫育120min，用磷酸緩沖液洗板5次，加入100μl biotin-標(biāo)記的anti-IL-4或anti-IFN-γ至每孔中，于20-25℃溫育60min。再洗板5次，加入100μl HRP-streptoavidin至每孔中，于20-25℃溫育30min。再洗板5次，加入HRP酶的底物，并測顏色變化OD450nm。用已知濃度的IL-4或IFN-γ作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品的濃度。見表1，2和圖1、2。
表1.新型小分子免疫調(diào)節(jié)劑(5F-DNM)對白細胞介素-4(IL-4)的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增大，抑制能力增強，呈劑量依賴關(guān)系

**代表藥物與未加藥對照組相比有顯著差異，p＜0.05，各值代表至少三次獨立實驗的平均值表2.新型小分子免疫調(diào)節(jié)劑(5F-DNM)增強小鼠脾臟細胞IFN-γ的分泌，并且隨著藥物濃度的增大，分泌能力增強，呈劑量依賴關(guān)系

**代表藥物與未加藥對照組相比有顯著差異，p＜0.05，各值代表至少三次獨立實驗的平均值5F-DNM的細胞毒性的檢測采用細胞毒性檢測試劑盒(Promega)。按照試劑盒的步驟定量檢測漿膜破損的細胞釋放至培養(yǎng)基上清中細胞質(zhì)酶LDH(lactate dehydrogenase)。結(jié)果證明5F-DNM對細胞無毒性作用。見表3。
表3.藥物5F-DNM對細胞沒有細胞毒作用Drugs(μM) ％Cytotoxicity無藥 0255.66±0504.60±3.29100 3.69±5.03采用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)10μM 5F-DNM對CD8T具有一定增強作用，對CD8T細胞從正常23％百分率增至31.3％，而10μM環(huán)孢素A對CD8T細胞無作用(正常CD8T為23％，10μM環(huán)孢素A作用后為25％)；10μM 5F-DNM對CD4T具有一定抑制作用，從正常CD4T 52％百分率降為19％，比環(huán)孢素A對CD4T抑制作用弱，10μM環(huán)孢素A對CD4T細胞，從正常CD4T 52％百分率降為為3.95％，與已知的對CD4T細胞選擇性的抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporin A，CYA)相比，免疫調(diào)節(jié)作用適中。見圖3A、3B、3C。
權(quán)利要求
1.化合物的結(jié)構(gòu)式為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征是抑制白細胞介素-4，刺激γ干擾素的分泌，對CD8T淋巴細胞有一定增強作用，而對CD4T淋巴細胞有一定抑制作用，是一種選擇性免疫調(diào)節(jié)劑，且對細胞無毒。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，該化合物的制備方法包括下列步驟A、將5mg-18mg的脫氧野尻霉素與25-35mg五氟芐基溴混合于DMF 4-9mL試劑中；B、將上述混合物于20-30℃下攪拌20-50分鐘，加入20-30mg碳酸銫；C、將步驟B的混合物于25-35℃下攪拌16-25小時，用TLC/紫外線監(jiān)測；D、將混合物靜置反應(yīng)40-90分鐘，待出現(xiàn)白色沉淀，過濾去除沉淀，真空抽干母液，得白色固體；E、采用C-18柱子純化，溶劑為異丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1，20-30℃蒸干溶劑，得到純化產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制白細胞介素－4，刺激γ干擾素的免疫調(diào)節(jié)劑及其制備方法。將脫氧野尻霉素與五氟芐基溴為原料合成免疫調(diào)節(jié)劑的化合物，該化合物具有抑制白細胞介素－4的產(chǎn)生，刺激γ干擾素的分泌的功能，對CD8T淋巴細胞有一定增強作用，而對CD4T淋巴細胞有一定抑制作用，是一種選擇性免疫調(diào)節(jié)劑，且證明對細胞無細胞毒作用?？捎米鳛樵鰪娂毎庖吆徒档腕w液免疫的藥物，在臨床上可作為增強細胞免疫的抗胞內(nèi)菌，抗病毒和寄生蟲的感染和抗移植物的排斥的藥物?；衔锝Y(jié)構(gòu)式如圖。
文檔編號C07D211/40GK1528747SQ20031011125
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日
發(fā)明者章曉聯(lián), 周翔, 謝鵬, 葉佳濤, 劉敏 申請人:武漢大學(xué)