專利名稱：酸堿法制備熊果酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種酸堿法制備熊果酸的方法。
背景技術(shù)：
熊果酸(Ursolic acid)又名烏索酸，系五環(huán)三萜類化合物。分子式C30H48O3，分子量456，廣泛存在于山茱萸、山楂、車前草、夏枯草、女貞子、冬凌草、白花蛇舌草等植物中。
式I 式II熊果酸(式I)及其同分異構(gòu)體——齊墩果酸(Oleanolic acid，式II)熊果酸具多種生理活性，除有抗炎、抗癌、抗病毒及抗皺等活性外(孫文基、張全房天然活性成分簡明手冊P579-580，中國醫(yī)藥科技出版社，1998)，近年又發(fā)現(xiàn)熊果酸具有抗肥胖(WO2003 011267)、抗動脈粥樣硬化(J.Ethnopharmacology 84(2-3)2003)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡(Anticancer Res 21(5)2001)、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞為正常細(xì)胞(J.Cancer Res Clin.Oncol 1994)等功能。
目前熊果酸都從植物中提取、分離而得。常用材料為香茶菜(陳德昌中藥化學(xué)對照品，中國醫(yī)藥科技出版社，2000)、車前草(孫文基天然藥物成分提取分離與制備，中國醫(yī)藥科技出版社，1999)、夏枯草(中國中藥雜志18(11)，1993)、長春花(CN1365978A)、女貞葉(CN1358733A)和女貞子(藥物分析雜志13(5)，1993)等。在這些植物中，有的如車前草、夏枯草等含熊果酸不多，含量不及生藥的0.5％；有的如香茶菜、女貞子則在含熊果酸的同時另含大量其它萜類化合物，同類雜質(zhì)多，給提取、純化帶來困難。已知香茶菜中含有的萜類化合物，僅二萜類就多達(dá)五百余種(孫漢董、許云龍、姜北香茶菜屬植物二萜化合物，科學(xué)出版社，2001)。
本發(fā)明人經(jīng)研究比較分析了十種資源植物中的熊果酸及其同分異構(gòu)體——齊墩果酸的含量，發(fā)現(xiàn)枇杷葉中的熊果酸在所測植物中含量最高，約是女貞葉的1.9倍，金錢草的2.5倍，白花蛇舌草的2.9倍，夏枯草的3.5倍，車前草的3.7倍，山茱萸的4.3倍。另外，枇杷葉中的齊墩果酸類雜質(zhì)，亦遠(yuǎn)比女貞子等為低，枇杷葉所含的齊墩果酸量不到其熊果酸量的1/4，而女貞子中所含的齊墩果酸量比熊果酸多2.9倍(見表1)。
表1十種資源植物中的熊果酸(UA)和齊墩果酸(OA)含量比較*資源植物 UA量(％) UA相對含量 OA量(％) UA∶OA枇杷葉0.803100.00.163100∶20.3山楂肉0.80099.7 0.124100∶15.5女貞子0.62077.3 1.795100∶289.5連翹果0.60174.8 0.506100∶84.2女貞葉0.42853.3 0.104100∶24.3金錢草0.31739.5 0.057100∶18.0白花蛇舌草0.27834.7 0.061100∶21.9夏枯草0.22828.5 0.050100∶21.9車前草0.21627.0 0.066100∶30.6山茱萸0.18823.4 0.048100∶25.5*樣品處理各取干燥粉碎的資源植物2g于30ml石油醚中，脫脂30分鐘，然后分別加乙醚30ml，超聲提取10分鐘，各取乙醚提取液2ml，水浴蒸干，各用甲醇溶解并分別定容至5ml，供HPLC測定。
測定條件固定相為Beckman Ultrasphere C18反相柱(4.6×250mm，加4.6×50mm保護(hù)柱)；流動相為甲醇∶磷酸緩沖液(89∶11)，流量1ml/min，進(jìn)樣量20μl，檢測波長215nm。
由此可見，枇杷葉確是制備熊果酸的好資源。
熊果酸的分離目前常用柱層析法，見林克勤等，中草藥26(8)1995；樊明文等CN1358733A，2002；Kim SH et alPhytotherapyresearch VoL12.553-556，1998，盡管柱層析法能很好地分離熊果酸和近似雜質(zhì)，但該法上樣量小，收得率低，同時洗脫劑需用石油醚、苯、氯仿、甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，成本大，亦不利于生產(chǎn)安全。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述方法的不足之處，研究設(shè)計(jì)一種成本低、安全性好的簡易制備熊果酸的方法。
本發(fā)明提供了一種酸堿法制備熊果酸的方法，該方法包括下列步驟一、水煮將枇杷葉加水(1∶8～10v/v)煮沸，棄水煮液，以除去枇杷葉中所含有機(jī)酸、糖類、鞣質(zhì)等水溶性雜質(zhì)；二、醇提用回流提取法使枇杷葉中的熊果酸溶于85～95％1∶10～15倍v/v乙醇中，回流提取1～2小時；三、脫色用0.1-1.0％活性炭攪拌吸附，30～60分鐘以除去葉綠素、葉黃素等雜質(zhì)；四、調(diào)堿將枇杷葉的醇提液用苛性鉀或苛性鈉調(diào)pH至10～14，靜置過夜后過濾，除去雜質(zhì)；五、酸析將堿性醇提液用HCl調(diào)pH至1～3，減壓濃縮，熊果酸即可從酸醇溶液中析出，而黃酮、甾醇類雜質(zhì)仍留酸醇中；六、水洗將酸醇析出物分別用酸性、堿性和中性蒸溜水洗滌，用量1∶100-200v/v，可進(jìn)一步去除生物堿、鹽和水溶性色素等雜質(zhì)；七、析晶將上述水洗后的水不溶物，于85-100％乙醇中加熱溶解，使呈過飽和狀態(tài)，按水不溶物中的實(shí)測熊果酸量計(jì)，使?jié)舛冗_(dá)6-10mg/ml，冷卻后即有熊果酸結(jié)晶析出。
上述水煮、醇提、脫色、調(diào)堿、酸析、水洗、析晶各步驟可重復(fù)2-3次，以充分提取和去雜，其順序也可適當(dāng)顛倒或刪減。按本法從枇杷葉中制備的熊果酸，經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜、薄層和高效液相色譜及差示掃描量熱法測定，均與熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品相一致。用本工藝制備熊果酸收得率可達(dá)0.8-1.2％，通過反復(fù)結(jié)晶，熊果酸純度可大于90％。
本工藝除適用枇杷葉制備熊果酸外，亦適用于從女貞葉、金錢草、女貞子、山楂、連翹、小蔓長春花、山茱萸、白花蛇舌草、夏枯草、車前草植物中制備熊果酸。
用酸堿法制備熊果酸，主要是利用熊果酸不溶于水，易溶于熱乙醇，在酸性條件下易析出，在過飽和醇液中易結(jié)晶的特性設(shè)計(jì)的。
本發(fā)明提出用酸堿法制備熊果酸，除應(yīng)用水和乙醇外，毋需其它有機(jī)溶劑，設(shè)備投資小，簡便易行，得率高，產(chǎn)品純。


圖1、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜圖2、枇杷葉熊果酸的HPLC圖譜圖3、枇杷葉熊果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析，顯示枇杷葉熊果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC吸收峰相重疊。
圖4、枇杷葉熊果酸的熱分析圖譜圖5、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的熱分析圖譜從圖4、5顯示兩者的外推始點(diǎn)均為286℃，頂峰溫度均為289℃。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取市售枇杷葉(青)10kg，粉碎后，加水100kg，浸潤30分鐘后煮沸1小時，過濾，棄煮水液，濾渣再加60kg水，煮沸1小時，取濾渣、烘干、粉碎；取水煮后枇杷葉渣(干)1份，加85-95％乙醇10份(g/v)，于中藥提取器中回流浸取2小時，過濾后收集醇提液(1)，殘?jiān)儆?0-95％乙醇(1∶8，g/v)回流提取2小時，得醇提液(2)；合并(1)(2)醇提液；
在醇提液中加入0.3％活性炭(g/v)，攪拌吸附60分鐘，過濾、除殘?jiān)?，得枇杷葉脫色醇提液；將上述脫色醇提液用1mol/L NaOH調(diào)pH至11，靜置過夜，離心或抽濾，除沉淀雜質(zhì)，得堿性醇提物；堿性醇提物用6mol/L HCl調(diào)pH至3，經(jīng)減壓濃縮，抽濾得枇杷葉酸醇析出物。
在枇杷葉酸醇析出物中，加100倍(v/v)pH3酸性蒸餾水，攪拌溶洗15分鐘，傾去水層后繼用100倍(v/v)pH12堿性水溶洗15分鐘，再用中性蒸餾水洗滌2次，得水不溶物；測定水不溶物中的熊果酸含量，按熊果酸含量計(jì)，以6-8mg/ml濃度溶于95％-100％乙醇中，加熱溶解后，置10-20℃下自然析晶，將析晶體在無水乙醇中重結(jié)晶，用冷乙醇淋洗后，60℃真空干燥，即為枇杷葉熊果酸產(chǎn)品。
用HPLC儀對本品作色譜分析，對照品為中國藥品生物制品檢定所提供的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(0742-200010)，儀器Waters HPLC儀，分析柱Inertsil ODS-3柱(4.6×250mm)，流動相∶乙腈∶水∶三氟醋酸＝85∶15∶0.1(v/v/v)，樣品用甲醇溶解，濃度3.8mg/ml，進(jìn)樣量20μl，檢測波長210nm，結(jié)果本品的延遲時間(RT)為19.493分，標(biāo)準(zhǔn)品為19.499分，兩者的吸收峰疊合一起，提示本品與標(biāo)準(zhǔn)品為同一化合物——熊果酸(圖1)。
實(shí)施例2取枇杷葉(黃)水煮后，殘?jiān)?5％乙醇分3次回流提取，每次乙醇用量為殘?jiān)亓康?-10倍；合并醇提液，加醇提液體積0.5％(g/v)的活性炭，在50-60℃下攪拌脫色60分鐘；脫色醇提液加NaOH，使達(dá)0.1Mol/L，靜置后過濾，除沉淀，濾液減壓濃縮至流浸膏；用100倍量的pH1-2的酸水加于流浸膏中攪拌溶解，得水不溶物；水不溶物用蒸餾水洗滌至中性；
水洗后不溶物按實(shí)施例1方法，在乙醇中析晶和重結(jié)晶。
用本工藝從枇杷葉中制備的晶體，作差示掃描量熱法(DifferentialScanning Calorimetry，DSC)測定，參比物用中國藥品生物制品檢定所提供的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(0742-200010)，結(jié)果其熱分析圖譜(DSC曲線)兩者基本一致，未見溫度差(ΔT)，即作為定性的特征溫度——外推始點(diǎn)(Onset)溫度，兩者均為286℃；峰頂溫度(熔融溫度)亦均為289℃，提示本晶體與參比物一樣為純一的熊果酸。(圖2)。
實(shí)施例3按實(shí)施例1方法，將枇杷葉經(jīng)水煮、醇提、脫色后得脫色醇提液；用6mol/L HCL調(diào)pH至1.5，回收乙醇得酸醇析出物和酸液；酸醇析出物用pH3-4水洗滌(1∶100v/v)，得水不溶物(1)；將酸液減壓濃縮至流浸膏，用50-80℃pH1-2的酸水?dāng)嚢枞芙猓闉V或離心，收集水不溶物(2)；將水不溶物(1和2)，用80-100倍95％乙醇回流溶解，用KOH調(diào)pH至12，于10-15℃處靜置12小時。
離心或抽濾，除沉淀物，濾液用HCL調(diào)pH至3-4，減壓濃縮至無醇味，靜置過夜，過濾后得酸醇析出物；酸醇析出物用蒸餾水洗滌，直至無氯離子反應(yīng)，烘干后用95％乙醇析晶和重結(jié)晶，方法同實(shí)施例1。
將所得結(jié)晶，在硅膠G薄層板上用下列展開劑作TLC分析，點(diǎn)樣、展層后用10％硫酸乙醇顯色劑顯色(105℃5分鐘)，對照品用中國藥品生物制品檢定所熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(110742-200212)，根據(jù)顯色斑點(diǎn)計(jì)算遷移率(Rf)，結(jié)果兩者經(jīng)下列五種展開劑展層后，其遷移率(Rf值)完全一致(表2)，提示用本工藝從枇杷葉中提取的晶體和標(biāo)準(zhǔn)品一樣均為熊果酸。
表2樣品和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的薄層層析(TLC)分析

權(quán)利要求
1.一種酸堿法提取熊果酸的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)水煮將粉碎的枇杷葉用1∶8-10倍V/V水煮沸，除去水溶性雜質(zhì)；(2)醇提水煮后殘?jiān)?jīng)烘干后，用85-95％乙醇1∶10-15倍V/V回流提取1-2小時；(3)脫色醇提液加0.1-1.0％活性炭，攪拌吸附30-60分鐘，以脫色；(4)調(diào)堿脫色醇提液用苛性鈉或苛性鉀調(diào)pH至10～14，靜置后使雜質(zhì)沉淀，除去；(5)酸析堿性醇提液用HCL或H2SO4調(diào)pH1～3，減壓濃縮后使熊果酸從酸醇中析出，而其它植物色素、黃酮和甾體類雜質(zhì)仍留存于酸醇液中；(6)水洗將酸析出物分別用酸性、堿性和中性水洗滌，得水不溶物；(7)析晶根據(jù)水不溶物中的熊果酸含量，按6-10mg/ml濃度，將水不溶物加熱溶于85～100％乙醇中，冷卻后即可析出熊果酸晶體。
2.按權(quán)利要求1所述生產(chǎn)熊果酸方法，其特征在于方法中的各步驟均可按需要重復(fù)2-3次操作；
3.按權(quán)利要求1所述生產(chǎn)熊果酸的方法，其特征在于其中所用原料為枇杷葉、山楂、女貞葉、女貞子、金錢草、連翹、小蔓長春花、白花蛇舌草、夏枯草、車前草或山茱萸。
全文摘要
本發(fā)明屬天然藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了用酸堿法制備熊果酸的新工藝，通過將枇杷葉水煮、乙醇提取、活性炭脫色、調(diào)堿除雜、調(diào)酸析出及水洗、析晶等步驟提得熊果酸。采用本工藝生產(chǎn)熊果酸不僅得率高、產(chǎn)品純，且生產(chǎn)中不用水和乙醇以外的其它有機(jī)溶劑，方法簡便，成本低廉，生產(chǎn)安全。
文檔編號C07J63/00GK1629180SQ20031012271
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者楊慶堯, 馮慧琴, 糜可, 楊曉彤, 于曉明, 周韻麗 申請人:楊慶堯, 周文軒