專利名稱：重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的說涉及重組蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)性疾病是人類常見的自身免疫性疾病，其危害極大且極難根治，同時，其與過敏人群所生存的外界環(huán)境密切相關(guān)。據(jù)相關(guān)報道，變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率在30％以上，并且有隨著城市化及工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)而不斷增多的趨勢。自然界的過敏原種類繁多，分布廣泛。作為空氣過敏原的植物花粉，不僅其本身的危害人類無法規(guī)避，而且不同植物花粉之間以及植物花粉與其它類型的過敏原之間都存在著交叉反應(yīng)，這樣就使得過敏人群始終處于過敏原包圍之中。
花粉過敏原有其普遍性?；ǚ圻^敏原的種類繁多，花粉以氣溶膠的形式存在，并隨著空氣流動，可以使相當(dāng)范圍的過敏人群受害。研究表明幾乎所有發(fā)生量較大的花粉都有其過敏人群。花粉過敏原普遍性的另一方面來自交叉反應(yīng)(cross-reactivity)的發(fā)生。具體表現(xiàn)在不僅不同種屬的植物花粉過敏原之間可以發(fā)生交叉反應(yīng)，而且不同科目的植物花粉過敏原間也能發(fā)生交叉反應(yīng)，甚至花粉過敏原與食物過敏原之間也可以發(fā)生交叉反應(yīng)。這樣就組成了一個強(qiáng)大的過敏原網(wǎng)絡(luò)，使得過敏性體質(zhì)人群總是處于過敏原包圍狀態(tài)之中，極其容易引發(fā)過敏癥。
一般地，在花粉大量開散季節(jié)，根據(jù)病人的典型病史、癥狀與體征來對花粉過敏癥作出非特異性診斷。對于特異性診斷，早期較多依賴于花粉浸提液穿刺皮膚試驗所得的結(jié)果，但是，由于陽性結(jié)果僅能說明患者存在對該類花粉過敏的可能，因此確診率并不高。相比較而言，根據(jù)病人血清中特異性IgE(sIgE)的含量進(jìn)行診斷，其準(zhǔn)確率卻相對較高。
免疫治療法是過敏性疾病的最佳治療方案，該方法首見報道于1911年，其后廣泛采用而流傳至今。但是，傳統(tǒng)的免疫療法依賴于花粉浸提液，由于其成分復(fù)雜而且無法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量，存在諸多缺點(diǎn)，如見效慢，需要病人長期堅持，有誘發(fā)過敏的危險等等，從而使其應(yīng)用受到了一定的限制。
相比較而言，重組過敏原的產(chǎn)量高，生產(chǎn)條件穩(wěn)定，方便進(jìn)行過敏原的標(biāo)準(zhǔn)化，利于臨床診斷和治療，因此對重組過敏原基因的研究正呈現(xiàn)急劇增長的態(tài)勢，并成為變態(tài)反應(yīng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。
具有廣泛的交叉反應(yīng)性的過敏原蛋白質(zhì)通常被稱之為泛過敏原。大量過敏原基因的獲得為揭示過敏原交叉反應(yīng)的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)平臺。研究表明雖然同種植物花粉過敏原之間存在高度的異質(zhì)性，但是，同種過敏原基因之間卻存在高度的相似性，而同科不同屬種植物花粉過敏原之間也享有一些共同的結(jié)構(gòu)特征。正是由于花粉過敏原之間保有共同的結(jié)構(gòu)特征，特別是IgE結(jié)合表位的相似性，才構(gòu)成了交叉反應(yīng)發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述問題及天然花粉過敏原浸提液行脫敏治療的不足，從過敏原基因的全長cDNA出發(fā)，通過基因工程的手段，合成重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白，用于研制一種具有廣譜性治療作用的重組花粉泛過敏原疫苗，以歸避天然提取物的非單一性及標(biāo)準(zhǔn)化難的障礙，應(yīng)用于一類變態(tài)反應(yīng)特應(yīng)性人群，以降低疫苗的變應(yīng)原性而提高免疫原性，縮短治療周期，從而替代花粉浸提液。
本發(fā)明的另一個目的在于提供該重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法。
本發(fā)明所獲得的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的氨基酸序列如圖1所示，其制備方法如下所示(1)從花粉中提取總RNA；(2)合成引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′，Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTG TCC-3′；(3)以上述總RNA為模板，通過RT-PCR獲得重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的5′基因片段；(4)設(shè)計引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAACAGGCCAAGC-3′；進(jìn)行重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的5′基因片段的cDNA末端擴(kuò)增，獲得肌動蛋白結(jié)合蛋白基因的3′基因片段，(5)利用5′及3′基因片段獲得全長基因；(6)將所得全長基因的開放閱讀框與原核表達(dá)載體酶切連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體；
(7)將所得重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主菌；(8)培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌并誘導(dǎo)其表達(dá)重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白；(9)純化重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白。
上述步驟(1)所述的花粉為葎草或/和豚草花粉。
上述步驟(3)所述的PCR過程的退火溫度為45～72℃。
上述步驟(6)所述的原核表達(dá)載體為pET-44。
上述步驟(6)所述酶切的酶切位點(diǎn)為EcoRI和PstI。
上述步驟(7)所述的宿主菌為BL21(DE3)。
上述步驟(8)是采用IPTG誘導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌表達(dá)重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的上述步驟(9)是采用親和層析的方法對重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白進(jìn)行純化。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明從過敏原基因的全長cDNA出發(fā)，采用基因工程的方法，合成了重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白，所得重組蛋白純度高，治療效果好，可用于制備一種具有廣譜性治療作用的重組花粉泛過敏原疫苗，以降低疫苗的變應(yīng)原性而提高免疫原性，縮短治療周期，從而替代花粉浸提液。同時本制備方法具有表達(dá)量高，生產(chǎn)條件穩(wěn)定，成本低的特點(diǎn)，方便進(jìn)行過敏原的標(biāo)準(zhǔn)化，有利于臨床的診斷和治療。


圖1為重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白氨基酸序列圖；
圖2為重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白D106誘導(dǎo)表達(dá)及純化電泳圖；圖3為重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白D03的誘導(dǎo)表達(dá)及純化電泳圖；圖4為重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白LCM9的免疫印跡結(jié)果圖；圖5為重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白LCS13的免疫印跡結(jié)果圖；圖6為重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白D03的免疫印跡結(jié)果圖。
其中，在圖2中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(218-6.8kD)；第1泳道，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在約14kD處有一新條帶，與第2泳道不經(jīng)IPTG誘導(dǎo)明顯不同，純化后，得到一條帶；圖3中，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(97-14.4kD)；第1泳道，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白純化后，得到一條帶，氨基酸測序為預(yù)期蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、基因克隆a)按照Invitrogen公司的TRIZOL Reagent說明書，從豚草花粉中提取總RNA。
b)從SWISS-PROT及TrEMBL21(http//www.expasy.org)、NCBI的GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)等數(shù)據(jù)庫取得花粉過敏原序列數(shù)百條，以CLUSTAL W(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)進(jìn)行序列對比和聚類，以聚類后各大簇中的主要亞簇的代表性過敏原之cDNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′；Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTGTCC-3′，以總RNA為模板，通過RT-PCR獲得肌動蛋白結(jié)合蛋白的5′基因片段，PCR過程中的退火溫度為45～72℃。其中所說的主要亞簇的代表性過敏原是指在聚類過程中優(yōu)先聚類的過敏原，即以對齊后的順序排列聚類結(jié)果時，排在每一亞簇的最里層的過敏原。
c)依據(jù)所得基因序列設(shè)計特異引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAACAGGCCAAGC-3′，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得肌動蛋白結(jié)合蛋白基因的3′基因片段。從而獲得全長cDNA基因序列。
2、載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)獲得全長cDNA基因序列，對開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增，從而在序列的兩端引入EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)，確定開放閱讀框(ORF)；與pET-44原核表達(dá)載體酶切、連接，使得插入片段的起始密碼子位于翻譯的起始密碼子位置，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
3、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，然后選擇陽性克隆，用IPTG誘導(dǎo)其進(jìn)行蛋白的表達(dá)。
調(diào)整基本LB培養(yǎng)基中的葡萄糖等的含量(0.1％-2％)以及培養(yǎng)溫度(15-38℃)，從而獲得目標(biāo)蛋白的最大表達(dá)量及最佳的水溶性。
4、蛋白的純化通過CNBr活化的瓊脂糖為固定相的親和層析系統(tǒng)經(jīng)透析等步驟獲得純的目標(biāo)蛋白質(zhì)。具體來說，其操作步驟如下。細(xì)菌經(jīng)裂解液(15-100mM Tris-HCl，50-300mM NaCl，0.01％-0.5％Triton X 100)在室溫條件下完全裂解后，以10000-40000g/min的離心力進(jìn)行離心，上清液即為上柱樣品。上樣完后，以1-5M尿素洗柱，之后以4-8M尿素洗脫蛋白。洗脫產(chǎn)物經(jīng)8-4M、5-1M、0.1-3M、0.01-0M尿素+1×PBS透析共30-56小時，產(chǎn)物再次上親和柱，重復(fù)上述沖洗、洗脫及透析步驟，即為純的重組蛋白，定量后凍干保存。純化后的蛋白上SDS-PAGE后，看到只有一單條帶。
5、重組蛋白的純化與鑒定經(jīng)加入和不加入IPTG的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)在預(yù)期大小處有一濃的條帶為誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。以親和柱進(jìn)行蛋白純化，純化蛋白經(jīng)氨基酸N末端測序，顯示與cDNA推測的氨基酸順序一致。表明該蛋白D106及D03即為重組蛋白肌動蛋白結(jié)合蛋白，如圖2及圖3所示。
6、重組蛋白肌動蛋白結(jié)合蛋白的過敏原性鑒定所得到的純化蛋白或未經(jīng)純化的蛋白混合物，經(jīng)SDS-PAGE分離后并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜或PVDF膜上，以花粉過敏病人血清中的特異性IgE為檢測一抗，兔抗人的anti-IgE為二抗，進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示重組蛋白能不同程度地與病人血清中特異性IgE結(jié)合，表明其具有過敏原性，如圖4、圖5及圖6所示。
權(quán)利要求
1.重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白，其氨基酸序列如圖1所示。
2.權(quán)利要求1所述的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法如下所示(1)從花粉中提取總RNA；(2)合成引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′，Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTG TCC-3′；(3)以上述總RNA為模板，通過RT-PCR獲得重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的5′基因片段；(4)設(shè)計引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAA CAGGCCAAGC-3′；進(jìn)行重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的5′基因片段的cDNA末端擴(kuò)增，獲得重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白基因的3′基因片段，(5)利用5′及3′基因片段獲得全長基因；(6)將所得全長基因的開放閱讀框與原核表達(dá)載體酶切連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體；(7)將所得重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主菌；(8)培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌并誘導(dǎo)其表達(dá)重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白；(9)純化重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的花粉為葎草或/和豚草花粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟(3)所述PCR的退火溫度為45～72℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟(6)所述的原核表達(dá)載體為pET-44。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟(6)所述酶切的酶切位點(diǎn)為EcoRI和PstI。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟(7)所述的宿主菌為BL21(DE3)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟(8)是采用IPTG誘導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌表達(dá)重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所示的重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白的制備方法，其特征在于步驟(9)是采用親和層析的方法對重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白進(jìn)行純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組過敏原肌動蛋白結(jié)合蛋白及其制備方法。本發(fā)明從葎草或/和豚草花粉中提取總RNA，以總RNA為模板，根據(jù)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)設(shè)計通用簡并引物，通過RT－PCR獲得肌動蛋白結(jié)合蛋白的5′基因片段；再合成肌動蛋白結(jié)合蛋白基因特異性引物，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得肌動蛋白結(jié)合蛋白基因的3′基因片段；利用5′及3′基因片段從而獲得基因全長；然后將基因克隆入pET－44原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)；接著采用親和層析的方法對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，從而獲得純的肌動蛋白結(jié)合蛋白。本制備方法具有表達(dá)量高，生產(chǎn)穩(wěn)定，成本低的特點(diǎn)。
文檔編號C07K14/415GK1687121SQ200410052290
公開日2005年10月26日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者何韶衡, 陶愛林 申請人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院