miRNA145-5p修飾臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用microRNA145-5p、修飾臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (human umbilical cordmesenchymal stem cell，hucMSC)中的外泌體（exosome)提取制備 的方法以及其在促進(jìn)創(chuàng)面愈合并抑制瘢痕增生，尤其是關(guān)節(jié)部位拮抗瘢痕治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast)是一種表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA)的由成纖維 細(xì)胞高度分化而來(lái)的細(xì)胞，它參與了纖維化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中纖維形成和細(xì)胞外基質(zhì)重塑兩個(gè)階 段（Van De Water L,Varney S,Tomasek JJ,Mechanoregulation of the Myofibroblast in Wound Contraction,Scarring,and Fibrosis:Opportunities for NewTherapeu tic Intervention. 2013May; 2(4): 122-141)。它的主要功能是產(chǎn)生力量和改變組織張力，是創(chuàng) 面肉芽收縮和纖維收縮性疾病主要的細(xì)胞。這些細(xì)胞大量分泌膠原、纖維連接蛋白、生長(zhǎng)因 子和各種酶類。當(dāng)組織由于氧化應(yīng)激、低氧狀態(tài)、炎癥、凋亡等刺激而受到損傷時(shí)，雖然通過(guò) 用細(xì)胞外基質(zhì)將損傷組織置換而試圖進(jìn)行修復(fù)，但損傷很嚴(yán)重時(shí)或者該刺激變?yōu)槁曰瘯r(shí) 等，肌成纖維細(xì)胞分化則不受調(diào)控進(jìn)而引起不適當(dāng)或過(guò)度的纖維結(jié)締組織生成，而在皮膚 損傷引起的過(guò)度瘢痕增生，在關(guān)節(jié)部位引起的瘢痕粘連攣縮都可以一并認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞 的過(guò)度增生。更有文獻(xiàn)表明它的存在與促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)也有直接關(guān)系(Junker JP^Kratz C， TollbackA,Kratz G,echanical tension stimulates the transdifferentiation of fibroblasts into myofibroblasts in huma n burn scars.Burns.2008Nov；34(7):942-6)〇
[0003] 近年來(lái)，干細(xì)胞相關(guān)機(jī)制及應(yīng)用在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域有了新的突破。研究表明間充質(zhì) 干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能夠促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合并且詰抗瘢痕過(guò)度形 成。但其本身在移植入新環(huán)境后存活數(shù)量隨時(shí)間急劇下降。其發(fā)揮主要作用的是通過(guò)旁分 泌產(chǎn)生的一些活性因子影響了創(chuàng)面的微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合、抑制組織過(guò)度纖維化并 且維持較良好的形態(tài)（Nie C，Yang D，Xu L et al .Locally administered adipose- derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and Vasculogenesis[J].Cell Transplant，2011，20(2):205-216)〇
[0004] 外泌體(exosome)作為來(lái)自干細(xì)胞細(xì)胞旁分泌的一種脂質(zhì)雙分子膜包裹的小囊泡 越來(lái)越受到關(guān)注。它由細(xì)胞的多囊體與質(zhì)膜融合后，以胞吐的方式釋放到胞外環(huán)境中。表面 含有大量與其來(lái)源和功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)成分以及核酸，其中以microRNA為主 (Simpson RJ,Lira Jff,Moritz RL,et.Exosomes：proteomic insights and diagnostic potential[J] .Expert Rev Proteomics,2009,6(3) ：267一283)。外泌體較易與鄰近細(xì)胞的 細(xì)胞膜發(fā)生融合，將生物學(xué)活性物質(zhì)選擇性地遞送至受體細(xì)胞，在不同細(xì)胞間進(jìn)行信息傳 遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能。（Record M，Subra C，et al.Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectom[J].Biochem ?1^現(xiàn)36〇1，2011，81(10):1171-1182)。后續(xù)的研究又證實(shí)外泌體中的11^(^〇1?祖在不同酸 堿環(huán)境、缺氧、高溫、反復(fù)凍融等惡劣條件下仍能保持較高穩(wěn)定性，還能對(duì)抗RNase的作用， 主要是因?yàn)橥饷隗w可將microRNA包裹并保持其完整性(Umezu T，Ohyashiki K，Kuroda M， et al.Leukemia cell to endothelial cell communication via exosomal miRNAs[J] .Oncogene，2013，32(22): 2747-55.)。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞可能是通過(guò)此機(jī)制將有利于創(chuàng) 面愈合及詰抗瘢痕的miRNA傳遞至傷口周圍并發(fā)揮功能。
[0005] hsa_miR-145(miR-145，Accession number:MIMAT0000437)作為一個(gè)研究相對(duì)透 徹的microRNA，之前已有其在調(diào)控腫瘤增殖方面的報(bào)道，如中國(guó)專利CN201110311076.2，申 請(qǐng)公布號(hào)為CN102676516A，發(fā)明名稱為"microRNA-145的新用途"，提供了 miR-145過(guò)表達(dá)后 可顯著增強(qiáng)高轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞的侵襲和迀移能力。miR-145其前體序列在正常生理情況 下能夠生成兩種不同的成熟體即hsa-miR-145_5p (miR_145_5p，Access ion number : MIMAT0000437)與 hsa-miR-145_3p (miR-145_3p，Access ion number :MIMAT0004601)。該兩 種成熟體在創(chuàng)傷領(lǐng)域研究甚少，而其成熟體之一的miR-145-5p被報(bào)道能夠參與調(diào)控TGF-i3/ SMADS信號(hào)傳導(dǎo)通路，而該通路在創(chuàng)面修復(fù)方面廣泛存在并起到重要作用(參考文獻(xiàn)Heldin CH，LandstrSm M，Moustakas A.Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest， apoptosis,and epithetlial-mesenchymal transition[J].Curr Opin Cell Biol,2009, 21:166-176)。干擾TGFiVSMAD可調(diào)控成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化繼而減輕過(guò)度纖維 化，因此對(duì)該通路具有調(diào)控作用的miR-145-5p可能對(duì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化具 有重要作用。
[0006] 目前尚無(wú)有關(guān)miR-145-5p修飾外泌體的文獻(xiàn)報(bào)道;更無(wú) miR-145-5p修飾臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體用于創(chuàng)面治療領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供以hsa-miR-145-5p(miR-145-5p)修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 分泌的外泌體及其制備方法;本發(fā)明的另一目的在于提供miR-145-5p修飾的臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞分泌的外泌體在加速皮膚創(chuàng)面愈合并同時(shí)抑制瘢痕過(guò)度增生藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本專利將間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體進(jìn)行改良修飾，過(guò)表達(dá)抑制肌成纖維細(xì)胞形 成的miR-145-5p，開(kāi)發(fā)成為一種既具有間充質(zhì)干細(xì)胞的作用特點(diǎn)，又能規(guī)避其不良分化和 腫瘤形成缺陷的新型治療手段，不僅促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，同時(shí)也預(yù)防了瘢痕的過(guò)度增生，為 mi croRNA的靶向治療提供新的思路。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供了 一種以microRNA145-5p修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌 的外泌體，所述的外泌體是由過(guò)表達(dá)Mi croRNAl 45-5p的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的。
[0010] 所述的過(guò)表達(dá)MicroRNA145_5p的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-145_5p，Accession number:MIMAT0000437,具體序列如下：guccaguuuucccaggaaucccu(SEQ ID NO: 1) 〇
[0011]其中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，可選自新鮮臍帶培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞，詳細(xì)步驟參照 實(shí)施例一。也可以通過(guò)美國(guó)ScienCell公司購(gòu)得。
[0012]本發(fā)明的第二方面，提供了上述以microRNA145-5p修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌 的外泌體的制備方法。步驟如下：
[0013] A.臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；
[0014] B.制備過(guò)表達(dá)microRNA145-5p的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0015] C.條件培養(yǎng)基的儲(chǔ)備，所述的條件培養(yǎng)基為干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入步驟B獲得的過(guò) 表達(dá)micr 〇RNA145-5p的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，48h-72h后的上清液；
[0016] D.外泌體的抽提與純化。
[0017]其中，步驟A較優(yōu)的是:取新生兒的新鮮臍帶，經(jīng)磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗后，浸泡于 含有1 %青鏈霉素的L-DMEM約5分鐘，剪成直徑約1.5mm大小的組織塊;含10 %胎牛血清L-DMEM營(yíng)養(yǎng)液，5 %C02、37°C飽和濕度培養(yǎng);待7-10日后可見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞爬出組織，去除組 織塊后以0.25 %胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0018] 步驟B較優(yōu)的是:制備高表達(dá)miRNA145-5p間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)。選自步驟I)或 者步驟Π ):
[0019] I)人工合成Micr〇RNA145-5p的成熟體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染第3-6代間充質(zhì)干細(xì)胞，獲 得MicroRNA 145-5p高表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞;其中micr〇RNA145-5p成熟體的構(gòu)建方法為常 規(guī)方法，可參見(jiàn)工具書(shū)(著[美]J.莎姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版 社），由上海吉瑪公司合成.
[0020] Π )構(gòu)建含有MicroRNA145-5p的編碼基因的重組載體、構(gòu)建含有MicroRNA145-5p 的編碼基因的重組病