專利名稱：一組非環(huán)核苷酸類似物及其合成方法和在抗病毒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組無環(huán)核苷磷酸化物的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物、所說酯化衍生物與酸的復(fù)合物(1∶1)、所說酯化衍生物的堿性配基上的胺基樟腦酰化物；本發(fā)明還涉及所說所有化合物的合成方法以及在抗病毒方面的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及以(R)-9-(2-羥丙基)-N6-苯甲酰腺嘌呤為起始原料，采用中間體不經(jīng)分離純化一步合成得到(R)-PMPA的方法。
背景技術(shù)：
核苷類藥物作為病毒類疾病的主要治療藥，近年來受到了廣泛關(guān)注。用于治療HIV和HBV感染的核苷類藥物一般都是HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和HBV病毒DNA聚合酶抑制劑。核苷類藥物目前仍是抗HIV和抗HBV的最為有效的藥物(湯雁波，李卓榮，中國(guó)生化藥物雜志，25(1)44，2004；De Clercq E.Journal of Clinical Virology，2001，22(1)73.)。
以替諾福韋(PMPA)和阿德福韋(PMEA)為代表的無環(huán)核苷的研究是近期抗病毒藥物的研究熱點(diǎn)。無環(huán)核苷類化合物對(duì)病毒呈現(xiàn)強(qiáng)抑制作用，并與臨床上使用的其它核苷類藥物沒有交叉耐藥性。但是，PMPA及PMEA的生物利用度差，影響其作為臨床藥物的開發(fā)。為提高其生物利用度，通常將它們制成酯類前藥。PMPA的異丙氧羰氧甲基酯的富馬酸復(fù)合物替諾福韋DF(WO 99/05150)作為HIV感染的治療藥物于2001年被FDA批準(zhǔn)上市，是迄今為止抗病毒活性最強(qiáng)，腎毒性又較低的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類AIDS治療藥物。PMEA的口服親脂性前藥阿德福韋二吡呋酯[bis(POM)PMEA]為PMEA的叔丁氧羰氧甲基酯化物(EP 0 632 048)，阿德福韋二吡呋酯作為抗HBV藥物也已于2002年9月被FDA批準(zhǔn)上市。
文獻(xiàn)報(bào)道的PMPA/PMEA烴基氧羰氧甲基酯類前藥中的烴基均為叔丁基或異丙基等非環(huán)狀飽和基團(tuán)，沒有針對(duì)烴基為環(huán)狀基團(tuán)或烴基為芳香基團(tuán)和烯丙基團(tuán)的研究報(bào)道。為研究無環(huán)核苷磷酸化物(PMPA/PMEA)的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物的抗病毒活性，本發(fā)明進(jìn)行了上述化合物的合成與抗病毒活性研究，以期篩選得到新型無環(huán)核苷類抗病毒化合物。
為考察無環(huán)核苷堿性配基上胺基的修飾對(duì)抗病毒活性的影響，并考慮到樟腦基團(tuán)的引入往往能夠增強(qiáng)化合物抗病毒活性的特點(diǎn)，本發(fā)明合成了無環(huán)核苷磷酸化物(PMPA/PMEA)的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物的樟腦酰胺化物，進(jìn)行抗病毒活性研究，以期篩選得到新型核苷氨基修飾的抗病毒化合物。
有機(jī)堿性或酸性化合物成鹽后往往會(huì)改變其結(jié)晶性、溶解性等物理化學(xué)性質(zhì)，成鹽后會(huì)也更方便于制備制劑或給藥。因此，本發(fā)明進(jìn)行了無環(huán)核苷磷酸化物(PMPA/PMEA)的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物與酸的鹽性復(fù)合物的制備方法及和其抗病毒活性研究。
本發(fā)明所提供的無環(huán)核苷磷酸化物(PMPA/PMEA)的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物、所說化合物與酸(1∶1)的復(fù)合物、所說化合物的樟腦酰胺化物，迄今均為未見有相關(guān)報(bào)道的新化合物。
文獻(xiàn)報(bào)道(Antonin Holy等Collection Czechoslovak Chem.Commun.，601196-1211)以(R)-9-(2-羥丙基)-N6-苯甲酰腺嘌呤為起始原料合成PMPA均為兩步操作法，即中間產(chǎn)物(R)-9-[2-(雙乙基磷酸甲氧)丙基]-腺嘌呤經(jīng)分離純化后進(jìn)行脫乙酯得到PMPA。本發(fā)明采用一鍋式操作，中間產(chǎn)物無須進(jìn)行分離純化，一步操作制得PMPA，簡(jiǎn)化了工藝和操作步驟，為本發(fā)明首次報(bào)道提供的新合成方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以PMPA以及PMEA為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行了無環(huán)核苷磷酸化物(PMPA/PMEA)的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物、所說化合物與富馬酸(1∶1)的復(fù)合物、所說化合物的樟腦酰胺化物的合成與抗病毒活性研究。體外活性研究結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物均表現(xiàn)出抑制HIV-1病毒復(fù)制和抑制HBV病毒復(fù)制的活性，為今后深入研究與開發(fā)所說化合物的抗病毒應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的首先要方面是提供了式(I)的一組非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中，R＝CH3或H；
R”＝H或樟腦?；?；R’＝含3~8個(gè)碳原子的環(huán)式結(jié)構(gòu)的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)，其例子有環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基等；或者含3~8個(gè)碳原子的帶有雙鍵或三鍵的鏈?zhǔn)交颦h(huán)式結(jié)構(gòu)的烴基，其例子有烯丙基等；或者含6~12個(gè)碳原子的苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)，其例子有芐基等；。
本發(fā)明還提供了式(I)化合物的合成方法，反應(yīng)式如下 其中，R、R’和R”與式(I)相同；X為鹵素、CH3SO3、CH3C6H4SO3等。
該方法包括如下步驟無環(huán)核苷磷酸化物在極性非質(zhì)子性溶劑(如DMF、N-甲基-2-吡咯烷酮等)中，在有機(jī)堿(如三乙胺、吡啶等)作用下，與烴氧羰氧基鹵代甲烷縮合，無環(huán)核苷磷酸化物分子中磷酸羥基被酯化，所得酯化物在非質(zhì)子性溶媒(典型代表為DMF、四氫呋喃)中，于堿性試劑(如三乙胺、吡啶)存在下，與樟腦酰氯反應(yīng)，堿性配基中的胺基被樟腦酰化。按照所述方法，制得無環(huán)核苷磷酸化物的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物，以及所述酯化衍生物的樟腦酰胺化物。
本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽是 其中，R、R’與式(I)相同，式中的酸性部分除富馬酸外，還包括從藥學(xué)上可接受的無機(jī)酸和有機(jī)酸。合適的例子有鹽酸、氫溴酸、硫酸、過氯酸、馬來酸、磷酸、羥基乙酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸和苯磺酸等。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明化合物藥學(xué)上可接受的鹽的合成方法，反應(yīng)式如下 其中，R、R’和R”與式(I)相同，該方法包括的步驟如下無環(huán)核苷磷酸化物的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物在極性溶劑(如乙醇、異丙醇、DMF、DMSO等)中，與酸(如富馬酸、乳酸等)成鹽，得到無環(huán)核苷磷酸化物的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物與酸的復(fù)合物。
本發(fā)明還提供了一種制備(R)-PMPA的方法，反應(yīng)式如下 其中，R1為含3～8個(gè)碳原子的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)，5～18個(gè)碳原子的芳香基團(tuán)。
該方法包括的步驟如下用(R)-9-(2-羥丙基)-N6-酰基保護(hù)腺嘌呤為原料，在金屬氫化物(如氫化鈉、氫化鈣)作用下，與CH3C6H4SO3CH2PO(OC2H5)縮合，縮合產(chǎn)物不須分離純化，直接進(jìn)行在金屬醇氧化物(最有優(yōu)勢(shì)的有甲醇鈉、乙醇鈉)催化下的醇交換脫?；Ｗo(hù)基反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物不須分離純化直接進(jìn)行鹵代硅烷(如三甲基鹵硅烷)作用下的脫乙基，制得(R)-PMPA。本發(fā)明采用一鍋式操作，中間產(chǎn)物無須進(jìn)行分離純化，一步制得(R)-PMPA的方法，簡(jiǎn)化了工藝和操作。
其中，起始原料(R)-9-(2-羥丙基)-N6-酰基保護(hù)腺嘌呤和側(cè)鏈CH3C6H4SO3CH2PO(OC2H5)參考文獻(xiàn)(Antonin Holy，Collect.Czech.Chem.Commun.，1197-1211，1995)合成得到，；側(cè)鏈XCH2OCOOR參考日本專利特開平8-40986合成得到。；9-[2-(磷酸甲氧)乙基]-腺嘌呤(R＝H)的合成參考專利EP 0 206 450方法合成得到。
本發(fā)明還提供了所說化合物在抑制病毒，尤其是抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒(如乙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒)方面的應(yīng)用。采用細(xì)胞培養(yǎng)法，測(cè)定了本發(fā)明化合物在體外對(duì)乙肝病毒和HIV病毒復(fù)制的影響。抗乙肝病毒活性研究中，樣品細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法為將試驗(yàn)細(xì)胞配制成每毫升10萬個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔板每孔100μl，37℃ 5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。目標(biāo)化合物和對(duì)照藥用培養(yǎng)液配制成所需濃度后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每濃度4孔，每4天換同濃度藥液一次，同時(shí)設(shè)無藥物細(xì)胞對(duì)照組。以觀察細(xì)胞病變?yōu)橹笜?biāo)，8天顯微鏡下觀察細(xì)胞病變程度。按Reed & Muench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度(TD50)。樣品抑制肝炎病毒活性試驗(yàn)方法為每毫升10萬個(gè)試驗(yàn)細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，37℃ 5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，加入藥物，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，4天換原濃度藥液或?qū)φ张囵B(yǎng)液一次。細(xì)胞裂解后按分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法提取HBV DNA。各樣品斑點(diǎn)雜交、放射自顯影、測(cè)量各雜交點(diǎn)的A值后，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算細(xì)胞對(duì)照及給藥組的HBV DNA含量后，計(jì)算半數(shù)有效濃度(IC50)。試驗(yàn)樣品的選擇指數(shù)(SI)計(jì)算方法為SI＝TC50/IC50。
抗HIV活性研究中，將MT-4細(xì)胞2×105/ml 50μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入50μl 10-2的HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株IIIB培養(yǎng)液，同時(shí)加10、3.33、1.11和0.37μg/ml共4個(gè)不同濃度藥物或不同稀釋度的陽性對(duì)照藥AZT(齊多夫定)和NVP藥液100μl，在37℃、5％CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，于第7天吸棄上清100μl，每孔加10μl 5mg/mlMTT染色，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，每孔加入100μl 50％DMF-17％Triton X-100脫色液，37℃過夜，在酶聯(lián)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm的OD570nm值，采用Reed &Muench法計(jì)算出藥物在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)半數(shù)有效濃度(EC50)和病毒抑制率。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物，可以含有治療有效量的上述化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于制備抗病毒藥物。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備，例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5％-95％的活性成分。
發(fā)明效果按照前述所說路線和方法，能夠穩(wěn)定、可重復(fù)性地合成得到本發(fā)明化合物；用本發(fā)明方法制備PMPA，可以簡(jiǎn)化操作工藝，提高收率，降低成本；多次體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明化合物的抗病毒活性測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性良好。
本發(fā)明化合物的抗肝炎病毒活性試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物5f的活性高于對(duì)照藥替諾夫韋DF，化合物5b、5d和5h的活性與替諾夫韋DF相當(dāng)，化合物5a、5c和5g呈現(xiàn)出比較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
總之，所說化合物中的大多數(shù)具有潛在的抗HBV活性，尤其以芐基及環(huán)戊基取代的烴氧羰氧甲基酯類化合物尤其值得特別關(guān)注。
抗HIV病毒活性測(cè)定結(jié)果表明，所有試驗(yàn)化合物對(duì)HIV-1 IIIB均具有抑制活性，其中，化合物5a、5d、5g和5h等的活性較更強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。所有化合物1-5的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、MS所確定。
實(shí)施例1(R)-9-[2-(磷酸甲氧)丙基]-腺嘌呤(PMPA)的制備(R)-9-(2-羥丙基)-N6-苯甲酰腺嘌呤10g(0.034mol)、對(duì)-甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯18.8g(0.058mol)的混合物與DMF(2×50ml)在不超過50℃油泵減壓下共蒸后，所得殘余物溶于250ml DMF中共蒸至殘余約25ml后，在冰水冷卻下向所得溶液中加入60％氫化鈉6.30g(0.158mol)，保持干燥的條件下反應(yīng)混合物于室溫下攪拌6h小時(shí)。然后加入0.1M甲醇鈉的甲醇溶液(500ml)，隔濕條件下放置過夜。反應(yīng)混合物用醋酸約5ml中和至弱堿性(pH7-8)。減壓下濃縮至干，殘余物用少量氯仿攪拌提取，過濾除雜質(zhì)，母液旋干，得黃褐色油狀物，油泵抽兩小時(shí)，粗品用于下步反應(yīng)。
將三甲基溴硅烷19.34g(0.126mol)加入到上述制得的粗品油狀物11.54g(0.034mol)和DMF120ml的混合物中(內(nèi)溫不超過50℃)，室溫下攪拌至原料及中間單酯消失(約20h小時(shí))。減壓蒸出溶劑，殘余物用氨水約5ml處理(pH 8)，再次蒸干后，去離子水混合(1/15g/ml)，用約4.5ml濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱回流溶解(應(yīng)監(jiān)視pH變化，必要時(shí)補(bǔ)加濃鹽酸以保證溶液的pH在3.0)，活性炭脫色，趁熱過濾，濾液自然冷卻至室溫，抽濾收集產(chǎn)物，紅外燈下烘干得松散固體PMPA 5.7g(59％)。mp268-271℃。旋光度[α]為-21.4°(C＝0.5，0.1MHCl)。1HNMR(D2O)δ(ppm)1.175(d，J＝6.3Hz，3H，CH3)，3.42-3.70(m，2H)，3.95-4.00(m，1H)，4.25-4.64(m，2H)，8.36(s，2H，嘌呤環(huán)上H)。
實(shí)施例2(R)-9-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3a)的制備(R)-9-[2-(磷酸甲氧)丙基]-腺嘌呤0.2g(0.697mmol)與DMF 4ml、三乙胺0.2g(1.98mmol)的混合物室溫下攪拌30min分鐘，然后加入烯丙氧羰基氧基氯甲烷0.47g(0.312mmol)，所得混合物先在80℃下攪拌反應(yīng)30min分鐘，然后60℃下攪拌反應(yīng)4h小時(shí)。加入乙酸乙酯6ml稀釋反應(yīng)混合物，并于約25℃攪拌30min分鐘以上。濾除析出的固體，用乙酸乙酯2ml洗滌固體，合并濾液和洗滌液。用水洗提乙酸乙酯(2×4ml)，水層再用乙酸乙酯回提取(2×4ml)。合并乙酸乙酯層，減壓蒸出溶媒后，殘余物硅膠柱層析分離(氯仿∶甲醇20∶1為流動(dòng)相)得油狀產(chǎn)物(R)-9-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3a)0.17g(57％)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)1.046(d，J＝6Hz，3H，CH3)，3.955-3.996(m，3H)，4.163-4.262(m，2H)，4.655(d，J＝5.7Hz，4H，2×CO2CH2C＝)，5.232-5.362(m，4H，2×＝CH2)，5.497-5.593(m，4H，2×OCH2O)，5.872-5.929(m，2H，2×-CH＝)，7.239(s，2H，NH2)，8.020(s，1H)，8.13(s，1H)。MS-ESI516(M++1)。
實(shí)施例3(R)-9-[2-[(雙芐氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3b)的制備以實(shí)施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(雙芐氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3b)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)1.007(d，J＝6Hz，3H，CH3)，3.889-3.966(m，3H)，4.079-4.231(m，2H)，5.182(s，4H，2×與苯環(huán)相連CH2)，5.493-5.584(m，4H，2×OCH2O)，7.232(s，2H，NH2)，7.356(s，10H，苯環(huán)H)，8.001(s，1H)，8.13(s，1H)。MS-ESI616(M++1)。
實(shí)施例4(R)-9-[2-[(雙環(huán)戊氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3c)的制備以實(shí)施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(雙環(huán)戊氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3c)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)1.042(d，J＝6Hz，3H，CH3)，1.557-1.975(m，8H，環(huán)戊基上4×CH2)，3.956-4.028(m，3H)，4.118-4.264(m，2H)，5.031(s，2H，2×環(huán)戊基上次甲基H)，5.479-5.547(m，4H，2×OCH2O)，7.225(s，2H，NH2)，8.018(s，1H)，8.13(s，1H)。MS-ESI572(M++1)。
實(shí)施例5(R)-9-[2-[(環(huán)己氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3d)的制備以實(shí)施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(環(huán)己氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤(3d)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)1.045(d，J＝6Hz，3H，CH3)，1.136-1.801(m，20H，環(huán)己基上10×CH2)，3.902-3.993(m，3H)，4.118-4.277(m，2H)，4.574(m，2H，2×環(huán)己基上次甲基H)，5.474-5.559(m，4H，2×OCH2O)，7.241(s，2H，NH2)，8.025(s，1H)，8.133(s，1H)。MS-ESI600(M++1)。
實(shí)施例69-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3e)的制備以實(shí)施例1類似方法合成得到9-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3e)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)3.866(t，J＝4.8Hz，2H)，3.999(d，J＝7.8Hz，2H，OCH2P)，4.306(t，J＝4.8Hz，2H，NCH2)，4.655(d，J＝5.4Hz，4H，2×CO2CH2C＝)，5.235-5.364(m，4H，2×＝CH2)，5.573-5.613(m，4H，2×OCH2O)，5.854-5.965(m，2H，2×-CH＝)，7.255(s，2H，NH2)，8.056(s，1H)，8.126(s，1H)。MS-ESI502(M++1)。
實(shí)施例79-[2-[(雙芐基氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3f)的制備以實(shí)施例1類似方法合成得到9-[2-[(雙芐基氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3f)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)3.830(t，J＝4.8Hz，2H)，3.972(d，J＝7.8Hz，2H，OCH2P)，4.272(t，J＝4.8Hz，2H，NCH2)，5.180(s，4H，2×與苯環(huán)相連CH2)，5.548-5.590(m，4H，2×OCH2O)，7.220(s，2H，NH2)，7.359(s，10H，2×苯環(huán)H)，8.031(s，1H)，8.125(s，1H)。MS-ESI602(M++1)。
實(shí)施例89-[2-[(雙環(huán)戊氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3g)的制備以實(shí)施例1類似方法合成得到9-[2-[(雙環(huán)戊氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3g)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)1.544-1.828(m，8H，環(huán)戊基上4×CH2)，3.869(t，J＝5.1Hz，2H)，3.986(d，J＝8.1Hz，2H，OCH2P)，4.307(t，J＝5.1Hz，2H，NCH2)，5.009-5.046(m，2H，2×環(huán)戊基上次甲基H)，5.495-5.576(m，4H，2×OCH2O)，7.242(s，2H，NH2)，8.055(s，1H)，8.13(s，1H)。MS-ESI558(M++1)。
實(shí)施例99-[2-[(雙環(huán)己氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3h)的制備以實(shí)施例1類似方法合成得到9-[2-[(雙環(huán)己氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤(3h)。1HNMR(DMSO)δ(ppm)1.174-1.798(m，20H，環(huán)己基上10×CH2)，3.847-3.881(m，2H)，3.979-4.005(m，2H)，4.287-4.320(m，2H)，4.527-4.597(m，2H，2×環(huán)己基上次甲基H)，5.506-5.590(m，4H，2×OCH2O)，7.216(s，2H，NH2)，8.050(s，1H)，8.119(s，1H)。MS-ESI586(M++1)。
實(shí)施例10(R)-9-[2-(雙異丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤N樟腦酰(4i)的制備(R)-9-[2-[(雙異丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤0.52g(1.51mmol)，溶于5ml氯仿中，加入三乙胺0.44g(4.35mmol)，攪拌均勻后，再加入樟腦酰氯0.71g(3.28mmol)，室溫下攪拌18h小時(shí)。反應(yīng)液中加入30ml氯仿，然后再加入30ml蒸餾水，震搖、靜置分層。氯仿層加40ml0.1mol/L的K2CO3溶液，震搖、靜置分層。氯仿層水洗(2×20ml)后，減壓蒸出溶媒，殘余物進(jìn)行柱層析(氯仿-甲醇體系，梯度洗脫)，得油狀產(chǎn)物(R)-9-[2-(雙異丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧)丙基]-腺嘌呤N樟腦酰(4i)0.6g(產(chǎn)率76％)。1HNMR(CDCl3)δ(ppm)0.959-1.358(m，18H，6×CH3)，1.739-1.784(m，1H)，1.962-2.115(m，2H)，2.622-2.666(m，1H)，3.583-4.467(m，9H)，8.210(s，1H，嘌呤環(huán)上H)，8.781(s，1H，嘌呤環(huán)上H)。MS-ESI700(M++1)。
同樣用類似方法合成得到PMPA和PMEA酯化物的樟腦酰物4a-h等。
實(shí)施例11(R)-9-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5a)的制備(R)-9-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5a)的制備方法如下(R)-9-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤0.5g(0.97mmol)與0.12g(0.97mmol)富馬酸以及2ml異丙醇混合，所得混合物于50℃下攪拌至固體完全溶解，然后室溫下冷卻析晶，濾取固體，并用乙醚洗滌固體，得產(chǎn)品0.46g(68.6％)。mp109-111℃。旋光度[α]為-3.21°(溶劑∶甲醇)。1HNMR(DMSO)中除PMPA酯信號(hào)外，在δ(ppm)6.623(s，2H)處顯示出富馬酸雙鍵氫的信號(hào)。
實(shí)施例12(R)-9-[2-[(雙芐氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5b)的制備以實(shí)施例11類似方法得到(R)-9-[2-[(雙芐氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5b)。mp100-102℃。旋光度[d]為-2.55°(溶劑∶甲醇)。富馬酸雙鍵氫的1HNMR(DMSO)信號(hào)為δ(ppm)6.62(s，2H)。
實(shí)施例13(R)-9-[2-[(雙環(huán)戊氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5c)的制備以實(shí)施例11類似方法得到(R)-9-[2-[(雙環(huán)戊氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5c)。mp109-111℃。旋光度[d]為-3.21°(溶劑∶甲醇)。富馬酸雙鍵氫的1HNMR(DMSO)信號(hào)為δ(ppm)6.62(s，2H)。
實(shí)施例14(R)-9-[2-[(雙環(huán)己氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5d)的制備以實(shí)施例11類似方法得到(R)-9-[2-[(雙環(huán)己氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]丙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5d)。mpmp114-117℃。旋光度[d]為-2.47°(溶劑∶甲醇)。富馬酸雙鍵氫的1HNMR(DMSO)信號(hào)為δ(ppm)6.62(s，2H)。
實(shí)施例159-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5e)的制備以實(shí)施例11類似方法得到9-[2-[(雙烯丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5e)。mp98-101℃。富馬酸雙鍵氫的1HNMR(DMSO)信號(hào)為δ(ppm)6.62(s，2H)。
實(shí)施例169-[2-[(雙芐氧羰基氧甲基)磷酸甲氧]乙基]-腺嘌呤富馬酸復(fù)合物(5f)的制<p>組別n ALT AST 白蛋白 Hyp(U/L)(U/L) (g/L) (ug/g)空白對(duì)照組 12 128.2± 317.6± 28.4± 224.8±58.3** 64.5** 1.4** 116.3**模型組 10 684.2± 1263.4 ± 20.2±1.7 1361.7 ±134.6314.6342.7?；撬?水 12 314.5± 394.7± 25.9± 687.3±飛薊賓葡甲 21.8**#135.7**#1.3**#77.5**#胺組水飛薊賓葡 12 426.4± 567.3± 22.7± 827.2±甲胺組 23.1** 155.4** 1.1*125.8*注與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與水飛薊賓葡甲胺組比較，#p＜0.05，##p＜0.01。
鏡下見正常肝小葉結(jié)果被破壞，出現(xiàn)典型假小葉，間質(zhì)纖維增生，牛磺酸+水飛薊賓葡甲胺組組肝炎變程度較輕，較水飛薊賓葡甲胺組也輕。
上述結(jié)果顯示，?；撬?水飛薊賓葡甲胺復(fù)方藥物具有明顯的保護(hù)肝功能的作用，抑制肝纖維化的作用，其療效優(yōu)于單獨(dú)使用水飛薊賓葡甲胺。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例是說明本發(fā)明的，但并不意味這限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1制備牛磺酸+甘草酸二銨注射劑(1000支)
制備方法稱取?；撬帷⒏什菟岫@，加入到80％的注射用水中，攪拌溶解，用1％氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至3.0-4.5之間，過濾，補(bǔ)加蒸餾水至足量，冷凍干
*在實(shí)驗(yàn)藥物濃度下顯示出細(xì)胞毒性所有試驗(yàn)化合物對(duì)HBV病毒均有抑制活性，其中，化合物5b、5d、5f和5h呈現(xiàn)出較強(qiáng)的病毒抑制活性和較弱的細(xì)胞毒性，化合物5f的活性強(qiáng)于對(duì)照藥替諾夫韋DF。
實(shí)施例20在MT-4細(xì)胞內(nèi)抑制人類免疫缺陷病毒(HIV-1 IIIB)的活性測(cè)定將MT-4細(xì)胞2×105/ml 50μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入50μl 10-2的HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株IIIB培養(yǎng)液，同時(shí)加10、3.33、1.11和0.37μg/ml共4個(gè)不同濃度藥物或不同稀釋度的陽性對(duì)照藥AZT和NVP藥液100μl，在37℃、5％CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，于第7天吸棄上清100μl，每孔加10μl 5mg/mlMTT染色，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，每孔加入100μl 50％DMF-17％Triton X-100脫色液，37℃過夜，在酶聯(lián)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm的OD570nm值，采用Reed & Muench法計(jì)算藥物在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)10μg/ml藥物濃度下的抑制率。結(jié)果如表2所示。
表2.PMPA/PMEA衍生物抑制HIV-1 IIIB活性數(shù)據(jù)
*泰諾夫韋DF在0.37μg/ml濃度下的抑制率為53％，但在10μg/ml濃度下表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性，抑制率反而下降至20％；5a在1.11μg/ml濃度下的抑制率已達(dá)78％，在10μg/ml濃度下表現(xiàn)出微弱細(xì)胞毒性，抑制率仍然比較強(qiáng)，為86％；5h在1.11μg/ml濃度下的抑制率為31％，但在10μg/ml濃度下表現(xiàn)出強(qiáng)細(xì)胞毒性，細(xì)胞正常代謝受損，無法測(cè)出對(duì)病毒抑制率。
結(jié)果表明，本發(fā)明所有試驗(yàn)化合物對(duì)HIV-1 IIIB均具有抑制活性，其中，化合物5a、5d、5g和5h等的活性較強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一組非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示 其中，R＝CH3或H；R”＝H或樟腦?；?；R’＝含3～8個(gè)碳原子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)，或者含3～8個(gè)碳原子的帶有雙鍵或三鍵的鏈?zhǔn)交颦h(huán)式結(jié)構(gòu)的烴基，或者含6～12個(gè)碳原子的苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，R’＝環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基、烯丙基或芐基。
3.如權(quán)利要求1所述的非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，其反應(yīng)式如下 其中，R、R’和R”與權(quán)利要求1相同，X選自鹵素、CH3SO3、CH3C6H4SO3。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟無環(huán)核苷磷酸化物在極性非質(zhì)子性溶劑中，在有機(jī)堿作用下，與烴氧羰氧基鹵代甲烷縮合，無環(huán)核苷磷酸化物分子中磷酸羥基被酯化，所得酯化物在非質(zhì)子性溶媒中，于堿性試劑存在下，與樟腦酰氯反應(yīng)，堿性配基中的胺基被樟腦酰化。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其中極性非質(zhì)子性溶劑選自DMF、N-甲基-2-吡咯烷酮；有機(jī)堿選自三乙胺、吡啶；非質(zhì)子性溶媒選自DMF、四氫呋哺。
6.以權(quán)利要求1的非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽為有效成分的藥物組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征是含有藥學(xué)上可接受的一種或多種載體。
8.權(quán)利要求1所述非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1所述的非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征是所說鹽的結(jié)構(gòu)如下所示 其中R和R’與權(quán)利要求1相同；酸性部分選自鹽酸、氫溴酸、硫酸、過氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、羥基乙酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸和苯磺酸。
10.權(quán)利要求9所述非環(huán)核苷酸類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，其反應(yīng)式如下 其中R和R’與權(quán)利要求1相同。
11.如權(quán)利要求10所述的制備方法，包括以下步驟無環(huán)核苷磷酸化物的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物和烯丙氧羰氧甲基酯化衍生物在極性溶劑中，與酸成鹽。
12.如權(quán)利要求11所述的制備方法，其中極性溶劑選自乙醇、異丙醇；與酸成鹽的酸選自富馬酸、乳酸。
13.一種(R)-PMPA的制備方法，其特征是，反應(yīng)式如下 其中，R1為含3～8個(gè)碳原子的碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)，5～18個(gè)碳原子的芳香基團(tuán)。
14.如權(quán)利要求13所述的制備方法，包括如下步驟用(R)-9-(2-羥丙基)-N6-?；Ｗo(hù)腺嘌呤為原料，在金屬氫化物作用下，與CH3C6H4SO3CH2PO(OC2H5)縮合，縮合產(chǎn)物不須分離純化，直接進(jìn)行在金屬醇氧化物催化下的醇交換脫?；Ｗo(hù)基反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物不須分離純化直接進(jìn)行鹵代硅烷作用下的脫乙基，制得PMPA。
15.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其中金屬氫化物選自氫化鈉、氫化鈣；金屬醇氧化物選自甲醇鈉、乙醇鈉；鹵代硅烷選自三甲基鹵硅烷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組無環(huán)核苷磷酸化物的環(huán)氧羰氧甲基酯化衍生物、芐氧羰氧甲基酯化衍生物、所說酯化衍生物與酸的復(fù)合物、所說酯化衍生物的堿性配基上的胺基樟腦?；锏暮铣膳c抗病毒活性研究，體外活性研究結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物均表現(xiàn)出抑制HIV－1病毒復(fù)制和抑制HBV病毒復(fù)制的活性，為今后深入研究與開發(fā)所說化合物的抗病毒應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07F9/6561GK1634943SQ200410088840
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者李卓榮, 湯雁波, 劉宗英, 李玉環(huán), 彭宗根, 王建華, 陶佩珍, 陳鴻珊 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所