專利名稱：2＂－羥基煙草胺及其制造方法,及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、降壓劑及健康食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有ACE抑制活性的新物質(zhì)、該新物質(zhì)或者該新物質(zhì)的含有物的制造方法，以及作為有效成分含有該新物質(zhì)的降壓劑、以及含有該新物質(zhì)的健康食品。
背景技術(shù)：
作為生物體內(nèi)的升壓系統(tǒng)之一的、人的重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)己知的血管緊張肽原酶-血管緊張素類中，當(dāng)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin IConverting Enzyme以下簡稱為ACE。)與血管緊張素I作用，產(chǎn)生具有強(qiáng)血壓升高作用的血管緊張素-II，因此，具有抑制ACE活性的作用的物質(zhì)在作為降壓劑治療原發(fā)性高血壓癥等中被實(shí)用化?？墒牵@些藥劑不能避免頭暈、站起時眩暈、惡心、口渴、過度鎮(zhèn)靜等副作用。
1971年由Noma等[M.Noma et at.，Tetrahedron Letters，No.22，pp2017-2020(1971)]從煙葉中萃取了的煙草胺(nicotianamine)是用下述式(2)表示的天然的化合物，其不用擔(dān)心產(chǎn)生副作用的同時，還具有抑制ACE活性的作用，具有降低血壓作用的可能性很高。可是，在特開平5-246865號公報(專利文獻(xiàn)1)公開了用水或熱水萃取大豆得到萃取液，用合成吸附樹脂分離、采取該萃取液的煙草胺的煙草胺制造方法。
蕎麥自古就被認(rèn)為是營養(yǎng)價值高，優(yōu)良的健康食品，對于蕎麥的營養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)含量比其他谷類高，其氨基酸值是92，與精白米的65和小麥的41比較非常高，含在蕎麥中的蛋白質(zhì)是優(yōu)良蛋白質(zhì)。另外，有報告，蕎麥除了食物纖維比其他的谷物多之外，蕎麥蛋白質(zhì)還有食物纖維的作用，可抑制膽固醇吸收等作用。在蕎麥的功能成分中，自古就已知有通過與維生素C的協(xié)同作用強(qiáng)化毛細(xì)血管的蘆丁，但最近的研究成果中，離析鑒定出含有蘆丁的大量多酚，它們抗氧化作用的功能性受到了關(guān)注。
關(guān)于血管緊張肽原酶-血管緊張素類和蕎麥的關(guān)系，有報告說，蕎麥熱水萃取物或蕎麥蛋白質(zhì)水解物具有ACE抑制功能，認(rèn)為蕎麥的降血壓作用是由于蘆丁或肽類的緣故。
進(jìn)而，在特開平5-97798號公報(專利文獻(xiàn)2)公開了一種天然的新物質(zhì)，即，對于蕎麥，將脫殼種子或蕎麥粉用水或熱水進(jìn)行萃取的萃取液通過凝膠過濾的柱色譜進(jìn)行分餾，進(jìn)行制備具有ACE抑制活性的組分的操作，對于得到的組分用吸附柱色譜進(jìn)行分餾，制備ACE抑制活性強(qiáng)的組分，進(jìn)而，通過凝膠過濾的柱色譜分餾該組分，進(jìn)行制備ACE抑制活性強(qiáng)的組分的操作，得到用下述式(3)表示的、具有ACE抑制活性，具有降壓作用的可能性高的天然的新物質(zhì)。
這些具有ACE抑制活性的天然化合物是有效地用于降血壓劑、健康食品等方面的可能性高的化合物，但不能說對具有ACE抑制活性的新物質(zhì)進(jìn)行了充分的探索，還需要對具有ACE抑制活性的新物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步地探索。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供具有ACE抑制活性的新物質(zhì)、該新物質(zhì)或者該新物質(zhì)的含有物的制造方法，以及作為有效成分含有該新物質(zhì)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、降壓劑及含有該新物質(zhì)的健康食品。
本發(fā)明者們精心地進(jìn)行了研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行通過用萃取溶劑萃取蕎麥粉、蕎麥皮、蕎麥莖葉、蕎麥芽、苦蕎麥粉、苦蕎麥皮、苦蕎麥莖葉、蕎麥湯等的蕎麥試樣來得到萃取液的萃取工序，接著，對該萃取液，進(jìn)行通過使用陰離子交換樹脂的離子交換色譜法的分離精制得到具有ACE抑制活性的組分的分離精制工序而得到的物質(zhì)，是具有ACE抑制活性的新物質(zhì)，且該新物質(zhì)是2”-羥基煙草胺，從而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明(1)在于提供用下述式(1)表示的2”-羥基煙草胺。通過采取這樣的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明(1)可起到提供具有ACE抑制活性的新物質(zhì)的效果。
另外，本發(fā)明(2)在于提供2”-羥基煙草胺的制造方法，其進(jìn)行用萃取用溶劑萃取蕎麥試樣得到萃取液的萃取工序，接著，進(jìn)行通過對該萃取液，進(jìn)行通過使用陰離子交換樹脂的離子交換色譜法的分離精制而得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的組分的分離精制工序。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(2)可起到能制造具有ACE抑制活性的2”-羥基煙草胺的效果。
本發(fā)明(3)在于提供上述本發(fā)明(2)所記載的2”-羥基煙草胺的制造方法，其中上述萃取用溶劑是乙醇水溶液。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(3)除了起到上述發(fā)明(2)的效果，還起到提高萃取工序的萃取能力的效果。
本發(fā)明(4)在于提供上述本發(fā)明(2)或(3)所記載的2”-羥基煙草胺的制造方法，其在進(jìn)行濃縮上述萃取液得到濃縮液的濃縮工序后，對該濃縮液進(jìn)行上述分離精制工序。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(4)除了起到上述發(fā)明(2)或(3)的效果，還起到可減少分離精制工序的樣品的體積量的效果。
另外，本發(fā)明(5)在于提供上述發(fā)明(2)～(4)的任何1項所記載的2”-羥基煙草胺的制造方法，其中進(jìn)行2次以上上述分離精制工序。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(5)除了起到上述發(fā)明(2)～(4)的任何1項的效果，還起到可減少含在得到的生成物中的夾雜物的效果。
另外，本發(fā)明(6)在于提供上述發(fā)明(2)～(5)的任何1項所記載的2”-羥基煙草胺的制造方法。其對上述萃取液或上述濃縮液，進(jìn)行通過使用陽離子交換樹脂的離子交換色譜法，得到滯留在陽離子交換樹脂中的滯留物，得到洗脫出該滯留物的洗脫液的洗脫工序，接著，對該洗脫液進(jìn)行上述分離精制工序。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(6)除了起到上述發(fā)明(2)～(5)的任何1項的效果，還起到可以除去未滯留在陽離子交換樹脂的物質(zhì)，所以可減少含在得到的生成物中的夾雜物的效果。
另外，本發(fā)明(7)在于提供上述發(fā)明(2)～(6)的任何一項所記載的2”-羥基煙草胺的制造方法。其在上述萃取工序或上述濃縮工序后，對得到的萃取液或上述濃縮液，用1種或2種以上的有機(jī)溶劑進(jìn)行1次或2次以上的萃取，作為萃取液或上述濃縮液而得到的水層。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(7)除了起到上述發(fā)明(2)～(6)的任何1項的效果，還起到通過進(jìn)行脫酯可以減少含在得到的生成物中的夾雜物的效果。
本發(fā)明(8)在于提供上述發(fā)明(2)～(7)的任何1項所記載的2”-羥基煙草胺的制造方法。其進(jìn)行上述分離精制工序后，進(jìn)而，對于具有上述血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的組分進(jìn)行重結(jié)晶操作，進(jìn)行離析結(jié)晶的離析工序。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(8)除了起到上述發(fā)明(2)～(7)的任何1項的效果，還起到可得到純度高的2”-羥基煙草胺的效果。
本發(fā)明(9)在于提供上述發(fā)明(8)所記載的2”-羥基煙草胺的制造方法。其在上述離析工序中，用于重結(jié)晶操作的溶劑是乙醇水溶液。通過采取這樣的構(gòu)成，本發(fā)明(9)除了起到上述發(fā)明(8)的效果，還起到可增加由于重結(jié)晶操作得到的2”-羥基煙草胺量的效果。
本發(fā)明(10)在于提供血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，其作為有效成分含有上述發(fā)明(1)的2”-羥基煙草胺。
本發(fā)明(11)在于提供降血壓劑，其作為有效成分含有上述發(fā)明(1)的2”-羥基煙草胺。
另外，本發(fā)明(12)在于提供健康食品，其含有上述發(fā)明(1)的2”-羥基煙草胺。


圖1是表示本發(fā)明的新物質(zhì)的1H-NMR測定譜圖。
圖2是表示本發(fā)明的新物質(zhì)的13C-NMR測定譜圖。
圖3是表示本發(fā)明的新物質(zhì)的1H-1HCOSY譜圖。
圖4是表示本發(fā)明的新物質(zhì)的13C-1HCOSY譜圖。
圖5是表示來自本發(fā)明新物質(zhì)的FAB(Fast Atom Bombardment快速原子撞擊法)-MS的、m/z320(M+H)+的正極產(chǎn)物離子譜圖。
具體實(shí)施例方式
以下說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但本發(fā)明不受這些實(shí)施方式的限制。本發(fā)明的2”-羥基煙草胺的(以下，也稱為新物質(zhì))具有以下的理化學(xué)性質(zhì)。
<1H-NMR>
{在重水液中將(TMSP)作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行測定，270MHZ括弧內(nèi)是多重性、耦合常數(shù)及歸屬}本發(fā)明的新物質(zhì)的1H-NMR峰是δ2.05～2.3ppm(2H，m，H-2′)、δ2.4～2.85ppm(2H，m，H-3)、δ3.25～3.53ppm(2H，m，H-1”and H-1’)、δ3.85ppm(1H，dd，J＝4.78Hz，J＝8.42Hz，H-3’)、δ3.92～4.15ppm(2H，m，H-4)、δ4.01ppm(1H，d，J＝3.3 Hz，H-3”)、δ4.42～4.48ppm(1H，m，H-2”)、δ4.77ppm(1H，t，J＝9.57Hz，H-2)，1H-NMR測定譜表示在圖1中。
<13C-NMR>
{在重水液中將(TMSP)作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行測定，68MHZ括弧內(nèi)是歸屬}本發(fā)明的新物質(zhì)的13H-NMR峰是δ23.9ppm(C-3)、δ27.6ppm(C-2’)、δ51.2ppm(C-1”)、δ53.4ppm(C-4)、δ54.1ppm(C-1’)、δ60.5ppm(C-3”)、δ62.4ppm(C-3’)、δ68.3ppm(C-2”)、δ69.7ppm(C-2)、δ173.3ppm(C-4”)、δ174.9ppm(C-4’)、δ176.0ppm(C-1)，13C-NMR測定譜表示在圖2中。
<1H-1HCOSY及13C-1HCOSY>
另外，本發(fā)明的新物質(zhì)，通過1H-1HCOSY可得到圖3所示的1H-1HCOSY譜，通過13C-1HCOSY可得到圖4所示的13C-1H COSY譜。
<MS>
通過FAB(Fast Atom Bombardment)-MS、ESI(Electrospray Ionization電噴霧離子化)-MS測定本發(fā)明新物質(zhì)的質(zhì)譜時，在FAB-MS中，在m/z＝320可看到弱的(M+H)的峰。另外，即使在ESI-MS中也可確認(rèn)m/z＝320是(M+H)的峰。
<高分解能MS>
另外，通過高分解能FAB-MS，(M+H)離子的峰是m/z＝320.1458，與由C12H22O7N3計算的質(zhì)量數(shù)320.1458一致，分子式?jīng)Q定為C12H21O7N3。
<其他的理化學(xué)性質(zhì)>
本發(fā)明的新物質(zhì)雖然對茚三酮反應(yīng)顯示陽性，但可通過Cu2+離子抑制茚三酮反應(yīng)。另外，本發(fā)明的新物質(zhì)具有溶解于水、稀酸、稀堿等的性質(zhì)。另外，使用6N HCl在110℃下將本發(fā)明的新物質(zhì)水解16小時，使用氨基酸自動分析計檢測氨基酸時，通常幾乎檢測不出氨基酸，顯示復(fù)雜組成的分解產(chǎn)物。另外，本發(fā)明的新物質(zhì)的熔點(diǎn)是275～280℃。比旋光度是[α]D23.5＝-40°(C＝0.4g/100ml；溶劑是水)、[α]D23.5＝-34.5°(C＝0.2g/100ml；溶劑是1N HCl溶液)。另外，使用n-丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2的混合展開溶劑的硅膠載體的薄層色譜法(TLC)分析中，Rf值是0.03、在使用n-丙醇∶氨＝7∶3的混合展開溶劑的TLC中，顯示Rf值為0.06的單一的點(diǎn)。
本發(fā)明的新物質(zhì)通過由FAB-MS、ESI-MS得到的光譜的分子量是319，從高分解能MS得到的光譜，可明確是C12H21O7N3的分子式。由于對于茚三酮反應(yīng)顯示陽性，所以推定是氨基酸或肽，由于在氨基酸檢測中顯示復(fù)雜組成的分解產(chǎn)物，所以推定不是肽而是非蛋白質(zhì)性的氨基酸，由于Cu2+離子抑制了茚三酮反應(yīng)，所以推定是α-氨基酸。綜合本物質(zhì)的1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、13C-1H COSY得到的光譜的解析和上述各種數(shù)據(jù)的解析結(jié)果，推定本物質(zhì)是煙草胺的2’或2”-羥基衍生物。在來自FAB-MS的m/z＝320(M+N)正離子的生成物離子光譜(圖5)中，除了來自氮雜環(huán)丁烷環(huán)的m/z＝56的峰之外，確認(rèn)了與煙草胺一致的m/z＝114，128，186，201的峰。另外，在m/z＝245，191等的峰顯示了在2”位上存在著羥基。由此，確定了本發(fā)明的新物質(zhì)的結(jié)構(gòu)是2”-羥基煙草胺。
<蕎麥試樣>
以下說明制造本發(fā)明的新物質(zhì)的方法。作為原料的蕎麥試樣，不僅是作為植物派生的天然的非加工樣品，且使用了蕎麥的加工食品等的加工物，只要含有本發(fā)明的新物質(zhì)就可以使用，作為天然的非加工樣品，可舉出蕎麥粉、蕎麥皮、蕎麥植物莖葉及蕎麥芽、苦蕎麥等，作為加工物，可舉出蕎麥湯等。其中，蕎麥粉最適宜使用。這些蕎麥試樣也可以直接以原來的形狀在萃取工序中使用，但也可以在粉碎后在萃取工序中使用。
<萃取用溶劑>
制造本發(fā)明的新物質(zhì)的方法的萃取工序是用萃取用溶劑將蕎麥試樣萃取得到萃取液的工序，作為萃取用溶劑可舉出水、溫水、乙醇水溶液、甲醇水溶液、稀酸等的溶劑。其中，優(yōu)選的是乙醇水溶液，進(jìn)而，在該乙醇水溶液中，乙醇的濃度優(yōu)選的是60～80容量％。
<萃取工序的順序>
萃取工序是用上述萃取用溶劑萃取上述蕎麥試樣來得到萃取液的工序，作為萃取方法，可使用公知的方法對此沒有特別限制，可舉出將萃取用溶劑和蕎麥試樣混合萃取、過濾，濾液作為萃取液而得到的方法、將萃取用溶劑和植物試樣混合萃取后，離心分離，得到的上清液作為萃取液的方法等。進(jìn)行萃取工序時，作為萃取用溶劑的溫度沒有特別限制，但例如在乙醇水溶液時，由于50～100℃的萃取能力優(yōu)良，所以是理想的。另外，每重量1kg蕎麥試樣的萃取用溶劑的體積越多萃取效率越好，但優(yōu)選的是10倍容積左右。萃取的條件·次數(shù)等可根據(jù)試樣適宜地設(shè)定，也可加入萃取用溶劑進(jìn)行萃取，進(jìn)行多次得到萃取液的操作。另外，用乙醇水溶液萃取后，進(jìn)而，對得到的萃取液用己烷、醋酸乙酯、乙醚等進(jìn)行萃取得到水層，將水層作為萃取液的方法等，也可在用上述萃取用溶劑的萃取工序后，用1種或2種以上的有機(jī)溶劑進(jìn)行1次或2次以上的萃取，得到水層作為萃取液也是可能的。作為這樣的有機(jī)溶劑，可舉出己烷、醋酸乙酯、乙醚、石油醚等。
<濃縮工序>
制造本發(fā)明的新物質(zhì)的方法還可以是在進(jìn)行濃縮上述萃取工序得到的萃取液而得到濃縮液的濃縮工序后，對該濃縮液進(jìn)行下述的分離精制工序的方法。在濃縮工序中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等濃縮裝置濃縮萃取液而得到濃縮液。另外，對得到的濃縮液，用乙醚或己烷進(jìn)行萃取得到水層，接著，對該水層用醋酸乙酯萃取，將水層作為濃縮液得到的方法等，除了濃縮工序外，也可使用1種或2種以上的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，得到濃縮液。作為這樣的有機(jī)溶劑，可使用“萃取工序的順序”舉出的有機(jī)溶劑。
<洗脫工序>
另外，制造本發(fā)明的新物質(zhì)的方法，可以是對由上述萃取工序得到的萃取液或上述濃縮工序得到的濃縮液，通過使用了陽離子交換樹脂的離子交換色譜法得到在陽離子交換樹脂中滯留的滯留物后，進(jìn)行洗脫該滯留物而得到洗脫液的洗脫工序，接著，對于該洗脫液進(jìn)行下述的分離精制工序的方法。在洗脫工序中，滯留在陽離子交換樹脂中的滯留物，優(yōu)選吸附在陽離子交換樹脂中的吸附物。
<洗脫工序的柱用樹脂>
在進(jìn)行使用了陽離子交換樹脂的離子交換色譜法時，作為填充在柱的陽離子交換樹脂，沒有特別限制，但優(yōu)選的是Amberlite IR-120(Rohm andHaas社制)或Dowex 50(The Dow Chemical社制)類的強(qiáng)陽離子性交換樹脂。
<洗脫用的洗脫劑>
作為洗脫用的洗脫劑，可舉出氨、吡啶、氫氧化鈉、氫氧化鉀等的電解質(zhì)水溶液。在這些電解質(zhì)中，特別優(yōu)選的是氨。另外，作為洗脫劑中的電解質(zhì)的濃度，優(yōu)選的是0.5～2.0mol/L。
<洗脫工序的順序>
洗脫工序是將經(jīng)過萃取工序得到的萃取液或經(jīng)過濃縮工序得到的濃縮液，用注射器法、閥回路法(valve loop)等公知的方法注入到填充了陽離子交換樹脂的柱中，將含在該萃取液或該濃縮液的陽離子帶電荷的物質(zhì)滯留在柱中得到滯留物，接著，使洗脫用洗脫劑通過柱中，洗脫滯留物得到洗脫液。此時，對得到的洗脫液測定ACE抑制活性，在該洗脫液的多個組分中，能夠取出具有ACE抑制活性的組分作為洗脫液。對于這樣得到的洗脫液，通過進(jìn)行下述的分離精制工序取出具有ACE抑制活性的組分。
<分離精制工序>
含在上述萃取液、上述濃縮液或上述洗脫液的新物質(zhì)具有滯留或者吸附在陽離子交換樹脂中的性質(zhì)，所以表明是陽離子帶電荷的物質(zhì)。制造本發(fā)明的新物質(zhì)的方法的分離精制工序是將含在上述萃取液、上述濃縮液或洗脫液的陽離子帶電荷的物質(zhì)的本發(fā)明新物質(zhì)，通過用陰離子交換樹脂的離子交換色譜法的分離精制，得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性組分的工序。
<柱用樹脂>
在進(jìn)行使用了陰離子交換樹脂的離子交換色譜法時，作為填充在柱中的陰離子交換樹脂，沒有特別限制，但優(yōu)選的是Dowex l(Ten Dow Chemical社制)等的強(qiáng)陰離子性交換樹脂。這些陰離子交換樹脂，作為醋酸型使用。
<分離精制工序的洗脫液>
作為洗脫液，可舉出醋酸、甲酸、鹽酸、氨、吡啶等的電解質(zhì)的水溶液。
<分離精制工序的順序>
分離精制工序是通過用公知的方法將經(jīng)過萃取工序得到的萃取液注入到填充了陽離子交換樹脂的柱及填充了陰離子交換樹脂的柱中，對用水洗滌或用上述洗脫用電解質(zhì)水溶液洗脫得到的組分測定ACE抑制活性，得到具有ACE抑制活性的組分來進(jìn)行的。ACE抑制活性的測定可用Cushman和Cheung的方法等公知的方法進(jìn)行。
<離析工序>
在制造本發(fā)明的新物質(zhì)的方法中，可以通過將經(jīng)過以上的工序得到的具有ACE抑制活性的組分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、噴霧干燥、凍結(jié)干燥等公知的干燥裝置干固后，得到粉末狀的物質(zhì)的方法等公知的方法，從具有ACE抑制活性的組分得到粉末狀的本發(fā)明的2”-羥基煙草胺。可是，優(yōu)選從具有ACE抑制活性的組分得到粉末狀的新物質(zhì)，進(jìn)一步進(jìn)行重結(jié)晶操作，進(jìn)行離析結(jié)晶的離析工序，得到無色結(jié)晶的新物質(zhì)。作為用于重結(jié)晶操作的溶劑，可舉出丙酮水溶液、甲醇水溶液、水、乙醇水溶液等的可溶解本發(fā)明的新物質(zhì)的溶劑，但由于乙醇水溶液容易進(jìn)行重結(jié)晶操作，所以是理想的。在該乙醇水溶液中，將乙醇水溶液作為100重量％時，乙醇濃度通常是10～80容量％，優(yōu)選的是30～60容量％。對乙醇水溶液的重結(jié)晶操作的溫度條件沒有特別限制，但可采用在70～100℃下溶解粉末狀的2”-羥基煙草胺，在-10～10℃下進(jìn)行重結(jié)晶的方法。
用制造上述本發(fā)明的新物質(zhì)的方法得到的新物質(zhì)具有在上述的<1H-NMR>、<13C-NMR>、<1H-1H COSY及13C-1H COSY>、<MS>、<高分解能MS>、<其他的理化學(xué)性質(zhì)>中記載的理化學(xué)的性質(zhì)。
本發(fā)明的2”-羥基煙草胺可作為ACE抑制劑的有效成分。即，可將本發(fā)明的2”-羥基煙草胺與賦形劑、潤滑劑、結(jié)合劑、賦香劑等藥典所承認(rèn)的載體一起，用常法作成口服用的片劑、膠囊劑、糖片、粉末或細(xì)?！ゎw粒劑、溶解在水溶液中的溶劑等，得到ACE抑制劑，該ACE抑制劑可作為降血壓劑使用。上述ACE抑制劑或降血壓劑可作為口服或作為注射劑使用于靜脈注射等。
本發(fā)明的2”-羥基煙草胺可作為各種飲食品的加工材料進(jìn)行添加，將面包、洋點(diǎn)心、餅干、小甜餅干、點(diǎn)心類、蕎麥、面條、中華面等的面類、天麩羅、油炸食品等的熟制品類作成健康食品。進(jìn)而，通過將本發(fā)明的2”-羥基煙草胺溶解添加到果汁、咖啡、可可、烏龍茶、綠茶、健康飲料等的飲料類，制成健康食品。
向本發(fā)明的健康食品添加本發(fā)明的2”-羥基煙草胺的添加量沒有特別限制，但對于面包、點(diǎn)心、面、熟制品類等的食品，優(yōu)選的是10mg以上/100g，另外，對于飲料，優(yōu)選的是加入5mg以上/100g。另外，本發(fā)明的2”-羥基煙草胺也可作為健康食品、醫(yī)藥品直接利用。
實(shí)施例以下，舉出實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但這僅是個例子，本發(fā)明不受其限制。
實(shí)施例1<萃取工序>
在蕎麥粉2kg中加入70％乙醇8升，在室溫下放置1夜萃取。用濾紙過濾，作為第1萃取液。進(jìn)而，將對于殘渣用相同量的70％乙醇萃取，用濾紙過濾得到萃取液的操作進(jìn)行2次，得到第2萃取液及第3萃取液。
<濃縮工序>
收集第1萃取液、第2萃取液及第3萃取液，作為萃取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將該萃取液濃縮到約2升。
使用分液漏斗用己烷萃取濃縮液，得到己烷層和水層1。在根據(jù)己烷層和水層1的下述的<ACE抑制活性的測定>測定ACE抑制活性時，ACE抑制活性存在于水層1中，在己烷層未看到活性，在水層1中殘存活性。接著，用醋酸乙酯萃取該水層1得到醋酸乙酯層和水層2。根據(jù)醋酸乙酯層和水層2的下述(ACE抑制活性的測定)測定ACE抑制活性時，ACE抑制活性存在于水層2，對于醋酸乙酯層上未看到活性，活性殘存在水層2中。將該水層2作為濃縮液，進(jìn)行以下的分離精制工序。
<洗脫工序>
將陽離子交換樹脂Amberlite IR-120(H+)填充到柱中，用水充分地洗滌，平衡化。作為洗脫液，配制濃度1mol/L的氨水溶液。將存在抑制活性的上述濃縮液作為樣品直接注入到上述陽離子交換樹脂Amberlite IR-120(H+)的柱中，水洗非吸附組分后收集。另外，吸附組分是將濃度1mol/L的NH4OH水溶液作為洗脫用的洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到洗脫液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將各個的組分濃縮到干固，溶解到一定量的水中，根據(jù)下述的<ACE抑制活性的測定>測定ACE抑制活性時，僅在洗脫液存在活性。由此，判明活性成分是陽離子帶電荷的物質(zhì)。
<分離精制工序>
將陰離子交換樹脂Dowexlx4填充到柱中，充分水洗、平衡化。作為洗脫液，配制0.3mol/L的醋酸水溶液。使用氨水將上述洗脫液調(diào)節(jié)成pH8，直接注入到上述陰離子交換樹脂Dowexlx4的柱中。將純水、上述洗脫液順序通到柱，得到多個組分。對于該多個組分，根據(jù)下述的<ACE抑制活性的測定>測定ACE抑制活性，得到具有ACE抑制活性的組分。接著，對具有該ACE抑制活性的組分，重復(fù)2次陰離子交換樹脂Dowexlx4的柱的離子交換色譜法，精制具有ACE抑制活性的組分。其結(jié)果，得到具有強(qiáng)的ACE抑制活性的物質(zhì)的組分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干固時，得到具有強(qiáng)的ACE抑制活性的物質(zhì)85mg。
<離析工序>
對于具有上述強(qiáng)的ACE抑制活性的物質(zhì)85mg，進(jìn)行使用水-乙醇混合液(含有乙醇40容量％)的2次重結(jié)晶操作，離析44mg的無色結(jié)晶。對于這樣離析的無色結(jié)晶，進(jìn)行1H-NMR測定、13C-NMR測定、1H-1H COSY測定、13C-1H COSY測定、MS測定、高分解能MS測定等時，得到上述圖1～圖5所示的光譜的同時，說明了該無色結(jié)晶是具有記載在上述的<其他的理化性質(zhì)>的理化性質(zhì)的新物質(zhì)?？烧J(rèn)為該新物質(zhì)是2”-羥基煙草胺。
<ACE抑制活性的測定>
ACE活性的測定按照Cushman & Cheung的方法如下進(jìn)行。
(1)試劑的配制(i)將本發(fā)明的新物質(zhì)，即無色結(jié)晶1.60mg、0.8mg、0.4mg加入到水100ml中，分別配制本發(fā)明的新物質(zhì)的濃度50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L的試樣液1、試樣液2、試樣液3。
(ii)配制硼酸濃度0.2mol/L的緩沖液(pH8.3)。
(iii)將Hippuryl-L-histidyl-L-leucine溶解到上述的緩沖液中，使之成為7mmol/L濃度，配制基質(zhì)溶液。
(iv)配制2mol/L的Nacl水溶液。
(v)ACE使用來自Sigma公司的兔肺的冷凍干燥品，將該ACE 1IU加入到上述緩沖液6.67ml中，配制ACE活性150mIU/ml的酶溶液。
(2)反應(yīng)組成液(i)基質(zhì)溶液；500μl(ii)2mol/L Nacl溶液；400μl(iii)試樣液1～3；分別是30μl(iv)水；40μl(v)酶溶液；30μl(3)反應(yīng)條件將上述反應(yīng)組成液的(i)、(ii)、(iii)及(iv)混合后，不用預(yù)先培育，加入(v)的酶溶液，在37℃下反應(yīng)30分鐘(培育)。接著加入1mol/L的鹽酸500μl，停止反應(yīng)。然后，用醋酸乙酯3ml萃取游離了的馬尿酸。用離心蒸發(fā)器蒸發(fā)干固萃取液，溶解到水1ml中，用分光光度計測定228nm的吸光度。將測定了的吸光度作為ODs(對于使用了試樣液1～3的反應(yīng)分別是ODsl、ODs2及ODs3)。
(4)對照測定使用水30μl代替上述的(3)的反應(yīng)液的(iii)試樣液，其他與(3)完全相同的條件下進(jìn)行反應(yīng)，將得到的228nm的吸光度作為Odc。
(5)空白測定混合上述的反應(yīng)組成液的(i)～(iV)，在37℃下反應(yīng)30小時，用1mol/LHCI停止反應(yīng)后，加入(V)的酶液。與(3)相同地用醋酸乙酯萃取它。以后的操作是與(3)相同的。將得到的228nm的吸光度作為ODb。
(6)表示ACE抑制率50％(IC50)的本發(fā)明的新物質(zhì)的濃度的決定用下述式(4)求出Ods1、Ods2、Ods3的抑制率，ACE抑制率(％)＝{1-(Ods-ODb)/(ODc-ODb)}×100(4)通過圖表外插法決定表示抑制率50％(IC50)的本發(fā)明的新物質(zhì)的濃度。其結(jié)果，顯示抑制率50％(IC50)的ACE抑制活性的本發(fā)明的新物質(zhì)的濃度是0.08μmol/L。
比較例1在(1)試劑例的配制中，除了將煙草胺1.51mg、0.76mg、0.38mg加入到水100ml，分別調(diào)節(jié)成煙草胺的濃度為50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L的試樣液4、試樣液5、試樣液6，將該試樣液4～6作為(2)反應(yīng)組成液的(iii)試樣液，在(3)的反應(yīng)條件下使用以外，其他都與實(shí)施例1相同地進(jìn)行<ACE抑制活性的測定>的測定。其結(jié)果，作為試樣液4～6的吸光度的Ods(ODs4、ODs5及ODs6)，從實(shí)施例1求出的ODc和ODb和上述式(4)得到，顯示抑制率50％(IC50)的ACE抑制活性的煙草胺濃度是0.085μmol/L。
從以上進(jìn)行的實(shí)施例1及比較例的結(jié)果顯示，本發(fā)明的新物質(zhì)2”-羥基煙草胺的ACE抑制活性的IC50是0.08μM，與同樣條件下的煙草胺的IC50、0.085μM幾乎相等或者具有更強(qiáng)的抑制活性。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的2”-羥基煙草胺具有ACE抑制活性。另外，制造本發(fā)明的新物質(zhì)的方法，可以起到制造具有ACE抑制活性2”-羥基煙草胺的效果。進(jìn)而，通過含有本發(fā)明的2”-羥基煙草胺作為有效成分，可以作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、降壓劑，通過含有本發(fā)明的2”-羥基煙草胺作為有效成分，可以作為健康食品。
權(quán)利要求
1.一種用下述式(1)表示的2”-羥基煙草胺。
2.一種2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，進(jìn)行用萃取用溶劑萃取蕎麥試樣得到萃取液的萃取工序，接著，再對該萃取液，進(jìn)行由使用了陰離子交換樹脂的離子交換色譜法進(jìn)行分離精制得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的組分的分離精制工序。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，上述萃取用溶劑是乙醇水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，在濃縮上述萃取液得到濃縮液的濃縮工序后，對該濃縮液進(jìn)行上述分離精制工序。
5.根據(jù)權(quán)利要求2～4中任意1項所述的2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，進(jìn)行2次以上所述分離精制工序。
6.根據(jù)權(quán)利要求2～5中任意1項所述的2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，對上述萃取液或上述濃縮液，進(jìn)行通過使用了陽離子交換樹脂的離子交換色譜法，得到滯留在陽離子交換樹脂中的滯留物，并洗脫出該滯留物而得到洗脫液的洗脫工序，接著，對該洗脫液進(jìn)行上述分離精制工序。
7.根據(jù)權(quán)利要求2～6中任意1項所述的2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，在上述萃取工序或上述濃縮工序后，對得到的萃取液或濃縮液，用1種或2種以上的有機(jī)溶劑進(jìn)行1次或2次以上的萃取，作為萃取液或濃縮液得到水層。
8.根據(jù)權(quán)利要求2～7中任意1項所述的2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，進(jìn)行上述分離精制工序后，進(jìn)一步，對具有上述血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的組分進(jìn)行重結(jié)晶操作，并進(jìn)行離析結(jié)晶的離析工序。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的2”-羥基煙草胺的制造方法，其特征是，在上述離析工序中，用于重結(jié)晶操作的溶劑是乙醇水溶液。
10.一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，其作為有效成分含有上述權(quán)利要求1所述的2”-羥基煙草胺。
11.一種降血壓劑，其作為有效成分含有上述權(quán)利要求1所述的2”-羥基煙草胺。
12.一種健康食品，其含有上述權(quán)利要求1所述的2”-羥基煙草胺。
全文摘要
提供具有ACE抑制活性的2”－羥基煙草胺、該2”－羥基煙草胺的制造方法，以及以該2”－羥基煙草胺為有效成分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、降壓劑、以及含有該新物質(zhì)的健康食品。2”－羥基煙草胺的制造方法是從蕎麥試樣得到萃取液，接著，通過使用了陰離子交換樹脂的離子交換色譜法得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的組分。
文檔編號C07D205/04GK1780816SQ20048001178
公開日2006年5月31日 申請日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月7日
發(fā)明者青柳康夫 申請人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)