專(zhuān)利名稱(chēng)：心肌收縮性和心力衰竭傾向的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心肌收縮能力和心肌病顯型的調(diào)節(jié)、對(duì)相同癥狀的預(yù)防和治療以及涉及相同癥狀的轉(zhuǎn)基因小鼠。
背景技術(shù)：
心力衰竭使估計(jì)為5百萬(wàn)的美國(guó)人遭受痛苦，同時(shí)每年新增約400,000的患者，年度花費(fèi)超過(guò)二百億美元(Lloyd-Jones等人(2002)Circulation 1063068-3072)。在過(guò)去二十年里使用的主要治療方法基于對(duì)心肌收縮能力的藥理學(xué)操縱(Remme，W.J.(2001)Cardiovasc.Drugs Ther.15375-377；Felker等人(2001)Am.J.Heart 142393-401；Packer，M.(2001)Am.J.Med.110 Suppl 7A81S-94S)。心力衰竭的特征在于收縮性的逐步喪失、心室增大、增大的外周血管阻力和/或失調(diào)的液體平衡。正性肌力劑最初被用作一種增強(qiáng)心臟泵功能的方法，然而現(xiàn)在僅利用緊急救治患嚴(yán)重心力衰竭的病人，因?yàn)樗鼈儗?duì)病人的長(zhǎng)期存活產(chǎn)生危害(Felker等人(2001)Am.J.Heart 142393-401)。最近，對(duì)β-腎上腺素受體的藥理學(xué)阻塞已經(jīng)成為受青睞的治療心力衰竭的方法，雖然仍舊不能確定是否β-阻塞劑通過(guò)減少心肌收縮能力(短期)或增加它(長(zhǎng)期)對(duì)心肌有益(Packer，M.(2001)Am.J.Med.110Suppl 7A81S-94S；Bristow M.W.(2000)Circulation 101558-569；Bouzamondo等人。(2001)Fundam.Clin.Pharmacol.151595-109)。與人類(lèi)心臟衰竭相關(guān)的其它兩個(gè)特征是鈣平衡失調(diào)和神經(jīng)內(nèi)分泌刺激劑增加，信號(hào)通過(guò)Gαq-和Gαs-聯(lián)結(jié)的受體。
多種人類(lèi)疾病和由心臟異?；蛐呐K功能不良表明的狀況能導(dǎo)致心力衰竭。心力衰竭是一種心臟未能泵出足夠的血液以達(dá)到身體循環(huán)需要的生理狀況。在基因不同的人中對(duì)這種疾病和狀況的研究是困難的和不可預(yù)知的。因而，需要一種有利于鑒定心肌病的潛在治療劑的模型體系。
當(dāng)受到一組神經(jīng)體液因子刺激或當(dāng)遇到心室壁肌張力增加時(shí)，心肌出現(xiàn)適應(yīng)性肥大反應(yīng)。心臟肥大是一種心臟對(duì)多種形式的心臟病的適應(yīng)性反應(yīng)，包括那些由高血壓、機(jī)械載荷、心肌梗塞、心律不齊、內(nèi)分泌失調(diào)和/或心臟收縮蛋白基因的基因突變引起的心臟病。雖然肥大反應(yīng)最初是一種增加心輸出量的補(bǔ)償機(jī)制，但持續(xù)的肥大會(huì)導(dǎo)致心力衰竭和突然死亡。
心臟肥大的原因和結(jié)果已被文獻(xiàn)證實(shí)，但是將細(xì)胞膜處起始的肥大信號(hào)與心肌細(xì)胞基因表達(dá)的重組連接起來(lái)的根本機(jī)制仍少為人知。對(duì)這些機(jī)制的闡明是心血管生物學(xué)的一個(gè)中心課題，并且對(duì)設(shè)計(jì)新的策略來(lái)預(yù)防或治療心臟肥大和心力衰竭來(lái)說(shuō)是重要的。
研究已經(jīng)涉及細(xì)胞內(nèi)Ca2+作為心臟肥大的一種信號(hào)。響應(yīng)肌細(xì)胞的拉伸或者在工作心臟制備上增加的載荷，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度增加(Marban等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846005-6009；Bustamante等人(1991)J.Cardovasc.Pharmacol.17S110-S113；和Hongo等人(1995)Am.J.Physiol.269C690-C697)，與Ca2+在調(diào)節(jié)生理反應(yīng)和提高的心輸出量中的作用一致。
肥大刺激導(dǎo)致成人肌細(xì)胞中的基因表達(dá)的重組，這種編碼胎兒蛋白質(zhì)異構(gòu)體，如β-肌球蛋白重鏈(MHC)和α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白的基因是上調(diào)的，然而相應(yīng)的成人異構(gòu)體α-MHC和α-心肌肌動(dòng)蛋白是下調(diào)的。通過(guò)血管舒張和尿鈉排泄降低血壓的鈉尿肽、心房利尿鈉因子和b-型鈉尿肽，響應(yīng)肥大信號(hào)在心臟中也是迅速下調(diào)的。(Komuro和Yazaki(1993)Ann.Rev.Physiol.5555-75)。在肥大期間協(xié)同調(diào)節(jié)這些心臟基因所涉及的機(jī)制是未知的。
許多信號(hào)分子的特征在于是這種疾病響應(yīng)后遺癥的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)子，包括，但不限于，具體的G-蛋白異構(gòu)體、低分子量GTPases(Ras、RhoA、Rac)、絲裂原激活的蛋白致活酶(MAPK)、蛋白致活酶C(PKC)、鈣調(diào)磷酸酶、gp130-STAT、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β。例如，AngII、PE和ET-1表面受體的結(jié)合導(dǎo)致磷脂酶C的活化、引起甘油二酯和三磷酸肌醇的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)員和蛋白致活酶C的活化。這些信號(hào)途徑在心臟肥大時(shí)期相互作用的程度是未知的(Molkentin等人(2001)Annu.Rev.Physiol.63391-426)。
鈣和/或類(lèi)脂活化的絲氨酸-蘇氨酸致活酶的蛋白致活酶C(PKC)家族在幾乎所有的膜關(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游發(fā)揮作用(Molkentin等人(2001)Annu.Rev.Physiol.63391-426)。大約12個(gè)不同的同工酶組成此PKC家族，它們通過(guò)其活化特征被廣泛的分類(lèi)。常規(guī)的PKC同工酶(PKCα、βI、βII和γ)是鈣和類(lèi)脂活化的，而新型同工酶(ε、θ、η和δ)和非典型的同工酶(ζ、ι、υ和μ)不依賴(lài)于鈣，但是被不同的類(lèi)脂活化(Dempsey等人(2000)Am.J.Physiol.Lung Mol.Physiol.279247-251)。一旦被活化，PKC同工酶通過(guò)直接作用于停泊蛋白或稱(chēng)為RACK(Receptor for Activated C Kinases[活化的C致活酶受體])改變到不連續(xù)的亞細(xì)胞位置，停泊蛋白允許具體的底物識(shí)別和隨即進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Mochly-Rosen，D(1995)Science 268247-251)。
報(bào)道已經(jīng)將PKC活化與肥大、擴(kuò)張性心肌病、缺血性損傷或絲裂原刺激聯(lián)系起來(lái)(DeWindt等人(2000)J.Biol.Chem.27513571-13579；Gu & Bishop(1994)Circ.Res.75926-931；Jalili等人(1999)Am.J.Physiol.277H2298-H2304；Takeishi等人(1999)Am.J.Physiol.276H53-H62)。例如，嚙齒動(dòng)物中的血液動(dòng)力學(xué)壓力過(guò)載刺激促進(jìn)PKCα、β、γ、ε和θ移位。在多種培養(yǎng)心肌細(xì)胞中，激動(dòng)劑和應(yīng)力刺激也是有效的PKC同工酶移位激活因子。同工酶特異的肽抑制劑已經(jīng)被使用于心肌細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因小鼠中以提供更大的PKC抑制的特異性。具體地講，心肌細(xì)胞中的PKCβ C2結(jié)構(gòu)域肽的過(guò)表達(dá)阻塞了弗波酯調(diào)節(jié)的鈣通道的活性(Zhang等人(1997)Circ.Res.80720-729)，然而一種PKCε抑制或活化肽影響了收縮變力性和缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(Gray等人(1997)J.Biol.Chem.27230945-30951；Johnson等人(1996)J.Biol.Chem.27124962-24966；Dorn等人(1999)Proc.Natl.Acad Sci USA 9612798-12803)。此外，腺病毒調(diào)節(jié)PKCε的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入培養(yǎng)的成年兔子心室肌細(xì)胞中，增加基礎(chǔ)肌細(xì)胞收縮力和鈣瞬變。肌細(xì)胞中的結(jié)果說(shuō)明PKCε發(fā)揮提高心肌收縮能力的作用(Baudet等人(2001)Cardiovasc.Res.50486-494)。
弗波酯在多細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮急性生物學(xué)效應(yīng)，與之最一致的是立即活化多種PKC同工酶。在心肌細(xì)胞中，PMA是多種同工酶移位和活化的有效誘導(dǎo)者，同工酶包括，但不限于，PKCα、β、δ和ε(Braz等人(2002)J.Biol.Chem.156905-919)。因此，急性PMA給藥可以被用以檢查PKC移位對(duì)心臟收縮變力性和收縮力立即的但是非特異性的效果。急性弗波酯施用已經(jīng)被用于評(píng)估PKC同工酶部分地調(diào)節(jié)全心或分離的肌細(xì)胞收縮性能的假說(shuō)。例如，使用分離的小雞心室肌細(xì)胞，PMA處理產(chǎn)生細(xì)胞縮短幅度的濃度和時(shí)間依賴(lài)性的降低，當(dāng)在1μM藥品時(shí)達(dá)到降低54％的最大值(Leatherman等人(1987)Am.J.Physiol.253H205-209)。與這個(gè)效果相一致，PMA產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和鈣再攝取率的降低。相反，PMA預(yù)處理來(lái)自心臟的乳頭肌加強(qiáng)α1-受體調(diào)節(jié)的正收縮變力性，證明使用PMA的非選擇性的效果(Otani等人(1988)Circ.Res.628-17)。一項(xiàng)在成年大鼠分離的心室肌細(xì)胞中進(jìn)行的分析顯示PMA有急性負(fù)性收縮效果(Capogrossi等人(1990)Circ.Res.661143-1155)。這些作者使用1Hz穩(wěn)定電場(chǎng)刺激鈣濃度1mM的成人肌細(xì)胞，刺激之后PMA(10-7M)被使用以引起收縮幅度達(dá)對(duì)照品約60％的降低。在單個(gè)心肌細(xì)胞中鈣響應(yīng)的肌絲不受PMA的影響，但是負(fù)收縮變力的效果是由于減少的鈣瞬變幅度。與此報(bào)道形成對(duì)比的是，一項(xiàng)使用有輕微差異的弗波酯，12-O-四葵酸佛波13-乙酯(TPA)的單獨(dú)研究，顯示了細(xì)胞縮短的顯著增加和在松弛期間的細(xì)胞長(zhǎng)度變化率的增加，說(shuō)明PKC同工酶的活化提高了收縮性(MacLeod等人(1991)J.Physiol.444481-498)。一項(xiàng)較為精心設(shè)計(jì)的在分離心肌細(xì)胞和完整豚鼠-豬心臟中的研究顯示，使用10-12M PMA時(shí)發(fā)生顯著的正收縮變力反應(yīng)，但是當(dāng)濃度高于10-10M PMA時(shí)發(fā)生負(fù)收縮變力反應(yīng)(Ward和Moffat(1992)J.Mol.Cell Cardiol.24937-948)。上述討論的結(jié)果說(shuō)明弗波酯調(diào)節(jié)的心肌收縮能力的變化是復(fù)雜的。
轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)被使用改變心臟中的PKC同工酶的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。小鼠心臟中PKCβ的或者野生型或者組成型活性缺失突變體的過(guò)表達(dá)據(jù)報(bào)道誘導(dǎo)了心肌病(Wakasaki等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA949320-9325；Bowman等人(1997)J.Clin.Invest.1002189-2195)，但是最新的研究表明更低水平的表達(dá)或成人發(fā)病型PKCβ活化有利于缺血的恢復(fù)(Tiang等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.9613536-13541；Huang等人(2001)Am.J.Physiol.Cell.Physiol.280C1114-C1120)。三個(gè)研究組也報(bào)道了心臟中具有改變了的PKCε或PKCδ活性的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠心臟中PKCε或PKCδ活化肽的表達(dá)與每種同工酶的生理活化和輕度肥大反應(yīng)相聯(lián)系(Mochly-Rosen等人(2000)supra；Chen等人(2001)Proc.Natl.Acad Sci.9811114-11119)。同樣，小鼠心臟中的活化突變體PKCεcDNA的過(guò)表達(dá)據(jù)報(bào)道會(huì)誘導(dǎo)顯著的心臟肥大(Takeishi等人(2000)Circ.Res.861218-1223)，但是這樣的結(jié)果可能取決于PKCε過(guò)表達(dá)的絕對(duì)水平和活性(Pass等人(2001)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.280H946-H955)。然而許多研究已經(jīng)證明了多種PKC同工酶和心臟肥大或缺血損傷之間的聯(lián)系，具體的PKC同工酶的必需的和充分的功能仍在討論中。例如，當(dāng)小鼠心臟中的PKCβ、δ或ε的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)能引起心臟肥大時(shí)，這三個(gè)異構(gòu)體的靶基因不明顯地影響心臟，PKCβ缺失的小鼠也不會(huì)缺失肥大反應(yīng)(Roman等人(2001)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.280H2264-H2270)。這些結(jié)果共同突出了本領(lǐng)域關(guān)于PKC同工酶作為心肌收縮能力調(diào)節(jié)因子的作用的混亂認(rèn)識(shí)。PKCα基因去除小鼠已經(jīng)被Legites等人產(chǎn)生Mol.Endocrinol.16，847-858)，顯示PKCα通過(guò)PI3K增強(qiáng)胰島素信號(hào)。
PKCα是小型和大型哺乳動(dòng)物心臟中表達(dá)的主要PKC異構(gòu)體，然而關(guān)于它在此器官中的功能了解甚少(Pass等人(2001)supra；Ping等人(1997)Circ.Res.81404-414)。雖然許多相關(guān)的研究已經(jīng)被公布，顯示了PKCα活化和心臟肥大或心力衰竭之間的關(guān)系，幾乎沒(méi)有原因的或機(jī)制的數(shù)據(jù)被報(bào)道。使用培養(yǎng)的表達(dá)或者野生型或者主要是負(fù)性突變型的PKCα、β、δ和ε初生心肌細(xì)胞和重組腺病毒對(duì)PKC同工酶功能的增益和損失功能分析已經(jīng)被進(jìn)行。據(jù)報(bào)道，PKCα部分通過(guò)ERK1/2調(diào)節(jié)培養(yǎng)的初生肌細(xì)胞的肥大增長(zhǎng)，但是它在心肌收縮能力中的作用是未知的(Braz等人(2002)supra)。同樣，在培養(yǎng)初生心肌細(xì)胞中的對(duì)PKCα的反義硫代磷酸低聚核苷酸在激動(dòng)劑刺激之后減少肥大基因的表達(dá)(Kerkela等人(2002)Mol.Pharmacol.621482-1491)。然而，這些觀(guān)察報(bào)告都不包括體內(nèi)PKCα的機(jī)制評(píng)估。
人們對(duì)多種PKC異構(gòu)體潛在調(diào)節(jié)心肌收縮能力的作用了解很少。已知PKC異構(gòu)體直接磷酸化肌蛋白，例如cTnI，它據(jù)報(bào)道由于肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的相互作用影響最高ATPase活性的比率(de Tombe & Solaro(2000)Ann.Biomed.Eng.28991-1001)。然而，仍然不清楚與PKA的良好效果相對(duì)照，是否PKC調(diào)節(jié)的收縮蛋白磷酸化顯著地改變了心臟的性能。
因此，需要一種PKCα的體內(nèi)作用的機(jī)制評(píng)估。它對(duì)發(fā)展調(diào)節(jié)心臟組織中的PKCα活性的方法來(lái)說(shuō)是重要的。它對(duì)發(fā)展一種模型轉(zhuǎn)基因體系來(lái)說(shuō)也是重要的，這種體系用于鑒定PKCα調(diào)節(jié)和抗心肌病的化合物和研究心肌病。
人心力衰竭的治療部分的基于根本的原因(假如已知)，以及其它的因素，包括疾病嚴(yán)重程度、現(xiàn)有的藥物和其它的風(fēng)險(xiǎn)因素(例如冠心病、高血壓、瓣膜缺損或血脂過(guò)多)。病人中的嚴(yán)重心力衰竭可由急性的和慢性的類(lèi)型組成，它們需要不同的治療。因此，目前的心力衰竭治療策略的目標(biāo)是或者急性的代謝失調(diào)心力衰竭(ADHF)或者心力衰竭的慢性重構(gòu)效果。ADHF的治療是一種未滿(mǎn)足的醫(yī)療需要，在美國(guó)作為初步診斷每年有約1百萬(wàn)個(gè)住院額，作為二級(jí)診斷另外有2百萬(wàn)個(gè)住院額。ADHF的特點(diǎn)是由于對(duì)心臟的急性傷害造成的功能性的不足，例如，心肌梗塞、心律不齊，或可以被慢性心力衰竭的并發(fā)癥促成，例如，發(fā)展的LV重構(gòu)、心臟擴(kuò)大癥和肌細(xì)胞損失。在任一個(gè)例子中，病人需要立即的干預(yù)以獲得成功的結(jié)果。目前對(duì)ADHF的治療很大程度上取決于急救室中的癥狀，但是可以包括強(qiáng)心劑(例如多巴酚丁胺和米力農(nóng))、靜脈注射利尿劑(例如呋塞米)和/或血管擴(kuò)張藥(例如奈西立肽(RTM)為了改善心肌性能和維持充分的心輸出量。使用這些藥物的目的是急性地提高或恢復(fù)心臟的收縮和松弛，并提供癥狀地改善。除了ADHF之外，上述提到的藥物當(dāng)被認(rèn)為是存活的醫(yī)療必需品時(shí)，還被施用在任何心臟功能不良中(例如作為敗血病的后果遺留的心室功能不良)，而不考慮病源學(xué)。在慢性心力衰竭中，藥物治療方案是不同的，并且普遍地包括劑如血管緊縮素-轉(zhuǎn)換加工酶抑制劑、血管緊縮素受體阻塞劑、利尿劑和/或β-腎上腺素受體阻塞劑。這些藥物不被施用于A(yíng)DHF，并且事實(shí)上在這種情況下達(dá)不到預(yù)期目的(例如，β-腎上腺素受體阻塞劑)。雖然這些藥物對(duì)心臟收縮或松弛提供很少的或沒(méi)有立即的改善，它們已經(jīng)被證明能改善心力衰竭病人的存活和心臟重構(gòu)。因此，需要鑒定新的對(duì)象和它們的調(diào)節(jié)子以提供足夠的心力衰竭急性和慢性有益效果。
發(fā)明概述本發(fā)明基于一種新發(fā)現(xiàn)，即PKCα調(diào)節(jié)心肌收縮性和心肌病，并因此調(diào)節(jié)急性代謝失調(diào)心力衰竭(ADHF)和慢性心力衰竭。因此，據(jù)信調(diào)節(jié)PKCα活性能提供增強(qiáng)心臟收縮變力性和心室性能的治療方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于鑒定預(yù)防和治療失調(diào)的化合物，失調(diào)被心臟收縮能力和包括心臟肥大的心肌病調(diào)節(jié)。這些動(dòng)物也可用于研究目的，用以檢查涉及對(duì)肥大信號(hào)響應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本發(fā)明還詳細(xì)說(shuō)明了測(cè)量體內(nèi)PKCα活性以篩選PKCα活性的藥理調(diào)節(jié)物的過(guò)程。
本發(fā)明的組合物包括轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠、細(xì)胞和組織包含一個(gè)表達(dá)彈夾，該彈夾包含可操作地連接到PKCα核苷酸序列的心臟組織優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1，NCBI訪(fǎng)問(wèn)號(hào)X04796)或片段或它們的變異體。變異體在序列標(biāo)識(shí)號(hào)7中被提出，并編碼顯示具有顯性負(fù)性作用的多肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)8)。表達(dá)表達(dá)彈夾的細(xì)胞顯示具有改變了的PKCα表達(dá)或活性。另一方面，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示具有改變的心肌收縮能力。另一方面，本發(fā)明的小鼠顯示具有改變的對(duì)心肌病的易感性。
另一方面，轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因組織包含至少一個(gè)斷裂的PKCα基因。一方面，此斷裂足以減少或消除PKCα的表達(dá)水平。另一方面，本發(fā)明的PKCα缺失的小鼠顯示具有改變的心肌收縮能力。另一方面，本發(fā)明的小鼠顯示具有改變的對(duì)心肌病的易感性。
一方面，鑒定調(diào)節(jié)心肌收縮能力的化合物的方法被公開(kāi)，包括提供表達(dá)PKCα基因的第一和第二細(xì)胞、組織或小鼠；施用需鑒定的化合物到所述第一細(xì)胞；孵育第一和第二細(xì)胞一段合適的預(yù)定時(shí)間；測(cè)量所述第一和所述第二細(xì)胞中PKCα的活性；和鑒定那些與所述第二細(xì)胞的活性相比較，調(diào)節(jié)所述第一細(xì)胞中PKCα活性的化合物作為心肌收縮能力的調(diào)節(jié)物。
另一方面，鑒定調(diào)節(jié)心肌病的化合物的方法被公開(kāi)，包括提供表達(dá)PKCα蛋白的第一和第二細(xì)胞；施用需鑒定的化合物到所述第一細(xì)胞；孵育第一和第二細(xì)胞一段合適的預(yù)定時(shí)間；測(cè)量所述第一和所述第二細(xì)胞中的PKCα活性；和鑒定那些與所述第二細(xì)胞的活性相比較，調(diào)節(jié)所述第一細(xì)胞中PKCα活性的化合物作為心肌收縮能力的調(diào)節(jié)物。
另一方面，鑒定調(diào)節(jié)PKCα活性的化合物的方法被公開(kāi)，包括提供表達(dá)PKCα蛋白的第一和第二細(xì)胞；施用需鑒定的化合物到所述第一細(xì)胞；孵育第一和第二細(xì)胞一段合適的預(yù)定時(shí)間；測(cè)量所述第一和所述第二細(xì)胞中的PKCα活性；和鑒定那些與所述第二細(xì)胞的活性相比較，調(diào)節(jié)所述第一細(xì)胞中PKCα活性的化合物作為PKCα活性的調(diào)節(jié)物。
對(duì)于上述用以鑒定調(diào)節(jié)心肌收縮能力、心肌病、和PKCα活性的化合物的檢測(cè)分析法；任何表達(dá)合適水平的PKCα蛋白的細(xì)胞可以被使用，例如，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的細(xì)胞系、心肌細(xì)胞細(xì)胞系、或任何動(dòng)物來(lái)源的原代細(xì)胞、或組織。來(lái)自轉(zhuǎn)基因小鼠或基因去除小鼠的細(xì)胞和組織；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自身；和本發(fā)明的顯性負(fù)性突變型都適用于此目的。
PKCα活性調(diào)節(jié)物包括多種PKCα活性的抑制劑或激活因子，包括，但不限于，酶活性；移位活性；和與多種RACK的結(jié)合。
另一方面，使用上述方法鑒定的化合物還可以使用檢測(cè)分析法被進(jìn)一步驗(yàn)證，該分析法利用多種細(xì)胞培養(yǎng)、培養(yǎng)組織、或心肌收縮能力的動(dòng)物模型、或本文所述的心肌病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在心臟組織中優(yōu)先調(diào)節(jié)PKCα活性的方法。此方法包括提供轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠在至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)包含穩(wěn)定結(jié)合的表達(dá)彈夾。此穩(wěn)定結(jié)合的表達(dá)彈夾包含一個(gè)心臟優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列，它可操作的連接到到序列標(biāo)識(shí)號(hào)1中提出的PKCα核苷酸序列、或片段或它們的變異體。感興趣的變異體包括，但不限于，顯性負(fù)性突變型例如定點(diǎn)突變型，它具有在序列標(biāo)識(shí)號(hào)7中提出的核苷酸序列。本發(fā)明還包括小鼠心臟組織中的PKCα表達(dá)水平的測(cè)定法。在此方法的一個(gè)方面，小鼠顯示具有改變的心肌收縮能力。另一方面，小鼠顯示具有改變的對(duì)心肌病的易感性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)小鼠的PKCα表達(dá)的方法。此方法包括提供轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠在至少一個(gè)細(xì)胞的基因組內(nèi)包含至少一個(gè)斷裂的PKCα基因。本發(fā)明還包括小鼠中的PKCα表達(dá)水平的測(cè)定法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防動(dòng)物中由異常心肌收縮能力引起的急性心力衰竭的方法。此方法包括給動(dòng)物施用PKCα調(diào)節(jié)化合物的步驟。在此發(fā)明的一個(gè)方面，PKCα調(diào)節(jié)化合物被施用到該動(dòng)物的心臟組織。在此發(fā)明的一個(gè)方面，PKCα的調(diào)節(jié)化合物是一種PKCα抑制劑。在此發(fā)明的一個(gè)方面，此方法增強(qiáng)動(dòng)物的心肌收縮能力。合適的動(dòng)物包括，但不限于小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、人、兔子、狗、豬、山羊、母牛、大鼠、猴子、黑猩猩、綿羊和斑馬魚(yú)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防動(dòng)物心肌病的方法。此方法包括給動(dòng)物施用PKCα調(diào)節(jié)化合物的步驟。在此發(fā)明的一個(gè)方面，PKCα調(diào)節(jié)化合物被施用到該動(dòng)物的心臟組織。在此發(fā)明的一個(gè)方面，PKCα的調(diào)節(jié)化合物是一種PKCα抑制劑或激動(dòng)劑。在此發(fā)明的一個(gè)方面，本方法降低動(dòng)物的對(duì)心肌病的易感性。合適的動(dòng)物包括，但不限于小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、人、兔子、狗、豬、山羊、母牛、大鼠、猴子、黑猩猩、綿羊和斑馬魚(yú)。
可用于治療心肌收縮能力或心肌病的PKCα抑制劑包括，但不限于核酸、抗體、小分子、激活因子與抑制劑肽、和Ro-32-0432、LY333531和Ro-31-8220。
本發(fā)明也提供了進(jìn)行PKCα調(diào)節(jié)化合物的鑒定方法的試劑盒。本發(fā)明的一個(gè)方面，用來(lái)識(shí)別PKCα調(diào)節(jié)化合物的試劑盒包括一個(gè)PKCα指示多肽。在此發(fā)明的一個(gè)方面，用以鑒定PKCα調(diào)節(jié)化合物的試劑盒包含一個(gè)包含PKCα指示多肽的細(xì)胞。
序列列表描述
附圖概述

圖1描述鼠PKCα基因斷裂轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生和特征。此試驗(yàn)的細(xì)節(jié)在本文的其它部分描述。分圖A描述鼠PKCα基因組位點(diǎn)和目標(biāo)載體的示意圖，目標(biāo)載體用以置換具有用新霉素抗性基因(新)的ATP結(jié)合外顯子(E)。SalI、EcoRV、和ClaI限制酶位點(diǎn)的大致位置被指出。用作基因組探針以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的核苷酸序列的大致位置也被指出。序列識(shí)別號(hào)9和10提供刪除的外顯子的核苷酸和氨基酸序列，并且序列標(biāo)識(shí)號(hào)11至14是用以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的引物。分圖B描述胚胎干細(xì)胞的Southern blot分析結(jié)果。泳道1包含來(lái)自野生型細(xì)胞的DNA，而泳道2包含來(lái)自轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的DNA。分圖C描述蛋白制備中的PKCα的Western blot分析結(jié)果，蛋白來(lái)自野生型雜合(PKCα+/-)、和PKCα-/-轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟。泳道1至2顯示來(lái)自野生型小鼠的蛋白；泳道3至4顯示來(lái)自PKCα+/-小鼠的蛋白；泳道5至6顯示來(lái)自PKCα-/-小鼠的蛋白。
圖2描述蛋白制備中的PKCα、PKCβ、PKCδ和PKCε的Westernblot分析結(jié)果，蛋白來(lái)自野生型PKCα-/-小鼠的心臟。泳道1至4顯示來(lái)自野生型小鼠的蛋白質(zhì)；泳道5至8顯示來(lái)自PKCα-/-小鼠的蛋白質(zhì)。泳道1、2、5和6中的蛋白質(zhì)來(lái)自經(jīng)過(guò)假程序的動(dòng)物心臟。泳道3、4、7和8中的蛋白質(zhì)來(lái)自經(jīng)過(guò)主動(dòng)脈縮窄(TAC)的動(dòng)物心臟。蛋白質(zhì)在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳之前被分成可溶解的(S)(泳道1、3、5和7)和顆粒狀的(P)(泳道2、4、6和8)部分。
圖3描述來(lái)自心室性能的無(wú)創(chuàng)血液動(dòng)力學(xué)評(píng)估的結(jié)果，結(jié)果表示為在麻痹的胸腔關(guān)閉小鼠中相對(duì)于基線(xiàn)的，或響應(yīng)增加的多巴酚丁胺注射量(β激動(dòng)劑)的最大dP/dt。最大dP/dt的遞增用mmHg/sec表示。多巴酚丁胺劑量用ng多巴酚丁胺/g小鼠/min表示。來(lái)自野生型小鼠的結(jié)果用圓圈(N＝6)表示。來(lái)自PKCα-/-小鼠的結(jié)果用三角形表示(N＝6)。試驗(yàn)的細(xì)節(jié)在本文別處描述。
圖4描述在野生型(Wt)和PKCα純合性缺失(PKCα-/-)小鼠中的心臟心室性能的分析結(jié)果。來(lái)自野生型小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示。來(lái)自PKCα-/-小鼠的結(jié)果用有交叉影線(xiàn)的欄表示。在每個(gè)分圖中，首先兩欄顯示來(lái)自2個(gè)月大小小鼠的數(shù)據(jù)，而最后兩欄顯示來(lái)自10個(gè)月大小小鼠的數(shù)據(jù)。(在每一組中N＝4只小鼠)。分圖A描述來(lái)自體外工作的心臟的最大dP/dt。分圖B描述測(cè)量的用mmHg表示的左心室壓力(LVP)。
圖5描述來(lái)自野生型(NTG，圓圈)和PKCα純合性缺失的(PKCα缺失，三角形)小鼠中的結(jié)果。分圖A響應(yīng)增加的多巴酚丁胺用每分鐘跳動(dòng)次數(shù)(bpm)描的心律(HR)。分圖B描述響應(yīng)增加的多巴酚丁胺用mmHg表示的平均動(dòng)脈壓(MAP)。(響應(yīng)心得安和重復(fù)的多巴酚丁胺劑量的心律和平均動(dòng)脈壓也被評(píng)估。)試驗(yàn)的細(xì)節(jié)在本文別處描述。
圖6描述PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生和特征。試驗(yàn)的細(xì)節(jié)在本文別處描述。分圖A描述心臟組織優(yōu)選的α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)啟動(dòng)子(Genbank U71441；序列標(biāo)識(shí)號(hào)15)的示意圖，該啟動(dòng)子可操作地連接到兔子PKCα基因(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1)。分圖B描述蛋白制備中的PKC異構(gòu)體的Western blot分析結(jié)果，蛋白來(lái)自野生型和PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟。所感興趣的異構(gòu)體(PKCα、PKCβ、PKCδ和PKCε)被表示在左手邊的雜交印跡上。泳道1和2包含來(lái)自野生型(NTG)小鼠的蛋白質(zhì)；泳道3和4包含來(lái)自PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠(PKCαTG)的蛋白質(zhì)。所述PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠也稱(chēng)為PKCα過(guò)表達(dá)小鼠。分圖C描述和PKCα自動(dòng)磷酸化位點(diǎn)抗體的Western blot分析結(jié)果。蛋白質(zhì)來(lái)自非轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟(泳道1和2)；PKCα-/-小鼠(泳道3和4)，和PKCα過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠(泳道5和6)。
圖7描述心臟心室性能評(píng)估的結(jié)果。來(lái)自野生型小鼠的結(jié)果用空白欄表示；來(lái)自PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示。分圖A描述超聲心動(dòng)圖的片段縮短百分比評(píng)估結(jié)果。分圖B描述來(lái)自分離的工作心臟的心室性能分析結(jié)果，用最大dP/dt(最大dP/dt)表示。
圖8描述來(lái)自未經(jīng)刺激的雄性PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠中心臟肥大的心重(HW)對(duì)體重(BW)比率的分析結(jié)果。四只小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2、4、6和8個(gè)月)被評(píng)估。
圖9描述對(duì)野生型成年大鼠肌細(xì)胞進(jìn)行的峰縮短分析結(jié)果。細(xì)胞被編碼β-半乳糖苷酶(Adβgar，空白欄)、野生型PKCα(實(shí)體欄)、和顯性負(fù)性PKCα(dn-PKCα，條紋欄)的腺病毒感染。分析細(xì)胞的數(shù)目被顯示在每個(gè)欄的下方。
圖10描述來(lái)自涉及PKCα活性和受磷蛋白磷酸化狀態(tài)改變的一系列分析結(jié)果。此試驗(yàn)的細(xì)節(jié)在本文的其它部分描述。分圖A描述來(lái)自三個(gè)野生型(Wt，泳道4至6)和三個(gè)PKCα-/-(泳道7至9)心臟的蛋白的Western blot結(jié)果，心臟在大小為兩個(gè)月時(shí)用SERCA2、肌鈣蛋白(CSQ)和受磷蛋白(PLB)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。泳道1至3(標(biāo)準(zhǔn))加入指示量的蛋白。總受磷蛋白(PLB)對(duì)SERCA2的相對(duì)定量也被描述(分圖C)。來(lái)自野生型心臟的數(shù)據(jù)用實(shí)體欄表示；來(lái)自PKCα-/-的心臟的數(shù)據(jù)用空白欄表示。分圖B描述來(lái)自三個(gè)野生型(Wt，泳道4至6)和三個(gè)PKCα-/-(泳道7至9)心臟的蛋白的Western blot定量結(jié)果，心臟用PLB絲氨酸16磷酸特異性抗體檢測(cè)。泳道1至3(標(biāo)準(zhǔn))加入指示量的蛋白。總PLB(PLB tot)對(duì)磷酸化PLB(phos-PLB)的相對(duì)定量也被描述(分圖C)。來(lái)自野生型心臟的數(shù)據(jù)用實(shí)體欄表示；來(lái)自PKCα-/-的心臟的數(shù)據(jù)用空白欄表示。
圖11描述來(lái)自野生型成年大鼠心室肌細(xì)胞的蛋白的Western blot結(jié)果，肌細(xì)胞用編碼β-半乳糖苷酶(Adβgal)的腺病毒或編碼顯性負(fù)性PKCα(AdPKCα-dn)的腺病毒感染所指示的天數(shù)。雜交印跡用PLB絲氨酸16磷酸特異性抗體檢測(cè)。
圖12，分圖A描述在指示年齡的野生型(Wt)和PKCα-/-(缺失)小鼠的RNA點(diǎn)雜交分析結(jié)果。點(diǎn)雜交用受磷蛋白(PLB)、SERCA2和GAPDH特異性探針進(jìn)行檢測(cè)。分圖B描述兩種野生型和兩種PKCα-/-(缺失)小鼠的RT-PCR分析結(jié)果。所進(jìn)行的循環(huán)數(shù)目被指出。對(duì)PLB、SERCA2a和核糖體蛋白L7(L7)特異性的探針被使用。
圖13描述來(lái)自涉及PKCα水平和受磷蛋白磷酸化狀態(tài)改變的一系列分析結(jié)果。分圖A描述來(lái)自三個(gè)野生型(Wt)和三個(gè)PKCα轉(zhuǎn)基因(PKCαTG)心臟的蛋白的Western blot結(jié)果，心臟在大小為兩個(gè)月時(shí)用SERCA2、肌鈣蛋白(CSQ)和受磷蛋白(PLB)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。在分圖B中總受磷蛋白(PLB)對(duì)SERCA2的相對(duì)定量被描述。來(lái)自野生型心臟的數(shù)據(jù)用實(shí)體欄表示；來(lái)自PKCαTG心臟的數(shù)據(jù)用空白欄表示。分圖C描述來(lái)自三個(gè)野生型(Wt)和三個(gè)PKCα轉(zhuǎn)基因(PKCαTG)心臟的蛋白的Western blot結(jié)果，心臟用PLB絲氨酸16磷酸特異性抗體檢測(cè)。最先的三個(gè)泳道(標(biāo)準(zhǔn))加入指示量的蛋白。在分圖D中總PLB(PLB tot)對(duì)磷酸化PLB(phos-PLB)的相對(duì)定量也被描述。來(lái)自野生型心臟的數(shù)據(jù)用實(shí)體欄表示；來(lái)自PKCαTG心臟的數(shù)據(jù)用空白欄表示。
圖14描述PKCα-/-心肌細(xì)胞中的一系列鈣瞬變?cè)u(píng)估分析的結(jié)果。此試驗(yàn)的細(xì)節(jié)在本文的其它部分描述。分圖A描述來(lái)自成年野生型(WT)和PKCα-/-(KO)心肌細(xì)胞(2個(gè)月大小)的有代表性的Fura-2(340/380)鈣瞬變發(fā)射追蹤圖。分圖B描述峰鈣釋放(左側(cè))和用秒測(cè)量的80％的馳豫時(shí)間(T80，右側(cè))。來(lái)自野生型小鼠肌細(xì)胞的結(jié)果用空白欄表示。來(lái)自PKCα-/-小鼠肌細(xì)胞的結(jié)果用實(shí)體欄表示。
圖15，分圖A描述來(lái)自在咖啡因給藥之前和之后，野生型(wt)和PKCα-/-(KO)肌細(xì)胞的有代表性的Indo-1 AM發(fā)射追蹤。咖啡因刺激點(diǎn)被指出。分圖B描述來(lái)自肌細(xì)胞中咖啡因誘導(dǎo)的Ca2+瞬變的評(píng)估結(jié)果。野生型肌細(xì)胞(WT)用空白欄表示(n＝19)；PKCα-/-(KO)肌細(xì)胞用實(shí)體欄表示(n＝37)。
圖16描述平均峰鈣密度(ICa)的追蹤圖，它來(lái)自-50mV至+40mV的以10mV遞增的去極化電壓階躍。來(lái)自野生型(NTG)細(xì)胞的結(jié)果是左側(cè)的追蹤圖；來(lái)自PKCα-/-(PKCα-KO)的結(jié)果時(shí)右側(cè)的追蹤圖。
圖17描述在野生型(Wt，實(shí)體欄)和PKCα-/-(PKCα-/-，空白欄)小鼠中進(jìn)行的總磷酸酶、PP1特異的和PP2A特異的酶分析的結(jié)果。
圖18描述來(lái)自野生型(Wt，實(shí)體欄)或PKCα轉(zhuǎn)基因(過(guò)表達(dá))心臟(α-TG，空白欄)的PP1和PP2A特異的酶分析的結(jié)果。N＝3分開(kāi)的分析，各來(lái)自3個(gè)心臟中的一個(gè)。
圖19描述來(lái)自腺病毒急性感染的初生心肌細(xì)胞中的PP1-和PP2A-特異的酶分析結(jié)果，腺病毒被指示編碼β-半乳糖苷酶(Adβgal，空白欄)的腺病毒；PKCα過(guò)表達(dá)腺病毒(AdPKCαwt，實(shí)體欄)；和PKCα顯性負(fù)性腺病毒(AdPKCαdn，條紋欄)。磷酸酶活性以單位每分鐘(cpms)每μg蛋白表示。
圖20，分圖A描述E.coli純化的抑制劑-1野生型蛋白的SDS-PAGE，該蛋白易被32P-ATP和純化的蛋白致活酶C磷酸化。每個(gè)泳道包含來(lái)自指示時(shí)間點(diǎn)(10、30、或60分鐘)的一份等分試樣。結(jié)果在凝膠下的圖中被概括。所述圖描述在指示時(shí)間點(diǎn)的磷酸化的抑制劑-1蛋白的量。分圖B描述E.coli純化的I-1野生型(Wt)或S67A突變型蛋白的SDS-PAGE，該蛋白易被32P-ATP和純化的蛋白致活酶C磷酸化。所述在凝膠下的圖指示磷酸化的抑制劑-1野生型或S67A蛋白的相對(duì)量。
圖21，分圖A描述來(lái)自腺病毒感染的初生心肌細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物的Western blot，心肌細(xì)胞用抗血清對(duì)抑制劑-1(I-1)培養(yǎng)。提取物由用表達(dá)β-半乳糖苷酶(βgal)、抑制劑-1(I-1)、PKCα野生型(PKCαwt)、PKCα顯性負(fù)性突變型(PKCαdn)、抑制劑-1與β-半乳糖苷酶(I-1+β-gal)、抑制劑-1與PKCα野生型(I-1+PKCαwt)、和抑制劑-1與PKCα顯性負(fù)性(I-1+PKCαdn)的腺病毒感染的培養(yǎng)物制備。提取物與PP1c一起被免疫沉淀。免疫沉淀物被再懸浮、電泳、轉(zhuǎn)膜并與anti-I-1抗血清雜交。包含PP1c蛋白條帶的膜帶被與PP1c抗血清(顯示在I-1處理的Western blot下面)雜交。雜交蛋白被定量并且結(jié)果被概括在分圖B中。分圖B描述沉淀自每一種提取物的I-1的相對(duì)量，提取物包括抑制劑-1和β-半乳糖苷酶(Ad-I-1+Ad-β-gal，實(shí)體欄)，抑制劑-1和PKCα野生型(Ad-I-1+Ad PKCαwt，空白欄)，和抑制劑-1和PKCα顯性負(fù)性(Ad-I-1+AdPKCαdn，條紋欄)。
圖22描述來(lái)自腺病毒感染的初生心肌細(xì)胞培養(yǎng)物的，用I-1磷酸特異性抗體對(duì)蘇氨酸-35和絲氨酸-67的Western blot。
圖23描述來(lái)自野生型、PKCα-/-和PKCα轉(zhuǎn)基因心臟的對(duì)I-1磷酸-絲氨酸67的獨(dú)立Western blots定量。典型的Western blots顯示在圖的下面。
圖24，分圖A描述“正常”人供體心臟(空白欄，供體)或衰竭的擴(kuò)張型心肌病心臟(實(shí)體欄，HF)中的對(duì)總PKCα蛋白質(zhì)水平的westernblotting定量。分圖B描述“正?！惫w心臟(空白欄，供體)和衰竭心臟(實(shí)體欄，HF)中的在PKCα水平和I-1絲氨酸-67磷酸化之間的western blot定量。
圖25描述PKCα蛋白在成年大鼠心肌細(xì)胞中定位的共焦顯微照片，蛋白定位在基線(xiàn)(PKCα)或在PMA(PKCα，+PMA)刺激后。
圖26描述野生型(Wt)和PKCα-/-小鼠經(jīng)或者TAC程序或者假手術(shù)十二周后，心臟功能的評(píng)估結(jié)果。來(lái)自野生型、假手術(shù)的小鼠的結(jié)果用空白欄表示；來(lái)自PKCα-/-、假手術(shù)的小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示，來(lái)自野生型、TAC小鼠的結(jié)果用有交叉影線(xiàn)的欄表示，來(lái)自PKCα-/-、TAC小鼠的結(jié)果用條紋欄表示。圖的左側(cè)描述體外工作的心臟制備(最大dP/dt，以mmHg/sec測(cè)量)的結(jié)果。圖的右側(cè)用mmHg描述左心室壓力(LVP)。
圖27描述野生型(Wt)和PKCα-/-小鼠經(jīng)或者主動(dòng)脈縮窄(TAC)程序或者假手術(shù)十二周后，心臟功能和肥大的評(píng)估結(jié)果。來(lái)自野生型、假手術(shù)的小鼠的結(jié)果用空白欄表示；來(lái)自PKCα-/-、假手術(shù)的小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示，來(lái)自野生型、TAC小鼠的結(jié)果用有交叉影線(xiàn)的欄表示，來(lái)自PKCα-/-、TAC小鼠的結(jié)果用條紋欄表示。分圖A用mm描述左心室末端舒張(LVED)和左心室末端收縮(LVES)的尺寸。分圖B描述片段縮短(FS)的超聲心動(dòng)圖分析結(jié)果。
圖28描述野生型(Wt)、MLP-/-、和MLP-/-PKCα-/-小鼠中的心臟功能、肥大和總心臟形態(tài)的評(píng)估結(jié)果。來(lái)自野生型小鼠的結(jié)果用空白欄表示；來(lái)自PKCα-/-小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示，來(lái)自MLP-/-小鼠的結(jié)果用陰影線(xiàn)的欄表示，來(lái)自PKCα-/-、MLP-/-小鼠的結(jié)果用條紋欄表示。分圖A用mm描述左心室末端舒張(LVED)和左心室末端收縮(LVES)的尺寸。分圖B描述片段縮短(FS)的超聲心動(dòng)圖分析結(jié)果。
圖29描述野生型(Wt)、MLP-/-、和MLP-/-PKCα-/-小鼠中的心臟功能、肥大和總心臟形態(tài)的評(píng)估結(jié)果。來(lái)自野生型小鼠的結(jié)果用空白欄表示；來(lái)自MLP-/-小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示，來(lái)自PKCα-/-、MLP-/-小鼠的結(jié)果用條紋欄表示。圖的左側(cè)描述體外工作的心臟制備(最大dP/dt，以mmHg/sec測(cè)量)的結(jié)果。圖的右側(cè)用mmHg描述左心室壓力(LVP)。
圖30描述心重(HW)對(duì)體重(BW)的比率(對(duì)每一組N＝4)。來(lái)自野生型小鼠的結(jié)果用空白欄表示；來(lái)自PKCα-/-小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示，來(lái)自MLP-/-小鼠的結(jié)果用陰影線(xiàn)的欄表示，來(lái)自PKCα-/-、MLP-/-小鼠的結(jié)果用條紋欄表示。
圖31描述野生型(Wt)、PKCα-/-、MLP-/-、和MLP-/-PKCα-/-小鼠中通過(guò)蘇木素伊紅染色的心臟組織切片進(jìn)行的總心臟形態(tài)評(píng)估。
圖32描述來(lái)自成年野生型(Wt，空白欄)、PKCα-/-(α-/-，有交叉影線(xiàn)的欄)、PP1c轉(zhuǎn)基因(實(shí)體欄)和PKCα-/-x PP1c(條紋欄)小鼠(在每組中小鼠N＝4)心臟的PP1-和PP2A-特異性的磷酸酶分析結(jié)果。
圖33描述片段縮短(FS)超聲心動(dòng)圖的評(píng)估，來(lái)自所指示的小鼠的組(每組N＝4)野生型(Wt，空白欄)；PP1c轉(zhuǎn)基因(PP1c，實(shí)體欄)和PKCα-/-X PP1c(PP1-cα-/-，條紋欄)。
圖34描述野生型(Wt，空白欄)；PP1c(PP1c，黑欄)；和PKCα-/-X PP1c(PP1cα-/-，條紋欄)中的體外工作心臟的心室性能評(píng)估。分圖A描述最大dP/dt。分圖B描述最小dP/dt。分圖C描述用mmHg表示的左心室壓力(LVP)。
圖35描述兩種心力衰竭模式的死亡率分析。分圖A描述野生型(Wt，空白欄)和PKCα-/-(PKCα-/-，實(shí)體欄)在TAC操作后的所指示的時(shí)間點(diǎn)的存活百分比。分圖B描述野生型(Wt，空白欄)、PKCα-/-(PKCα-/-，實(shí)體欄)、MLP-/-(MLP-/-，陰影線(xiàn)欄)、和PKCα-/-/MLP-/-(雙倍，條紋欄)小鼠在所指示的年齡的存活百分比。
圖36描述最大(分圖A)和最小(分圖B)dP/dt值，所述值來(lái)自注入豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)的分離心臟。來(lái)自野生型心臟的結(jié)果用空?qǐng)A圈表示；來(lái)自PKCα-/-心臟的結(jié)果用實(shí)心圓圈表示。每組中的四個(gè)心臟被分析，并且錯(cuò)誤欄表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。PMA劑量被指出。
圖37描述所指示的正常人心臟中的PKC異構(gòu)體(PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCγ、和PKCε)的Western blot分析。Ca2+調(diào)節(jié)的同工酶是等同的。分圖A中左側(cè)的三個(gè)泳道包含細(xì)菌(標(biāo)準(zhǔn))中產(chǎn)生的重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)。右側(cè)的六個(gè)泳道包含來(lái)自六個(gè)正常人心臟(人心臟樣品)的蛋白。分圖B描述每種相對(duì)于樣品總蛋白含量的同工酶的量的定量。每種同工酶的量以ng/50μg總?cè)芫罕硎尽８信d趣的PKC異構(gòu)體在每欄的下面被指出。錯(cuò)誤欄表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖38描述來(lái)自體外工作心臟制備中的急性心肌收縮能力的評(píng)估結(jié)果。來(lái)自對(duì)照組小鼠的結(jié)果用空白欄表示；來(lái)自Ro-32-0432處理的小鼠的結(jié)果用實(shí)體欄表示?；€(xiàn)結(jié)果被指出。來(lái)自注入Ro-32-0432或載體對(duì)照的數(shù)據(jù)被指出(注入)。整個(gè)濃縮時(shí)間段(7分鐘每10不同的遞增濃度)的值被求和以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)目的，表示為約1×10-8M的平均劑量。僅僅注入Ro-32-0432的組顯示統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性增加(p＜0.05)。
圖39描述用DMSO(PKCα-GFP+載體)或PMA(PKCα-GFP+PMA60分鐘)處理的培養(yǎng)細(xì)胞中的PKCα指示多肽(PKCα-GFP)的共焦顯微照片。
圖40描述在正常Sprague-Dawley和Lewis大鼠體內(nèi)以所指示的劑量注入LY333531后，急性心臟收縮變力和正性變舒功能的評(píng)估結(jié)果，各自以最大dP/dt(圖40A)和最小dP/dt(圖40B)表示。
圖41顯示在大鼠心肌梗塞模型中注入Ro-31-8220后最大dP/dt相對(duì)于基線(xiàn)(B/L)的百分比增加。
發(fā)明詳述本發(fā)明為急性心力衰竭中的心肌收縮能力和一般的心力衰竭中的心肌病提供調(diào)節(jié)。本發(fā)明的組合物包括由PKCα核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或具有PKCα核苷酸序列斷裂的動(dòng)物。本發(fā)明還包括從這些小鼠中分離出來(lái)的細(xì)胞與組織。本發(fā)明提供調(diào)節(jié)PKCα活性、PKCα表達(dá)水平、心肌收縮能力、心肌病易感性、和急性心力衰竭的方法。本發(fā)明提供進(jìn)行PKCα調(diào)節(jié)化合物的鑒定方法的試劑盒。
本發(fā)明涉及關(guān)聯(lián)PKCα基因的組合物和方法(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物被穩(wěn)定的用表達(dá)彈夾轉(zhuǎn)化，該彈夾包含可操作地連接到PKCα核苷酸序列的心臟優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物被穩(wěn)定地用表達(dá)彈夾轉(zhuǎn)化，該表達(dá)彈夾包含心臟優(yōu)選的調(diào)節(jié)因子序列，該序列可操作地連接到PKCα核苷酸序列的片段或變體，例如在序列標(biāo)識(shí)號(hào)7中闡述的顯性負(fù)性變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物被穩(wěn)定地用分離的核苷酸分子轉(zhuǎn)化，該分子破壞原PKCα核苷酸序列，這樣PKCα表達(dá)水平就被降低了。一方面，心臟優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列是心臟優(yōu)選的啟動(dòng)子序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的種系細(xì)胞基因組包含相關(guān)的核苷酸序列。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是從本發(fā)明的包含至少一個(gè)表達(dá)彈夾或斷裂彈夾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離出來(lái)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因組織，例如心臟組織，是包含轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的組織。
在涉及斷裂彈夾的實(shí)施方案中，相關(guān)的核苷酸序列兩側(cè)可能會(huì)有自然發(fā)生的核酸分子被轉(zhuǎn)化進(jìn)入的細(xì)胞基因組DNA的核苷酸序列。
PKCα核苷酸序列的片段與變體和因此被編碼的蛋白質(zhì)也被包括在本發(fā)明中?！捌巍笔侵负塑账嵝蛄谢虬被嵝蛄械囊徊糠郑约耙虼吮痪幋a的蛋白質(zhì)。核苷酸序列的片段可以編碼保持原蛋白質(zhì)的生物活性的蛋白質(zhì)片段，因此顯示具有PKCα活性?？晒┻x擇地，核苷酸序列片段可用于雜交探針。PKCα的生物活性部分可以通過(guò)下列方法制備分離本發(fā)明的其中一個(gè)核苷酸序列的部分、表達(dá)PKCα蛋白質(zhì)被編碼的部分(例如，通過(guò)體外重組表達(dá))，評(píng)估PKCα蛋白質(zhì)被編碼部分的活性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將認(rèn)識(shí)到除了那些序列列表中的物種，其它物種尤其是哺乳動(dòng)物物種的PKCα基因和蛋白質(zhì)將可用于本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到通過(guò)使用來(lái)自已知物種序列的探針，cDNA或同源于已知序列的基因序列可以從相同的或替代物種中通過(guò)已知的克隆方法獲得。這種PKCα同系物和直向同源物被包括在本發(fā)明PKCα基因和蛋白質(zhì)的定義中。
因此，蛋白致活酶C-α核苷酸序列的一個(gè)片段可以編碼一個(gè)蛋白致活酶C-α(PKCα)的生物活性部分，或它可以是一個(gè)片段，此片段用以下公開(kāi)的方法可以用作一個(gè)雜交探針或PCR引物。PKCα的生物活性部分可以通過(guò)下列方法被制備分離本發(fā)明其中一個(gè)PKCα核苷酸序列的一部分、表達(dá)PKCα蛋白質(zhì)被編碼的部分(例如，通過(guò)體外重組表達(dá))，評(píng)估PKCα蛋白質(zhì)被編碼部分的活性。作為一個(gè)蛋白致活酶C-α核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500或3524個(gè)核苷酸，或最多達(dá)本文公開(kāi)的全長(zhǎng)蛋白致活酶C-α核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目，或者包含單獨(dú)來(lái)自PKCα基因組位點(diǎn)或與上述討論的序列的組合的額外的序列。
“變體”是指基本上類(lèi)似的序列。對(duì)核苷酸序列而言，保守變體包括那些因?yàn)檫z傳密碼退化，編碼本發(fā)明其中一個(gè)PKCα多肽的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位變體例如這些可以用已知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定的，例如用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。為了分離直向同源物和其它變體，一般的嚴(yán)緊雜交條件主要通過(guò)規(guī)定具體序列、序列長(zhǎng)度、GC含量和其它參數(shù)被利用。變體核苷酸序列還包括合成來(lái)源的核苷酸序列，例如那些通過(guò)使用定點(diǎn)誘變生成的核苷酸序列。變體也可包含單獨(dú)來(lái)自基因組位點(diǎn)或與其它序列組合的額外的序列。
變體蛋白質(zhì)可以通過(guò)刪減(也叫切斷)或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生自天然蛋白質(zhì)；刪減或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或在天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本發(fā)明包括的蛋白質(zhì)變體可以保持生物活性，也可以不保持。這種變異體可以由例如基因多態(tài)性或人類(lèi)操縱產(chǎn)生。一個(gè)示例性的變體PKCα蛋白被序列標(biāo)識(shí)號(hào)7闡明的核苷酸序列編碼。被序列標(biāo)識(shí)號(hào)7闡明的核苷酸序列編碼的變體蛋白質(zhì)顯示具有顯性負(fù)性作用。
可通過(guò)多種途徑，包括氨基酸取代、刪除、切斷和插入來(lái)改變本發(fā)明的蛋白。例如，PKCα蛋白的氨基酸序列變體可以通過(guò)DNA突變制備。誘變和核苷酸序列改變的方法為本領(lǐng)域所熟知。參見(jiàn)例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154367-382；美國(guó)專(zhuān)利4,873,192；Walker和Gaastra編輯(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company，New York)和其中所引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響生相關(guān)蛋白的生物活性的合適的氨基酸替代可以在Dayhoff等人的模型中找到參考。(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)。
變體核苷酸序列和蛋白也包括從誘導(dǎo)突變和引起重組的程序如DNA重組中得到的序列與蛋白。用這種程序，一個(gè)或多個(gè)不同的PKCα編碼序列可以被操縱產(chǎn)生一種新的具有所需特性的PKCα。用這種方法，重組的多核苷酸文庫(kù)可以從一組相關(guān)序列的多核苷酸中產(chǎn)生，這組多核苷酸包含有基本的序列同一性而且可以被體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域。例如，用這種方法，編碼相關(guān)結(jié)構(gòu)域的序列基序可以在本發(fā)明的PKCα基因和其它已知的PKCα基因之間進(jìn)行重組以獲得一種新基因，新基因編碼一種具有改變的相關(guān)特性的蛋白質(zhì)，例如顯性負(fù)性突變(Ohba等人(1998)Mol.Cell.Biol.1851199-51207，Matsumoto等人(2001)J.Biol.Chem.27614400-14406)。這種DNA重組的策略為本領(lǐng)域所熟知。
所述“序列同一性百分比”或“序列同一性”通過(guò)比較兩種最佳排列的序列或隨后在比較窗口或跨度進(jìn)行測(cè)定，其中序列在比較窗口的部分可任選地包括增加或刪除(即缺口)，它與參比序列相比較(它不包含增加或刪除)以獲得兩個(gè)序列的最佳排列。該百分比如下計(jì)算測(cè)定其中相同的殘基(例如核酸堿基或氨基酸殘基)在兩個(gè)序列中都存在的位置的數(shù)目，以獲得匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的總位置數(shù)目，將所得結(jié)果乘以100，獲得了序列同一性百分比。
序列同一性百分比能通過(guò)區(qū)域同源性運(yùn)算獲得，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482-485(1981)；或通過(guò)同源性排列運(yùn)算獲得，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443-445(1970)；或通過(guò)手工或計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些運(yùn)算(GAP & BESTFIT in the GCG WisconsinSoftware Package，Genetics Computer Group)。
測(cè)定同源性或序列同一性的優(yōu)選的方法是通過(guò)BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)分析，使用通過(guò)程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx進(jìn)行的運(yùn)算(Karlin等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，2264-2268，和Altschul，(1993)J.Mol.Evol.36，290-300)，這些程序被定制為序列相似性搜索。通過(guò)BLAST程序使用的該方法首先考慮在查詢(xún)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間的類(lèi)似片段，然后評(píng)估所確定的所有匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)有效性，最后僅總結(jié)滿(mǎn)足預(yù)先選擇的有效性閾值的那些匹配。對(duì)柱狀圖、描述、排列、期望值(即對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列報(bào)道匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)有效性閾值)、中止、基質(zhì)和過(guò)濾器的搜索參數(shù)一般被設(shè)為blastp、blastx、tblastn和tblastx的默認(rèn)值基質(zhì)BLOSUM62(Henikoff等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919)。
正如本文所述，PKCα基因和蛋白、它們的等位基因和其它變體(例如接合變體)、它們來(lái)自其它物種的同系物和直向同源物與多種片段和突變型將顯示具有序列變異。典型的，這些序列可顯示具有對(duì)本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)約75％的序列同一性，優(yōu)選地至少約80％的序列同一性，更優(yōu)選地至少約90％的序列同一性和更優(yōu)選地至少約95％的序列同一性。
本發(fā)明的PKCα序列以表達(dá)彈夾的形式提供，用于在相關(guān)動(dòng)物中的表達(dá)。此彈夾將包括可操作地連接到本發(fā)明的PKCα序列的5′和3′調(diào)節(jié)序列。“可操作地連接”是指在調(diào)節(jié)序列影響下的異源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。用這種方法，為本發(fā)明的PKCα核苷酸序列的核苷酸序列可以用表達(dá)彈夾連同心臟組織優(yōu)選的啟動(dòng)子的形式提供，以在相關(guān)動(dòng)物，更具體地講在動(dòng)物的心臟中表達(dá)。
為這樣的表達(dá)彈夾提供了用于插入核苷酸序列以在調(diào)節(jié)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的至少一個(gè)限制位點(diǎn)。表達(dá)彈夾還可以包含可選擇的標(biāo)記基因。
表達(dá)彈夾將包括5′至3′方向的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、和相關(guān)的異源核苷酸序列。除了包含轉(zhuǎn)錄起始和控制位點(diǎn)之外，表達(dá)彈夾還包含轉(zhuǎn)錄中止所必需的序列，和轉(zhuǎn)錄區(qū)域中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其它用于表達(dá)的調(diào)節(jié)控制元件包括起始和終止密碼子以及多聚腺苷酸信號(hào)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將知道很多的用于表達(dá)載體的調(diào)節(jié)序列。這種調(diào)節(jié)序列被描述在，例如，Sambrook等人(1989)Molecular CloningALaboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
包含本發(fā)明可操作地連接到啟動(dòng)子核苷酸序列的PKCα序列的表達(dá)彈夾也可以包含至少一個(gè)額外的核苷酸序列，用以基因被共轉(zhuǎn)移到生物體中?？晒┻x擇地，額外的序列(s)能在另一個(gè)表達(dá)彈夾上提供。
本文所述的多核苷酸能被可操作地連接到的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些包括，但不限于，來(lái)自噬菌體λ的左側(cè)啟動(dòng)子、lac、TRP、和來(lái)自E.coli的TAC啟動(dòng)子，早期和晚期啟動(dòng)子來(lái)自SV40、CMV立即早期啟動(dòng)子、腺病毒早期和晚期啟動(dòng)子、和逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列。
據(jù)認(rèn)可，本發(fā)明的PKCα核苷酸序列可操作地與任何心臟組織優(yōu)選的啟動(dòng)子連接，并且可以在心臟組織內(nèi)被表達(dá)?！靶呐K組織”是指任何來(lái)自心臟的組織，包括，但不限于，與心臟發(fā)展聯(lián)系的組織，例如肺部心肌層。
據(jù)認(rèn)可，增強(qiáng)子和/或組織優(yōu)選的元件可以與啟動(dòng)子組合利用，用以增加轉(zhuǎn)錄水平或改變組織特異性。例如，來(lái)自其它心臟優(yōu)選啟動(dòng)子的定量的或組織特異性上游元件可以與α-MHC啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，用以產(chǎn)生PKCα過(guò)表達(dá)小鼠，以增大心臟優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄。這些元件的特征在于，例如，鼠TIMP-4啟動(dòng)子、A型和B型鈉尿肽啟動(dòng)子、人類(lèi)心臟肌鈣蛋白I啟動(dòng)子、小鼠S100A1啟動(dòng)子、鮭魚(yú)心臟肽啟動(dòng)子、GATA反應(yīng)元件、可誘導(dǎo)的心臟優(yōu)選啟動(dòng)子、兔α-肌球蛋白啟動(dòng)子、和小鼠α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子(Rahkonen，等人(2002)Biochim Biophys Acta 157745-52；Thuerauf和Glembotski(1997)J.Biol.Chem.2727464-7472；LaPointe等人(1996)Hypertension 27715-722；Grepin等人(1994)Mol.Cell Biol.143115-29；Dellow，等人(2001)Cardiovasc.Res.503-6；Kiewitz，等人(2000)Biochim Biophys Acta 1498207-19；Majalahti-Palviainen，等人(2000)Endocrinology 141731-740；Charron等人(1999)Molecular & Cellular Biology 194355-4365；Genbank U71441；美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/393,525和60/454,947；和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/613,728)。
多種心臟組織優(yōu)選的啟動(dòng)子元件已經(jīng)在文獻(xiàn)中被描述，并且可以用在本發(fā)明中。這些包括，但不限于，來(lái)自以下基因的組織優(yōu)選的元件肌球蛋白輕鏈-2、α-肌球蛋白重鏈、AE3、心臟肌鈣蛋白C、和心臟α肌動(dòng)蛋白。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ranz等人(1997)Cardiovasc.Res.35560-566；Robbins等人(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752492-505；Linn等人(1995)Circ.Res.76584-591；Parmacek等人(1994)Mol Cell Biol.141870-1885；Hunter等人(1993)Hypertension 22608-617；和Sartorelli等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894047-4051。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼區(qū)域被可操作地連接到一個(gè)可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件或幾個(gè)元件。多種可誘導(dǎo)啟動(dòng)子體系在文獻(xiàn)中被描述并且可以用在本發(fā)明中。一種已知的可用的條件體系是二元的、四環(huán)素基礎(chǔ)的體系，它已被用在細(xì)胞和動(dòng)物中以通過(guò)增加或移除四環(huán)素或其類(lèi)似物可逆地誘導(dǎo)表達(dá)。另一個(gè)這種二元體系的實(shí)施例是噬菌體P1的cre/loxP重組酶體系。對(duì)于cre/loxP重組酶體系的描述可參見(jiàn)Lakso等人(1992)PNAS896232-6236。
另一類(lèi)啟動(dòng)子元件是那些響應(yīng)低含氧量的條件，活化可操作地連接的相關(guān)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子元件包括至少部分的被低含氧量誘導(dǎo)的因子-1調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子元件。缺氧響應(yīng)元件包括，但不限于，促紅細(xì)胞生成素缺氧響應(yīng)增強(qiáng)子元件(HREE1)、肌丙酮酸致活酶HRE；β-烯醇酶HRE；和內(nèi)皮素-1 HRE元件、以及包含這些序列的嵌合核苷酸序列。參見(jiàn)Bunn和Poynton(1996)Physiol.Rev.76839-885；Dachs和Stratford(1996)Br.J.Cancer 74S126-S132；Guillemon和Krasnow(1997)Cell 899-12；Firth等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.916496-6500；Jiang等人(1997)Cancer Res.575328-5335；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,834,306)。
除了促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的控制區(qū)域之外，表達(dá)載體還包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，例如阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)和增強(qiáng)子。實(shí)施例包括SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子、多瘤病毒增強(qiáng)子、腺病毒增強(qiáng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR增強(qiáng)子。
適當(dāng)條件下，本發(fā)明的PKCα核苷酸序列和任何額外的核苷酸序列(s)都可以在轉(zhuǎn)化動(dòng)物中被最優(yōu)化以增加表達(dá)。即，這些核苷酸序列能使用物種優(yōu)選的密碼子而被合成以改善表達(dá)，例如小鼠優(yōu)選的密碼子用以改善小鼠中的表達(dá)。本領(lǐng)域有方法可用于合成物種優(yōu)選的核苷酸序列。參見(jiàn)Wada等人(1992)Nucleic Acids Res.20(Suppl.)，2111-2118；Butkus等人(1998)Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl.25S28-33；和Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.
已知額外的序列改變能增強(qiáng)細(xì)胞宿主的基因表達(dá)。這些序列改變包括對(duì)編碼假多聚腺苷酸信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子結(jié)合位點(diǎn)信號(hào)、類(lèi)轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列、和其它對(duì)基因表達(dá)有害的特征明顯的序列的序列消除。異源核苷酸序列的G-C含量可以被調(diào)節(jié)到給定細(xì)胞宿主的平均水平，參照宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算。如果可能，序列被改變以避免預(yù)測(cè)的mRNA發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)。
在那些期望有異源PKCα核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)施例中，該產(chǎn)物直接到具體的細(xì)胞器中，尤其是線(xiàn)粒體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中；或分泌到細(xì)胞表面或細(xì)胞外；表達(dá)彈夾還可包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列。這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽為本領(lǐng)域的所熟知，并且包括，但不限于，用于?；d體蛋白、RUBISCO小亞基等的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
斷裂彈夾被用以打斷和/或移除來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞基因組的相關(guān)序列以產(chǎn)生“去除”、“刪除”、或“缺失”突變型。“目標(biāo)載體”和“斷裂彈夾”是指一種被分離的核酸分子，它包含一個(gè)5’側(cè)區(qū)、一個(gè)斷裂區(qū)、和一個(gè)3’側(cè)區(qū)。斷裂彈夾和它們的使用方法為本領(lǐng)域所熟知。參見(jiàn)Doetschman等人(1987)Nature 330576-578；Doetschman等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci 858583-87；Schwartz等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.8810416-20；Oliver等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.9414730-14735；Nagy等人Ed.(2003)Manipulating theMouse Embryo，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY。
報(bào)告基因或可選擇的標(biāo)記基因可以被包括在表達(dá)彈夾中。本領(lǐng)域所知的合適的報(bào)告基因的實(shí)施例可見(jiàn)于，例如，Ausubel等人(2002)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，NY。用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織選擇的可選擇的標(biāo)記基因可包括賦予抗生素抗性的基因。其它能在轉(zhuǎn)基因事件的恢復(fù)中發(fā)揮效用，但是可能不需要在最后的產(chǎn)品中的基因包括，但不限于，例如GUS(β-葡糖苷酸酶)、熒光蛋白(例如GFP)、CAT；和熒光素酶。
適用于將多核苷酸摻入宿主細(xì)胞的遞送載體包括，但不限于，病毒載體和非病毒載體(Verma和Somia(1997)Nature 389239-242)。
遞送多核苷酸的多種非病毒載體為本領(lǐng)域所熟知并且被包括在本發(fā)明中。分離的核酸分子能以裸DNA(WO 97/40163)的形式被遞送到細(xì)胞中。可供選擇地，多核苷酸能和多種物質(zhì)(遞送形式)一起被遞送到通過(guò)多種途徑聯(lián)系的細(xì)胞中，這些物質(zhì)包括，但不限于，陽(yáng)離子類(lèi)脂；生物適合性聚合物，包括天然的和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人造病毒包膜；金屬顆粒；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和細(xì)菌。遞送載體可以是微粒。這些不同物質(zhì)的混合物或組合物也能被用作遞送載體。多核苷酸能與這些遞送形式非共價(jià)的或共價(jià)的連接。脂質(zhì)體能被用于一種具體的細(xì)胞型，例如用于心肌細(xì)胞。
病毒載體包括，但不限于，DNA病毒載體例如那些基于腺病毒、單純皰疹病毒、痘病毒如牛痘病毒、和細(xì)小病毒包括腺伴隨病毒的病毒載體；和RNA病毒載體，包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括鼠白血病病毒和慢病毒，例如人免疫缺陷病毒。參見(jiàn)Naldini等人(1996)Science 272263-267。
包含一種多核苷酸的非病毒遞送載體可以通過(guò)本領(lǐng)域所知的任何合適的方法被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞和/或靶細(xì)胞，例如通過(guò)磷酸鈣共沉技術(shù)轉(zhuǎn)染；電穿孔；電滲透；脂質(zhì)體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染；彈道轉(zhuǎn)染；基因槍法包括微粒轟擊、射流噴射、和針與注射器注射、或通過(guò)顯微注射。轉(zhuǎn)染的多種方法為技術(shù)人員所熟知。
病毒遞送載體能通過(guò)感染被引入細(xì)胞?？晒┻x擇地，病毒載體能被摻入任何上述的非病毒遞送載體以遞送進(jìn)細(xì)胞。例如，病毒載體能與陽(yáng)離子類(lèi)脂(Hodgson和Solaiman(1996)Nature Biotechnol.14339-342)混和；或與層狀脂質(zhì)體(Wilson等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.743471-3475；和Faller等人(1984)J.Virol.49269-272)混和。
對(duì)于體內(nèi)遞送，載體能通過(guò)技術(shù)人員所知的任何方法被引入個(gè)體或生物體。
任何用于表達(dá)載體的調(diào)節(jié)的或其它的序列能組成轉(zhuǎn)基因序列的一部分。這包括內(nèi)含子序列和多聚腺苷酸信號(hào)，假如它們還未被包括進(jìn)去。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是已受精的卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，它們能被用于產(chǎn)生包含至少一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的表達(dá)彈夾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該表達(dá)彈夾包含相關(guān)的核苷酸序列。可供選擇地，宿主細(xì)胞可以是干細(xì)胞或其它早期組織前體細(xì)胞，該細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具體的細(xì)胞子集并能被用于在動(dòng)物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因組織。也參見(jiàn)Thomas等人，(1987)Cell 51503對(duì)同源重組載體的描述。載體被引入胚胎干細(xì)胞系(例如通過(guò)電穿孔)，并且其中所引入的基因與基因組發(fā)生重組的細(xì)胞被選擇(參見(jiàn)例如，Li，E.等人(1992)Cell 69915)。被選擇的細(xì)胞然后被注入動(dòng)物(例如小鼠)的胚泡中以形成聚合嵌合體(參見(jiàn)例如Bradley，A.in Teratocarcinomasand Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，編輯(IRL，Oxford，1987)，第113至152頁(yè))。然后嵌合胚胎能被植入合適的假孕雌性培養(yǎng)動(dòng)物體內(nèi)并培育到末期。在其生殖細(xì)胞中具有重組DNA的后代能通過(guò)轉(zhuǎn)基因的種系傳遞被用于繁殖所有細(xì)胞痘包含重組DNA的動(dòng)物。構(gòu)建同源重組載體和同源重組動(dòng)物的方法還被描述在Bradley，A.(1991)Current Oinion in Biotechnology 2823-829和PCT WO90/11354；WO 91/01140；和WO 93/04169中。
經(jīng)由胚胎操縱和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，尤其是象小鼠這樣的動(dòng)物，在本領(lǐng)域中已經(jīng)變得常規(guī)，并且被描述在，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,736,866；4,870,009；4,873,191；6,201,165和Nagy等人Ed.(2003)Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本文所述的非人類(lèi)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆也能依照下述的方法產(chǎn)生Wilmut等人(1997)Nature 385810-813和PCT WO 97/07668和WO97/07669。簡(jiǎn)而言之，來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞(例如體細(xì)胞)能被分離并誘導(dǎo)退出生長(zhǎng)周期，進(jìn)入Go階段。然后通過(guò)使用例如電脈沖這樣的方法，靜止細(xì)胞能被融合到去核的卵母細(xì)胞，該卵母細(xì)胞來(lái)自相同物種的動(dòng)物，從該動(dòng)物中分離出所述靜止細(xì)胞。再構(gòu)建的卵母細(xì)胞然后被培養(yǎng)以使得它發(fā)育成桑椹胚或胚泡，并且隨后轉(zhuǎn)到假孕雌性培養(yǎng)動(dòng)物體內(nèi)。雌性培養(yǎng)動(dòng)物的后代將是所述動(dòng)物的克隆，細(xì)胞，例如體細(xì)胞，從所述動(dòng)物中分離。
其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)施例包括非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、綿羊、狗、豬、豚鼠、倉(cāng)鼠、母牛、山羊、兔子和大鼠。提供轉(zhuǎn)基因兔子的方法被描述在Marian等人(1999)J.Clin.Invest.1041683-1692和James等人(2000)Circulation 1011715-1721。
“PKCα活性”是指由本文所述的野生型PKCα顯示具有的任何活性。這些活性包括，但不限于，致活酶活性、活化的C致活酶(RACK)受體的結(jié)合活性、表達(dá)、從胞質(zhì)部分到顆粒部分的移位、和到肌膜的移位。PKCα活性的調(diào)節(jié)包括但不限于調(diào)節(jié)以下PKCα活性致活酶活性、RACK結(jié)合、或調(diào)節(jié)PKCα表達(dá)水平或細(xì)胞分布。
分析致活酶活性的方法為本領(lǐng)域所熟知，這些方法包括，但不限于，使用磷酸化肽的抗體的免疫沉淀反應(yīng)；熒光偏振；使用放射性同位素的過(guò)濾結(jié)合分析法、閃爍鄰近測(cè)定法、使用結(jié)合抗體的96孔分析法；時(shí)間分辨熒光分析法、薄層色譜法；免疫沉淀和免疫復(fù)合物分析法；非三氯乙酸磷酸化氨基酸測(cè)定法；和蛋白致活酶分析法。參見(jiàn)Braz等人(2002)J.Cell Biol.156905-919；Ping等人(1999)Am.J.Physiol.276H1468-H1481；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0030036106；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5447860；Walker，John編輯(2002)Protein Protocols on CD-ROM v.2；和Ausubel等人編輯(1995)Current Protocols in MolecularBiology，(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。
分析PKCα結(jié)合RACK的方法為本領(lǐng)域所熟知，這些方法包括，但不限于，ELISA、蛋白交互式誘捕、X-射線(xiàn)晶體學(xué)、NMR、超速離心法、免疫沉淀反應(yīng)、共免疫沉淀反應(yīng)、交聯(lián)、酵母雙雜交分析法、親和色譜法。實(shí)施例參見(jiàn)Mochly-Rosen(1995)Biochem Soc.Trans.23(3)596-600；Walker，John編輯(2002)Protein Protocols on CD-ROM v.2；和Ausubel等人編輯(1995)Current Protocols in Molecular Biology，(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。
本發(fā)明提供檢測(cè)PKCα指示多肽移位的方法?！爸甘径嚯摹笔侵溉魏芜m用于檢測(cè)亞細(xì)胞位置的多肽。適合的指示多肽包括包含上文所述的報(bào)告基因的融合多肽，例如，但不限于，熒光蛋白(例如GFP)、β-半乳糖苷酶、c-jun、c-myc；親和多肽標(biāo)簽(例如His標(biāo)簽)、放射標(biāo)記的多肽、生物素標(biāo)記的多肽、抗原標(biāo)記的多肽和染料標(biāo)記的多肽。合適的指示多肽包括相關(guān)多肽特異性的抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種改變動(dòng)物的PKCα表達(dá)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，PKCα的表達(dá)在整個(gè)動(dòng)物中被調(diào)節(jié)(例如斷裂突變型)。在一個(gè)實(shí)施方案中PKCα表達(dá)以一種心臟優(yōu)選的方式被調(diào)節(jié)?！靶呐K優(yōu)選的”是指異源PKCα的表達(dá)在心臟組織中是最豐富的，然而一些表達(dá)可能在其它類(lèi)型的組織中發(fā)生，尤其是在與心臟組織發(fā)育相關(guān)的組織中。
測(cè)定表達(dá)水平的方法為本領(lǐng)域所熟知，這些方法包括，但不限于，定量Western blot分析、免疫沉淀反應(yīng)、放射性分析法、多肽純化、分光光度分析、丙烯酰胺凝膠的考瑪斯染色、ELISA、RT-PCR、2-D凝膠電泳、微陣列分析、原位雜交、化學(xué)發(fā)光法、銀染、酶分析法、麗春紅S染色、多重RT-PCR、免疫組織化學(xué)分析法、放射性免疫測(cè)定、比色分析、免疫放射分析法、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)、Northern blotting、熒光測(cè)定分析法和SAG。參見(jiàn)例如Ausubel等人編輯(2002)CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley-Interscience，New York，New York；Coligan等人(2002)Current Protocols in ProteinScience，Wiley-Interscience，New York，New York；和Sun等人(2001)Gene Ther.81572-1579。
據(jù)認(rèn)定，PKCα核苷酸序列可以與它們的原啟動(dòng)子一起使用以增加或減少由轉(zhuǎn)化動(dòng)物心臟組織中顯型的改變引起的表達(dá)。
顯示具有改變的心臟優(yōu)選的PKCα表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被用于進(jìn)行鑒定化合物的分析，該化合物影響心臟的功能，例如，但不限于心肌收縮能力。測(cè)定心肌收縮能力的分析方法為本領(lǐng)域所熟知，這些方法包括，但不限于，縮短分析法、峰縮短、到峰值時(shí)間、到最大松弛時(shí)間、收縮和松弛率分析法、心臟變時(shí)作用改變、心臟變松作用改變、和總心臟收縮分析法。PKCα表達(dá)的改變的心臟優(yōu)選的表達(dá)可能導(dǎo)致對(duì)心肌病的易感性改變。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明通過(guò)急性調(diào)節(jié)心肌收縮能力的方法。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供急性調(diào)節(jié)心肌病的方法。急性的調(diào)節(jié)或改變?cè)谑┯肞KCα調(diào)節(jié)劑后1秒內(nèi)；10秒；30秒；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分鐘；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小時(shí)；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天開(kāi)始。調(diào)節(jié)持續(xù)時(shí)間的變化從短持續(xù)時(shí)間例如，但不限于，十億分之一秒、秒、和分鐘遞增；中間長(zhǎng)度的持續(xù)時(shí)間例如，但不限于，小時(shí)、天和周遞增；至長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間例如，但不限于，月和年遞增，最高達(dá)包括接受者的全部壽命。
在本發(fā)明的上下文中，“心肌收縮能力”或“心肌收縮性”被定義為心臟功能的量度，該心臟功能可包括，但不限于心輸出量、射血分?jǐn)?shù)、片段縮短、心臟作功、心指數(shù)、變時(shí)作用、變松作用、圓周纖維縮短的速率、做心律校正的圓周纖維縮短速率、每搏輸出量、心臟收縮或松弛率、心室內(nèi)壓力的極限值(最大dP/dt和最小dP/dt)、心室體積、心臟功能的臨床評(píng)估(例如應(yīng)力超聲心動(dòng)圖和跑步機(jī)步行)和這些參數(shù)的變型或正常型。這些參數(shù)可以在人類(lèi)或動(dòng)物中被測(cè)量，同樣用以評(píng)估心肌功能并幫助診斷和預(yù)后心臟病。
“心肌病””是任何失調(diào)或涉及心肌組織或心臟功能不良的情況涉及心肌組織的失調(diào)包括，但不限于，心肌疾病，包括但不限于擴(kuò)張性心肌病、肥大性心肌病、限制性心肌病、心肌頓抑和心肌炎；心力衰竭、急性心力衰竭；風(fēng)濕熱；橫紋肌瘤；肉瘤；先天性心臟病，包括但不限于，左至右轉(zhuǎn)流晚型發(fā)紺，例如心房間隔缺損、心室間隔缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉和房室隔缺損，右至左轉(zhuǎn)流早型發(fā)紺，例如法洛氏四聯(lián)癥、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、動(dòng)脈干、三尖瓣閉鎖、和肺靜脈完全回流異常、阻塞性先天性異常，例如主動(dòng)脈縮窄、肺動(dòng)脈瓣狹窄和閉鎖、和主動(dòng)脈縮窄和閉鎖；涉及心臟移植的失調(diào)；動(dòng)脈高血壓；圍生期心肌病；酒精性心肌?。恍膭?dòng)過(guò)速；上心室性心動(dòng)過(guò)速；心搏徐緩；心房撲動(dòng)；胎兒水腫；心律不齊；期外收縮的心律不齊；胎兒心臟心律不齊；心內(nèi)膜炎；心房顫動(dòng)；先天擴(kuò)張性心肌病；Chagas′心臟??；長(zhǎng)QT綜合癥；Brugada綜合癥；缺血；氧不足；心室顫動(dòng)；心室過(guò)速；再狹窄；充血性心力衰竭；暈厥；心律不整；心包疾病；心肌梗塞；不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定型心絞痛；和心絞痛，病毒性心肌炎；和涉及心肌組織的非增殖細(xì)胞失調(diào)。
“改變的易感性”是指本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯示具有心肌病顯型的程度不同于非轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。心肌病顯型可存在于發(fā)育的任何階段，包括，但不限于，胚胎期的、出生后的、成年的、和接近動(dòng)物壽命末期的。在一個(gè)實(shí)施方案中，心肌病顯型可被外部刺激誘導(dǎo)，例如，但不限于，飲食、鍛煉、化學(xué)處理、或外科手術(shù)程序。
心肌病顯型包括，但不限于，肥大；形態(tài)，例如室間間隔肥大；左心室末端心臟收縮最大dP/dt或末端心臟舒張尺寸(τ)；乳頭肌尺寸；左心室流出道阻塞；中心室肥大；心尖部肥大；不對(duì)稱(chēng)肥大；同心擴(kuò)大的心室質(zhì)量；偏心擴(kuò)大的心室質(zhì)量；肌小節(jié)結(jié)構(gòu)；肌原纖維功能；受體表達(dá)；心率；心室收縮壓；心室舒張壓；主動(dòng)脈舒張壓；收縮性；間質(zhì)纖維化；心肌細(xì)胞混亂；Ca2+敏感性；Ca2+釋放；Ca2+攝?。粌翰璺用舾行?；α-腎上腺素敏感性；β-腎上腺素敏感性；多巴酚丁胺敏感性；甲狀腺素敏感性；血管緊縮素轉(zhuǎn)換加工酶抑制劑敏感性；胺碘酮敏感性；利多卡因敏感性；糖蛋白受體拮抗劑敏感性；合成代謝類(lèi)固醇敏感性；肉毒堿傳送不規(guī)則；左心室擴(kuò)張，減少的左心室射血分?jǐn)?shù)；左心房擴(kuò)張；利尿劑敏感性；血管容積；缺血；白細(xì)胞流體性質(zhì)；多形核白細(xì)胞(PMN)膜流動(dòng)性；PMN胞質(zhì)Ca2+含量；高心室間隔缺損，玫瑰花結(jié)抑制效果；收縮力傳送；心肌纖維混亂；增加的室硬度；減弱的松弛；小血管疾??；呼吸困難；心絞痛；前暈厥；心動(dòng)過(guò)速；暈厥；昏睡；呼吸窘迫；褶皺毛發(fā)；背部拱起姿勢(shì)；周邊水腫；腹水；肝腫大；肺水腫；心臟擴(kuò)大癥；組織血栓形成；心重/體重比率；壓力發(fā)展比率、壓力失效比率、細(xì)胞收縮測(cè)量等等。參見(jiàn)例如Braunwald等人(2002)Circulation 1061312-1316；Wigle等人(1995)Circulation 921680-1692；和Pi & Walker(2000)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol 279H26-H34；因此全文引入本文以供參考。
測(cè)量心肌病顯型的方法為本領(lǐng)域所熟知，這些方法包括，但不限于，經(jīng)胸壁對(duì)比超聲心動(dòng)圖、經(jīng)食管超聲心動(dòng)圖、斷裂測(cè)試、尿/兒茶酚氨分析、EIA、光學(xué)顯微鏡法、心臟導(dǎo)管插入術(shù)、動(dòng)態(tài)心電圖、Langendorff離體心臟制備、工作心臟制備、MRI、多重RT-PCR、正電子反射斷層攝影術(shù)、血管照像術(shù)、磁共振自旋回波、短軸位MRI掃描、多普勒速度記錄、多普勒彩色血流造影、應(yīng)力鉈研究、心臟超聲、胸X-射線(xiàn)、氧消耗測(cè)試、電生理學(xué)研究、聽(tīng)診、掃描EM、重量分析法、蘇木精和曙紅染色、皮膚纖維分析、透射電子顯微鏡、免疫熒光分析、三色染色、Masson三色染色、Von Kossa染色、2-D超聲心動(dòng)圖、宮縮描記圖、基線(xiàn)M-型超聲心動(dòng)圖、和心肌乳酸鹽產(chǎn)生分析法。參見(jiàn)例如Braz等人(2002)J.Cell.Biol.156905-919；Braunwald等人(2002)Circulation1061312-1316；Sohal等人(2001)Circulation Res.8920-25；Nagueh等人(2000)Circulation 1021346-1350；Sanbe等人(2001)J.Biol.Chem.27632682-32686；Sanbe等人(1999)J.Biol.Chem.27421085-21094；Wigle等人(1995)Circulation 921680-1692；Pi& Walker(2000)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol 279H26-H34；和Wang等人(2001)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.269H90-H98，因此全文引入本文以供參考。
本文所用術(shù)語(yǔ)“治療”是指，在狹義上，使用本發(fā)明化合物可減輕存在于宿主內(nèi)、優(yōu)選存在于哺乳動(dòng)物個(gè)體內(nèi)、更優(yōu)選存在于人體內(nèi)的疾病或失調(diào)。因此，術(shù)語(yǔ)“治療”包括預(yù)防宿主內(nèi)感染性疾病的發(fā)生，尤其是當(dāng)宿主傾向于患有該疾病但尚未診斷出該疾病時(shí)；抑制感染性疾??；和/或緩和或減輕感染性疾病。在將本發(fā)明方法用于預(yù)防失調(diào)的情況下，應(yīng)當(dāng)理解的是，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”不需完全抑制病狀。(參見(jiàn)Webster的NinthCollegiate Dictionary。)相反，本文所用術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別易感染疾病群體的能力，這樣就可在疾病開(kāi)始發(fā)作之前，使用本發(fā)明化合物。該術(shù)語(yǔ)并不意味著可完全避免病狀。
用于治療減弱的心臟收縮和松弛的PKCα抑制劑可以用已知的方法鑒定。PKCα抑制劑可以通過(guò)評(píng)估PKCα酶活性來(lái)鑒定。這可以通過(guò)使用許多市售試劑盒完成。其中一些試劑盒使用“標(biāo)記的”底物，包括，但不限于，發(fā)光的、熒光的、放射性的或其它可測(cè)量的和可定量的終點(diǎn)?？晒┻x擇地，例如本發(fā)明中闡述的，PKCα蛋白本身可連接到一個(gè)可追蹤的標(biāo)記物，包括，但不限于，發(fā)光的、熒光的、放射性的離子或分子，以確定分離的或在細(xì)胞或組織內(nèi)的PKCα的分布與活性。因?yàn)镻KCα細(xì)胞中有許多已知的底物，通過(guò)測(cè)量PKCα細(xì)胞中底物的磷酸化或去磷酸化，PKCα活性可以被評(píng)估。通過(guò)使用標(biāo)記的或未標(biāo)記的磷酸化位點(diǎn)特異性抗體，發(fā)光的、熒光的、放射性的生物標(biāo)記或其它對(duì)比PKCα的底物評(píng)定其活性的方法，PKCα底物的磷酸化/去磷酸化狀態(tài)可以得到測(cè)量?？晒┻x擇地，底物的再分布也可用來(lái)測(cè)量它對(duì)PKCα活性變化的響應(yīng)。當(dāng)?shù)孜锸且粋€(gè)致活酶、磷酸酶或其它酶時(shí)，底物的活性可以通過(guò)使用已確立的技術(shù)來(lái)測(cè)量。
可以通過(guò)使用分離的細(xì)胞或已測(cè)定含有PKCα的分離的組織，完成對(duì)有心臟功能不良的人類(lèi)有益的PKCα抑制劑的鑒定。例如，PKCα抑制劑可以在來(lái)自哺乳動(dòng)物或其它機(jī)體的分離的細(xì)胞、優(yōu)選地心肌細(xì)胞中得到測(cè)試，PKCα抑制劑的作用可以通過(guò)測(cè)量細(xì)胞縮短百分比(％FS)來(lái)確定縮短或重新伸長(zhǎng)的比率(±dL/dt)，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定。可供選擇地，肌，優(yōu)選心臟來(lái)源的肌，可被分離，并且收縮功能評(píng)定可在有或沒(méi)有PKCα抑制劑的情況下得到測(cè)量，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定。如本發(fā)明中概括的，可以通過(guò)測(cè)量急性血液動(dòng)力，包括心率、血壓、收縮率和松弛率(+dP/dt和-dP/dt)、左心室壓，以及這些參數(shù)的衍生，鑒定PKCα抑制劑?？梢酝ㄟ^(guò)這些方法鑒定合適的正常動(dòng)物，包括，但不限于，小鼠的多種遺傳品系、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、人、兔子、狗、豬、山羊、母牛、猴子、黑猩猩、綿羊、倉(cāng)鼠及斑馬魚(yú)的PKCα抑制劑。通過(guò)這些方法鑒定合適的心力衰竭或心臟功能不良的動(dòng)物模型的PKCα抑制劑，包括，但不限于，轉(zhuǎn)基因或去除基因小鼠的多種遺傳品系，例如MLP(-/-)KO小鼠，1型絲氨酸或蘇氨酸磷酸酶過(guò)表達(dá)小鼠(PP1c)和PKCα過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。此外，因?yàn)檫z傳或多重遺傳缺陷而產(chǎn)生心力衰竭及心臟功能不良的自發(fā)的或天然的模型包括，但不限于，自發(fā)的高血壓心力衰竭大鼠或Dahl鹽敏感大鼠，它們的PKCα抑制劑可以得到鑒定。另外，心臟功能不良外科手術(shù)誘導(dǎo)模型包括，但不限于，心肌梗塞模型、冠狀微栓子模型、主動(dòng)脈收縮模型、動(dòng)靜脈瘺模型或其它大鼠、豚鼠、兔子、狗、豬、山羊、母牛、猴子、黑猩猩、綿羊、倉(cāng)鼠及斑馬魚(yú)的壓力或容積超負(fù)荷模型，它們的PKCα抑制劑可以被鑒定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、組織或細(xì)胞可以被用來(lái)鑒定PKCα調(diào)節(jié)化合物?！癙KCα調(diào)節(jié)化合物”是調(diào)節(jié)PKCα活性的化合物。PKCα調(diào)節(jié)化合物包括，但不限于，甘油二酯、磷脂酰絲氨酸、Ca++；PMA、CGP54345、雙吲哚亞醯銨、AAP10、星形孢菌素、H-7(SigmaCo.)、二氮嗪、DiC8、花生四烯酸、G-6976(PKC及包括PKCα)、CGP54345、HBDDE(也叫PKCγ)和Ro-32-0432(也叫PKCβ)。檢測(cè)分析PKCα活性的方法在本文的別處描述。本領(lǐng)域-已知的任何檢測(cè)分析PKCα活性的方法都可以用來(lái)監(jiān)控相關(guān)化合物對(duì)本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的作用。
PKCα抑制劑包括，但不限于，致活酶抑制劑、蛋白致活酶C抑制劑和PKCα特異性抑制劑。“致活酶抑制劑”是指抑制多種致活酶包括PKCα在內(nèi)的化合物?！暗鞍字禄蠲窩抑制劑”是指一種優(yōu)選抑制蛋白致活酶C活性的化合物，與它對(duì)其它致活酶的作用相比較?！癙KCα特異性抑制劑”是指一種與其降低另外一種致活酶活性相比能更多的降低PKCα活性的化合物，其它的致活酶包括其它蛋白致活酶C的同工酶。已知的PKCα抑制劑包括，但不限于，具有反義核苷酸序列和反義分子的核酸分子，市售于Isis Pharmaceuticals，和顯性負(fù)突變型的PKC，例如賴(lài)氨酸368精氨酸突變型(Braz等人(2002)J.Cell.Biol.156905-919)。
補(bǔ)充到用于PKCα核苷酸序列的信使RNA(mRNA)的至少一個(gè)部分的反義構(gòu)造可以被構(gòu)建。反義核苷酸被構(gòu)建以與相應(yīng)的mRNA雜交。一旦序列雜交到并且干擾了相應(yīng)mRNA的表達(dá)，反義序列可以被改變。用這種方法，可以使用對(duì)相應(yīng)的反義序列具有至少約70％，優(yōu)選地至少約80％，更優(yōu)選地至少約85％的序列同一性的反義構(gòu)造。此外，反義核苷酸的部分可以被用于中斷目標(biāo)基因的表達(dá)。通常使用有至少50個(gè)核苷酸，100個(gè)核苷酸，200個(gè)核苷酸或更多核苷酸的序列。因此，反義DNA序列可以被可操作的連接到心臟組織優(yōu)選的啟動(dòng)子上以減少或抑制心臟組織中天然蛋白質(zhì)的表達(dá)。
除了反義技術(shù)之外，基因表達(dá)還能通過(guò)雙鏈RNA進(jìn)行抑制，雙鏈RNA包括短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)、干涉RNA(RNAi)、短末端RNA(stRNA)、mikroRNA(miRNA)或短干涉RNA(siRNA)。這些RNA干涉方法能使用不同大小的RNA，但是通常限于15至28個(gè)核苷酸，并且以目前仍不清楚的基質(zhì)發(fā)揮功能。這個(gè)技術(shù)已經(jīng)被成功的作為抑制基因功能的方法在體外和體內(nèi)使用。
評(píng)估增加的收縮性和心力衰竭進(jìn)展的標(biāo)準(zhǔn)包括，但不限于，β-受體數(shù)、β-受體耦連、腺苷酸環(huán)化酶活性、靜態(tài)cAMP水平、施用福司可林后的cAMP水平、PKA活性、PKA蛋白水平、L-型鈣通道電流密度、SERCA2a蛋白水平、和受磷蛋白mRNA水平或蛋白質(zhì)的受磷蛋白磷酸化。
根據(jù)本發(fā)明的鑒定可被篩選的化合物包括但不限于已知的化合物庫(kù)，包括天然產(chǎn)物，例如植物或動(dòng)物提取物、合成化學(xué)制劑、生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、肽，例如可溶解的肽，包括但不限于隨機(jī)肽庫(kù)的組分、和由D-或L-構(gòu)型氨基酸組成的組合化學(xué)衍生的分子庫(kù)、磷酸肽(包括但不限于隨機(jī)的或部分簡(jiǎn)并的定向磷酸肽庫(kù)的組分)、抗體(包括但不限于多克隆的、單克隆、嵌合的、人的、抗獨(dú)特型或單鏈的抗體，和Fab、F(ab′)2和Fab表達(dá)庫(kù)片段，及其結(jié)合表位的片段)、有機(jī)的和無(wú)機(jī)的分子。
除了測(cè)試化合物的較多傳統(tǒng)來(lái)源外，計(jì)算機(jī)模擬和查詢(xún)技術(shù)容許利用來(lái)自本發(fā)明蛋白質(zhì)的配體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)信息來(lái)合理搜索測(cè)試化合物。對(duì)于測(cè)試化合物的這些合理搜索可降低為候選治療化合物必須篩選的試驗(yàn)化合物的數(shù)目。了解本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列有助于產(chǎn)生結(jié)合位點(diǎn)模型，用于篩選可能的配體。這個(gè)過(guò)程可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方式來(lái)完成。優(yōu)選的方法包括產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列與模板(衍生自相似蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)或基于NMR的模型)的序列對(duì)比、氨基酸結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化和通過(guò)分子力學(xué)和表觀(guān)鑒定來(lái)改進(jìn)模型。如果不能得到強(qiáng)序列對(duì)比，那么通過(guò)建立疏水螺旋模型也可產(chǎn)生模型。指向殘余物-殘余物接觸的突變數(shù)據(jù)也可用于定位彼此相對(duì)的螺旋，以便實(shí)現(xiàn)這些接觸。在這個(gè)過(guò)程中，通過(guò)利用穩(wěn)定配體結(jié)合的相互作用，將已知的配體對(duì)接至在螺旋內(nèi)的結(jié)合部位空穴也有助于定位該螺旋。此模型可以通過(guò)使用分子力學(xué)進(jìn)行精化和使用標(biāo)準(zhǔn)同源建模技術(shù)進(jìn)行套環(huán)構(gòu)建來(lái)完成。關(guān)于模擬的一般信息參見(jiàn)Schoneberg，T.等人，Molecularand Cellular Endocrinology，151181-193(1999)、Flower，D.，Biochimica et Biophysica Acta，1422207-234(1999)和Sexton，P.M.，Current Opinion in Drug Discovery and Development，2(5)2(5)440-448(1999)。
一旦模型被完成，它可以與幾個(gè)現(xiàn)有計(jì)算機(jī)程序的其中一個(gè)一起被用于減少需被篩選的化合物的數(shù)目，這些化合物使用本發(fā)明的方法進(jìn)行篩選，象DOCK程序(UCSF Molecular Design Institute，533 ParnassusAve，U-64，Box 0446，San Francisco，California 94143-0446)。在它的幾個(gè)改進(jìn)程序中，可以篩選商用的和/或?qū)＠幕衔锏臄?shù)據(jù)庫(kù)，用于對(duì)結(jié)合部位進(jìn)行空間擬合和粗糙的靜電力互補(bǔ)?？墒褂玫牧硪粋€(gè)程序是FLEXX(Tripos Inc.，1699 South Hanley Rd.，St.Louis，MO)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“可藥用的載體”是指包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌的和抗真菌的試劑、等張的和吸收延遲的試劑等，相容于藥物的施用。藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)與試劑的使用為本領(lǐng)域所熟知。除了任何常規(guī)的介質(zhì)與試劑是與活性化合物不相容的，這種介質(zhì)可以在本發(fā)明的組合物中使用。輔助的活性化合物也可被摻入組合物。本發(fā)明的藥學(xué)組合物被配制為與其預(yù)期的給藥途徑相容。給藥途徑的實(shí)施例包括腸胃外給藥，例如，靜脈注射、皮層內(nèi)注射、皮下注射、口服(例如，吸入)、透皮注射(局部用藥)、經(jīng)粘膜給藥和直腸給藥。用于腸胃外給藥的溶液或懸浮液、皮層內(nèi)注射或皮下注射的應(yīng)用包括以下組分消毒的稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑例如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺酸；緩沖液例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽、和用來(lái)調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或右旋糖。pH可以用酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外給藥制備可以裝在一次用量的針劑內(nèi)、一次性的注射器或玻璃或塑料制的多重劑量小瓶中。
適于注射的藥用組合物包括無(wú)菌的水溶液(水溶性的)或分散體，和用以無(wú)菌可注射溶液或分散體臨時(shí)制備的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈注射，合適載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有這些例子中，組合物必需無(wú)菌并且其必須是易于以針劑形式存在的流體。在制造和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定并且儲(chǔ)存必須避免被微生物污染，例如細(xì)菌和真菌。載體可以是溶劑或包含分散體的介質(zhì)，例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、以及它們的合適的混合物。合適的流動(dòng)性可以通過(guò)使用包衣例如卵磷脂、在分散體中維持所需的粒度和使用表面活性劑來(lái)維持。可以通過(guò)多種抗菌的和抗真菌的試劑來(lái)預(yù)防微生物，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等等。在許多情況下，優(yōu)選將等張?jiān)噭┌ㄟM(jìn)組合物，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨醇和氯化鈉。注射組合物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)將能延遲吸收的試劑，例如鋁一硬脂酸鹽和明膠，包括進(jìn)入組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
無(wú)菌注射溶液可以通過(guò)將所需的量的活性化合物(例如羧肽酶蛋白或抗羧肽酶抗體)摻入到合適的溶劑中，如必需的話(huà)可與上文列舉的成分的一種或組合一起摻入，接著通過(guò)過(guò)濾除菌來(lái)制備。通常分散體通過(guò)摻入活性化合物到包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上文列舉的那些所需的其它成分的無(wú)菌載體中來(lái)制備。在用以制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末的例子中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，它們產(chǎn)生活性成分加上任何額外的所需成分的粉末，這些成分來(lái)自以前它們無(wú)菌過(guò)濾后的溶液。
口服組合物通常包括一種惰性稀釋劑或一種可食用的載體。它們能被包進(jìn)明膠膠囊或壓縮進(jìn)入片劑。為口服給藥，通過(guò)已知的方法試劑能被包被以腸衣的形式通過(guò)胃，或進(jìn)一步被包被或混和以被釋放在胃腸道的特定區(qū)域。為了達(dá)到口服治療劑的目的，活性化合物能被摻入賦形劑并以片劑、藥片或膠囊的形式使用。口服組合物也能使用流體載體制備，用作漱口水，其中流體載體中的化合物被口服給藥，漱口并吐出或咽下。藥物相容的結(jié)合劑和/或輔劑物質(zhì)能作為一部分被包括進(jìn)組合物。片劑、藥丸、膠囊、藥片等等能包含任何下述成分或具有相似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖、崩解劑如藻酸、Primogel(RTM)或谷物淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；助流劑如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷油、甲基水楊酸酯或橙味劑為了通過(guò)吸入給藥，化合物被以氣溶膠噴霧的形式遞送，氣溶膠噴霧來(lái)自加壓的容器或分配器，它們包含合適的推進(jìn)劑例如象二氧化碳這樣的氣體，或噴霧器。
系統(tǒng)的給藥也可以通過(guò)經(jīng)粘膜的或透皮注射的方法。為了經(jīng)粘膜的或透皮注射的給藥，對(duì)想要滲透通過(guò)的障礙適用的滲透劑被用于制劑中。這些滲透劑是本領(lǐng)域通常已知的，并且包括，例如為經(jīng)粘膜的給藥，洗滌劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜的給藥可以通過(guò)使用鼻噴劑或栓劑被成功完成。為了透皮注射的給藥，活性化合物被配制成本領(lǐng)域通常已知的油膏劑、藥膏、凝膠或霜膏。
化合物也能以栓劑(例如用常規(guī)栓劑基質(zhì)如椰子油和其它甘油酯)或用于直腸遞送的保留灌腸的形式制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物和載體一起被制備，載體將保護(hù)化合物不被身體迅速的消除，例如一種受控的釋放制劑，包括灌輸和微膠囊化的遞送體系。能使用可生物講解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。材料也能從Alza Corporation and NovaPharmaceuticals，Inc.購(gòu)得。脂質(zhì)體懸浮液(包括和病毒抗原單克隆抗體一起用于感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也能被用作可藥用的載體。這些能依照本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的方法被制備，例如，描述在美國(guó)專(zhuān)利4,522,811。
尤其有利的是以劑量單位的形式配制口服的或腸胃外給藥的組合物，易于給藥和同一化劑量。本文所用的“劑量單位形式”是指適用作被治療的個(gè)體一體劑量的物理離散單元，每個(gè)單位包含與所需藥物載體聯(lián)合使用，產(chǎn)生所需治療效果計(jì)算的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格被指示自并直接取決于活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和想要獲得的具體治療效果，以及本領(lǐng)域組合這樣一種用于個(gè)體治療的活性化合物所受的內(nèi)在限制。
本發(fā)明的方法鑒定的抗心肌病的化合物可以被用于人類(lèi)的治療。
方法實(shí)施例1.轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生PKCα基因通過(guò)胚胎干細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)同源重組產(chǎn)生刪除，接著產(chǎn)生嵌合小鼠，它被培養(yǎng)并傳遞目標(biāo)等位基因進(jìn)入種系。編碼PKCα中ATP結(jié)合彈夾的外顯子被刪除，導(dǎo)致缺失與蛋白表達(dá)相關(guān)的等位基因。為了產(chǎn)生PKCα過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，編碼PKCα的cDNA被亞克隆進(jìn)入包含鼠α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子的表達(dá)載體并注入新的已受精的卵母細(xì)胞。MLP、PP1c和壓力超負(fù)荷的外科手術(shù)模型(TAC)都在其它文獻(xiàn)中被描述(Arber等人(1997)Cell 88393-403；Carr等人(2002)Mol.Cell.Biol.224124-4135；和Liang等人(2003)EMBO.J.225079-5089)。雄性小鼠被專(zhuān)用于所有研究中以保持一致性。所有的動(dòng)物試驗(yàn)被Institutional Animal Care and Use Committee批準(zhǔn)。
實(shí)施例2.超聲心動(dòng)圖分析來(lái)自所有基因型或處理組的小鼠被異氟烷麻醉，并且超聲心動(dòng)圖使用一臺(tái)Hewlett Packard 5500儀器和一個(gè)15-MHZ的微探針進(jìn)行。每組四只單獨(dú)的小鼠在M-模式進(jìn)行三次超聲心動(dòng)圖測(cè)量。本研究中使用的離體小鼠心臟的制備以前被詳細(xì)的描述過(guò)(Gulick等人(1997)Circ.Res.80655-664)，本文所用的閉胸工作心臟模型也是如此(Lorenz等人(1997)Am.J.Physiol.272H1137-H1146)。
實(shí)施例3.組織學(xué)肥大標(biāo)記基因分析心臟在指示的時(shí)間被采集，固定在10％包含PBS的福爾馬林中，內(nèi)部植入石蠟。來(lái)自每一組的連續(xù)的5-μm心臟切片被分析。樣品用蘇木精和曙紅或Masson三色染色法染色。如以前所述，肥大分子標(biāo)記的心臟基因表達(dá)通過(guò)RNA點(diǎn)雜交分析進(jìn)行評(píng)估(Jones等人(1996)J.Clin.Invest 981906-1917)。
實(shí)施例4.腺病毒感染后單個(gè)成年大鼠心肌細(xì)胞的收縮性心室肌細(xì)胞被分離自Sprague-Dawley大鼠的心臟(Westfall等人，(1997 Methods Cell Biology 52307-322)，并置于層粘連蛋白涂敷的蓋玻片上，浸于有5％血清的DMEM中2小時(shí)。介質(zhì)然后被無(wú)血清的包含一個(gè)重組病毒載體的DMEM置換。無(wú)血清的DMEM 1小時(shí)后被加入，介質(zhì)每2天更換一次。約70％至85％的分離細(xì)胞是桿狀的，每個(gè)心臟中有1-2×106桿狀肌細(xì)胞。用于縮短分析的肌細(xì)胞在補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素、10mM N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(Hepes)、0.2mg/mL白蛋白、和10mM谷胱甘肽的介質(zhì)199中被電刺激(Westfall and Borton，(2003)J.Biol.Chem.27833694-33700)。肌細(xì)胞在放置1天后被用鉑電極轉(zhuǎn)移到刺激室中，并在使＜25％的肌細(xì)胞產(chǎn)生收縮的電壓下，以0.2Hz和2.5ms的脈沖被刺激。刺激室中的介質(zhì)每12小時(shí)被置換。對(duì)收縮性功能研究，蓋玻片被安裝在溫控的室中，室中包含用于肌小節(jié)縮短測(cè)量的M199。肌小節(jié)長(zhǎng)度經(jīng)由可變場(chǎng)率CCD攝影機(jī)(Ionoptix；Milton，MA)測(cè)量，并用肌小節(jié)長(zhǎng)度檢測(cè)軟件記錄。肌細(xì)胞以0.2Hz的頻率被刺激，并記錄60秒的肌小節(jié)縮短。峰縮短、到峰值時(shí)間、到最大松弛一半的時(shí)間和收縮與松弛率來(lái)自10次收縮的信號(hào)平均。來(lái)自這些研究的結(jié)果通過(guò)單因素方差分析和事后Newman-Keuls測(cè)試被比較。
實(shí)施例5.電生理學(xué)記錄。
心肌細(xì)胞分離自3個(gè)月大小的野生型或非轉(zhuǎn)基因(Ntg)和PKCα-KO小鼠，電生理學(xué)記錄如前所述的方法進(jìn)行(Petrashevskaya等人(2002)Cardiovasc.Res.54117-132和Masaki等人(1997)Am.J.Physiol.272H606-H612)。簡(jiǎn)而言之，心臟使用無(wú)Ca2+的Tyrode溶液經(jīng)受逆行冠狀動(dòng)脈灌注10分鐘，并使用包含膠原酶II型(Worthington；1.0mg/ml)、5mM?；撬岷?0mM BDM(2，3-丁二酮單肟)的Tyrode溶液(250μM Ca2+)在37℃下灌注8至12分鐘，用95％O2和5％CO2起泡。在灌注的結(jié)尾心臟被移除，心室組織在低Cl-、高K+-KB介質(zhì)中被機(jī)械切碎。然后切碎的心室組織被輕柔地過(guò)濾，并儲(chǔ)存在4℃直到電生理學(xué)研究。僅僅具有清楚地交叉條紋的、無(wú)自發(fā)性收縮或顯著粗糙表面的耐Ca2+細(xì)胞被選出用于試驗(yàn)。
試驗(yàn)在20℃至24℃下，在分離的心肌細(xì)胞上進(jìn)行。所有當(dāng)前的記錄都來(lái)自整細(xì)胞，通過(guò)使用1.60OD硅酸硼玻璃電極(Garner GlassCompany)膜片鉗技術(shù)的電壓鉗構(gòu)型。通過(guò)在一個(gè)來(lái)自0mV的鉗制電位的由25mV超極化測(cè)試脈沖(25ms)引起的非補(bǔ)償性的瞬變?nèi)萘肯抡洗藚^(qū)域，細(xì)胞容量能被計(jì)算。電阻范圍是2MΩ至11MΩ。這些研究中所述的大多數(shù)數(shù)據(jù)用有0.5MΩ至3MΩ電阻的電極獲得。在記錄電極和肌細(xì)胞膜之間形成高電阻的密封后，電極電容在破壞膜片之前被充分的電子補(bǔ)償。ICa電流被引發(fā)，這是通過(guò)去極化電壓階躍(380ms)-從50mV至+40mV，從一個(gè)鉗制電位-60mV以10mV遞增。被記錄的電流通過(guò)一個(gè)四極低頻Bessel過(guò)濾器以2kHz被過(guò)濾，并在5kHz被數(shù)字化。試驗(yàn)使用pClamp 5.6軟件(Axon Instruments)被控制，并使用Clampfit 6.0.3.被分析。Ca2+流使用外部溶液被記錄，該溶液包含(用mM計(jì)算)CaCl21.8、氯化四乙銨(TEA-Cl)135、4-氨基吡啶(4-AP)5、葡萄糖10、HEPES 10、MgCl2、(pH 7.3)。吸移管溶液包含(mM)天冬氨酸銫100、CsCl 20、MgCl21、Mg-ATP 2、Na2-GTP 0.5、EGTA 5、HEPES 5、(pH7.3，CsOH)。這些溶液從其它膜電流中分離ICa，例如Na+和K+通道電流，和通過(guò)Na+/Ca2+交換器的Ca2+流。
實(shí)施例6.鈣瞬變測(cè)量分離小鼠左心室肌細(xì)胞以評(píng)估鈣瞬變的測(cè)量依照前述的方法進(jìn)行(Chu等人(1996)Circ.Res.791064-1076)。Ca2+瞬變?cè)谑覝叵聫男募〖?xì)胞中被測(cè)量。簡(jiǎn)而言之，小鼠心臟被切離麻醉的(戊巴比妥鈉，70mg/kg，i.p.)成年小鼠，安裝在Langendorff灌注設(shè)備上，用無(wú)Ca2+的Tyrode溶液在37℃下被灌注3分鐘。正常Tyrode溶液包含140mM NaCl、4mM KCl、1mM MgCl2、10mM葡萄糖和5mM HEPES、pH 7.4。然后灌注被轉(zhuǎn)換為包含75units/mL 1型膠原酶(Worthington)的相同溶液，并持續(xù)灌注直到心臟變得無(wú)力(～10至15分鐘)。左心室組織被切離、切碎、吸移管分離并通過(guò)240μm篩網(wǎng)過(guò)濾。然后細(xì)胞懸浮液被連續(xù)在25、100、200μM和1mM Ca2+-Tyrode中洗滌。為獲得胞內(nèi)Ca2+信號(hào)，細(xì)胞用fura-2(Fura-2/AM；2μM)型乙酰甲基酯室溫培養(yǎng)30分鐘，并再懸浮在1.8mM的Ca2+-Tyrode溶液中。肌細(xì)胞懸浮液被置于樹(shù)脂玻璃室中，此室被放置在反向落謝熒光顯微鏡(Nikon Diaphot 200)上，并用1.8mM的Ca2+-Tyrode溶液在室溫下(22℃至23℃)灌注。肌細(xì)胞收縮被Grass S5刺激器(0.5Hz，方波)場(chǎng)刺激，并且細(xì)胞在340nm和380nm被Delta Scan雙電子束熒光分光光度計(jì)(PhotonTechnology International)交替刺激5次。Ca2+瞬變以因而發(fā)生的510nm發(fā)射的340/380nm比率被記錄。獲得了由340/380nm比率預(yù)測(cè)的基線(xiàn)和振幅，以及80％衰減的Ca2+信號(hào)和tau。所有的數(shù)據(jù)使用來(lái)自FeliX和Ionwizard的軟件被分析。
實(shí)施例7.I-1的體外PKCα磷酸化PKC致活酶反應(yīng)混合物包括10μM抑制劑-1、20mM MOPS、pH 7.2，25mM β-磷酸甘油、1mM MgCl2、1mM原釩酸鈉、1mM DTT、1mM CaCl2、0.1mg/mL磷脂酰絲氨酸、0.01mg/mL甘油二酯、100μM ATP和0.6mCi/mL[32P]ATP。PKC從兔心臟肌肉中分離(Woodgett和Hunter，(1987)J.Biol.Chem.2624836-4843)，重組野生型和Ser-67-Ala抑制劑-1從E.coli中分離(Bibb等人(2001)J.Biol.Chem.27614490-14497)。反應(yīng)在30℃下進(jìn)行，等分試樣在具體的時(shí)間點(diǎn)被移除，并且通過(guò)加入蛋白質(zhì)樣品緩沖液終止?；瘜W(xué)計(jì)量通過(guò)SDS-PAGE和直接的放射能定量被測(cè)定。
實(shí)施例8.原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)初生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)通過(guò)如前所述的酶分離1至2天大小的Sprague-Dawley幼年大鼠獲得(De Windt等人(2000)J.Biol.Chem.27513571-13579)。心肌細(xì)胞在補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素(100U/mL)和L-谷氨酰胺(2mmol/L)的無(wú)血清M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
實(shí)施例9.復(fù)制缺乏的腺病毒編碼心肌細(xì)胞中野生型或顯性負(fù)性突變型的PKCα的腺病毒的特征以前被描述(Braz等人(2002)J.Cell Biol.156905-919)。顯性負(fù)性PKCαcDNA由賴(lài)氨酸到精氨酸的突變組成，突變發(fā)生在氨基酸位置368處的ATP結(jié)合區(qū)域。每種重組腺病毒被噬斑純化、展開(kāi)并在HEK293細(xì)胞中測(cè)定濃度。典型的試驗(yàn)涉及6個(gè)初生大鼠心肌細(xì)胞在100個(gè)空斑形成單位的moi處感染2個(gè)小時(shí)，溫度37℃，在潮濕的、6％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。接下來(lái)，細(xì)胞在分析前在無(wú)血清的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)額外的24小時(shí)。在這些條件下95％的細(xì)胞顯示重組蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例10.PKC移位分析和免疫印跡分析可溶的和顆粒狀的片段用前述的方法制備(Braz等人(2002)J.Cell Biol.156905-919)。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE(10％凝膠)被轉(zhuǎn)移到Hybond-P膜(Amersham Pharmacia Biotech)上，用7％的牛奶封閉，并和PKCα、β、δ、ε、SERCA2、肌鈣蛋白、PLB、磷酸絲氨酸-16PLB、抑制劑-1和PP1cα的第一抗體一起培養(yǎng)。磷酸特異性I-1抗體以前被描述(Bibb等人(2001)J.Biol.Chem.27614490-14497。第一抗體4℃下在3％的牛奶中被培養(yǎng)過(guò)夜。第二抗體IgG(堿性磷酸酶綴合的-抗-小鼠、-兔子或-山羊)室溫下在0.5％至3％的牛奶中被培養(yǎng)1小時(shí)。化學(xué)熒光檢測(cè)用Vistra ECF試劑(RPN 5785；AmershamPharmacia Biotech)直接進(jìn)行并用PhosphorImager掃描，或化學(xué)發(fā)光用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行，并暴露在薄膜上。
實(shí)施例11.免疫沉淀反應(yīng)和蛋白質(zhì)磷酸酶活性分析蛋白質(zhì)提取物產(chǎn)生自用編碼β-半乳糖苷酶、I-1、PKCα和PKCα-dn的腺病毒感染的心肌細(xì)胞。提取物與結(jié)合到瓊脂糖微珠的PPIcα免疫沉淀，接著與I-1進(jìn)行western blotting。磷酸化蛋白底物的制備和蛋白質(zhì)磷酸酶的放射性分析依照Protein Serine/Threonine Phosphatase(PSP)Assay System(New England BioLabs，Inc.)進(jìn)行準(zhǔn)備。
實(shí)施例12.咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變?cè)趤?lái)自4只PKCα缺失小鼠的總共37個(gè)肌細(xì)胞和來(lái)自3只野生型小鼠的19個(gè)對(duì)照肌細(xì)胞中被測(cè)量。在膠原酶消化后，肌細(xì)胞室溫下與Indo-1 AM(25μg/2mL)一起被載入12分鐘。在以前的靜止?fàn)顟B(tài)(無(wú)電刺激)和在加入20mM咖啡因期間的胞內(nèi)鈣瞬變(通過(guò)Indo-1熒光比率測(cè)量)被記錄。
實(shí)施例13.心臟官能度評(píng)估心臟分離自四只野生型和四只PKCα-/-(PKCα缺失)的轉(zhuǎn)基因小鼠。分離的心臟用9個(gè)不同濃度的PMA灌輸，濃度范圍從8×10-11至8×10-7M。每種濃度的急性PMA灌輸進(jìn)行7分鐘。心臟在收縮期和舒張期分別被測(cè)量最大和最小dP/dt。一個(gè)這種試驗(yàn)的結(jié)果在圖36中被描述。
實(shí)施例14.PKC同工酶豐度評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)被用以評(píng)估健康人心臟中的PKC同工酶的相對(duì)豐度。細(xì)菌中產(chǎn)生的重組人蛋白PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCγ和PKCε購(gòu)自供應(yīng)商。制備三份已知濃度的等分試樣。
成人心室組織移植自六個(gè)無(wú)疾病的人。制備全細(xì)胞蛋白溶液。三份標(biāo)準(zhǔn)PKC等分試樣和心臟蛋白質(zhì)在相同凝膠上經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到膜上。膜被封閉并與PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCγ和PKCε同工酶特異性的抗體一起培養(yǎng)。來(lái)自這樣一個(gè)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)在圖37中被描述。
實(shí)施例15.心臟官能度評(píng)估相對(duì)選擇性的PKCα/β抑制劑化合物Ro-32-0432[2-{8-[(二甲氨基)甲基]-6，7，8，9-四氫吡啶[1，2-a]吲哚-3-yl}-3-(1-甲基吲哚-3-yl)馬來(lái)酰亞，鹽酸鹽][3-{8-[(二甲氨基)甲基]-6，7，8，9-四氫吡啶[1，2-a]吲哚-10-yl}-4-(1-甲基吲哚-3-yl)-1H-吡咯-2，5-二酮，鹽酸鹽]被用作直接檢查急性PKCα抑制對(duì)心臟功能和收縮性的效果的一種方法，使用體外工作心臟的制備。工作心臟制備分隔心臟的固有泵功能與總血管阻力的潛在改變，此改變?nèi)绻幬镌隗w內(nèi)被灌輸可能會(huì)發(fā)生。
工作成年野生型小鼠心臟用載體對(duì)照物(10％DMSO)或在10％DMSO中的Ro-32-0432灌輸，Ro-32-0432的濃度范圍在4×10-10至4×10-6M之間。在Ro-32-0432組中四只動(dòng)物被分析并與載體對(duì)照組中的三只動(dòng)物作比較。在濃度時(shí)間段(7分鐘每10個(gè)不同的遞增濃度)的值被求和以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)目的，表示一個(gè)約1×10-8M的平均劑量。載體對(duì)照和試驗(yàn)組顯示在不進(jìn)行任何處理之前，心率每分鐘分別跳動(dòng)363+/-15和295+/-26次。載體和藥物處理組的平均心率分別是每分鐘跳動(dòng)351+/＝3和292+/-6次。盡管心率較低，Ro-32-0432灌輸組顯示以最大dP/dt測(cè)量的急性收縮功能增加，并且左心室的壓力增加。Ro-32-0432處理組中急性收縮性能改變約20％，與PKCα缺失小鼠中觀(guān)察到的心臟功能的增加相似。來(lái)自一個(gè)這種試驗(yàn)的數(shù)據(jù)在圖38中被描述。
實(shí)施例16.PKCα指示多肽的移位PKCα指示物通過(guò)可操作地連接編碼PKCα的核苷酸序列到編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核苷酸序列被制備。包含PKCα-GFP核苷酸序列的表達(dá)彈夾被制備。包含PKCα-GFP表達(dá)彈夾的腺病毒被制備。
初生大鼠心肌細(xì)胞在塑料盤(pán)中培養(yǎng)直到達(dá)到合適的密度。心肌細(xì)胞用編碼PKCα-GFP的腺病毒感染。培養(yǎng)物被孵育24小時(shí)。24小時(shí)后細(xì)胞或者單獨(dú)與DMSO(載體處理)或者與DMSO和PMA一起孵育60分鐘。細(xì)胞被固定并通過(guò)共焦顯微鏡檢查。PMA刺激的細(xì)胞顯示具有高度局部化的和點(diǎn)狀染色的模式，而載體僅僅刺激細(xì)胞顯示具有相對(duì)分散的PKCα-GFP分布。
實(shí)施例17.麻醉大鼠中的體內(nèi)PKCα抑制劑評(píng)估選擇性的PKCα抑制劑在天然大鼠和有心肌梗塞(MI)的大鼠中被評(píng)估其對(duì)心肌收縮能力和血液動(dòng)力的效果。
重量在225gm至500gm的雄性Sprague-Dawley或Lewis大鼠用異氟烷進(jìn)行麻醉，MI被用以下方式誘導(dǎo)。完成第四或第五脈間的胸廓切開(kāi)術(shù)，暴露心臟，打開(kāi)心包膜。5-0縫合被置于離開(kāi)原位2至4毫米的左冠狀動(dòng)脈降支周?chē)?，并被固定系住。肋、肌肉、皮膚被分別閉合，動(dòng)物允許恢復(fù)。手術(shù)后二十至二十三周動(dòng)物被用來(lái)評(píng)估PKCα抑制劑對(duì)心肌收縮能力和血液動(dòng)力的效果。
抑制劑對(duì)天然的和MI大鼠的心肌收縮能力和血液動(dòng)力的效果評(píng)估如下。動(dòng)物被用異氟烷進(jìn)行麻醉。為測(cè)量全身血壓，股動(dòng)脈被分離并插入導(dǎo)管。頸靜脈被分離和插入導(dǎo)管以靜脈注射抑制劑。右頸動(dòng)脈被分離，一個(gè)Millar電導(dǎo)系數(shù)導(dǎo)管被插入心臟的左心室(LV)。左心室的心臟收縮壓力、心臟舒張末壓、+最大值dP/dt、-最小值dP/dt和心率得自L(fǎng)V壓力波形。平均動(dòng)脈血壓得自全身血壓波形。數(shù)據(jù)被連續(xù)地記錄，并使用計(jì)算機(jī)化的數(shù)據(jù)采集軟件(Notocord或Powerlab)。
經(jīng)過(guò)一段時(shí)間地穩(wěn)定，PKCα抑制劑被以以下劑量注入 大鼠0.1、0.3、1.0、3.0、10、30、100、300和1000nmol/kg/min。每一劑量的注入被允許持續(xù)至少五分鐘。對(duì)于MI大鼠，注入劑量如下10、30、100、300、和1000nmol/kg/min，至少五分鐘。當(dāng)量注入體積被施用給分離的載體對(duì)照天然的和MI動(dòng)物。測(cè)試注入的最后，5.0μg/kg/min多巴酚丁胺被注入。
實(shí)施例18.抗心肌癥化合物的鑒定方法此分析可被用于多種心肌癥顯型。相關(guān)的PKCα核苷酸序列被克隆進(jìn)一個(gè)包含心臟組織優(yōu)選的啟動(dòng)子的表達(dá)載體。包含啟動(dòng)子的表達(dá)彈夾，可操作地連接到相關(guān)核苷酸序列，被限制酶消化。限制反應(yīng)產(chǎn)物被放在瓊脂糖凝膠上電泳，表達(dá)彈夾純化自由瓊脂糖凝膠。表達(dá)彈夾依照本領(lǐng)域已知的任何方法被制備用于顯微注射。表達(dá)彈夾被用于提供轉(zhuǎn)基因小鼠。使用Southern blot分析，證實(shí)了轉(zhuǎn)基因的存在。
兩組年齡匹配的轉(zhuǎn)基因小鼠被確定。其中一群小鼠的飲食被相關(guān)化合物補(bǔ)充。另外一群的飲食被安慰劑補(bǔ)充。兩組小鼠被培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間并終止試驗(yàn)。小鼠被監(jiān)控是否心肌癥顯型，例如，使用本文別處描述的左心室/身體重量比率的肥大。兩群小鼠顯示的心肌癥顯型被比較。可供選擇地，化合物可以用已確立的方法和技術(shù)直接施用于動(dòng)物，包括，但不限于，動(dòng)脈內(nèi)注射或靜脈注射化合物，通過(guò)用注射器或微型滲透泵或其它方法、口服強(qiáng)飼法、腹膜內(nèi)注射或皮下注射。
試驗(yàn)結(jié)果和討論在以下圖中，除非另外指明，數(shù)據(jù)用用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差描述。
圖1PKCα位點(diǎn)(也叫Prkca)是胚胎干細(xì)胞中的同源重組靶向的，以便于通過(guò)用新霉素抗性標(biāo)記物替換刪除編碼催化ATP結(jié)合彈夾的外顯子(見(jiàn)分圖A)。通過(guò)用EcoRV消化的DNA和一個(gè)載體同源區(qū)域以外的5′探針的Southern blotting檢查基因組靶向(見(jiàn)分圖B)，說(shuō)明正確的靶向和選擇的外顯子的刪除。使用以前本領(lǐng)域常用的普通技術(shù)，正確靶向的胚胎干細(xì)胞被用來(lái)產(chǎn)生包含種系的PKCα靶向小鼠。PKCα+/-小鼠被雜交，以預(yù)知的孟德?tīng)栴l率，產(chǎn)生PKCα-/-后裔。分圖C顯示來(lái)自野生型、PKCα+/-和PKCα-/-小鼠心臟蛋白提取物的PKCα蛋白水平的western blotting，說(shuō)明PKCα-/-小鼠的PKCα蛋白被完全消除，并且與非靶向的野生型小鼠相比，PKCα+/-小鼠的蛋白被降低約50％。
圖2為了評(píng)估其它PKC同工酶可能補(bǔ)償心臟內(nèi)PKCα損失的潛力，來(lái)自?xún)蓚€(gè)月大小PKCα-/-小鼠，經(jīng)受通過(guò)主動(dòng)脈縮窄(TAC)而遭受的壓力超負(fù)荷兩周的小鼠或虛假對(duì)照動(dòng)物的心臟，進(jìn)行western blotting。野生型對(duì)照動(dòng)物也經(jīng)受TAC或假手術(shù)。來(lái)自這些心臟的蛋白提取物被分成可溶解的(S)或顆粒的(P)部分，進(jìn)行western blot以選擇PKC同工酶。數(shù)據(jù)顯示PKCα-/-小鼠完全缺乏PKCα蛋白，而PKCβ、δ和ε水平或移位效率未受影響。這些結(jié)果指示交替的PKC同工酶不太可能明顯地補(bǔ)償心臟內(nèi)PKCα的損失。
圖36個(gè)PKCα-/-和6個(gè)非靶向的野生型小鼠的閉胸?zé)o創(chuàng)血液動(dòng)力評(píng)估顯示最大dP/dt從基線(xiàn)增長(zhǎng)了15％至20％，伴隨著受多巴酚丁胺刺激后的β腎上腺素的受體相應(yīng)的平行增長(zhǎng)。這些結(jié)果指示PKCα-/-小鼠體內(nèi)有高收縮的心臟。
圖4為了評(píng)估除了潛在的血液動(dòng)力學(xué)補(bǔ)償反應(yīng)的心臟固有功能，體外順式工作的心臟制備在2至10個(gè)月大小的PKCα-/-或野生型小鼠(每組4個(gè)心臟)中進(jìn)行。每個(gè)心臟被調(diào)速在約每分鐘400下，以確保功能容量的相同評(píng)估。PKCα-/-心臟顯示，與年齡匹配、野生型同窩出生的對(duì)照相比較，在2和10個(gè)月時(shí)，最大dP/dt分別增加15％和32％。(分圖A)。左心室壓力發(fā)展相應(yīng)的增長(zhǎng)也可在PKCα-/-小鼠中被觀(guān)察到(分圖B)。這些結(jié)果還表明PKCα-/-小鼠有高收縮的心臟，不足不會(huì)被存在于整個(gè)動(dòng)物中的其它機(jī)制補(bǔ)償。
圖56個(gè)PKCα-/-和6個(gè)非靶向的野生型小鼠胸腔閉胸?zé)o創(chuàng)血液動(dòng)力評(píng)估顯示心率(分圖A)或平均動(dòng)脈壓(分圖B)都沒(méi)有變化。這些結(jié)果表明PKCα-/-中被觀(guān)察到的心臟的伸縮力的增強(qiáng)不是因?yàn)檠獕夯蛐穆实拇渭?jí)改變。
圖6為了評(píng)估與心臟中PKCα蛋白去除相關(guān)聯(lián)的功能獲得顯型，在心臟特異性α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子控制下過(guò)表達(dá)野生型PKCαcDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠被產(chǎn)生(分圖A)。來(lái)自野生型小鼠或PKCα過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟蛋白提取物的定量western blotting顯示轉(zhuǎn)基因心臟內(nèi)PKCα蛋白的5倍的過(guò)表達(dá)，PKCβ、δ或ε中沒(méi)有任何補(bǔ)償性的改變(分圖B，上部)。來(lái)自野生型、PKCα轉(zhuǎn)基因或PKCα-/-小鼠的心臟蛋白提取物的Western blotting顯示PKCα增強(qiáng)的磷酸化，說(shuō)明了由轉(zhuǎn)基因引起的更強(qiáng)的活性(分圖B，下部)。Western blotting程序中，PKCα-/-心臟提取物被用作遷移對(duì)照物。這些結(jié)果表明PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠心臟內(nèi)有顯著更強(qiáng)的PKCα活性。
圖7PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)心肌病癥狀。4個(gè)月大小的PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠顯示減少的片段縮短，此縮短與年齡和品系匹配的野生型對(duì)照相比較，通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)量，說(shuō)明增強(qiáng)的PKCα活性減少體內(nèi)心臟的收縮性能(分圖A)。用體外工作心臟制備(分圖B)評(píng)估的最大dP/dt評(píng)估也支持此結(jié)論，與野生型對(duì)照相比較，PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠也顯示減少的心臟性能。在以上的試驗(yàn)中，每組(A和B)使用4只動(dòng)物。
圖8直到6和8個(gè)月大小的時(shí)候，即在圖7說(shuō)明的減少收縮性能后不久，PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠才出現(xiàn)心臟肥大癥狀。到6和8個(gè)月大小時(shí)，心臟肥大的逐漸顯示是減少的收縮性能的結(jié)果，這些共同表明心臟內(nèi)PKCα活性的增強(qiáng)引起心肌病。每組使用4只動(dòng)物。
圖9雖然PKCα基因靶向的和轉(zhuǎn)基因小鼠顯示對(duì)立的心肌收縮能力顯型，與慢性的PKCα活性改變相關(guān)的次級(jí)作用的潛力不能被忽視。為了驗(yàn)證此考慮，PKCα活化或抑制的急性模型被在野生型成年大鼠的心肌細(xì)胞內(nèi)建立，接著是檢查單個(gè)細(xì)胞的收縮反應(yīng)。野生型或顯性負(fù)性PKCα的腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移分別降低和增強(qiáng)肌細(xì)胞的收縮性，收縮性通過(guò)峰縮短進(jìn)行測(cè)量(P＜0.05)。最大縮短速率也同樣的被影響，在對(duì)照成年肌細(xì)胞中的值為4.04±0.23μm/sec。與之相比，野生型和顯性負(fù)性PKCα腺病毒-感染的肌細(xì)胞分別為3.16±0.25μm/sec和5.48±0.36μm/sec(P＜0.05)。這些數(shù)據(jù)表明PKCα活性急性改變影響肌細(xì)胞收縮性，與圖1至8中描述的遺傳小鼠模型一致。
圖10PKCα-/-心臟顯示受磷蛋白(PLB)過(guò)度磷酸化，導(dǎo)致使用western blotting的遲緩的遷移和絲氨酸16直接磷酸化的增強(qiáng)，絲氨酸CA2或肌鈣蛋白水平?jīng)]有變化(分圖A、B)。為更好的表現(xiàn)遷移中地差別，PLB五聚物形態(tài)被顯示。有趣的是，觀(guān)察到的PLB過(guò)度磷酸化特征圖也與降低的PLB蛋白水平相關(guān)，因此導(dǎo)致PLB/SERCA2蛋白比率被降低50％至70％，預(yù)計(jì)這樣可以使SERCA2更具活性(分圖A)。已知用來(lái)改變PLB收縮效力的位點(diǎn)，與野生型(Wt)對(duì)照心臟相比較，位于絲氨酸16的PLB磷酸化的直接測(cè)量結(jié)果在PKCα-/-小鼠心臟內(nèi)是增加的(分圖C、D)。這些結(jié)果表明有一種潛在的機(jī)制，通過(guò)其PKCα蛋白損失通過(guò)消除PLB抑制絲氨酸SERCA2a活性的功效增強(qiáng)心肌收縮能力能。
圖11PKCα和PLB之間的全部的調(diào)節(jié)范例也在急性感染的成年大鼠心肌細(xì)胞中被觀(guān)察到。具體地講，腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的顯性負(fù)性PKCα表達(dá)，也與位于絲氨酸16的PLB增強(qiáng)的磷酸化相關(guān)。這些結(jié)果共同表明PKCα信號(hào)的變化影響PLB磷酸化狀態(tài)和蛋白水平，說(shuō)明有一種機(jī)制，通過(guò)其PKCα的去除或過(guò)表達(dá)可能影響收縮性。
圖12使用RNA dot blotting(分圖A)或半定量的RT-PCR(分圖B)，都未發(fā)現(xiàn)野生型和PKCα-/-心臟間的PLB或SERCA2 mRNA水平有變化，表示圖10描述的PB蛋白被觀(guān)察到的下調(diào)，由轉(zhuǎn)錄后機(jī)制引起。PLB蛋白水平的降低被假設(shè)是由降低的蛋白穩(wěn)定性導(dǎo)致，SR中的凈分裂形態(tài)的穩(wěn)定的SERCA2復(fù)合物。
圖13PKCα轉(zhuǎn)基因小鼠具有心臟中更多的PKCα活性和蛋白，它與PKCα-/-小鼠相比顯示PLB的反向改變。具體地講，心臟中的PLB磷酸化被減少了，而總蛋白增加了2.1倍(P＜0.05)(分圖A-D)。觀(guān)察到的PLB去磷酸狀態(tài)與總蛋白的增加一起會(huì)顯著抑制SERCA2活性。因此，PKCα的過(guò)表達(dá)降低心肌收縮能力。為更好地說(shuō)明蛋白遷移的變化，PLB五聚物形態(tài)被顯示。
圖14PLB磷酸化的改變將直接改變SERCA2功能，因此影響肌質(zhì)網(wǎng)中的鈣進(jìn)入和鈣瞬變的幅度。分離自PKCα-/-小鼠的成熟心肌細(xì)胞顯示增強(qiáng)的鈣瞬變，說(shuō)明有更多的鈣進(jìn)入肌質(zhì)網(wǎng)中(分圖A)。裝有Fura-2的PKCα-/-細(xì)胞顯示了鈣峰釋放52％的增加，以及17％更快的鈣再攝入(T80)，相應(yīng)于時(shí)間常數(shù)Tau 20％的降低(n＝36個(gè)細(xì)胞來(lái)自6只野生型小鼠，33個(gè)細(xì)胞來(lái)自4只PKCα-/-小鼠)(分圖B)。這些數(shù)據(jù)與增強(qiáng)的SERCA2a功能和更大的肌質(zhì)網(wǎng)中鈣進(jìn)入相一致，因此反映了心肌的休克狀態(tài)。
圖15這些結(jié)果說(shuō)明PKCα-/-心肌細(xì)胞中觀(guān)察到的增大的鈣瞬變是由于肌質(zhì)網(wǎng)中增加的鈣進(jìn)入。在Indo-1載入的心肌細(xì)胞中被咖啡因給藥誘導(dǎo)的鈣釋放峰值直接測(cè)量說(shuō)明了PKCα-/-小鼠與野生型(Wt)對(duì)照相比顯著更大的肌質(zhì)網(wǎng)鈣進(jìn)入(P＜0.05)(分圖A顯示代表性的鈣追蹤圖，B顯示對(duì)峰咖啡因誘導(dǎo)的鈣釋放的定量的數(shù)據(jù))。
圖16圖14中描述的鈣瞬變被觀(guān)察到的增加也可能是部分由于肌膜中L-型鈣電流的增大。然而，平均ICa密度的直接測(cè)量值在野生型和PKCα-/-心肌細(xì)胞中沒(méi)有變化。
圖17β-腎上腺素受體信號(hào)或蛋白致活酶A活性不發(fā)生相應(yīng)的變化，PLB磷酸化中觀(guān)察到的改變說(shuō)明作用于PLB的磷酸酶的潛在作用。為了研究這種潛在的效應(yīng)器途徑，PP1-和PP2A-特異性磷酸酶分析被從野生型心臟和PKCα-/-心臟中進(jìn)行(每種N＝4個(gè)心臟)。在PKCα-/-心臟中的總蛋白磷酸酶活性降低了約18％，而PP1-特異性活性降低了大于30％，而PP2A-特異性活性無(wú)顯著的不同。這些結(jié)果指示PKCα的損失與心臟中的PP1活性的降低相聯(lián)系。
圖18相應(yīng)于PKCα-/-小鼠心臟中顯示的數(shù)據(jù)，PKCα過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠顯示了心臟中PP1活性的顯著增加，但是PP2A活性未發(fā)生變化。這些結(jié)果指示心臟中增加的PKCα活性與PP1活性的特異性增加相聯(lián)系。數(shù)據(jù)被表示為相對(duì)磷酸酶活性。
圖19與圖17和18中描述的數(shù)據(jù)一致，培養(yǎng)心肌細(xì)胞的急性腺病毒感染顯示隨著顯性負(fù)性PKCα突變型的表達(dá)的PP1活性60％的減少，以及隨著野生型PKCα過(guò)表達(dá)的PP1活性30％的增加(來(lái)自三重實(shí)驗(yàn))。PKCα的急性改變對(duì)應(yīng)于PP1活性的改變，這說(shuō)明PKCα可能通過(guò)一種在下面的圖中詳細(xì)闡述的機(jī)制直接調(diào)節(jié)PP1活性。
圖20PP1活性被一類(lèi)蛋白質(zhì)抑制劑調(diào)節(jié)，例如抑制蛋白-1(I-1)。I-1直接結(jié)合PP1，導(dǎo)致抑制PP1的活性，雖然I-1的PP1結(jié)合能力取決于它的來(lái)自可誘導(dǎo)信號(hào)的磷酸化狀態(tài)。為了檢查PKCα可能直接磷酸化I-1并因此調(diào)節(jié)它與PP1的結(jié)合這一假說(shuō)，在存在32P-ATP的條件下使用細(xì)菌產(chǎn)生的I-1和純化PKC進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)。野生型I-1蛋白被PKC在化學(xué)計(jì)量水平以時(shí)間依賴(lài)性的方式體外直接磷酸化。I-1中的假定PKC磷酸化位點(diǎn)分析顯示了一個(gè)在絲氨酸-67的共有基序。重組S67A突變型I-1蛋白顯示與相同量的野生型蛋白相比約50％減少的通過(guò)PKC的磷酸化。
圖21為了進(jìn)一步檢查PP1活性被PKCα改變的潛在機(jī)制，在腺病毒感染的經(jīng)受PP1c下調(diào)的心肌細(xì)胞中進(jìn)行一系列I-1免疫沉淀反應(yīng)，接下列進(jìn)行I-1 western blotting(輸入通道不被免疫沉淀)。數(shù)據(jù)說(shuō)明，野生型PKCα過(guò)表達(dá)特異性地減少I(mǎi)-1與PP1c的結(jié)合能力約50％，而顯性負(fù)性PKCα(dn)增加復(fù)合物形成大于70％。在每一種免疫沉淀反應(yīng)中的總PP1c水平?jīng)]有不同。
圖22I-1結(jié)合并抑制PP1的能力也被蛋白致活酶A-調(diào)節(jié)的I-1中的蘇氨酸-35磷酸化調(diào)節(jié)。在此位點(diǎn)的磷酸化致使I-1成為更有效的PP1抑制劑，因此減少它的活性，這與通過(guò)PKCα的絲氨酸-67磷酸化效果相反。我們研究了野生型或顯性負(fù)性PKCα的表達(dá)對(duì)I-1的或者蘇氨酸-35或者絲氨酸-67位點(diǎn)磷酸化的影響，使用對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的磷酸特異性的抗體。用AdI-1(Ad＝腺病毒)和Adβgal、AdPKCα-wt或AdPKCα-dn一起使用，感染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞以增加分析的敏感性，相應(yīng)于PKCα調(diào)節(jié)在蘇氨酸-35磷酸化中沒(méi)有觀(guān)察到變化。然而，AdPKCα-dn表達(dá)顯著地減少I(mǎi)-1絲氨酸-67磷酸化超過(guò)70％，而AdPKCα-wt增加磷酸化大于60％。
圖23圖20至22中描述的數(shù)據(jù)使用PKCα轉(zhuǎn)基因靶向基因小鼠被體內(nèi)提供，在這些小鼠中內(nèi)源I-1的磷酸化被從心臟提取物中分析。用絲氨酸-67磷酸特異性抗血清進(jìn)行的Western blotting說(shuō)明來(lái)自PKCα-/-心臟的磷酸化顯著地減少(超過(guò)50％)，而PKCα轉(zhuǎn)基因心臟具有增加地磷酸化(2倍)(P＜0.05)。
圖24與圖20至23中顯示的數(shù)據(jù)一致，用來(lái)自擴(kuò)張型衰竭人類(lèi)心臟的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行的western blotting也顯示與正常人供體心臟(分圖B)相比較，I-1絲氨酸-67磷酸化的增加。這些數(shù)據(jù)也與通過(guò)相同蛋白提取物的western blotting評(píng)估的PKCα蛋白質(zhì)水平的普遍增加相一致(P＜0.05)(分圖A)。這些結(jié)果指示衰竭的、患心肌病的人心臟顯示PKCα水平和I-1中絲氨酸67磷酸化的增加。
圖25培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞中的PKCα蛋白的共焦免疫組織化學(xué)分析顯示PMA誘導(dǎo)的到膜移位和Z線(xiàn)。在未受刺激的細(xì)胞中，PKCα位于細(xì)胞各處，但是PMA的急性刺激引起它迅速的轉(zhuǎn)移到與肌質(zhì)網(wǎng)中Z線(xiàn)位置的PLB和SERCA2富集區(qū)相同的結(jié)構(gòu)上去。這些數(shù)據(jù)指示PKCα一旦被活化，移位到合適的胞內(nèi)位置以影響肌質(zhì)網(wǎng)中的鈣處理。
圖26此處我們檢驗(yàn)PKCα靶向基因小鼠中觀(guān)察到的相對(duì)溫和的高收縮狀態(tài)可能有益于衰竭心臟這一假說(shuō)。PKCα-/-小鼠和野生型同胎仔畜對(duì)照經(jīng)受長(zhǎng)期的主動(dòng)脈帶誘導(dǎo)的心力衰竭。小鼠8周大小時(shí)開(kāi)始在動(dòng)脈腔中施用TAC 12周，然后通過(guò)工作心臟制備評(píng)估心臟功能。來(lái)自野生型小鼠的心臟顯示與相同年齡的假手術(shù)對(duì)照小鼠相比最大dP/dt 50％的減少和LVP 35％的減少，而PKCα缺失小鼠的這兩個(gè)參數(shù)不顯示顯著的減少(每組中N＝4個(gè)心臟)。這些結(jié)果指示PKCα-/-小鼠對(duì)壓力過(guò)載刺激誘導(dǎo)的心臟補(bǔ)償不全和收縮性損失是抗性的。
圖27接著如圖26所述的長(zhǎng)期主動(dòng)脈帶誘導(dǎo)的心力衰竭，心動(dòng)超聲圖也被用以進(jìn)一步檢查收縮性影響。PKCα缺失小鼠和野生型同胎仔畜對(duì)照當(dāng)8周大小時(shí)開(kāi)始在動(dòng)脈腔中施用TAC 12周，然后通過(guò)心動(dòng)超聲圖評(píng)估心臟功能。來(lái)自經(jīng)受12周TAC處理的野生型小鼠的心臟顯示與經(jīng)受相同刺激的PKCα-/-相比更顯著地增加的左心室舒張末徑(LVED)和左心室收縮末徑(LVES)(分圖A)。野生型TAC小鼠的心臟左室短軸縮短率(FS)與顯示心室性能損失更少的PKCα-/-小鼠相比也更顯著的減少了(分圖B)。這些結(jié)果進(jìn)一步指示PKCα-/-小鼠對(duì)壓力過(guò)載刺激誘導(dǎo)的心臟補(bǔ)償不全和體內(nèi)收縮性損失是抗性的。
圖28由于去除肌肉lim蛋白(MLP)基因而產(chǎn)生擴(kuò)張型心肌病的小鼠模型作為第二心力衰竭模型也被分析。通過(guò)心動(dòng)超聲圖，2個(gè)月大小的MLP缺失小鼠與野生型對(duì)照或PKCα-/-小鼠相比顯示減少的功能容量和更大的左心室擴(kuò)張(分圖A、B)。然而，缺失PKCα的MLP缺失小鼠顯示心力衰竭癥狀的顯著改善，例如更少的心室擴(kuò)張(LVED和LVES)和保留的片段縮短(分圖A、B)。這些結(jié)果指示PKCα損失預(yù)防在另一種小鼠心肌病與心力衰竭體內(nèi)模式中的心臟功能不良和重塑。
圖29收縮性也在MLP-/-小鼠中使用分離的體外工作心臟制備被評(píng)估。這些數(shù)據(jù)顯示MLP-/-小鼠中心肌收縮能力的顯著減少，在也缺失PKCα(雙缺失)的小鼠中這種減少被阻止，收縮性通過(guò)最大dP/dt或發(fā)展的左心室壓力(LVP)的變化進(jìn)行測(cè)量。這些結(jié)果進(jìn)一步指示PKCα損失預(yù)防在MLP小鼠心肌病和心力衰竭體外模式中的心臟功能不良。
圖30通過(guò)刪除MLP-/-背景中的PKCα來(lái)預(yù)防心力衰竭和心肌收縮能力減少說(shuō)明心肌病的其它方面可以被減少。與MLP-/-小鼠相比，雙缺失小鼠(也缺失PKCα)顯示在反應(yīng)性肥大中的損失，反應(yīng)性肥大代表MLP缺失顯型。因此，通過(guò)PKCα刪除提高收縮性預(yù)防涉及心重(HW)對(duì)體重(BW)比率增加的擴(kuò)張型心肌病顯現(xiàn)的增加。
圖31與圖30描述的數(shù)據(jù)一致，單MLP-/-小鼠有與在縱斷剖面擴(kuò)張的和增大的心肌層相關(guān)的組織學(xué)疾病，而雙缺失小鼠(也缺失PKCα)基本上顯示無(wú)疾病。這些結(jié)果進(jìn)一步支持PKCα刪除預(yù)防涉及組織病理學(xué)和總形態(tài)改變的擴(kuò)張型心肌病顯現(xiàn)的論點(diǎn)。
圖32已知在心臟中表達(dá)超過(guò)3倍PP1催化亞基的轉(zhuǎn)基因小鼠在3個(gè)月大小時(shí)功能容量減少并有心肌病。我們的已知資料說(shuō)明PKCα能直接調(diào)節(jié)心臟中的PP1活性(圖18至24)，我們推斷PKCα的損失將部分地抑制與PP1適度過(guò)表達(dá)相聯(lián)系地增加地活性。與PP1轉(zhuǎn)基因小鼠雜交的PKCα缺失小鼠證明心臟中PP1活性的顯著減少。來(lái)自PP1轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟與來(lái)自野生型小鼠的心臟相比顯示約2.5倍增加的PP1活性。再一次實(shí)驗(yàn)，來(lái)自PKCα-/-小鼠的心臟顯示顯著減少的心臟PP1活性。在PP2A中觀(guān)察不到變化。這些結(jié)果指示PKCα損失減少心臟中的過(guò)表達(dá)PP1的效果。
圖33通過(guò)超聲心動(dòng)圖評(píng)估，3個(gè)月大小的PP1轉(zhuǎn)基因小鼠顯示顯著減少的心室性能的。然而，在PP1轉(zhuǎn)基因背景下刪除PKCα，它在圖32中顯示能減少PP1活性，能有效地預(yù)防心室性能的損失。這些結(jié)果指示PKCα能體內(nèi)預(yù)防心肌病效果和在PP1轉(zhuǎn)基因小鼠中觀(guān)察到的收縮性的不足。
圖343個(gè)月大小的PP1轉(zhuǎn)基因小鼠也有減少的收縮性，收縮性用體外工作心臟制備來(lái)測(cè)量。然而，在PP1轉(zhuǎn)基因背景下刪除PKCα同樣預(yù)防收縮性的損失，收縮性用最大dP/dt、最小dP/dt和發(fā)展的左心室壓力(LVP)的改變測(cè)量。這些結(jié)果進(jìn)一步支持PKCα能體外反轉(zhuǎn)PP1轉(zhuǎn)基因小鼠中觀(guān)察到的心肌病效果和收縮性不足的結(jié)論。
圖35為了說(shuō)明PKCα抑制對(duì)由心力衰竭和心肌病引起的死亡率的有益效果，死亡作為一個(gè)終點(diǎn)也被量化。圖26和27中所述的12周的TAC實(shí)驗(yàn)也在對(duì)照野生型小鼠和PKCα-/-小鼠中進(jìn)行動(dòng)物死亡監(jiān)控。數(shù)據(jù)顯示與經(jīng)受TAC的PKCα-/-小鼠相比，在經(jīng)受超過(guò)12周時(shí)期TAC的野生型小鼠中觀(guān)察到顯著更多的死亡。在兩種基因型的假控制小鼠中沒(méi)有死亡被觀(guān)察到。這些結(jié)果指示PKCα的損失保護(hù)小鼠不發(fā)生TAC誘導(dǎo)的心力衰竭和最終的過(guò)早死亡。此外，死亡率也在MLP-/-小鼠中被評(píng)估。圖35B指示MLP-/-小鼠與其它描述的組相比有高的死亡率。MLP-/-小鼠中的高死亡率在缺少M(fèi)LP和PKCα(雙缺失)的小鼠中被減輕。數(shù)據(jù)指示PKCα去除/抑制在MLP去除和心力衰竭情況下提供存活的有益效果。
圖36為了更仔細(xì)的評(píng)估PKCα作為心肌收縮能力調(diào)節(jié)因子的潛在作用，我們?cè)隗w外工作心臟制備中使用PMA急性給藥到野生型或PKCα-/-心臟。PKC活化類(lèi)化合物是弗波酯，它被用以引發(fā)心肌收縮能力的急性的、PKC依賴(lài)性的改變。此處分離的心臟用9個(gè)不同濃度的PMA灌輸，濃度范圍從8×10-11至8×10-7M(分圖A、B)。數(shù)據(jù)顯示濃度為8×10-11至8×10-9M的急性PMA灌輸對(duì)野生型小鼠心臟的收縮性能基本上無(wú)效果，收縮性關(guān)于或者最大dP/dt或者最小dP/dt(分圖A、B)。然而，高于8×10-9M的濃度產(chǎn)生野生型心臟中功能性能標(biāo)志性的增長(zhǎng)，說(shuō)明PKC活化能在此制備中減少心肌收縮能力(分圖A、B)。然而，經(jīng)受相同濃度的PMA處理的PKCα缺失心臟顯示對(duì)低劑量PMA的立即的正收縮變力效果，并且在最高濃度的PMA下功能性能僅有輕度的降低(圖36A、B)。這些結(jié)果指示PMA誘導(dǎo)的心肌收縮能力降低直接取決于PKCα。這些數(shù)據(jù)支持PKCα作為收縮性的急性負(fù)性調(diào)節(jié)因子的重要作用，區(qū)別于其它也被PMA活化的PKC同工酶。
圖37因?yàn)镻KCα可以作為一種新型靶用以急性改變心肌收縮能力并因此影響心力衰竭，人們有興趣檢查PKCα對(duì)來(lái)自心臟的其它類(lèi)的PKC同工酶的相對(duì)豐度。重組人蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(細(xì)菌中產(chǎn)生)購(gòu)買(mǎi)自供應(yīng)商，以便于產(chǎn)生PKCα、βI、βII、γ和ε的蛋白含量對(duì)western blotting信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。這些蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與來(lái)自6個(gè)正常人心臟的全細(xì)胞蛋白樣品在相同的凝膠中電泳并經(jīng)受western blotting抗體檢測(cè)。(分圖A、B)。數(shù)據(jù)說(shuō)明PKCα與其它在人類(lèi)心臟中分析的PKC同工酶相比被以顯著更高的水平表達(dá)(分圖A、B)。這些結(jié)果說(shuō)明PKCα是一種人類(lèi)心臟中顯著的PKC異構(gòu)體。
圖38相對(duì)選擇性的PKCα/β抑制劑化合物Ro-32-0432[2-{8-[(二甲氨基)甲基]-6，7，8，9-四氫吡啶[1，2-a]吲哚-3-yl}-3-(1-甲基吲哚-3-yl)馬來(lái)酰亞，鹽酸鹽]被用作直接檢查急性PKCα抑制對(duì)心臟功能和收縮性的效果的一種方法，使用體外工作心臟的制備。成年野生型小鼠心臟用載體對(duì)照物(10％DMSO)或在10％DMSO中的Ro-32-0432灌輸，Ro-32-0432的濃度范圍在4×10-10至4×10-6M之間。在濃度時(shí)間段(7分鐘每10個(gè)不同的遞增濃度)的所有值被求和以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)目的，表示一個(gè)約1×10-8M的平均劑量。載體對(duì)照和試驗(yàn)組顯示在不進(jìn)行任何處理之前，心率每分鐘分別跳動(dòng)363+/-15和295+/-26次。載體和藥物處理組的平均心率分別是每分鐘跳動(dòng)351+/-3和292+/-6次。盡管心率更低，Ro-32-0432灌輸組顯示用最大dP/dt測(cè)量的急性收縮功能20％的增加和發(fā)展的左心室壓力20％的增加(P＜0.05)(分圖A、B)。在Ro-32-0432組中四只動(dòng)物被分析并與載體對(duì)照組中的三只動(dòng)物作比較。Ro-32-0432處理組中急性收縮性能改變約20％，與此申請(qǐng)前面討論的PKCα缺失小鼠中觀(guān)察到的心臟功能的增加相似。這些結(jié)果共同指示使用Ro-32-0432的PKCα急性抑制有效地增加心臟功能和收縮性。
圖39PKC同工酶移位常常與活化相聯(lián)系，并且PKC抑制劑能阻止移位。PKCα-綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)融合表達(dá)腺病毒被產(chǎn)生作為一種小心的監(jiān)控PKCα移位或抑制初生心肌細(xì)胞培養(yǎng)中的移位的方法。響應(yīng)載體處理(DMSO)，PKCα-GFP與未處理的相比不受影響，顯示遍及細(xì)胞的相當(dāng)分散的定位，與輕度的肌組織一致。然而，60分鐘的PMA刺激引起PKCα-GFP強(qiáng)烈的重新分布，以至于定位分散的背景被替換成高度局部化和點(diǎn)狀染色的模式，并且總熒光減少。這種重新分布的凈效應(yīng)是每個(gè)細(xì)胞中的總熒光特征的改變，這種改變能用大規(guī)模篩選分析容易的檢測(cè)到。因此，合適的PKCα抑制化合物能基于PKCα-GFP細(xì)胞重新分布被迅速的鑒定。
圖40A和40B為了說(shuō)明PKCα抑制劑體內(nèi)調(diào)節(jié)收縮性的能力，一種PKC抑制劑，LY333531，(S)-13[(一甲氨基)甲基]-10，11，14，15-四氫-4，916，21-二美替諾-1H，13H-二苯[E，K]并-[3，4-H][1，4，13]氧化雙氮-環(huán)己定-1，3(2H)-二酮，被施用在實(shí)驗(yàn)部分描述的正常大鼠中(n＝3)。LY333531被溶解在20％的丁基磺酸鈉-B-環(huán)糊精鈉鹽(Captisol)、50mM的乙酸緩沖液中，pH5.0?；衔锉灰詧D40的每個(gè)濃度灌注5分鐘。在1000nmol/kg/min的劑量，LY333531顯示了最大dP/dt(圖40A)和最小dP/dt(圖40B)的顯著增加。圖40A顯示最大dP/dt而圖40B顯示最小dP/dt，包括無(wú)化合物(基線(xiàn)；B/L)和下列的灌注0.1、0.3、1、3、10、30、100、300和1000nmol/kg/min的LY333531，它們被指示在橫坐標(biāo)上。然后藥物停止5分鐘(P/D)，多巴酚丁胺(Dob)被以5.0μg/kg/min施用5分鐘。在圖40B中，最小dP/dt值被以絕對(duì)的或數(shù)字的值表示以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)化目的。在1000nmol/kg/min劑量下，與基線(xiàn)測(cè)量相比最大dP/dt增加28％而最小dP/dt降低17％，與PKCα缺失小鼠和施用Ro-32-0432于分離的工作心臟制備中的數(shù)據(jù)一致。在圖40A和40B中，星號(hào)指示與基線(xiàn)值的統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異(P＜0.05)，此差異被使用Dunnett’s MultipleComparisons事后檢驗(yàn)的單因素方差分析(ANOVA)測(cè)定。在1000nmol/kg/min時(shí)心臟收縮和舒張的增加對(duì)心率(基線(xiàn)每分鐘跳動(dòng)315±17對(duì)1000nmol/kg/min每分鐘跳動(dòng)294±8，無(wú)統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性)或左心室收縮壓(基線(xiàn)12kPa±400Pa(90±3mmHg)對(duì)1000nmol/kg/min每分鐘跳動(dòng)105±6，無(wú)統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性)不產(chǎn)生影響。這些數(shù)據(jù)指示正常大鼠中的PKCα抑制導(dǎo)致正心臟收縮變力性(收縮)和變松作用(松弛)。LY338522，一種LY333531的活性代謝物，也已經(jīng)顯示在抑制PKC異構(gòu)體中是有效的。
圖41為了說(shuō)明PKCα在心肌梗塞模型中的體內(nèi)功效，Ro-31-8220，3-[1-[3-(脒基硫)丙基-1H-吲哚-3-yl]-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-yl)馬來(lái)酰亞胺，雙吲哚亞醯銨IX，甲磺酸，一種已知的PKC抑制劑被灌注進(jìn)大鼠(n＝4)中，大鼠經(jīng)受外科手術(shù)以誘導(dǎo)心肌梗塞(MI大鼠)。Ro-31-8220被溶解于20％丁基磺酸鈉-B-環(huán)糊精鈉鹽(Captisol)，50mM的乙酸緩沖液中，pH5.0。Ro-31-8220如實(shí)驗(yàn)部分描述的那樣被體內(nèi)遞送。灌注Ro-31-8220導(dǎo)致最大dP/dt百分比增加(21％)劑量依賴(lài)性的增強(qiáng)，它在300nmol/kg/min劑量下達(dá)到統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異(P＜0.05)(圖41；單因素ANOVA和Dunnett’s Multiple Comparisons事后檢驗(yàn))。圖41顯示施用10、30、100、300和1000nmol/kg/min的Ro-81-8220后，最大dP/dt對(duì)基線(xiàn)(B/L)的百分比增加，這被指示在橫坐標(biāo)上。然后藥物停止5分鐘(P/D)，多巴酚丁胺(Dob)被以5.0μg/kg/min施用5分鐘。這些數(shù)據(jù)指示PKCα抑制引起大鼠心力衰竭模型中的正收縮變力效果。灌注Ro-31-8220后觀(guān)察到的收縮變力有益效果大于施用多巴酚丁胺后所觀(guān)察到的有意效果，多巴酚丁胺是一種在A(yíng)DHF中臨床施用的正性肌力藥。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明遞送PKCα抑制劑到受心肌收縮或松弛功能不良的患者中，例如在A(yíng)DHF中觀(guān)察到的結(jié)果，將提供對(duì)這些患者的一種功能性的有益效果，一種醫(yī)學(xué)治療理想的結(jié)果。
除非另外指明，所有包括數(shù)量、百分比、分?jǐn)?shù)和比例的量均被理解成由詞“約”所修飾，并且量不旨在表示有效數(shù)字。
除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”和“所述”是指“一個(gè)或多個(gè)”。
所有引用文獻(xiàn)的相關(guān)部分均引入本文以供參考，任何文獻(xiàn)的引用不可解釋為是對(duì)其作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的認(rèn)可。
盡管已用具體實(shí)施方案來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，但對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不背離本發(fā)明的精神和保護(hù)范圍的情況下可作出許多其它的變化和修改。因此，附錄的權(quán)利要求書(shū)旨在包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。
序列表<110>兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心(Children’s Hospital Medical Center)辛辛納提大學(xué)(University of Cincinnati)J.D.莫爾肯廷(Molkentin，Jeffery D)E.G.克拉尼斯(Kranias，Evangelia G)<120>心肌收縮性和心力衰竭傾向的調(diào)節(jié)<130>9761M#L<140>未知<141>2004-09-17<150>US 60/503,853<151>2003-09-19<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2841<212>DNA<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)<220>
<221>CDS<222>(205)..(2223)<400>1gcgagcgaga gagagccagc gagcggctcc ggctccgcgc cgcgccgcgc ccgctcgcct 60ctccccggcc gccgccgcct ccagcccgcg ccccgcgccg gggtcgcccc tcgccccgcc 120gcccctcccc cgcccgcccc cgcccacccc ggccctcgcc ggctgccgct ccccggcgga 180ggcaagaggt ggttgggggg gacc atg gct gac gtt ttc ccg gcc aac gac 231Met Ala Asp Val Phe Pro Ala Asn Asp1 5tcc acg gcg tct cag gac gtg gcc aac cgc ttc gcc cgc aaa ggg gcg279Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala10 15 20 25
ctg agg cag aag aac gtg cac gag gtg aaa gac cac aaa ttc atc gcg327Leu Arg Gln Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala30 35 40cgc ttc ttc aag cag ccc acc ttc tgc agc cac tgc acc gac ttc atc375Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile45 50 55tgg ggg ttt ggg aag caa ggc ttc cag tgc caa gtt tgc tgt ttt gtg423Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val60 65 70gtt cac aag agg tgc cat gaa ttt gtt acc ttt tct tgt ccg ggt gcg471Val His Lys Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala75 80 85gat aag gga cct gac act gat gac ccc agg agc aag cac aag ttt aaa519Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys90 95 100 105atc cac acc tac ggg agc ccc acc ttc tgc gat cac tgt ggg tca ctg567Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu110 115 120ctg tac gga ctc atc cac cag ggg atg aaa tgt gac acc tgc gac atg615Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met125 130 135aac gtt cac aag cag tgt gtg atc aat gtc ccc agc ctg tgt ggg atg663Asn Val His Lys Gln Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met140 145 150gac cat acg gag aag agg gga cgg atc tac ctg aag gcc gag gtc acc711Asp His Thr Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr155 160 165gat gaa aag ctc cac gtc acg gta cga gat gca aaa aac ctg atc ccc759Asp Glu Lys Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro170 175 180 185atg gat ccc aac ggg ctt tca gat ccc tac gtg aag ctg aaa ctc att807Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile190 195 200
cct gat ccc aag aat gaa agc aaa caa aaa acc aaa acc atc cgc tcc 855Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser205 210 215acg ctg aac ccg cag tgg aac gaa tcc ttt acc ttc aaa tta aaa ccc 903Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro220 225 230tcc gac aaa gac cga cga ctg tct gta gaa atc tgg gac tgg gac cga 951Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg235 240 245aca aca agg aat gac ttc atg ggg tcg ctc tcc ttt ggc gtc tcg gag 999Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu250 255 260 265ctc atg aag atg cca gcc agt gga tgg tac aag ttg ctg aac caa gaa1047Leu Met Lys Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu270 275 280gaa ggt gaa tac tac aat gtg ccc att ccg gaa ggg gac gaa gat ggg1095Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Asp Gly285 290 295aac gtg gag ctc agg cag aaa ttc gag aaa gcc aag ctg ggg ccc gct1143Asn Val Glu Leu Arg Gln Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala300 305 310ggc aac aag gtg atc agt ccc tcg gaa gac agg aag cag ccg tcc aac1191Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn315 320 325aac ctg gac cga gtg aag ctc acc gac ttc aac ttc ctc atg gtc ctg1239Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu330 335 340 345gga aaa ggc agt ttt ggg aag gtg atg ctg gcg gac agg aag ggc acg1287Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr350 355 360gaa gag ctg tac gcc atc aag atc ctg aag aag gac gtg gtg att cag1335Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln365 370 375
gat gac gac gtg gag tgc acc atg gtg gag aag cgg gtt ctg gcc ctg1383Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu380 385 390atg gac aag ccg ccc ttc ctg aca cag ctg cac tcc tgc ttc cag acc1431Met Asp Lys Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr395 400 405gtg gac cgg ctg tac ttt gtc atg gaa tac gtc aac ggc gga gac ctc1479Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu410 415 420 425atg tac cac atc cag caa gtg gga aag ttc aag gag cca caa gca gta1527Met Tyr His Ile Gln Gln Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val430 435 440ttc tat gca gca gag att tcc att ggg ctg ttc ttc ctt cac aaa aga1575Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg445 450 455ggg atc atc tat agg gac ctg aag cta gat aac gtc atg ctg gac tcg1623Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser460 465 470gaa gga cac atc aaa atc gct gac ttt ggg atg tgc aag gaa cac atg1671Glu Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met475 480 485atg gac ggg gtc acc acc agg acc ttc tgt ggg act cca gat tac atc1719Met Asp Gly Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile490 495 500 505gcc ccg gag atc atc gct tat cag ccg tac ggc aaa tcc gtg gac tgg1767Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp510 515 520tgg gcc tac ggc gtc ctg ctg tat gag atg ctg gct ggg cag cct cca1815Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro525 530 535ttt gat ggc gag gac gaa gac gag ctg ttt cag tcc atc atg gag cac1863Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His540 545 550
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agatgcgaaa gtgaacctgc cccagcctgg tgggccggaa gcacctccaa ccaggaggta 2673aaggaatggg gagcccggag aggggcgggg gaggtctgcg agctgccgac cacggtctgt 2733gcctcggtgg aaacgaccga ccccctgggt gtgagaggcc gggacaagac tacttactat 2793tccccgacat cgacacggcg tcaccaactc tagcccagct tccaaaac 2841<210>2<211>672<212>PRT<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)<400>2Met Ala Asp Val Phe Pro Ala Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val1 5 10 15Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His20 25 30Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr35 40 45Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly50 55 60Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu65 70 75 80Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp85 90 95Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro100 105 110Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln115 120 125Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val130 135 140Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly
145 150 155 160Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr Asp Glu Lys Leu His Val Thr165 170 175Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser180 185 190Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser195 200 205Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn210 215 220Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu225 230 235 240Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met245 250 255Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser260 265 270Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val275 280 285Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Asp Gly Asn Val Glu Leu Arg Gln Lys290 295 300Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro305 310 315 320Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu325 330 335Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys340 345 350Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys355 360 365Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr370 375 380
Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Met Asp Lys Pro Pro Phe Leu385 390 395 400Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val405 410 415Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val420 425 430Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser435 440 445Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu450 455 460Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala465 470 475 480Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg485 490 495Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr500 505 510Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu515 520 525Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp530 535 540Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser545 550 555 560Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His565 570 575Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg580 585 590Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg595 600 605Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu610 615 620
Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Val Thr Pro Pro625 630 635 640Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe645 650 655Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ser Val660 665 670<210>3<211>2465<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(163)..(2181)<400>3gcgagcgaga gagagccagc gagcggctcc ggctccgcgc cgcgccgcgc ccgctcgcct 60ctccccggcc gccgccgcct ccagcccgcg ccccgcgccg gggtcgcccc tcgccccgcc120cgcagcgagc cagagagccg gagagagcag agagagcggc tc ggc tcc cag ctc 174Gly Ser Gln Leu1gag tgg cgc agg ccg ccc ggt ctc cgg ccc gcg cac acg atc tac acg 222Glu Trp Arg Arg Pro Pro Gly Leu Arg Pro Ala His Thr Ile Tyr Thr5 10 15 20cac tgg cgc ggc cgc cac cgc tct gtg tcc ggc gga ggc agg agg tgg 270His Trp Arg Gly Arg His Arg Ser Val Ser Gly Gly Gly Arg Arg Trp25 30 35ttg ggg gga acc atg gct gac gtt tac ccg gcc aac gac tcc acg gcg 318Leu Gly Gly Thr Met Ala Asp Val Tyr Pro Ala Ash Asp Ser Thr Ala40 45 50tct cag gac gtg gcc aac cgc ttc gcc cgc aaa ggg gcg ctg agg cag 366Ser Gln Asp Val Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln55 60 65
aag aac gtg cat gag gtg aaa gac cac aaa ttc atc gcc cgc ttc ttc414Lys Asn Val His Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe70 75 80aag caa ccc acc ttc tgc agc cac tgc acc gac ttc atc tgg ggg ttt462Lys Gln Pro Thr Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe85 90 95 100ggg aaa caa ggc ttc cag tgc caa gtt tgc tgt ttt gtg gtt cat aag510Gly Lys Gln Gly Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys105 110 115agg tgc cat gag ttc gtt acg ttc tct tgt ccg ggt gcg gat aag gga558Arg Cys His Glu Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly120 125 130cct gac act gac gac ccc agg agc aag cac aag ttc aaa atc cac aca606Pro Asp Thr Asp Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr135 140 145tac gga agc cct acc ttc tgt gat cac tgt ggg tcc ctg ctc tat gga654Tyr Gly Ser Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly150 155 160ctt atc cac caa ggg atg aaa tgt gac acc tgc gac atg aat gtt cac702Leu Ile His Gln Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His165 170 175 180aag cag tgt gtg atc aat gtc cct agc ctc tgc gga atg gat cac aca750Lys Gln Cys Val Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr185 190 195gag aag agg ggg cgg att tat ctg aag gct gag gtc act gat gaa aag798Glu Lys Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Thr Asp Glu Lys200 205 210ctc cac gtc acg gta cga gat gca aaa aat cta atc cct atg gat cca846Leu His Val Thr Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro215 220 225aat ggg ctt tcg gat cct tat gtg aag ctg aaa ctt atc cct gac ccc894Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro230 235 240
aag aat gag agc aaa cag aaa acc aaa acc atc cgc tcc aca ctg aat 942Lys Asn Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn245 250 255 260cct cag tgg aat gag tcc ttc acg ttc aaa tta aaa cct tca gac aaa 990Pro Gln Trp Asn Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys265 270 275gac cgg cga ctg tct gta gaa atc tgg gac tgg gat cgg acg act cgg1038Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg280 285 290aat gac ttc atg gga tcc ctt tcc ttt ggt gtc tca gag cta atg aag1086Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys295 300 305atg ccg gcc agt gga tgg tat aaa ctg ctc aac caa gaa gag ggc gaa1134Met Pro Ala Ser Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu310 315 320tat tac aat gtg ccc att cca gaa gga gat gaa gaa ggc aac atg gaa1182Tyr Tyr Asn Val Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly Asn Met Glu325 330 335 340ctc agg cag aag ttt gag aaa gcc aag cta ggc cct gct ggt aac aaa1230Leu Arg Gln Lys Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys345 350 355gtc atc agc cct tca gaa gac aga aag caa cca tcc aac aac ctg gac1278Val Ile Ser Pro Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp360 365 370aga gtg aaa ctc aca gac ttc aac ttc ctc atg gtg ctg ggg aag ggg1326Arg Val Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly375 380 385agt ttt ggg aag gtg atg ctt gct gac agg aag gga acg gag gaa ctg1374Ser Phe Gly Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu390 395 400tac gcc atc aag atc ctg aag aag gac gtg gtg atc cag gac gac gac1422Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp405 410 415 420
gtg gag tgc acc atg gtg gag aag cgc gtg ctg gcc ctg ctg gac aag1470Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys425 430 435ccg cca ttt ctg aca cag ctg cac tcc tgc ttc cag aca gtg gac cgg1518Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg440 445 450ctg tac ttc gtc atg gaa tac gtc aac ggc ggg gac ctc atg tac cac1566Leu Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His455 460 465att cag caa gtc gga aaa ttt aag gag cca caa gca gta ttc tac gca1614Ile Gln Gln Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala470 475 480gcc gag atc tcc atc gga ctg ttc ttc ctt cat aaa aga ggg atc att1662Ala Glu Ile Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile485 490 495 500tac agg gat ctg aag ctg gac aat gtc atg ctg gac tca gaa ggg cac1710Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His505 510 515atc aaa atc gcc gac ttc ggg atg tgc aag gaa cac atg atg gat gga1758Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly520 525 530gtc acg acc agg acc ttc tgt ggg act ccg gac tac att gcc cca gag1806Val Thr Thr Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu535 540 545ata atc gct tac cag ccg tac ggg aag tct gta gat tgg tgg gcg tac1854Ile Ile Ala Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr550 555 560ggt gtg ctg ctg tac gag atg cta gcc ggg cag cct ccg ttt gat ggt1902Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly565 570 575 580gaa gat gaa gat gaa ctg ttt cag tct ata atg gag cac aac gtg tcc1950Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser585 590 595
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Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ala Val660 665 670<210>7<211>2019<212>DNA<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)<220>
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gaagtggtgg tgtaggaaag tcaggacttc acatagaagc ctagcccaca ccagaaatga 5400cagacagatc cctcctatct cccccataag agtttgagtc gac544權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因小鼠，所述轉(zhuǎn)基因小鼠在至少一個(gè)細(xì)胞的基因組中包含至少一個(gè)穩(wěn)定摻入的表達(dá)彈夾，所述表達(dá)彈夾包含一種心臟組織優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列可操作地連接到相關(guān)的核苷酸序列，所述相關(guān)核苷酸序列選自(a)序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的核苷酸序列；(b)具有與序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的核苷酸序列至少約90％同一性的核苷酸序列；(c)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有序列標(biāo)識(shí)號(hào)2的氨基酸序列；(d)編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有與序列標(biāo)識(shí)號(hào)2中闡明的氨基酸序列至少約90％的同一性；(e)包含與序列標(biāo)識(shí)號(hào)1中闡明的核苷酸序列相鄰的至少約50個(gè)核苷酸的核苷酸序列；(f)在嚴(yán)緊條件下雜交到序列標(biāo)識(shí)號(hào)1中闡明的核苷酸序列的核苷酸序列；(g)序列標(biāo)識(shí)號(hào)7中闡明的核苷酸序列；和(h)由(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、或(g)中任何一種核苷酸序列的補(bǔ)充組成的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中包含心臟組織優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列的表達(dá)彈夾被可操作地連接到序列標(biāo)識(shí)號(hào)1的核苷酸序列。
3.一種鑒定調(diào)節(jié)心肌收縮能力的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將化合物與蛋白致活酶C-α蛋白接觸；(b)測(cè)定是否所述化合物結(jié)合蛋白致活酶C-α；和(c)鑒定那些結(jié)合蛋白致活酶C-α的化合物作為心肌收縮能力的調(diào)節(jié)子。
4.一種鑒定調(diào)節(jié)心肌病的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將化合物與蛋白致活酶C-α蛋白接觸；(b)測(cè)定是否所述化合物結(jié)合蛋白致活酶C-α；和(c)鑒定那些結(jié)合蛋白致活酶C-α的化合物作為心肌病的調(diào)節(jié)子。
5.如權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法，其中所述蛋白致活酶C-α蛋白在細(xì)胞中被表達(dá)，并且所述調(diào)節(jié)子的效果以所述蛋白致活酶C-α活性與不接觸所述化合物的細(xì)胞相比發(fā)生的變化進(jìn)行測(cè)量。
6.如權(quán)利要求3或5所述的方法，所述方法還包括以下步驟(a)選擇那些調(diào)節(jié)蛋白致活酶C-α蛋白活性的化合物，并且進(jìn)一步測(cè)定是否那些化合物調(diào)節(jié)心肌收縮能力模型體系中的心肌收縮能力；和(b)鑒定那些在心肌收縮能力模型體系中調(diào)節(jié)心肌收縮能力的測(cè)試化合物作為用以調(diào)節(jié)心肌收縮能力的候選化合物。
7.如權(quán)利要求4或5所述的方法，所述方法還包括以下步驟(a)選擇那些調(diào)節(jié)蛋白致活酶C-α蛋白活性的化合物，并且進(jìn)一步測(cè)定是否那些化合物調(diào)節(jié)心肌病模型體系中的心肌??；和(b)鑒定那些在所述心肌病模型體系中調(diào)節(jié)心肌病的測(cè)試化合物作為用以調(diào)節(jié)心肌病的候選化合物。
8.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因小鼠或它們的細(xì)胞或組織在權(quán)利要求5、6或7中任一項(xiàng)所述的方法中作為所述模型體系的應(yīng)用。
9.一種轉(zhuǎn)基因小鼠，所述轉(zhuǎn)基因小鼠在至少一個(gè)細(xì)胞的基因組中包含至少一個(gè)斷裂的蛋白致活酶C-α基因，所述斷裂足以降低蛋白致活酶C-α的表達(dá)水平。
10.一種蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物在制造用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中被心肌收縮能力調(diào)節(jié)的失調(diào)的藥物中的應(yīng)用。
11.一種蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物在制造用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的心肌病的藥物中的應(yīng)用。
12.一種蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物在制造用于治療或預(yù)防有此需要的哺乳動(dòng)物中的急性心力衰竭的藥物中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求10、11或12中的任一項(xiàng)所述的蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物的應(yīng)用，其中所述蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物是一種選自Ro-32-0432、LY333531和Ro-31-8220的蛋白致活酶C-α抑制劑。
14.一種在需要治療的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防由心肌收縮能力調(diào)節(jié)的失調(diào)的方法，所述方法包括(a)鑒定需要治療或預(yù)防由心肌收縮能力調(diào)節(jié)的失調(diào)的動(dòng)物；和(b)施用蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物給所述哺乳動(dòng)物。
15.一種在需要治療的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防心肌病的方法，所述方法包括(a)鑒定需要治療或預(yù)防心肌病的動(dòng)物；和(b)施用蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物給所述哺乳動(dòng)物。
16.一種在需要治療的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防急性心力衰竭的方法，所述方法包括(a)鑒定需要治療或預(yù)防急性心力衰竭的動(dòng)物；和(b)施用蛋白致活酶C-α調(diào)節(jié)化合物給所述哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明的方法和組合物用于在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中改變PKCα的表達(dá)。本發(fā)明的組合物包括分離的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因組織、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯示具有改變的PKCα活性。所述方法可以產(chǎn)生具有改變的PKCα表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明可以進(jìn)行心肌收縮能力的調(diào)節(jié)。具體地講，本發(fā)明提供一種改變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)心肌病易感性的方法。一種本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于鑒定抗心肌病化合物。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1950502SQ200480026359
公開(kāi)日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月19日
發(fā)明者J·D·莫爾肯廷, E·G·克拉尼斯 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心, 辛辛納提大學(xué)