專利名稱：細胞對表面的附著的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在培養(yǎng)期間能夠附著并維持細胞的微載體領域。更具體的說，本發(fā)明涉及的微載體由包被有增強細胞附著的化合物的多孔基質組成。本發(fā)明也包括制備這種微載體和進行細胞培養(yǎng)的方法。
背景使用微載體支持體促進生物細胞生長已有長期且變更的歷史。早期這種使細胞生長到可用數(shù)量的系統(tǒng)包括各種器皿和燒瓶。有意通過提高培養(yǎng)表面積而提高單位器具體積細胞生產(chǎn)量的努力導致了大盤子的使用。一些這種早期細胞生長系統(tǒng)仍然在小規(guī)模、大勞動量的細胞培養(yǎng)方法即足夠的場所使用，例如在醫(yī)院和大學中。
但是，需要有其它方法用以大規(guī)模培養(yǎng)細胞。一種普遍的細胞培養(yǎng)方法是滾瓶系統(tǒng)。本質上，一個滾瓶就是一個裝有小量營養(yǎng)培養(yǎng)基的圓筒狀容器。操作中，滾瓶沿著其縱軸線緩慢旋轉，使得營養(yǎng)培養(yǎng)基持續(xù)浸潤瓶的整個內(nèi)表面，而細胞就在這個表面上生長?？稍跐L瓶架上操作許多滾瓶。
另一種普遍的方法是微載體系統(tǒng)。盡管近年來已經(jīng)引入了其它技術例如膜系統(tǒng)，但微載體系統(tǒng)仍表現(xiàn)為最被廣泛采用的方法，其中貼壁細胞的生長可以達到商業(yè)上有利的生產(chǎn)率。以這種方式進行的大規(guī)模培養(yǎng)優(yōu)于通過復制如滾瓶系統(tǒng)和其它已知系統(tǒng)進行的大規(guī)模培養(yǎng)。另外，微載體生物反應器系統(tǒng)也適于貼壁細胞的大規(guī)模自動化培養(yǎng)。
微載體的發(fā)展開始于20世紀六十年代末，當時證明在混懸培養(yǎng)模式下，葡聚糖珠可以作為貼壁細胞生長的基質。最早的微載體是基于利用普通的陽離子、強堿性、離子交換基團，例如二乙基氨基乙烷(DEAE)。自此以后，作為微載體已成功使用了許多不同的材料，包括玻璃、聚苯乙烯塑料、丙稀酰胺、固體膠原、多孔膠原、纖維素和液體碳氟化合物。
通過共價鍵或非共價鍵將一個或多個黏著肽附著到表面的微載體也被建議使用。例如，美國專利號4,578,079(La Jolla ResearchFoundation)公開了一種示例性組合物，當其固定到基質上時將促進細胞的附著。這種公開的組合物是纖連蛋白的一個小片段，更具體的是包括連接到至少一個其他氨基酸上的Asp-Gly-Asp序列的多肽片段。因此，公開的四肽組合物具有與纖連蛋白基本相同的細胞附著活性，這種附著活性基于生物特異性親和相互作用。這種組合物的明顯缺點是其具有的生物活性，指在例如制藥工業(yè)或診斷產(chǎn)業(yè)的某些應用中，例如由于混入工藝流中而存在的生物活性可能是非所需的。根據(jù)說明書在實驗中鑒別了4,578,079中要求保護的片段，其中設計是用于選擇性合成比先前顯示細胞活性片段更小的肽。在4,578,079中陳述了測定顯示出活性最小片段的這種方法。此外，作為上述討論的’079的繼續(xù)的美國專利6,180,610推斷盡管四肽是決定性的，但多肽最適宜的大小是包括定義的四肽的六肽。
也已經(jīng)知道單個氨基酸可用以提供與所需靶分子作用的基團，如在層析中。例如弱陰離子交換劑Arginine SepharoseTM(精氨酸瓊脂糖)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)由主要通過其α-氨基偶聯(lián)到顆粒狀瓊脂糖基質的Arg氨基酸所組成。因此，商業(yè)上將精氨酸瓊脂糖TM作為層析凝膠提供，其中顆粒平均大小總體上基本小于微載體要求的尺度。
已經(jīng)出現(xiàn)了其它增強微載體的細胞附著性質的包被材料。例證性實例是CytodexTM1(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，其由交聯(lián)葡聚糖基質組成，其上包被有一種已知的靜電結合細胞的聚陽離子包被材料即二乙基氨基乙烷(DEAE)纖維素。但是這種細胞附著和生長性質并不是對所有類型的細胞都是最適合的，例如低鋪板率(plating-efficiency)細胞或分化型細胞或敏感型細胞。因此仍然需要改進的可選擇的微載體類型。
為進一步改進細胞附著性質，已經(jīng)出現(xiàn)了包被有更復雜化合物的微載體。例證性實例是類似于CytodexTM1的CytodexTM3(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，由一種交聯(lián)葡聚糖基質組成，但是基質包被一層酸變性的豬膠原。但是源自哺乳動物的膠原可限制CytodexTM3在某些方面的應用。
美國專利6,214,618涉及用于細胞培養(yǎng)的微載體珠，并更具體的說，涉及在這類產(chǎn)物中避免動物蛋白的問題。推薦的解決方案是用酸性溶液洗滌苯乙烯共聚物和表面的三甲胺組成的微載體珠，使該微載體珠適合細胞培養(yǎng)。
美國專利6,378,527(Chondros Inc.)涉及到一種手術操作，其中將病人的軟骨細胞取出并快速增殖然后再移植入所述病人體內(nèi)用于修復軟骨。為增殖軟骨細胞，這些細胞被培養(yǎng)、涂平板并最后生長到包含一種多糖衍生物的支架上，該衍生物通過多糖如葡聚糖和聚胺交聯(lián)得到。更具體的說，該多糖首先被氧化成二醛衍生物，然后與無毒聚胺反應以形成亞胺交聯(lián)結構，這個交聯(lián)結構可進一步加氫形成更加穩(wěn)定的胺鍵。公開的微載體的一個優(yōu)點在于其使軟骨細胞增殖和II型膠原形成。另一優(yōu)點在于當其在體外應用時，該微載體將降解為無毒成分而留下軟骨細胞在原位形成軟骨組織。
顯然，仍需要有可選的和/或改進的用于細胞培養(yǎng)的微載體，同時也需要有新穎的制備這種微載體的方法。也更廣泛的需要改進細胞和其它表面間的相互作用。這包括將分析表面用于多種應用例如藥物篩選、生物活性化合物研究、細胞表面受體研究和環(huán)境污染物監(jiān)測中。
發(fā)明簡述本發(fā)明一方面提供一種使細胞附著和細胞培養(yǎng)的新型微載體。根據(jù)本發(fā)明這可通過將陽離子化合物經(jīng)胍基(例如基于電荷相互作用)固定到微載體表面實現(xiàn)。
本發(fā)明另一方面提供一種用于細胞附著和培養(yǎng)的微載體，其不含有任何得自哺乳動物的產(chǎn)物。
本發(fā)明的又一方面提供用于細胞附著和培養(yǎng)的微載體，其毒性和污染物容易控制。
本發(fā)明另外的方面提供制備使細胞附著和細胞培養(yǎng)的新型聚陽離子微載體的方法。根據(jù)本發(fā)明這可通過一種方法實現(xiàn)，其中包含至少一個胍基的化合物與一個環(huán)氧化物激活的基質表面接觸，從而固定于其表面。
本發(fā)明又一個另外的方面提供細胞培養(yǎng)方法，其中在一個或多個包被了陽離子化合物的微載體表面在提供生存力的環(huán)境下培養(yǎng)細胞，所述細胞經(jīng)陽離子包被提供的胍基附著于微載體。
本發(fā)明進一步的方面及優(yōu)點將在下文中詳述。
附圖簡述

圖1顯示了實施例1中解釋的本發(fā)明微載體上非洲綠猴腎細胞株系細胞(Vero細胞)培養(yǎng)中細胞數(shù)目如何隨培養(yǎng)時間而變化。
圖2顯示了實施例1中解釋的本發(fā)明微載體上非洲綠猴腎細胞株系細胞(Vero細胞)培養(yǎng)中細胞數(shù)目如何隨培養(yǎng)時間而變化。
定義本文所用術語“微載體”以其常規(guī)含義用于支持細胞培養(yǎng)的顆粒狀物質。因此，在本申請中，術語“微載體”用于指，其表面上固定有能使細胞附著的化合物的基質。
術語“聚陽離子”微載體是指微載體表面的凈電荷為正電荷。
術語“基質”是指載體的核心，即可附著細胞的物質。
術語基質的“表面”包括基質的外表面以及，如果基質多孔還包括孔表面。
發(fā)明詳述本發(fā)明的第一個方面涉及一種微載體，陽離子化合物經(jīng)胍基固定到其表面。在上下文中，應理解術語“化合物”指被固定于微載體表面的一定量的所述化合物，而不是其單個分子。因此，由于每個微載體都固定優(yōu)選包被有多個所述化合物分子，所以每個微載體將呈現(xiàn)出凈正電荷，并因此可稱為“聚陽離子”。
在一個實施方案中，本發(fā)明微載體能夠通過陽離子化合物與細胞間的電荷相互作用附著細胞。在上下文中，應理解“附著”指細胞被良好錨定足以使細胞生存。在一個實施方案中，陽離子化合物與蛋白相互作用，優(yōu)選與色氨酸側鏈相互作用。在另一實施方案中，這種相互作用是上述情況的混合。
通過轉移固定到基質表面以提供包被的本發(fā)明陽離子化合物，其本質上無反應活力，這意味著實際上它與細胞接觸但不在任何實質水平上參與與其它物質的反應。此外，該化合物是生物可容的，也就是它對接觸到的細胞和環(huán)境中的其它生物物質沒有有害作用。因此該化合物是無毒的。在上下文中出現(xiàn)的細胞的“附著”，也被稱為細胞的錨定，是指細胞的結合強度足以進行培養(yǎng)。
眾所周知，細胞通常不能在高pH環(huán)境下存活。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明微載體的表面pH約為7。在一個特定實施方案中，固定的陽離子化合物在基質上形成弱堿性包被。
在本發(fā)明微載體優(yōu)選實施方案中，固定的化合物包含一個或兩個氨基酸。在一個有利的實施方案中，化合物包含一個特征為不能改變電荷及不與酸性部分自催化形成酰胺鍵的氨基酸。在一個特定實施方案中，氨基酸的氨基基團有反應活性并能夠通過形成氨基甲酸酯改變電荷。
在一個實施方案中，固定的化合物包含除賴氨酸(Lys)外的任何單氨基酸。為了給微載體表面提供上述弱堿性包被，固定化合物可包含一個或多個堿性氨基酸。因此，在一個有利實施方案中，化合物是精氨酸(Arg)。由于Arg的酸性羧酸酯基團，這個實施方案為細胞培養(yǎng)提供了與上述市售DEAE-包被的微載體相比具更低的表面pH，并結果是更適宜pH的微載體。一個特定實施方案是固定有基于精氨酸化合物的微載體，優(yōu)選固定附著有緩沖基團的精氨酸。這樣一個化合物可用通式Arg-X定義，其中X是一個緩沖酸性基團。在另一個實施方案中，化合物由兩個或更多不同氨基酸組成，因而在基質表面將固定有兩個或更多不同配基。例如，化合物可由精氨酸和天冬氨酸的混合物組成。
在一個可選擇的實施方案中，固定的化合物是，或者包含二肽。因此，在一個實施方案中，二肽是精氨酸-谷氨酸(Arg-Glu)或精氨酸-天冬氨酸(Arg-Asp)。但是，也可考慮其它二肽，只要它們提供給微載體為細胞附著和生長所需的本文公開的性質。在一個特定實施方案中，一個或多個附加基團例如緩沖基團，可連接到二肽上。
因此，概括來說，在一個實施方案中，固定化合物選自單個氨基酸例如Arg；兩個氨基酸的混合物，例如Arg和Asp；或者二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。在最優(yōu)實施方案中，固定化合物選自單個氨基酸，例如Arg；和二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。
本發(fā)明所用的氨基酸和二肽易于從商業(yè)來源獲得，例如得自Merck(精氨酸Merck ref.797；Arg-GluMerck ref.798)。可選擇的，其由本領域技術人員使用熟知的重組或化學技術例如固相合成來制備它們。簡而言之，通過與保護的α氨基酸偶聯(lián)從肽的C末端起始固相合成得到適當?shù)臉渲蝗鐓⒁娒绹鴮＠?,244,946號。
因此，固定到本發(fā)明微載體基質上的化合物約為一個氨基酸大小，或者可能是偶聯(lián)成二肽的兩個氨基酸?？紤]到上述美國專利4,578,079號(La Jolla Researsh Foundation)的結論，也就是纖連蛋白的最小可能片段應是四肽或優(yōu)選甚至六肽，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)顯然是出乎意料的。
另外，本發(fā)明的微載體與細胞的附著作用顯然是基于電荷相關相互作用，因此化合物為正電荷從而使帶負電荷的細胞能夠附著。這與上述’079中討論的纖連蛋白片段例如Arg-Gly-Asp不同，其如本文所述有與纖連蛋白基本相同的生物特異親和細胞附著活力。
在本發(fā)明微載體的一個可選擇的實施方案中，固定化合物包含嘌呤，或者嘌呤的混合物。在一個具體實施方案中，嘌呤是腺嘌呤或鳥嘌呤。因此，化合物可包含核苷酸或核苷酸相關化合物。
因為每個胍基輔助細胞結合，所以固定在基質表面的化合物可被認為是一個配基，其功能團就是胍基。在微載體的一個具體實施方案中，配基濃度范圍為0.1-3.0μmol/mg微載體干重。因此，在例證性實施方案中，配基濃度為如0.2、0.4、0.7、1.2、2.5或3.0μmol/mg微載體干重。在一個具體實施方案中，固定化合物是Arg，配基濃度約為0.7μmol/mg微載體干重。在一個可選擇的實施方案中，固定化合物是一個二肽，配基濃度約為相同量。本發(fā)明微載體的一個例證性重量密度范圍為1.02-1.05g/cm3，但是更重或更輕的物質可能更適合于具體應用。
在一個有利的實施方案中，本發(fā)明微載體的基質是交聯(lián)的糖，或者包含這種糖的必需部分。在一個具體實施方案中，制備微載體的原料選自瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、魔芋、角叉藻聚糖、胞外多糖和藻酸鹽。因此在一個有利的實施方案中，本發(fā)明微載體是凝膠。在最有利的實施方案中，微載體表現(xiàn)多孔結構，這樣促使細胞生長進入到顆粒中，同時也提供最大量的可用營養(yǎng)物。
本發(fā)明微載體原料可通過標準方法方便的制得，例如反轉混懸凝膠化(inverse suspension gelation)(S HjertenBiochim Biophys Acta79(2)，393-398(1964))?？蛇x擇的，基礎基質為商業(yè)上可得的產(chǎn)品，例如SepharoseTMFF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。平均上，本發(fā)明微載體平均顆粒大小為40-300μm，例如100-250μm，例如約230μm(在0.9％NaCl中)。在最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明微載體至少約為170μm(在0.9％NaCl中)。
在一個可選擇的實施方案中，本發(fā)明微載體包含交聯(lián)的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等，它們可自身進行修飾以實現(xiàn)化合物的最優(yōu)固定即配基偶聯(lián)，和細胞培養(yǎng)。
在本發(fā)明微載體的最有利實施方案中，化合物通過仲胺固定到基質表面上。有關用于制備本發(fā)明微載體的方法的進一步細節(jié)將在下文本發(fā)明第二方面描述中提供。
本發(fā)明也包括上述用于細胞培養(yǎng)微載體的應用。因此，本發(fā)明一個方面提供了由上述權利要求中任一項的至少一種微載體組成的細胞培養(yǎng)支持物。
本發(fā)明第二方面涉及到制備聚陽離子微載體的方法，通過使一種至少含一個胍基的化合物與一個經(jīng)環(huán)氧化物活化的基質結合，以固定該化合物。環(huán)氧化物活化可為堿性例如pH 9或酸性催化。在這個領域中，基質的環(huán)氧化物活化是熟知的并是普遍使用的固定技術；參見Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Greg T.Hermanson，A. Krishna Mallia和Paul K. Smith，Academic Press，INC，1992。固定在一個控制pH的溶液里進行最為有利。關于通過本發(fā)明的方法來制備微載體的更多細節(jié)可在上文中本發(fā)明的第一方面相關內(nèi)容中找到。
基質可以是上述原料中的任何一種，例如由一種交聯(lián)聚糖制成的基本上球狀多孔珠。在上述環(huán)氧化物活化的一個步驟里，糖類基質被烯丙基化，例如下文實驗說明部分所述。相反的，如果基質由合成的聚合物制成，那么烯丙基一般已經(jīng)存在于基質中，因此不需要烯丙基化步驟。
固定化合物也可如本發(fā)明第一方面所描述。因此在一個實施方案中，固定化合物選自單個氨基酸，例如Arg；兩個氨基酸的混合物，例如Arg和Asp；或者二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。在最優(yōu)實施方案中，固定化合物選自單個氨基酸，例如Arg；和二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。
在固定化合物是一個二肽的情況下，偶聯(lián)可以是在含有兩種氨基酸的溶液里發(fā)生的轉移反應，即第一個氨基酸然后第二個氨基酸的逐步偶聯(lián)反應。將化合物固定到本發(fā)明種類的支持物表面的方法，是本領域技術人員所熟知的。
第三方面，本發(fā)明涉及到使細胞附著于表面的方法，其中包含至少一個胍基的陽離子化合物被用來使細胞附著于所述表面。在一個實施方案中，附著作用是通過電荷作用進行的。在最優(yōu)選的實施方案中，化合物是精氨酸(Arg)。表面可以是如微載體表面、膜表面、織物表面、芯片例如微芯片表面、毛細管例如微毛細管表面或者導管表面。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的表面是一個織物表面，在附著細胞后可用于多種用途。本發(fā)明的方法可用于如生產(chǎn)過程中的分析目的，和/或用于治療用途，如用于治療灼傷病人的薄紗(tissue)。
另外，本發(fā)明涉及到為高通量篩選(HTS)定位細胞方法，包括與上文本發(fā)明第三方面一致的限定的方法。
第四方面，本發(fā)明涉及到細胞培養(yǎng)方法，其中細胞在一個或多個包被了一種陽離子化合物的微載體表面于提供生存條件的環(huán)境下培養(yǎng)，所述細胞通過陽離子包被提供的胍基附著到微載體上。在一個實施方案中，細胞附著基于電荷相互作用。在最有利的實施方案中，微載體為如上文所述。在這個上下文里，技術人員將理解提供生存條件是指為每種細胞供給合適的溫度、營養(yǎng)和更多條件。因此，細胞已經(jīng)附著于其上的微載體在合適容器中保持溶解或懸浮狀態(tài)，優(yōu)選在溫度控制下并伴有攪拌。根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的細胞可以是任何真核細胞或原核細胞，優(yōu)選是真核細胞，例如哺乳動物細胞，如重組細胞系、植物細胞等。在一個實施方案中，細胞為完全(truly)貼壁細胞，例如原代細胞或上皮形態(tài)細胞。在一個尤其有利的實施方案中，細胞為低鋪板率細胞或分化型細胞或敏感型細胞，例如肝細胞或內(nèi)分泌細胞。在下文實驗部分中，本發(fā)明的這個方面通過用一個成纖維細胞系稱為Vero細胞來闡明，這是一個來自非洲綠猴腎臟的嚴格貼壁成纖維細胞。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括更進一步的步驟，即從所述微載體收獲有活力的細胞。在一個實施方案中，培養(yǎng)的細胞在后續(xù)步驟中被用于分析和/或治療目的。在一個替代的實施方案中，培養(yǎng)的細胞在后續(xù)步驟被用于支持培養(yǎng)病毒、細菌、霉菌、真菌或藻類。這個實施方案有利于疫苗制備相關方法和其它用途。
最后，本發(fā)明涉及到表面固定有來自魚類的明膠的微載體。明膠是一種復雜的混合物，但是其中的蛋白含有大量陽離子肽和一些蛋白。固定魚明膠的基質可以是上文本發(fā)明第一方面所述的任何一種。既然這樣的微載體上沒有哺乳動物蛋白存在，考慮到可獲得Cytodex 3TM(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)的微載體，本發(fā)明這方面是有利的。另外，明膠可提供促進細胞生長的生長因子，也可在微載體相互碰撞或其與培養(yǎng)容器表面碰撞時為附著細胞提供機械保護。
附圖詳述圖1顯示了實施例1中解釋的本發(fā)明微載體上非洲綠猴腎細胞株系細胞(Vero細胞)培養(yǎng)中細胞數(shù)目如何隨培養(yǎng)時間而變化。在圖1中，Y軸表示細胞數(shù)目(每毫升懸液中細胞數(shù)目)，X軸表示時間。在約168小時，描述使用本發(fā)明的培養(yǎng)情況的最上面的線(菱形)已經(jīng)達到約1.40E+06；而為市售交聯(lián)葡聚糖顆粒的對照CytodexTM1(Amersham Biosciences，Uppsala，Swenden)(圓形)達到約8.00E+05，且為包被有明膠的市售交聯(lián)葡聚糖顆粒的另一對照實例CytodexTM3(Amersham Biosciences，Uppsala，Swenden)(三角形)在相應時間點只達到1.00E+06以下。因此，圖1清晰顯示出本發(fā)明微載體可提供的細胞數(shù)目顯著高于市售微載體，并因此提高了生產(chǎn)率。
圖2顯示了實施例1中解釋的本發(fā)明微載體上非洲綠猴腎細胞株系細胞(Vero細胞)培養(yǎng)中細胞數(shù)目如何隨培養(yǎng)時間而變化。圖2所示圖形，除菱形代表實施例2中使用微載體培養(yǎng)的結果以外與圖1類似。再一次的，本發(fā)明微載體顯示相對于市售微載體顯著提高了生產(chǎn)率。
實驗部分本實施例僅為說明性目的提供，不應如附加的權利要求書定義那樣限制本發(fā)明。所有下列給出的及在本說明書中其它地方出現(xiàn)的參考文獻通過引用結合到本文中。
實施例1SephadexTMG-50 Fine的烯丙基化取32g干SephadexTMG-50 Fine(Amersham Biosciences，Uppsala，Swenden)，在玻璃容器中與388ml水混合，溶脹1h。SephadexTMG-50Fine的溶脹為每克干重約12ml。
溶脹的凝膠轉移到一個裝有機械攪拌器的三頸圓底燒瓶中，攪拌下向圓底燒瓶中加入44g Na2SO4。漿狀物加熱至30℃，并在30℃下保持1.5小時。然后加入80ml NaOH(50％w/w)和0.6gNaBH4。再加熱漿狀物至50℃，加入80ml烯丙基縮水甘油醚(AGE)。在50℃下反應持續(xù)一夜。
加入乙酸(60％w/w)中和pH至6.5-7.5以停止反應。在玻璃濾器上用4倍凝膠體積的水洗滌凝膠，再用3倍凝膠體積的乙醇洗滌，最后用6倍凝膠體積的水洗滌。
根據(jù)標準方法在RADIOMETER ABU 93 TRIBURETTEHE上用0.1M AgNO3測定烯丙基含量。烯丙基含量測定為101μmol/ml凝膠。
烯丙基化的SephadexTMG-50 Fine的精氨酸偶聯(lián)取250ml烯丙基化的凝膠轉移到一個裝有攪拌器的三頸圓底燒瓶中，加入63ml水和10.3g NaAc*3H2O。逐滴滴加溴水直至出現(xiàn)穩(wěn)定的黃色。反應繼續(xù)進行5min。通過加入甲酸鈉直到黃色消失終止反應。攪拌漿狀物30分鐘，然后在玻璃濾器上吸干。
將凝膠加入到一個盛有251ml水和36.9gL-精氨酸的溶液的圓底燒瓶中。加熱漿狀物至45℃，并用NaOH(50％w/w)調pH值至11.4。在30min和60min后測量pH值，并調至11.4。在45℃下反應持續(xù)一夜。
在一個玻璃濾器上依次用與1倍凝膠體積的0.1M Tris，pH 8及與1倍凝膠體積的0.1M NaOAc，pH 4洗滌凝膠，共進行8個循環(huán)。最后用8倍凝膠體積的水洗滌凝膠。
根據(jù)標準方法在RADIOMETER ABU 93 TRIBURETTEHE上用0.1M HCl測定氯離子容量。氯離子容量測定為0.58μmol/mg干凝膠。
實施例2烯丙基化的SephadexTMG-50 Fine的精氨酸偶聯(lián)與實施例1類似，但使用得自實施例1的烯丙基化的SephadexTMG-50 Fine 50ml，12.5ml水、2.06g NaAc*3H2O，50ml水及7.33g L-精氨酸。
根據(jù)標準方法在RADIOMETER ABU 93 TRIBURETTEHE上用0.1M HCl測定氯離子容量。氯離子容量測定為0.58μmol/mg干凝膠。
實施例33.1在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)Vero細胞如下文所述，用同樣方法制備所有不同的微載體類型(基于CytodexTM載體)。在這些條件下，一個鋪滿層為約1×105細胞/cm2，并且在一個更長的時間內(nèi)用于接種臨界細胞數(shù)為1-2×104/cm2。這些是T瓶數(shù)據(jù)。
所有操作均在一個遮蓋物下于無菌條件中使用無熱原材料進行。培養(yǎng)基溫度保持在37℃，pH值約為7.2。
3.1.1在T瓶中培養(yǎng)Vero細胞在T瓶(NunclonTMΔSurface；Nunc Brand Products)中單層Vero細胞情況下，用胰蛋白酶或螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)脫附細胞。
首先，將上清液倒入廢液瓶，并用PBS(wo Ca2+/Mg2+)洗滌細胞一次。在下一步中，根據(jù)下列表1將胰蛋白酶/EDTA加入到T瓶并在細胞層上散布。
表1 T瓶中培養(yǎng)Vero細胞

在室溫下孵育若干分鐘后，敲擊T瓶使細胞脫附，然后根據(jù)表1立即加入胰蛋白酶抑制劑。在下一步中，加入條件培養(yǎng)基(見表1)。
然后，按分傳比(split ratio)的概念分傳細胞。每周按1∶3比例傳代Vero細胞兩次(根據(jù)培養(yǎng)表面計算需要體積)。
在培養(yǎng)箱中，用9％(v/v)CO2和增濕空氣，在37℃下培養(yǎng)細胞。
3.1.2在滾瓶中培養(yǎng)Vero細胞使用175cm2T瓶中的鋪滿培養(yǎng)物接種到850cm2的滾瓶中(Corning)。按上文3.1.1所述脫附細胞。用200ml條件培養(yǎng)基重懸細胞并轉移到滾瓶中。將120ml無菌CO2充入滾瓶中并在37℃下以0.2rpm在滾瓶器上培養(yǎng)。
用類似程序脫附來自滾瓶培養(yǎng)的細胞。將上清液倒入廢液瓶，并用PBS(wo Ca2+/Mg2+)洗滌細胞層一次。將PBS也倒入廢液瓶，然后根據(jù)表2加入胰蛋白酶/EDTA。
表2 滾瓶中培養(yǎng)Vero細胞

室溫下孵育若干分鐘后，敲擊下滾瓶中的細胞再根據(jù)表2加入抑制劑。用條件培養(yǎng)基重懸細胞(見表2)。然后可將細胞懸液分裝到幾個滾瓶中，每個滾瓶用培養(yǎng)基添加到200ml，并將120ml無菌CO2充入每個滾瓶中。在37℃下以0.2rpm轉速培養(yǎng)細胞。
3.1.3用EDTA脫附Vero細胞為接種微載體培養(yǎng)物，用EDTA法將細胞從表面上脫附。
用無菌PBS(wo Ca2+/Mg2+)從0.16％(w/w)EDTA儲藏液稀釋到0.02％(w/w)溶液，并水浴加熱到37℃。倒掉鋪滿培養(yǎng)細胞層的上清液，用PBS(wo Ca2+/Mg2+)洗滌細胞層一次。根據(jù)表3用如3.1.1和3.1.2所述方法脫附細胞。
表3 用EDTA脫附Vero細胞

不必加入任何種類的抑制劑，因為EDTA將與培養(yǎng)基中的二價離子螯合。如表1或表3所述加入相同量的培養(yǎng)基。
然后將細胞懸液分裝到幾個容器中，并如3.1.1和3.1.2所述進行培養(yǎng)。
3.2旋動瓶中在微載體上培養(yǎng)Vero細胞所有操作均于無菌和無熱原條件下在一個遮蓋物下進行。
3.2.1旋動瓶中微載體的平衡和用量將至少方程1中體積的微載體加入到50ml試管中。在載體沉降后，除去PBS并加入等量的培養(yǎng)基。載體重懸，沉降后也除去培養(yǎng)基。重復該程序4次。最后PBS的稀釋倍數(shù)應高于10。
Vcarriar=n×VCulture×c×SV1000Eq.1]]>VCarrier＝×VCu1ture×c×SV/1000VCarrier………溶脹后載體體積(ml)VCulture………培養(yǎng)物最終體積(ml)n………………旋動管數(shù)目c………………載體濃度(g/L)SV……………溶脹微載體體積(mg/L)最后一次洗滌且載體沉降后，用移液管除去培養(yǎng)基，使最后體積的50％為沉降微載體。按方程2的體積從這個混懸物轉移到一個旋動管中。
VSpinner＝2×VCulture×c×SV/1000 Eq.2VSpinner………每支旋動管載體混懸物體積(ml)VCulture………培養(yǎng)物最終體積(ml)c………………載體濃度(g/L)SV……………溶脹微載體體積(mg/L)盛有培養(yǎng)基和載體的旋動管平衡在一個培養(yǎng)箱中過夜(37℃，9％(v/v)CO2)。
3.2.1旋動培養(yǎng)的接種如3.1.1和3.2.2所述在175cm2T瓶中或在850cm2滾瓶中培養(yǎng)細胞。用EDTA法脫附滾瓶培養(yǎng)細胞(見3.1.3)。在接種過程中將不同培養(yǎng)瓶的細胞匯合并保持在37℃。根據(jù)方程3計算一個實驗所需的瓶數(shù)。
NFlask＝(CCSpinner×VCulture×n)/AFlask×105Eq.3NFlask………瓶子數(shù)目CCSpinner………最終接種細胞濃度(細胞數(shù)/ml)VCulture………培養(yǎng)物最終體積(ml)n………………旋動管數(shù)目AFlask………培養(yǎng)面積(cm2)T175型為175cm2或R850型為850cm2用錐蟲藍染色法估計總細胞濃度和生存力。
每個旋動瓶接種體的體積用方程4計算。
Vinoc＝(CCinocr×VCulture×100)/(CCTotal×Fviab) Eq.4Vinoc…………每支旋動管接種體體積(ml)VCulture………培養(yǎng)物最終體積(ml)CCTotal………總接種體細胞濃度(細胞數(shù)/ml)VCulture………培養(yǎng)物最終體積(ml)Fviab…………生存能力(％)所有實驗最后培養(yǎng)體積均選用40ml，這意味著每個旋動瓶(125ml燒瓶；Techne)的頂部空間約為200ml空氣。
為了接種，仔細旋轉移動旋動瓶，并用一根磁力攪拌棒固定夾子。在20秒內(nèi)將接種物逐滴滴加到載體懸液中。然后，37℃下在一個旋動管臺(Cellspin；Integra Biosciences)上按靜止25分鐘、35rpm攪拌5分鐘循環(huán)間斷攪拌混合培養(yǎng)物6小時。在此時間段后，用新鮮培養(yǎng)基添加體積到40ml，再開始以35rpm持續(xù)攪拌。在這個時間點，取出第一份樣品(見3.2.3)。每24小時取樣一次。
48小時后，更換20ml培養(yǎng)基，并充入混合氣體(75％N2、20％O2、5％CO2；每旋動瓶換氣750ml；Linde)。從這時開始，每24h更換一次培養(yǎng)基和混合氣體。
3.2.3旋動培養(yǎng)物的取樣3.2.3.1細胞濃度的估測為常規(guī)取樣，通過計算釋放胞核來測定細胞濃度。在這個方法中，在微載體上生長的細胞在一種低滲溶液中孵育，在該溶液中用結晶紫對溶胞釋放的胞核進行染色(Microcarrier cell culture；Pharmacia Biotech；2000)。
從旋動培養(yǎng)物取出1.5ml勻質樣品，然后取1ml加到一個1.5mlEP管中，通過重力使載體沉積；剩余0.5ml樣品用于拍照(見3.2.3.2)。再用一支移液管吸掉EP管中的上清液。根據(jù)估計細胞濃度，加入0.5或1.0ml結晶紫(見3.3.1)，通過振蕩樣品混合。這個樣品于37℃下孵育1小時，期間并時時振蕩。
孵育結束后，用血細胞計數(shù)器計算釋放的胞核并計算細胞濃度(方程5)。
這些樣品在4℃下能保持穩(wěn)定一周。
CCSpinner＝RN×VCV×1000/(SQ×VSample)Eq.5CCSpinner………細胞濃度(細胞數(shù)/ml混懸物)RN………………計算胞核總數(shù)VCV……………結晶紫液體積(ml)SQ……………細胞計數(shù)格數(shù)目VSample………樣品體積(ml)3.2.3.2微載體培養(yǎng)物拍照如3.2.3.1所述取樣，其中0.5ml加入到一個EP管中。重力沉降載體后倒掉上清液，加入0.25ml蘇木素溶液(見3.3.2)并仔細混合。然后室溫孵育幾個小時(至少2h，o/n更佳)。為進行顯微拍照，每份樣品取30μl加入到一個96孔板的一個孔中(Cat.No.269620；NuncBrand Products)。并在顯微鏡下拍攝數(shù)碼照片。
3.3溶液3.3.1用于計算釋放胞核的結晶紫溶液檸檬酸0.1mol/L 19，21g/LFWC6H8O7＝192，1g/mol結晶紫0.1％ 1g/LRO-水該溶液用一張濾紙過濾并保存在4℃下。
3.3.2微載體的蘇木素染色蘇木素 0.1％(w/w) 1g/LNaIO30.02％(w/w) 0.02g/LKAl(SO4)2×12H2O 1％(w/w) 10gL FW＝474.38g/mol室溫下溶解于900ml RO-水中并室溫攪拌o/n。攪拌后加入以下物質。
水合氯醛 5％(w/w) 50g/LFWC2H3Cl302＝165.4g/mol檸檬酸0.1％(w/w)1g/L FWC6H807＝192，1g/mol用RO水稀釋溶液至1000ml并用濾紙過濾。
該溶液在6℃下保存，并在2年內(nèi)可用。
3.3.3用于細胞脫附的胰蛋白酶胰蛋白酶0.1％(w/w) 1g/LGibco 27250-042EDTA0.02％(w/w) 0.2g/L溶解于PBS(w/o Ca2+/Mg2+)中，然后用0.2μm濾膜過濾除菌。也在4℃或-20℃下保存。
3.3.4用于細胞脫附的胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 1mg/mlSigma T 6522溶解于PBS(w/o Ca2+/Mg2+)中，然后用0.2μm濾膜過濾除菌。也在4℃或-20℃下保存。
權利要求
1.一種微載體，所述微載體的表面經(jīng)胍基固定有陽離子化合物。
2.權利要求1的微載體，所述微載體能夠經(jīng)陽離子化合物與細胞間的電荷相互作用附著細胞。
3.權利要求1或2的微載體，其中所述陽離子化合物在微載體表面形成聚陽離子包被。
4.前述權利要求中任一項的微載體，其中所述陽離子化合物在微載體表面形成弱堿性包被。
5.前述權利要求中任一項的微載體，其中所述陽離子化合物包含一個或兩個氨基酸。
6.權利要求5的微載體，其中所述陽離子化合物由精氨酸(Arg)組成。
7.權利要求5的微載體，其中所述陽離子化合物由二肽組成。
8.權利要求7的微載體，其中所述二肽為精氨酸-谷氨酸(Arg-Glu)或精氨酸-天冬氨酸(Arg-Asp)。
9.前述權利要求中任一項的微載體，其中所述陽離子化合物經(jīng)仲胺固定于微載體表面。
10.前述權利要求中任一項的微載體，其中所述微載體由交聯(lián)糖組成。
11.一種細胞培養(yǎng)支持物，所述支持物由前述權利要求中任一項的至少一種微載體組成。
12.一種制備微載體的方法，所述方法包括使包含至少一個胍基的化合物與環(huán)氧化物激活的基質表面接觸，從而經(jīng)胍基將化合物固定于所述表面。
13.權利要求12的方法，其中所述化合物包含一個或兩個氨基酸。
14.權利要求13的方法，其中所述化合物由精氨酸(Arg)組成。
15.權利要求13的方法，其中所述化合物由二肽組成。
16.權利要求12的方法，其中所述化合物包含一個或多個核苷酸。
17.權利要求12-16中任一項的方法，其中所述基質為交聯(lián)糖。
18.權利要求12-17中任一項的方法，其中所述由此制備的微載體如權利要求1-10中任一項所定義。
19.一種使細胞附著于表面的方法，其中使用包含至少一個胍基的陽離子化合物使細胞附著于所述表面。
20.權利要求19的方法，其中所述附著經(jīng)電荷相互作用。
21.權利要求19或20的方法，其中所述陽離子化合物由精氨酸(Arg)組成。
22.權利要求19-21中任一項的方法，其中所述表面為微載體、膜、織物、載玻片、芯片、毛細管或器皿的表面。
23.權利要求19-22中任一項的方法，其中所述細胞附著用于分析或生產(chǎn)目的。
24.一種用于高通量篩選(HTS)的定位細胞方法，所述方法使用權利要求19-23中定義的方法。
25.一種細胞培養(yǎng)方法，其中在一個或多個包被了陽離子化合物的微載體表面并在提供生存力的環(huán)境下培養(yǎng)細胞，所述細胞經(jīng)陽離子包被提供的胍基附著于微載體。
26.權利要求25的方法，其中所述細胞附著基于電荷相互作用。
27.權利要求26的方法，其中所述陽離子化合物由精氨酸(Arg)組成。
28.權利要求26或27的方法，所述方法進一步包括從所述微載體收獲活細胞的步驟。
29.權利要求26或27的方法，所述方法進一步包括將細胞用于分析和/或治療目的的步驟。
30.權利要求25的方法，所述方法包括將細胞用于支持培養(yǎng)病毒、細菌、霉菌、真菌或藻類的進一步步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及微載體，其表面經(jīng)胍基固定有陽離子化合物。該微載體能夠附著細胞，例如經(jīng)電荷相互作用附著細胞，并有利于用作細胞培養(yǎng)的支持體。所述化合物可包含一個或兩個氨基酸，如精氨酸或二肽。本發(fā)明還涉及制備聚陽離子微載體的方法，該方法包括將包含至少一個胍基的化合物固定在環(huán)氧化物活化的基質上。
文檔編號C07C29/00GK1863819SQ200480029074
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月5日 優(yōu)先權日2003年10月6日
發(fā)明者J·范阿爾斯蒂恩, H·貝里, A·布于爾林 申請人:阿默森生物科學有限公司