專利名稱:源自蜂王漿的抗氧化肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及具有抗氧化作用的肽,具體而言涉及通過將蜂王漿中含有的蛋白質(zhì)水解所獲得的抗氧化肽。
背景技術(shù):
現(xiàn)在,蜂王漿廣泛地應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥品、化妝品等領(lǐng)域,報告顯示其具有擴(kuò)張血管、降低血壓、抗菌等各種藥理作用及營養(yǎng)生理作用。
蜂王漿是由蜜蜂的唾液腺合成、由位于頭部的大顎腺分泌的乳狀物質(zhì),是工蜂為了培育蜂王而喂食蜂王幼蟲巢中的幼蜂的物質(zhì)。蜂王漿均衡地富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì),一生都食用蜂王漿的蜂王的壽命是工蜂的40倍,并且具有一天產(chǎn)卵2000個的能力。對蜂王漿的有效成分的研究,一直以10-羥基-2-癸烯酸(デセン酸)為代表的脂肪酸、氨基酸、維生素等低分子化合物為中心而進(jìn)行。
另一方面,雖然蜂王漿一般含有10%以上的蛋白質(zhì),但是對與該蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、生理作用相關(guān)的研究一直比較落后。并且,制造含有蜂王漿的化妝品、保健藥水(ドリンク剤)等時,進(jìn)行醇提取,蛋白質(zhì)作為沉淀物被分離,但現(xiàn)階段沒有實(shí)現(xiàn)對該蛋白質(zhì)的有效利用。
關(guān)于蜂王漿蛋白質(zhì)的蛋白酶處理物,為人所知的是其具有鈣吸收促進(jìn)作用(仲佐輝子、食品と開発、34,5(1999))、降低血糖值作用(上田修一郎、Food Style、21,6,5(2002)),并且也有關(guān)于其抗氧化作用的報道((社)日本全國蜂王漿公平貿(mào)易理事會(全國ロ一ャルゼリ一公正取引協(xié)議會)「ロ一ャルゼリ一(Royal Jelly)に関する研究」平成13年度研究報告書),但其效果不如維生素E。
本發(fā)明的目的在于提供具有強(qiáng)抗氧化作用的天然物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述課題,經(jīng)過反復(fù)的研究,結(jié)果本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將蜂王漿用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶進(jìn)行酶處理,可以獲得具有和維生素E同等程度的強(qiáng)抗氧化能力的抗氧化肽。
即,本發(fā)明涉及如下所示的發(fā)明1.具有以下(1)~(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu;(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln;(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
2.以上述1所述的抗氧化肽作為有效成分的抗氧化劑。
3.含有上述1所述的抗氧化肽的食品。
4.具有以下(1)~(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽的制造方法(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu;(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln;(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp,其特征在于,用蛋白酶將源自蜂王漿的蛋白質(zhì)水解。
5.含有上述1所述的抗氧化肽的化妝品。
圖1表示通過硫氰酸鐵法進(jìn)行的抗氧化作用的測定結(jié)果。圖1中,“none”表示沒有蛋白質(zhì)的對照,“Chymom”表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶處理所獲得的分解物(Chymo級分),“S.I”表示表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及小腸酶處理所獲得的分解物(S.I級分),“V.E”表示維生素E。
圖2表示陽離子交換色譜分析法的色譜圖、及各級分的抗氧化試驗(yàn)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的抗氧化肽具有如下的氨基酸序列。
Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu(以下簡稱為“肽1”)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln(以下簡稱為“肽2”)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp(以下簡稱為“肽3”)肽1~肽3是新的肽,其抗氧化作用通過本發(fā)明首次得到明確。
本發(fā)明的抗氧化肽也可以通過基因重組或化學(xué)合成獲得,并且,也可以通過使胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶作用于蜂王漿本身(生蜂王漿、干蜂王漿等)或者源自蜂王漿的蛋白質(zhì)級分來獲得。并且,只要可以獲得肽1~肽3,也可以使用由胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶等水解酶將蜂王漿以外的蛋白質(zhì)原料水解而得到的物質(zhì)。
作為用于通過蛋白質(zhì)的酶分解制造本發(fā)明的抗氧化肽的酶可以舉出胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小腸酶等,這些酶是可以將源自微生物、包括哺乳動物在內(nèi)的動物、植物、酵母、真菌等任意的生物的肽鍵水解的酶的例子,優(yōu)選胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶。例如,通過將源自蜂王漿的蛋白質(zhì)在37℃左右的溫度下和源自各種生物的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小腸酶同時進(jìn)行約1~約48小時的處理,可以獲得本發(fā)明的任意一種抗氧化肽。
本發(fā)明的肽可以從源自蜂王漿的蛋白質(zhì)的酶分解物中進(jìn)行分離、提純后使用,也可以將包括本發(fā)明的抗氧化肽和其他多種肽的蛋白分解物組合物(根據(jù)需要去除鹽類、糖類或者高分子蛋白質(zhì)等的物質(zhì))作為抗氧化肽用于食品、化妝品等各種用途。
例如,含有蜂王漿的保健藥水是通過將向蜂王漿添加約70~約95%(v/v)的醇、優(yōu)選乙醇后沉淀的蛋白質(zhì)除去而制造的,該含水醇中不溶性的源自蜂王漿的蛋白質(zhì)可以作為酶處理的原料蛋白質(zhì)使用。作為化學(xué)合成法,可以通過肽合成器進(jìn)行合成,也可以通過固相合成或者液相合成,階段性地通過肽鍵將氨基酸延長來制造。
本發(fā)明的抗氧化肽基于其抗氧化作用,可以適合添加到由活性氧引起的各種疾病的預(yù)防及治療用的食品中。本發(fā)明的抗氧化肽具有和維生素E同等程度的抗氧化能力,通過作為食品每天攝取約1μg~約1000mg,可以預(yù)防或者治療由活性氧引起的各種疾病。作為食品,可以添加到飲料、保健藥水等液狀食品、膠狀食品(包括營養(yǎng)輔助食品、下咽困難者用的食品),也可以作為輔助物、功能性食品等以藥片、顆粒等固形食品的形式攝取。并且,也可以用于準(zhǔn)醫(yī)藥品(口中清涼劑、護(hù)齒、護(hù)膚、毛發(fā)用劑、洗浴用劑、爽身粉類(てんか粉類)、保健藥水、健胃清涼劑等)、動物用食品(寵物食品等)、動物用飼料、植物用肥料等。
本發(fā)明的抗氧化肽通過添加到對氧化不穩(wěn)定的食品中,可以作為穩(wěn)定劑使用。
并且,本發(fā)明的抗氧化肽也可以添加到化妝品中。作為化妝品,例如適用于洗劑、化妝水、乳狀液、口紅、霜劑、凝膠、面膜(パック)、粉底霜等主要用于皮膚或粘膜等的物質(zhì)。
以下對本發(fā)明通過實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例1(1)抗氧化肽級分的調(diào)制將醇變性蜂王漿蛋白質(zhì)凍干之后,溶解到5倍量的蒸餾水中。通過進(jìn)行透析去除低分子的糖、雜質(zhì),獲得純度更高的醇變性蜂王漿蛋白質(zhì)。將該蛋白質(zhì)溶液用1N HCl調(diào)整到pH2.8,在最初用1/500重量比的胃蛋白酶進(jìn)行處理。將其分解物依次用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(シグマ公司制造)、源自豬的小腸酶進(jìn)行處理。對于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶,添加后在37℃下進(jìn)行24小時溫育,對于小腸酶,添加后在37℃下進(jìn)行1小時溫育。在反應(yīng)停止時,如果是胃蛋白酶,用1N NaOH調(diào)整到pH8.0以使酶失活,如果是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小腸酶時,添加4倍量的99.7%乙醇,以3,000×g進(jìn)行20分的離心分離,去除未反應(yīng)的蛋白質(zhì)及酶。將通過小腸酶處理所獲得的上清液用蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮干燥固化后,溶解到蒸餾水中,作為醇變性蜂王漿蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物。將這樣所獲得的胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分解物(Chymo級分)、胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分解物/小腸酶分解物(S.I級分)作為樣本使用。肽的濃度測定通過Lowry法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)使用牛血清白蛋白。
此外,作為“醇變性蜂王漿蛋白質(zhì)”使用通過將蜂王漿用醇(本實(shí)施例中為70%v/v含水乙醇)沉淀處理,將所獲得的蜂王漿蛋白質(zhì)凍干而得到的物質(zhì)。
(2)抗氧化作用的測定(2-1)氧化模型體系氧化模型體系是將Chen等的方法(14)加以改良后進(jìn)行的。向管形瓶中加入5mg亞麻酸、1ml的0.2M磷酸鉀緩沖液(K-phosphatebuffer)(pH7.0;1%TritonX-100),作為氧化促進(jìn)劑添加0.05mM氯化鐵(II)和蒸餾水,在40℃下進(jìn)行4分鐘的超音波處理,做成乳化液。加入樣本(0.2%)和蒸餾水使最終容量為1ml,,在40℃的恒溫槽中加熱60分鐘,并振動。對于加熱前及加熱后的反應(yīng)液的過氧化脂質(zhì)的量盡快地通過硫氰化鐵法進(jìn)行測定。對于抗氧化作用的評價,通過對加熱前后的過氧化脂質(zhì)的增加量的比較來進(jìn)行。
(2-2)硫氰酸鐵法根據(jù)大澤等的方法(23)進(jìn)行。向0.05ml的反應(yīng)液中加入99.5%的乙醇2.25ml、30%硫氰酸銨水溶液0.05ml、0.1ml的1N HCl以及0.1ml的0.02MFeCl2/3.5%HCl,進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬?,測定500nm下的吸光度。測定時使用Jasco、V-530UV分光光度計(jì)。S.I級分、Chymo級分、維生素E(VE)及無蛋白質(zhì)對照(none)的比較結(jié)果如圖1所示。另外,各肽以0.2%的濃度添加。這是因?yàn)橐话闱闆r下食品添加物的使用濃度是0.1%左右,所以使用與該濃度相近的值??梢钥闯?,S.I樣本顯示出和α-生育酚(維生素E)同等的抗氧化作用。
(3)抗氧化肽的分離、鑒定(3-1)陽離子交換色譜分析法S.I級分溶解到0.05M的乙酸銨緩沖液(pH6.0)中,并使其吸附到用該緩沖液平衡化的AG50WX2(H+型,50-100目,BioRad)柱上。將非吸附物質(zhì)用同樣的緩沖液清洗后,將吸附的級分用0.2M的NH4OH洗脫。將洗脫的吸附級分凍干,獲得堿性肽級分。陽離子交換色譜分析法的色譜圖、以及各級分的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。圖2中具有最高抗氧化活性的級分V進(jìn)一步用HPLC提純。
(3-2)HPLC為了分離級分V中存在的抗氧化肽,進(jìn)行使用反相柱的高效液體色譜分析法(HPLC)。其中柱使用ODS柱(Pegasil-3000DS,SenshuScientific Co.),洗脫時使用從0.1%TFA水溶液到含有0.085%TFA的60%乙腈溶液的60分鐘的濃度梯度法(1%/min)。肽的洗脫位置用220nm下的吸光度進(jìn)行了確認(rèn)。并且,再次進(jìn)行HPLC時,使用從含有0.1%TFA的20%乙腈溶液到含有0.085%TFA的40%乙腈溶液的40分鐘的濃度梯度法(0.5%/min)。對于通過用反相柱的HPLC分離的抗氧化肽的氨基酸序列,使用蛋白質(zhì)定序儀(プロティンシ一クェンサ一)G-1005A(ヒュ一レット·パッカ一ド社)進(jìn)行分析。其結(jié)果是獲得了肽<p>(6)將經(jīng)步驟(5)處理的復(fù)合材料薄膜,單向疊層,放入模具中真空熱壓,真空度0.08Mpa左右,熱壓溫度160℃左右,壓力60Mpa左右,然后脫模、精修、滅菌、包裝。得到實(shí)施例1.a組分復(fù)合材料試件。
實(shí)施例1中,b、c、d、e各組復(fù)合材料的制備工藝與a組相同(僅配比不同)。
(7)將經(jīng)步驟(6)處理的復(fù)合材料試件,在MTS-810材料試驗(yàn)機(jī)上測試彎曲強(qiáng)度、彎曲模量、剪切強(qiáng)度和壓縮強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1表1 CPG/PLLA/PDLLA復(fù)合材料力學(xué)性能(重量比)
復(fù)合材料電鏡掃描照片CPG/PLLA/PDLLA單向長纖維復(fù)合材料拉伸斷口形貌(見圖1)、CPG/PLLA/PDLLA單向復(fù)合材料橫向拉伸斷口的SEM照片(見圖2),纖維分布均勻界面粘結(jié)交好。
(8)降解實(shí)驗(yàn)將復(fù)合材料試樣真空干燥后,放入盛有人工降解液(Ringer’s生理鹽液)的試管中(固液比1∶50),在恒溫37℃下降解,經(jīng)一定時間取出,觀察試樣表面變化、烘干、稱重和測試力學(xué)性能。宏觀表面觀察發(fā)現(xiàn)a、e兩組試件,表層均有裂紋。
降解過程中,力學(xué)性能衰減規(guī)律見表2表2 CPG/PLLA/PDLLA復(fù)合材料降解性能
制劑例3健康食品(片劑)配合以下各成份,按照通常的方法調(diào)制成片劑。
淀粉15重量%乳糖25重量%羥丙基纖維素4重量%硬脂酸鎂1重量%蟲膠(シェラック)5重量%砂糖45重量%實(shí)施例1所獲得的蜂王漿蛋白質(zhì)酶分解物 5重量%根據(jù)本發(fā)明,可以獲得源自天然物質(zhì)的、安全性高的抗氧化肽,并可廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域。
序列表<110>株式會社山田養(yǎng)蜂場(YAMADA APICULTURE CENTER,INC.)<120>源自蜂王漿的抗氧化肽<130>SPI050357-25<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>蜂王漿<400>1Tyr Tyr Ser Pro Leu5<210>2<211>8<212>PRT<213>蜂王漿<400>2
Asn Tyr Pro Phe Asp Val Asp Gln58<210>3<211>8<212>PRT<213>蜂王漿<400>3Ser Leu Pro Ile Leu His Glu Trp58
權(quán)利要求
1.具有以下(1)~(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu;(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln;(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
2.以權(quán)利要求1所述的抗氧化肽的任意一種作為有效成分的抗氧化劑。
3.含有權(quán)利要求1所述的抗氧化肽的任意一種的食品。
4.具有以下(1)~(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽的制造方法(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu;(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln;(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp,其特征在于,用蛋白酶將源自蜂王漿的蛋白質(zhì)水解。
5.含有權(quán)利要求1所述的抗氧化肽的化妝品。
全文摘要
本發(fā)明提供具有以下(1)~(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu;(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln;(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
文檔編號C07K7/00GK1680429SQ20051000942
公開日2005年10月12日 申請日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月16日
發(fā)明者西村敏英, 田邊創(chuàng)一, 雜賀愛 申請人:株式會社山田養(yǎng)蜂場