專利名稱：一類具有抗氧化活性的六肽、其分離方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領(lǐng)域，具備涉及一類具有抗氧化活性的角類多肽、其分離方法及用途。本申請為200910233784. 1的分案申請。
背景技術(shù)：
角類動物藥材是祖國醫(yī)學(xué)寶庫的重要組成部分，其功效確切，作用特點突出。中國現(xiàn)已知最早的本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中就已經(jīng)記載了犀角(Cornu Rhinoceri Asiatici) 和羚羊角(Cornu Saigae Tataricae)的性味與功效，而后漢代《名醫(yī)別錄》中出現(xiàn)了關(guān)于水牛角(Cornu Bubali)性味與功效的記載。千百年來，犀(廣)角、羚羊角、水牛角等角類藥材一直是中醫(yī)臨床不可或缺的要藥，主要用于治療熱證。然而，目前法律已經(jīng)明令禁止使用及交易犀角及其制品，賽加羚羊作為瀕危物種，其角的使用也受到限制，只有水牛角因取材廣泛，價格低廉，療效確切而被沿用至今。從20世紀60年代起，科研人員就開始對多種角類藥材進行比較研究與評價，結(jié)果認為水牛角在氨基酸組成、宏微量元素組成、藥理藥效作用等方面與犀角相似且功效確切，因此目前中醫(yī)普遍采用水牛角及水牛角濃縮粉代用犀 (廣)角用作醫(yī)藥工業(yè)和臨床調(diào)劑，取得良好的效果，以緩解中醫(yī)臨床千年來對于犀(廣) 角使用的依賴性。水牛角 Cornu Bubali 為?？苿游?Bubalus bubal is Linnaeus 的雙角，為 2005 版 《中華人民共和國藥典》收載品種，性味苦，寒，歸心，肝經(jīng)。水牛角主要含有角蛋白、多肽、氨基酸、膽固醇等物質(zhì)，具清熱解毒、涼血、定驚等功效，中醫(yī)臨床以直接煎湯或入方劑煎湯服用，主要用于治療溫病高熱，神昏譫語，發(fā)斑發(fā)疫，吐血衄血，驚風(fēng)，癲狂等證。雖然犀(廣)角、羚羊角、水牛角等角類藥材應(yīng)用歷史逾千年，但因藥材來源部位、 材質(zhì)、組成成分等特殊性，其效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制的研究還較為薄弱，關(guān)于其活性成分的報道幾乎為零。因此，如何充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，從角類藥材中分離純化活性多肽并進行結(jié)構(gòu)鑒定，深入開展研究角類藥材效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制研究，是該領(lǐng)域科研技術(shù)人員多年來努力尋求突破的研究方向之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用現(xiàn)代生化技術(shù)手段，對水牛角中具有抗氧化活性多肽成分進行跟蹤， 進行逐步的分離、純化，并對此活性組分的結(jié)構(gòu)進行分析鑒定。本發(fā)明公開了下列3種結(jié)構(gòu)式的多肽Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn(II)；Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn (III)。它們均分離自水牛角，也可人工合成。從水牛角分離的方法包括a、取水牛角粉，用純水加熱回流提取，濾過，濾液濃縮冷凍干燥，得粗提物；
b、對粗提物進行凝膠柱層析分離，在254nm下檢測流出樣品，根據(jù)檢測器的樣品峰收集每個組分，測定抗氧化活性；C、將最高抗氧化活性的組分進一步利用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分離純化，離子交換柱先用50mM磷酸鹽緩沖液(PBS)pH6. 5，以lml/min流速預(yù)處理池； 上樣后，離子交換柱用50mM PBS pH6. 5，以lml/min流速洗脫池，然后以線性梯度為0_0. 3M NaCl的PBS緩沖液50mM，pH6. 5洗脫，洗脫曲線在2Mnm下檢測；根據(jù)洗脫峰收集每個組分， 冷凍干燥；d、將c得到的凍干粉，純水溶解成較高濃度，通過Waters 2545-2489-2676自動純化HPLC系統(tǒng)進行脫鹽，測定抗氧化活性，得到較好抗氧化活性組分D2和D3 ；e、將組分D2和D3，再通過Waters 2545-2489-2676自動純化HPLC系統(tǒng)進一步分離純化；以線性梯度為2% -60%甲醇洗脫，其中含0. 三氟乙酸，在230nm下檢測；D2組分反相HPLC層析分離時，收集保留時間約為4. 6min和7. 3min的兩個色譜峰，分別為多肽I 和II ；D3組分反相HPLC層析分離時，收集保留時間約為5. ^iin的色譜峰，為多肽III ；收集得到的樣品，減壓濃縮除去甲醇后，冷凍干燥；分別得到多肽I，II和III的凍干粉。上述分離純化方法純化的活性多肽I、II、III的分子量分別為708. 090Da, 1018. 296Da 和 1271. 379Da。結(jié)構(gòu)式Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn(II)；Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn (III)。 將3個多肽溶于細胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過稀釋分別配成0. 5 μ M，5 μ M和50 μ M溶液，與大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(rCMECs)預(yù)孵1 后，去除含多肽的細胞培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍，加入含有500 μ M H2O2的細胞培養(yǎng)液，共孵池后，進行MTT實驗，同時吸出細胞上清液用于測定LDH含量。結(jié)果表明，3個多肽在5 μ M和50 μ M濃度時，能夠增加rCMECs細胞存活率，減少上清LDH釋放量，對H2A所致rCMECs損傷均有保護作用。其中以多肽III的抗氧化活最佳，明顯優(yōu)于多肽I和多肽II，能夠顯著提高細胞存活率，并減少LDH的釋放。結(jié)果見圖1 和圖2。本發(fā)明對水牛角中具有抗氧化活性的多肽成分進行跟蹤，進行逐步分離、純化，并對純多肽進行氨基酸序列分析，獲得3個具有抗氧化活性的角類多肽。本發(fā)明工藝簡單，應(yīng)用范圍廣，為其它角類藥材物質(zhì)基礎(chǔ)研究，活性成分的分離純化提供思路與方法。3個活性多肽的特點是具有良好的抗氧化活性，對H2A所致的rCMECs過氧化損傷具有保護作用，體現(xiàn)了抗氧化活性；3個活性多肽分子量特點都低于2kDa，分子量越小的多肽越易于穿過機體半透膜到達作用部位；氨基酸組成特點是都含有疏水性氨基酸和質(zhì)子供體氨基酸，疏水性氨基酸殘基能夠促進多肽與生物系統(tǒng)內(nèi)脂質(zhì)的結(jié)合，質(zhì)子供體氨基酸能夠提供質(zhì)子參與氧化還原反應(yīng)，因此3個活性多肽的脂溶性較好，并具有良好的抗氧化活性。本發(fā)明分離得到的多肽分子量小，活性突出，氨基酸序列明確，為進一步人工合成活性多肽提供了必要的基礎(chǔ)，為今后開發(fā)利用角類抗氧化活性多肽進行藥品、保健品等產(chǎn)品研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的活性多肽可以和藥學(xué)上可接受的載體混合制成各種劑型，也可以和食品添加劑混合制成保健食品。本發(fā)明的多肽還可以和藥用鹽形成藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在。


圖1為純化多肽I、II和III抗rCMECs氧化損傷MTT實驗示意圖。圖2為純化多肽I、II和III抗rCMECs氧化損傷LDH釋放實驗示意圖。圖3為kphadex G_25凝膠柱層析分離水牛角提取物中活性多肽的層析示意圖。圖4為DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析分離活性組分G3的層析示意圖。圖5為Waters自動純化HPLC系統(tǒng)純化活性成分D2的層析示意圖。圖6為Waters自動純化HPLC系統(tǒng)純化活性成分D3的層析示意圖。圖7為純化多肽I的串聯(lián)質(zhì)譜及氨基酸序列從頭計算示意圖。圖8為純化多肽II的串聯(lián)質(zhì)譜及氨基酸序列從頭計算示意圖。圖9為純化多肽III的串聯(lián)質(zhì)譜及氨基酸序列從頭計算示意圖。
具體實施例方式實施例1(1)水牛角提取物的制備取水牛角粉500g，與5000ml純水混合，加熱微沸回流提取兩次，每次8小時，煎煮結(jié)束后合并濾液，濾過，濾液在50°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適量后進行冷凍干燥，可得粗提物凍干粉，用于后面不同組分的分離及各組分抗氧化活性評價實驗。(2)對粗提物的凝膠柱層析分離將步驟(1)制得的粗提物與純水混合，在4°C下充分攪拌，4°C下12000rpm后離心 20min,收集上清液，采用滴定管將樣品小心加到kphadex G-25柱2. OX IOOcm頂端。用純水進行洗脫，流速為0. 15ml/min，檢測波長為2Mnm，自動分部收集器收集洗脫液樣品，每 2ml收集1管。經(jīng)G-25凝膠柱層析后共獲得G1，G2，G3和G4四個組分，其層析示意圖見圖 3。收集這四個組分，冷凍干燥后，進行細胞實驗，以噻唑藍(MTT)實驗和乳酸脫氫酶(LDH) 釋放實驗為指標，觀察四個組分對H2A所致rCMEC損傷的保護作用，評價其抗氧化活性。結(jié)果表明，G3具有最高的抗氧化損傷活性，進行進一步的陰離子交換層析。(3)對分離組分的陰離子交換柱層析分離經(jīng)過步驟O)的分離得到的活性組分先用適量50mM PBS pH6.5緩沖液溶解，上樣到DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱2. 0X 20cm，離子交換柱事先用50mM PBS pH6. 5緩沖液充分平衡。上樣后，用50mM PBS pH6. 5以lml/min流速洗滌，待出現(xiàn)穿透峰Dl后，采用線性梯度為0-0. 3M NaCl的50mM PBS pH6. 5緩沖液洗脫，出現(xiàn)D2和D3兩個組分，其層析示意圖見圖4。收集這三個組分冷凍干燥，凍干粉用少量蒸餾水溶解后，通過Waters2545-24894676自動純化HPLC系統(tǒng)進行脫鹽，分離柱為SunFire C18反相柱， 19mmX 50mm;進樣后，先采用2 %甲醇洗脫^iin，后用60%甲醇洗脫lOmin，收集60%甲醇洗脫液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除去甲醇后，冷凍干燥；凍干粉進行細胞實驗，以MTT實驗和LDH 釋放實驗為指標，觀察三個組分對H2A所致rCMEC損傷的保護作用，評價其抗氧化活性。結(jié)果表明，D2和D3均具有良好的抗氧化損傷活性，進一步通過反相HPLC進行純化。
(4)反相HPLC層析純化經(jīng)陰離子交換柱層析分離后獲得的具有較好抗氧化活性組分，再通過 Waters2545-2489-2676自動純化HPLC系統(tǒng)進一步分離純化；以線性梯度為2% -60%甲醇洗脫，其中含0. 三氟乙酸(TFA)，在230nm下檢測；D2組分反相HPLC層析分離時，收集保留時間約為4. 6min和7. 3min的兩個色譜峰，分別為多肽I和II，其層析示意圖見圖5 ； D3組分反相HPLC層析分離時，收集保留時間約為5. 4min的色譜峰，為多肽III，其層析示意圖見圖6 ；根據(jù)洗脫峰收集樣品，減壓濃縮除去甲醇后，冷凍干燥；凍干后得到3個角類活性多肽凍干粉，分別為I，II和III。多肽I的序列為Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val，多肽II 的序列為 Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn,多肽 III 的序列為 Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn。多肽I和II從D2部分分離純化獲得，多肽III從D3 部分分離純化獲得。(5)純化活性多肽的序列分析在此研究中，我們采用經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS) 和串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MQ分析3個活性多肽的分子量及其氨基酸序列。MALDI-T0F 上樣基質(zhì)選用α-氰基-4-羥基肉桂酸，將大約1μ 1的樣品與1基質(zhì)充分混合后，點樣于上樣靶，室溫下干燥。MALDI-T0F/T0F-MS分析激光波長為337nm，一級質(zhì)譜加速電壓設(shè)置為19kV，串聯(lián)質(zhì)譜最終加速電壓為^kV,串聯(lián)質(zhì)譜大約由1000次轟擊累加而成。結(jié)果獲得 3個多肽的[M+H] +分別為709. 090Da, 1019. 296Da和1272. 379Da ；3個多肽的氨基酸序列分另1J為:Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val, Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn 禾口 Ala-Ala-As p-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn，3個多肽的串聯(lián)質(zhì)譜及氨基酸序列從頭計算示意圖見圖7，圖8和圖9。
權(quán)利要求
1.具有式I的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)。
2.權(quán)利要求1的多肽的制備方法，包括a、取水牛角粉，用純水加熱回流提取，濾過，濾液濃縮冷凍干燥，得粗提物；b、對粗提物進行凝膠柱層析分離，在254nm下檢測流出樣品，根據(jù)檢測器的樣品峰收集每個組分，測定抗氧化活性；C、將最高抗氧化活性的組分進一步利用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分離純化，離子交換柱先用50mM磷酸鹽緩沖液pH6.5，以lml/min流速預(yù)處理池；上樣后，離子交換柱用50mM磷酸鹽緩沖液pH6. 5，以lml/min流速洗脫2h，然后以線性梯度為 0-0. 3MNaCl的磷酸鹽緩沖液50mM，pH6. 5洗脫，洗脫曲線在254nm下檢測；根據(jù)洗脫峰收集每個組分，冷凍干燥；d、將c得到的凍干粉，純水溶解成較高濃度，通過Waters2545-2489-2676自動純化 HPLC系統(tǒng)進行脫鹽，測定抗氧化活性，得到較好抗氧化活性組分D2和D3 ；e、將組分D2和D3，再通過Waters2545-2489-2676自動純化HPLC系統(tǒng)進一步分離純化；以線性梯度為2% -60%甲醇洗脫，其中含0. 三氟乙酸，在230nm下檢測；D2組分反相HPLC層析分離時，收集保留時間約為4. 6min的色譜峰，為多肽I ；收集得到的樣品，減壓濃縮除去甲醇后，冷凍干燥；得到多肽I的凍干粉。
3.—種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。
4.權(quán)利要求1的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備抗氧化藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化活性的六肽、其分離方法及用途。本發(fā)明的多肽具有下列序列結(jié)構(gòu)Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val。這種多肽提取分離自水牛角，藥理試驗證明，本發(fā)明的多肽具有良好的抗氧化活性。
文檔編號C07K1/18GK102321157SQ201110278428
公開日2012年1月18日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者劉睿, 唐于平, 段金廒, 郭建明, 錢大瑋 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)