專利名稱：酒花花葉病毒基因和用于檢測酒花花葉病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酒花花葉病毒的基因(此后簡稱為HMV)和用于檢測HMV的診斷方法。
背景技術(shù)：
HMV，一種酒花的病原性病毒，是一種包含單鏈RNA基因組的絲狀病毒，并且作為酒花潛在病毒屬于相同的香石竹潛病毒組。HMV是對(duì)敏感的酒花品種的花葉病癥狀的一種重要的病原體[Probasco和Skotland，Can.J.Microbiol.22116011162(1976)；Adams和Barbara，應(yīng)用生物學(xué)年評(píng)96201208(1980)；Adams和Barbara，應(yīng)用生物學(xué)年評(píng)101495500(1982)；Yu和Liu，植物病理學(xué)363844(1987)；Kanno等，Ann.Phytopath.Soc.Japan 680(1994)]；因此，對(duì)于酒花的產(chǎn)生，進(jìn)行了不受這一病毒污染的田塊的調(diào)查和無病毒幼苗的監(jiān)測。
通常，為了證實(shí)無病毒幼苗和進(jìn)行田塊調(diào)查以阻止病毒再感染，已經(jīng)使用了免疫診斷方法，如ELISA。然而，經(jīng)ELISA的HMV診斷法存在各種問題，如制備上的困難以及抗體的可用性。此外，即使抗體可供使用，ELISA仍然存在一些問題，例如由于抗體的非特異性反應(yīng)產(chǎn)生的診斷結(jié)果的低準(zhǔn)確度。
另一方面，由于分子生物學(xué)的最新進(jìn)展使得已經(jīng)闡明了各種病毒基因序列，因此可以利用基因工程技術(shù)精確地檢測和診斷某些病毒物種。然而，HMV的檢測依賴于以上提到的免疫學(xué)方法，因?yàn)樗幕蛐蛄羞€沒有被闡明。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人曾積極努力分離和純化HMV基因，并且闡明它的堿基序列。此外，他們已經(jīng)開發(fā)了利用這樣的核酸序列檢測HMV的方法。

發(fā)明內(nèi)容
正如以上所描述的，本發(fā)明提供了酒花花葉病毒的基因或包含其部分序列(即HMV基因的片段)的核酸。
這些分離的與純化的(例如，合成的)核酸使得可以利用遺傳學(xué)方法在酒花種苗內(nèi)和田塊中檢測病毒的存在。例如，采用這些核酸，遺傳學(xué)方法(如PCR，雜交方法等)使得可以以一種高度精確的方式檢測微小量的病毒。
以上描述的核酸可以從酒花花葉病毒的基因組RNA或其對(duì)應(yīng)的cDNA制備。
上述酒花花葉病毒cDNA的堿基序列與SEQ ID NO1中所顯示的堿基1-1844完全相同，或者與該序列是基本上相同的序列。本文中術(shù)語″基本上相同的序列″指利用遺傳學(xué)檢測方法(例如雜交方法等)可以用來檢測酒花花葉病毒的序列，包括與SEQ ID NO1的序列可雜交的那些序列。即這樣的與SEQ ID NO1之序列基本上相同的序列可以利用上述SEQ ID NO1中所示的核酸經(jīng)遺傳學(xué)方法(例如雜交方法等)制備。優(yōu)選地，這些序列是在下文所描述的條件下可雜交的。
此外，可以優(yōu)選地利用上述的部分序列，例如，編碼病毒顆粒和外被蛋白質(zhì)等的構(gòu)成物的基因區(qū)。更具體地說，可以利用編碼由525-1445位堿基編碼的306個(gè)氨基酸殘基的、編碼由1445-1753位堿基編碼的102個(gè)氨基酸殘基的、或者編碼由302-508位堿基編碼的68個(gè)氨基酸殘基的SEQ ID NO1序列。在其中它們用作PCR法的引物和雜交法的探針的情況下，盡管為了利用這些部分序列可以使用以上所述的全長序列，但是在病毒檢測中可以選擇包含至少15個(gè)堿基及合適長度的區(qū)域。例如，為了用作PCR法的引物和雜交法的探針，優(yōu)選地采用SEQ ID NO2和3中所示的堿基序列。本發(fā)明也包括以下任何DNA序列其編碼由SEQ IDNO1的525-1445位堿基編碼的306個(gè)氨基酸殘基、編碼由SEQ ID NO1的1445-1753位堿基編碼的102個(gè)氨基酸殘基、或者編碼由SEQ ID NO1的302-508位堿基編碼的68個(gè)氨基酸殘基。
此外，本發(fā)明提供了通過采用上述純化的核酸的篩選遺傳學(xué)方法檢測酒花樣品內(nèi)酒花花葉病毒，以證實(shí)其是否由這一病毒污染的方法。
根據(jù)本發(fā)明，與常規(guī)的免疫學(xué)技術(shù)比較，存在于微小量樣品中的病毒可以以高的靈敏度得到檢測。以上所述的遺傳學(xué)方法，例如，可以優(yōu)選地使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。也就是說，酒花花葉病毒引起的感染可以按以下步驟快速地得到檢測利用以包含酒花花葉病毒基因部分序列的核酸為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增酒花樣品內(nèi)的核酸，接著，測定擴(kuò)增產(chǎn)物的長度，即檢測從酒花花葉病毒基因擴(kuò)增的核酸在擴(kuò)增中是否確實(shí)產(chǎn)生。當(dāng)然，從酒花花葉病毒基因擴(kuò)增的核酸的存在與待試酒花樣品中的病毒存在相關(guān)聯(lián)，即所試驗(yàn)的酒花受到了病毒的感染。相反地，從酒花花葉病毒基因擴(kuò)增的核酸的不存在與待試酒花樣品中的病毒不存在相關(guān)聯(lián)，即所試驗(yàn)的酒花未受到病毒的感染。
作為以上描述的PCR引物，可以優(yōu)選地使用例如，SEQ ID NO2或3的核酸。當(dāng)它們用作為引物時(shí)，可以通過將被作為最終擴(kuò)增產(chǎn)物的395個(gè)堿基對(duì)的特定DNA片段檢測有酒花花葉病毒引起的感染。引物不僅可以通過組合SEQ ID NO2和3中的序列設(shè)計(jì)，也可以從SEQ ID NO1的序列中選擇合適的區(qū)域來設(shè)計(jì)。此外，部分不同于SEQ ID NO1，2和3中序列的序列也可以用作引物，只要它們能夠退火到酒花花葉病毒基因序列上并被擴(kuò)增。
作為一個(gè)不同于PCR的遺傳學(xué)方法，可以優(yōu)選地使用雜交方法。用于這一雜交方法的探針可以基于酒花花葉病毒基因或其部分序列來制備。例如作為這種探針可以利用在SEQ ID NO1中所描述的核酸，它的互補(bǔ)序列或部分序列，即其片段。作為這種部分序列，可以優(yōu)選地利用SEQ ID NO3中的核酸。此外，即使是部分地不同于SEQ ID NO1中的核酸，但基本上等同于SEQ ID NO1中的核酸，可以雜交到酒花花葉病毒核酸上，這種核酸也可優(yōu)選地作為探針使用。
此外，本發(fā)明為方便地檢測酒花花葉病毒提供了試劑盒，其基于上述核酸和方法。例如，在經(jīng)PCR檢測HMV的情況下，除上述的核酸之外，對(duì)PCR必需的試劑如聚合酶等可以包括在其中。如果必要，陽性或陰性對(duì)照樣品可以包括在其中。通過提供這樣一種試劑盒，可以更方便地檢測酒花花葉病毒。
當(dāng)參照與附圖相聯(lián)系的下文時(shí)，本發(fā)明和其許多存在的優(yōu)點(diǎn)可以更容易地得到理解。


圖1是描述HMV基因cDNA片段大小的電泳照片，該基因是由利用AP2，3NTRAP2以及CARORF3引物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR測定的道MDNA大小標(biāo)記(λDNA的StyI消化物)第1道土豆病毒S第2道酒花潛在病毒第3道酒花花葉病毒第4道蒸餾水。
圖2是描述實(shí)施例5的HMV基因診斷方法中PCR產(chǎn)物之電泳結(jié)果的照片道MDNA大小標(biāo)記(Φx174的HinfI消化物)第1道ELISA的HLV和HMV-陽性酒花(品種Bullion/HLV基因診斷結(jié)果)第2道ELISA的HLV和HMV-陰性酒花(品種Bullion/HLV基因診斷結(jié)果)
第3道ELISA的HLV和HMV-陽性酒花(品種Bullion/HMV基因診斷結(jié)果)第4道ELISA的HLV和HMV-陰性酒花(品種Bullion/HMV基因診斷結(jié)果)。
具體實(shí)施例方式
1.HMV基因的分離純化和其堿基序列的測定1)HMV的濃縮HM可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法從含HMV的酒花濃縮，例如利用聚乙二醇濃縮，用有機(jī)溶劑或熱處理、分布離心等澄清。
2)從HMV濃縮物抽提RNA從HMV濃縮物抽提RNA可以用主要用于從其他植物病毒抽提的標(biāo)準(zhǔn)方法(如SDS苯酚法)進(jìn)行。
3)cDNA的克隆利用所提取的RNA為模板，體外合成雙鏈cDNA。對(duì)于這一雙鏈cDNA的合成，有效的是利用引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，所說的引物是基于相同香石竹潛病毒組之堿基序列設(shè)計(jì)的[Mackenzie等，病毒遺傳學(xué)雜志70，10531063(1989)，Rupasov等，病毒遺傳學(xué)雜志70，1861-1869(1983)，F(xiàn)oster等，病毒遺傳學(xué)雜志71，1877-1880(1990)，Memelink等，病毒遺傳學(xué)雜志71，917-924(1990)，Morozov等，病毒學(xué)183，782-785(1991)，Levay & Zavriev，病毒遺傳學(xué)雜志72，2333-2337(1991)，F(xiàn)oster & Mills，病毒基因63，213-220(1992)，Cavileer等，病毒遺傳學(xué)雜志75，711-720(1994)；所有這些參考文獻(xiàn)并入本文作為參考]。這樣合成的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)整合進(jìn)質(zhì)粒載體。這樣的質(zhì)粒可以使用任何一種，如pUC119，pBluescript II等，它們能夠在大腸桿菌中自主復(fù)制。
在克隆之后，將質(zhì)粒插入到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。細(xì)胞插入所需質(zhì)粒后在培養(yǎng)物中選擇和生長，從由此獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞回收質(zhì)粒，并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化?？梢岳绺鶕?jù)Maniatis等的方法(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，引入本文作為參考)，進(jìn)行從cDNA克隆至質(zhì)粒回收的這些過程。
4)測定來自HMV基因組的cDNA的堿基序列利用以上描述的來源于具有克隆的cDNA插入物的重組質(zhì)粒，其堿基序列可以按照Maxam-Gilbert法或雙脫氧法測定。
2.HMV感染酒花的病毒基因診斷1)利用逆轉(zhuǎn)錄PCR的病毒基因診斷a)引物的合成基于用上述方法所確定的HMV基因組的堿基序列或所說堿基序列的互補(bǔ)鏈的堿基序列合成寡核苷酸，并用作引物。這些在PCR中用為引物的寡核苷酸長度具有至少15個(gè)堿基，優(yōu)選地超過17個(gè)堿基，更優(yōu)選地超過20個(gè)堿基。引物可以具有長度高達(dá)，例如，20，25，30，35，45或50個(gè)堿基，包括在它們之間的所有特定值及子范圍。
更具體地說，優(yōu)選地使用包含SEQ ID NO2或3中堿基序列的引物。此外，與SEQ ID NO2或3中堿基序列不完全相同但包含其部分序列的寡核苷酸也可以用作引物。因?yàn)镻CR主要用來擴(kuò)增從許多堿基選出的序列的特定基因信息的拷貝，所以即使包含與本發(fā)明的引物類似的堿基序列的寡核苷酸也被認(rèn)為作為病毒基因診斷之引物等同可用。
此外，上述寡核苷酸可以以市售的自動(dòng)DNA合成儀，采用例如，氰乙基亞磷酰胺法和硫代亞磷酸酯法獲得。
b)從酒花樣品抽提核酸通過磨碎并在緩沖液中懸浮樣品組織以濃縮病毒，接著經(jīng)苯酚處理等，可以從酒花植物抽提核酸。此外，在任何生長階段的酒花植物都可以用作以上所述的酒花樣品。
c)逆轉(zhuǎn)錄PCR利用如此獲得的核酸和上述的引物，就可以對(duì)來源于HMV基因組的DNA采用例如Saiki等的方法(科學(xué)，230，1350-1354，并入本文作為參考)在一定的條件下嘗試逆轉(zhuǎn)錄PCR。
更具體地說，PCR反應(yīng)溶液可以按以下方法制備。向包含氯化鎂(約1.0mM，優(yōu)選的范圍從約1.5mM-約3.0mM)，氯化鉀，明膠，牛血清白蛋白，表面活性劑(吐溫20，NP-40，曲通X-100等)，二甲基亞砜等的擴(kuò)增緩沖液中加入兩種不同的寡核苷酸，DNA聚合酶，四種堿(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)以及從酒花樣品中提取的DNA。此外，熱穩(wěn)定DNA聚合酶由一種從PERKIN ELMER獲得的酶例證性說明。
在PCR反應(yīng)中，重復(fù)下列循環(huán)過程20-50次，優(yōu)選地25-40次。變性步驟通過一般在90℃-95℃下，優(yōu)選地在約94℃-95℃下加熱反應(yīng)混合物約30秒鐘-2分鐘，優(yōu)選地約30秒鐘-2分鐘完成。引物退火步驟通過一般在30-60℃下，優(yōu)選地在約30℃-55℃下與引物一起溫育約1分鐘-約3分鐘，優(yōu)選地約1分鐘-2分鐘進(jìn)行。DNA聚合酶延伸步驟一般在約70℃-約73℃下，優(yōu)選地在72℃-73℃下以熱穩(wěn)定DNA聚合酶處理約30秒鐘-約4分鐘，優(yōu)選地約30秒鐘-約2分鐘進(jìn)行。
由上述PCR獲得的DNA通過在瓊脂糖凝膠，丙烯酰胺凝膠等上電泳分級(jí)分離，根據(jù)DNA大小選擇。在瓊脂糖凝膠的情況下，通?？梢栽诩s0.5％-約3％的濃度下使用。電泳緩沖液由Tris-磷酸鹽(pH 7.5-pH8.0)，Tris-乙酸鹽(pH 7.5-pH 8.0)，Tris-硼酸鹽(pH7.5-pH8.3)(優(yōu)選地為Tris-硼酸鹽)系統(tǒng)等例證性地說明，如果必要，可以向其中加入EDTA等。
電泳在例如50V-300V下進(jìn)行10分鐘到120分鐘，優(yōu)選地在150V下進(jìn)行30分鐘，并且，可以使用大小標(biāo)記，例如，一種市售的100Base-PairLadder(Pharmacia公司)。在電泳之后，這樣分級(jí)分離的擴(kuò)增DNA可以用染色方法顯影以便檢測，其中采用可以與核酸相互作用的菲啶系列的染料，如溴化乙錠。所說的染色染料不僅可以在電泳之后加入，而且也可以在其之前加入到電泳緩沖液中。在電泳終止后的染色的情況下，凝膠浸沒在溴化乙錠等溶液中約60分鐘，在暗處以254nm或366nm紫外光照射，檢測紅色的帶。此外，在電泳期間染色的情況下，染料如溴化乙錠以約0.5g/ml的終濃度加入至電泳緩沖液中。在染色與電泳同時(shí)進(jìn)行的情況下，通過在暗處用254nm或366nm UV照射(即使在電泳期間)來檢測紅色帶。
病毒感染可以由存在或不存在擴(kuò)增的DNA進(jìn)行檢測。即利用相同的引物進(jìn)行PCR時(shí)，來源于病毒感染的酒花樣品檢測到特異性擴(kuò)增的DNA，而未感染的酒花樣品檢測不到。
例如，當(dāng)上述的SEQ ID NO2和3的堿基序列用作引物時(shí)，包含395個(gè)堿基對(duì)的特異性DNA節(jié)段由病毒感染的酒花樣品擴(kuò)增。然而，在轉(zhuǎn)化的HMV的情況下，所說的特異性DNA節(jié)段可以在長度上發(fā)生變化。
(2)雜交的基因診斷不同于常規(guī)免疫測定的HMV診斷可以通過以下方法進(jìn)行，通過化學(xué)合成或基因操作制備具有互補(bǔ)于HMV基因組DNA的序列的核酸，與所說的核酸探針雜交。
由于探針采用鏈長度一般具有20至幾千個(gè)堿基的核酸，所以以用限制酶切割所說HMV基因組cDNA所產(chǎn)生的DNA片段為例說明。在雜交之前，這些探針在末端或內(nèi)部經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的方法用輻射發(fā)射物修飾，所說的輻射發(fā)射物例如放射性同位素，熒光劑等，二級(jí)可標(biāo)記的物質(zhì)如生物素，地高辛配基等等，酶如堿性磷酸酶等。
用于雜交的酒花植物核酸可以按標(biāo)準(zhǔn)方法抽提，例如，在Murray &Thompson，核酸研究，8，4321-4325(1980)(并入本文作為參考)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)核酸抽提方法。將這樣獲得的核酸進(jìn)行變性處理，并且點(diǎn)在濾膜上，如硝酸纖維素濾膜或尼龍濾膜上，優(yōu)選地，例如，Hybond-N+(Amersham)。
通過在包含甲酰胺，MOPS，乙酸鈉，EDTA等的溶液中于60-70℃下，優(yōu)選地在65℃下加熱5-20分鐘，優(yōu)選地15分鐘，然后迅速冷卻進(jìn)行核酸的變性處理。在這一變性處理之后，核酸與20XSSC混合，然后點(diǎn)在濾膜上。
將點(diǎn)在濾膜上的核酸在42-65℃，優(yōu)選地在46℃的條件下在雜交溶液中與以上描述的探針雜交12-20小時(shí)，優(yōu)選地是16小時(shí)。在進(jìn)行反應(yīng)后，沖洗濾膜，干燥，并且由檢測方法，例如放射自顯影等檢測在點(diǎn)樣處是否存在信號(hào)。即具有來源于病毒感染酒花的核酸(DNA+RNA)的樣品檢測到信號(hào)，因?yàn)樗鼈兣c探針雜交，而來源于未感染酒花的樣品檢測不到信號(hào)，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈εc探針互補(bǔ)的序列。
3.HMV基因的合成核酸的應(yīng)用HMV基因的合成核酸不僅可以用于以上所述方法檢測HMV病毒，而且可以用于經(jīng)反義技術(shù)產(chǎn)生酒花對(duì)現(xiàn)有病毒的抗性。更具體地說，HMV基因以使得可以形成反義RNA的方式插入到表達(dá)載體中，并且用所說載體轉(zhuǎn)化酒花，導(dǎo)致產(chǎn)生顯示對(duì)病毒的抗性的轉(zhuǎn)化的酒花。
實(shí)施例在下列實(shí)施例中，將參照例子詳細(xì)描述本發(fā)明，它們用來說明但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1HMV的濃縮HMV-感染的酒花的種苗莖干(品種Bullion，HMV的單一感染由ELISA確認(rèn))(100g)在4體積的0.5M磷酸鉀緩沖液，pH7.2，(包含1％亞硫酸鈉)中磨碎，并且通過紗布過濾獲得粗提物。然后，將曲通X-100(8ml)加入至所說的抽提物中，并且，在混合攪拌1小時(shí)后，在3,000xg下離心10分鐘，以獲得上清液。向上清液中加入1/3體積的四氯化碳，在冰冷的情況下攪拌混合物3分鐘，在3,000xg下離心10分鐘再次獲得上清液。向如此獲得的上清液中加入聚乙二醇(20g)和氯化鈉(2.4g)，攪拌混合物40分鐘，靜置1小時(shí)，然后在3,000xg下離心40分鐘，獲得沉淀。將該沉淀懸浮在0.5M磷酸鉀緩沖液，pH7.2(包含1％曲通X-100)中，高速(在15,000xg下10分鐘)離心，獲得上清液，將其進(jìn)一步超離心(在100,000xg下120分鐘)，回收沉淀。重復(fù)這一分級(jí)離心方法兩次，將病毒和污染物分離，使其懸浮在0.5M磷酸鉀緩沖液(pH7.2)中，并以HMV濃縮物貯存。
除非有其他說明，以上所描述的所有過程均在4℃下進(jìn)行。
實(shí)施例2從HMV抽提RNA從HMV濃縮物抽提RNA由SDS苯酚法[Proll等，土豆研究24，110(1981)，并入本文作為參考]完成。
向與實(shí)施例1類似的方法獲得的HMV濃縮溶液(178μl)中加入20％SDS(10μl)，20XSSC(2μl)和蛋白酶(20mg/ml)(10μl)，將所形成的混合物在37℃溫?zé)?0分鐘。然后通過加入0.5％皂土懸液(100μl)和TE-飽和的苯酚(300μl)到上述混合物中進(jìn)行苯酚抽提，接著用等體積的苯酚∶三氯甲烷(1∶1，v/v)進(jìn)行第二次苯酚抽提。在含水層以三氯甲烷抽提之后，向含水層加入3M乙酸鈉(10μl)和冷乙醇(250μl)，使所形成的混合物在-80℃下靜置30分鐘。然后將混合物在15,000xg下離心5分鐘，以獲得沉淀，用70％乙醇經(jīng)離心洗滌之。經(jīng)干燥除去乙醇后，將由此獲得的沉淀溶解在蒸餾水(100μl)中。向這一溶液中加入4M氯化鋰(100μl)，使混合物在冰浴中靜置一夜。
然后將上述混合物在15,000xg下離心5分鐘，獲得沉淀，如上再次用70％乙醇經(jīng)離心洗滌之，經(jīng)干燥除去乙醇后，將沉淀溶解在蒸餾水(20μl)中，并作為RNA樣品貯存。
實(shí)施例3cDNA的克隆首先，基于與HMV屬于相同組的香石竹潛病毒(Calravirus)的堿基序列，合成CARORF引物(5′TGCCACTTACACCGCCTCCT3′)(SEQ IDNO4)，AP2引物(5′-GCTACCATGGACGTCCGCGCGG(T)15-3′)(SEQID NO5)(其中一個(gè)銜接子連接到oligo-dT上)，和3NTRAP 2引物(5′-CGATGGTACCTGCAGGCGCGCC-3′)(SEQ ID NO6)(其互補(bǔ)于所說的AP2引物序列)。向RNA樣品(3μl)加入10μM AP2引物(1μl)和蒸餾水(7μl)，使混合物在65℃下靜置10分鐘。然后經(jīng)迅速冷卻，與5X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(GIBCO BRL)(4μl)，2.5mM dNTP(1μl)和逆轉(zhuǎn)錄酶(2,000U/μl，GIBCO BRL)(1μl)混合來變性RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃下進(jìn)行1小時(shí)。
為了進(jìn)行PCR，制備包含10XPCR緩沖液(Boehringer)(5μl)，2.5mMdNTP(4μl)，10μM 3NTRAP2引物(1μl)，10μM CARORF3引物(1μl)，熱穩(wěn)定DNA聚合酶(5U/μl，Boehringer)(1μl)和蒸餾水(33μl)的反應(yīng)溶液。反應(yīng)條件如下每一個(gè)循環(huán)包含變性步驟(98℃，30秒)和延伸步驟(68℃，5分鐘)，將這一循環(huán)重復(fù)30次。將所擴(kuò)增的產(chǎn)品的十分之一在1.0％瓊脂糖凝膠上(在1XTRE緩沖液中)進(jìn)行電泳，并且鑒別約1.8Kb的擴(kuò)增的DNA節(jié)段(圖1)。
然后，將以上描述的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物平端化，并與pUC119的SmaI限制酶位點(diǎn)連接。更具體地說，用SmaI消化質(zhì)粒pUC119制備一些節(jié)段，將其進(jìn)一步脫磷酸化(50ng/μl)(2μl)，與平端PCR產(chǎn)物混合(1μl)。其次，向這一混合中加入10mM ATP，10X連接緩沖液(Boehringer)，T4 DNA連接酶(5U/μl，Boehringer)和蒸餾水(13μl)，將所形成的混合物在22℃下保持溫?zé)徇^夜以促進(jìn)連接反應(yīng)。
制備大腸桿菌MV1184(100μL)的感受態(tài)細(xì)胞，與以上描述的連接反應(yīng)溶液混合，使混合物在冰上靜置30分鐘，在42℃以下溫?zé)?0秒，并在冰上迅速冷卻。向這一細(xì)胞溶液加入SOC介質(zhì)(500μl)，將所形成的混合物在37℃下溫?zé)?小時(shí)，在瓊脂介質(zhì)上平緩溫育，并在37℃下溫育過夜。這里所使用的瓊脂介質(zhì)是通過向2XYT瓊脂介質(zhì)添加2％X-gal(50μl)，100mM IPTG(50μl)和氨芐青霉素(50g/ml)制備的。
在溫育一夜后，選擇多個(gè)白色菌落(Lac Z-)，分別接種到液體培養(yǎng)基中，并溫育。從這些培養(yǎng)溶液用標(biāo)準(zhǔn)的方法抽提質(zhì)粒DNA。選擇具有帶來源于插入的HMV基因組cDNA片段(約1.8Kb)的質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞，并貯存。
實(shí)施例4測定來源于HMV基因組的cDNA堿基序列將在實(shí)施例3中選擇的大腸桿菌細(xì)胞于37℃下在2×YT培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)一夜，用標(biāo)準(zhǔn)方法制備質(zhì)粒。以以上描述的cDNA片段為模板，利用DNA測序儀(Li-Cor公司)和測序試劑盒(Amersham)，用雙脫氧方法[Sanger等，美國科學(xué)院院報(bào)，74，5463(1977)，并入本文作為參考]對(duì)它們的堿基序列解碼，以確定1844個(gè)堿基的序列。這些結(jié)果在SEQ ID NO1中顯示。
從如此獲得的堿基序列，分析翻譯區(qū)。結(jié)果在所說的堿基序列中，鑒別了編碼具有約6.9kD蛋白質(zhì)(68個(gè)氨基酸殘基)的翻譯區(qū)(序列表中SEQ ID NO1的302-508位堿基的序列)，推定的編碼外殼蛋白(306個(gè)氨基酸殘基，分子量33.9kD)的翻譯區(qū)(序列表中SEQ ID NO1的525-1445位堿基的序列)，編碼具有約11.3kD分子量的蛋白質(zhì)(102個(gè)氨基酸殘基)的翻譯區(qū)(序列表中SEQ ID NO1的1445-1753位堿基的序列)。
實(shí)施例5經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄PCR的HMV-感染酒花的基因診斷將HMV-感染酒花(品種，Bullion)或無病毒酒花(相同品種)的葉子(各0.1g)分別在0.5M磷酸鉀緩沖液(pH7.2，1ml)中磨碎，以三氯甲烷抽提磨碎物溶液。在由此獲得的上清液用苯酚，然后用醚處理三次后，將乙醇加入至沉淀核酸中。通過在70％乙醇中離心洗滌由此獲得的沉淀，經(jīng)干燥除去剩下的乙醇。將干燥的核酸溶解在蒸餾水(50 1)中，將2-1小份進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。
用于PCR的引物基于本發(fā)明的堿基序列設(shè)計(jì)，用DNA合成儀(ABI，380B型)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法合成。這里合成的引物序列在SEQ ID NO2和3中顯示，此后分別簡稱為1P和1M。
利用這些引物，完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。首先，將1M引物(25pM)，逆轉(zhuǎn)錄酶(Nippon Gene，5U)，以及以上所制備的酒花核酸(2μg)混合。向這一混合物中加入50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.3)(包含75mM KCl，3mMMgCl2，10mM DDT和0.5mM dNTP)，將所形成的混合物在37℃溫育1小時(shí)。
然后，向逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品中加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Boehringer，0.5U)和擴(kuò)增引物(25pM)以完成PCR。將反應(yīng)溶液的體積設(shè)定為10μl，將礦物油(約20μl)置于頂層以阻止反應(yīng)溶液蒸發(fā)。
每一個(gè)PCR中的步驟在下列條件下完成。在將PCR混合物在94℃保持3分鐘后，將包含在94℃下1分鐘的變性步驟在55℃下1分鐘的引物退火步驟，在72℃下2分鐘的DNA延伸步驟的PCR循環(huán)重復(fù)30次。然后，將反應(yīng)溶液在72℃下保持5分鐘，并且在4℃下貯存。
經(jīng)電泳分析由以上描述的PCR獲得的擴(kuò)增DNA的大小，所說的電泳在包含2mM EDTA的Tris-硼酸鹽緩沖液(pH8.0)中在2％瓊脂糖凝膠上100V下進(jìn)行30分鐘，大小標(biāo)記使用由限制酶HinfI(Nippon Gene)消化的x174 DNA。
在電泳完成后，將凝膠浸沒在溴化乙錠水溶液中(0.5g/ml)10分鐘，在暗處以UV 254nm照射以檢測DNA-溴化乙錠復(fù)合物的紅色帶。由電泳獲得的分級(jí)分離模式在圖2中顯示。
作為瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，從與所利用的引物對(duì)應(yīng)的HMV-感染的酒花獲得特定的DNA擴(kuò)增片段(395bp)，但不能從未感染的酒花獲得，使得可以區(qū)別二者。
實(shí)施例6經(jīng)斑點(diǎn)印跡雜交的基因診斷由下列過程制備進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交的樣品。
將HMV-感染酒花或無病毒酒花的葉子(各0.1g)在0.5M磷酸鉀緩沖液(pH7.2，1ml)中磨碎，以三氯甲烷抽提磨碎物溶液。在由此獲得的上清液用苯酚，然后用醚處理三次后，將乙醇加入至沉淀核酸中。通過在70％乙醇中離心洗滌由此獲得的沉淀，經(jīng)干燥除去剩下的乙醇。將干燥的核酸溶解在TE緩沖液(20μl)中。
向2-μl小份所說的溶液中加入三體積的核酸變性緩沖液(由65％甲酰胺，20％甲醛，1.54M MOPS，6.5mM乙酸鈉和1.3mM EDTA組成)，將混合物在65℃下溫?zé)?5分鐘，然后迅速冷卻。向這一溶液加入20XSSC(由0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉組成，pH7.0)。將10-μl小份所形成的混合物點(diǎn)在濾膜(Amersham，商品名Hybond-N+)上，并且進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。
通過用限制酶BamHI與EcoRI消化實(shí)施例4中制備的大腸桿菌來源的質(zhì)粒，并純化消化物形成探針。這一純化步驟通過用瓊脂糖凝膠分離消化的片段并用柱(Takarashuzo，商品名Suprec01 TM柱)洗脫HMV-來源的cDNA。
然后，采用隨機(jī)標(biāo)記試劑盒(Takarashuzo)用[32P]dCTP標(biāo)記這樣洗脫的cDNA，并且通過Sephadex G50柱，以除去未結(jié)合的[32P]dCTP。在包含5XSSC，100μg/ml酵母tRNA(Boehringer)，0.5％SDS，0.1％菲可，0.1％PVP以及0.1％BSA的溶液中于46℃進(jìn)行雜交16小時(shí)。放射自顯影圖結(jié)果顯示，在來源于HMV-感染酒花的點(diǎn)樣點(diǎn)觀察到信號(hào)，從無HMV酒花觀察不到信號(hào)。
從以上描述的結(jié)果可知，已經(jīng)證實(shí)，按照所說信號(hào)的存在或不存在可以將HMV-感染的酒花與無HMV酒花區(qū)分開。
如上所述，在本發(fā)明中，不僅闡明了從3′-末端到1884位堿基的HMV基因組基因結(jié)構(gòu)，而且也開發(fā)了HMV基因診斷方法，使得能夠提供用于HMV的高精確檢測方法。按本發(fā)明的遺傳學(xué)檢測方法中，不需要常規(guī)免疫學(xué)方法所需的許多檢測步驟，包括HMV的分離，抗血清的制備，抗體的純化，使得可以更快速地檢測HMV。此外，本發(fā)明的遺傳學(xué)檢測方法使得可以以比常規(guī)ELISA更高準(zhǔn)確度與精確度診斷HMV感染。另外，通過這所說病毒基因的反義鏈轉(zhuǎn)化酒花，本發(fā)明使得可以使酒花產(chǎn)生對(duì)所說病毒的抗性。
明顯地，在以上內(nèi)容教導(dǎo)下，本發(fā)明的許多修改和變化是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可以在附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)，而不是在本文具體描述范圍內(nèi)實(shí)施。
本申請(qǐng)以日本專利申請(qǐng)平9-212568(1997年7月23日)為基礎(chǔ)，其全文并入本文作為參考。
序列表SEQ ID NO1長度1844類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型物種cDNA序列描述CGCCTGATTA CACCAAAGTT TTGGCTAGTG CTGTGATCGG GGCTACGTTA 50GCACTCATCA CGTGGACCTT GAGTAGGAAC ACATTGCCAC AAGTTGGGGA 100TAGGGATCAT TATCTGCCGC ACGGGGGTTT CTATAGGGAC GGTACGAAAG 150TTATTCGCTA CTTTGGGCCG AATAAGCTAA ATTCCCTGGA AGGTAGATCT 200GGTGGAGGGC TCTGGCAGCC TTGGGCCATA GTCGTGGTGC TGGTAGCAGT 250TATAGTTGGA CTCAGCAAGG GTTTCTACCC ACGGTGCGCT AGGTGTGGCC 300A ATG TCA TTA AAT CTG GTC TGC GCC TGT GTC GGG TTA GTT 340Met Ser Leu Asn Leu Val Cys Ala Cys Val Gly Leu Val
TGC TTC GCT TGC ATT TTG GTG TAC CTG AGT GGT GGA GGC AAT AGC 385Cys Phe Ala Cys Ile Leu Val Tyr Leu Ser Gly Gly Gly Asn SerTGT ATA GTT GTC CTA ACG GGG GAA TCA GTT AGG TTC CAA GGT TGC 430Cys Ile Val Val Leu Thr Gly Glu Ser Val Arg Phe Gln Gly CysGAC GTC ACA GAA GAG TTC GCG CGT GCC TTA TCA AAC GTC AAG TCC 475Glu Val Thr Glu Glu Phe Ala Arg Ala Leu Ser Asn Val Lys SerCTT GGG GGT TGT GGT ACT TTA GGT TTA GAG TGAATAATTG TCAAAATA 524Leu Gly Gly Cys Gly Thr Leu Gly Leu GluATG TCT GGG AGT ACT GAA GCA GGA AAG CTT GCC CCT GAG GCC CAG 569Met Ser Gly Ser Thr Glu Ala Gly Lys Leu Ala Pro Glu Ala GlnAAA CCG CAG TAT GGT GGG GAA GAA ACC AAG CTC AAG GAG AAA GTG 614Lys Pro Gln Tyr Gly Gly Glu Glu Thr Lys Leu Lys Glu Lys ValGGG GCT GGC GAG TCC TCA ACC GTA AGT GTA GAT GAT TAC GCT GCC 659Gly Ala Gly Glu Ser Ser Thr Val Ser Val Asp Asp Tyr Ala AlaGGG CTT AAA GAT CTG GAG GCG GTC CGG GAG GAA ATG CTA GAA GCG 704Gly Leu Lys Asp Leu Glu Ala Val Arg Glu Glu Met Leu Glu Ala
AGA TTG GAG AAG CTG AGG GAA TTT ATG CGC AGC GGC GCA GTG CTG 749Arg Leu Glu Lys Leu Arg Glu Phe Met Arg Ser Gly Ala Val LeuTTC AAT CAC GAA TTC TGG CTT GGA ACT GGT AGG CCG GCT TTG ACA 794Phe Asn His Glu Phe Trp Leu Gly Thr Gly Arg Pro Ala Leu ThrCTT ACT GCT GAT ATG CGC TCC GAC CCA GCC AAC CCT TAC TGT AAA 839Leu Thr Ala Asp Met Arg Ser Asp Pro Ala Asn Pro Tyr Cys LysCCA TCT CTT GAC TCA CTG CTG CGT ATA CCA CCG AAA CCT GTT TCC 884Pro Ser Leu Asp Ser Leu Leu Arg Ile Pro Pro Lys Pro Val SerAAT AAT ATG GCT ACC GCA GAG GAC ATA ATG AAA ATC TAT ACA AAC 929Asn Asn Met Ala Thr Ala Glu Asp Ile Met Lys Ile Tyr Thr AsnTTG GAG GGG CTA GGT GTA CCG ACT GAG CAC ATA CAA AGG GTA ATC 974Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu His Ile Gln Arg Val IleATT CAG GCA GTG ATA TAT TGT AAG GAT GCG AGC AGC TCT GTA TAT 1019Ile Gln Ala Val Ile Tyr Cys Lys Asp Ala Ser Ser Ser Val TyrCTA GAT CCA AGG GGC TCT TTT GAG TGG CCT GGC GGA GCC ATT GCA 1064Leu Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Trp Pro Gly Gly Ala Ile Ala
GCT GAC TCA GTA CTG GCC ATT ATG AAG AAG GAC GCA GAA ACA CTT 1109Ala Asp Ser Val Leu Ala Ile Met Lys Lys Asp Ala Glu Thr LeuCGG AGG GTC TGC CGA TTG TAT GCA CCC GTG ACG TGG TCT TAC ATG 1154Arg Arg Val Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Val Thr Trp Ser Tyr MetTTG GTG CAC AAC CAG CCA CCC TCT GAC TGG GCG GCC ATG GGG TTT 1199Leu Val His Asn Gln Pro Pro Ser Asp Trp Ala Ala Met Gly PheCAA TTC GAG GAT CGC TTT GCT GCC TTC GAC TGC TTC GAT TAT GTT 1244Gln Phe Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe Asp Cys Phe Asp Tyr ValGAG AAT GCA GCT GCC GTA CAA CCG CTT GAA GGC ATT GTA AGG CGA 1289Glu Asn Ala Ala Ala Val Gln Pro Leu Glu Gly Ile Val Arg ArgCCA ACT CCA AGG GAG AAG CTG GCG CAC AAC ACA CAC AAA GAT ATG 1134Pro Thr Pro Arg Glu Lys Leu Ala His Asn Thr His Lys Asp MetGCC CTT CGA AAA GCC AAT AGG AAT CAG CAT TTT GGG AAT ATG GAC 1379Ala Leu Arg Lys Ala Asn Arg Asn Gln His Phe Gly Asn Met AspGTG GAG GTC ACC GGC GGC CGC AGT GGC CCA GAG ATT ATC CGT GAT 1424Val Glu Val Thr Gly Gly Arg Ser Gly Pro Glu Ile Ile Arg Asp
TAT TCC AAG TCG AAT AGG TA ATG ATG CAC TGG TGG CGT GCT GCT 1468Tyr Ser Lys Ser Asn Arg Met Met His Trp Trp Arg Ala AlaATG TTA TTA TAT AAA GTT ATG TTT GAT GTG TGT GGT AGG TCT AGT 1513Met Leu Leu Tyr Lys Val Met Phe Asp Val Cys Gly Arg Ser SerCTT TAC ATT AGC GTT GAT ATA GCT CGG AGG GCG GGC CGT CCT ATT 1558Leu Tyr Ile Ser Val Asp Ile Ala Arg Arg Ala Gly Arg Pro IleGGG GGC GGT AAG TCG TCC TAT GCT CGT AAG AGA CGC GCA ATA AAG 1603Gly Gly Gly Lys Ser Ser Tyr Ala Arg Lys Arg Arg Ala Ile LysATG GGG CGA TGT GTG CGG TGC TAC CGC GTC TCA CCG CCT TTC TAT 1648Met Gly Arg Cys Val Arg Cys Tyr Arg Val Ser Pro Pro Phe TyrCAT ACT ACT AGA TGT GAC GGT TTG TCG TGT GTA CCT GGA CTC TCG 1693His Thr Thr Arg Cys Asp Gly Leu Ser Cys Val Pro Gly Leu SerCTA AAT GCT GGC GTC GCC AGG TTA ATC AAG GGT GGA GTA ACT GAG 1738Leu Asn Ala Gly Val Ala Arg Leu Ile Lys Gly Gly Val Thr GluGTG ATC CCA TCC TAGTCCAAAT GAAGCGAGAG TAGCCACTAA ATCCTATTTA 1790Val Ile Pro Ser
ATATATAAGG TGTGCTACTA TAAATAAAAT TTGGTTTTTA AATATTTTTA 1840GC CASEQ ID NO2長度20類型核酸鏈型單拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型物種合成DNA序列描述GGAATCAGCA TTTTGGGAATSEQ ID NO3長度20類型核酸鏈型單拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型物種合成DNA序列描述ATGGGATCAC CTCAGTTACTSEQ ID NO4長度20類型核酸鏈型單拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型物種合成DNA序列描述TGCCACTTAC ACCGCCTCCTSEQ ID NO5長度23類型核酸鏈型單拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型物種合成DNA序列描述GCTACCATGG ACGTCCGCGC GGTSEQ ID NO6長度22類型核酸鏈型單拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型物種合成DNA序列描述CGATGGTACC TGCAGGCGCG CC
權(quán)利要求
1.一種核酸分子，其包含酒花花葉病毒基因或所說基因的片段，其中所說的酒花花葉病毒基因或其片段選自如下一組(a)包含編碼由SEQ ID NO1的第525-1445位核苷酸編碼的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子；(b)包含編碼由SEQ ID NO1的第1445-1735位核苷酸編碼的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子；(c)包含編碼由SEQ ID NO1的第302-508位核苷酸編碼的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子；(d)包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的核酸分子；和(e)包含SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，其是一種cDNA分子。
3.一種測定酒花樣品中酒花花葉病毒存在的方法，該方法包括(i)用含有(b)從酒花獲得的核酸的樣品處理(a)權(quán)利要求1或2的核酸分子；(ii)檢測(a)和(b)之間的雜交存在或不存在。
4.權(quán)利要求3的方法，其中(a)包含由限制酶切割的包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列的核酸分子。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中在所說的樣品中存在或不存在酒花花葉病毒在實(shí)施所說的方法之前是未知的。
6.一種在酒花樣品中測定酒花花葉病毒存在的方法，該方法包括(i)在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中用含有(b)從酒花獲得的核酸的樣品處理(a)權(quán)利要求1或2的核酸分子；以及(ii)檢測在所說的PCR中經(jīng)(a)由(b)中酒花花葉病毒基因序列擴(kuò)增產(chǎn)生的核酸的存在或不存在。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在所說的檢測步驟中檢測酒花花葉病毒基因395個(gè)堿基對(duì)片段存在或不存在。
8.用以檢測酒花花葉病毒的試劑盒，其包含權(quán)利要求1或2的核酸分子。
全文摘要
已分離和純化了酒花花葉病毒(HMV)基因，并且已闡明了其堿基序列。可以利用分離的HMV基因的核酸序列經(jīng)簡單并精確的方法檢測HMV。這些方法對(duì)于在植物中檢測HMV感染尤其有用。與常規(guī)的免疫學(xué)方法(如ELISA)相比，利用本發(fā)明提供的方法更簡單并精確地檢測HMV是可能的。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1844135SQ20051002298
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期1998年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月23日
發(fā)明者須田成志, 畑谷達(dá)兒 申請(qǐng)人:薩波羅啤酒株式會(huì)社