同時檢測番茄黃化曲葉病毒及伴隨的越南番茄黃化曲葉衛(wèi)星DNAβ的方法及其專用引物組的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種同時檢測番茄黃化曲葉病毒及伴隨的越 南番茄黃化曲葉衛(wèi)星DNA0的方法及其專用引物組。
【背景技術】
[0002] 雙生病毒（Geminivirus)是一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀植物DNA病毒， 在世界范圍內廣泛發(fā)生，并已在多種作物上造成毀滅性危害。自20世紀90年代起，在中 國的云南、廣西、廣東和福建等南方各?。▍^(qū)）該病毒病害危害日趨嚴重。番茄黃化曲葉 病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)和中國番木瓜曲葉病毒（Papayaleaf curlChinavirus，PaLCuCNV)都屬于雙生病毒科（Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬 (Begomovirus)成員，番前黃化曲葉病毒于20世紀50年代末始發(fā)于以色列，目前已在全世 界40多個國家和地區(qū)大面積暴發(fā)，自20世紀90年代傳入我國以來，由南向北、自東向西迅 速全國性蔓延，已在臺灣、廣東、廣西、浙江、江蘇、上海、云南、四川、陜西、山東、安徽、河北、 天津和北京等20多個番茄主產區(qū)大范圍發(fā)生，特別是對我國北方秋茬保護地和南方露地 番茄生產造成了極其嚴重的損失。
[0003] 雙生病毒分為四個屬，玉米線條病毒屬、甜菜曲頂病毒屬、番前偽曲頂病毒屬和菜 豆金色花葉病毒屬。菜豆金色花葉病毒屬多數為雙組份基因組，即DNAA和DNAB。少數為單 組份基因組，其基因組結構只有DNAA。有些單組份菜豆金色花葉病毒屬病毒成員常伴隨有 其它小分子衛(wèi)星DNA，包括衛(wèi)星DNA0及衛(wèi)星DNAa等，被伴隨的這些菜豆金色花葉病毒屬 病毒稱為輔助病毒，DNAP已被證明為致病因子，能夠影響輔助病毒在寄主中的積累，又是 引起典型癥狀不可缺少的因子，它與輔助病毒之間沒有序列同源性，并且必須依賴于輔助 病毒進行復制、包裹和移動。在田間自然發(fā)病的植株中，這些單組份雙生病毒常與其伴隨的 衛(wèi)星DNA形成病害復合體，有的伴隨一種衛(wèi)星DNA，有的伴隨兩種，例如雙生病毒/DNA0病 害復合體、雙生病毒/DNAa病害復合體、雙生病毒/DNAP/DNAa病害復合體等。
[0004] 番茄黃化曲葉病毒屬于菜豆金色花葉病毒屬病毒，是一種單組份雙生病毒。番茄 植株感染番茄黃化曲葉病毒病后，初期主要表現為生長遲緩或停滯，植株節(jié)間變短，植株明 顯矮化，葉片變小變厚；葉質脆硬，葉片有褶皺、向上卷曲，葉片邊緣至葉脈區(qū)域黃化，植株 上部葉片癥狀比較典型，下部老葉癥狀不明顯。由于番茄黃化曲葉病毒和越南衛(wèi)星DNA0 有潛在的致病力增強的威脅，且復合侵染的產區(qū)正在擴大，開發(fā)能同時檢測兩種成分的特 異、簡便和靈敏的方法對這種病害的新疫情的早期預警和及時防控具有現實意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種同時檢測番茄黃化曲葉病毒和/或越南 衛(wèi)星DNA0的方法。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了引物組。
[0007] 本發(fā)明所提供的引物組，由引物對TY和引物對0組成；
[0008] 所述引物對TY由名稱為TY-F的引物和名稱為TY-R的引物組成；所述TY-F為序 列表中序列1所示的單鏈DNA;所述TY-R為序列表中序列2所示的單鏈DNA;
[0009] 所述引物對e由名稱為e-F的引物和名稱為e-R的引物組成；所述e-F為序 列表中序列4所示的單鏈DNA;所述0 -R為序列表中序列5所示的單鏈DNA。
[0010] 所述引物對TY也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0011] 所述引物對0也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述引物組、所述引物對TY或所述引物對0的制備方法。
[0013] 所述引物組的制備方法可包括將所述引物組中各條引物分別單獨包裝或所述引 物組中各條引物的量按照1:1:1:1比例混合在一起。
[0014] 所述引物對TY的制備方法可包括將所述TY-F和所述TY-R分別單獨包裝或所述 TY-F的量和所述TY-R的量按照1:1比例混合在一起。
[0015] 所述引物對P的制備方法可包括將所述P-F和所述P-R分別單獨包裝或所述 0 -F的量和所述0 -R的量按照1:1比例混合在一起。
[0016] 本發(fā)明還提供了試劑盒A、試劑盒B和試劑盒C。
[0017] 所述試劑盒A含有所述引物組。
[0018] 所述試劑盒B含有所述引物對TY。
[0019] 所述試劑盒C含有所述引物對0。
[0020] 所述試劑盒A可為將反應試劑A和空白對照組裝在一起得到的產品。
[0021] 所述試劑盒B可為將反應試劑B和空白對照組裝在一起得到的產品。
[0022] 所述試劑盒C可為將反應試劑C和空白對照組裝在一起得到的產品。
[0023] 所述反應試劑A，可包括 10XEasyTaqBuffer(含Mg2+) 2. 5yL、TaqDNA聚合 酶（5U/yL) 0? 5yL、ddH20 18. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、TY-F(濃度為 10ymol/ L)0. 5yL、TY-R(濃度為 10ymol/L)0. 5yL、0-F(濃度為 10ymol/L)0. 5yL和 0-R(濃 度為 10ymol/L) 0? 5yL，共 24yL。
[0024] 所述反應試劑B，可包括lOXEasyTaqBuffer(含Mg2+)2.5yL、TaqDNA聚合 酶（5U/yL) 0? 5yL、ddH20 19. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、0-F(濃度為 10ymol/ 1)〇.5 1^和0-1?(濃度為1〇4111〇1/1)〇.5 1^，共241^〇
[0025] 所述反應試劑C，可包括 10XEasyTaqBuffer(含Mg2+) 2. 5yL、TaqDNA聚合 酶（5U/yL) 0? 5yL、ddH20 19. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、TY-F(濃度為 10ymol/ L) 0? 5yL和TY-R(濃度為 10ymol/L) 0? 5yL，共 24yL。
[0026] 所述空白對照為滅菌超純水，使用時加入1yL。
[0027] 所述lOXEasyTaqBuffer(含Mg2+)為北京全式金生物技術有限公司產品，目錄號 為API11-02 的"EasyTaqDNAPolymerase" 中的組件。
[0028] 下述cl)_c6)中至少一種應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0029] cl)上述任一所述試劑盒A檢測待測樣本中是否含有或疑似含有番茄黃化曲葉病 毒和/或越南衛(wèi)星DNA0中的應用；
[0030] c2)上述任一所述試劑盒A檢測待測病毒是否為候選的番茄黃化曲葉病毒或越南 衛(wèi)星DNA0中的應用。
[0031] c3)上述任一所述試劑盒B檢測待測樣本中是否含有或疑似含有番茄黃化曲葉病 毒中的應用；
[0032] c4)上述任一所述試劑盒B檢測待測病毒是否為候選的番茄黃化曲葉病毒中的應 用；
[0033] c5)上述任一所述試劑盒C檢測待測樣本中是否含有或疑似含有越南衛(wèi)星DNA0 中的應用；
[0034] c6)上述任一所述試劑盒C檢測待測病毒是否為候選的越南衛(wèi)星DNAP中的應用。
[0035] 下述al)_a9)中至少一種應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0036] al)上述任一所述引物組制備用于檢測番茄黃化曲葉病毒和/或越南衛(wèi)星DNA0 的試劑盒中的應用；
[0037]a2)上述任一所述引物組檢測待測樣本中是否含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒 和/或越南衛(wèi)星DNA中的應用；
[0038]a3)上述任一所述引物組檢測待測病毒是否為候選的番茄黃化曲葉病毒或越南衛(wèi) 星DNAI3中的應用；
[0039]a4)上述任一所述引物對TY制備用于檢測番茄黃化曲葉病毒的試劑盒中的應用；
[0040]a5)上述任一所述引物對TY檢測待測樣本中是否含有或疑似含有番茄黃化曲葉 病毒中的應用；
[0041] a6)上述任一所述引物對TY檢測待測病毒是否為候選的番茄黃化曲葉病毒中的 應用；
[0042] a7)上述任一所述引物對制備用于檢測越南衛(wèi)星DNAI3的試劑盒中的應用；
[0043]a8)上述任一所述引物對檢測待測樣本中是否含有或疑似含有越南衛(wèi)星DNA0 中的應用；
[0044] a9)上述任一所述引物對0檢測待測病毒是否為候選的越南衛(wèi)星DNAP中的應 用。
[0045] 本發(fā)明還提供了如下dl)_d3)中至少一種方法：
[0046] dl) -種檢測待測樣本是否含有番茄黃化曲葉病毒和/或越南衛(wèi)星DNAP的方法， 可包括如下步驟：
[0047] 提取待測樣本的基因組DNA，以上述任一所述引物組進行PCR擴增，然后進行如下 評判：（1)如果PCR擴增產物中含有DNA分子1、則待測樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲 葉病毒，如果PCR擴增產物中不含有DNA分子1、則待測樣本中不含有或疑似不含有番茄黃 化曲葉病毒；（2)如果PCR擴增產物中含有DNA分子2、則待測樣本中含有或疑似含有越南 衛(wèi)星DNA，如果PCR擴增產物中不含