專利名稱：雙丁二酮化合物、銪配合物、含該配合物的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型雙丁二酮化合物、含該化合物作為配位體的銪配合物以及含該銪配合物的組合物。本發(fā)明還涉及所述組合物在化學(xué)發(fā)光免疫分析中的用途。
背景技術(shù)：
迄今為止，生物體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)的免疫測定方法已經(jīng)歷了由放射免疫分析(RIA)、熒光免疫分析(FIA)、酶聯(lián)免疫分析(EIA)，以及化學(xué)發(fā)光免疫分析等諸階段。這一衍變過程主要是基于對檢測方法的敏感性、準(zhǔn)確性、以及操作簡捷性的需求的不斷提高而決定的。
正如放射免疫(RIA)分析技術(shù)當(dāng)年從發(fā)明到應(yīng)用的推陳出新的歷程一樣，化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測法成為現(xiàn)今取代放射免疫分析的有力分析手段和技術(shù)。在國際領(lǐng)域內(nèi)，化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測法已成為臨床檢驗(yàn)的一個非常重要的新技術(shù)和檢測手段，并將延展至臨床檢驗(yàn)的各個領(lǐng)域，這也是臨床檢驗(yàn)界的一致共識。
化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光波進(jìn)行檢測的方法?；瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記應(yīng)用于核酸檢測與免疫檢測中。例如，可通過多種途徑將特異結(jié)合對中的某一分子與發(fā)光物質(zhì)結(jié)合形成發(fā)光復(fù)合物。該復(fù)合物可與樣品中被檢測物(特異結(jié)合對中的另一分子)反應(yīng)，分配于固相與液相中，且分配比例與檢測物的量相關(guān)。通過測定固相或液相中發(fā)光量，即可得出樣品中檢測物的相應(yīng)濃度。
具體地說，在均相條件下，將包被有活性分子并且內(nèi)部帶有染料的感光微球(納米級)以及包被有活性分子并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微球(納米級)的混合物作為試劑和有可能含有目標(biāo)分子的檢測樣品混合。此時包被有活性分子的納米感光微球和包被有活性分子的納米發(fā)光微球可迅速有效地捕捉目標(biāo)分子，納米感光微球、納米發(fā)光微球和目標(biāo)分子一起形成近距離的夾心復(fù)合物。經(jīng)激發(fā)光照射，納米感光微球中的染料被誘導(dǎo)激活并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離的納米發(fā)光微球俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微球中的發(fā)光化合物。發(fā)光微球中的發(fā)光化合物可于數(shù)微秒后在零背景無干擾的情況下釋放出高能級紅光。用光子計(jì)數(shù)器測定這些高能級光子并通過電腦將光子數(shù)量換算為目標(biāo)分子濃度，光子數(shù)量的多少即精確地反映了目標(biāo)分子的濃度。
美國專利5,709,994公開了一種測定目標(biāo)分子的方法，它包括對可能含有目標(biāo)分子的組合物進(jìn)行光輻照的步驟，所述組合物包括非顆?；|(zhì)或顆?；|(zhì)，所述基質(zhì)包被有經(jīng)光輻照會產(chǎn)生單線態(tài)氧的光敏劑和可被所述單線態(tài)氧活化的化學(xué)發(fā)光化合物。它還具體公開了所述化學(xué)發(fā)光化合物選自9-亞烷基-N-甲基吖啶、烯醇醚和烯胺，所述光敏劑選自亞甲基藍(lán)、玫瑰紅、卟啉、酞菁和葉綠素。但是，這種光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物形成的特異結(jié)合對具有發(fā)光效率低的缺點(diǎn)。
美國專利5,780,646公開了一種組合物，它包括(a)一種至少六配位的金屬鰲合物和(b)一種具有兩個芳基的帶雙鍵的化合物。它還提到所述化合物(b)可具有如下通式 其中，X′是S；D和D′各自選自CH3和(CH2)9CH3，R′為(CH2)6CH3或者(CH2)7CH3。
所述金屬鰲合物(a)可具有下列通式 (3a)
(3b)它還公開了在上式(3a)和(3b)中的一個TTA可被一個下述分子所代替 或者，上式(3a)和(3b)中的兩個TTA可各自被選自下列分子的基團(tuán)所代替
(3n) (3o) (3r) 或者，三個TTA可各自被選自下列分子的基團(tuán)所代替
與現(xiàn)有技術(shù)相比，美國專利5,780,646通過加入銪配合物極大地提高了發(fā)光效率，從而提高了檢測靈敏度。但是，這種方法還存在如下缺點(diǎn)由于現(xiàn)有的銪配合物鰲合度不夠，金屬銪離子會鰲合在納米微球的表面，造成納米微球表面包被容量下降。并且降低了發(fā)光效率。在將這種含所述金屬鰲合物(a)和所述具有兩個芳基的帶雙鍵的化合物(b)的組合物置于納米級發(fā)光微球中以后，發(fā)現(xiàn)發(fā)光微球的包被容量下降最高達(dá)40％；發(fā)光效率下降了30％-40％。
因此，需要開發(fā)一種新的、具有很強(qiáng)的鰲合力的金屬鰲合物，它可以避免金屬銪離子與納米微球表面基團(tuán)的反應(yīng)，從而避免了納米微球表面包被容量以及發(fā)光效率的下降。
發(fā)明的內(nèi)容鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明的一個目的是提供一種新型的發(fā)光組合物，它不會影響發(fā)光顆粒的包被容量并且顯著提高了發(fā)光球的發(fā)光效率，尤其提高了檢測信號值。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于免疫分析的雙丁二酮化合物。
因此，本發(fā)明提供一種具有如下通式的雙丁二酮化合物 其中X是具有1-5個碳原子直鏈烷基或者具有下式的芳基，其中Y是1-5個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代基 或者 本發(fā)明還提供一種化學(xué)發(fā)光組合物，它包括
1)帶有本發(fā)明雙丁二酮化合物作為配位體的銪配合物；2)具有下列通式的含烯鍵化合物 其中，X′是S或NR，R是具有1-10個碳原子的烷基或者6-18個碳原子的芳基；R′是氫原子或者具有1-10個碳原子的烷基；D和D′各自為氫原子或者具有1-20個碳原子的烷基。


圖1是光激化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(LICA)檢測原理圖，其中圖1a是包被第一抗體并含有光敏試劑的光敏微球的示意圖；圖1b是加入檢測試樣后被檢測抗原與第一抗體結(jié)合的示意圖；圖1c是加入包被有第二抗體并含有發(fā)光組合物的微球的示意圖；圖1d是光致發(fā)光的示意圖。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，除非另有說明，否則術(shù)語“烷基”是指具有1-10個碳原子、較好1-6個碳原子，更好1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，它包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、正戊基、異戊基、正己基、壬基、癸基等。
在本發(fā)明中，術(shù)語“芳基”是指具有6-18個環(huán)碳原子的芳香基團(tuán)，它可以是未取代的，或者被具有1-10個碳原子的烷基所取代。
圖1是本發(fā)明光激化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(LICA)檢測原理圖。如圖1a所示，納米級的微球10中帶有光敏劑，該微球表面包被有第一抗體1。如圖1b所示，當(dāng)將包被有第一抗體1并含有光敏劑的納米微球加入含被檢測抗原2的試樣中以后，第一抗體1會與抗原2相結(jié)合。如圖1c所示，發(fā)光微球20是含有發(fā)光組合物的納米微球，它表面包被有第二抗體3。當(dāng)將所述發(fā)光微球20加入上述試樣中以后，該發(fā)光微球上包被的第二抗體3也會與已經(jīng)與第一抗體1結(jié)合的抗原2相結(jié)合，形成夾合體。如圖1d所示，當(dāng)用激光輻照光敏微球以后，光敏微球中的光敏劑會放出單線態(tài)氧，該單線態(tài)氧被發(fā)光微球中的發(fā)光組合物俘獲后，會激發(fā)發(fā)光組合物中的發(fā)光化合物，發(fā)出特定波長的光線。通過檢測該波長的光線就可測定抗原的量。
下面結(jié)合附圖更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
一.光敏微球用作本發(fā)明光敏微球10的納米級微球基質(zhì)是本領(lǐng)域已知的微球基質(zhì)，例如，它可以是例如羧基改性的乳膠顆粒。這種顆粒的詳細(xì)情況可參見美國專利5,709,994與5,780,646(該文獻(xiàn)在此全文引為參考)。
用于光敏微球中的光敏劑無特別的限制，它可以是本領(lǐng)域已知的光敏劑，其非限定性例子有例如美國專利5,709,994公開的亞甲基藍(lán)、玫瑰紅、卟啉、酞菁和葉綠素。
在光敏微球中光敏劑的載帶量無特別的限制，它可以是本領(lǐng)域常用的量。適用于本發(fā)明的光敏微球以及第一抗體的包被方法可例如參見美國專利5,709,994與5,780,646。
用于將光敏劑加入納米微球的方法以及包被該光敏微球的方法可以是本領(lǐng)域常用的任何方法。這種方法可例如參見美國專利5,709,994與5,780,646。
二.發(fā)光微球1.基質(zhì)用作本發(fā)明發(fā)光微球20的納米級微球基質(zhì)是本領(lǐng)域已知的微球基質(zhì)，它可以與所述光敏微球基質(zhì)相同或不相同。例如，它可以是例如羧基改性的乳膠顆粒。這種顆粒的詳細(xì)情況可參見美國專利5,780,646和5,709,994(該文獻(xiàn)在此全文引為參考)。
2.發(fā)光組合物本發(fā)明發(fā)光微球中所含的發(fā)光組合物包括一種帶雙丁二酮化合物作為配位體的銪配合物和一種含不飽和烯鍵的化合物。這兩種組分的含量無特別的限制，只要能使該組合物的發(fā)光效率滿足最終免疫分析即可。在本發(fā)明的一個較好實(shí)例中，所述銪配合物占10-400mg/g微球，較好占50-200mg/g微球，更好占100mg/g微球；所述含不飽和烯鍵的化合物較好占50-500mg/g微球，更好占100-300mg/g微球，最好占200mg/g微球。
a.含烯鍵的化合物適用于本發(fā)明組合物的含烯鍵的化合物具有如下通式 其中，X′是S或NR，R是具有1-10個碳原子的烷基或者6-18個碳原子的芳基；R′是氫原子或者具有1-10個碳原子的烷基；D和D′各自為氫原子或者具有1-20個碳原子的烷基。
在本發(fā)明中，X′可以是NR，其中R是具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或者6-18個碳原子的取代或未取代的芳基。在本發(fā)明的一個較好實(shí)例中，所述R基團(tuán)是具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，較好為1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基。在本發(fā)明的另一個較好的實(shí)例中，所述R基團(tuán)是具有6-18個碳原子的芳基，它選自例如苯基、被具有1-10個碳原子的烷基取代的苯基；所述烷基取代基的例子有甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、己基、庚基、辛基、異辛基等。
在本發(fā)明的一個較好實(shí)例中，所述含烯鍵的化合物具有如下通式 其中，D和D′各自選自氫原子或者具有1-20個碳原子的直鏈或支鏈烷基，較好為具有6-20個碳原子直鏈或支鏈烷基、更好為具有6-15個碳原子的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選為(CH2)5CH3或者(CH2)13CH3；R′為氫原子或者具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，較好為具有1-6個碳原子直鏈或支鏈烷基、更好為具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選為(CH2)6CH3或者(CH2)7CH3。
在本發(fā)明的另一個較好實(shí)例中，所述含烯鍵的化合物具有如下通式
其中，D和D′各自選自(CH2)5CH3或者(CH2)13CH3；R′為氫原子、(CH2)6CH3或者(CH2)7CH3。
在本發(fā)明再一個較好的實(shí)例中，所述含烯鍵的化合物是如下化合物 其中各取代基的含意見下表A表A化合物 XArAr′1O 2S 3S 4S
5S 6 7 本發(fā)明上述含烯鍵的化合物的合成方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，它可采用美國專利5,780,646所述的方法合成。
b.雙丁二酮配位體適用于本發(fā)明銪配合物的雙丁二酮配位體具有如下通式 其中，X是具有1-5個碳原子直鏈烷基或者具有下式的芳基，其中Y是氫原子或者是具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代基 或者 在本發(fā)明的一個較好實(shí)例中，所述X基團(tuán)選自亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、鄰亞苯基、3-甲基-1，2-亞苯基、4-甲基-1，2-苯基、3-乙基-1，2-亞苯基、4-乙基-1，2-苯基、2，3-亞萘基、1，8-亞萘基、4-甲基-1，8-亞萘基、3-戊基-1，2-亞苯基、4-己基-1，2-苯基、5-庚基-2，3-亞萘基、5-(2′-甲基己基)-2，3-亞萘基、4-乙基-1，8-亞萘基、5-甲基-1，8-亞萘基、4-丙基-1，8-亞萘基、4-甲基-2，3-亞萘基、4-乙基-2，3-亞萘基、5-甲基-2，3-亞萘基、4-丙基-2，3-亞萘基。
適用于本發(fā)明的雙丁二酮化合物的非限定性例子有，例如下列化合物1)1，1-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)甲烷；
2)1，2-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)乙烷；3)1，3-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丙烷；4)1，6-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丁烷；5)4，4′-二(1″，1″，1″-三氟-2″，4″-丁二酮-4″-基)鄰聯(lián)三苯；6)3-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；7)4-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；8)3-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；9)4-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；10)2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；11)5-庚基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；13)4-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。
17)1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；18)5-庚基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；13)4-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。
以X是苯基為例，在本發(fā)明的一個較好實(shí)例中，所述配位體是將二苯基取代的X化合物與乙酰鹵反應(yīng)，形成二(對甲基羰基苯基)取代的X化合物，隨后再使得到的二(對甲基羰基苯基)取代的X化合物與三氟乙酸乙酯反應(yīng)，生成本發(fā)明雙丁二酮化合物。本發(fā)明雙丁二酮化合物的合成路徑如下
c.帶本發(fā)明雙丁二酮配位體的銪配合物本發(fā)明銪配合物可用通式Eu2(X″)3(DYE)2表示，其中，DYE是本領(lǐng)域常用的染料，其非限定性例子有例如TOPO(三辛基氧膦)或者DPP。較好是DPP(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)，它是一類常用的染料，它具有下列結(jié)構(gòu) 該配合物中配位體X″是本發(fā)明雙丁二酮化合物，而染料DYE可采用本領(lǐng)域常用的方法制得，或從化學(xué)公司購得。
3.發(fā)光球的制造方法將所述銪配合物放入納米發(fā)光球中的方法以及包被該發(fā)光球的方法可以是本領(lǐng)域常用的任何方法。在本發(fā)明的一個較好實(shí)例中，采用美國專利5,780,646公開的發(fā)光球制造方法，只是用本發(fā)明帶雙丁二酮配位體的銪配合物代替其金屬螯合物。
在本發(fā)明的另一個較好實(shí)例中，使用本發(fā)明銪配合物形成的新型發(fā)光組合物不會影響發(fā)光顆粒的包被容量并且顯著提高了發(fā)光球的發(fā)光效率，尤其提高了檢測信號值，從而減少了測量誤差。
下面，結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明測試方法1.包被容量取一組不同濃度的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入1mL蒽酮，在85℃孵育30分鐘。冷卻至室溫后，測定不同溶液在636nm處的吸光光度值(日立U-3000型分光光度計(jì)，購自日本日立公司)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在樣品納米發(fā)光球上包被葡聚糖，隨后加入1ml蒽酮，在85℃，孵育30分鐘。冷卻至室溫后，測定其在636nm處的吸光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微球表面的包被容量。
2.發(fā)光效率取等體積500μl的包被有抗體的感光球(50μg)與發(fā)光球(6.25μg)，加入50μl抗原與100μl作為檢測緩沖液的50mM磷酸鹽緩沖液(購自Sigma)混合。37度溫育15分鐘后，利用PMT光子計(jì)數(shù)器(購自上海朋遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司)讀取光子數(shù)。
合成例1合成含不飽和烯鍵的化合物(A)將34.4g(0.2mol)溴代苯胺溶解在125ml DMF中，加入0.6mol溴代十四烷及0.6mol二異丙基乙胺，反應(yīng)溶液加熱到100℃，然后反應(yīng)12小時。反應(yīng)的溶液加入300ml二氯甲烷，水洗三次除去DMF。去除二氯甲烷，產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶。得到N，N-二取代的對溴苯胺(式I化合物)，反應(yīng)的產(chǎn)率為70％ D＝D′＝C14H29向一個裝有滴液漏斗、溫度計(jì)和回流冷凝管的I ml圓底三頸燒瓶中加入100ml干燥的THF，隨后加入3g金屬鎂條，在回流條件下加入少量上面得到的N，N-二取代的對溴苯胺產(chǎn)物(式I化合物)以啟動反應(yīng)，并加入少量的碘以幫助反應(yīng)啟動。將0.11mol上述N，N-二取代的對溴苯胺產(chǎn)物(式I化合物)溶解于50ml干燥的THF中，并置于滴加漏斗中，緩緩地滴加此溶液并保持回流。加液完畢后讓反應(yīng)回流1小時。用冰浴冷卻反應(yīng)體系，在℃時緩緩地滴加0.1mol下式(II)化合物(購自Aldrich/Sigma)的50ml THF溶液。讓反應(yīng)在0℃進(jìn)行30分鐘，然后放置于室溫2小時。緩緩地加入0.1N HCl溶液以水解生成的鎂鹽。加入200mlCH2Cl2，然后用水洗滌有機(jī)層2-3次。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥。用硅膠柱分離所需產(chǎn)品。用20％乙酸乙脂80％正乙烷溶液分離產(chǎn)品，產(chǎn)品的Rf值在0.5左右。(20％乙酸乙脂/80％正乙烷/TLC)純化后的產(chǎn)品(式III化合物)產(chǎn)率為35％。
在一個帶有冷凝管的500ml圓底燒瓶中將0.1mol上述式III化合物溶解在100ml甲苯中，加入少量ZnCl2及0.11mol式IV化合物?；亓鞑⑷コ傻乃７磻?yīng)4小時反應(yīng)基本完成。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除多余的甲苯。然后用硅膠柱分離純化最后的產(chǎn)品(用95正乙烷，5％乙酸乙脂)，得到化合物A，產(chǎn)率為60％。
1H NMR7.0ppm-7.26ppm(多重峰，7H)，6.42ppm-6.44ppm(多重峰，2H)，4.48ppm-4.50ppm(多重峰，2H)，3.16ppm-3.32ppm(多重峰，4H)，1.52ppm-1.57ppm(多重峰，4H)，1.3ppm(多重峰，44H)，0.86ppm(3重峰，6H)。
合成例2合成含不飽和烯鍵的化合物(B)將34.4g(0.2mol)溴代苯胺溶解在125ml DMF中，加入0.6mol溴代丁烷及0.6mol二異丙基乙胺，反應(yīng)溶液加熱到100℃，然后反應(yīng)12小時。反應(yīng)的溶液加入300ml二氯甲烷，水洗三次除去DMF。去除二氯甲烷，產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶。得到N，N-二取代的對溴苯胺(式1化合物)，反應(yīng)的產(chǎn)率為70％ 向一個裝有滴液漏斗、溫度計(jì)和回流冷凝管的500ml圓底三頸燒瓶中加入100ml干燥的THF，隨后加入3g金屬鎂條，在回流條件下加入少量上面得到的N，N-二取代的對溴苯胺產(chǎn)物(式1化合物)以啟動反應(yīng)。將0.11mol上述N，N-二取代的對溴苯胺產(chǎn)物(式1化合物)溶解于50ml干燥的THF中，并置于滴加漏斗中，緩緩地滴加此溶液并保持回流。加液完畢后讓反應(yīng)回流1小時。用冰浴冷卻反應(yīng)體系，在℃時緩緩地滴加0.1mol下式(2)化合物(購自Aldrich/Sigm)的50ml THF溶液。讓反應(yīng)在0℃進(jìn)行30分鐘，然后放置于室溫2小時。緩緩地加入0.1N HCl溶液以水解生成的鎂鹽。加入200mlCH2Cl2，然后用水洗滌有機(jī)層2-3次。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥。用硅膠柱分離所需產(chǎn)品。用20％乙酸乙脂80％正乙烷溶液分離產(chǎn)品，產(chǎn)品的Rf值在0.5左右。(20％乙酸乙脂/80％正乙烷/TLC)純化后的產(chǎn)品(式3化合物)產(chǎn)率為35％。
在一個帶有冷凝管的500ml圓底燒瓶中將0.1mol上述式3化合物溶解在100ml甲苯中，加入少量ZnCl2及0.11mol式4化合物?；亓鞑⑷コ傻乃?。反應(yīng)4小時反應(yīng)基本完成。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除多余的甲苯。然后用硅膠柱分離純化最后的產(chǎn)品(用95正乙烷，5％乙酸乙脂)，得到化合物B，產(chǎn)率為60％。
1H NMR 7.0ppm-7.26ppm(多重峰，6H)，6.42ppm-6.44ppm(多重峰，2H)，4.48ppm-4.50ppm(多重峰，2H)，3.16ppm-3.32ppm(多重峰，4H)，2.2ppm(單重峰，3H).1.52ppm-1.57ppm(多重峰，4H)，0.86ppm(3重峰，6H)。1.3ppm(多重峰，4H)。
合成例3合成配位體化合物1
(1)將2.3g鄰苯基聯(lián)苯溶解在20ml干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94g AlCl3，然后冷卻到0℃。在劇烈的攪拌下加入2g的CH3C(O)Cl(購自Aldrich/Sigma)。滴加完成后讓反應(yīng)在室溫反應(yīng)1-2小時。有機(jī)溶液用水洗三次，然后用無水硫酸鈉干燥。去除溶劑后得到2.6g產(chǎn)物(81％產(chǎn)率)。
1H NMR7.1-7.9ppm(多重峰，12H)，2.3ppm(單重峰，6H)(2)將1.6g上述產(chǎn)物溶解在20ml的無水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇鈉)及2g CF3-C(O)OEt(三氟乙酸乙酯)。讓反應(yīng)在室溫下攪拌2-3小時。然后用水洗三次。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，除去有機(jī)溶液后得到1.6g產(chǎn)物(產(chǎn)率80％) 1H NMR 7.1-7.9ppm(多重峰，12H)，4.5ppm(單峰，4H)合成例4合成配位體化合物2
(1)，1.7g二苯甲烷溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94g AlCl3，然后冷卻到0℃。在劇烈的攪拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反應(yīng)在室溫反應(yīng)1-2小時。有機(jī)溶液用水洗三次，然后用無水硫酸鈉干燥。去除溶劑后得到1.4g產(chǎn)物(70％產(chǎn)率) 1H NMR7.6-7.9(雙重峰，4H)，3.1(單重峰，2H)，2.3(單重峰，6H)(2)上述1.3g上述產(chǎn)物溶解在20ml的無水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇納)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。讓反應(yīng)在室溫下攪拌2-3小時。然后用水洗三次。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，除去有機(jī)溶液后得到1.2g產(chǎn)物(產(chǎn)率80％) 1H NMR7.6-7.9(雙重峰，4H)，4.5(單重峰，4H)，3.1(單重峰，2H)。
合成例5合成配位體化合物3(1)，2.5g甲基鄰苯基聯(lián)苯溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94g AlCl3，然后冷卻到0℃。在劇烈的攪拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反應(yīng)在室溫反應(yīng)1-2小時。有機(jī)溶液用水洗三次，然后用無水硫酸鈉干燥。去除溶劑后得到1.4g產(chǎn)物(70％產(chǎn)率) 1H NMR7.6-7.9(多重峰，7H)，2.1(單重峰，3H)，2.3(單重峰，6H)
(2)上述1.7g上述產(chǎn)物溶解在20ml的無水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇納)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。讓反應(yīng)在室溫下攪拌2-3小時。然后用水洗三次。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，除去有機(jī)溶液后得到1.6g產(chǎn)物(產(chǎn)率80％) 1H NMR7.6-7.9(多重峰，7H)，4.5(單重峰，4H)，2.1(單重峰，3H)。
合成例6合成配位體化合物4(1)，2.9g鄰二苯基萘溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94gAlCl3，然后冷卻到0℃。在劇烈的攪拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反應(yīng)在室溫反應(yīng)1-2小時。有機(jī)溶液用水洗三次，然后用無水硫酸鈉干燥。去除溶劑后得到1.4g產(chǎn)物(70％產(chǎn)率) 1H NMR7.3-7.9(多重峰，10H)，2.3(單重峰，6H)(2)上述1.9g上述產(chǎn)物溶解在20ml的無水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇納)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。讓反應(yīng)在室溫下攪拌2-3小時。然后用水洗三次。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，除去有機(jī)溶液后得到1.8g產(chǎn)物(產(chǎn)率80％)
1H NMR7.3-7.9(多重峰，10H)，4.5(單重峰，4H)。
實(shí)施例1合成帶雙二丁酮配位體的銪配合物將2.932克EuCl3·6H2O與6.39克上面制得的配位體化合物1混合，加入40mL無水乙醇溶解。攪拌加入2mL NH3·H2O，pH為8左右。室溫?cái)嚢?小時。將溶液加入到800mL去離子水中，過濾溶液，收集沉淀，為10.3g。真空干燥后得到Eu(配位體化合物1)2·H2O，純度約為90％。
取4.0克DPP與120mL乙醇加熱溶解，冷卻后收集重結(jié)晶晶體。稱取3.014克Eu(配位體化合物1)2·H2O與0.997克DPP，加入300mL甲苯，62℃攪拌反應(yīng)一小時。冷卻到室溫，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲苯。真空干燥，收集銪配合物1。
制造發(fā)光球用美國專利5,780,646的實(shí)施例所述的方法將200mg合成例1制得的含烯鍵化合物A和100mg上面制得的銪配合物1放入200nm的納米顆粒(購自美國BangsLaboratories，Inc)中，形成發(fā)光球Eu-A。
包被抗體取10mL上述制得的發(fā)光球(20mg/mL，50mM磷酸鹽緩沖液，內(nèi)部染料為含烯鍵化合物A與本發(fā)明制得的銪配合物1)，加入40mg Amino-Dextran(4％，緩沖體系0.05Mes buffer)，20mg EDAC(4％，緩沖體系50mM磷酸鹽緩沖液)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。Sorvall SA-600轉(zhuǎn)頭4℃離心1小時，轉(zhuǎn)速為15,000rpm。離心后棄上清液，以8mL 50mM磷酸鹽緩沖液重懸浮。重復(fù)離心清洗三次。
取上述制備得到的發(fā)光球(25mg/mL，50mM磷酸鹽緩沖液，內(nèi)部染料為含烯鍵化合物A與本發(fā)明制得的銪配合物1，外部包被有Dextran)0.4ml，加入8.16mgIgG1按美國專利5,780,646實(shí)施例1所述制得的本發(fā)明發(fā)光球。
制造感光球用美國專利5,780,646的實(shí)施例所述的方法將200mg葉綠素A放入200nm的納米顆粒(購自美國Bangs Laboratories，Inc)中，并參照上述包被抗體的方法包被IgG2，形成本法明感光球。
包被容量測定用上面所述的包被容量測試方法測得本發(fā)明試樣的包被容量，結(jié)果列于表1。
用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
實(shí)施例2用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例2的發(fā)光球，但是使用合成例2合成的帶不飽和烯鍵化合物B和合成例4制得的配位體化合物2，制得發(fā)光球Eu-B。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
實(shí)施例3用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例3的發(fā)光球，但是使用合成例1合成的帶不飽和烯鍵化合物A和合成例5制得的配位體化合物3，制得發(fā)光球Eu-C。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
實(shí)施例4用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例4的發(fā)光球，但是使用合成例2合成的帶不飽和烯鍵化合物B和合成例6制得的配位體化合物4，制得發(fā)光球Eu-D。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
比較例1用與實(shí)施例1相同的方法制得發(fā)光球，但是使用TTA(噻吩三氟丁二酮)代替本發(fā)明的雙丁二酮配位體制得銪配合物 實(shí)施例5用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例5的發(fā)光球，但是使用根據(jù)美國專利5,780,646實(shí)施例2制得的上表A所列的帶不飽和烯鍵化合物2和合成例6制得的配位體化合物4，制得發(fā)光球Eu-E。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
實(shí)施例6用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例6的發(fā)光球，但是使用根據(jù)美國專利5,780,646實(shí)施例3制得的上表A所列的帶不飽和烯鍵化合物3和合成例5制得的配位體化合物3，制得發(fā)光球Eu-F。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
實(shí)施例7用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例7的發(fā)光球，但是使用根據(jù)美國專利5,780,646實(shí)施例4制得的上表A所列的帶不飽和烯鍵化合物5和合成例4制得的配位體化合物2，制得發(fā)光球Eu-G。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
實(shí)施例8用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例8的發(fā)光球，但是使用根據(jù)美國專利5,780,646實(shí)施例5制得的上表A所列的帶不飽和烯鍵化合物6和合成例3制得的配位體化合物1，制得發(fā)光球Eu-H。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
實(shí)施例9用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例9的發(fā)光球，但是使用根據(jù)美國專利5,780,646實(shí)施例6制得的上表A所列的帶不飽和烯鍵化合物7和合成例3制得的配位體化合物1，制得發(fā)光球Eu-I。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
為進(jìn)行比較，表1還給出了空白微球(200nm，25mg/mL，50mM磷酸鹽緩沖液，內(nèi)部無染料，外部包被有Dextran)的包被容量，結(jié)果列于表1。
實(shí)施例10用與實(shí)施例1相同的方法制得實(shí)施例10的發(fā)光球，但是使用TOPO取代DPP制得發(fā)光球Eu-J。
使用與實(shí)施例1相同的感光球和包被容量試驗(yàn)方法測得試樣的包被容量，結(jié)果列于表1用上面發(fā)光效率試驗(yàn)方法測得試樣的發(fā)光效率，結(jié)果列于表2。
表1

表2

由試驗(yàn)結(jié)果可見，用本發(fā)明發(fā)光組合物填入納米微球以后，該微球的包被容量與空白球相當(dāng)，而采用現(xiàn)有的銪配合物包被納米微球以后，其包被容量明顯下降。另一方面，由表2可見，如果將現(xiàn)有的發(fā)光球的發(fā)光效率定為1，則本發(fā)明發(fā)光球的發(fā)光效率分別為1.5和1.4，明顯高于現(xiàn)有的發(fā)光球的發(fā)光效率。上述試驗(yàn)證明，本發(fā)明通過改變銪配合物的配位化合物，極大地改進(jìn)了納米微球的包被容量和發(fā)光效率，取得了意想不到的效果。
在不偏離本發(fā)明發(fā)明思想的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和改進(jìn)。本發(fā)明包括在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的各種變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種具有如下通式的雙丁二酮化合物 其中X是具有1-5個碳原子直鏈烷基；或者具有下式的芳基，其中Y是1-5個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代基 或
2.如權(quán)利要求1所述的雙丁酮化合物，其特征在于所述X基團(tuán)選自具有1-3個碳原子的直鏈烷基、 或者 其中，Y是氫原子或甲基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的雙丁酮化合物，其特征在于x選自亞甲基或鄰亞苯基。
4.如權(quán)利要求1所述的雙丁酮化合物，其特征在于它選自1)1，1-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)甲烷；2)1，2-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)乙烷；3)1，3-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丙烷；4)1，6-二(對(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丁烷；5)4，4′-二(1″，1″，1″-三氟-2″，4″-丁二酮-4″-基)鄰聯(lián)三苯；6)3-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；7)4-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；8)3-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；9)4-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；10)2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；11)5-庚基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；13)4-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。17)1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；18)5-庚基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；1 3)4-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。
5.一種化學(xué)發(fā)光組合物，它包括a)銪配合物，該銪配合物帶有權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的雙丁二酮化合物作為配位體；2)具有下列通式的含烯鍵化合物 其中，X′是S或NR，R是具有1-10個碳原子的烷基或者6-18個碳原子的芳基；R′是氫原子或者具有1-10個碳原子的烷基；D和D′各自為氫原子或者具有1-20個碳原子的烷基。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于X′是硫原子。
7.如權(quán)利要求5或6所述的組合物，其特征在于R′是1-4個碳原子的烷基。
8.如權(quán)利要求5或6所述的組合物，其特征在于D和D′各自選自氫原子或者具有4-14個碳原子的烷基。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于D和D′各自選自氫原子、丁基或者十四烷基。
10.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于含烯鍵的化合物是具有如下結(jié)構(gòu)的化合物 其中各取代基選自
11.一種銪配合物，它含有權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物作為配位體。
12.如權(quán)利要求11所述的銪配合物在免疫分析中的用途。
全文摘要
公開了一種化學(xué)發(fā)光組合物，它包括1)式I的銪配合物，其中X是具有1－5個碳原子直鏈烷基或者芳基和2)式II的含烯鍵化合物，其中，X′是S或NR，R是具有1－10個碳原子的烷基或者6－18個碳原子的芳基；R′是氫原子或者具有1－10個碳原子的烷基；D和D′各自為氫原子或者具有1－20個碳原子的烷基。還公開了所述化學(xué)發(fā)光組合物在免疫分析中的用途。
文檔編號C07C49/00GK1696093SQ200510023820
公開日2005年11月16日 申請日期2005年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月4日
發(fā)明者何元 申請人:上海朋遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司