專利名稱：一類含硫結(jié)構(gòu)化合物、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型含硫結(jié)構(gòu)化合物，制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)遞質(zhì)(Neurotransmitter)是神經(jīng)系統(tǒng)中傳輸神經(jīng)信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)揮中扮演重要角色。神經(jīng)遞質(zhì)的作用是改變某些靶細(xì)胞的電和/或化學(xué)特性。但是當(dāng)這些遞質(zhì)在中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的作用發(fā)生紊亂和異常時(shí)則會(huì)引起許多臨床疾病如帕金森氏癥、癲癇、抑郁、精神分裂、心血管疾病、中風(fēng)、鎮(zhèn)痛、麻醉、藥物和毒品成癮、老年性癡呆等。
GABA即γ-氨基丁酸是哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與興奮性的神經(jīng)遞質(zhì)共同協(xié)調(diào)維持大腦的正常功能。GABA與GABA受體結(jié)合后，使神經(jīng)元產(chǎn)生突觸前或突觸后抑制，其結(jié)果均引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制效應(yīng)。GABA還通過和其它神經(jīng)遞質(zhì)的交互作用，影響運(yùn)動(dòng)、性行為、體溫調(diào)節(jié)、肌緊張、睡眠、應(yīng)激和酒后行為等。GABA在腦內(nèi)參與多種重要的行為和生理反應(yīng)，包括鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)食欲和心血管活動(dòng)等，并參與癲癇、抑郁癥、焦慮癥等疾病的發(fā)病機(jī)制。GABA能系統(tǒng)功能障礙是許多神經(jīng)精神疾病的直接或間接病因。
GABA的降解主要發(fā)生在膠質(zhì)細(xì)胞和突觸后神經(jīng)元。GABA主要作用于神經(jīng)末梢和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GABA transporters，GAT)，經(jīng)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的攝取而失活并終止其神經(jīng)突觸傳遞作用。攝取在GABA滅活中占重要地位。GAT-1亞型在皮層神經(jīng)元突觸前膜上高表達(dá)，是參與GABA重?cái)z取的主要蛋白。GAT-1亞型基因已被成功表達(dá)和克隆(中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所郭禮和教授實(shí)驗(yàn)室最先克隆出來的(Acta Cell & Mol.Biol.，2003，25(3)129-133)。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，常會(huì)出現(xiàn)GABA能神經(jīng)信號(hào)傳遞的降低，尤其是癲癇。癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約為0.5％～0.7％。據(jù)估計(jì)，在我國(guó)癲癇發(fā)病率較高，約900萬左右，尤其是青少年。在美國(guó)，約有250萬人患有癲癇，其中約有80萬人為部分性發(fā)作，估計(jì)每年診斷為癲癇的新病人有12.5萬人，且至少65萬人用藥后繼續(xù)發(fā)生驚厥。WHO1995年的世界衛(wèi)生報(bào)告估計(jì)有0.3億人患癲癇。研究發(fā)現(xiàn)GAT-1目前已成為篩選抗癲癇藥物的主要靶點(diǎn)，GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑對(duì)癲癇能起到很好的療效，如tiagabine，SKF-89976，CL-966，NO-711(GAT-1選擇性抑制劑)等都能起到良好的抗驚厥效果，其中tiagabine已在臨床上使用。另外，GAT-1還有其它的一些功能，如GAT-1參與學(xué)習(xí)與記憶，其機(jī)制可能是一種修飾的過程而不是造成不可逆的損傷，GAT-1抑制劑具有促進(jìn)學(xué)習(xí)與記憶功能。GAT-1參與了酒精對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，提示GAT-1可能成為治療酒精中毒與成隱的靶標(biāo)。GAT-1抑制劑的鎮(zhèn)痛作用具有藥物不耐受和不成隱的優(yōu)點(diǎn)，提示GAT-1可能成為鎮(zhèn)痛藥物篩選的靶標(biāo)(專利CN1382441A)。
Knud Erik Andersen等人(J.Med.Chem.1999，42(18)3447-3462)認(rèn)為在GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白上存在著一含富正電荷的區(qū)域，因而可以假設(shè)如果在GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在著一負(fù)電性部分，則可以與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白上的正電荷部分相互作用，而該負(fù)電性部分須存在于連接活性化合物的環(huán)狀氨基酸的氮原子與兩個(gè)芳基官能團(tuán)的烴基側(cè)鏈上。如SKF89976-A、Tiagabine等結(jié)構(gòu)中的1，1-二芳基乙烯基官能團(tuán)以及化合物CI-966結(jié)構(gòu)中的二芳基甲醚官能團(tuán)，NNC-711結(jié)構(gòu)中的二芳基甲基肟醚官能團(tuán)等都可以被認(rèn)為是電負(fù)性基團(tuán)。
SKF 89976-A Tiagabine(NNO-0328) CI-966NNC-711由此可知如果使連接烴鏈上的電負(fù)性增加，則可以增加化合物在體外對(duì)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制作用；如果連接烴鏈上的電負(fù)性區(qū)域趨于該鏈的中心位置，則該化合物與二芳基丁烯基衍生物和二芳基甲醚衍生物相比在體外對(duì)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用將增加。已知的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑的結(jié)構(gòu)多數(shù)為在上述連接烴鏈上具有C、N、O原子的化合物，僅有少數(shù)例子為在上述連接烴鏈上具有S原子的化合物(專利CN86107695A)。
動(dòng)植物體內(nèi)含有許多有機(jī)硫化合物，例如胱氨酸、半胱氨酸存在于蛋白質(zhì)中，硫辛醇是一種輔酶，二烯丙基二硫化物存在于芥子油中等。生物體內(nèi)的許多硫化物有著多種多樣的生理功能，是生命活動(dòng)所不可缺少的。如生物體內(nèi)的輔酶A在生物合成和代謝中是必不可少的，含巰基的蛋白質(zhì)，通過氧化-還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子具有一定的形狀并直接影響它的功能。有許多天然存在或人工合成的硫化物是重要的藥物。硫原子與氧原子是屬于同族元素，具有某些相似的化學(xué)性質(zhì)，而且比氧原子更具親核性，因此用硫原子來取代Tiagabine結(jié)構(gòu)中的1，1-二芳基乙烯基側(cè)鏈中的碳原子可以形成硫醚化合物，有可能改變烴基側(cè)鏈的電負(fù)性，另外，若將硫醚轉(zhuǎn)化成砜或亞砜，也有可能增加分子與受體結(jié)合，有利于改變生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題之一是提供一類新型含硫結(jié)構(gòu)化合物。本發(fā)明根據(jù)是基于有機(jī)硫化物存在著多種多樣的生理活性，又根據(jù)上述使連接烴鏈上的電負(fù)性增加，則可以增加化合物在體外對(duì)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制作用的結(jié)論，用硫原子來取代Tiagabine結(jié)構(gòu)中的1，1-二芳基乙烯基側(cè)鏈中的碳原子形成硫醚化合物，進(jìn)一步將硫醚轉(zhuǎn)化成砜或亞砜而得到的一類含硫結(jié)構(gòu)化合物則有可能改變烴基側(cè)鏈的電負(fù)性，也有可能增加分子與受體結(jié)合，有利于改變生物活性。
本發(fā)明要解決的問題之二是提供合成新型含硫結(jié)構(gòu)化合物的方法。
本發(fā)明要解決的問題之三是提供上述新型含硫結(jié)構(gòu)化合物的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一類新型含硫結(jié)構(gòu)化合物，具有下述結(jié)構(gòu)式 其中，Ar1與Ar2是相同的或不同的芳基或取代芳基。
所述的芳基或取代芳基可以是苯基或取代苯基，取代基推薦為不同位置取代的C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基、鹵素、三氟甲基、羥基、NR1R2(R1和R2各自為氫或低級(jí)烷基，所述的低級(jí)烷基推薦為C1-C6的烷基)、SO2NR1R2(其中R1和R2如前述定義)，優(yōu)選取代基為C1-C6的烷基，進(jìn)一步優(yōu)選為鄰位甲基(例如鄰位甲基和2，3-二甲基取代基)、對(duì)位甲基；所述的芳基或取代芳基還可以是含N、O、S原子的五元、六元雜環(huán)或取代的含N、O、S原子的五元、六元雜環(huán)，優(yōu)選為含S的五元環(huán)、取代的含S的五元環(huán)，取代基推薦為不同位置取代的C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基、鹵素、三氟甲基、羥基、NR1R2(R1和R2各自為氫或低級(jí)烷基，所述的低級(jí)烷基推薦為C1-C6的烷基)、SO2NR1R2(其中R1和R2如前述定義)，優(yōu)選取代基為C1-C6的烷基，進(jìn)一步優(yōu)選為鄰位甲基(例如鄰位甲基和2，3-二甲基取代基)、對(duì)位甲基。
n＝0，1，2；m＝1，2，3； (R)構(gòu)型、 (S)構(gòu)型、 (R+S)(消旋)或 或者這些堿與酸成的在藥物上可接受的鹽。優(yōu)選的 (R)構(gòu)型。
本發(fā)明推薦的新型含硫結(jié)構(gòu)化合物是具有下述通式的化合物， 其中，Ar1與Ar2如前述定義；n＝1，2； 為單鍵或雙鍵。當(dāng) 為單鍵時(shí)，則化合物I、II、III、IV為(R)構(gòu)型異構(gòu)體或(S)構(gòu)型異構(gòu)體或消旋體的堿或者這些堿與酸成的在藥物上可接受的鹽。
本發(fā)明優(yōu)選的新型含硫結(jié)構(gòu)化合物是具有1、2、3、4、2b、2c、3b、3c結(jié)構(gòu)的化合物，
本發(fā)明提供了上述新型含硫結(jié)構(gòu)化合物的制備方法。
本發(fā)明提供的上述新型含硫結(jié)構(gòu)化合物可由下列反應(yīng)路線獲得。

其中，Ar1與Ar2的定義如前所述；n＝1，2；m＝1，2，3；X＝F、Cl、Br等；化合物 (R)構(gòu)型或 (S)構(gòu)型或 (R+S)(消旋)或 R3代表C1～C5的烷基。
所述堿推薦為氫氧化鈉、氫氧化鉀、乙醇鈉等，所述的酸推薦為鹽酸、硫酸、磷酸等，所述的氧化劑推薦為四氧化二氮(N2O4)、高碘酸鈉(NaIO4)、30％的H2O2以及間氯過氧苯甲酸等。
推薦的制備過程如下式 具體來說可以是1)以1當(dāng)量的二芳基或二芳雜基甲醇為起始原料與1～5當(dāng)量的巰基乙醇在強(qiáng)酸性條件下如在1～20當(dāng)量的TFA(TFA代表三氟醋酸)作用下，推薦在0℃～室溫下經(jīng)硫烷基化反應(yīng)而得到二芳基或二芳雜基甲基取代的硫代乙醇VI。
2)該硫代乙醇VI發(fā)生鹵置換反應(yīng)，鹵置換反應(yīng)條件推薦為用鹵代劑(如HBr或PBr3)或用有機(jī)磷鹵化物(如三苯基膦和四溴化碳形成的鹵化物)對(duì)醇進(jìn)行鹵置換反應(yīng)。優(yōu)選條件為將1～10當(dāng)量的三苯基磷，1當(dāng)量的四溴化碳，1～10當(dāng)量的咪唑溶于有機(jī)溶劑，所述的有機(jī)溶劑推薦為二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、四氫呋喃、乙醚、乙腈、二氧六環(huán)、苯或甲苯等，推薦在-20℃～室溫下滴加硫代乙醇VI的有機(jī)溶液(如將VI溶于二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷等有機(jī)溶劑中)，發(fā)生溴置換反應(yīng)而得到相應(yīng)的溴代物VII。
3)將化合物VII溶于有機(jī)溶劑中，在堿(如碳酸鉀、吡啶或三乙胺)及碘化鉀的作用下與化合物V在0～50℃反應(yīng)10～72小時(shí)，得化合物VIII。所述的有機(jī)溶劑推薦為丙酮、乙腈或四氫呋喃等。
其中，化合物 (9)構(gòu)型或 (S)構(gòu)型或 (R+S)(消旋)或 R3代表C1～C5的烷基。
4)將化合物VIII溶于有機(jī)溶劑(如乙醇等)中，用1～15當(dāng)量的氫氧化鉀或氫氧化鈉水解，再用鹽酸酸化至PH為1～3可得目標(biāo)化合物I。
5)將化合物I溶于質(zhì)子溶劑如甲醇中，加入氧化劑，在0℃～室溫下反應(yīng)得到化合物II(n＝1，2)。所述的氧化劑推薦四氧化二氮(N2O4)、高碘酸鈉(NaIO4)、30％的H2O2以及間氯過氧苯甲酸等。
推薦的制備過程如下式 具體來說是1)以1當(dāng)量的二芳基或二芳雜基甲醇為起始原料與1～5當(dāng)量的巰基丙醇在強(qiáng)酸性條件下如在1～20當(dāng)量的TFA作用下，在0℃室溫下經(jīng)硫烷基化反應(yīng)而得到二芳基或二芳雜基甲基取代的硫代丙醇IX。
2)該硫代丙醇IX發(fā)生鹵置換反應(yīng)，鹵置換反應(yīng)條件推薦為用鹵代劑(如HBr或PBr3)或用有機(jī)磷鹵化物(如三苯基膦和四溴化碳形成的鹵化物)對(duì)醇進(jìn)行鹵置換反應(yīng)。優(yōu)選條件為將1～10當(dāng)量的三苯基磷，1當(dāng)量的四溴化碳，1～10當(dāng)量的咪唑溶于有機(jī)溶劑，所述的有機(jī)溶劑是二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、四氫呋喃、乙醚、乙腈、二氧六環(huán)、苯或甲苯等，在-20℃～室溫下滴加硫代丙醇IX的有機(jī)溶液(如將IX溶于二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷等有機(jī)溶劑中)，發(fā)生溴置換反應(yīng)而得到相應(yīng)的溴代物X。
3)將化合物X溶于有機(jī)溶劑中，在碳酸鉀、吡啶或三乙胺及碘化鉀的作用下與化合物V在0～50℃反應(yīng)10～72小時(shí)，得化合物XI。所述的有機(jī)溶劑推薦丙酮、乙腈或四氫呋喃等。
其中，化合物 (R)構(gòu)型或 (S)構(gòu)型或 (R+S)(消旋)或 R3代表C1～C5的烷基。
4)將化合物XI溶于有機(jī)溶劑如乙醇中用1～15當(dāng)量的氫氧化鉀或氫氧化鈉水解，再用鹽酸酸化至PH為1～3可得目標(biāo)化合物III。
5)將化合物III溶于質(zhì)子溶劑如甲醇中，加入氧化劑，在0℃～室溫下反應(yīng)得到化合物IV(n＝1，2)。所述的氧化劑包括四氧化二氮(N2O4)、高碘酸鈉(NaIO4)、30％的H2O2以及間氯過氧苯甲酸等。
當(dāng)m＝3時(shí)，用HSCH2(CH2)3OH代替HSCH2CH2OH或HSCH2(CH2)2OH，其它推薦的反應(yīng)條件同上。
本發(fā)明所提供了上述新型含硫結(jié)構(gòu)化合物的用途，即用于制備藥物。具體來說，本發(fā)明的化合物是一種具有GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GAT-1)抑制活性的新型含硫結(jié)構(gòu)化合物，可用于制備新型抗癲癇藥物；及可用于制備新型鎮(zhèn)痛藥物。
本發(fā)明含硫結(jié)構(gòu)化合物通過初步GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GAT-1)體外競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)試，顯示了一定的GAT-1抑制活性，可制備新型GAT-1抑制劑藥物；本發(fā)明含硫結(jié)構(gòu)化合物在最大電休克發(fā)作模型上具有很好的抗驚療效，可制備新型抗癲癇藥物；該含硫結(jié)構(gòu)化合物還可用于制備新型鎮(zhèn)痛藥物。
本發(fā)明提供了一類新型的含硫結(jié)構(gòu)化合物，該類化合物結(jié)構(gòu)不同于其他已知的GAT-1抑制劑，該結(jié)構(gòu)中含有的硫醚結(jié)構(gòu)或亞砜結(jié)構(gòu)有可能增加分子與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，有利于改變生物活性，提高GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制活性。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)例將說明制備本發(fā)明化合物的最好方法，但并不受這些例子的限制。
實(shí)施例1化合物VI與化合物IX的制備在50ml的反應(yīng)瓶中加入二芳基或二芳雜基甲醇Ar1(Ar2)CHOH(8.14mmol)，巰基乙醇1.40ml(20.70mmol)，在0℃下滴加三氟醋酸3.40ml，后逐漸升到室溫反應(yīng)過夜，加入水20ml，二氯甲烷20ml，分層，有機(jī)相用5％NaOH溶液10ml洗滌，水(3×10ml)洗滌，食鹽水(2×10ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。蒸干溶劑，殘余物中加入丙酮20ml，碳酸鉀0.93g及水1ml，再攪拌過夜，蒸干溶劑，加入乙酸乙酯20ml，少量水洗，無水硫酸鈉干燥。蒸干溶劑，殘余物用硅膠柱層析，可得化合物VI。
用HSCH2(CH2)2OH代替HSCH2CH2OH，其它反應(yīng)條件同上，可制備化合物IX。
實(shí)施例2化合物VII與化合物X的制備在干燥的50ml的反應(yīng)瓶中加入三苯基磷3.49g(13.31mmol)，四溴化碳1.67g(5.00mmol)，咪唑1.13g(16.64mmol)，再加入無水二氯甲烷25ml，在冰水浴下滴加化合物VI(3.33mmol)的10ml二氯甲烷溶液，滴加完后逐漸升到室溫反應(yīng)6小時(shí)，加入水10ml，分層，用二氯甲烷(3×10ml)提取，有機(jī)相用水(1×10ml)及飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥。蒸干溶劑，殘余物用硅膠柱層析，可得化合物VII。
用化合物IX代替化合物VI，其它反應(yīng)條件同上，可制備化合物X。

實(shí)施例3制備化合物VIII和化合物XI化合物VII(2.24mmol)溶于10ml丙酮中，加入(R)-3-哌啶甲酸乙酯0.35g(2.24mmol)，碘化鉀37mg，碳酸鉀0.31g，室溫?cái)嚢?8小時(shí)，停止反應(yīng)，濾除不溶物，蒸干濾液，硅膠柱層析得化合物VIII。
用化合物X代替化合物VII，其它反應(yīng)條件同上，可制備化合物XI。




實(shí)施例4制備化合物I和化合物III化合物VIII(1.49mmol)溶于15ml無水乙醇中，滴加12N的氫氧化鈉水溶液0.40ml，室溫?cái)嚢?小時(shí)，停止反應(yīng)，冰浴冷卻，用4N鹽酸將PH值調(diào)至1～2，用二氯甲烷萃取(3×20ml)，有機(jī)相飽和食鹽水洗(2×10ml)，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，加入乙酸乙酯10ml，有白色固體析出，過濾，濾餅用少量乙酸乙酯洗滌，干燥得純化合物I。
用化合物XI代替化合物VIII，其它反應(yīng)條件同上，可制備化合物III。



實(shí)施例5制備化合物II和化合物IV在25ml的反應(yīng)瓶中，加入化合物I(0.26mmol)，甲醇10ml，滴加30％H2O20.06ml，室溫(15℃～18℃)下攪拌反應(yīng)過夜，反應(yīng)完全，加入2～3滴飽和Na2S2O3溶液，攪拌1小時(shí)，用二氯甲烷萃取(3×20ml)，有機(jī)相飽和食鹽水洗(2×10ml)，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得到固體化合物II。
用化合物III代替化合物化合物I，其它反應(yīng)條件同上，可制備化合物IV。



實(shí)施例6本發(fā)明化合物新型含硫結(jié)構(gòu)化合物的體外GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GAT-1)競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合實(shí)驗(yàn)1)使用的儀器與試劑所用的儀器液閃記數(shù)儀(Beckman LS 5000TA)，恒溫水浴鍋，電子天平，移液槍，秒表。
試劑PPO2，5-二苯基噁唑(2，5-diphenyloxazole)；POPOP1，4-雙-[5-苯基-2-噁唑基]苯(1，4-Bis-[5-phenyl-2-oxazoyl]-benzene)；含有10％小牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基；[3H]GABA(Amersham Pharmacia Biotech)。
所用試劑的配制PBS(磷酸緩沖鹽溶液)在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，和0.24g KH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4，加水定容至1L，在15 1bf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20分鐘，保存于室溫；HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，pH8.0)；閃爍液(PPO 3.6g，POPOP 0.36g，二甲苯600ml，Triton X-100 300ml)。
2)測(cè)定步驟(1)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因篩選細(xì)胞工程細(xì)胞株的制備GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是最早克隆的神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。到目前為止，已克隆了四種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，它們屬于Na+/Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。
將GAT-1基因克隆用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到合適的表達(dá)載體(pCDNA3)上，將載體轉(zhuǎn)入到真核CHO細(xì)胞中，通過大批細(xì)胞培養(yǎng)，使GAT-1基因克隆高表達(dá)量地表達(dá)于CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞)細(xì)胞中。通過測(cè)同位素?cái)z取流量及Westblot(抗體反應(yīng)實(shí)驗(yàn))以確定其表達(dá)量以及確定是否為目標(biāo)蛋白(GAT-1)，從而獲得單克隆細(xì)胞。將確定的GAT-1單克隆細(xì)胞經(jīng)過傳代細(xì)胞培養(yǎng)，即可以得到大批的用于實(shí)驗(yàn)所需的含有GAT-1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的篩選細(xì)胞工程細(xì)胞株。
(2)衡量GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性在含有10％小牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)D8細(xì)胞于48孔板(Costar)至平板鋪滿(大約每孔6萬細(xì)胞)。棄培液，用PBS洗滌一次，吸去PBS溶液，每孔加入90μl HBS，25℃溫育10分鐘，每孔加入10μl HBS反應(yīng)液(含50nM[3H]GABA)。25℃溫育20分鐘，用冰浴的PBS溶液洗滌三遍，用100μl 2N NaOH溶液裂解30分鐘，吸取各孔的裂解液加入到1.6ml的閃爍液中，放入液閃記數(shù)儀中檢測(cè)同位素的含量，以此來衡量GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性(＞10萬DPM)。
(3)藥物篩選實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)i.將接種培養(yǎng)好的48孔細(xì)胞板快速翻轉(zhuǎn)甩去培養(yǎng)孔多余的培養(yǎng)液，并在吸水紙上吸干。
ii.每個(gè)培養(yǎng)孔用1×PBS洗一次，然后快速翻轉(zhuǎn)，棄掉PBS，扣干(若孔中還有殘液，用槍頭吸掉)。
iii.依次加HBS，陰性、陽(yáng)性control每孔90μl，藥物組每孔HBS+藥物共90μl，室溫放置10分鐘。
iv.每孔加入預(yù)先配制好的10μl[3H]標(biāo)記的同位素，室溫放置20分鐘(在此時(shí)可將1×PBS置于-20℃冰箱)。
v.冰PBS洗三次，并用泵吸干。
vi.每孔加入2N NaOH裂解液100μl，室溫放置20分鐘。
vii.將裂解液從每個(gè)培養(yǎng)孔中吸出并各自轉(zhuǎn)至2ml圓底eppendorf管中，每孔加入1.6ml閃爍液，蓋好蓋子，上下顛倒幾次混勻，裝入5ml中號(hào)管中，放置于液體閃爍儀上測(cè)定3HDPM(同位素的含量的一種表示方式)。
(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備實(shí)驗(yàn)分三個(gè)組總結(jié)合組、非特異結(jié)合組、標(biāo)準(zhǔn)樣品組。每組雙復(fù)管或三復(fù)管。所測(cè)得的量分別為總結(jié)合量、非特異結(jié)合量、測(cè)得量?？偨Y(jié)合量已轉(zhuǎn)染GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的CHO細(xì)胞對(duì)[3H]-GABA的結(jié)合數(shù)(未加藥的結(jié)合數(shù))；非特異結(jié)合量未轉(zhuǎn)染GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的CHO細(xì)胞對(duì)[3H]-GABA的結(jié)合數(shù)；測(cè)得量加藥后的已轉(zhuǎn)染GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的CHO細(xì)胞對(duì)[3H]-GABA的結(jié)合數(shù)?？偨Y(jié)合量減去非特異結(jié)合量得到特異結(jié)合量。
標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)放射標(biāo)記配體與GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異結(jié)合的抑制率可由下式求得抑制率(％)＝log[(測(cè)得量-非特異結(jié)合量)/(總結(jié)合量-非特異結(jié)合量)]*100％X＝-logM M濃度；Y＝log特異性結(jié)合率；-log(IC50)＝X(當(dāng)Y＝log50)。
以濃度—效應(yīng)對(duì)數(shù)作圖法，以特異性結(jié)合抑制百分率的log值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，可以得到表示濃度與抑制率關(guān)系的線性回歸方程，從而可以得到特異性結(jié)合抑制一半所需濃度(IC50)。
表1是本發(fā)明化合物新型含硫結(jié)構(gòu)化合物的體外GAT-1抑制活性結(jié)果
結(jié)果顯示化合物1、2、3、4、2b、2c、3b、3c的活性均明顯高于陽(yáng)性對(duì)照(R)-3-哌啶甲酸，表明具有一定的GAT-1抑制活性。
實(shí)施例7本發(fā)明化合物新型含硫結(jié)構(gòu)化合物在最大電休克發(fā)作模型上的抗驚療效1)使用的儀器與試劑苯巴比妥購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀，由山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器廠提供。
2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，♂，♀各半，體重20±2g(x±s)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
3)實(shí)驗(yàn)方法(1)MES的建立參照Woodbury，Philmore等人的實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物稱重后隨機(jī)分成4組，每組10只動(dòng)物，雌雄各半。將齒狀?yuàn)A電極浸生理鹽水，分別夾于小鼠二耳，然后通以固定電壓為100V，固定周期為16ms的不同強(qiáng)度電流值，以動(dòng)物出現(xiàn)后肢伸展為特征的強(qiáng)直性驚厥為指標(biāo)，確定95％以上動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)直性驚厥發(fā)作的電流強(qiáng)度。
(2)本發(fā)明化合物含硫結(jié)構(gòu)化合物抗癲癇療效觀察在建立MES的基礎(chǔ)上，ip不同劑量藥物，30min后通以使95％以上動(dòng)物產(chǎn)生最大電休克發(fā)作的電流值，以給藥后未出現(xiàn)特征為后肢伸展的強(qiáng)直性驚厥作為驚厥控制的指標(biāo)，觀察藥物的抗驚作用。
(3)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Blessing法計(jì)算CC95值。
4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)不同強(qiáng)度電壓對(duì)小鼠的致驚作用在固定電壓為100V，固定周期為16ms的條件下，采用不同強(qiáng)度電流對(duì)小鼠致驚。給予不同強(qiáng)度電流強(qiáng)度刺激時(shí)，動(dòng)物開始出現(xiàn)肢體彎曲，隨即后肢伸展產(chǎn)生強(qiáng)直性驚厥。隨著電流強(qiáng)度的增加，發(fā)生強(qiáng)直性驚厥的動(dòng)物數(shù)明顯增加，以此測(cè)定的CC95(95％動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)直性發(fā)作電流強(qiáng)度)為13.5mA。
(2)本發(fā)明化合物含硫結(jié)構(gòu)化合物對(duì)MES的對(duì)抗作用在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首先腹腔注射不同劑量的含硫結(jié)構(gòu)化合物，同時(shí)觀察上述藥物的一些常見副作用，在給藥后30min給予致驚強(qiáng)度的電流刺激；選用苯巴比妥作為陽(yáng)性對(duì)照藥，結(jié)果如表2所示。
表2是本發(fā)明化合物新型含硫結(jié)構(gòu)化合物的在最大電休克發(fā)作模型上的抗驚療效結(jié)果

上述藥品均溶解在4％的DMSO溶液中。
小鼠品系昆明 小鼠體重19-22g 給藥方式ip預(yù)防時(shí)間30min多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀電壓100V電流13.5mA波寬10ms周期16ms結(jié)果顯示，4％DMSO無任何抗驚作用，因此排除了溶劑對(duì)藥物抗驚作用的影響；化合物1與3b在劑量為40mg·kg-1ip時(shí)，均具有良好抗驚作用；而其他各藥在40mg·kg-1ip時(shí)則無明顯抗驚作用。因此，化合物1與3b，特別是3b，有可能應(yīng)用于抗癲癇的治療。但需要說明的是，上述各藥在所選擇的各藥劑量下，均對(duì)動(dòng)物的精神神經(jīng)活動(dòng)產(chǎn)生一定的影響，其表現(xiàn)為動(dòng)物自主活動(dòng)減少，較安靜。
權(quán)利要求
1.一種化合物，具有下述結(jié)構(gòu)式 其中，Ar1與Ar2為芳基或取代芳基，n＝0，1，2；m＝1，2，3；R＝ (R)構(gòu)型、 (S)構(gòu)型、 (R+S)(消旋)或 或者這些堿與酸成的在藥物上可接受的鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征是具有下述結(jié)構(gòu)I、II、III或IV的化合物， 其中，Ar1與Ar2如權(quán)利要求1所述；n＝1，2； 為單鍵或雙鍵；當(dāng) 為單鍵時(shí)，則化合物I、II、III、IV為(R)構(gòu)型異構(gòu)體或(S)構(gòu)型異構(gòu)體或消旋體的堿或者這些堿與酸成的在藥物上可接受的鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征是所述的芳基或取代芳基是苯基或取代苯基，含N、O、S原子的五元、六元雜環(huán)或取代的含N、O、S原子的五元、六元雜環(huán)；所述的取代芳基上的取代基為C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基、鹵素、三氟甲基、羥基、NR1R2或SO2NR1R2，所述的R1和R2為氫或低級(jí)烷基，
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征是所述的芳基或取代芳基是含S的五元環(huán)或取代的含S的五元環(huán)，所述的R＝ (R)構(gòu)型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征是具有下述結(jié)構(gòu)1、2、3、4、2b、2c、3b、3c結(jié)構(gòu)的化合物，
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，其特征是制備過程如下式， 其中，Ar1與Ar2如權(quán)利要求1所述；n＝1，2；m＝1，2，3；X＝F、Cl、Br等；化合物V＝ (R)構(gòu)型或 (S)構(gòu)型或 (R+S)(消旋)或 R3代表C1～C5的烷基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是由所述的二芳基或二芳雜基取代甲醇與HSCH2(CH2)mOH在TFA作用下發(fā)生S-烷基化反應(yīng)；再經(jīng)三苯基磷、四溴化碳和咪唑體系溴代，其中三苯基磷∶四溴化碳∶咪唑的摩爾比為1～10∶1∶1～10；再與化合物V在KI，K2CO3作用下發(fā)生N-烴化而得到所述的酯衍生物，該酯衍生物在NaOH的醇溶液中水解、再經(jīng)酸化得到所述的硫醚衍生物，該硫醚衍生物進(jìn)一步氧化得到所述的亞砜或砜的衍生物。
8.權(quán)利要求1所述的化合物在制備藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物的用途，其特征是用于制備GAT-1抑制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物的用途，其特征是用于制備抗癲癇藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物的用途，其特征是用于制備鎮(zhèn)痛藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型含硫結(jié)構(gòu)化合物，制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供一類新型含硫結(jié)構(gòu)化合物，該化合物可通過二芳基的制備。本發(fā)明的新型含硫結(jié)構(gòu)化合物可用于制備藥物，尤其是新型GAT－1抑制劑藥物，可用于制備新型抗癲癇藥物以及新型鎮(zhèn)痛藥物。
文檔編號(hào)C07D211/60GK1699344SQ20051002597
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日
發(fā)明者林國(guó)強(qiáng), 郭禮和, 張建革, 徐林峰, 方凱 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所