專利名稱：修飾性核苷酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類修飾性核苷酸，具體涉及一種質(zhì)子化的核苷酸；本發(fā)明還涉及此類化合物的藥用組合物，以及所述修飾性核苷酸在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雖然目前已有多種抗細菌和抗真菌藥物。但由于這些抗感染藥物的濫用導(dǎo)致出現(xiàn)了眾多的藥物抗性致病原，有些細菌甚至出現(xiàn)對多種藥物的抗性。因此，新的抗感染藥物的開發(fā)已成為今后新藥發(fā)展的主要領(lǐng)域和方向。這類新藥應(yīng)具備高效，能促進現(xiàn)有抗感染藥物的效果和低劑量等特點，從而降低產(chǎn)生新的抗性病原的可能性。
修飾性核苷酸已被廣泛用于疾病的治療。例如，AZT，ddI，d4T等用于治療艾滋病。5′-trifluormethyl-2′-deoxyuridine用于治療皰疹性角膜炎。5′-iodo-1-(2-deoxy-2-fluoro-b-D-arabinofuranosyl)cytosine用于治療巨細胞病毒，皰疹病毒，EB病毒等的感染(Drug Design and Development，Povl Krogsgaard-Larsen and Hans Bundgaard，Eds，HarwoodAcademic Publishers，1991，ch15)但這類化合物目前僅限于在抗病毒方面的應(yīng)用，至今尚未用于對細菌和真菌的抗感染方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類新型的抗感染化合物。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)利用天然核苷酸為基本結(jié)構(gòu)，利用優(yōu)化的化學(xué)合成途徑用取代基對其進行取代，所得修飾的核苷酸具有抗細菌和真菌感染活性，并且能增加天然核苷酸的穩(wěn)定性。
所述修飾的核苷酸的基本結(jié)構(gòu)為
其中，X和Y分別為5′和3′端保護基團，可為相同或不同的化學(xué)基團。這些基團選自直鏈烷基(如乙基、丙基、丁基)、羥基烷基(如羥丙基、羥丁基)、烷氧基烷基等；優(yōu)選的X或Y是正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、4-羥基正丁基(HO-CH3CH2CH2CH2-)；Z選自H、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的嘌呤基；優(yōu)選的Z是胸腺嘧啶基和H；A選自H、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烯基、烷基醇、苯酚基、烯醇等。
以下三個化合物(其代號分別為NBC-2、NBC-3和NBC-4)是本發(fā)明的優(yōu)選化合物，

結(jié)構(gòu)為

NBC-2

NBC-3
NBC-4本發(fā)明還可以利用質(zhì)子化過程對修飾性核苷酸進行酸化處理。所述質(zhì)子化或酸化是指將質(zhì)子或氫離子加到修飾性核苷酸中的磷酸或保護基團的質(zhì)子受體上的過程。隨著化合物溶液的PH降低，核苷酸被質(zhì)子化修飾的程度隨之增加。當(dāng)質(zhì)子化的核苷酸溶于中性水時(PH值約為7)，由于核苷酸被質(zhì)子化，產(chǎn)生的溶液的PH也會降低。
合成方法為用堿基與酰胺化物(amidite)反應(yīng)，然后對3′和5′用保護基進行保護。該合成方法為一步法過程，無需層析分離中間產(chǎn)物。利用此合成途徑，產(chǎn)量可達數(shù)克至數(shù)公斤，純度通常大于99％。
上述修飾性核苷酸還可進一步經(jīng)脂質(zhì)體包裝，使其抗感染作用更好；所述脂質(zhì)體顆粒大小范圍在60nm～110nm之間，優(yōu)選范圍在80nm～100nm之間；所述脂質(zhì)體內(nèi)修飾性核苷酸與脂質(zhì)的比例(藥脂比)為1∶9～1∶3，優(yōu)選的藥脂比為1∶5～1∶3。
所述脂質(zhì)體含有中性脂類、膽固醇類或聚乙二醇類等物質(zhì)。在制備脂質(zhì)體的優(yōu)選方案中，使用如部分氫化的大豆卵磷脂(Partially hydrogenated soy phosphatidylcholine，PHSPC)、膽固醇(cholesterol)、末端甲氧基的聚乙二醇(methoxy-terminated polyethyleneglycol，mPEG)、乙醇胺磷酸二硬脂酸酯(distearoyl phosphatidyl ethanolamine，DSPE)為原料。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實例中，所述脂質(zhì)體中含有部分氫化的大豆卵磷脂(PHSPC)、膽固醇、末端甲氧基的聚乙二醇—乙醇胺磷酸二硬脂酸酯，含量比例為50～60∶30～40∶5～10。
可采用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行脂質(zhì)體的制備。優(yōu)選采用乙醇注射法對修飾性核苷酸進行包裝，所制備的脂質(zhì)體具有在體內(nèi)穩(wěn)定和循環(huán)時間長等特點。
本發(fā)明提供的修飾性核苷酸具有抑制細菌生長的活性。所述細菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，例如，金黃色葡萄球菌(Straphylococcus aureas)，膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)，肺炎雙球菌(Streptococcus pheumoniae)，分枝桿菌(mycobacterum)和大腸桿菌(E.coli)。本發(fā)明提供的修飾性核苷酸具有廣泛的臨床應(yīng)用范圍，可用于治療急性，慢性，局部或全身感染。
本發(fā)明提供的修飾性核苷酸還具有廣譜抑制真菌生長的活性，可用于治療皮膚真菌病、念珠菌病、花斑菌癬、腿癬、頭癬、癬菌病等。所抑制的真菌菌屬包括Trichphyton，Epidermophyton，Microsporum，Candida albicans，Pityrosporum orbiculare，Trichophytonmentagrophytes，Trichphyton mbrum，Epidermophyton floccosum和Trichophyton tonsurans等.
用本發(fā)明提供的修飾性核苷酸可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種藥物可接受的載體、輔劑配合，制備成各種劑型的抗菌藥物制劑。這些藥物可通過常規(guī)給藥方式應(yīng)用于臨床。
所述抗菌藥物制劑包括口服劑，如片劑、膠囊，針劑、外用藥，如溶液劑、外用凝膠，外用藥膏，還可制成氣霧劑等。其制備方法可參照常規(guī)藥物制劑制備的方法。
具體實施例方式實施例1 NBC-3的化學(xué)合成將胸腺嘧啶(5.6克)溶于無水丙腈中，共蒸發(fā)后，再溶于85毫升無水二氯甲烷中。再將12.67克正丁基氰基乙基-N，N-二異丙基磷酰胺(n-butylcyanoethyl-N，N-diisopropylphosphoramidite)加入胸腺嘧啶溶液中。經(jīng)劇烈混勻后，加入3.32克(Tetrazole)，過夜攪拌。反應(yīng)混合物在鹽冰浴中(-10℃)冷卻后，緩慢加入10ml t-butylhydroperoxide的癸烷溶液(5～6M)。待反應(yīng)完成后(約2～3小時)，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入分液漏斗，并用50毫升含5％二硫化鈉的二氯甲烷洗兩次，再用50毫升飽和氯化鈉洗一次。待乳濁液分層后，分出有機相。
有機相經(jīng)過濾后，用旋轉(zhuǎn)真空干燥器揮發(fā)二氯甲烷。再用乙醚洗滌含油的癸烷(3×25毫升)，并小心倒掉上層乙醚。再將油相溶于二氯甲烷后(12.5毫升)，加入125毫升乙醚。經(jīng)過約15分鐘靜放后，倒掉溶劑，并在真空中干燥油相。
最后將經(jīng)干燥的油相溶于甲醇(每克油加入10毫升甲醇)，并加入2當(dāng)量的NaOH，在室溫下攪拌約1～2小時，反應(yīng)混合物經(jīng)真空濃縮后，用干甲醇共蒸發(fā)除去殘留水分，使產(chǎn)物成為膠質(zhì)狀。再用丙腈將此膠質(zhì)物固體化(100毫升，約1～2小時)，然后用真空干燥固體。此固體即為胸嘧啶-3’-5’雙磷酸丁酯(Thyamidine-3’-5’-bis-butyl phosphate)。
此產(chǎn)物經(jīng)31P NMR和1H NMR分析，其純度大于99％。
實施例2 NBC-3的質(zhì)子化NBC-3的質(zhì)子化可通過使用酸溶液來完成。這些酸溶液包括磷酸、硝酸，鹽酸或乙酸。在本實施例中，0.1N的HCl加入到NBC-3溶液中(每毫升100～300 A260單位)直到PH達到1～4.5。
酸化處理后的NBC-3溶液經(jīng)柱層析(抗酸型BioRad或P4柱)，除去過量的酸和鹽。再經(jīng)冷凍干燥，獲得質(zhì)子化的NBC-3。
當(dāng)該化合物溶解于水或生理鹽水時，溶液的PH應(yīng)當(dāng)在1～4范圍內(nèi)。
實施例3 NBC-3脂質(zhì)體的制備制備方法采用乙醇注射法。首先將PHSPC，膽固醇和mPEG-DSPE按56∶38∶6溶于乙醇中(脂類終濃度為150mM，乙醇含量約為30％)，攪拌至清亮溶液。
在旋渦震蕩器上，緩慢將脂溶液加入到NBC-3溶液中(50mg/ml)。脂溶液與NBC-3溶液的比例為1∶2(v/v)。混合物經(jīng)200mm的聚碳酸酯膜擠壓過濾，形成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體溶液再經(jīng)超聲處理20秒，凍融四次(冷凍5分鐘，融解5分鐘)，最后，經(jīng)透析過夜除去乙醇。再經(jīng)Sepharose柱將脂質(zhì)體與未包裝的游離NBC-3分開。
用此法制備的脂質(zhì)體顆粒大小在60～110nm范圍之間，NBC-3-5脂類的藥脂比為1∶4。
實施例4 NBC-3的抗細菌活性的測定實驗利用膿桿菌慢性呼吸道感染的大鼠模型對NBC-3的活性進行測定(Cash H.A等1979，Amer.Rev.Respir.Dis，119453-459)。大鼠經(jīng)麻醉后，通過氣管接種腸桿菌(1×107CFU/每只大鼠)，使慢性感染建立。大鼠的麻醉采用注射Ketamine(每公斤體重注射90mg)和Xylazine(每公斤體重注射10mg)。
脂質(zhì)體包裝的NBC-3的給藥方式采用一次性通過氣管注入大鼠肺部(每只大鼠的劑量為200A)。四天后，處死大鼠，收集肺器官，并對肺組織進行勻漿處理(5ml PBS)取100微升勻漿液，接種于Trypficase Soya Agar，在37℃下保溫1～2天。最后統(tǒng)計菌落生長情況(見下表)。


從上表可見，與對照相比，NBC-3能夠顯著地抑制細菌的生長。
實施例5 NBC-3的抗真菌活性實驗利用二種真菌株來證實NBC-3的抗真菌活性。這兩個菌株分別為Candidaalbicans和Saccharomyces pastorianus。實驗在24孔板上進行。每孔加入30微升NBC-3(濃度見下表)，20微升真菌細胞(約10個真菌細胞)，150微升10％的Sabouraud dexfrose培養(yǎng)液。
培養(yǎng)板在25℃下，搖動培養(yǎng)24小時，再放在室溫下培養(yǎng)24小時后，觀察測定真菌生產(chǎn)情況。結(jié)果見下表，其中，-代表完全抑制；+代表輕度生長；++代表中度生長；+++代表高度生長。

從上表可見，NBC-3可以抑制真菌的生長，在一定的濃度范圍內(nèi)，NBC-3可以完全殺死真菌細胞。
實施例6 NBC-3抗微生物活性濃度的測定測定使用96-孔板進行。每孔中加入150微升Meuller-Hinton broth(MHB)、30微升經(jīng)系列稀釋的NBC-3和20微升微生物液體(約為106CFU/ml)。在37℃下保溫24小時后，記錄微生物生長情況。結(jié)果見下表。

如上表所示，NBC-3可抑制廣泛的微生物生長，特別對藥物抗性菌尤為有效。
實施例7 NBC-3抗細菌感染的臨床實驗病例選擇用NBC-3進行了抗細菌感染的臨床實驗研究，選擇病例年齡在8-80歲，均發(fā)生不同部位的細菌感染，包括面部、四肢、皮膚等感染。
實驗藥物脂質(zhì)體包裝的NBC-3液體制劑實驗方法每日于患處涂抹藥物2～4次；對急性感染病人3天后記錄治療效果；對慢性感染病人7天后記錄治療效果。
感染程度按輕重分為10個等級，其中1為最輕級，10為最重級；每級中又分為四個亞級，以不同數(shù)量的“+”表示，“+++”為最重的亞級。
實驗結(jié)果所有受試者經(jīng)用藥后，均不同程度明顯減輕了感染程度。具體實驗結(jié)果見下表



實施例8 NBC-3抗真菌感染的臨床實驗病例選擇用NBC-3進行了抗細菌感染的臨床實驗，8例受試者均有不同程度的腳癬，其感染程度由?？漆t(yī)生確定。
實驗藥物脂質(zhì)體包裝的NBC-3噴霧制劑，規(guī)格為20 A260單位/ml實驗方法每日于患處噴藥物3次，每次100微升；2周后由?？漆t(yī)生檢查并記錄治療效果；感染程度按輕重分為10個等級，其中1為最輕級，10為最重級。
實驗結(jié)果受試者局部用藥后，均明顯減輕了感染程度，具體結(jié)果見下表

實施例9 NBC-2和NBC-4抗微生物活性的測定測定使用96-孔板進行。每孔中加入50微升10％的Meuller-Hinton broth(MHB)、30微升經(jīng)系列稀釋的受試藥物(NBC-2和NBC-4)，20微升微生物液體(約為106CFU/ml)。在37℃下保溫24小時后，記錄微生物生長情況，并測定最低抑菌濃度。結(jié)果見下表NBC-2的最低抑菌濃度

NBC-4的最低抑菌濃度


如上二表所示，NBC-2和NBC-4可抑制廣泛的微生物生長，特別對藥物抗性菌尤為有效。
權(quán)利要求
1.一種抗微生物化合物，其結(jié)構(gòu)為 其中，X和Y選自直鏈烷基、羥基烷基、烷氧基烷基；Z選自H、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的嘌呤基；A選自H、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烯基、烷基醇、苯酚基、烯醇。
2.權(quán)利要求1所述的抗微生物化合物，是質(zhì)子化的化合物；其中X和/或Y選自正丁基或4-羥基正丁基；Z選自胸腺嘧啶基或H；A選自H或甲氧基。
3.權(quán)利要求1所述的抗微生物化合物，其中X和Y均為CH3CH2CH2CH2-，Z是胸腺嘧啶基，A是H。
4.權(quán)利要求1所述的抗微生物化合物，特征是以脂質(zhì)體形式存在。
5.權(quán)利要求4所述的抗微生物化合物，所述脂質(zhì)體中含有下述物質(zhì)的一種或幾種中性脂類、膽固醇類、聚乙二醇；脂質(zhì)體中藥脂比為1∶9～1∶3；脂質(zhì)體顆粒大小為60～110nm。
6.權(quán)利要求5所述的抗微生物化合物，所述脂質(zhì)體顆粒大小為80nm～100nm；藥脂比為1∶5～1∶3。
7.權(quán)利要求5所述的抗微生物化合物，所述脂質(zhì)體中含有部分氫化的大豆卵磷脂(PHSPC)、膽固醇、末端甲氧基的聚乙二醇—乙醇胺磷酸二硬脂酸酯，含量比例為50～60∶30～40∶5～10。
8.權(quán)利要求7所述的抗微生物化合物，所述脂質(zhì)體中部分氫化的大豆卵磷脂(PHSPC)、膽固醇、末端甲氧基的聚乙二醇—乙醇胺磷酸二硬脂酸酯含量比例為56∶38∶6，顆粒大小為80nm～100nm，藥脂比為1∶4。
9.一種抗微生物藥物組合物，含有權(quán)利要求1～8所述的抗微生物化合物。
10.用權(quán)利要求1～8所述的化合物制備抗微生物藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及修飾性核苷酸及其用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一類修飾性核苷酸具有抗細菌和真菌作用，可用于制備抗感染藥物。
文檔編號C07H19/10GK1687100SQ200510063060
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者羅德瑞克·M·K·戴爾 申請人:奧林格斯技術(shù)有限公司