專利名稱：一種牛朊病毒抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛朊病毒抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
朊病毒(Proteinaceous infectious particles，Prion)病是一類由于機(jī)體正常細(xì)胞膜蛋白PrPC(Cellular Prion Protein，PrPC)因未知原因發(fā)生構(gòu)象改變成為具有蛋白酶抗性的PrPsc(Proteinase-resistant Protein，PrPsc)，在腦組織聚集沉積，引起人類和動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的遺傳性、傳染性疾病，預(yù)后死亡。在動物中包括牛海綿狀腦病(BSE)、羊癢病(Scrapie)、貂傳染性腦病(TME)、貓科動物海綿狀腦病(FSE)及鹿的慢性消耗性疾病(CWD)。在人類中包括庫魯病(Kuru病)、新型變異型克雅氏病(nvCJD)、吉斯-綜合癥(GSS)和致死性家族失眠癥(FFI)等。986年最早發(fā)生于英國的牛海綿狀腦病，經(jīng)研究證實(shí)與人類新型變異型克雅氏病(nvCJD)屬同一致病因子傳播，引起人們的極度恐慌，給公共衛(wèi)生、食品醫(yī)藥工業(yè)、國際貿(mào)易乃至國家安全帶來了全球性影響。新近發(fā)現(xiàn)于美國、加拿大等國家和地區(qū)的牛海綿狀腦病病例加劇了其負(fù)面影響。
由于BSE病原是機(jī)體自身的蛋白成分，機(jī)體不產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，因而不能通過檢測血清的方法進(jìn)行診斷。本病的確診主要依靠組織病理學(xué)方法，目前尚無BSE病原鑒定法。
國外同行較早開展了BSE的診斷研究，用去污劑浸出未固定的BSE感染腦組織，電鏡下觀察到特征性纖維具有診斷意義。通過免疫印跡在未固定的腦組織抽提物中檢查出特征異構(gòu)型的PrP蛋白(PrPSC)，免疫組化法檢查福爾馬林固定的腦組織中的PrPSC堆積，也是輔助診斷方法。1999年，EC批準(zhǔn)了瑞士Prionics公司的Western blot方法、Enfer Scientics公司的ELISA診斷方法、CEA公司的夾心ELISA技術(shù)。國內(nèi)的診斷仍依靠病理組織學(xué)方法。目前，國內(nèi)尚未建立起除病理組織學(xué)診斷以外的相關(guān)檢測技術(shù)。
牛朊蛋白(Bovine prion protein，bPrP)是染色體基因編碼的264個(gè)氨基酸(序列1)的糖蛋白，翻譯后修飾而成的209個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有一對二硫鍵。Prusiner等人證明疾病的發(fā)生是由于正常細(xì)胞蛋白PrP(PrPC)的錯(cuò)誤折疊，引起三維構(gòu)象的變化，進(jìn)而導(dǎo)致致病性蛋白PrP(PrPSc)在腦中蓄積而引起的。PRNP(朊蛋白基因)基因結(jié)構(gòu)如何引起蛋白三維構(gòu)象的變化及其導(dǎo)致構(gòu)象病的機(jī)理尚不清楚，但朊病毒病潛伏期、敏感性、種間屏障等都與Prion基因結(jié)構(gòu)的多態(tài)性相關(guān)。提純牛腦組織Prion蛋白是一項(xiàng)相當(dāng)繁瑣的工作，而且存在被疑似腦組織污染的風(fēng)險(xiǎn)。提純制備方法存在著成本高、產(chǎn)量低、耗時(shí)、操作繁雜、純度不高等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛朊病毒抗體及其制備方法。
本發(fā)明所提供的牛朊病毒抗體是以選自下述多肽家族之一的牛朊蛋白多肽為抗原免疫動物得到的抗體；所述多肽家族由以下多肽組成1)具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的多肽；2)從序列1的自氨基端第1位氨基酸殘基開始向羧基端連續(xù)去除1至24個(gè)氨基酸殘基，和/或從序列1的自氨基端第264位氨基酸殘基開始向氨基端連續(xù)去除1至23個(gè)氨基酸殘基得到的多肽。
所述抗原優(yōu)選為具有序列表中序列1的自氨基端第25位至241位氨基酸殘基序列的牛朊蛋白多肽。
所述被免疫的動物可為兔。
所述抗體可為多克隆抗體。
所述牛朊病毒抗體可為兔源多克隆抗體。
所述牛朊蛋白多肽可按如下方法制備將所述多肽家族中的任一多肽的編碼基因插入原核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有所述牛朊蛋白多肽編碼基因的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到牛朊蛋白多肽。
所述牛朊蛋白多肽編碼基因優(yōu)選為具有序列表中序列2的自5′端第73位堿基至第723位堿基的DNA序列。
所述原核細(xì)胞表達(dá)載體可為pET30a(+)。
所述原核宿主可為大腸桿菌和枯草桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)。
所述含有牛朊蛋白多肽編碼基因的重組表達(dá)載體可為pET30a(+)-bPrPc；所述pET30a(+)-bPrPc是將所述牛朊蛋白多肽編碼基因插入pET30a(+)的EcoRI和NdeI的識別位點(diǎn)間得到的。
本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)有效地表達(dá)牛朊蛋白多肽，表達(dá)量可達(dá)20mg/L培養(yǎng)基。本發(fā)明表達(dá)牛朊蛋白多肽的方法與已有的真核表達(dá)方法相比，表達(dá)外源基因成本低、產(chǎn)量高、安全、易純化、純度高而且簡便易行。本發(fā)明表達(dá)的牛朊蛋白多肽可被蛋白酶K消化，Western-blotting蛋白轉(zhuǎn)印試驗(yàn)證實(shí)，所表達(dá)的牛朊蛋白多肽具有良好的免疫反應(yīng)性。經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測證實(shí)，利用本發(fā)明表達(dá)的牛朊蛋白多肽免疫家兔制備的Prion兔多克隆抗體可用于PrPc的檢測。利用本發(fā)明表達(dá)的牛朊蛋白多肽作為抗原制備抗體，解決了從組織中提純制備牛朊病毒蛋白的難題。本發(fā)明的牛朊病毒抗體可用于牛海綿狀腦病(BSE)的檢測。


圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-bPrPc的構(gòu)建示意2為重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-bPrPc的PCR鑒定結(jié)果圖3為重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-bPrPc的雙酶切鑒定結(jié)果圖4為工程菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果圖5為工程菌表達(dá)產(chǎn)物的Western-Blotting分析6為工程菌表達(dá)產(chǎn)物及其純化、以及工程菌表達(dá)的牛朊蛋白多肽經(jīng)白酶K消化后的SDS-PAGE電泳圖譜圖7為用牛朊病毒抗體免疫檢測未經(jīng)蛋白酶K消化處理的牛PrPc樣品的圖譜具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、自序列1的氨基端第25位至241位氨基酸殘基序列的牛朊蛋白多肽的表達(dá)(一)重組工程菌的制備1、牛朊蛋白多肽的表達(dá)載體pET30a(+)-bPrPc的構(gòu)建pET30a(+)-bPrPc的構(gòu)建過程如圖1所示，具體步驟如下(1)PCR擴(kuò)增牛朊蛋白多肽基因(bPrPc基因)利用下列引物，以PMT18-TbPrPc載體為模板，反應(yīng)體系50μl。上游引物P15′CGGGATCCCATATGAAGAAGCGACCAAAACCTG3′(帶下劃線的堿基為BamHI和NdeI的識別位點(diǎn))；下游引物P25′GGGAATTCTATTAACTTGCCCCTCGTTGGTA3′(帶下劃線的堿基為EcoRI的識別位點(diǎn))；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。用TE緩沖液配成50pmol/μl。
采用rTaq PCR試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為50μl。
反應(yīng)體系
10×Buffer 5μldNTP4μlPMT18-TbPrPc1μl(約10ng)P1 1μlP2 1μlddH2O 36.5μlEx Taq DNA聚合酶1.5μl(2U)總體積 50μl反應(yīng)條件98℃預(yù)變性5min，60℃1min冷卻，加入1.5μl Ex Taq DNA聚合酶，低速離心進(jìn)入以下循環(huán)94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，以72℃延伸10min結(jié)束。
其中，PMT18-TbPrPc按如下方法構(gòu)建以按常規(guī)方法提取的牛血液基因組DNA為模板，利用引物F5‘-atggtgaaagccacataggc-3’和R5‘-gaagataatgaaacaggaag-3’按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)回收PCR產(chǎn)物，與載體pMD18-T連接，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，送交公司序列測定驗(yàn)證，將具有序列表中序列2的核苷酸序列的載體命名為PMT18-TbPrPc。
(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-bPrPc的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用glass milk試劑盒(TaKaRa產(chǎn)品，購自原平皓公司)回收，回收片段用EcoRI和NdeI雙酶切；用EcoRI和NdeI雙酶切經(jīng)質(zhì)粒純化試劑盒QIAPreP Spin Miniprep kit((QIAGEN，購自基因公司)純化的pET30a(+)(TaKaRa產(chǎn)品，購自原平皓公司)，并以低熔點(diǎn)瓊脂糖法純化回收酶切產(chǎn)物的大片段。將經(jīng)EcoRI和NdeI雙酶切的PCR產(chǎn)物，與表達(dá)載體pET30a(+)經(jīng)EcoRI和NdeI雙酶切回收的大片段用T4DNA連接酶連接，得到pET30a(+)-bPrPc，將pET30a(+)-bPrPc轉(zhuǎn)化制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂菌于含有50μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37℃生長12-16h，然后小量快速抽提質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和NdeI雙酶切鑒定和利用P1和P2為引物進(jìn)行PCR鑒定，并進(jìn)行測序。PCR鑒定結(jié)果如圖2所示，表明PCR擴(kuò)增得到的片段大小為651bp；圖中MDNA Marker DL2000(上海東風(fēng)麗珠生化試劑廠生產(chǎn)，購自鼎國生物工程公司)(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1、2、3、4PCR產(chǎn)物。酶切鑒定結(jié)果如圖3所示，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-bPrPc經(jīng)EcoRI和NdeI雙酶切后，得到651bp的bPrPc基因片段；圖中MWide Range DNA Ladder Marker(上海東風(fēng)麗珠生化試劑廠生產(chǎn)，購自鼎國生物工程公司)(15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp)；1利用P1和P2為引物得到的PCR產(chǎn)物2經(jīng)EcoRI和NdeI酶切片段。說明重組表達(dá)載體pET30a(+)-bPrPc含有具有序列表中序列2的自5′端第73位-723位堿基DNA序列的牛朊蛋白多肽的編碼基因(bPrPc基因)片段。
2、牛朊蛋白多肽的表達(dá)將鑒定后的陽性重組質(zhì)粒pET30a(+)-bPrPc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含50mg/ml卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)10小時(shí)，挑選生長良好的菌落，提質(zhì)粒，利用P1和P2進(jìn)行PCR鑒定，將經(jīng)PCR可擴(kuò)增得到約650bp的菌落作為工程菌。同時(shí)設(shè)置pET30a(+)載體空白對照。挑選生長良好的工程菌菌落，接種至3ml的含50mg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期OD600＝0.5-1.0。加入IPTG，使其終濃度為1mmol/L，37℃快速震蕩培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)前30min，誘導(dǎo)后1，2，3，4，5，6h收集菌液，取1ml表達(dá)菌體離心，將沉淀經(jīng)0.5mmol/L Tris·HCl和加樣緩沖液90(SDS 0.5g，巰基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚藍(lán)4mg，1M PH6.8Tris-HCl緩沖液2ml，加蒸餾水定容至10ml)裂解變性5min，8000rpm離心后，取10μl上清液上樣，同時(shí)設(shè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量孔，進(jìn)行15％SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖4所示，表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h后，有大小為24KDa的牛朊蛋白多肽表達(dá)。圖中，MMarker；1、2、3、4、5、6、7誘導(dǎo)前0.5h、誘導(dǎo)后1h、誘導(dǎo)后2h、誘導(dǎo)后3h、誘導(dǎo)后4h、誘導(dǎo)后5h、誘導(dǎo)后6h；箭頭示目的條帶。
根據(jù)QIAexpressDetection手冊，SDS-PAGE結(jié)束后，以按照實(shí)施例2步驟(一)的方法制備的兔抗牛朊病毒抗體為一抗，以羊抗兔IgG-HRP為二抗進(jìn)行Western blotting免疫印跡檢測，結(jié)果如圖5所示，表明在誘導(dǎo)3h、4h菌液沉淀中得到約24KDa的雜交條帶。圖中MMarker；1、2誘導(dǎo)3h、4h菌液上清；3、4誘導(dǎo)3h、4h菌液沉淀；箭頭示目的條帶。說明表達(dá)的牛朊蛋白多肽具有良好的免疫反應(yīng)性。
3、牛朊蛋白多肽的純化檢測取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，1000rpm離心，將沉淀重懸在超聲緩沖液(50mmol/LTris·HCl，pH8.02mmol/L EDTA)中，加入溶菌酶(終濃度100μl/ml)，DNA酶(終濃度10μg/ml)，和Triton X-100(終濃度0.01％V/V)，置30℃水浴15min，在冰浴條件超聲破碎，超聲條件為超聲4秒間隔4秒，超聲次數(shù)60次，功率200w，1000rpm離心，取沉淀得到包涵體，包涵體用含有0.5％Triton X-100，2mol/L NaCl和2mol/L尿素的20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH8.0)清洗。洗滌后的包涵體溶解在起始緩沖液PUBS(含有8mol/L尿素和0.1mol/L DDT的20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.0))中。洗滌過程的效果用SDS-PAGE檢測。利用BD Biosciences灌注層析系統(tǒng)，純化牛朊蛋白多肽，洗脫緩沖液是含有1mol/L NaCl的PUBS，層析條件為流速為3ml/min，洗脫體積35ml。將純化得到的蛋白溶液用15％SDS-PAGE進(jìn)行檢測。純化結(jié)果如圖6所示，空載體(pET30a(+))與重組載體(pET30a(+)-bPrPc)表達(dá)結(jié)果對比表明，牛朊蛋白多肽在BL21(DE3)中具有特異性表達(dá)，利用灌注層析系統(tǒng)，獲得了較好的純化效果(泳道6、7)。圖中，MMarker；泳道2、3為含pET30a(+)的大腸桿菌BL21(DE3)的表達(dá)蛋白結(jié)果，4、5為含重組載體pET30a(+)-bPrPc的大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)蛋白結(jié)果，6、7為含重組載體pET30a(+)-bPrPc的大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)的牛朊蛋白多肽的純化結(jié)果；箭頭示目的條帶。將15％SDS-PAGE電泳圖譜進(jìn)行掃描后利用Image Master軟件分析計(jì)算得到牛朊蛋白多肽的表達(dá)水平，牛朊蛋白多肽的最高表達(dá)水平為20mg/L培養(yǎng)基。
對純化后的牛朊蛋白多肽用蛋白酶K消化檢測，1g牛朊蛋白多肽加入1mg蛋白酶K，37℃反應(yīng)30min，進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖6的泳道1所示，表明蛋白酶K對牛朊蛋白多肽消化以后，牛朊蛋白多肽被完全降解，說明表達(dá)的牛朊蛋白多肽無抗蛋白酶的特性。
實(shí)施例2、兔抗牛朊病毒抗體的制備及用該抗體檢測牛PrPc(一)兔抗牛朊病毒抗體的獲得采用趾間、腘淋巴結(jié)、皮下注射結(jié)合的方法，用實(shí)施例1制備純化的牛朊蛋白多肽疫家兔。
1、取4只雄性大白兔，體重2.5-3.0kg。共進(jìn)行4次免疫，每次間隔2周。首免取純化的牛朊蛋白多肽，加等量弗氏完全佐劑充分乳化后足趾間注射，牛朊蛋白多肽劑量為200ug/只。
2、二免用弗氏不完全佐劑與牛朊蛋白多肽乳化后腘淋巴結(jié)免疫動物，牛朊蛋白多肽劑量為100ug/只；3、三免用弗氏不完全佐劑與牛朊蛋白多肽乳化后背部皮下多點(diǎn)注射，牛朊蛋白多肽劑量為100ug/只；4、第4次靜脈注射50ug牛朊蛋白多肽/只，三天后耳靜脈采血，分離血清常規(guī)間接ELISA法測血清效價(jià)。包被抗原同時(shí)分別設(shè)合成肽(LIHFGSDYEDRYYRE，上海生物工程公司合成購買)、牛朊蛋白多肽和腦組織PrPc(取0.1g牛腦組織，加十倍體積的勻漿緩沖液(5％Triton X-100，0.5％SDS，50mml/LTris-Cl，pH8.0)，勻漿，離心取上清，該上清即為腦組織PrPc)平行對照，結(jié)果表明得到的牛朊病毒抗體對合成肽的效價(jià)為1/108。使用飽和硫酸鹽沉淀法純化該牛朊病毒抗體。
(二)抗體免疫檢測牛PrPc1、牛腦組織PrPc提取物電泳樣品的制備(1)勻漿用天平稱取0.50g的正常牛腦干處腦閂部位的延髓，放入50ml的試管中。加入5ml 5×勻漿緩沖液(購自Roche公司的化學(xué)發(fā)光方法檢測試劑盒Prion-CheckWESTERN 3032840自帶)，在室溫下將該組織手動勻漿，得到牛PrPc的勻漿樣品。
(2)消化取10μl 1×消化緩沖液(購自Roche公司的化學(xué)發(fā)光方法檢測試劑盒Prion-Check WESTERN 3032840自帶)加入ependorf管中，再加入100μl牛PrPc的勻漿樣品和10μl蛋白酶K(20U/ml)(購自Roche公司的化學(xué)發(fā)光方法檢測試劑盒Prion-Check WESTERN 3032840自帶)，并用吸液管反復(fù)吹打混勻。48℃下消化40min。加入10μl的1×消化終止液(購自Roche公司的化學(xué)發(fā)光方法檢測試劑盒Prion-Check WESTERN 3032840自帶)，終止消化，得到消化后的牛PrPc樣品。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western blotting分析分別向10μl牛PrPc的勻漿樣品，10μl消化后的牛PrPc樣品中加入100μl加樣緩沖液，混勻，96℃加熱5min；將試劑盒Prion-Check WESTERN 3032840的PrPc蛋白作為對照，65℃加熱2min。進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳后，分別以步驟(一)制備的牛朊病毒抗體和抗Prion蛋白抗體(Prion-Check WESTERN 3032840)為一抗，以堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗(1∶5000)(M德國生產(chǎn)，購自Roche公司)，進(jìn)行Western blotting分析，利用化學(xué)發(fā)光方法檢測試劑盒Prion-CheckWESTERN 3032840(德國生產(chǎn)，購自Roche公司)，進(jìn)行檢測，結(jié)果表明用蛋白酶K消化的牛PrPc樣品，PrPc被完全降解；未經(jīng)蛋白酶K消化處理的牛PrPc的勻漿樣品由于PrPc的糖基化程度不同，相應(yīng)的產(chǎn)生3條大小不同的條帶(圖7，其中泳道1為實(shí)施例1步驟(一)制備的牛朊病毒抗體反應(yīng)，泳道2為試劑盒Prion-Check WESTERN 3032840牛朊病毒抗體反應(yīng))。說明該牛朊病毒抗體可用于牛PrPc的檢測。
序列表<160>2<210>1<211>264<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<400>1Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala1 5 10 15Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly20 25 30Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly35 40 45Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His50 55 60Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His85 90 95Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys100 105 110Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Ile Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala115 120 125Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala130 135 140Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr145 150 155 160Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro165 170 175Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn180 185 190
Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn195 200 205Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met210 215 220Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly225 230 235 240Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser245 250 255Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly260<210>2<211>795<212>DNA<213>牛(Bos taurus)<400>2atggtgaaaa gccacatagg cagttggatc ctggttctct ttgtggccat gtggagtgac60gtgggcctct gcaagaagcg accaaaacct ggaggaggat ggaacactgg ggggagccga120tacccaggac agggcagtcc tggaggcaac cgttatccac ctcagggagg gggtggctgg180ggtcagcccc atggaggtgg ctggggccag cctcatggag gtggctgggg ccaacctcat240ggaggtggct ggggtcagcc ccatggtggt ggctggggac agccacatgg tggtggaggc300tggggtcaag gtggtaccca cggtcaatgg aacaaaccca gtaagccaaa aaccaacata360aagcatgtgg caggagctgc tgcagctgga gcagtggtag ggggccttgg tggctacatg420ctgggaagtg ccatgagcag gcctcttata cattttggca gtgactatga ggaccgttac480tatcgtgaaa acatgcaccg ttaccccaac caagtgtact acaggccagt ggatcagtat540agtaaccaga acaactttgt gcatgactgt gtcaacatca cagtcaagga acacacagtc600accaccacca ccaaggggga gaacttcacc gaaactgaca tcaagatgat ggagcgagtg660gtggagcaaa tgtgcattac ccagtaccag agagaatccc aggcttatta ccaacgaggg720gcaagtgtga tcctcttctc ttcccctcct gtgatcctcc tcatctcttt cctcatttttctcatagtag gatag 79權(quán)利要求
1.一種制備牛朊病毒抗體的方法，是以選自下述多肽家族之一的牛朊蛋白多肽為抗原免疫動物得到的抗體；所述多肽家族由以下多肽組成1)具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的多肽；2)從序列1的自氨基端第1位氨基酸殘基開始向羧基端連續(xù)去除1至24個(gè)氨基酸殘基，和/或從序列1的自氨基端第264位氨基酸殘基開始向氨基端連續(xù)去除1至23個(gè)氨基酸殘基得到的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述抗原為具有序列表中序列1的自氨基端第25位至241位氨基酸殘基序列的牛朊蛋白多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述被免疫的動物為兔。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述牛朊病毒抗體為兔源多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述牛朊蛋白多肽可按如下方法制備將所述多肽家族中的任一多肽的編碼基因插入原核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有所述牛朊蛋白多肽編碼基因的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到牛朊蛋白多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述牛朊蛋白多肽編碼基因具有序列表中序列2的自5′端第73位堿基至第723位堿基的DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述原核細(xì)胞表達(dá)載體為pET30a(+)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述原核宿主為大腸桿菌和枯草桿菌；優(yōu)選為大腸桿菌；尤其優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述含有牛朊蛋白多肽編碼基因的重組表達(dá)載體為pET30a(+)-bPrPc；所述pET30a(+)-bPrPc是將所述牛朊蛋白多肽編碼基因插入pET30a(+)的EcoR I和Nde I的識別位點(diǎn)間得到的。
10.由權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的方法得到的牛朊病毒抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛朊病毒抗體及其制備方法。本發(fā)明所提供的制備牛朊病毒抗體的方法，是以選自下述多肽家族之一的多肽為抗原免疫動物得到的抗體；所述多肽家族由以下多肽組成1)具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的多肽；2)從序列1的自氨基端第1位氨基酸殘基開始向羧基端連續(xù)去除1至24個(gè)氨基酸殘基，和/或從序列1的自氨基端第264位氨基酸殘基開始向氨基端連續(xù)去除1至23個(gè)氨基酸殘基得到的多肽。利用本發(fā)明表達(dá)的牛朊蛋白多肽作為抗原制備抗體，解決了從組織中提純制備牛朊病毒蛋白的難題。本發(fā)明的牛朊病毒抗體可用于牛海綿狀腦病(BSE)的檢測。
文檔編號C07K16/08GK1699422SQ20051007980
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日
發(fā)明者趙德明, 楊建民, 劉美麗, 尹曉敏, 馬李穎, 周向梅 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)