專利名稱：朊病毒蛋白配基和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明涉及蛋白配基相互作用領(lǐng)域，更具體地涉及結(jié)合朊病毒蛋白的配基的鑒定和使用該配基檢測(cè)或除去生物學(xué)樣品中朊病毒的方法。
背景技術(shù)：
天然或細(xì)胞朊病毒蛋白“PrPc”在整個(gè)哺乳類中廣泛分布，并具有格外高度保守的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)。感染性朊病毒被認(rèn)為是由正常細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPc)的修飾型組成，被稱做“ft^sc”。朊病毒與其它感染性病原體有一些共同的性質(zhì)，但似乎不合有核酸。相反，推測(cè)非感染性I^rPc向感染性ft^sc的轉(zhuǎn)變涉及翻譯后的構(gòu)象變化，在這期間α 螺旋被轉(zhuǎn)換為β-折疊片。含有3個(gè)α螺旋，少有β-折疊片結(jié)構(gòu)；相反，PrPsc富含 β -折疊片。據(jù)認(rèn)為I^rPc轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPsc會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生感染性海綿狀腦病(TSh)，其間PrPsc 積聚在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ中，并伴有神經(jīng)病理性改變和神經(jīng)學(xué)功能障礙。ft^sc，通常稱作朊病毒蛋白的“瘙瘁病(scrapie) ”型，被認(rèn)為對(duì)動(dòng)物和人的這些感染性神經(jīng)變性疾病的傳播和發(fā)病機(jī)理是必須的并且可能是足夠的。TSEs的具體實(shí)例包括瘙癢病，其影響綿羊和山羊；牛海綿狀腦病(BES)，其影響牛；感染性水貂腦病，貓海綿狀腦病和長(zhǎng)耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和麋鹿的慢性萎縮病 (CWD)。在人類，TSE疾病可自我表現(xiàn)為庫魯病(kuru)、克-雅綜合癥(CJD)、格-施-沙 (Gerstmann-Straussler-Scheinker)綜合征(GSS)、致死性失眠癥和變異克-雅綜合癥 (vCJD)。vCJD最近在人類出現(xiàn)是BSE在英國流行的結(jié)果，很有可能是由于消費(fèi)了來源于感染了 BSE或“瘋牛病”的牛的食物產(chǎn)品所致。在上世紀(jì)從80年代中期到90年代早期，在英國有未知數(shù)目的人攝入了被BSE感染的牛的神經(jīng)組織潛在性污染的食物。因?yàn)檫@種經(jīng)口感染的疾病的潛伏期在人類可能超過二十年，因此vCJD的準(zhǔn)確發(fā)病率可能許多年都不明顯。 迄今為止，已知超過130個(gè)人已經(jīng)感染這種疾病，主要在英國；然而，加拿大、法國、香港、愛爾蘭、意大利和美國也有病例報(bào)道。被污染的牛飼料產(chǎn)品從英國向全世界的出口表明BSE 有可能全球存在，因此有發(fā)生cVJD的可能性。與這些觀察一致的是在大多數(shù)歐洲國家、日本和以色列檢測(cè)到BSE。所以，從包括食物產(chǎn)品的各種材料中檢測(cè)和除去感染性朊病毒蛋白的能力是極其重要的。在歷史上，TSEs的診斷是基于該疾病臨床癥狀的出現(xiàn)，而且只有通過對(duì)死后腦組織的組織學(xué)檢查才能夠確認(rèn)。所有TSh的特征是缺乏對(duì)病因的可測(cè)量的宿主免疫應(yīng)答。因此，沒有抗體產(chǎn)生，不能使用常規(guī)的血清學(xué)試驗(yàn)鑒定被感染的動(dòng)物。最近，對(duì)腦中異常朊病毒蛋白的鑒定已經(jīng)提高了做出疾病診斷的能力。
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除了攝入牛來源的被感染產(chǎn)品，輸血和器官移植代表了另一種在人類中傳播vCJD 的潛在方式。人類通過輸血傳播vCJD的可能性目前尚不知道，但是基于從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、 包括從經(jīng)口實(shí)驗(yàn)性感染BSE的綿羊和天然感染搔癢病的綿羊傳播的數(shù)據(jù)，這似乎非常有可能。和其它人類TSh不同，PrPsc存在于vCJD病人的淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)中，因此增加了傳染原存在于血液中以及其通過輸血傳播的可能性。提高對(duì)通過輸血傳播的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)注的其它因素包括未知數(shù)目、但是推測(cè)有大量的人暴露于BSE并且缺乏vCJD臨床前診斷性試驗(yàn)。而且， 在靈長(zhǎng)類和小鼠中的物種適應(yīng)后，vCJD的毒力似乎增強(qiáng)，提示人和人之間的傳播可能比從牛到人的傳播更有效。因此，急需用于防止vCJD通過輸血傳播的方法。這樣的措施可能包括感染供體的早期鑒定以及動(dòng)物來源食品和旨在用于動(dòng)物或人類消費(fèi)或應(yīng)用的健康產(chǎn)品、 人和牛來源的血源性產(chǎn)品、以及器官移植中TSE病原的延遲，除去和滅活。不幸的是，PrPsc 顯著耐受化學(xué)和物理滅活方法，選擇性的滅活方法很難找。通過與配基的特異性相互作用除去朊病毒似乎更有希望。已經(jīng)鑒定出許多結(jié)合朊病毒蛋白的配基。如在PCT/US01/11150中所描述的，已經(jīng)嘗試了從組合肽文庫中篩選出能和在所有已知哺乳動(dòng)物朊病毒蛋白中發(fā)現(xiàn)的八肽重復(fù)序列(PHGGGWGQ(SEQ ID NO220))結(jié)合的配基，而且發(fā)現(xiàn)了一系列的配基。其它材料包括各種聚合物，例如，TosoBiokp的氨基聚丙烯酸甲酯、常用的離子交換樹脂(見美國專利No. 5，808，OlLGawryl等)、與淀粉樣斑塊相互作用的配基，例如剛果紅(Ingrosso, L.，等，Congo red prolongs the incubation periodin scrapie-infected hamsters. J. Virology 69 :506-508 (1995))、4_碘，4_脫氧阿 ^ (Tagliavini,F. ,^,Effectiveness ofanthracycline against experimental prion disease in Syrianhamster. Science 276 :1119-1122 (1997))、兩性霉素 B、卟啉和酞菁 (Priola, S. Α.,等，Porphyrin and Phthalocyainine antiscrapiecompounds, Science 287 :1503-1506(2000)),金屬(Mockel 等，Biochemistry，37，7185-7193 (1998))、以及與prp相互作用形成復(fù)合體的肽(見美國專利5，750，361，Prusiner等，和Soto， C.等，Reversion of prion protein conformational changes insynthetic β -sheet breakerpeptides, Lancet, 355 192-197 (2000)),肝素和其它多硫酸化聚陰離子 (Caughey, B.，等，Binding of the Protease—sensitive form ofprion protein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and CongoRed, J. Virology 68:2135-2141(1994))、 抗體(Kascsak, R. J., 等，Immunodiagnosis of prion disease, Immunological Inyest. 26 :259-268(1997)),以及其它蛋白，例如纖溶酶原(Fischer, Μ. B.等，Binding of disease-associated prion protein to plasminogen. , Nature 408 :479-483 (2000))。目前，盡管一些配基在特定的環(huán)境中可能有用，但是還沒有完全表征一個(gè)配基或者發(fā)現(xiàn)它能結(jié)合來自多種介質(zhì)的朊病毒(見美國專利No. 5，808，011，Gawryl等)。到目前為止，人類TSE疾病100%是致命的。不幸的是，盡管已經(jīng)報(bào)道有許多化合物可能是有前景的治療劑，包括兩性霉素，硫酸化聚陰離子、剛果紅染料以及蒽環(huán)抗生素， 但所有化合物均顯示較微弱的阻礙朊病毒增殖的潛能，沒有一個(gè)顯示對(duì)從感染宿主中除去預(yù)先存在的朊病毒有任何影響。因此，仍急需新的治療試劑。在許多其它疾病中，其中許多疾病是神經(jīng)性疾病，正常可溶蛋白的裝配和分解形成構(gòu)象改變和不溶形式被認(rèn)為是致病過程。疾病的發(fā)生和從正常形式轉(zhuǎn)變到構(gòu)象改變蛋白之間的關(guān)系還很不清楚。除了朊病毒外，這種不溶蛋白的實(shí)例還包括阿爾茨海默氏(Alzheimer' s)病和腦淀粉樣血管病(CAA)的淀粉樣蛋白斑中的β -淀粉狀蛋白肽；帕金森氏(Parkinson' s)病的Lewy小體中的α突觸核蛋白(α-synuclein)沉積物、在額顳葉癡呆(frontal temporal dementia)和皮克(Pick's)病中神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的tau、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化中的超氧化物歧化酶；以及亨廷頓(Huntington' s)病中的亨廷頓蛋白(huntingtin)。一般這些高度不溶的蛋白形成由具有片層構(gòu)象共有特征的無分支原纖維構(gòu)成的聚集物。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，淀粉狀蛋白可存在于腦和腦脊膜血管中(腦血管沉積) 以及腦實(shí)質(zhì)(斑塊)中。在人和動(dòng)物模型中神經(jīng)病理學(xué)的研究表明鄰近淀粉樣沉積物的細(xì)胞的正常功能受到擾亂。神經(jīng)炎斑塊形成的確切機(jī)制以及斑塊形成與疾病相關(guān)性神經(jīng)變性過程的相互關(guān)系在很大程度上還不清楚。為理解其轉(zhuǎn)變的過程以及發(fā)現(xiàn)將與疾病相關(guān)形式特異性相互作用的結(jié)構(gòu)，都需要有可容易地分離或可區(qū)別蛋白的兩個(gè)或多個(gè)構(gòu)象型(例如I^rPc和ft^sc) 的方法學(xué)。當(dāng)前分離或區(qū)別同種型的方法學(xué)包括在存在離液劑如尿素的聚丙烯酰胺凝膠即橫向尿素梯度膠中的不同遷移率；對(duì)蛋白酶，例如蛋白酶K(PK)處理的不同敏感性，稱作 PrPres的ft~PSC的1 耐受性消化產(chǎn)物的檢測(cè)；不同的溫度穩(wěn)定性；在非離子型去污劑中的相對(duì)溶解度；以及纖維結(jié)構(gòu)結(jié)合某些化學(xué)物質(zhì)(例如剛果紅和異黃酮S)的能力。然而，仍迫切需要鑒定對(duì)構(gòu)象發(fā)生改變的蛋白、尤其是疾病相關(guān)型蛋白特異的高親合力試劑。這種試劑將可用于開發(fā)可能的診斷性試劑盒，分離和純化不同形式的蛋白，用于從治療劑、生物產(chǎn)品、疫苗、和食品中除去所述疾病的感染型，以及用于治療。發(fā)明概述本發(fā)明提供了結(jié)合朊病毒蛋白的配基及其應(yīng)用。所述配基是與朊病毒分析物以選擇性和特異性相結(jié)合的肽。它們能夠結(jié)合朊病毒蛋白中的一種或多種形式，包括細(xì)胞朊病毒蛋白O^rPc)、感染性朊病毒蛋白(PrPsc)以及重組朊病毒蛋白(PrPr)。該配基可結(jié)合來自各種物種，包括人和倉鼠的朊病毒。也提供了包含在支持物如樹脂或膜上的朊病毒蛋白結(jié)合配基的組合物。配基可用于從樣品中檢測(cè)或除去朊病毒蛋白，所述樣品例如是生物學(xué)流體或環(huán)境樣品。配基可用于檢測(cè)或除去樣品中所有的朊病毒蛋白，或可選擇性地挑選以檢測(cè)或除去朊病毒蛋白的單一型，因此配基可用于在來自患人TSh的病人和患瘙瘁病、BSE和CWD的動(dòng)物的樣品中區(qū)分感染性和非感染性朊病毒蛋白。也提供了一種治療受試者中朊病毒相關(guān)病理或延緩其進(jìn)展的方法。例如，本發(fā)明的配基可用于治療病變，如CJD、vCJD、GSS、致死性失眠癥、瘙癢病、BSE和CWD。這種配基可能是通過抑制PrPsc的聚合或通過抑制PrPsc和I^rPc的相互作用、從而延緩PrPsc的進(jìn)一步進(jìn)展而起作用的。本發(fā)明的另一方面提供了用于鑒定額外配基，特別是對(duì)蛋白的構(gòu)象改變形式特異的配基的方法，其中的一些形式參與疾病的發(fā)展。所描述的方法學(xué)也適合開發(fā)、評(píng)價(jià)或篩選直接結(jié)合ft^sc的大量潛在的藥物候選物。從下面詳細(xì)的描述和優(yōu)選的實(shí)施例中明顯可知本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)。附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1來自結(jié)合腦勻漿物的haPrPc和haPrPsc的組合文庫的珠中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。通過特異性單克隆抗體(3F4)與綴合了對(duì)3F4特異的二抗的堿性磷酸酶的結(jié)合檢測(cè)和Prfsc。在放射自顯影膠片上檢測(cè)對(duì)堿性磷酸酶特異性的化學(xué)發(fā)光底物所產(chǎn)生的光。對(duì)組合文庫的珠所產(chǎn)生的信號(hào)的位置編號(hào)。隨后對(duì)珠上的配基測(cè)序。這些珠在轉(zhuǎn)移和變性之前不產(chǎn)生信號(hào)，但是在結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)移和變性以及用綴合3F4抗體的酶標(biāo)記之后，發(fā)射出強(qiáng)信號(hào)。圖2顯示了正常人腦提取物中的hUft~PC與柱樣形式的親和樹脂的結(jié)合。制備腦勻漿物和珠，并在磷酸鹽(PBQ或檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖(CPD)緩沖液中平衡。蛋白印跡上信號(hào)的強(qiáng)度是結(jié)合到樹脂上的I^rPc的強(qiáng)度的函數(shù)。泳道1包含分子量標(biāo)準(zhǔn)(MW)；泳道2 20ul 0. 正常人腦勻漿物。泳道3-8，從珠中洗脫的I^rPc。圖3顯示了 CJD感染的人腦的提取物中huft^sc以分批形式與親和樹脂的結(jié)合。 該圖是蛋白印跡，其中顯示與含有散發(fā)性CJD病人的huft^sc的組織勻漿物相接觸后從珠中洗脫的朊病毒量。在與已用1 處理以顯示ft^res的存在或者保持未處理的組織勻漿物接觸后，沖洗珠。將它們?cè)诤蠸DS的緩沖液中煮沸以釋放結(jié)合蛋白，在蛋白印跡之后通過 SDS-PAGE拆分樣品。用單克隆抗體3F4探針探測(cè)后，由PrP特異性條帶的出現(xiàn)證明huft^sc 和與樹脂的結(jié)合。在凝膠的頂端顯示了肽序列。Hi消化的樣品表示為(+)，未消化的為㈠。圖4CJD感染人腦的提取物中的huft^sc與柱形式的親和性樹脂的結(jié)合。在凝膠的頂端顯示肽序列。事先用Hi消化過的樣品以+表示，未消化的以-表示。對(duì)照包括20ul 1 %腦勻漿。使用單克隆抗體3F4特異性檢測(cè)和ft^sc，并通過化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)使其可見。圖5 “珠印跡”轉(zhuǎn)移方案的圖示。在與起始材料孵育之后在凝膠中排列珠。結(jié)合蛋白從珠上轉(zhuǎn)移并如所示通過緩沖液的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移捕獲在膜上。圖6通過各種親和樹脂從感染的RBCCs中除去PrPres。用患瘙癢病的倉鼠的腦勻漿使紅細(xì)胞濃縮物(RBCCs)致敏，并順序通過具有不同親和配基的樹脂柱。通過凝膠電泳分析樹脂結(jié)合型蛋白。凝膠上樣的方式顯示于表11中。發(fā)明詳述這里描述了結(jié)合朊病毒蛋白的配基及其應(yīng)用。所述配基是能夠以特異性和親和性結(jié)合朊病毒蛋白的蛋白、肽或多肽。優(yōu)選地，配基具有6kDa或更低的分子量。配基可用于檢測(cè)樣品、如人或動(dòng)物來源的生物學(xué)流體或環(huán)境樣品中朊病毒蛋白的方法，以及診斷和治療朊病毒疾病的方法。例如，本發(fā)明的配基可用于使用全血、血液成分、 細(xì)胞、血清、血漿、血漿衍生物、腦脊液、尿液、淚液、扁桃體、闌尾和其它樣品治療診斷病變?nèi)鏑JD、vCJD、GSS、致死性失眠癥、瘙癢病、BSE和CWD以及其它TSh。配基也可用于從樣品中除去朊病毒蛋白，所述樣品例如是血液樣品、血液成分、細(xì)胞、血清、血漿、血漿衍生物、腦脊液、尿液、淚液、扁桃體、闌尾和其它樣品。配基用于在樣品中檢測(cè)或從中除去所有朊病毒蛋白，或者可選擇性的選取以檢測(cè)或除去朊病毒蛋白的單一形式，因此可用來區(qū)分樣品中的感染性和非感染性朊病毒蛋白。 所描述的方法可用于從聚合物、合成化合物以及合成化合物文庫中篩選朊病毒的額外配基。 這里也提供了鑒定額外配基，特別是對(duì)蛋白的構(gòu)象改變形式特異的配基的方法，其中的一些改變形式與是疾病的進(jìn)展有關(guān)。也提供了適于發(fā)現(xiàn)、評(píng)價(jià)或篩選大量潛在藥物候選物的方法學(xué)。定義這里使用的術(shù)語“一個(gè)”、“一種”、“這個(gè)”和“這種”定義為“一個(gè)或多個(gè)”或“一種
或多種”，還包含多個(gè)(種)的情形，除非上下文顯示不適當(dāng)。術(shù)語“3F4”指對(duì)IM3c的天然型，但不對(duì)天然PrPsc或ft^res特異的單克隆抗體。 抗體對(duì)倉鼠和人類PrPc，PrPsc和ft^res的變性形式有特異性。如這里使用的，術(shù)語“血源性組合物”和血液組合物可交換地使用，意思是包括全血、紅細(xì)胞濃縮物、血漿、血清、富含血小板和缺乏血小板的成分、血小板濃縮物、白細(xì)胞、血漿沉淀物、血漿分級(jí)分離沉淀物和上清液，包括IgA、IgE、IgG和IgM的免疫球蛋白制品、純化的凝血因子濃縮物、纖維蛋白原濃縮物，或來源于人類或動(dòng)物的各種其它組合物。其也包括通過現(xiàn)有技術(shù)中的各種常用方法中的任何一種方法，包括離子交換、親和、凝膠滲透、和/ 或疏水層析或通過示差沉淀所制備的純化的血源性蛋白。術(shù)語“組合文庫”指通過固相組合化學(xué)技術(shù)合成的化學(xué)制劑的集合。這個(gè)定義包括使用產(chǎn)生數(shù)百萬有明確長(zhǎng)度的隨機(jī)肽或可設(shè)計(jì)成包括明確結(jié)構(gòu)的分離-偶聯(lián)-重組方法。 構(gòu)件可以是天然氨基酸、合成分子、氨基酸類似物、分枝類似物、三嗪染料等。術(shù)語特定序列的“保守性變異”或“保守性修飾變異”指氨基酸或其它具有實(shí)質(zhì)性化學(xué)相似性的密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)。此外，改變、添加或缺失編碼序列中單個(gè)氨基酸或小比例氨基酸的各取代、缺失或添加是保守性修飾變異，其中所述變異導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸取代另一種氨基酸。提供功能相似性氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。在下面的六組中，每一組都含有可相互進(jìn)行保守性取代的天然氨基酸1)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。許多非天然氨基酸也被視為是天然存在的氨基酸的保守取代。如果當(dāng)序列排列以達(dá)到最大對(duì)應(yīng)時(shí)，兩個(gè)序列中的氨基酸殘基序列相同，那么這兩個(gè)多肽可以說成是“同一的”?？赏ㄟ^ Smith 和 Waterman，Adv. App 1. math. 2 =482(1981)的局部同源性算法、通過 Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性排列算法、通過 Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (US. AJ 85:2444(1988)的相似性搜索方法、通過電腦完成這些算法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和 TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup，575 Science Dr. ,Madison，WI)或通過檢查,進(jìn)行序列的最佳排列以便比較。術(shù)語“配基”指與蛋白、肽或多肽結(jié)合的分子。本發(fā)明的配基可以是抗體制劑、蛋白、肽、多肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、糖、脂類、有機(jī)分子、聚合物、和/或推定的治療劑寸。術(shù)語“蛋白”、“肽”、“多肽”、和“寡肽”可交換使用，這里被定義為氨基酸鏈，其中碳通過由一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基之間的縮合反應(yīng)所形成的肽鍵相連接。在鏈一端的末端氨基酸(即氨基末端)有游離氨基，而在鏈的另一端的末端氨基酸(即羧基末端)有游離羧基。這樣，術(shù)語“氨基末端”(縮寫為N-末端)指肽的氨基末端處氨基酸上的游離氨基，或者指肽內(nèi)任何其它部位處的氨基酸的氨基(當(dāng)參與肽鍵時(shí)指亞氨基)。類似地，術(shù)語“羧基末端”(縮寫為C-末端)指肽的羧基末端處氨基酸上的游離羧基，或者指肽內(nèi)任何其它部位處氨基酸的羧基。當(dāng)在樹脂上通過Merrifield合成法合成時(shí)，通常通過與固定化氨基的肽鍵將C-末端羧基偶聯(lián)到樹脂上。典型地，按順序?qū)M成肽的氨基酸編號(hào)，從氨基末端開始，并且向肽的羧基末端的方向增加。因此，當(dāng)提及一個(gè)氨基酸“跟隨”另一個(gè)時(shí)，則后一氨基酸比“前面的”氨基酸更靠近肽的羧基末端。術(shù)語“PrPc”指在哺乳動(dòng)物體內(nèi)自然而廣泛表達(dá)的天然朊病毒蛋白分子。其結(jié)構(gòu)高度保守，而且與疾病狀態(tài)不相關(guān)。術(shù)語“ft^sc”指分子的構(gòu)象改變型，其被認(rèn)為是有感染性的，而且與TSE/朊病毒疾病有關(guān)，包括vCJD、CJD、庫魯病(kuru)、致命性失眠癥、GSS、瘙瘁病、BSE、CffD,以及俘獲和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的其它罕見TSh。它和正常的細(xì)胞有相同的氨基酸序列，但已經(jīng)將其中一些α-螺旋轉(zhuǎn)換成了 β-片層，并且與疾病狀態(tài)有關(guān)。術(shù)語〃 PrPres"指在用I3K部分消化IM3SC后仍然存在的IM3SC蛋白的27_30kDa 蛋白酶耐受性衍生物。術(shù)語〃 ft^r〃指通過重組技術(shù)表達(dá)的朊病毒蛋白。術(shù)語‘‘PrP ‘‘指一般的朊病毒蛋白。這里使用的術(shù)語“殘基”指通過酰胺鍵或酰胺鍵模擬物摻入到寡肽中的氨基酸(D 或L)或氨基酸模擬物。這樣，氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者，除非另有限制，還可包括以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用的天然氨基酸的已知類似物(即氨基酸模擬物)。此外，酰胺鍵模擬物包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的肽骨架修飾。術(shù)語“基本相同”意思是多肽包含至少66%或更多相同氨基酸的序列。多肽序列基本相同的另一個(gè)指征是一種肽是否與針對(duì)所公開的肽產(chǎn)生的抗體有免疫學(xué)反應(yīng)性。因此，本發(fā)明的肽包括與針對(duì)所公開的免疫原性肽所產(chǎn)生的抗體有免疫學(xué)反應(yīng)性的肽和其它化學(xué)物質(zhì)。這里使用的術(shù)語“能夠結(jié)合”指兩個(gè)或多個(gè)分子在其中所述兩個(gè)或多個(gè)分子能夠形成復(fù)合體、例如蛋白質(zhì)-配基復(fù)合體的條件下相互結(jié)合而形成復(fù)合體，例如，配基與蛋白或肽的結(jié)合。結(jié)合的特定氨基酸序列的配基這里所描述的朊病毒結(jié)合配基都是小分子，優(yōu)選肽。配基結(jié)合來源于朊病毒蛋白的肽、多肽，或者整個(gè)朊病毒分子。如在這里使用的，術(shù)語“肽”沒有暗示特定的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，這里所描述的配基結(jié)合具有下列氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)的朊病毒蛋白R(shí)YPxQ (SEQ ID NO :221)，其中 χ 是 G，P 或 NXxYYux (SEQ ID NO :222)，其中 χ 是任何氨基酸，u 是 R 或 Q更優(yōu)選地，配基結(jié)合具有下列氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)的朊病毒蛋白R(shí)YPGQ (SEQ ID NO 1)
DRYYRD(SEQ ID NO 2)QAYYQR(SEQ ID NO 3)QVYYRP (SEQ ID NO 4)當(dāng)用于探測(cè)組合文庫以篩選結(jié)合朊病毒的配基時(shí)，具有上面提供的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的標(biāo)記肽是有用的。優(yōu)選地，當(dāng)用于篩選文庫以尋找朊病毒配基時(shí)，將肽在氨基末端放射標(biāo)記和乙?；隰然┒缩０坊?。這里所描述的配基的氨基酸序列缺少在W001/77687中公開的氨基酸序列，其結(jié)合朊病毒蛋白的八肽重復(fù)序列。在第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，配基是具有可結(jié)合SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白或肽。在下面表1中所示的氨基酸序列(SEQ IDNO 5-13)是可結(jié)合SEQ ID NO 1的氨基酸序列的實(shí)例。因此，在第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案的配基中包括了具有下表1所示序列中的一個(gè)或多個(gè)序列的配基。在6聚體文庫中篩選可結(jié)合SEQ ID NO :1的6聚體，鑒定出了表 1中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作為樹脂和文庫的組合肽之間的間隔子來構(gòu)建文庫， 在表1包括的序列中表示為最后的A。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解這里提供的配基不限于具有表1所示示范性序列的那些配基。表 1結(jié)合SEQ ID NO :1的6氨基酸序列
SEQ ID NO序列5KIHKFLA6GTHDFQA7KFGSTHA8FVNEIEA9GLHFKSA10GRVLHHA11QKNSEWA12HAYFTHA13WPKGAVA在第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，配基是具有可結(jié)合SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表2中所示的氨基酸序列(SEQ IDNOS :14-22)是結(jié)合SEQ ID NOS 2的氨基酸序列的實(shí)例。因此，在第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案的配基中包括了具有在表2所示序列中的一個(gè)或多個(gè)序列的配基。在6聚體文庫中篩選可結(jié)合SEQ ID NO :2的6聚體，鑒定出了表2所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作為樹脂和文庫的組合肽之間的間隔子來構(gòu)建文庫，在序列中表示為最后的A。賴氨酸⑷出現(xiàn)11次，組氨酸(H)出現(xiàn)7次，二者都高于分布平均值-3。因此，優(yōu)選含有賴氨酸(K)或組氨酸(H)的6聚體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解這里所提供的配基不限于具有表2所示示范性序列的那些配基。表2可結(jié)合SEQ ID NO 2的6_氨基酸序列
權(quán)利要求
1.一種朊病毒結(jié)合配基，其中所述配基是由SEQ ID NO :63的氨基酸序列組成的肽。
2.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合朊病毒蛋白的天然形式(PrPc)和/或朊病毒蛋白的構(gòu)象改變形式(PrPsc)。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的配基，其中所述配基具有小于6kDa的分子量。
4.一種從樣品中除去朊病毒蛋白的方法，包括在足以導(dǎo)致在朊病毒蛋白和配基之間形成復(fù)合體的條件下，將樣品與配基相接觸，其中所述配基是能夠結(jié)合朊病毒蛋白的具有SEQ ID NO 63的氨基酸序列的肽；以及從樣品中除去復(fù)合體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述配基具有小于6kDa的分子量。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述樣品是生物學(xué)樣品。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自血液、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板濃縮物、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導(dǎo)管流體、眼淚、精液、糞便、扁桃體、淋巴結(jié)、膠原、腦提取物和腺體提取物。
8.權(quán)利要求4的方法，其中在與樣品接觸前將配基附著到固體支持物上。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述固體支持物選自膜和樹脂。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述固體支持物是選自聚甲基丙烯酸酯、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖、復(fù)合交聯(lián)多糖、硅藻土、聚乙烯基D、丙烯酸酯氟化物、聚苯乙烯和纖維素中的樹脂。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述固體支持物是聚甲基丙烯酸酯樹脂。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述固體支持物是選自尼龍和纖維素的材料的膜。
13.用于結(jié)合朊病毒蛋白的組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的配基；以及固體支持物，其中所述配基附著到所述固體支持物上。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述固體支持物選自膜和樹脂。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)合朊病毒蛋白的配基以及使用該配基檢測(cè)或除去樣品、如生物學(xué)流體或環(huán)境樣品中朊病毒蛋白的方法。配基能夠結(jié)合一種或多種形式的朊病毒蛋白，包括細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPc)，感染性朊病毒蛋白(PrPsc)，和重組朊病毒蛋白(PrPr)。配基結(jié)合各種物種、包括人和倉鼠的朊病毒。也提供了一種治療受試者中朊病毒相關(guān)病理或延緩其進(jìn)展的方法。
文檔編號(hào)C07K5/087GK102241741SQ20111011324
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者D·J·哈蒙德, J·T·萊斯羅普, L·切爾維納科娃, R·G·卡博內(nèi)爾 申請(qǐng)人:北卡羅來納州大學(xué), 病原體切除與診斷科技公司