專利名稱：用作層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑的低分子量肽衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是能起層粘連蛋白與巢蛋白之間相互作用(層粘連蛋白/巢蛋白相互作用)抑制劑作用的低分子量肽衍生物，其制備方法，由其制備的藥物組合物，以及所述肽衍生物在制備藥物和鑒定層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑中的應(yīng)用。
層粘連蛋白(一種800kDa糖蛋白)與巢蛋白(一種160kDa糖蛋白)之間的相互作用被認(rèn)為是基底膜合成與穩(wěn)定中的決定性生物分子機(jī)制(Mayer，U.和Timpl，R.(1994)分子外基質(zhì)裝配和結(jié)構(gòu)(Extracellular Matrix Assembly and Structure)(P.D.Yurchenco，D.Birk and R.P.Mecham，Ed.)S.389-416，Academic Press，Orlando，F(xiàn)L)。巢蛋白與基底膜的所有主要成分例如含有γ1的層粘連蛋白同種型(關(guān)于命名參見(jiàn)Burgeson，R.E.；Chiquet，M.；Deutzmann，R.；Ekblom，P.；Engel，J.；Kleinmann，H.；Martin，G.R.；Meneguzzi，G.；Paulsson M.；Sanes，J.；Timpl，R.；Tryggvasson，K.；Yamada，Y.；Yurchenco，P.D.(1994)Matrix Biology 14；209-211)、膠原IV、基底膜聚糖和fibulin、以及它們各自的相關(guān)結(jié)構(gòu)形成三元復(fù)合物的能力意謂著其承擔(dān)著聯(lián)系、空間組織和穩(wěn)定獨(dú)立的宏觀結(jié)構(gòu)的功能(Fox，J.W.；Mayer，U.；Nischt，R.；Aumailley，M.；Reinhardt，D.；Wiedemann，H.；Mann，K.；Timpl，R.；Krieg，T.；Engel，J.；和Chu，M.-L.(1991)EMBO J.10，3137-3146)。
基底膜是高度特化的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，其在控制細(xì)胞和組織功能、組織體系結(jié)構(gòu)、組織相互作用、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞遷移以及組織特異性基因表達(dá)中行使重要功能(Adams，J.C.和Watt，F(xiàn).M.(1993)Development 117，1183-1198)。用多克隆抗層粘連蛋白抗體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已清楚地證明了層粘連蛋白/巢蛋白相互作用在功能性基底膜合成中的至關(guān)重要作用。所述抗體是通過(guò)用層粘連蛋白P1或重組制得的層粘連蛋白的巢蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(γ1 III 3-5)給兔子免疫接種而獲得的。通過(guò)使用層粘連蛋白P1或?qū)诱尺B蛋白γ1 III 3-5基質(zhì)的親和色譜濃縮的抗體在抑制測(cè)定中顯示層粘連蛋白/巢蛋白相互作用的完全抑制。然而，這是基于抗體空間阻斷巢蛋白接近層粘連蛋白，所述抗體的結(jié)合區(qū)域位于層粘連蛋白的巢蛋白結(jié)合序列附近(Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885)。
在胚胎器官培養(yǎng)物中，所述抗體既抑制腎小管的發(fā)育、肺泡的形成，又抑制胚胎唾液腺的形態(tài)形成。這三個(gè)模型是依賴新基底膜無(wú)阻合成的代表性個(gè)體發(fā)育模型(Ekblom，P.；Ekblom，M.；Fecker，L.；Klein，G.；Zhang，H.-Y.；Kadoya，Y.；Chu，M.-L.；Mayer，U.；Timpl，R.(1994)Development 120；2003-2014)。
直接抗層粘連蛋白γ1鏈序列區(qū)域(與巢蛋白結(jié)合所必需的)的抗體也能夠抑制層粘連蛋白/巢蛋白相互作用。然而，與上述抗層粘連蛋白抗體不同，該抑制是競(jìng)爭(zhēng)性的，這是因?yàn)樗鼈冎苯优c巢蛋白競(jìng)爭(zhēng)層粘連蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)(WO 98/31709)。
IgM亞類的單克隆抗體(抗層粘連蛋白P1 A6/2/4-DSM ACC2327；參見(jiàn)WO 98/31709)在體外抑制粘連蛋白/巢蛋白相互作用，IC50為30nM。象上述多克隆抗層粘連蛋白抗體一樣，其在器官培養(yǎng)物中阻止了胚胎唾液腺的形態(tài)形成。這強(qiáng)調(diào)了粘連蛋白/巢蛋白相互作用的特異性、LE-4組件的重要性、以及層粘連蛋白γ1 III 4結(jié)構(gòu)域中鑒定出的序列區(qū)域在該相互作用中的重要性。
已經(jīng)對(duì)層粘連蛋白的巢蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了清楚的鑒定，并且在其位置、序列及其空間結(jié)構(gòu)方面作了特征描繪(X-射線晶體結(jié)構(gòu)和NMR結(jié)構(gòu))(Gerl，M.；Mann，K.；Aumailley，M.；Timpl，R.(1991)Eur.J.Biochem.202；167-174.Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBOJ.12；1879-1885.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668.Stetefeld，J.；Mayer，U.；Timpl，R.；Huber，R.(1996)J.Mol.Biol.257；644-657)。其位于結(jié)構(gòu)域γ1 III 4中層粘連蛋白γ1鏈短臂的″LE組件″(層粘連蛋白型表皮生長(zhǎng)因子樣)內(nèi)?！錖E組件″是具有類似于EGF的復(fù)雜折疊模式的50-60氨基酸結(jié)構(gòu)基元，其具有4個(gè)二硫鍵連接(Bairoch，A.；(1995)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域命名(Nomenclature ofextracellular domains).The SWISS-PROT Protein sequencedata bank.release 310.Engel，J.(1989)FEBS Letters 251；1-7)。
已經(jīng)用得自小鼠EHS腫瘤的層粘連蛋白P1、得自人胎盤的層粘連蛋白2和層粘連蛋白4、以及得自果蠅的層粘連蛋白測(cè)定了巢蛋白對(duì)互補(bǔ)層粘連蛋白結(jié)構(gòu)域的高親和力。該種屬重疊結(jié)合特異性的原因是，對(duì)于所研究的種屬，在γ1 III4結(jié)構(gòu)域中存在非常高的序列同源性。當(dāng)考慮整個(gè)結(jié)構(gòu)域時(shí)，在人和小鼠之間存在97％同源性，在小鼠和果蠅之間存在61％同源性，在小鼠和Caenorhabditis elegans之間存在51％同源性(Pikkarinen，T.；Kallunki，T.；Tryggvasson，K.(1987)J.Biol.Chem.263；6751-6758.Chi，H.-C.；Hui，C.-F.(1989)J.Biol.Chem.264；1543-1550.Wilson，R.等人.(1994)Nature 36832-38.Pschl，E.；Mayer，U.；Stetefeld，J.；Baumgartner，R.；Holak，T.A.；Huber，R.；Timpl，R.(1996)EMBO J.155154-5159)。
除了對(duì)結(jié)合在完整三維結(jié)構(gòu)上的巢蛋白的依賴性以外，還鑒定了位于結(jié)構(gòu)域γ1 III 4的S-S穩(wěn)定環(huán)a和c中的明確序列區(qū)域。已鑒定出了5個(gè)必需氨基酸，其中4個(gè)位于環(huán)a的7氨基酸部分中，另一個(gè)是在環(huán)c中的酪氨酸側(cè)鏈(Mann，K.；Deutzmann，R.；Timpl，R.(1988)Eur.J.Biochem.178；71-80)。
J.W.Fox和R.Timpl(US 5,493,008)公開(kāi)了可衍生自γ1 III 4結(jié)構(gòu)域的適當(dāng)區(qū)域、并且在特異性結(jié)合測(cè)定中完全抑制層粘連蛋白/巢蛋白結(jié)合的合成肽。
據(jù)信，對(duì)巢蛋白的層粘連蛋白結(jié)合位點(diǎn)的高親和力結(jié)合需要與實(shí)際結(jié)合序列鄰近的環(huán)(環(huán)c)中的酪氨酸或組氨酸的相互作用。據(jù)假定該芳族相互作用是下述抑制作用和結(jié)果的先決條件即基于層粘連蛋白γ1 III 3-5的3D結(jié)構(gòu)IC50＜500nM的抑制作用，和在US專利5,493,008中描述的結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系結(jié)果。然而，對(duì)于環(huán)c是否與巢蛋白直接相互作用，或者其是否有助于穩(wěn)定NIDPNAV序列區(qū)域的適當(dāng)空間結(jié)構(gòu)的疑問(wèn)仍然不清楚(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668.Stetefeld，J.；Mayer，U.；Timpl，R.；Huber，R.(1996)J.Mol.Biol.257644-657)。
層粘連蛋白/巢蛋白相互作用受強(qiáng)構(gòu)象成分的影響(Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885.Mann，K.；Deutzmann，R.；Timpl，R.(1988)Eur.J.Biochem.178；71-80)?？裳苌詫诱尺B蛋白的巢蛋白結(jié)合位點(diǎn)的合成肽不能形成如在LE組件中存在的二硫鍵合模式，但是它們?cè)谝种茰y(cè)定中顯示出比完整層粘連蛋白P1或?qū)诱尺B蛋白γ1 III 3-5弱約400-10,000倍的活性(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.J.W.Fox和R.Timpl；US5,493,008)。這種活性降低是不尋常的，因?yàn)橐阎脑谒芤褐锌沙尸F(xiàn)無(wú)數(shù)種不同構(gòu)象，并且發(fā)現(xiàn)只有一定百分比的肽呈生物活性構(gòu)象。迄今為止所描述的最有活性的肽(IC50為22nM)具有約2700Da的分子量(＝LE組件的約50％)。其包含完整的S-S環(huán)，據(jù)假定該環(huán)穩(wěn)定必需的NIDPNAV序列區(qū)域的結(jié)構(gòu)(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.J.W.Fox and R.Timpl；US 5,493,008)。
序列NIDPNAV(Asn-Ile-Asp-Pro-Asn-Ala-Val)的化學(xué)式如下所示 層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑適于制備用于治療與基底膜的增加或不良合成有關(guān)的疾病的藥物。
這樣的疾病是例如伴有基底膜增厚(尤其是在腎、眼睛、血管系統(tǒng)中)的所有類型的糖尿病晚期并發(fā)癥，特征是竇狀隙中持續(xù)基底膜合成的肝臟纖維變性、尤其是酒精中毒性肝臟纖維變性和由其引起的毛細(xì)管化，其中可觀察到基底膜或基底膜成分合成增加的所有纖維組織形成(慢性或醫(yī)原性)(腎、肺、皮膚)，特征是脂質(zhì)代謝的調(diào)控受限制的動(dòng)脈粥樣硬化，這可能特別是由于經(jīng)由部分毛細(xì)管化的肝臟竇狀隙引起的脂蛋白受損滲入引起的(可在動(dòng)脈粥樣硬化中觀察到的該血管系統(tǒng)病變還可能部分由于血管基底膜的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致)，其中血管生成導(dǎo)致臨床圖像變質(zhì)的疾病，例如其中腫瘤生長(zhǎng)需要新血管生成的癌癥，糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織形成、具有強(qiáng)炎性成分的疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性脈管炎)、血管瘤、牛皮癬、以及其它疾病。
然而，象在US 5,493,008中描述的，肽作為藥物的應(yīng)用非常有限，因?yàn)樗鼈兙哂袠?gòu)象柔性、對(duì)蛋白酶不穩(wěn)定、并且生物利用度和藥效學(xué)特性不佳(Milner-White，E.J.(1989)Trends Pharmacol.Sci.10；70-74.Verber，D.F.；Freidinger，R.M.；(1985)Trends Neurosci.8；392-396.Hruby，V.J.(1994)inPeptides，Proc.Thirteenth American Peptide Symposium；(Hodges，R.S.；Smith，J.A.；Ed.)S.3-17；ESCOMLeiden，Netherlands)。
因此，本申請(qǐng)的目的是發(fā)現(xiàn)低分子量肽衍生物，它們能特異性地與巢蛋白的層粘連蛋白結(jié)合位點(diǎn)相互作用，并以低濃度競(jìng)爭(zhēng)性地抑制層粘連蛋白與巢蛋白的結(jié)合。
因此，本發(fā)明的目的是式I化合物 其中R1是其中一個(gè)下式所示基團(tuán) 或 或或 或 或 或或 其中R4表示-A、-NH2、-NHR、-NR2、A2、-NHR1、
或 或 且R5表示-(CH2)lCOOA、-(CH2)lCONH2、-(CH2)lNH2或-(CH2)l-SO3H、 或 且X是其中一個(gè)下式所示基團(tuán) 或 或 或 或 或 或 或 其中Y表示O、S、-N(A)-CO-或-(CH2)r-，D表示(CH2)r、O、S、NH、NR、(CH2)r-O、(CH2)r-S、(CH2)r-NH或(CH2)rNR，且
R2表示-A、-E-OH、-E-COOH或-E-CONH2，其中E表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基鏈，該烷基鏈未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，或者E表示C5-C10-環(huán)烷基，該環(huán)烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，且R3是其中一個(gè)下式所示基團(tuán) 或 或 其中R6表示-H、-COOH、-CONH2、-CONHR、-CONR2、-CH2OH或 或 或 其中R7表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基，該烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，或者R7表示C5-C10-環(huán)烷基，該環(huán)烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，且R表示直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環(huán)烷基、Het或Ar，所述基團(tuán)可任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素、C1-C6-烷氧基、直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環(huán)烷基或-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代，其中Het表示單環(huán)或二環(huán)5元-10元芳族或非芳族環(huán)，該環(huán)包含1或2個(gè)相同或不同的選自氮、氧和硫的雜原子作為所述環(huán)的成員，并且未取代或者被一個(gè)或多個(gè)羥基或羧基取代，Ar表示單環(huán)或二環(huán)5元-10元芳環(huán)，該環(huán)未取代或者被一個(gè)或多個(gè)羥基或羧基取代，Z表示(CH2)m、O、S、NH、NR、N-C(O)-R或NSO2R，A表示H或C1-C4-烷基，l、m和r是0-3的整數(shù)，n和k是1-2的整數(shù)，p是0-1的整數(shù)，q是1-3的整數(shù)，其中所述化合物是所有其立體異構(gòu)體和所有比例的立體異構(gòu)體混合物，并包括它們的所有生理可耐受鹽。
生理可耐受鹽是例如無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸的鹽，例如鹽酸、硫酸、乙酸、檸檬酸、或?qū)妆交撬岬柠}，或無(wú)機(jī)堿和有機(jī)堿的鹽，例如NH4OH、NaOH、KOH、Ca(OH)2、Mg(OH)2、二乙醇胺或乙二胺的鹽，或氨基酸的鹽，例如精氨酸、賴氨酸、賴氨酰賴氨酸或谷氨酸的鹽。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是其中n為1的式I化合物。
進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示Het或Ar，所述Het或Ar可任選被-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代?；鶊F(tuán)X中的R更優(yōu)選為Het。例如，Het表示
或 或 或 或 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案還是這樣的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示Ar，所述Ar可任選被-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Ar或Ar取代。基團(tuán)X中的R優(yōu)選表示Ar。
例如Ar表示
或 或 或 優(yōu)選的實(shí)施方案還是這樣的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示 或 在式I化合物中，X優(yōu)選為下式所示基團(tuán)
Y優(yōu)選為-(CH2)r，其中r優(yōu)選為0或1，且k優(yōu)選為1或2。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中基團(tuán)X是下式所示基團(tuán) 其中D優(yōu)選為-(CH2)r-，其中r優(yōu)選為0或1。
還優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R是下式所示基團(tuán) 其中Z優(yōu)選表示(CH2)m，且m是0或1。R5優(yōu)選表示-(CH2)l-COOA，其中A優(yōu)選表示H，或者R5表示-(CH2)l-COONH2，其中l(wèi)是0。R4優(yōu)選表示-NH2或-A，其中A優(yōu)選表示H，或者R4優(yōu)選表示-NHR1，其中-NHR1優(yōu)選表示
且其中-NHR1的R5優(yōu)選表示 且l優(yōu)選為0，或者-NHR1的R5優(yōu)選表示 且l優(yōu)選為0，或者-NHR1的R5優(yōu)選表示(CH2)l-NH2，且l優(yōu)選為0。
進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R1是下式所示基團(tuán) 其中Z優(yōu)選表示-(CH2)m-，且m優(yōu)選為1，R4優(yōu)選表示-NH2，且R5優(yōu)選表示-(CH2)l-COOA，其中l(wèi)優(yōu)選為0，且其中A優(yōu)選表示H。
進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R1是下式所示基團(tuán) 其中R5優(yōu)選表示-(CH2)l-COOA，其中l(wèi)優(yōu)選為0，且其中A優(yōu)選表示H。
進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R2表示A，且A優(yōu)選表示-CH3，或者其中R2表示-E-COOH，優(yōu)選為-CH2-COOH，或者其中R2表示-E-OH，優(yōu)選為-CH2-OH。
進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團(tuán) 其中k優(yōu)選為2。
進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團(tuán) 進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團(tuán) 其中R7優(yōu)選為支鏈C1-C10-烷基，優(yōu)選為-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-CH(CH3)CH2-CH3或-CH2-CH(CH3)2，且其中R6優(yōu)選表示-H、-COOH、-CONH2、-CH2OH、-CON(CH3)2，或者R更優(yōu)選表示 其中q優(yōu)選為2。
進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團(tuán)表示
其中R7優(yōu)選-CH(CH(CH3)2)2或-CH2C(CH3)3。
本發(fā)明化合物是非天然(即不是天然生成的)、低分子量肽衍生物，其能在nM濃度范圍內(nèi)抑制層粘連蛋白/巢蛋白相互作用。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些低分子量結(jié)構(gòu)能以高親和力結(jié)合到巢蛋白的層粘連蛋白結(jié)合位點(diǎn)上，同時(shí)不需要與實(shí)際結(jié)合序列鄰近的環(huán)(環(huán)c)中的酪氨酸或組氨酸相互作用。
更令人驚奇的是，在本發(fā)明中描述的分子量為550-800Da的低分子量肽衍生物表現(xiàn)出與下述迄今為止所描述的最有活性的肽(IC50為22nM)相同數(shù)量級(jí)的抑制作用具有約2700Da的分子量(＝LE組件的約50％)，包含完整的S-S環(huán)，據(jù)假定該環(huán)穩(wěn)定必需NIDPNAV序列區(qū)域的結(jié)構(gòu)(J.W.Fox and R.Timpl；US 5,493,008)。
根據(jù)巢蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系和公開(kāi)的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)在樹(shù)脂載體上特定合成肽衍生物實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明目的。用于肽合成的構(gòu)件隨合適標(biāo)準(zhǔn)而變，以保證非天然構(gòu)件的廣泛結(jié)構(gòu)多樣性和集成。使用合適的靈敏篩選測(cè)定來(lái)測(cè)定和比較從樹(shù)脂載體上分離下來(lái)的所得肽衍生物的抑制活性。
本發(fā)明化合物可用于制備用于治療與基底膜的增加或不良合成有關(guān)的疾病的藥物。
因此，本發(fā)明肽衍生物和/或其生理可耐受鹽的可能治療應(yīng)用領(lǐng)域是1.伴有基底膜增厚(尤其是在腎、眼睛、血管系統(tǒng)中)的所有類型的糖尿病晚期并發(fā)癥。
2.特征是竇狀隙中持續(xù)基底膜合成的肝臟纖維變性，尤其是酒精中毒性肝臟纖維變性，和由其引起的毛細(xì)管化。
3.其中可觀察到基底膜或基底膜成分合成增加的所有纖維組織形成(慢性或醫(yī)原性)(腎、肺、皮膚)。
4.特征是脂質(zhì)代謝的調(diào)控受限制的動(dòng)脈粥樣硬化，這可能特別是由于經(jīng)由部分毛細(xì)管化的肝臟竇狀隙引起的脂蛋白受損滲入引起的?？稍趧?dòng)脈粥樣硬化中觀察到的該血管系統(tǒng)病變還可能部分由于血管基底膜的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致。
5.其中血管生成導(dǎo)致臨床圖像變質(zhì)的疾病，例如其中腫瘤生長(zhǎng)需要新血管生成的癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織形成、具有強(qiáng)炎性成分的疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性脈管炎)、血管瘤、牛皮癬、以及其它疾病。
因此，本發(fā)明化合物和/或其生理可耐受鹽適于用作藥物。所以本發(fā)明的進(jìn)一步目的是含有至少一種本發(fā)明肽衍生物和/或其生理可耐受鹽的藥物組合物。
可依據(jù)本發(fā)明將式I化合物和/或其生理可耐受鹽可作為治療或預(yù)防藥物施用給動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物，特別是人。它們可以以自身的形式給藥，在彼此混合物中給藥，或者以經(jīng)腸或非胃腸道給藥用藥物制劑的形式給藥，所述制劑包含有效劑量的至少一種式I化合物和/或其生理可耐受鹽以及衍生物作為活性成分和常規(guī)可藥用無(wú)毒賦形劑和/或添加劑。
藥物可系統(tǒng)或局部施用。藥物可以以例如丸劑、片劑、膜包衣片劑、糖包衣片劑、粒劑、硬和軟明膠膠囊劑、粉劑、溶液、糖漿劑、乳劑、懸浮劑或其它藥物劑型的形式給藥。然而，給藥還可以經(jīng)陰道或直腸進(jìn)行，例如以栓劑的形式陰道或直腸給藥，或者以例如注射液或輸液、微膠囊或貯藥柱的形式非胃腸道給藥或植入給藥，或者以例如軟膏劑、溶液或酊劑的形式局部給藥或經(jīng)皮給藥，或者以其它途徑給藥，例如以鼻用噴霧劑或氣霧劑混合物的形式給藥，或作為可吸入干粉制劑給藥。如果溶液是非胃腸道給藥的，它們可通過(guò)例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)或其它方式例如吸入濕氣霧劑或干粉制劑給藥。
本發(fā)明藥物制劑可按照其自身已知的方法制備，除了式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物以外，還可以使用藥物惰性無(wú)機(jī)和/或有機(jī)賦形劑。為了制備丸劑、片劑、糖包衣片劑和硬明膠膠囊，可使用例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其鹽等。軟明膠膠囊劑和栓劑的賦形劑有例如脂肪、蠟、半固體和液體多元醇、聚乙二醇，天然或硬化油等。為了制備溶液例如注射液、或乳劑或糖漿劑，合適的賦形劑是例如水、醇、甘油、二醇、多元醇、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖、植物油等。對(duì)于微膠囊、植入物或貯藥柱，合適的賦形劑是例如乙醇酸與乳酸的共聚物。藥物賦形劑通常含有大約0.5-90％的式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物。
除了活性化合物和賦形劑以外，本發(fā)明藥物制劑還可以含有輔料或添加劑，例如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、防腐劑、甜料、著色劑、矯味劑或香料、增稠劑、稀釋劑、緩沖物質(zhì)、溶劑或助溶劑、獲得貯藥效果的裝置、改變滲透壓的鹽、包衣劑或抗氧化劑。本發(fā)明藥物制劑還可以含有兩種或兩種以上的式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物。此外，除了至少一種式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物以外，本發(fā)明藥物制劑還可以含有其它治療或預(yù)防活性物質(zhì)。本發(fā)明藥物制劑通常每劑含有0.2-500mg、優(yōu)選1-100mg式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物。
如果式I化合物或含有它們的藥物制劑是作為氣霧劑例如鼻用氣霧劑給藥，或通過(guò)濕氣霧劑或干粉吸入給藥，可分別使用噴霧器、霧化器、泵式噴灑器、吸入裝置、計(jì)量吸入器或干粉吸入器給藥。用于將式I化合物作為氣霧劑給藥的藥物劑型可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備。對(duì)于其制備，例如在使用常規(guī)添加劑例如苯甲醇或其它合適防腐劑、提高生物利用度的吸收增強(qiáng)劑、助溶劑、分散劑等、和如果適當(dāng)?shù)脑挸Ｒ?guī)推進(jìn)劑例如氯氟烴和/或氟烴的式I化合物在水、水-醇混合物或適當(dāng)鹽水溶液中的溶液或分散液是合適的，而式I化合物和/或其生理可耐受鹽的干粉制劑可通過(guò)將式I化合物和/或其生理可耐受鹽與合適水溶性添加劑例如糖或糖衍生物和氨基酸的水溶液冷凍干燥或優(yōu)選噴霧干燥而制得。
當(dāng)使用式I化合物時(shí)，劑量可在寬的限度內(nèi)變化，并且如醫(yī)師所知道的那樣，通常在每一個(gè)體病例中對(duì)于具體病癥使用特定劑量。劑量取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、所用的化合物、或者所治療或預(yù)防的是急性還是慢性疾病、或者除了式I化合物以外是否還施用其它活性化合物。通常，對(duì)于口服給藥，為了獲得有效結(jié)果，在成人中約0.01-100mg/kg、優(yōu)選0.1-10mg/kg、特別是0.3 to 2mg/kg(每kg體重)的日劑量是適當(dāng)?shù)?。?duì)于靜脈內(nèi)給藥，日劑量為約0.01-50mg/kg、優(yōu)選0.01-10mg/kg體重。特別是當(dāng)使用較大劑量時(shí)，日劑量可分多次，例如2、3或4次施用。如果適當(dāng)?shù)脑?，根?jù)個(gè)體特性，可能需要超出所指出日劑量范圍的上限和下限。
此外，本發(fā)明式I化合物及其鹽可用作制備可由式I化合物制得的其它化合物、特別是其它藥物活性化合物的中間體，例如，所述其它化合物可通過(guò)例如將官能團(tuán)酯化、還原、氧化或其它轉(zhuǎn)化，修改或引入基團(tuán)或功能基，由式I化合物制得。
因此，一方面，本發(fā)明肽衍生物可直接用作治療劑，但是它們也可形成適于用作治療與基底膜的增加或不良合成有關(guān)的疾病的治療劑的相關(guān)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一目的是鑒定抑制層粘連蛋白與巢蛋白相互作用的化合物的方法，其中使用本發(fā)明化合物作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。該方法還包括以可藥用形式鑒定的化合物的制劑。
本發(fā)明的目的還是，提供制備包含經(jīng)鑒定能抑制層粘連蛋白與巢蛋白相互作用的化合物的藥物組合物的方法，其中使用本發(fā)明化合物作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，并將所鑒定的化合物和/或其生理可耐受鹽與可藥用載體混合。
本發(fā)明的目的還是提供制備本發(fā)明式I化合物的方法。
本發(fā)明式I化合物
是通過(guò)將式II化合物 與III化合物進(jìn)行片段縮合而制得的 其中變量R1、X、n、R2和R3具有上述含義，并且可通過(guò)肽化學(xué)中的已知常用保護(hù)基將式II和III化合物在如上所定義的官能團(tuán)上保護(hù)(參見(jiàn)例如Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie，vol.15/1和15/2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。合適的縮合方法是本領(lǐng)域眾所周知的(Houben-Weyl，Methoden der OrganischenChemie，Vol.15/1和15/2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。合適的縮合劑或偶合劑有例如羰基二咪唑、碳二亞胺例如二環(huán)己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺、或O-((氰基(乙氧基羰基)亞甲基)氨基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸鹽(TOTU)或焦磷酸酐(PPA)。該縮合反應(yīng)可在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。在肽縮合期間，通常用易于在不同于偶合條件的條件下除去的保護(hù)基將不打算參與偶合反應(yīng)的氨基保護(hù)。這同樣適用于不打算參與偶合反應(yīng)的羧基，優(yōu)選在偶合反應(yīng)期間將羧基作為C1-C6-烷基酯、芐基酯或叔丁基酯保護(hù)。對(duì)于仍然以氨基前體例如硝基或氰基形式存在的氨基，無(wú)需將該氨基保護(hù)。縮合反應(yīng)后，通過(guò)水合步驟形成氨基?？s合步驟后，通過(guò)已知的合適方法除去保護(hù)基，例如芐氧基羰基和芐基可通過(guò)在芐基酯中水合來(lái)除去；叔丁基酯的保護(hù)基一般是在酸性條件下除去；9-芴基甲氧基羰基殘基是通過(guò)仲胺除去。
本發(fā)明式I化合物的制備還可以通過(guò)各成分例如天然、非天然氨基酸及其衍生物在固相上的分步加成來(lái)進(jìn)行，這樣各成分可以以多種不同順序加上。
為了制備式I化合物，還有利的是，不通過(guò)片段縮合將式I和II化合物直接偶合，而是偶合它們各自適當(dāng)?shù)那绑w，以獲得可通過(guò)例如衍生化轉(zhuǎn)化成式I化合物的中間體。
不是直接，而是通過(guò)其各自前體將官能團(tuán)引入到分子中，以獲得可易于在縮合反應(yīng)后通過(guò)將前體基團(tuán)轉(zhuǎn)化成各自的官能團(tuán)來(lái)制得終產(chǎn)物的中間體的上述方法也可用于制備式I化合物分子的不同部分，例如式I化合物的R1-或R1-X-側(cè)鏈。
實(shí)施例縮寫具有下述含義試劑和溶劑AcOH 乙酸aq 含水BSA牛血清白蛋白DCCN，N’-二環(huán)己基碳二亞胺DCM二氯甲烷DIPEA N，N-二異丙基乙胺DMAP 4-二甲基氨基吡啶DMFN，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲亞砜Et2O 乙醚
EtOAc 醋酸乙酯(乙酸乙酯)EtOH醇Fmoc-OSucc Fmoc-O-琥珀酰亞胺HOBT1-羥基苯并三唑KHMDS 六甲基二硅氮烷基鉀n-Buli 正丁基鋰MeOH甲醇MTBE甲基叔丁基醚TEA 三乙胺TFA 三氟乙酸THF 氫呋喃TMEDA 甲基乙二胺TMSCI 三甲基甲硅烷基氯TOTUO-((氰基(乙氧基羰基)亞甲基)氨基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸鹽TrisN3三甲硅烷基疊氮化物化學(xué)基團(tuán)Me 甲基 CH3-Et 乙基 CH3-CH2-nPr 正-丙基CH3CH2CH2-iPr 異丙基 (CH3)2CH-nBu 正丁基 CH3CH2CH2CH2-iBu 異丁基 (CH3)2CHCH2-tBu 叔丁基 (CH3)3C-Ph 苯基 C6H5-Fmoc9-芴基甲氧基羰基Z 芐氧基羰基 C6H5-CH2-O-CO-BOC 叔丁氧基羰基 (CH3)3C-O-CO-
1.篩選層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑的庫(kù)設(shè)計(jì)庫(kù)來(lái)找到更小的、效力更強(qiáng)的、且代謝更穩(wěn)定的與現(xiàn)有技術(shù)已知的庚肽NIDPNAV有關(guān)的肽(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.Pschl，E.；Mayer，U.；Stetefeld，J.；Baumgartner，R.；Holak，T.A.；Huber，R.；Timpl，R.(1996)EMBO J.155154-5159.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668)。將庫(kù)作為三個(gè)子庫(kù)來(lái)合成和篩選；五聚物、六聚物和七聚物。下面描述五聚物子庫(kù)的篩選策略。該方法代表了篩選其它兩個(gè)子庫(kù)所用的方法，只是在第一個(gè)步驟中，以約50個(gè)珠子/孔篩選六聚物，以約100個(gè)珠子/孔篩選七聚物。
1.1篩選五聚物庫(kù)該五聚物庫(kù)含有2,160種不同化合物。
1)將約8,800個(gè)珠子懸浮在0.1％HCl中，并以大約14個(gè)珠子/孔分配到7個(gè)濾底96孔微量滴定板內(nèi)。
2)將珠子用200μl去離子水洗滌2次，然后加入50μl 500mMHEPES，pH 7.0。當(dāng)pH增加至7.0時(shí)，在該庫(kù)中使用的接頭釋放1等分試樣的化合物，過(guò)夜進(jìn)行該分裂步驟。
3)將平板堆積在U-底濾板的頂部并離心。從珠子上釋放下來(lái)的化合物的混合物收集在底部板上，而相應(yīng)的珠子保留在最初的濾板中。
4)每孔中向珠子加入25μl DMSO以將剩余化合物從珠子上洗下來(lái)，并將平板再次離心以將溶液中的化合物與珠子分離開(kāi)。所得貯備液大概在333mM HEPES，33％DMSO中含有27μM化合物。
5)將化合物貯備液與巢蛋白一起預(yù)培養(yǎng)(10μl化合物貯備液/90μl巢蛋白溶液)，進(jìn)行在附加方案中描述的測(cè)定，獲得2.7μM化合物的最終篩選濃度。
6)在其中可重復(fù)抑制≥62％的25個(gè)測(cè)定孔中，將得自最初濾板的相應(yīng)珠子懸浮在0.05％HCl，0.1％吐溫20中，并以1個(gè)珠子/孔吸移到5個(gè)新的濾板中。向每個(gè)板中加入兩個(gè)在相同接頭上有母化合物的對(duì)照珠子以用作對(duì)照。
7)將珠子用200μl去離子水洗滌2次，然后向每個(gè)孔中加入25μl50mM NaOH。當(dāng)pH從7.0增加至10.0或更高時(shí)，在該庫(kù)中使用的接頭釋放第二份等摩爾等分試樣的化合物，該分裂步驟進(jìn)行3小時(shí)。
8)將平板堆積在U-底濾板的頂部并離心。從珠子上釋放下來(lái)的化合物的混合物收集在底部板上，而相應(yīng)的珠子保留在最初的濾板中。
9)將珠子用20μl加入50mM HCl的50mM HEPES(最初pH 7.0)洗滌，將該溶液離心到下層板中，并與第一次的釋放物合并。
10)將珠子用25μl DMSO進(jìn)行第3次洗滌，其中是將DMSO與珠子平衡10分鐘，然后離心。
11)如步驟#5所述，以1/10的體積測(cè)定所得釋放物。
12)抑制作用與對(duì)照珠子(約50％抑制)一樣好或者更好的溶液認(rèn)為是hit。收集到了23個(gè)hit珠子，其它2個(gè)潛在的hit孔可通過(guò)在單個(gè)孔中添加的弱抑制劑來(lái)解釋。
13)將Hit溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，以測(cè)定分子量。
14)將相應(yīng)的各hit珠子進(jìn)行Edman降解以測(cè)定肽序列。
15)分析合并的MS和Edman數(shù)據(jù)以鑒定hit化合物結(jié)構(gòu)。
其結(jié)構(gòu)和回收頻率如下所示。G-Hopa＝甘氨酸羥基丙基酰胺，剩余接頭頻率IC50，μM6D Nal2 NDVG-Hopa0.434D Nal2 NAVG-Hopa0.374D Nal2 NDIG-Hopa0.644D Nal2 NSVG-Hopa0.493D Nal2 NSIG-Hopa0.812D Nal2 NAIG-Hopa0.47
圖例文字Nal2＝L-3-(2-萘基)丙氨?；?G-Hopa＝甘氨酸-3-羥基丙基酰胺 D＝Asp(天冬氨?；?，P＝Pro(脯氨?；?，N＝Asn(天冬酰胺?；?，A＝Ala(丙氨?；?，V＝Val(纈氨?；?，S＝Ser(絲氨?；?，I＝Ile(異亮氨?；?。
1.2方法制備肽庫(kù)使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽Fmoc化學(xué)(Stewart，J.M.，and Young，J.D.(1984)Solid Phase Peptide Synthesis.Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.；Atherton，E.，and Sheppard，R.C.(1989)Solid Phase Peptide Synthesis.IRL Press Oxford)，通過(guò)分裂/混合合成方法合成肽庫(kù)(Lam，K.S.，Salmon，S.E.，Hersh，E.M.，Hruby，V.J.，Kazmierski，W.M.，and Knapp，R.J.(1991)Nature 354，82；Furka，A.，Sebestyen，F(xiàn).，Asgedom，M.，andDibo，G.(1991)Int.J.Pept.Protein Res.37，487)。在每一偶合循環(huán)中，將每個(gè)樹(shù)脂珠子僅暴露于一種活化的氨基酸。因此，在庫(kù)合成完成時(shí)，每個(gè)樹(shù)脂珠子僅表達(dá)一個(gè)肽實(shí)體。因?yàn)椴荒軉为?dú)測(cè)定所有化合物，我們通過(guò)差別可分裂接頭在每個(gè)樹(shù)脂珠子上以一式兩份構(gòu)建相同結(jié)構(gòu)，fig.1(Kocis，P.，Krchnak，V.，和Lebl，M.(1993)Tetr.Lett.34，7251；Lebl，M.，Krchnak，V.，Salmon，S.E.，和Lam，K.S.(1994)A Companion to Methods inEnzymolog 6，381)。然后可用不同分裂機(jī)制在順序步驟中將肽從樹(shù)脂珠子上釋放下來(lái)。在pH 7-9的緩沖液中將第一部分肽作為羥基丙基酰胺釋放下來(lái)。使用更高pH將第二部分肽釋放下來(lái)(合成方案1)。
在肽庫(kù)中，使用聚乙二醇接枝的聚苯乙烯珠子或TentaGelSNH2。實(shí)際上，在含水條件下與肽合成和篩選相容的所有樹(shù)脂珠子都是適用的。
用一個(gè)固定位置(L-天冬酰胺)制備五聚物、六聚物、和七聚物庫(kù)。在C-末端上的甘氨酸羥基丙基酰胺是接頭的一部分。
H-X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(2,160個(gè)肽)H-X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(25,920個(gè)肽)H-X6X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(311,040個(gè)肽)X1在第一個(gè)隨機(jī)化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(9)纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、β(2-萘基)丙氨酸、2-氮雜環(huán)丁烷甲酸、脯氨酸、環(huán)己基甘氨酸、苯基甘氨酸。
X2在第二個(gè)隨機(jī)化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(4)丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸。
X3＝X5＝X6在第三、五和六個(gè)隨機(jī)化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(12)2-哌啶酸、β(2-萘基)丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、2-氮雜環(huán)丁烷甲酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸、3，5-二碘酪氨酸、瓜氨酸、精氨酸。
X4在第四個(gè)隨機(jī)化中使用的N-Fmoc-L-氨基酸(5)天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、O-硫酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸。
將樹(shù)脂(PEG-PS.HCl，Millipore，20g，裝載0.58mmol/g，平均粒徑220μm)在N，N-二甲基甲酰胺中膨脹2小時(shí)，然后用10％N，N-二異丙基乙胺在二氯甲烷中的溶液中和。用二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹(shù)脂。用1，3-二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑(各3eq)將接頭(Fig.1，3eq)在N，N-二甲基甲酰胺中于室溫偶合12小時(shí)。通過(guò)溴酚藍(lán)方法監(jiān)測(cè)反應(yīng)(Krchnak，V.，Vagner，J.，Safar，P.，和Lebl，M.(1988)Collec.Czech.Cem.Commun.53，2542)。通過(guò)茚三酮測(cè)試確定偶合完全(Kaiser，E.，Colescott，R.L.，Bossinger，C.D.，和Cook，P.I.(1969)Anal.Biochem.34，595)。用N，N-二甲基甲酰胺洗滌后，用50％哌啶在N，N-二甲基甲酰胺中的溶液處理15分鐘來(lái)除去Fmoc保護(hù)基。然后用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹(shù)脂，通過(guò)UV光譜測(cè)定法(302nm)定量測(cè)定所釋放的富烯-哌啶加成物的量。在整個(gè)庫(kù)合成中，以該方法測(cè)定的穩(wěn)定水平的樹(shù)脂裝載(mmol/g)用作一個(gè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
將樹(shù)脂分成9個(gè)等份。然后將9份Fmoc-保護(hù)的氨基酸(X1)獨(dú)立地加到各樹(shù)脂等分試樣中，并通過(guò)所述方法偶合2小時(shí)。然后將樹(shù)脂匯集在在底部裝配有玻璃料的圓柱形玻璃容器中。通入干燥氮?dú)庖詫?shù)脂混合。如上所述除去Fmoc保護(hù)基。
將樹(shù)脂分成4個(gè)等份。然后將4份Fmoc-保護(hù)的氨基酸(X2)獨(dú)立地加到各樹(shù)脂等分試樣中，并用相同偶合方法進(jìn)行偶合。除去Fmoc保護(hù)基，并測(cè)定樹(shù)脂裝載。在下一循環(huán)中，通過(guò)所述方法偶合L-天冬酰胺。然后將樹(shù)脂分成等分試樣以進(jìn)行另一偶合循環(huán)。所有隨機(jī)化步驟完成后，除去Fmoc，用三氟乙酸(82.5％)、茴香醚(5％)、水(5％)、茴香硫醚(5％)、乙二硫醇(2.5％)的混合物經(jīng)由2.5小時(shí)裂解掉側(cè)鏈保護(hù)基。然后用三氟乙酸、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗滌樹(shù)脂。將所得庫(kù)在4℃干燥貯存。
為了檢查庫(kù)的質(zhì)量，隨機(jī)選擇幾個(gè)珠子，通過(guò)Edman降解和質(zhì)譜技術(shù)定序。
合成方案1
1.3結(jié)果(還參見(jiàn)附圖
2-12)







2.大規(guī)模合成2.1合成N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)概述分10步制備N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)
2.1.1反式-3-(2’-萘基)-丙烯酸乙酯(A1)向2-萘甲醛(7.8g，50mmol)在50mL乙醇內(nèi)的溶液中加入(乙氧羰基亞甲基)三苯基正膦(18.3g，52.5mmol)。觀察到有輕微放熱。有沉淀形成，同時(shí)將該混合物攪拌過(guò)夜。將該反應(yīng)混合物用Et2O(500mL)稀釋，并用1M H3PO4(2×100mL)、飽和NaHCO3(1×100mL)、水(100mL)、和鹽水(100mL)洗滌。將有機(jī)部分干燥(MgSO4)，并減壓濃縮。將殘余物過(guò)SiO2塞，用9∶1己烷∶EtOAc洗脫。真空濃縮后，以接近定量的收率收集到了產(chǎn)物，為85∶15的幾何異構(gòu)體混合物(反式占優(yōu)勢(shì)，nmr)。將產(chǎn)物從己烷/EtOAc(己烷占大部分)中重結(jié)晶，收集到了4.5g所需產(chǎn)物，為97∶3的異構(gòu)體混合物(nmr)。將母液濃縮，并如前所述重結(jié)晶，又收集到了2.9g(總共7.4g，33mmol，收率65％)。NMR(CDCl3)δ7.93(s，1H)；7.88-7.83(c，4H)；7.67(dd，1H，J＝1.6，8.6Hz)；7.53-7.50(c，2H)；6.55(d，1H，J＝16.0Hz)；4.30(q，2H，J＝7.1Hz)；1.42(t，3H，J＝7.1Hz)。
2.1.2反式-3-(2’-萘基)-丙烯酸(A2)向酯A1(4.24g，18.8mmol)在THF(75mL)內(nèi)的溶液中加入在水(19mL)中的LiOH.H2O(2.36g，56.3mmol)。將開(kāi)始時(shí)呈多相的該混合物劇烈攪拌過(guò)夜，該混合物變均勻。用濃鹽酸將該反應(yīng)混合物酸化(pH約為2)，形成了沉淀。將該多相混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并用EtOAc(3×150mL)萃取。將合并的萃取液干燥(MgSO4)，并真空濃縮，收集到了該羧酸，為白色固體(3.66g，收率98％)。NMR(CDCl3)δ7.97(d，1H，J＝15.7Hz)；7.90(d，1H，J＝15.3Hz)；7.90-7.83(c，3H)；7.70(dd，1H，J＝1.6，8.6Hz)；7.57-7.50(c，2H)；6.58(d，1H，J＝16.0Hz)。
2.1.3反式-(4S)-3-(3’-(2″-萘基)-丙烯?；?-4-苯基-2-噁唑烷酮(A3)
將羧酸A2(3.66g，18.5mmol)和三乙胺(1.87g，2.56mL，18.5mmol)在無(wú)水THF(74mL)中的溶液冷卻至-78℃。用2分鐘加入新戊酰氯(2.35g，2.40mL，19.4mmol)，期間形成了白色沉淀。10分鐘后，將燒瓶置于0℃浴中放置10分鐘，然后將燒瓶再冷卻至-78℃，并保持1.5h小時(shí)。在一個(gè)單獨(dú)燒瓶中，將衍生自L-苯基甘氨醇的噁唑烷酮(3.31g，20.3mmol)在無(wú)水THF(74mL)中的溶液冷卻至-78℃。加入n-BuLi溶液(1.6M的己烷溶液，11.6mL，18.5mmol)，并繼續(xù)攪拌約1小時(shí)，從該THF/溶液中沉淀出了金屬化的噁唑烷酮。通過(guò)插管將該混合酸酐加到金屬化的噁唑烷酮中，并將該反應(yīng)混合物置于0℃浴中。1小時(shí)后，移去該浴，將該混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒈３诌^(guò)夜。用50mL飽和NH4Cl中止該反應(yīng)。將THF減壓除去，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，然后用CH2Cl2(3×75mL)萃取。將合并的有機(jī)部分用1MNaOH(2×50mL)洗滌，干燥(MgSO4)并濃縮。將殘余物從EtOAc/己烷中重結(jié)晶，收集到了白色固體(3.87g，11.2mmol，收率61％)。NMR(CDCl3)δ8.05(d，1H，J＝15.7Hz)；7.94(d，1H，J＝15.4Hz)；7.87-7.81(c，3H)；7.76(dd，1H，J＝1.5，8.6Hz)；7.53-7.47(c，2H)；7.41-7.34(c，5H)；5.58(dd，1H，J＝8.7，3.9Hz)；4.76(t，1H，J＝8.7Hz)；4.33(dd，1H，J＝8.8，3.9Hz)。
2.1.4(3’R4S)-3-(3’-(2″-萘基)-4’-戊烯酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(A4)在-78℃，向CuI(3.96g，20.9mmol)和TMEDA(2.66g，3.46mL，22.9mmol)在無(wú)水THF(92mL)內(nèi)的溶液中加入溴化乙烯基鎂(1.0M的THF溶液，20.9mL，20.9mmol)。將該混合物攪拌15分鐘。在一個(gè)單獨(dú)的燒瓶中，將三甲基甲硅烷基氯(5.69g，6.64mL，52.2mmol)加到不飽和酰亞胺A3(3.87g，11.3mmol)在無(wú)水THF(42mL)內(nèi)的溶液中。由于該酰亞胺的不溶性，移去含有銅酸鹽試劑的該燒瓶的隔片，一次性加入酰亞胺漿液，并用少量THF迅速洗滌。將水浴溫度升至-30℃，并繼續(xù)攪拌1小時(shí)。將該反應(yīng)混合物倒入250mL 3∶2的飽和NH4Cl∶濃NH4OH混合物中。分離各層，用EtOAc(3×200mL)萃取水層。將合并的有機(jī)部分依次用飽和NH4Cl(1×100mL)和水(1×100mL)洗滌。將有機(jī)部分(MgSO4)干燥并減壓濃縮。將殘余物過(guò)二氧化硅塞以進(jìn)行純化，用4∶1的己烷∶EtOAc洗脫。將洗脫液真空濃縮，收集到了白色固體(3.64g，9.81mmol，收率87％).NMR(CDCl3)δ7.87-7.82(c，3H)；7.72(s，1H)；7.54-7.27(c，8H)；6.11(ddd，1H，J＝6.7，10.4，17.0Hz)；5.34(dd，1H，J＝8.6，3.5Hz)；5.10(d，1H，J＝8.2Hz)；5.08(d，1H，J＝17.2Hz)；4.56(t，1H，J＝8.8Hz)；4.26(dd，1H，J＝8.8，3.5Hz)；4.16(ddd，1H，J＝8.1，7.0，6.9Hz)；3.68(dd，1H，J＝8.4，16.5Hz)；3.50(dd，1H，J＝6.5，16.5Hz)。
2.1.5(2’S3’R4S)-3-(2’-疊氮基-3’-(2″-萘基)-4’-戊烯?；?-4-苯基-2-噁唑烷酮(A5)在-78℃，將六甲基二硅氮烷基鉀(0.5M的甲苯溶液，25.5mL，12.8mmol)一次性加到無(wú)水THF(34mL)中。通過(guò)插管加入酰亞胺A4(3.64g，9.81mmol)在THF(34mL)中的漿液，并用THF(2×11mL)洗滌以轉(zhuǎn)移完全。30分鐘后，將三甲硅烷基疊氮化物(4.40g，14.2mmol)溶于THF(34mL)中，冷卻至-78℃，并通過(guò)插管加入。30分鐘后，加入AcOH(1.41g，1.34mL，23.4mmol)以中止反應(yīng)。將該混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將該混合物在CH2Cl2(300mL)和稀鹽水(150mL)之間分配。分離各層，并用CH2Cl2(3×150mL)萃取水相。將合并的有機(jī)部分干燥(MgSO4)，并減壓濃縮。通過(guò)快速柱色譜法純化殘余物，回收到了產(chǎn)物(3.41g，8.28mmol，收率84％)。NMR(CDCl3)δ7.85-7.82(c，3H)；7.72(s，1H)；7.53-7.47(c，2H)；7.42(dd，1H，J＝1.7，8.5Hz)；7.37-7.31(c，3H)；7.18-7.15(c，2H)；6.28(ddd，1H，J＝8.2，10.2，17.1Hz)；5.63(d，1H，J＝10.2Hz)；5.37(d，1H，J＝17.0Hz)；5.34(d，1H，J＝10.2Hz)；4.83(dd，1H，J＝3.0，8.3Hz)；4.14(t，1H，J＝7.2Hz)；4.07(dd，1H，J＝9.3，17.9Hz)；3.94(dd，1H，J＝3.0，5.8Hz)；3.68(t，1H，J＝8.6Hz)。
2.1.6(2S3R)-2-疊氮基-3-(2’-萘基)-4-戊烯酸甲酯(A6)向酰亞胺A5(3.41g，8.28mmol)在THF(62mL)內(nèi)的溶液中加入水(21mL)、35％H2O2(2.7mL)、和LiOH.H2O(695mg，16.6mmol)。2小時(shí)后，加入Na2SO3(4.17g，33.1mmol)在水(41mL)中的溶液。將該混合物攪拌15分鐘，減壓除去THF。用HCl酸化該水溶液，并用EtOAc(2×150mL)萃取。將合并的萃取液干燥(MgSO4)，并減壓濃縮。將殘余物過(guò)二氧化硅塞柱，并用1∶1的己烷∶EtOAc洗脫，濃縮后，收集到了白色固體，推測(cè)其是羧酸與手性副產(chǎn)物的混合物。從己烷/EtOAc中重結(jié)晶，獲得了手性副產(chǎn)物，為針狀結(jié)晶。將母液濃縮，并進(jìn)行酯化步驟。將含有羧酸粗產(chǎn)物的殘余物溶于無(wú)水MeOH(46mL)中，并冷卻至0℃。加入亞硫酰氯(1.18g，725μL，9.94mmol)，10分鐘后，將該混合物加熱回流2小時(shí)。向該混合物中加入水(1.0mL)，攪拌10分鐘，將燒瓶的內(nèi)容物減壓濃縮。把殘余物在EtOAc(150mL)和鹽水(100mL)之間分配。分離各層，將有機(jī)部分干燥(MgSO4)，并減壓濃縮。通過(guò)快速柱色譜法(19∶1己烷∶EtOAc)純化殘余物，收集到了該甲酯(1.54g，5.48mmol，收率66％)。NMR(CDCl3)δ7.84-7.80(c，3H)；7.71(s，1H)；7.50-7.46(c，2H)；7.39(dd，1H，J＝1.8，8.5Hz)；6.23(ddd，1H，J＝8.3，10.9，17.6Hz)；5.30(d，1H，J＝9.9Hz)；5.28(d，1H，J＝17.7Hz)；4.22(d，1H，J＝7.5Hz)；4.06(t，1H，J＝7.9Hz)。
2.1.7反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸甲酯(A7)將硼烷-二甲硫醚絡(luò)合物(2.0M的THF溶液，6.57mL，13.1mmol)用無(wú)水THF(26mL)稀釋，并冷卻至0℃。通過(guò)注射器小心地加入環(huán)己烯(2.16g，2.66mL，26.3mmol)。30分鐘后已形成了白色沉淀，繼續(xù)攪拌3小時(shí)。將燒瓶中的內(nèi)容物真空濃縮。將該反應(yīng)物在CH2Cl2(36mL)中形成漿液，并冷卻至0℃。將乙烯基疊氮化物A6(1.23g，4.38mmol)溶于CH2Cl2(9mL)中，并通過(guò)插管加入。該反應(yīng)混合物變成淡黃色，明顯有氣體釋放出來(lái)。將該混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒈３诌^(guò)夜。加入MeOH(26mL)，并再攪拌15分鐘。將該混合物減壓濃縮。把殘余物置于Et2O(25mL)中，并用0.1M HCl(5×25mL)萃取。用飽和碳酸氫鈉將水萃取液堿化，并用CH2Cl2(3×100mL)萃取。將有機(jī)萃取液干燥(MgSO4)，并真空濃縮，收集到了含有一些衍生自二環(huán)己基硼烷的污染物的環(huán)化產(chǎn)物(974mg，3.82mmol，粗產(chǎn)物收率87％)。NMR(CDCl3)δ7.84-7.78(c，3H)；7.71(s，1H)；7.49-7.41(c，3H)；3.91(d，1H，J＝6.9Hz)；3.69(s，3H)；3.63(m，1H)，3.48(dd，1H，J＝8.2，15.4Hz)；3.27(d，1H，J＝7.8Hz)；3.25(d，1H，J＝7.8Hz)；2.33(m，1H)，2.09(m，1H)。
2.1.8N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)將510mg(2mmol)甲酯(A7)在12ml 6N HCl中于100℃加熱10小時(shí)。將該反應(yīng)溶液減壓濃縮，把固體殘余物懸浮在15ml丙酮中。用2N碳酸鈉溶液將該懸浮液調(diào)節(jié)至pH 9-10。然后緩慢地加入742mg(2.2mmol)Fmoc-O-琥珀酰亞胺。然后將pH調(diào)節(jié)至9-10，并將該混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后在室溫放置過(guò)夜。用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至2，將該混合物與乙酸乙酯混合。抽濾出560mg沉淀產(chǎn)物。用乙酸乙酯將水相萃取3次，然后與二氯甲烷混合。又以沉淀形式獲得了185mg產(chǎn)物。產(chǎn)量745mg(80.4％)。NMR(d6-DMSO)δ7.95-7.80(c，6H)；7.68(d，1H，J＝7.3Hz)；7.60(d，1H，J＝7.4Hz)；7.50-7.34(c，6H)；7.25(m，1H)，4.39-4.15(c，4H)；3.70-3.48(c，3H)；2.29(m，1H)；2.14(m，1H)。
2.2N-琥珀?；?反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨?；?L-天冬酰胺?；?L-丙氨酰基-L-纈氨酰胺(34) 2.2.1N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-纈氨酰胺(B1)將463.5mg(1mmol)N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸(A8)、338mg H-Asn-Ala-Val-NH2鹽酸鹽(依據(jù)常規(guī)肽化學(xué)方法制備的)和135mg HOBT溶于20ml DMF中。在0℃，加入0.13ml N-乙基嗎啉和220mg DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)，之后在室溫放置過(guò)夜。抽濾出沉淀，將溶液在高度真空下濃縮。將殘余物在戊醇和碳酸氫鈉溶液之間分配。用KHSO4溶液和H2O/NaCl溶液洗滌戊醇相。抽濾出沉淀，并用乙醚充分研制。獲得了473mg產(chǎn)物。將戊醇相用Na2SO4干燥并濃縮。用乙醚將殘余物研制2次。又獲得了另外257mg產(chǎn)物。產(chǎn)量730mg(97.7％)。
2.2.2反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-纈氨酰胺(B2).
將248mg(0.332mmol)N-Fmoc-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-纈氨酰胺B1置于5ml DMF中。加入0.35ml(3.32mmol)二乙胺，將該混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。將該混合物經(jīng)由澄清層抽濾，并在高度真空下濃縮。將該固體殘余物用乙醚研制，并抽濾產(chǎn)量141mg(81％)。
2.2.3琥珀酸甲酯叔丁酯(B3).
在氬氣氛下，將13.2g(100mmol)琥珀酸一甲酯懸浮在500ml二氯甲烷中。用30分鐘滴加12.9ml(150mmol)草酰氯，然后將該混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。大約3.5小時(shí)后，獲得了澄清的溶液。然后滴加300ml叔丁醇。之后將該混合物在室溫放置21小時(shí)，并將該澄清溶液濃縮。把殘余物溶于乙酸乙酯中，并用H2O、NaHCO3溶液和H2O洗滌。用硫酸鈉將該溶液干燥，并濃縮。
產(chǎn)量21.6g(油狀粗產(chǎn)物)。
2.2.4琥珀酸一叔丁酯(B4)將9.4g(50mmoL)琥珀酸甲酯叔丁酯(B3)溶于115ml 1，4-二氧雜環(huán)己烷中。然后加入110ml 0.5N NaOH。將該混合物在室溫放置，產(chǎn)物沉淀出來(lái)。將該混合物在室溫放置一個(gè)周末，之后濃縮。用乙醚萃取該水溶液。將水相冷卻至0℃，并用冷的2N H2SO4酸化至pH4。然后用乙醚將該混合物萃取5次。合并有機(jī)相，用水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮。產(chǎn)量5.62g油狀物(64.5％)。
2.2.5N-叔丁基琥珀?；?反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-纈氨酰胺(B5)將262mg(0.5mmol)反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-纈氨酰胺(B2)、87.1mg(0.5mmol)琥珀酸一叔丁酯(B4)和67.5mg HOBt溶于5ml DMF。在0℃，加入110mg DCC，將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并在室溫放置過(guò)夜。抽濾出沉淀，將濾液在高度真空下濃縮。用碳酸氫鈉溶液研制殘余物，抽濾，用水洗滌，并在干燥器中干燥。
產(chǎn)量169mg(49.6％)。
2.2.6N-琥珀?；?反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-纈氨酰胺(34)將316mg N-叔丁基琥珀酰基-反式-3-(2’-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬酰胺-L-丙氨酸-L-纈氨酰胺(B5)溶于2ml 90％濃度的三氟乙酸中，并在室溫放置1小時(shí)。然后將該混合物經(jīng)由澄清層過(guò)濾，并濃縮。用乙醚研制殘余物，并抽濾。獲得了159mg粗產(chǎn)物。為了純化，將該粗產(chǎn)物經(jīng)由SephadexLH20進(jìn)行色譜處理，用丁醇/冰醋酸/水混合物洗脫。
產(chǎn)量27.5mg(9.5％)。
m/z625.298949(M+H)+(高分辨率質(zhì)譜)。
化合物34的NMR數(shù)據(jù)
化合物34在DMSO中于300K的化學(xué)位移
2.3N-琥珀?；?L-(2-萘基)丙氨?；?L-天冬酰胺酰基-L-絲氨?；?L-纈氨?；拾彼?3-羥基丙基酰胺(24)
2.3.1芐氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C1)將627g(30mmol)Gly-OH、2.45ml 3-氨基-1-丙醇、4.05gHOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入6.6g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并在室溫放置過(guò)夜。抽濾出沉淀，將濾液在高度真空下濃縮。把殘余物在乙酸乙酯和NaHCO3溶液之間分配。然后將有機(jī)相用NaHCO3溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮。用乙醚研制殘余物。
產(chǎn)量7.05g(88.2％)。
2.3.2芐氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C2)將7g(26.28mmol)芐氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C1)溶于60二氧雜環(huán)己烷中。在低溫下(液態(tài)CO2)，緩慢地加入6ml H2SO4。然后加入60ml縮合的異丁烯。將該混合物在高壓反應(yīng)釜中于室溫和大約20巴的氮?dú)鈮毫ο抡駬u3天。然后將該混合物與乙醚混合，并用2NNa2CO3溶液萃取3次。用乙醚洗滌該水溶液。合并有機(jī)相，用水洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮。
產(chǎn)量7.98g(94.2％)。
2.3.3甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C3)將7.98g(24.75mmol)芐氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C2)溶于80ml MeOH中，與Pd/碳混合，并使用HCl甲醇溶液和H2在自動(dòng)滴定儀上氫化。然后抽濾出催化劑，并將濾液濃縮。將殘余物在高度真空下干燥。
產(chǎn)量4.7g(84.5％)。
2.3.4芐氧基羰基-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C4)將5.13g(20.43mmol)芐氧基羰基-Val-OH、4.59g(20.43mmol)甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C3)和2.75g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入2.65ml N-乙基嗎啉和4.5g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將該混合物在室溫放置過(guò)夜，然后在高度真空下濃縮。將該殘余物在冰醋酸和碳酸氫鈉溶液之間分配。然后將冰醋酸相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮。用乙醚乙醚研制固體殘余物，并抽濾。
產(chǎn)量7.32g(85％)。
2.3.5L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C5)將7.29g(17.3mmol)芐氧基羰基-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C4)溶于90ml MeOH中，與Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自動(dòng)滴定儀上氫化。然后抽濾出催化劑，并將濾液濃縮。將殘余物(無(wú)定形)在高度真空下干燥，用乙醚研制，并抽濾。
產(chǎn)量5.22g(93.2％)。
2.3.6芐氧基羰基-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C6)將5.46g(18.5mmol)Z-Ser(But)OH、6g(18.5mmol)L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C5)和2.5g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入2.4ml N-乙基嗎啉和4.07g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將該混合物在室溫放置過(guò)夜，然后在高度真空下濃縮。將該固體殘余物在冰醋酸和碳酸氫鈉溶液之間分配。然后將冰醋酸相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮。用乙醚研制固體殘余物，并抽濾。
產(chǎn)量9.74g(93.2％)。
2.3.7L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C7)將9.74g(17.25mmol)芐氧基羰基-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C6)溶于大約100ml MeOH中，與Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自動(dòng)滴定儀上氫化。然后抽濾出催化劑，并將濾液濃縮。將殘余物(無(wú)定形)在高度真空下干燥，用乙醚研制，并抽濾。
產(chǎn)量8.02g(99.6％)。
2.3.8芐氧基羰基-L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C8)將4.53g(17mmol)Z-Asn-OH、7.94g L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C7)和2.3g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入2.21ml N-乙基嗎啉和3.74g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后在高度真空下濃縮。將該固體殘余物在戊醇和碳酸氫鈉溶液之間分配。然后將戊醇相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4干燥并濃縮。用乙醚研制殘余物，冷卻并抽濾。將產(chǎn)物在干燥器中用P2O5干燥。
產(chǎn)量10.8g(93.6％)。
2.3.9L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C9)將10.8g(15.9mmol)芐氧基羰基-L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C8)溶于大約160ml溫?zé)岬腗eOH中，與Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自動(dòng)滴定儀上氫化。然后抽濾出催化劑，并將濾液濃縮。將無(wú)定形殘余物在高度真空下干燥，用乙醚研制，冷卻并抽濾。
產(chǎn)量8.96g(97％)。
2.3.10芐氧基羰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C10)將5.24g(15mmol)芐氧基羰基-2-Nal-OH、8.72g(15mmol)L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C9)和2.04g HOBt溶于60ml DMF中。在0℃，加入1.95ml N-乙基嗎啉和3.3g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后將該混合物在室溫放置過(guò)夜，用DMF稀釋并輕微加熱。然后抽濾出沉淀，并將濾液在高度真空下濃縮。用NaHCO3溶液研制殘余物，抽濾，然后用KHSO4溶液研制，抽濾，用水研制，抽濾，并用水洗滌，在干燥器中用P2O5干燥。
產(chǎn)量13.25g(＞99％)。
2.3.11L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C11)將8.85g(10.1mmol)芐氧基羰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺(C10)部分溶于270ml MeOH中，與Pd/碳混合，并用HCl甲醇溶液在自動(dòng)滴定儀上氫化。用DMF將該懸浮液稀釋。大約6小時(shí)后，將該混合物濃縮至其最初體積的一半。所有物質(zhì)都溶解了。將該混合物在室溫放置過(guò)夜。然后抽濾出催化劑，將濾液用相同量的MeOH稀釋，與新催化劑(Pd/碳)混合，并在自動(dòng)滴定儀上進(jìn)一步氫化。7小時(shí)后，將該混合物在室溫放置過(guò)夜。然后將該混合物再氫化4小時(shí)，抽濾出催化劑，并將濾液濃縮。將殘余物(無(wú)定形)在高度真空下干燥，然后用乙醚研制，并抽濾。
產(chǎn)量7.56g(96.2％)。
2.3.12N-叔丁基琥珀?；?L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-絲氨酸-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C12)將523mg(3mmol)L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)酰胺鹽酸鹽(C11)、2.33g琥珀酸一叔丁酯(B4)和405mg HOBt溶于20ml DMF中。在0℃，加入0.39ml N-乙基嗎啉和660mg DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時(shí)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后在室溫放置過(guò)夜。將該混合物在高度真空下濃縮，用NaHCO3溶液研制固體殘余物，抽濾。然后用KHSO4溶液研制產(chǎn)物，抽濾，用水洗滌，在干燥器中用P2O5干燥。
產(chǎn)量3.04g(粗產(chǎn)物)。
2.3.13N-琥珀?；?L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-絲氨酸-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(24)將3g(粗產(chǎn)物)N-叔丁基琥珀酰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬酰胺-L-絲氨酸-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)酰胺(C12)溶于30ml 90％濃度的三氟乙酸中，并在室溫放置1小時(shí)。然后將該混合物濃縮，用乙醚研制殘余物，并抽濾。獲得了2.6g粗產(chǎn)物。為了純化，將250mg粗產(chǎn)物溶于溫?zé)岬谋姿嶂?，并?jīng)由Sephadex LH20進(jìn)行色譜處理，用丁醇/冰醋酸/水混合物洗脫。
產(chǎn)量103mgm/z730.341246(M+H)+(高圖形分辨率質(zhì)譜).
化合物24的NMR數(shù)據(jù)
3.抑制層粘連蛋白/巢蛋白相互作用和生物活性除非另有說(shuō)明，否則所用的化學(xué)品購(gòu)自Merck(Darmstadt)，Sigma(Munich)或Riedel de Haen(Seelze)。
從人胎盤中分離層粘連蛋白P1、從轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中分離人巢蛋白、和從HEK-293細(xì)胞中分離小鼠層層粘連蛋白γ1 III 3-5描述在WO 98/31709中。
實(shí)施例3.1抑制測(cè)定-用所發(fā)現(xiàn)的肽衍生物抑制層粘連蛋白/巢蛋白結(jié)合3.1.1.HTS篩選測(cè)定(高靈敏性測(cè)定變型)時(shí)間-解析熒光測(cè)定包被試管在室溫將微量滴定板(例如FluoroNunc)用75μl 0.1μg/ml層粘連蛋白P1溶液(在0.159g Na2CO3，0.293g NaHCO3，0.02g NaN3/升，pH 9.2中)包被1小時(shí)。然后將該溶液倒出，通過(guò)與0.5％BSA(在7.9g NaCl，1.2g Na2HPO4，0.31g KCl，0.23g of NaH2PO4，0.04％吐溫20/升，pH 7.2中)在室溫培養(yǎng)0.5小時(shí)來(lái)阻斷游離的結(jié)合位點(diǎn)。阻斷反應(yīng)完成后，傾出溶液，用250μl洗滌緩沖液(PBS/0.04％吐溫)洗滌一次。
順序抑制與包被平行進(jìn)行的是，將85-100μl 0.25nM巢蛋白溶液(重組制得的人巢蛋白)與抑制劑或標(biāo)準(zhǔn)物在單獨(dú)的反應(yīng)容器中預(yù)培養(yǎng)(在7.9g NaCl，1.2g Na2HPO4，0.31g KCl，0.23g NaH2PO4，0.04％吐溫20/升，0.5％BSA，pH 7.2中于室溫預(yù)培養(yǎng)1小時(shí))。
將75μl預(yù)培養(yǎng)物(巢蛋白+抑制劑或標(biāo)準(zhǔn)物)轉(zhuǎn)移到微量滴定板的包被孔中，并在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。然后用PBS/0.04％吐溫洗滌2次。通過(guò)在室溫與75μl特異性抗體制備物(由用人巢蛋白免疫接種的小雞的蛋黃制得的)培養(yǎng)1小時(shí)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的巢蛋白。使用在PBS/0.04％吐溫中進(jìn)行了1∶500稀釋的IgY片段。用PBS/0.04％吐溫洗滌后，通過(guò)加入抗-小雞IgY-生物素(75μl 1∶2500稀釋液；Promega，Madison，WI 53711，608-274-4330)來(lái)檢測(cè)巢蛋白與特異結(jié)合抗體的復(fù)合物。培養(yǎng)1小時(shí)，用PBS/0.04％吐溫洗滌2次，然后與鏈霉抗生物素蛋白-銪培養(yǎng)(Wallac；在室溫培養(yǎng)1小時(shí))，用PBS/0.04％吐溫洗滌2次。加入100μl增強(qiáng)溶液(Wallac)并振搖5分鐘后，可用銪方案在Victor多標(biāo)記計(jì)數(shù)器中測(cè)定熒光信號(hào)。發(fā)現(xiàn)了在該溶液中與抑制劑結(jié)合的巢蛋白的量和不具有所加入的抑制劑的巢蛋白的量之間的關(guān)系。
3.1.2.3-天平衡測(cè)定在該測(cè)定變型中評(píng)價(jià)所選抑制劑的抑制活性。該測(cè)定描述在US5,493,008中。
下表比較了所選物質(zhì)的IC50值與HTS篩選測(cè)定的結(jié)果。很明顯，該3-天測(cè)定給出了稍低的測(cè)定值，并且如預(yù)計(jì)的那樣，該測(cè)定比篩選測(cè)定的靈敏度高。然而，從該比較中可明顯看出，可用我們開(kāi)發(fā)的篩選測(cè)定可靠地鑒定具有抑制活性的結(jié)構(gòu)。
表2層粘連蛋白/巢蛋白結(jié)合的特異性抑制劑的特征在不同測(cè)定變型中的IC50值(μM)
實(shí)施例3.2(假設(shè))測(cè)試肽衍生物的生物活性可使用在文獻(xiàn)中詳細(xì)描述的幾種模型來(lái)測(cè)定肽衍生物的生物活性。
其中的代表性模型如下所述在胚胎腎培養(yǎng)物中的細(xì)管形成Grobstein，C.；(1956)Exp.Cell Res.10424-440.Ekblom，P.等人.(1994)Development 1202003-2014在胚胎肺中的分支形態(tài)Ekblom，P.等人.(1994)Development 1202003-2014在胚胎唾液腺中的分支形態(tài)Grobstein，C.(1953)J.Exp.Zool.124383-413Kadoya，Y.等人.(1997)Development 124683-691器官型皮膚培養(yǎng)物中的基底膜裝配Smola，H.；Stark，H.-J.；Thiektter，G.；Mirancea，N.；Krieg，T.；Fusenig，N.E.(1998)Exp.Cell Res.239399-410得自分裂細(xì)胞的hydra重新構(gòu)成Yang，Y.G.；Mayura，K.；Spainhour，C.B.；Edwards Jr.，J.F.；Phillips，T.D.(1993)Toxicology 85179-198在提高的葡萄糖濃度下培養(yǎng)后hydra中基底膜的增厚。
Zhang，X.；Huff，J.K.；Hudson，B.G.；Sarras Jr.；M.P.(1990)Diabetologia 33704-707R.K.等人.在Nature Medicine(1997)Vol.3，No.中的綜述性文章里對(duì)所有定量血管生成測(cè)定作了總結(jié)，例如通過(guò)植入得自自發(fā)血管內(nèi)皮瘤的細(xì)胞來(lái)在小鼠中誘導(dǎo)血管瘤O’Reilly，M.S.；Brem，M.S.；Folkman，J.(1995)J.Pediatr.Surg.302；325-329在不含血清的大鼠主動(dòng)脈培養(yǎng)物中微血管的生長(zhǎng)Nicosia，R.F.；Ottinetti，A.(1990)Lab.Invest Vol.63，No.1，115-122包埋到纖維蛋白凝膠中后在微載體上形成內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)管Nehls，V.；Drenckhahn，D.(1995)Microvascular Research 50311-322.
權(quán)利要求
1.式I化合物 其中R1是其中一個(gè)下式所示基團(tuán) 或 或 或 或 或 或 或 其中R4表示-A、-NH2、-NHR、-NR2、A2、-NHR1、 或 或 且R5表示-(CH2)lCOOA、-(CH2)lCONH2、-(CH2)lNH2或-(CH2)l-SO3H、 或 且X是其中一個(gè)下式所示基團(tuán) 或 或 或 或 或 或 或 其中Y表示O、S、-N(A)-CO-或-(CH2)r-，D表示(CH2)r、O、S、NH、NR、(CH2)r-O、(CH2)r-S、(CH2)r-NH或(CH2)rNR，且R2表示-A、-E-OH、-E-COOH或-E-CONH2，其中E表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基鏈，該烷基鏈未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，或者E表示C5-C10-環(huán)烷基，該環(huán)烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，且R3是其中一個(gè)下式所示基團(tuán) 或 或 其中R6表示-H、-COOH、-CONH2、-CONHR、-CONR2、-CH2OH或 或 或 其中R7表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基，該烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，或者R7表示C5-C10-環(huán)烷基，該環(huán)烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環(huán)烷基取代，且R表示直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環(huán)烷基、Het或Ar，所述基團(tuán)可任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素、C1-C6-烷氧基、直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環(huán)烷基或-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代，其中Het表示單環(huán)或二環(huán)5元-10元芳族或非芳族環(huán)，該環(huán)包含1或2個(gè)相同或不同的選自氮、氧和硫的雜原子作為所述環(huán)的成員，并且未取代或者被一個(gè)或多個(gè)羥基或羧基取代，Ar表示單環(huán)或二環(huán)5元-10元芳環(huán)，該環(huán)未取代或者被一個(gè)或多個(gè)羥基或羧基取代，Z表示(CH2)m、O、S、NH、NR、N-C(O)-R或NSO2R，A表示H或C1-C4-烷基，l、m和r是0-3的整數(shù)，n和k是1-2的整數(shù)，p是0-1的整數(shù)，q是1-3的整數(shù)，其中所述化合物是所有其立體異構(gòu)體和所有比例的立體異構(gòu)體混合物，并包括它們的生理可耐受鹽。
2.權(quán)利要求1的式I化合物，其中n是1。
3.權(quán)利要求1或2的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示Het或Ar，所述Het或Ar可任選被-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代。
4.權(quán)利要求3的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示Het。
5.權(quán)利要求4的式I化合物，其中Het表示
6.權(quán)利要求4的式I化合物，其中Het表示
7.權(quán)利要求4的式I化合物，其中Het表示
8.權(quán)利要求4的式I化合物，其中Het表示
9.權(quán)利要求4的式I化合物，其中Het表示
10.權(quán)利要求3的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示Ar，所述Ar可任選被-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Ar或Ar取代。
11.權(quán)利要求10的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示Ar。
12.權(quán)利要求11的式I化合物，其中Ar表示
13.權(quán)利要求11的式I化合物，其中Ar表示
14.權(quán)利要求11的式I化合物，其中Ar表示
15.權(quán)利要求11的式I化合物，其中Ar表示
16.權(quán)利要求10的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示
17.權(quán)利要求10的式I化合物，其中基團(tuán)X中的R表示
18.權(quán)利要求1-17中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中X是下式所示基團(tuán)
19.權(quán)利要求18的式I化合物，其中Y表示-(CH2)r-。
20.權(quán)利要求19的式I化合物，其中r是1。
21.權(quán)利要求19的式I化合物，其中r是0。
22.權(quán)利要求18-21的化合物，其中k是2。
23.權(quán)利要求18-21的化合物，其中k是1。
24.權(quán)利要求1-17中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中X是下式所示基團(tuán)
25.權(quán)利要求24的式I化合物，其中D表示-(CH2)r-。
26.權(quán)利要求24的式I化合物，其中r是0。
27.權(quán)利要求24的式I化合物，其中r是1。
28.權(quán)利要求1-27中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R1是下式所示基團(tuán)
29.權(quán)利要求28的式I化合物，其中Z表示(CH2)m。
30.權(quán)利要求29的式I化合物，其中m是0。
31.權(quán)利要求29的式I化合物，其中m是1。
32.權(quán)利要求28-31中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COOA。
33.權(quán)利要求32的式I化合物，其中A表示H。
34.權(quán)利要求28-31中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COONH2。
35.權(quán)利要求31-34中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中l(wèi)是0。
36.權(quán)利要求28-35中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R4表示-NH2。
37.權(quán)利要求28-35中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R4表示-A。
38.權(quán)利要求37的式I化合物，其中A表示H。
39.權(quán)利要求28-35中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R4表示-NHR1。
40.權(quán)利要求39的式I化合物，其中-NHR1表示
41.權(quán)利要求40的式I化合物，其中-NHR1的R5表示 且l是0。
42.權(quán)利要求40的式I化合物，其中-NHR1的R5表示且l是0。
43.權(quán)利要求40的式I化合物，其中-NHR1的R5表示(CH2)l-NH2，且l是0。
44.權(quán)利要求1-27中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R1是下式所示基團(tuán)
45.權(quán)利要求44的式I化合物，其中Z表示-(CH2)m-。
46.權(quán)利要求45的式I化合物，其中m是1。
47.權(quán)利要求44-46中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R4表示-NH2。
48.權(quán)利要求44-47中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COOA。
49.權(quán)利要求48的化合物，其中l(wèi)是0。
50.權(quán)利要求48或49的化合物，其中A表示H。
51.權(quán)利要求1-27中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R1是下式所示基團(tuán)
52.權(quán)利要求51的式I化合物，其中R5表示-(CH2)l-COOA。
53.權(quán)利要求52的式I化合物，其中l(wèi)是0，且A表示H。
54.權(quán)利要求1-53中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R2表示A。
55.權(quán)利要求54的式I化合物，其中R2表示-CH3。
56.權(quán)利要求1-53中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R2表示-E-COOH。
57.權(quán)利要求56的式I化合物，其中R2表示-CH2-COOH。
58.權(quán)利要求1-53中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R2表示-E-OH。
59.權(quán)利要求58的式I化合物，其中R2表示-CH2-OH。
60.權(quán)利要求1-59中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R3是下式所示基團(tuán)
61.權(quán)利要求60的式I化合物，其中k是2。
62.權(quán)利要求1-59中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R3表示
63.權(quán)利要求1-59中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R3是下式所示基團(tuán)
64.權(quán)利要求63的式I化合物，其中R7是支鏈C1-C10-烷基。
65.權(quán)利要求64的式I化合物，其中R7表示-CH(CH3)2。
66.權(quán)利要求64的式I化合物，其中R7表示-C(CH3)3。
67.權(quán)利要求64的式I化合物，其中R7表示-CH(CH3)CH2-CH3。
68.權(quán)利要求64的式I化合物，其中R7表示-CH2-CH(CH3)2。
69.權(quán)利要求63-68中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R6表示-H。
70.權(quán)利要求63-68中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R6表示-COOH。
71.權(quán)利要求63-68中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R6表示-CONH2。
72.權(quán)利要求63-68中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R6表示-CH2OH。
73.權(quán)利要求63-68中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R6表示-CON(CH3)2。
74.權(quán)利要求63-68中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R6表示
75.權(quán)利要求74的式I化合物，其中q是2。
76.權(quán)利要求1-59中一項(xiàng)或多項(xiàng)的式I化合物，其中R3是下式所示基團(tuán)
77.權(quán)利要求76的式I化合物，其中R7表示-CH(CH(CH3)2)2。
78.權(quán)利要求76的式I化合物，其中R7表示-CH2C(CH3)3。
79.藥物組合物，其中含有至少一種如一項(xiàng)或多項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的化合物和/或其生理可耐受鹽。
80.用作藥物的權(quán)利要求1-78中一項(xiàng)或多項(xiàng)的化合物和/或其生理可耐受鹽。
81.權(quán)利要求1-78中一項(xiàng)或多項(xiàng)的化合物和/或其生理可耐受鹽在制備用于治療與基底膜的增加或不良合成有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
82.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病是糖尿病的晚期并發(fā)癥。
83.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病是伴有基底膜或其成分合成增加的纖維變性。
84.權(quán)利要求83的應(yīng)用，其中所述疾病是肝臟纖維變性。
85.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病是動(dòng)脈粥樣硬化。
86.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病是癌癥。
87.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
88.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病是晶狀體后纖維組織形成。
89.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病涉及強(qiáng)炎性成分。
90.權(quán)利要求89的應(yīng)用，其中所述疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
91.權(quán)利要求89的應(yīng)用，其中所述疾病是骨關(guān)節(jié)炎。
92.權(quán)利要求89的應(yīng)用，其中所述疾病是結(jié)節(jié)性脈管炎。
93.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病涉及血管瘤。
94.權(quán)利要求81的應(yīng)用，其中所述疾病是牛皮癬。
95.鑒定能抑制層粘連蛋白與巢蛋白相互作用的化合物的方法，其中是使用權(quán)利要求1-79的化合物作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
96.權(quán)利要求95的方法，其中還包括將所鑒定的化合物配制成可藥用形式。
97.制備藥物組合物的方法，其中包括權(quán)利要求95的方法，并且將所鑒定的化合物和/或其生理可耐受鹽與可藥用載體混合。
全文摘要
本發(fā)明的目的是能起層粘連蛋白與巢蛋白之間相互作用(層粘連蛋白/巢蛋白相互作用)抑制劑作用的低分子量肽衍生物，其制備方法，由其制備的藥物組合物，以及所述肽衍生物在制備藥物和鑒定層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K5/10GK1775801SQ20051012475
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2000年2月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月1日
發(fā)明者H·U·斯蒂爾茲, M·格爾, G·A·弗琳, M·斯坦克瓦, R·A·賓尼 申請(qǐng)人:薩諾費(fèi)－阿文蒂斯德國(guó)有限公司