專利名稱：人類微小rna以及用于抑制人類微小rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求于2005年4月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/714,519的優(yōu)先權(quán)，其說(shuō)明書(shū)的全部?jī)?nèi)容以引用的形式結(jié)合于此。
本申請(qǐng)中描述的發(fā)明是利用來(lái)自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院/美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)研究院的資助完成的，基金號(hào)為1 P01 GM073047-01和1 R01GM068476-01。美國(guó)政府在本發(fā)明中具有一定的權(quán)利。

背景技術(shù)：
典型地，微小RNA是長(zhǎng)度通常約19至25個(gè)核苷酸的小RNA分子。這些微小RNA是從發(fā)夾前體上切割下來(lái)的非編碼RNA。人們已經(jīng)在大范圍的多細(xì)胞生命形式的基因組中鑒定出了多種微小RNA。
動(dòng)物中的微小RNA是在不同的基因組位置上找到的。典型地，大多數(shù)微小RNA是在基因間區(qū)域編碼的。其他微小RNA位于mRNA的內(nèi)含子內(nèi)或非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)。
許多微小RNA在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的生物之間的序列內(nèi)是保守的并且表現(xiàn)出組織特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)。生物之間的序列保守性表明微小RNA可能在生物過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。
已經(jīng)有報(bào)道稱微小RNA分子在大量生物中以序列特異性方式通過(guò)部分雜交到靶基因mRNA的非編碼3’區(qū)域后阻斷翻譯從而來(lái)控制基因的表達(dá)。微小RNA所靶向的基因大部分還有待于表征。
然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明微小RNA與多種疾患和病癥相關(guān)。例如，已表明果蠅微小RNA靶向到與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因。此外，B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病也與兩種微小RNA的缺失有關(guān)。
因此，闡明與在多種疾患和病癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用的調(diào)解基因有關(guān)的機(jī)制非常重要。因此，需要能有助于闡明在多種疾患和病癥中的調(diào)節(jié)因子例如微小RNA的功能的材料和方法。
另外，由于微小RNA誘導(dǎo)RNA降解或抑制編碼重要蛋白質(zhì)的mRNA的翻譯，因此也需要新的分子，該分子能抑制微小RNA誘導(dǎo)的切割或通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯阻遏而促進(jìn)表達(dá)。


發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有SEQ ID NO1-94中示出的微小RNA中的序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為非互補(bǔ)的。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種修飾的單鏈微小RNA分子，該修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有與SEQ ID NO1-94中示出的微小RNA分子中的連續(xù)的堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈抗微小RNA分子，該分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈由多個(gè)主鏈單元組成，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ IDNO1-94中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且該分子能夠抑制微小RNP活性。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法，微小RNP包含微小RNA分子，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求18所述的單鏈抗微小RNA分子引入細(xì)胞內(nèi)，其中抗微小RNA與該微小RNA分子互補(bǔ)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的微小RNP，該分離的微小RNP包含本文中描述的分離的DNA或RNA分子。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的微小RNP，該分離的微小RNP包含本文中描述的分離的單鏈微小RNA分子。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有SEQ ID NO281-374中示出的微小RNA中的序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為非互補(bǔ)的。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有SEQ ID NO467-481中示出的微小RNA中的序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為非互補(bǔ)的。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有SEQ ID NO497-522中示出的微小RNA中的序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為非互補(bǔ)的。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有SEQ ID NO549中示出的微小RNA中的序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為非互補(bǔ)的。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種修飾的單鏈微小RNA分子，該修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈由多個(gè)主鏈單元組成，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ ID NO281-374中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種修飾的單鏈微小RNA分子，該修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQID NO467-481中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種修飾的單鏈微小RNA分子，該修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQID NO497-522中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種修飾的單鏈微小RNA分子，該修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包括多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQID NO549中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈抗微小RNA分子，該分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ IDNO281-374中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且該分子能夠抑制微小RNP的活性。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈抗微小RNA分子，該分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包括多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ IDNO467-481中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且該分子能夠抑制微小RNP的活性。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈抗微小RNA分子，該分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包括多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ IDNO497-522中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且該分子能夠抑制微小RNP的活性。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈抗微小RNA分子，該分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包括多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ IDNO549中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；不超過(guò)50％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且該分子能夠抑制微小RNP的活性。



圖1示出了本說(shuō)明書(shū)中討論的修飾的核苷酸單元。B表示下列核酸堿基中的任何一個(gè)腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、胸腺嘧啶或尿苷。
圖2已知和預(yù)測(cè)的人類微小RNA的保守模式。該保守模式是以UCSC phastCons scores(http://genome.ucsc.edu)為基礎(chǔ)的。本圖示出了在兩側(cè)均具有另外3000個(gè)側(cè)翼核苷酸的微小RNA的染色體區(qū)域。該染色體坐標(biāo)遵循來(lái)自UCSC(http://genome.ucsc.edu/)的人類基因組的構(gòu)建34組合(build 34 assembly)(hg16)。為了簡(jiǎn)便，X軸表示相對(duì)位置。已知的微小RNA根據(jù)它們的Rfam名稱略去“hsa”前綴而命名。預(yù)測(cè)的微小RNA分為兩類被證實(shí)的預(yù)測(cè)-在本研究中通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了的這些預(yù)測(cè)；新預(yù)測(cè)-這些預(yù)測(cè)尚未得到證實(shí)。微小RNA的方向用箭頭進(jìn)行標(biāo)記。A一個(gè)微小RNA預(yù)測(cè)的實(shí)例，它擴(kuò)展了一個(gè)已知的配對(duì)簇(pair cluster)。B闡明了一個(gè)新的多成員簇。(圖未按比例繪制，因此保守區(qū)域的寬度是所展示區(qū)域長(zhǎng)度的一個(gè)函數(shù)；該區(qū)域越長(zhǎng)，所展示的圖越窄)。

具體實(shí)施例方式 微小RNA分子 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈微小RNA分子，該分離的單鏈微小RNA分子具有SEQ ID NO1-94中的任何一個(gè)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈微小RNA分子，該分離的單鏈微小RNA分子具有SEQ ID NO281-374中的任何一個(gè)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈微小RNA分子，該分離的單鏈微小RNA分子具有SEQ ID NO467-481中的任何一個(gè)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈微小RNA分子，該分離的單鏈微小RNA分子具有SEQ ID NO497-522中的任何一個(gè)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的單鏈微小RNA分子，該分離的單鏈微小RNA分子具有SEQ ID NO549中的任何一個(gè)。
微小RNA分子在本領(lǐng)域中是已知的(見(jiàn)例如關(guān)于微小RNA分子的綜述Bartel，Cell，2004，116，281-297)。Bartel所著的文獻(xiàn)中的微小RNA分子的定義及特征以引用的方式結(jié)合于此。這些分子來(lái)自于基因組座位，并且是由特異的微小RNA基因產(chǎn)生的。
成熟的微小RNA分子是從形成局部發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體轉(zhuǎn)錄本中加工而來(lái)的。該發(fā)夾結(jié)構(gòu)通常被稱為Dicer的酶切割，從而產(chǎn)生一種微小RNA二聚體。參見(jiàn)上面Bartel的參考文獻(xiàn)。
通常，微小RNA二聚體的兩條鏈中的一條包裝在微小RNA核糖核蛋白復(fù)合體(微小RNP)中。例如，人類的微小RNP也包含蛋白質(zhì)eIF2C2/Argonaute(Ago)2、螺旋酶Gemin3和Gemin4。Argonaute蛋白質(zhì)族系的其他成員例如Ago1、3和4也與微小RNA結(jié)合，并形成微小RNP。
在人類，包含Ago2的微小RNP典型地引導(dǎo)微小RNA切割靶RNA序列。包含其他Ago蛋白(例如Ago1、3和4)的微小RNP復(fù)合體通常阻遏靶mRNA的翻譯。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有表A中SEQ ID NO1-94中示出的序列及其等同物。優(yōu)選地，分離的DNA或RNA分子包括至少13個(gè)，更優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)的堿基。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有表A2中SEQ ID NO281-374中示出的序列及其等同物。優(yōu)選地，分離的DNA或RNA分子包括至少13個(gè)，更優(yōu)選地至少15個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)的堿基。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有表A4中SEQ ID NO467-481中示出的序列及其等同物。優(yōu)選地，分離的DNA或RNA分子包括至少13個(gè)，更優(yōu)選地至少15個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)的堿基。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有表A6中SEQ ID NO497-522中示出的序列及其等同物。優(yōu)選地，分離的DNA或RNA分子包括至少13個(gè)，更優(yōu)選地至少15個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)的堿基。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有表A8中SEQ ID NO549中示出的序列及其等同物。優(yōu)選地，分離的DNA或RNA分子包括至少13個(gè)，更優(yōu)選地至少15個(gè)，甚至更優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)的堿基。
表A.微小RNA序列 表A1.微小RNA發(fā)夾前體序列 >hsa-mir-18b CUUGUGUUAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAGUGAAGCAGCUUAGAAUCUACUGCC CUAAAUGCCCCUUCUGGCACAGG(SEQ.ID.NO95) >hsa-mir-20b GAUAAGAUUGGGUCCUAGUAGUACCAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAGUUUUGGC AUGACUCUACUGUAGUAUGGGCACUUCCAGUACUCUUGGAUAACAAAUCUCUUG UUG(SEQ.ID.NO96) >hsa-mir-301b GGGGUCCCCCCUGCUGGCCGCAGGUGCUCUGACGAGGUUGCACUACUGUGCUCUG AGAAGCAGUGCAAUGAUAUUGUCAAAGCAUCUGGGACCAGCCUUGGGGAUCUC >hsa-mir-329-1(SEQ.ID.NO97) GGUACCUGAAGAGAGGUUUUCUGGGUUUCUGUUUCUUUAAUGAGGACGAAACAC ACCUGGUUAACCUCUUUUCCAGUAUC(SEQ.ID.NO98) >hsa-mir-329-2 GUGGUACCUGAAGAGAGGUUUUCUGGGUUUCUGUUUCUUUAUUGAGGACGAAAC ACACCUGGUUAACCUCUUUUCCAGUAUCAA(SEQ.ID.NO99) >hsa-mir-374b ACUCGGAUGGAUAUAAUACAACCUGCUAAGUGUCCUAGCACUUAGCAGGUUGUA UUAUCAUUGUCCGUGU(SEQ.ID.NO100) >hsa-mir-421 CACAUUGUAGGCCUCAUUAAAUGUUUGUUGAAUGAAAAAAUGAAUCAUCAACAG ACAUUAAUUGGGCGCCUGCUCUGUG(SEQ.ID.NO101) >hsa-mir-500 CCAGAUCCUAGAACCCUAUCAAUAUUGUCUCUGCUGUGUAAAUAGUUCUGAGUA GUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUUUGGUGUUUGG(SEQ.ID.NO102) >hsa-mir-504 GGCGGCCCCGCGGUGCAUUGCUGUUGCAUUGCACGUGUGUGAGGCGGGUGCAGU GCCUCGGCAGUGCAGCCCGGAGCCGGC(SEQ.ID.NO103) >hsa-mir-604 GGGUUGGGCAAGGUGCGGGGCUAGGGCUAACAGCAGUCUUACUGAAGGUUUCCU GGAAACCACGCACAUGCUGUUGCCAC(SEQ.ID.NO104) >hsa-mir-610 CUCCAUGCCUUGAGUGUAGGACCGUUGGCAUCUUAAUUACCCUCCCACACCCAAG GCUUGCA(SEQ.ID.NO105) >hsa-mir-618 UUAUUGUGAAAUAUGUCAUUAAUAUGUACUGACAAAGCGUAUCUGUGUAAUAAA UAUGCUUUUUGUCAGUACAUGUUAAUGGUAUAUUUCAUAACAA(SEQ.ID.NO106) >hsa-mir-619 GCGGCUGCUGGACCCACCCGGCCGGGAAUAGUGCUCCUGGUUGUUUCCGGCUCGC GUGGGUGUGUCGGCGGCGGG(SEQ.ID.NO107) >hsa-mir-620 CGCCCCCACGUGGCCCCGCCCCCUGAGGCCGGCGCUGCCGCCAUGUUGGGAGCGG GCAGGUUGGGAGCG(SEQ.IDNO108) >hsa-mir-631 GGGGCGGGAGGGGGGUCCCCGGUGCUCGGAUCUCGAGGGUGCUUAUUGUUCGGU CCGAGCCUGGGUCUCCCUCUUCCCCCC(SEQ.ID.NO109) >hsa-mir-720A UGCUCUGGAUACCUGUGUGUGAUGAGCUGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGUUGAAU AUGUGAAUGGCAUCGGCUAACAUGCAACUGCUGUCUUAUUGCAUAUACAAUGAA CAUCAGAGUG(SEQ.ID.NO110) >hsa-mir-720b UGAAUCAGGUAGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGCUGCUUGGGUCAAGUCAGCAGCC ACAACUACCCUGCCACUUGCUUCU(SEQ.ID.NO111) >hsa-mir-723 GCCACCUUCCGAGCCUCCAGUACCACGUGUCAGGGCCACAUGAGCUGGGCCUCGU GGGCCUGAUGUGGUGCUGGGGCCUCAGGGGUCUG(SEQ.ID.NO112) >hsa-mir-730 GCGGUACUUAAUGAGAAGUUGCCCGUGUUUUUUUCGCUUUAUUUGUGACGAAAC AUUCGCGGUGCACUUCUUUUUCAGUAUCCU(SEQ.ID.NO113) >hsa-mir-732 CCAACGUCAGGGAAAGGAUUCUGCUGUCGGUCCCACUCCAAAGUUCACAGAAUGG GUGGUGGGCACAGAAUCUGGACUCU(SEQ.ID.NO114) >hsa-mir-429 CGGCCGAUGGGCGUCUUACCAGACAUGGUUAGACCUGGCCCUCUGUCUAAUACUG UCUGGUAAAACCGUCCAUCCGCUG(SEQ.ID.NO115) >hsa-mir-754 UGCUUCUGUGUGAUAUGUUUGAUAUUGGGUUGUUUAAUUAGGAACCAACUAAAU GUCAAACAUAUUCUUACAGCAGCA(SEQ.ID.NO116) >hsa-mir-755 GCAGACUGGAAAAUCUCUGCAGGCAAAUGUGAUGUCACUGAGGAAAUCACACAC UUACCCGUAGAGAUUCUACAGUCUGA(SEQ.ID.NO117) >hsa-mir-800A CUUUCUUUUCCGUGCUAACCUUUGGUACUUGGAGAGUGGUUAUCCCUGUCCUGU UCGUUUUGCUCAUGUCGAAUCGUACAGGGUCAUCCACUUUUUCAGUAUCAAGAG CGC(SEQ.ID.NO118) >hsa-mir-800b UGAAGAGUGGUUAUCCCUGCUGUGUUCGCUUAAUUUAUGACGAAUCAUACAGGG ACAUCCAGUUUUUCA(SEQ.ID.NO119) >hsa-mir-803 CCCUGGCGUGAGGGUAUGUGCCUUUGGACUACAUCGUGGAAGCCAGCACCAUGCA GUCCAUGGGCAUAUACACUUGCCUCAAGG(SEQ.ID.NO120) >hsa-mir-805-2 GAUGCUAAACUAUUUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAUGUAAUAUAAAUGUAUUGGG GACAUUUUGCAUUCAUAGUUUUGUAUC(SEQ.ID.NO121) >hsa-mir-451 CUUGGGAAUGGCAAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAAUGGU UCUCUUGCUAUACCCAGA(SEQ.ID.NO122) >hsa-mir-433 CCGGGGAGAAGUACGGUGAGCCUGUCAUUAUUCAGAGAGGCUAGAUCCUCUGUG UUGAGAAGGAUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGUUCUCCAGG(SEQ.ID.NO123) >hsa-mir-431 UCCUGCUUGUCCUGCGAGGUGUCUUGCAGGCCGUCAUGCAGGCCACACUGACGGU AACGUUGCAGGUCGUCUUGCAGGGCUUCUCGCAAGACGACAUCCUCAUCACCAAC GACG(SEQ.ID.NO124) >hsa-mir-452 GCUAAGCACUUACAACUGUUUGCAGAGGAAACUGAGACUUUGUAACUAUGUCUC AGUCUCAUCUGCAAAGAAGUAAGUGCUUUGC(SEQ.ID.NO125) >hsa-mir-453 GCAGGAAUGCUGCGAGCAGUGCCACCUCAUGGUACUCGGAGGGAGGUUGUCCGU GGUGAGUUCGCAUUAUUUAAUGAUGC(SEQ.ID.NO126) >hsa-mir-814 GUGCAUUUGCAGGAACUUGUGAGUCUCCUAUUGAAAAUGAACAGGAGACUGAUG AGUUCCCGGGAACAC(SEQ.ID.NO127) >hsa-mir-815 CUAUGCACUGCACAACCCUAGGAGAGGGUGCCAUUCACAUAGACUAUAAUUGAA UGGCGCCACUAGGGUUGUGCAGUGCACAA(SEQ.ID.NO128) >hsa-mir-816 GGGUUUGGGGAAACGGCCGCUGAGUGAGGCGUCGGCUGUGUUUCUCACCGCGGU CUUUUCCUCCCACUC(SEQ.ID.NO129) >hsa-mir-817 CUUGGUGACGCUGUAUGCCCUCACCGCUCAGCCCCUGGGGCUGGCUUGGCAGACA GUACAGCAUCCAGGGGAGUCAAGGGCAUGGGGCGAGACCAGA(SEQ.ID.NO130) >hsa-mir-818-1 GGUAAGGGUAGAGGGAUGAGGGGGAAAGUUCUAUAGUCCUGUAAUUAGAUCUCA GGACUAUAGAACUUUCCCCCUCAUCCCUCUGCCCUCUACC(SEQ.ID.NO131) >hsa-mir-818-2 GUAGAGGGCAGAGGGAUGAGGGGGAAAGUUCUAUAGUCCUGAGAUCUAAUUACA GGACUAUAGAACUUUCCCCCUCAUCCCUCUACCCUUACCA(SEQ.ID.NO132) >hsa-mir-819 GGCCCGCACUCUCUCCAUUACACUACCCUGCCUCUUCUCCAUGAGAGGCAGCGGG GUGUAGUGGAUAGAGCACGGGUU(SEQ.ID.NO133) >hsa-mir-821-1 GCGGCGGCGGCGGAGGCUGCUGCUGGGGCGGCUGCUGCUGGGGCGGCUGCGGCGG CGGCUGCUGCGGGGGCUGCUGCUGCUGUUGC(SEQ.ID.NO134) >hsa-mir-821-2/-3 GCGGCUGCGGCGGCGGCGGAGGCUGCGGCGGCGACCGUGGCAGAGGCGGUGGCGG AGGCCUCCGUGGCGGAGGCGGAAGC(SEQ.ID.NO135) >hsa-mir-822 ACUCUAUAAAUCUAGUGGAAACAUUUCUGCACAAACUAGAUUCUGGACACCAGU GUGCGGAAAUGCUUCUGCUACAUUUUUAGGGU(SEQ.ID.NO136) >hsa-mir-824 GUUUCAUACUUGAGGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGUUCGCUUUAUUUAUGAUGAA UCAUACAAGGACAAUUUCUUUUUGAGUAUCAAAU(SEQ.ID.NO137) >hsa-mir-825 UCUCAGACAUCUCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGAUACCAGUGUGCACUUGUGACA GAUUGAUAACUGAAAGGUCUGGGA(SEQ.ID.NO138) >hsa-mir-826-2 UUGUCUGUGGUACCCUACUCUGGAGAGUGACAAUCAUGUAUAACUAAAUUUGAU UGACACUUCUGUGAGUAGAGUAACGCAUGACAC(SEQ.ID.NO139) >hsa-mir-826-3 UUGUCUGUGGUACCCUACUCUGGAGAGUGACAAUCAUGUAUAAUUAAAUUUGAU UGACACUUCUGUGAGUAGAGUAACGCAUGACAC(SEQ.ID.NO140) >hsa-mir-828 CUUCCUCAUGCUGACAUAUUUACUAGAGGGUAAAAUUAAUAACCUUCUAGUAAG AGUGGCAGUCGAAGGGAAG(SEQ.ID.NO141) >hsa-mir-829 CAGUCAGAAAUGAGCUUAUUCAUAAAAGUGCAGUAUGGUGAAGUCAAUCUGUAA UUUUAUGUAUAAGCUAGUCUCUGAUUG(SEQ.ID.NO142) >hsa-mir-831-1 GCUCCGCCCCACGUCGCAUGCGCCCCGGGAACGCGUGGGGCGGAGCUUCCGGAGG CCCCGCUCUGCUGCCGACCCUGUGGAGCGGAGGGUGAAGCCUCCGGAUGCCAGUC CCUCAUCGCUGGCCUGGUCGCGCUGUGGCGAAGGGGGCGGAGC(SEQ.ID.NO143) >hsa-mir-831-2 GCUCCGCCCCACGUCGCAUGCGCCCCGGGAACGCGUGGGGCGGAGCUUCCGGAGG CCCCGCCCUGCUGCCGACCCUGUGGAGCGGAGGGUGAAGCCUCCGGAUGCCAGUC CCUCAUCGCUGGCCCGGUCGCGCUGUGGCGAAGGGGGCGGAGC(SEQ.ID.NO144) >hsa-mir-831-3/-4/-5 CGCUCCGCCCCACGUCGCAUGCGCCCCGGGAAAGCGUGGGGCGGAGCUUCCGGAG GCCCCGCCCUGCUGCCGACCCUGUGGAGCGGAGGGUGAAGCCUCCGGAUGCCAGU CCCUCAUCGCUGGCCCGGUCGCGCUGUGGCGAAGGGGGCGGAGC(SEQ.ID.NO 145) >hsa-mir-832 AUUGUUCGACACCAUGGAUCUCCAGGUGGGUCAAGUUUAGAGAUGCACCAACCU GGAGGACUCCAUGCUGUUGAGCUGU(SEQ.ID.NO146) >hsa-mir-834 CAGGGCUUUGUACAUGGUAGGCUUUCAUUCAUUCGUUUGCACAUUCGGUGAAGG UCUACUGUGUGCCAGGCCCUG(SEQ.ID.NO147) >hsa-mir-835 CUGGCAGGCCAGGAAGAGGAGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAGGUGAUGGAUGUU UUCCUCCGGUUCUCAGGGCUCCACCUCUUUCGGGCCGUAGAGCCAG(SEQ.ID.NO 148) >hsa-mir-837 AGAGGAGGGUCUCCUCGAGGGGUCUCUGCCUCUACCCAGGACUCUUUCAUGACCA GGAGGCUGAGGCCCCUCACAGGCGGCUUCUUACUCU(SEQ.ID.NO149) >hsa-mir-838 UCGUCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAUAAACCCCUAAAUAGGGACUUUCCCGGGGGG UGACCCUGGCUUUUUUGGCGA(SEQ.ID.NO150) >hsa-mir-839 CUGACUCCCACCCCGAGUAUCCUGUACUGAGCUGCCCCGAGCUGGGCAGCAUGAA GGGCCUCGGGGCAGCUCAGUACAGGAUGCCCCAGGGAGGAUGGAGAUCAG (SEQ.ID.NO151) >hsa-mir-839-2 CUCCAUCCUCCCUGGGGCAUCCUGUACUGAGCUGCCCCGAGGCCCUUCAUGCUGC CCAGCUCGGGGCAGCUCAGUACAGGAUACUCGGGGUGGGAGUCAG(SEQ.ID.NO 152) >hsa-mir-840 UUCAUCAAGACCCAGCUGAGUCACUGUCACUGCCUACCAAUCUCGACCGGACCUC GACCGGCUCGUCUGUGUUGCCAAUCGACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUGGUAGAUA GGCGGUCAUGCAUACGAAUUUUCAGCUCUUGUUCUGGUGAC(SEQ.ID.NO153) >hsa-mir-841 AGAAUCAUCUCUCCCAGAUAAUGGCACUCUCAAACAAGUUUCCAAAUUGUUUGA AAGGCUAUUUCUUGGUCAGAUGACUCU(SEQ.ID.NO154) >hsa-mir-842 CCUAGAUAAGUUAUUAGGUGGGUGCAAAGGUAAUUGCAGUUUUUCCCAUUAUUU UAAUUGCGAAAACAGCAAUUACCUUUGCACCAACCUGAUGGAGUCCCCCU (SEQ.ID.NO155) >hsa-mir-843 GCCCUCAAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGGGGUAAAUGACUUGCACAUGAACACA ACUAGACUGUGAGCUUCUAGAGGGC(SEQ.ID.NO156) >hsa-mir-845-1 CGCGAGGCCGGGGUCGAGCGCUUCAGUAGCUCAUGGCUCUGUAGAGUGCGCAUGG CCAAGCAAAGGAAAGCAUGCUCCAGUGGCGCA(SEQ.ID.NO157) >hsa-mir-845-2 AGUAACCACUUAGUGUGUAUUGACUUGUCAGAAUUUUCAGAAUUUAAAGCAUGC UCCAGUGGCGCA(SEQ.ID.NO158) >hsa-mir-846 CGGGGCGCGUCGCCCCCCUCAGUCCACCAGAGCCCGGAUACCUCAGAAAUUCGGC UCUGGGUCUGUGGGGAGCGAAAUGCAACCCA(SEQ.ID.NO159) >hsa-mir-847 UUACUGUGUCAUUGUUGCUGUCAUUGCUACUGAGGAGUACUGACCAGAAUCAUC UGCAACUCUUAGUUGGCAGAGAGGACCACUAUGGCGGGUAG(SEQ.ID.NO160) >hsa-mir-848 UGGGCCAGAUUGCCAUCCCCUAUGGACCAGAAGCCAAGGAUCUCUCUAGUGAUGG UCAGAGGGCCCAAAUGGCAGGGAUACCCA(SEQ.ID.NO161) >hsa-mir-849 GCUUCUGUCUACUACUGGAGACACUGGUAGUAUAAAACCCAGAGUCUCCAGUAA UGGACGGGAGC(SEQ.ID.NO162) >hsa-mir-850 CUGGGUUAGGGCCCUGGCUCCAUCUCCUUUAGGAAAACCUUCUGUGGGGAGUGG GGCUUCGACCCUAACCCAG(SEQ.ID.NO163) >hsa-mir-851 GCAGAUCCUUGGGAGCCCUGUUAGACUCUGGAUUUUACACUUGGAGUGAACGGG CGCCAUCCCGAGGCUUUGC(SEQ.ID.NO164) >hsa-mir-852 AGUAGGCCUCAGUAAAUGUUUAUUAGAUGAAUAAAUGAAUGACUCAUCAGCAAA CAUUUAUUGUGUGCCUGCU(SEQ.ID.NO165) >hsa-mir-853 CCUGGGCUCUGACCUGAGACCUCUGGGUUCUGAGCUGUGAUGUUGCUCUCGAGCU GGGAUCUCCGGGGUCUUGGUUCAGGG(SEQ.ID.NO166) >hsa-mir-854 GGUGUUAGCCCUGCGGCCCCACGCACCAGGGUAAGAGAGACUCUCGCUUCCUGCC CUGGCCCGAGGGACCGACUGGCUGGGCC(SEQ.ID.NO167) >hsa-mir-855 UGGGUGCGGGCGUGUGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGUGUCGCUCCGGGUCCACG CUCAUGCACACACCCACACGCCCACACUCA(SEQ.ID.NO168) >hsa-mir-855 UGGGUGCGGGCGUGUGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGUGUCGCUCCGGGUCCACG CUCAUGCACACACCCACACGCCCACACUCA(SEQ.ID.NO169) >hsa-mir-857 GGGCCCGGCCCCAGGAGCGGGGCCUGGGCAGCCCCGUGUGUUGAGGAAGGAAGGC AGGGCCCCCGCUCCCCGGGCCU(SEQ.ID.NO170) >hsa-mir-864 CCUUCUCUUCUCAGUUCUUCCCCAAGUUAGGAAAAGCUGAGUUGAGAGGG (SEQ.ID.NO171) >hsa-mir-151 GUCUCUCUUCAGGGCUCCCGAGACACAGAAACAGACACCUGCCCUCGAGGAGCUC ACAGUCUAGAC(SEQ.ID.NO172) >hsa-mir-869 AAAGAUGGUGGGCCGCAGAACAUGUGCUGAGUUCGUGCCAUAUGUCUGCUGACC AUCACCUUU(SEQ.ID.NO173) >hsa-mir-871-1 UCCUACCCGGGUCGGAGUUAGCUCAAGCGGUUACCUCCUCAUGCCGGACUUUCUA UCUGUCCAUCUCUGUGCUGGGGUUCGAGACCCGCGGGUGCUUACUGACCCUUUUA UGCA(SEQ.ID.NO174) >hsa-mir-92b CCGGGCCCCGGGCGGGCGGGAGGGACGGGACGCGGUGCAGUGUUGUUUUUUCCCC CGCCAAUAUUGCACUCGUCCCGGCCUCCGGCCCCCCCGGCCCCCCGG(SEQ.ID.NO 175) >hsa-mir-883 GAUACUCGAAGGAGAGGUUGUCCGUGUUGUCUUCUCUUUAUUUAUGAUGAAACA UACACGGGAAACCUCUUUUUUAGUAUC(SEQ.ID.NO176) >hsa-mir-884 AUUUUCAUCACCUAGGGAUCUUGUUAAAAAGCAGAUUCUGAUUCAGGGACCAAG AUUCUGCAUUUUUAGCAAGUUCUCAAGUGAUGCUAAU(SEQ.ID.NO177) >hsa-miR-885 GUGCUCUCCUGGCCCAUGAAAUCAAGCGUGGGUGAGACCUGGUGCAGAACGGGA AGGCGACCCAUACUUGGUUUCAGAGGCUGUGAGAAUAAC(SEQ.ID.NO178) >hsa-mir-886 CCCCUGUGCCUUGGGCGGGCGGCUGUUAAGACUUGCAGUGAUGUUUAACUCCUCU CCACGUGAACAUCACAGCAAGUCUGUGCUGCUUCCCGUCCCUACGCUGCCUGGGC (SEQ.ID.NO179) >hsa-mir-887 GUUUAGUGGUACUAUACCUCAGUUUUAUCAGGUGUUCUUAAAAUCACCUGGAAA CACUGAGGUUGUGUCUCACUGAAC(SEQ.ID.NO180) >hsa-mir-888 GCUGCUGUUGGGAGACCCUGGUCUGCACUCUAUCUGUAUUCUUACUGAAGGGAG UGCAGGGCAGGGUUUCCCAUACAGAGGGC(SEQ.ID.NO181) >hsa-mir-889 GGAAUUGACUUAGCUGGGUAGUGGGGAACCCUUCCAUGAGGAGUAGAACACUCC UUAUGCAAGAUUCCCUUCUACCUGGCUGGGUUGGAGUC(SEQ.IDNO182) >hsa-mir-890 UCAUUCCUUCAGUGUUGAAACAAUCUCUACUGAACCAGCUUCAAACAAGUUCACU GGAGUUUGUUUCAAUAUUGCAAGAAUGA(SEQ.ID.NO183) >hsa-mir-891 CACAAACUGUGAAGUGCUGUGGAUUUCUUUGUGAAUCACCAUAUCUAAGCUAAU GUGGUGGUGGU UUACAAAGUAAUUCAUAGUGCUUCACAGGUG(SEQ.ID.NO184) >hsa-mir-892 GCGGCUGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCUGUUGCUGUUGCUGCUGCUG CUGCUGCUGCUGUUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC(SEQ.ID.NO185) >hsa-mir-893 GAGGGGGAAGACGGGAGGAAAGAAGGGAGUGGUUCCAUCACGCCUCCUCACUCC UCUCCUCCCGUCUUCUCCUCUC(SEQ.ID.NO186) >hsa-mir-894 CUACUGCUGUUGGUGGCAGCUUGGUGGUCGUAUGUGUGACGCCAUUUACUUGAA CCUUUAGGAGUGACAUCACAUAUACGGCAGCUAAACUGCUACAUGGGACAACAA UU(SEQ.ID.NO187) 表A2.微小RNA序列 表A3.微小RNA發(fā)夾前體序列 表A4.微小RNA序列 表A5.微小RNA發(fā)夾前體序列 表A6.微小RNA序列 表A7.微小RNA發(fā)夾前體序列 表A8.微小RNA序列和發(fā)夾前體序列 在本說(shuō)明書(shū)中，堿基是指通常在天然存在的DNA或RNA中找到的核苷酸堿基中的任何一種。堿基可以是嘌呤或嘧啶。嘌呤堿基的實(shí)例包括腺嘌呤(A)和鳥(niǎo)嘌呤(G)。嘧啶堿基的實(shí)例包括胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。腺嘌呤可被2，6-二氨基嘌呤取代。
已顯示本說(shuō)明書(shū)中披露的核酸分子序列含有尿嘧啶堿基。尿嘧啶堿基出現(xiàn)在RNA分子中。本發(fā)明還包括DNA分子。該DNA分子的堿基序列與該RNA分子相同，只是在DNA分子中尿嘧啶堿基被胸腺嘧啶堿基取代。
序列中的每個(gè)堿基均可與互補(bǔ)的堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)。本文中使用的Watson-Crick堿基對(duì)是指在例如下列堿基腺嘌呤和胸腺嘧啶(A-T)；腺嘌呤和尿嘧啶(A-U)；并且胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤(C-G)之間有氫鍵相互作用。
等同物是指一些分子，其中例如在SEQ ID NO1-94中達(dá)到30％的連續(xù)堿基為搖擺堿基，和/或達(dá)到10％，優(yōu)選達(dá)到5％的連續(xù)堿基為非互補(bǔ)的。
如在本文中使用的，搖擺堿基是指在分子序列中1)用尿嘧啶取代胞嘧啶，或2)用鳥(niǎo)嘌呤取代腺嘌呤。這些搖擺堿基取代通常稱為UG或GU搖擺。表B示出了分子中連續(xù)堿基的數(shù)量和搖擺堿基的最大數(shù)量。
表B.連續(xù)堿基數(shù)量和搖擺堿基的最大數(shù)量 本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非互補(bǔ)”是指插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合。插入是指在上述任何堿基的連續(xù)序列中的嵌入。缺失是指連續(xù)序列中存在的任何部分的去除。錯(cuò)配是指用不同的堿基取代連續(xù)序列中的一個(gè)堿基。
插入、缺失或錯(cuò)配可以發(fā)生在連續(xù)的序列中的任何位置，例如在分子連續(xù)的序列的兩個(gè)末端之一或分子連續(xù)的序列之內(nèi)。典型地，如果連續(xù)的序列相對(duì)較短例如長(zhǎng)度為從約10至約15個(gè)堿基，則缺失或錯(cuò)配發(fā)生在連續(xù)的序列的末端。如果連續(xù)的序列相對(duì)較長(zhǎng)例如最少16個(gè)的連續(xù)序列，則插入、缺失或錯(cuò)配可發(fā)生在連續(xù)序列的任何位置。
例如，當(dāng)連續(xù)堿基的數(shù)量是10至19，則連續(xù)的堿基中沒(méi)有一個(gè)或只有一個(gè)可以為插入的、缺失的或錯(cuò)配的；當(dāng)連續(xù)堿基的數(shù)量是20或更多，則允許0個(gè)、1個(gè)或2個(gè)插入、缺失或錯(cuò)配。
除了微小RNA的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，該分離的DNA或RNA分子可能還具有一個(gè)或多個(gè)附加的核苷酸。附加的核苷酸的數(shù)量沒(méi)有上限。典型地，將不多于約500個(gè)核苷酸，優(yōu)選將不多于約300個(gè)核苷酸添加到微小RNA的至少10個(gè)連續(xù)的堿基中。
可以添加任何核苷酸。附加的核苷酸可以包括任何上述的堿基。因此，例如，附加的核苷酸可以是A、G、C、T或U中的一種或多種。
在一個(gè)實(shí)施例中，微小RNA是發(fā)夾前體序列或其片段的一部分。例如，表A1中的SEQ ID NO95-187示出的適合的發(fā)夾前體序列。下面示出了其他的發(fā)夾前體序列表A3的SEQ ID NO375-466；表A5的SEQ ID NO482-496；表A7的SEQ ID NO523-548并且表A8的SEQ ID NO550。
所述片段可以是發(fā)夾前體序列的任何片段，該片段在5’端和/或在3’端包含至少10個(gè)，優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，核苷酸序列位于微小RNA存在的發(fā)夾前體中。
微小RNA或發(fā)夾前體可插入一個(gè)載體中，例如一個(gè)重組載體。典型地，為了構(gòu)建包含微小RNA的重組載體，將包含微小RNA序列的發(fā)夾前體序列整合到該載體中。參見(jiàn)例如Chen et al.Science2004，30383-86。
重組載體可以是任何重組載體，例如質(zhì)粒、粘粒或噬菌體。重組載體通常具有復(fù)制起點(diǎn)。該載體可以是例如病毒載體，如腺病毒載體或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體，參見(jiàn)Ledley 1996，Pharmaceutical Research 131595-1614和Verma et al.Nature 1997，387239-242。
載體可進(jìn)一步包括選擇性標(biāo)記。合適的選擇性標(biāo)記包括抗藥性標(biāo)記如四環(huán)素或慶大霉素，或者可檢測(cè)的基因標(biāo)記如β-半乳糖苷酶或熒光素酶。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該分離的DNA或RNA分子包含SEQID NO1-187中示出的任何一個(gè)微小RNA序列或發(fā)夾前體序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該分離的DNA或RNA分子包含SEQ ID NO281-466中示出的任何一個(gè)微小RNA序列或發(fā)夾前體序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該分離的DNA或RNA分子包含SEQ ID NO467-496中示出的任何一個(gè)微小RNA序列或發(fā)夾前體序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該分離的DNA或RNA分子包含SEQ ID NO497-548中示出的任何一個(gè)微小RNA序列或發(fā)夾前體序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該分離的DNA或RNA分子包含SEQ ID NO549-550中示出的任何一個(gè)微小RNA序列或發(fā)夾前體序列。
在本說(shuō)明書(shū)中，“分離的”是指該分子基本上不含其他的核酸?；旧喜缓渌暮怂崾侵冈摲肿拥闹辽偌s90％，優(yōu)選至少約95％，更優(yōu)選至少約98％不含其他核酸。
優(yōu)選地，該分子基本上是純的，這指分子不僅不含其他的核酸，而且不含在該分子的合成和分離中使用的其他材料。在合成中使用的材料包括例如酶。在分離中使用的材料包括例如凝膠，如SDS-PAGE。分子的至少約90％，優(yōu)選至少約95％，更優(yōu)選至少約98％不含這些材料。
微小RNA或發(fā)夾前體中的堿基序列是高度保守的。由于高度保守性，序列可來(lái)自任何哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括寵物動(dòng)物象狗和貓、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物象牛、馬和羊、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物象大鼠、小鼠和兔，以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物象猴子和人類。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人類或小鼠。
修飾的單鏈微小RNA分子 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種修飾的單鏈微小RNA分子。該修飾的單鏈微小RNA分子可以是上述微小RNA分子、發(fā)夾前體分子或其等同物中的任何一種，只是所述修飾的分子包括至少一個(gè)修飾的部分(即至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分)。在該實(shí)施例中，修飾的微小RNA分子包括最少10個(gè)部分，優(yōu)選最少13個(gè)，更優(yōu)選最少15個(gè)，甚至更優(yōu)選最少18個(gè)，最優(yōu)選最少21個(gè)部分。
修飾的微小RNA分子優(yōu)選包括最多50個(gè)部分，更優(yōu)選最多40個(gè)，甚至更優(yōu)選最多30個(gè)，最優(yōu)選最多25個(gè)，最理想是最多23個(gè)部分?？梢酝ㄟ^(guò)將上述任何一個(gè)最小值與上述任何一個(gè)最大值結(jié)合而獲得合適的部分的最小和最大數(shù)量的范圍。
每個(gè)修飾的部分均包含結(jié)合于主鏈單元的堿基。主鏈單元可以是能夠穩(wěn)定結(jié)合堿基且形成寡聚鏈的任何分子單元。在本說(shuō)明書(shū)中，修飾部分的主鏈單元不包括通常在天然存在的DNA或RNA分子中存在的主鏈單元。
這些修飾的微小RNA分子增強(qiáng)了對(duì)核酸酶的耐受性。因此，與僅包含未修飾的核糖核苷酸部分、僅包含未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或同時(shí)包含二者的序列相比，該分子對(duì)核酸酶的耐受性增加。這些修飾的部分在本領(lǐng)域中是熟知的，并且在例如Kurreck的Eur.J.Biochem.270，1628-1644(2003)中已經(jīng)加以綜述。
耐受的核酸酶可以是核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶或者二者均有。核酸外切酶可以是3’→5’核酸外切酶或5’→3’核酸外切酶。3’→5’人類核酸外切酶的實(shí)例包括PNPT1、沃納綜合征螺旋酶(Wernersyndrome helicase)、RRP40、RRP41、RRP42、RRP45和RRP46。5’→3’核酸外切酶的實(shí)例包括XRN2和FEN1。核酸內(nèi)切酶的實(shí)例包括Dicer、Drosha、RNase4、核糖核酸酶P、核糖核酸酶H1、DHP1、ERCC-1和OGG1。既可以發(fā)揮核酸外切酶又可以發(fā)揮核酸內(nèi)切酶作用的核酸酶實(shí)例包括APE1和EXO1。
修飾的部分可以存在于微小RNA分子中的任何位置。例如，為了保護(hù)微小RNA分子免受3’→5’核酸外切酶的作用，該分子可以在分子的3’端具有至少一個(gè)修飾的部分，優(yōu)選在3’端具有至少兩個(gè)修飾的部分。如果期望保護(hù)分子免受5’→3’核酸外切酶的作用，微小RNA分子可以在該分子的5’端具有至少一個(gè)修飾的部分，優(yōu)選至少兩個(gè)修飾的部分。為了增加該分子對(duì)核酸內(nèi)切酶的耐受性，微小RNA分子還可以在分子的5’和3’端之間具有至少一個(gè)修飾的部分，優(yōu)選至少兩個(gè)修飾的部分。優(yōu)選地，至少約10％、更優(yōu)選至少約25％、甚至更優(yōu)選至少約50％、進(jìn)一步更加優(yōu)選至少約75％、最優(yōu)選至少約95％的部分是被修飾的。在一個(gè)實(shí)施例中，所有部分都是被修飾(例如，耐核酸酶的)。
在一個(gè)修飾的微小RNA分子的實(shí)例中，該分子包含至少一個(gè)修飾的脫氧核糖核苷酸部分。適合的修飾的脫氧核糖核苷酸部分在本領(lǐng)域中是已知的。這些修飾的脫氧核糖核苷酸部分包括例如作為主鏈單元的硫代磷酸脫氧核糖基團(tuán)。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)1。包含硫代磷酸(酯)(phosphoroamidate)脫氧核糖核苷酸部分的修飾的微小RNA分子通常稱為硫代磷酸(PS)DNA。參見(jiàn)例如Eckstein，Antisense Nucleic Acids Drug Dev.10，117-121(2000)。
修飾的脫氧核糖核苷酸部分的另一個(gè)合適的實(shí)例是N’3-N’5氨基磷酸(酯)(phosphoroamidate)脫氧核糖核苷酸部分，它包含作為主鏈單元的N’3-N’5氨基磷酸脫氧核糖基團(tuán)。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)2。包含氨基磷酸脫氧核糖核苷酸部分的寡核苷酸分子通常稱為氨基磷酸(NP)DNA。參見(jiàn)例如Gryaznov et al.，J.Am.Chem.Soc.116，3143-3144(1994)。
在另一個(gè)修飾的微小RNA分子的實(shí)例中，該分子包括至少一個(gè)修飾的核糖核苷酸部分。修飾的核糖核苷酸部分的一個(gè)合適的實(shí)例是在2’位置的核糖核苷酸部分被取代。2’位置的取代基可以是例如C1至C4烷基基團(tuán)。C1至C4烷基基團(tuán)可以是飽和或非飽和的，直鏈的或支鏈的。C1至C4烷基基團(tuán)的一些實(shí)例包括乙基、異丙基及烯丙基。優(yōu)選的C1至C4烷基基團(tuán)是甲基。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)3。包含在2’位置用C1至C4烷基基團(tuán)取代的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常被稱為2’-O-(C1-C4烷基)RNA，例如2’-O-甲基RNA(OMe RNA)。
修飾的核糖核苷酸部分在2’位置的取代基的另一個(gè)合適的實(shí)例是C1至C4烷氧基-C1至C4烷基基團(tuán)。C1至C4烷氧基(烷基氧)和C1至C4烷基基團(tuán)可包含上述烷基基團(tuán)中的任何一個(gè)。優(yōu)選的C1至C4烷氧基-C1至C4烷基基團(tuán)是甲氧乙基。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)4。包含多于一個(gè)的在2’位置用C1至C4烷氧基-C1至C4烷基基團(tuán)取代的核糖核苷酸部分的寡核苷酸分子被稱為2’-O-(C1至C4烷氧基-C1至C4烷基)RNA，例如2’-O-甲氧乙基RNA(MOE RNA)。
修飾的核糖核苷酸部分的另一個(gè)合適的實(shí)例是在2’氧原子和4’碳原子之間具有一個(gè)亞甲基橋的核糖核苷酸。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)5。包含具有在2’氧原子和4’碳原子之間的亞甲基橋的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常被稱為鎖核酸(LNA)。參見(jiàn)例如Kurreck et al.，Nucleic Acids Res.30，1911-1918(2002)；Elayadi et al.，Curr.Opinion Invest.Drugs 2，558-561(2001)；Φ rum et al.，Curr.Opinion Mol.Ther.3，239-243(2001)；Koshkin et al.，Tetrahedron 54，3607-3630(1998)；Obika et al.，Tetrahedron Lett.39，5401-5404(1998)。鎖核酸可從Proligo(Paris，F(xiàn)rance和Boulder，Colorado，USA)購(gòu)得。
修飾的核糖核苷酸部分的另一個(gè)合適的實(shí)例是在2’位置用氟基取代的核糖核苷酸。這種2’-氟代核糖核苷酸部分在本領(lǐng)域中是已知的。含有2’-氟代核糖核苷酸部分的分子在本文中通常稱為2’-氟代核糖核酸(FANA)。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)7，Damha etal.，J.Am.Chem.Soc.120，12976-12977(1998)。
在修飾的微小RNA分子的另一個(gè)實(shí)例中，該分子包括至少一個(gè)修飾的部分，該修飾的部分包含結(jié)合于作為主鏈單元的氨基酸殘基的堿基。具有至少一個(gè)結(jié)合于氨基酸殘基的堿基的修飾部分在本文中被稱為肽核酸(PNA)部分。這些部分是對(duì)核酸酶耐受的，而且在本領(lǐng)域中是已知的。具有PNA部分的分子通常稱為肽核酸。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)6。Nielson，Methods Enzymo.313，156-164(1999)；Elayadi，et al，id.；Braasch et al.，Biochemistry 41，4503-4509(2002)，Nielsen et al.，Science 254，1497-1500(1991)。
氨基酸可以為任何氨基酸，包括天然的或非天然的氨基酸。天然存在的氨基酸包括例如蛋白質(zhì)中通常存在的20種最常見(jiàn)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Glu)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。
非天然氨基酸可以包括例如烷基、芳基或烷芳基。烷基氨基酸的一些實(shí)例包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸以及ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些實(shí)例包括鄰-、間-及對(duì)-氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些實(shí)例包括鄰-、間-及對(duì)-氨基苯乙酸以及γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸還包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括例如將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)添加至天然存在的氨基酸。
例如，可將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)添加至苯丙氨酸或酪氨酸殘基芳環(huán)的2’、3’、4’、5’或6’位置或者色氨酸殘基苯環(huán)的4’、5’、6’或7’位置中的一個(gè)或多個(gè)位置上。該基團(tuán)可以是可添加至芳環(huán)的任何化學(xué)基團(tuán)。這些基團(tuán)的一些實(shí)例包括羥基、C1-C4烷氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基、硝基、鹵素(即氟、氯、溴或碘)或者支鏈的或直鏈的C1-C4烷基如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基。
作為天然存在的氨基酸衍生物的非天然存在氨基酸的其他實(shí)例包括正纈氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)和羥脯氨酸(Hyp)。
氨基酸可以是彼此相同或不同的。堿基通過(guò)分子連接鍵連接于氨基酸單元。連接的實(shí)例是亞甲基羰基、乙烯羰基以及乙基連接。(Nielsen et al.，Peptide Nucleic Acids-Protocols and Applications，Horizon Scientific Press，pages 1-19；Nielsen et al.，Science 2541497-1500)。PNA部分的氨基酸殘基的一個(gè)實(shí)例是N-(2-氨乙基)-甘氨酸。
PNA部分的其他實(shí)例包括環(huán)己基PNA、反向PNA(retro-inversoPNA)、磷酸PNA(phosphone PNA)、丙酰PNA和氨基脯氨酸PNA部分。對(duì)這些PNA部分的描述，可參見(jiàn)Nielsen et al.，Peptide NucleicAcids-Protocols and Applications，Horizon Scientific Press，1-19頁(yè)的圖5。Nielsen et al.第7頁(yè)上的圖5以引用形式結(jié)合于此。
PNA可以利用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行化學(xué)合成，例如利用改良的Fmoc或tBoc肽合成方案。PNA具有多種理想的性質(zhì)包括高解鏈溫度(Tm)、與核酸的高度堿基配對(duì)特異性以及不帶電的分子主鏈。此外，PNA不賦予RNA酶H對(duì)靶RNA的敏感性，并且通常具有良好的代謝穩(wěn)定性。
肽核酸也可從Applied Biosystems(Foster City，California，USA)購(gòu)得。
在修飾的微小RNA分子的另一個(gè)實(shí)例中，該分子包含至少一個(gè)嗎啉代氨基磷酸核苷酸部分。包含嗎啉代氨基磷酸核苷酸部分的分子通常稱為嗎啉代(MF)核酸。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)8。Heasman，Dev.Biol.243，209-214(2002)。嗎啉代寡核苷酸可從Gene Tools LLC(Corvallis，Oregon，USA)購(gòu)得。
在修飾的微小RNA分子的另一個(gè)實(shí)例中，該分子包含至少一個(gè)環(huán)己烯(cyclohexene)核苷酸部分。包含環(huán)己烯核苷酸部分的分子通常稱為環(huán)己烯核酸(CeNA)。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)10。Wangetal.，J.Am.Chem.Soc.122，8595-8602(2000)，Verbeure et al.，Nucleic Acids Res.29，4941-4947(2001)。
在修飾的微小RNA分子的最后一個(gè)實(shí)例中，該分子包含至少一個(gè)三環(huán)核苷酸部分。包含三環(huán)核苷酸部分的分子通常稱為三環(huán)核酸(tcDNA)。見(jiàn)圖1中的結(jié)構(gòu)9。Steffens et al.，J.Am.Chem.Soc.119，11548-11549(1997)，Renneberg et al.，J.Am.Chem.Soc.124，5993-6002(2002)。
該分子可以為嵌合的修飾的微小RNA分子。在本領(lǐng)域中，包含上述任何部分的混合物的嵌合分子也是已知的，而且可以利用本領(lǐng)域中已知方法進(jìn)行制備。見(jiàn)例如上面引用的參考文獻(xiàn)以及Wangetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，13989-13994(1999)，Liangetal.，Eur.J.Biochem.269，5753-5758(2002)，Lok et al.，Biochemistry 41，3457-3467(2002)和Damha et al.，J.Am.Chem.Soc.120，12976-12977(2002)。
本發(fā)明的修飾的微小RNA分子包括至少10個(gè)、優(yōu)選至少13個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、甚至更優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有SEQ ID NO1-94、SEQ ID NO281-374、SEQ IDNO467-481、SEQ ID NO497-522或SEQ ID NO549中示出的天然存在的微小RNA分子的連續(xù)堿基序列中的任何一個(gè)，只是該修飾的分子包含至少一個(gè)修飾的部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該修飾的微小RNA分子包含SEQ ID NO1-94、SEQ ID NO281-374、SEQID NO467-481、SEQ ID NO497-522或SEQ ID NO549中示出的任何微小RNA分子的完整序列。
只要分子中的部分的總數(shù)不超過(guò)50個(gè)，可將具有任何堿基序列的任何數(shù)量的附加部分(最高達(dá)到40個(gè)部分)插入至包含連續(xù)堿基序列的部分。附加部分可以插入至連續(xù)序列的5’端、3’端或兩端。該附加的部分可以包括微小RNA出現(xiàn)的發(fā)夾前體或任何其片段在5’端的堿基序列和/或在3’端的堿基序列。分子中的附加部分，如果需要，可以為上述的修飾的或未修飾的部分。
修飾的微小RNA分子包括其等同物。等同物包括上述的搖擺堿基和非互補(bǔ)堿基。
此外，不超過(guò)50％，優(yōu)選不超過(guò)30％的連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元。例如，表C和D示出了19-23個(gè)連續(xù)堿基的脫氧核糖核苷酸主鏈單元的最大數(shù)量。
在另一個(gè)實(shí)施例中，除了上述搖擺堿基對(duì)和非互補(bǔ)堿基，對(duì)應(yīng)于天然存在的微小RNA序列的位置11的部分可以為插入的、缺失的或錯(cuò)配的。
如上文所定義的，修飾的微小RNA分子優(yōu)選是分離的，更優(yōu)選是純化的。
表C.包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元的50％的連續(xù)部分 表D.包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元的30％的連續(xù)部分 在另一個(gè)實(shí)施例中，為了增加上述本發(fā)明的修飾的微小RNA分子或分離的DNA或RNA分子對(duì)核酸酶的耐受性，可將帽結(jié)構(gòu)連接到分子的一個(gè)末端、兩個(gè)末端和/或兩個(gè)末端之間。增加對(duì)例如核酸外切酶和/或核酸內(nèi)切酶的耐受性是需要的。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于增加對(duì)核酸酶耐受性的帽結(jié)構(gòu)均可以采用。
這些帽結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括反向核苷酸帽(inverted nucleotide cap)和化學(xué)帽。反向核苷酸帽可以連接到5’和/或3’端?；瘜W(xué)帽可以連接到該分子的一個(gè)末端、兩個(gè)末端和/或兩個(gè)末端之間。
反向核苷酸帽是指連接到修飾的微小RNA分子或者DNA或RNA分子的5’和/或3’端的3’→5’核酸序列。反向帽中的核苷酸最大數(shù)量不存在限制，只要它不干擾微小RNA分子或分離的DNA或RNA分子結(jié)合到它的靶mRNA即可。任何核苷酸可用于反向核苷酸帽中。通常，核苷酸帽長(zhǎng)度少于約40個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度少于約30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度少于約20個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選長(zhǎng)度少于約10個(gè)核苷酸。典型地，反向核苷酸帽長(zhǎng)度為1個(gè)核苷酸。用于反向帽的核苷酸通常為胸腺嘧啶，但可以是任何核苷酸如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶。
化學(xué)帽是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于增加核酸的核酸酶耐受性的任何化學(xué)基團(tuán)。這種化學(xué)帽的實(shí)例包括羥烷基(烷基氫氧化物)或者氨烷基(烷基胺類)。羥烷基有時(shí)稱為烷二醇基(例如乙二醇)。氨烷基有時(shí)稱為氨基連接物(amino linker)。
羥烷基或氨烷基中的烷基鏈可以為直鏈或支鏈。存在于烷基鏈中的碳原子的最小數(shù)量是1個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，甚至更優(yōu)選至少約3個(gè)碳原子。
存在于烷基鏈中的碳原子的最大數(shù)量為約18個(gè)，優(yōu)選約16個(gè)，更優(yōu)選約12個(gè)。典型的烷基基團(tuán)包括甲基、乙基和丙基。烷基可以進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)羥基和/或氨基取代。
氨基連接劑的一些實(shí)例示于表E中。表E中列出的氨基連接物可從TriLink Biotechnologies，San Diego，CA購(gòu)得。
分離的微小RNP 另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的微小RNP，該分離的微小RNP包含上述任何分離的DNA或RNA分子或上述修飾的微小RNA分子。微小RNP中的上述分離的DNA或RNA分子或修飾的微小RNA分子可以結(jié)合到蛋白質(zhì)。
這些蛋白質(zhì)的實(shí)例包括那些屬于Ago族系的蛋白。Ago族系的蛋白質(zhì)實(shí)例包括Ago1、2、3和4。典型地，Ago2蛋白質(zhì)與微小RNA復(fù)合體在RNAi中引導(dǎo)靶mRNA切割，而Ago1、3和4阻遏靶mRNA的翻譯。
抗微小RNA分子 另一方面，本發(fā)明提供了一種抗微小RNA分子。該抗微小RNA的分子可以為上述任何分離的DNA或RNA分子或上述修飾的微小RNA分子中的任何一種，只是抗微小RNA分子的堿基序列與分離的DNA或RNA分子或修飾的微小RNA分子中的堿基序列互補(bǔ)。
抗微小RNA分子序列的實(shí)例在表F、F1、F2、F3和F4中示出。
表E.來(lái)自TriLink Biotechnologies的氨基連接物 2’-脫氧胞苷-5-C6氨基連接物(3’末端) 2’-脫氧胞苷-5-C6氨基連接物(5’或內(nèi)部) 3’C3氨基連接物 3’C6氨基連接物 3’C7氨基連接物 5’C12氨基連接物 5’C3氨基連接物 5’C6氨基連接物 C7內(nèi)部氨基連接物 胸苷-5-C2氨基連接物(5’或內(nèi)部) 胸苷-5-C6氨基連接物(3’端) 胸苷-5-C6氨基連接物(內(nèi)部) 表F.表A中微小RNA的抗微小RNA序列 表F1.表A2中的微小RNA的抗微小RNA序列 表F2.表A4中的微小RNA的抗微小RNA序列 表F3.表A6中的微小RNA的抗微小RNA序列 表F4.表A8中的微小RNA的抗微小RNA序列 抗微小RNA分子可用上述的方法對(duì)修飾的微小RNA分子進(jìn)行修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，抗微小RNA分子中的連續(xù)部分與相應(yīng)的微小RNA分子互補(bǔ)。抗微小RNA分子的互補(bǔ)程度受到與上述修飾的微小RNA分子相同的限制的影響，包括與搖擺堿基對(duì)相關(guān)的限制以及與插入、缺失和錯(cuò)配相關(guān)的限制。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，如果抗微小RNA分子僅包含未修飾的部分，則該抗微小RNA分子在至少10個(gè)連續(xù)堿基中包含至少一個(gè)堿基，該至少一個(gè)堿基與微小RNA非互補(bǔ)和/或包含一個(gè)化學(xué)帽。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，如果抗微小RNA分子中的至少10個(gè)連續(xù)堿基與微小RNA分子完全(即100％)互補(bǔ)，則該抗微小RNA分子在至少10個(gè)連續(xù)堿基中包含至少一個(gè)修飾的部分和/或包含一個(gè)化學(xué)帽。
在另外一個(gè)實(shí)施例中，抗微小RNA分子中對(duì)應(yīng)于天然存在的微小RNA位置11的位置上的部分是非互補(bǔ)的。如上所述，通過(guò)引入插入、缺失或錯(cuò)配，可使得抗微小RNA分子中對(duì)應(yīng)于天然存在的微小RNA位置11的部分成為非互補(bǔ)的。
應(yīng)用 本發(fā)明的微小RNA分子和抗微小RNA分子具有多種體外、離體和體內(nèi)應(yīng)用。
例如，可將本發(fā)明的微小RNA分子和/或抗微小RNA分子引入細(xì)胞內(nèi)，以研究微小RNA的功能并從整體上研究微小RNA分子。
在一個(gè)實(shí)施例中，用合適的抗微小RNA分子抑制細(xì)胞內(nèi)的微小RNA?？商娲?，通過(guò)將一種或多種其他的微小RNA分子引入細(xì)胞內(nèi)，可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的微小RNA分子的活性。通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)與微小RNA活性的抑制或增強(qiáng)相關(guān)的變化可推斷出微小RNA的功能。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法。用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法包括將本發(fā)明的單鏈抗微小RNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。該微小RNP包含微小RNA分子。任何抗微小RNA分子均可用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法，只要抗微小RNA分子(受上述限制的影響)與存在于微小RNP中的微小RNA互補(bǔ)。
本發(fā)明的抗微小RNA分子通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞內(nèi)微小RNP中的微小RNA，能夠抑制微小RNP的活性。微小RNP的活性是指切割靶序列或阻遏靶序列的翻譯。靶序列可以是部分或完全與微小RNA內(nèi)的堿基序列互補(bǔ)的任何序列。
例如，本發(fā)明的微小RNA分子和抗微小RNA分子可以用作基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，該基因至少部分與抗微小RNA分子或微小RNA互補(bǔ)。例如，如果一個(gè)特定的微小RNA對(duì)細(xì)胞的存活是有益的，可將本發(fā)明合適的分離的微小RNA引入細(xì)胞以促進(jìn)其存活?？商娲兀绻粋€(gè)特定的微小RNA是有害的(例如誘導(dǎo)凋亡，誘導(dǎo)癌癥等)，為了抑制該微小RNA的活性并降低損傷，可將合適的抗微小RNA分子引入細(xì)胞。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將微小RNA分子和/或抗微小RNA分子引入細(xì)胞。例如，可將微小RNA分子和/或抗微小RNA分子直接注射入細(xì)胞，例如通過(guò)顯微注射?？商娲?，可將該分子與細(xì)胞接觸，優(yōu)選通過(guò)遞送系統(tǒng)的輔助。
有用的遞送系統(tǒng)包括例如脂質(zhì)體和帶電脂質(zhì)。脂質(zhì)體典型地在其水性中心內(nèi)包裹寡核苷酸分子。由于電荷相反，帶電脂質(zhì)大體上形成脂質(zhì)-寡核苷酸分子復(fù)合體。
這些脂質(zhì)體-寡核苷酸分子復(fù)合體或脂質(zhì)-寡核苷酸分子復(fù)合體通常利用內(nèi)吞作用而內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體或帶電脂質(zhì)通常包含輔助脂質(zhì)，該輔助脂質(zhì)可使內(nèi)體(endosomal)膜破裂并釋放寡核苷酸分子。
用于將微小RNA分子或抗微小RNA引入細(xì)胞的其他方法包括使用遞送載體如樹(shù)狀聚合物、可生物降解的聚合物、氨基酸的聚合物、糖的聚合物以及結(jié)合寡核苷酸的納米顆粒。此外，Pluronic膠(Pluronic gel)可作為一種儲(chǔ)存池(depot reservoir)用于在一個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)遞送抗微小RNA寡核苷酸分子。上述方法描述在例如Hughes et al.，Drug Discovery Today 6，303-315(2001)；Liang et al.，Eur.J.Biochem.269 5753-5758(2002)；以及Becker et al.，In AntisenseTechnology in the Central Nervous System(Leslie，R.A.，Hunter，A.J.& Robertson，H.A.，eds)，pp.147-157，Oxford University Press中。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，將微小RNA分子或抗微小RNA分子靶向特定細(xì)胞。例如，可將微小RNA分子或抗微小RNA分子結(jié)合到與細(xì)胞上的受體特異識(shí)別的抗體或配體上。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，將分子給予哺乳動(dòng)物。合適的給藥模式的一些實(shí)例包括口服給藥和系統(tǒng)給藥。系統(tǒng)給藥可以為腸內(nèi)或非腸道給藥。可采用液體或固體(例如片劑、凝膠膠囊)制劑。
分子的非腸道給藥包括例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下注射。例如，如在本領(lǐng)域中已知的，可通過(guò)持續(xù)釋放將分子給予哺乳動(dòng)物。持續(xù)釋放給藥是一種在特定的時(shí)間段內(nèi)達(dá)到一定藥物水平的藥物遞送方法。
其他給藥途徑包括口服、局部、支氣管內(nèi)或鼻內(nèi)給藥。對(duì)于口服給藥可采用液體或固體制劑。適于口服給藥的制劑的一些實(shí)例包括片劑、凝膠膠囊、丸劑、含片、酏劑、懸浮液、糖漿和薄片。支氣管內(nèi)給藥包括噴霧吸入劑。對(duì)于鼻內(nèi)給藥，本發(fā)明的分子的給藥可通過(guò)噴霧器或液體噴霧而實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的分子可存在于合適的藥用載體中。在本說(shuō)明書(shū)中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，認(rèn)為藥用載體與運(yùn)載體或賦形劑同義。載體實(shí)例包括淀粉、乳劑、糖、某些類型的粘土、凝膠、硬脂酸或其鹽類、硬脂酸鎂或鈣、滑石粉、植物脂肪或油、樹(shù)膠和乙二醇。
藥用載體還可包含下列物質(zhì)中的一種或多種穩(wěn)定劑、表面活性劑，優(yōu)選非離子型表面活性劑以及可選地鹽和/或緩沖劑。
穩(wěn)定劑可以是例如氨基酸如甘氨酸；或寡糖如蔗糖、四糖(tetralose)、乳糖或葡聚糖?？商娲兀€(wěn)定劑可以是糖醇如甘露醇；或其組合。優(yōu)選地，穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的組合構(gòu)成該分子重量的從約0.1％至約10％的重量。
表面活性劑優(yōu)選為非離子型表面活性劑例如聚山梨醇酯(polysorbate)。合適的表面活性劑的一些實(shí)例包括Tween20、Tween80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙二醇，例如從約0.001％(w/v)至約10％(w/v)的Pluronic F-68。
鹽或緩沖劑可以是任何鹽或緩沖劑，例如分別為氯化鈉或磷酸鈉/鉀鹽。優(yōu)選地，緩沖劑將本發(fā)明分子的pH維持在約5.5至約7.5的范圍內(nèi)。該鹽和/或緩沖劑對(duì)于將滲透壓維持在適于哺乳動(dòng)物給藥的水平也很有用。優(yōu)選地，鹽或緩沖劑以約150mM至約300mM的大致等滲的濃度存在。
藥用載體還可以包含一種或多種常規(guī)添加劑。這些添加劑的一些實(shí)例包括助溶劑例如甘油；抗氧化劑例如苯扎氯銨(季銨化合物的混合物，稱為“夸脫”)、苯甲醇、三氯叔丁醇或氯丁醇；麻醉劑例如嗎啡衍生物；或等滲劑等，如上所述。為了進(jìn)一步預(yù)防氧化或其他變質(zhì)，分子可以在具有氣密性塞子的密封瓶子中在氮?dú)鈼l件下保存。
本發(fā)明的微小RNA分子和/或抗微小RNA分子的另一種體外應(yīng)用是作為診斷工具使用的。出于這個(gè)目的，可以對(duì)微小RNA分子和/或抗微小RNA分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明的分子可以按照本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行標(biāo)記。例如，已經(jīng)描述了標(biāo)記寡核苷酸的方法，如Leary et al.，1983.Proc.Nat..Acid.Sci.USA 804045；Renz and Kurz 1984.Nuc..Acids Res.123435；Richardson and Gumport 1983.Nuc..AcidsRes.116167；Smith et al.1985.Nuc..Acids Res.132399；Meinkoth and Wahl，Anal.1984.Biochem.138267；and Ausubel，F(xiàn).M.et al.(Eds.)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1999，每個(gè)均以引用的方式結(jié)合于此。
標(biāo)記可以是放射活性的。有用的放射活性標(biāo)記的一些實(shí)例包括32P、125I、131I、35S、14C和3H。放射活性標(biāo)記的應(yīng)用已經(jīng)描述在U.K.2,034,323、U.S.4,358,535和U.S.4,302,204中。
非放射活性標(biāo)記的一些實(shí)例包括酶和生色團(tuán)。有用的酶標(biāo)記物包括在底物中引起可檢測(cè)到的變化的酶。一些有用的酶及其底物包括例如辣根過(guò)氧化物酶(連苯三酚和鄰苯二胺)、β-半乳糖苷酶(熒光素-β-D-吡喃半乳糖苷)以及堿性磷酸酶(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/硝基四唑藍(lán))。酶標(biāo)記的使用已經(jīng)描述在U.K.2,019,404，EP63,879in Ausubel，F(xiàn).M.et al.(Eds.)，Rotman 1961.Proc.Natl.Acad.Sci.USA471981-1991，and by Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.，New York(1999)。
有用的生色團(tuán)包括例如熒光的、化學(xué)發(fā)光的以及生物發(fā)光的分子及染料。一些在本發(fā)明中有用的特異生色團(tuán)包括例如熒光素、羅丹明、Cy3、Cy5、德克薩斯紅、藻紅蛋白、傘形酮(7-羥基香豆素)、魯米諾(luminol)。
可使用本領(lǐng)域熟知的方法將標(biāo)記與本發(fā)明的分子結(jié)合。該標(biāo)記可以通過(guò)分子上的官能團(tuán)直接連接。探針可以包含或者可使其包含這樣的官能團(tuán)。一些合適的官能團(tuán)的實(shí)例包括例如氨基、羰基、巰基、馬來(lái)酰亞胺、異氰酸鹽(酯)、異硫氰酸鹽(酯)。
可替代地，可通過(guò)偶聯(lián)劑(例如二醛、碳二亞胺、二馬來(lái)酰亞胺等)的方式將標(biāo)記(如酶和生色分子)結(jié)合到分子上。還可借助于配體和受體的方式將標(biāo)記結(jié)合于分子，其中配體利用上述方法連接于分子，該受體則用于將配體結(jié)合到標(biāo)記物上。任何已知的配體-受體組合均是合適的。一些合適的配體-受體對(duì)包括例如生物素-親和素或-抗生物素蛋白鏈菌素和抗體-抗原。優(yōu)選生物素-親和素組合。
一些微小RNA表達(dá)在特異性組織或細(xì)胞中。下面在表G和表G1中示出了本發(fā)明的微小RNA在不同組織中的表達(dá)。表G和表G1以百分比示出了相對(duì)于每個(gè)特定文庫(kù)中已鑒定的微小RNA總數(shù)的相對(duì)克隆頻率。在表G和表G1中，特定微小RNA的表達(dá)延續(xù)了幾頁(yè)。
如果微小RNA在一種組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)比它在其他組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)多約3倍，優(yōu)選多約4倍，更優(yōu)選多約5倍，則認(rèn)為它在該組織或細(xì)胞類型中為特異性富集。例如，微小RNAhsa-mir-20b在B細(xì)胞源淋巴瘤BL41中表達(dá)(0.05％表達(dá))；在胚胎源細(xì)胞系/腫瘤NT2/D1中表達(dá)(0.37％表達(dá))、在NCCIT(0.72％表達(dá))和Hek(0.13％表達(dá))中表達(dá)；在小細(xì)胞腎上腺癌細(xì)胞系SW13(感染或不感染黃熱病病毒時(shí)，分別表達(dá)2.01％和2.93％)中表達(dá)以及在導(dǎo)管乳腺癌HCC38(0.09％表達(dá))中表達(dá)。認(rèn)為微小RNAhsa-mir-20b在小細(xì)胞腎上腺癌細(xì)胞系SW13中富集，因?yàn)樗谋磉_(dá)比它在其他組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)多約3倍。
因此，例如，本發(fā)明的抗微小RNA分子可作為探針以識(shí)別特定的組織或細(xì)胞類型。
此外，本發(fā)明的微小RNA分子和/或抗微小RNA分子可以用于微小RNA表達(dá)分析的微陣列中。例如，本發(fā)明的抗微小RNA分子可以標(biāo)記在微陣列中?？梢约尤牒形⑿NA的樣品并檢測(cè)雜交。這種微陣列可用于例如在診斷性分析中測(cè)定癌癥患者臨床樣品中的微小RNA表達(dá)，并有助于診斷和某些癌癥類型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的分期。
表G以％表示的相對(duì)于每個(gè)特定文庫(kù)已鑒定的微小RNA總數(shù)的相對(duì)克隆頻率。














表中的“-”表示0％。
表G1以％表示的相對(duì)于每個(gè)特定文庫(kù)已鑒定的微小RNA總數(shù)的相對(duì)克隆頻率。
















實(shí)施例 實(shí)施例1材料和方法 總RNA的分離、克隆和注解(annotation) 如前所述，從100-200μg的總RNA中分離出小RNA，并進(jìn)行克隆。注解是基于來(lái)自以下的信息GenBank(http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/)、人類tRNA序列數(shù)據(jù)集(http://rna.wustl.edu/GtRDB/Hs/Hs-seqs.html)、人類sn/snoRNA序列數(shù)據(jù)集(http://mbcr.bcm.tmc.edu/smallRNA/Database，snoRNA-LBME-dbathttp://www-snorna.biotoul.fr/index.php以及NONCODE v1 at http://noncode.bioinfo.org.cn/)、微小RNA注冊(cè)發(fā)行(registry release)的5.1版以及來(lái)自UCSC(http://genome.ucse.edu)的人類基因組集合17版的重復(fù)元件注解。
細(xì)胞系和組織 征得患者親屬的書(shū)面同意，患者死后2小時(shí)后對(duì)腦垂體進(jìn)行解剖。出于隱私原因，掩飾了患者的身份。人乳腺癌細(xì)胞系MCF7和SkBr3是Dr.Neal Rosen(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，NY)贈(zèng)送的，該細(xì)胞在補(bǔ)充了100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、4mM谷氨酰胺和10％熱滅活的胎牛血清的DMEF12培養(yǎng)基的1:1混合物中，在5％ CO2中37℃下孵育。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BE(2)-M17(ATCCCRL-2267)在補(bǔ)充了非必需氨基酸、10％熱滅活的胎牛血清的OptiMemF12培養(yǎng)基的1:1混合物中，在5％CO2中37℃下孵育。
實(shí)施例2新的miRNA基因的預(yù)測(cè) 我們通過(guò)使用保守性過(guò)濾器(conservation filters)以及發(fā)夾的結(jié)構(gòu)特征和折疊能(Folding energy)來(lái)預(yù)測(cè)微小RNA前體。我們將這些預(yù)測(cè)的序列與來(lái)自人類組織和細(xì)胞系的克隆結(jié)果進(jìn)行比較，并與其他哺乳動(dòng)物中已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的微小RNA序列進(jìn)行比較。在應(yīng)用相似性考慮時(shí)，我們遵循Rfam，其中，多于45％的人類記錄(human entries)得到了與其他哺乳動(dòng)物中的微小RNA相似性的支持。表1示出了已證實(shí)的預(yù)測(cè)。圖2A示出將miR-200簇?cái)U(kuò)展到包括一個(gè)另外的成員，該成員已經(jīng)通過(guò)從人類組織克隆而被證實(shí)，位于miR-200a下游約1000個(gè)核苷酸(表1)。圖2B證實(shí)了在miR-369附近鑒定出2種其他微小RNA基因，一個(gè)通過(guò)克隆證實(shí)，一個(gè)通過(guò)它與小鼠同系物的序列相似性而得到支持(表1)。
表1.已知微小RNA附近的預(yù)測(cè)微小RNA基因的支持證據(jù) 通過(guò)克隆支持的預(yù)測(cè)的微小RNA基因
1列出了前體的坐標(biāo)。當(dāng)預(yù)測(cè)的miRNA位于已知的miRNA簇附近時(shí)，列出整個(gè)簇的坐標(biāo)，從第一個(gè)miRNA前體的起始坐標(biāo)到最后一個(gè)miRNA前體的終末坐標(biāo)。
2染色體號(hào)、鏈和坐標(biāo)取自UCSC的2003年7月的人類基因組的build34(hg16)(http://genome.ucsc.edu)。
3預(yù)測(cè)的miRNA坐標(biāo)位于與已知簇成員相同的染色體和鏈上。
4給克隆的miRNA起了新的名稱。當(dāng)來(lái)自前體主干(stem)兩側(cè)的miRNA被鑒定且與我們的預(yù)測(cè)相符，它們則帶3p和5p進(jìn)行命名。
5存在利用相似性的三種類型的支持證據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA或RNA分子，所述分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，所述連續(xù)的堿基具有在SEQ IDNO1-94中示出的微小RNA中的一種序列，只是達(dá)到30％的所述堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的所述連續(xù)的堿基可以是非互補(bǔ)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的分子，進(jìn)一步包括出現(xiàn)在SEQ ID NO95-187或其任何片段中示出的發(fā)夾前體序列中的5’端堿基序列和/或3’端堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分離的分子，其中所述發(fā)夾前體序列是微小RNA出現(xiàn)在其中的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的分子，其中所述微小RNA被整合入一種載體中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的分子，其中所述分離的分子是一種DNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的分子，其中所述分離的分子是一種RNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的分子，其中所述分離的分子進(jìn)一步包括一個(gè)帽結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種分離的分子，其中所述帽結(jié)構(gòu)是反向核苷酸帽。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種分離的分子，其中所述帽結(jié)構(gòu)是化學(xué)帽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的分子，其中所述分離的分子包括SEQ ID NO1-94中示出的微小RNA序列中的任何一個(gè)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的分子，其中所述分離的分子包括SEQ ID NO1-187中示出的序列中的任何一個(gè)。
12.一種修飾的單鏈微小RNA分子，所述修飾的單鏈微小RNA分子在一個(gè)分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的一個(gè)堿基，其中
至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ ID NO1-94中示出的微小RNA分子中的連續(xù)的堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的所述堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且
至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種分子，進(jìn)一步包括出現(xiàn)在SEQ IDNO95-187或其任何片段中示出的任何一種發(fā)夾前體序列的5’端的堿基序列和/或3’端的堿基序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種分子，其中所述發(fā)夾前體序列是微小RNA出現(xiàn)在其中的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種分子，其中所述分子被修飾以增強(qiáng)對(duì)核酸酶的耐受性。
16.一種分離的單鏈抗微小RNA分子，所述分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分包含一個(gè)結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中
至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ ID NO1-94中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；以及
所述分子能夠抑制微小RNP的活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中在對(duì)應(yīng)于微小RNA的位置11的位置上的部分是非互補(bǔ)的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中達(dá)到5％的所述連續(xù)部分與微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列是非互補(bǔ)的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種分子，其中非互補(bǔ)部分為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，該分子具有表F中示出的抗微小RNA序列中的任何一個(gè)。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的至少一個(gè)是修飾的脫氧核糖核苷酸部分。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種分子，其中所述修飾的脫氧核糖核苷酸是硫代磷酸脫氧核糖核苷酸部分。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種分子，其中所述修飾的脫氧核糖核苷酸是N’3-N’5氨基磷酸脫氧核糖核苷酸部分。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的至少一個(gè)是修飾的核糖核苷酸部分。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的一種分子，其中所述修飾的核糖核苷酸在2’位置被取代。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的一種分子，其中在所述2’位置的取代基是C1至C4烷基。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的一種分子，其中所述烷基是甲基。
28.根據(jù)權(quán)利要求28所述的一種分子，其中所述烷基是烯丙基。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的一種分子，其中在所述2’位置的取代基是C1至C4烷氧基-C1至C4烷基。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的一種分子，其中所述C1至C4烷氧基-C1至C4烷基是甲氧乙基。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的一種分子，其中所述修飾的核糖核苷酸在2’氧原子和4’碳原子之間具有一個(gè)亞甲基橋。
32.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的至少一個(gè)是肽核酸部分。
33.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的至少一個(gè)是2’-氟代核糖核苷酸部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的至少一個(gè)是嗎啉代氨基磷酸核苷酸部分。
35.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的至少一個(gè)是三環(huán)核苷酸部分。
36.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的至少一個(gè)是環(huán)己烯核苷酸部分。
37.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述分子是嵌合分子。
38.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述分子包括至少一個(gè)修飾的部分以增強(qiáng)對(duì)核酸酶的耐受性。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的一種分子，其中所述核酸酶是一種核酸外切酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的一種分子，其中所述分子在5’端包含至少一個(gè)修飾的部分。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的一種分子，其中所述分子在5’端包含至少兩個(gè)修飾的部分。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的一種分子，其中所述分子在3’端包含至少一個(gè)修飾的部分。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的一種分子，其中所述分子在3’端包含至少兩個(gè)修飾的部分。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的一種分子，其中所述分子在5’端包含至少一個(gè)修飾的部分并且在3’端包含至少一個(gè)修飾的部分。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的一種分子，其中所述分子在5’端包含至少兩個(gè)修飾的部分并且在3’端包含至少兩個(gè)修飾的部分。
46.根據(jù)權(quán)利要求39所述的一種分子，其中所述分子在所述分子的5’端、3’端，或兩個(gè)末端包含一個(gè)帽結(jié)構(gòu)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的一種分子，其中所述分子包含一個(gè)化學(xué)帽。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的一種分子，其中所述分子包含一個(gè)反向核苷酸帽。
49.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述核酸酶是一種核酸內(nèi)切酶。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的一種分子，其中所述分子在5’端和3’端之間包含至少一個(gè)修飾的部分。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的一種分子，其中所述分子在5’端和3’端之間包含一個(gè)化學(xué)帽。
52.根據(jù)權(quán)利要求16所述的一種分子，其中所述部分的全部是耐核酸酶的。
53.一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法，所述微小RNP包含微小RNA分子，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求16所述的單鏈抗微小RNA分子引入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述抗微小RNA與所述微小RNA分子互補(bǔ)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的一種方法，對(duì)應(yīng)于所述微小RNA分子的位置11的位置處的所述抗微小RNA分子中的部分是非互補(bǔ)的。
55.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的DNA或RNA分子。
56.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的單鏈微小RNA分子。
57.一種分離的DNA或RNA分子，所述分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，所述連續(xù)的堿基具有在SEQ IDNO281-374中示出的微小RNA中的一種序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以是非互補(bǔ)的。
58.一種分離的DNA或RNA分子，所述分離的DNA或RNA分子包括至少10個(gè)連續(xù)的堿基，所述連續(xù)的堿基具有SEQ IDNO467-481中示出的微小RNA中的一種序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以是非互補(bǔ)的。
59.一種分離的DNA或RNA分子，所述分離的DNA或RNA分子包括至少10個(gè)連續(xù)的堿基，所述連續(xù)的堿基具有SEQ IDNO497-522中示出的微小RNA中的一種序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以是非互補(bǔ)的。
60.一種分離的DNA或RNA分子，所述分離的DNA或RNA分子包括至少10個(gè)連續(xù)的堿基，所述連續(xù)的堿基具有SEQ IDNO549中示出的微小RNA中的一種序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為搖擺堿基，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以是非互補(bǔ)的。
61.一種修飾的單鏈微小RNA分子，所述修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中
至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有與SEQ ID NO281-374中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的所述連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且
至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
62.一種修飾的單鏈微小RNA分子，所述修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中
至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有與SEQ ID NO467-481中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的所述連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且
至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
63.一種修飾的單鏈微小RNA分子，所述修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中
至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有與SEQ ID NO497-522中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的所述連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且
至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
64.一種修飾的單鏈微小RNA分子，所述修飾的單鏈微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，其中
至少10個(gè)連續(xù)的堿基具有與SEQ ID NO549中示出的微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列相同的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的所述連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且
至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
65.一種分離的單鏈抗微小RNA分子，所述分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中
至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ ID NO281-374中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且
所述分子能夠抑制微小RNP的活性。
66.一種分離的單鏈抗微小RNA分子，所述分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中
至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ ID NO467-481中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入、缺失、錯(cuò)配或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且
所述分子能夠抑制微小RNP的活性。
67.一種分離的單鏈抗微小RNA分子，所述分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中
至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ ID NO497-522中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且
所述分子能夠抑制微小RNP的活性。
68.一種分離的單鏈抗微小RNA分子，所述分離的單鏈抗微小RNA分子在分子主鏈上包含最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包含多個(gè)主鏈單元，每個(gè)部分均包含結(jié)合于一個(gè)主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成Watson-Crick堿基對(duì)，其中
至少10個(gè)連續(xù)堿基具有與SEQ ID NO549中示出的任何一個(gè)微小RNA分子中的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)的序列，只是達(dá)到30％的堿基對(duì)可以為搖擺堿基對(duì)，并且達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以為插入的、缺失的、錯(cuò)配的或其組合；
不超過(guò)50％的所述連續(xù)部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且
所述分子能夠抑制微小RNP的活性。
69.一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法，所述微小RNP包含微小RNA分子，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求65所述的單鏈抗微小RNA分子引入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述抗微小RNA與所述微小RNA分子互補(bǔ)。
70.一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法，所述微小RNP包含微小RNA分子，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求66所述的單鏈抗微小RNA分子引入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述抗微小RNA與所述微小RNA分子互補(bǔ)。
71.一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法，所述微小RNP包含微小RNA分子，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求67所述的單鏈抗微小RNA分子引入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述抗微小RNA與所述微小RNA分子互補(bǔ)。
72.一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法，所述微小RNP包含微小RNA分子，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求68所述的單鏈抗微小RNA分子引入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述抗微小RNA與所述微小RNA分子互補(bǔ)。
73.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求57所述的分離的DNA或RNA分子。
74.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求58所述的分離的DNA或RNA分子。
75.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求59所述的分離的DNA或RNA分子。
76.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求60所述的分離的DNA或RNA分子。
77.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求61所述的分離的單鏈微小RNA分子。
78.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求62所述的分離的單鏈微小RNA分子。
79.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求63所述的分離的單鏈微小RNA分子。
80.一種分離的微小RNP，所述分離的微小RNP包含根據(jù)權(quán)利要求64所述的分離的單鏈微小RNA分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的DNA或RNA分子，該分離的DNA或RNA分子包含至少10個(gè)連續(xù)的堿基，該連續(xù)的堿基具有在SEQ ID NO1-94、281-374、467-481、497-522或549中示出的微小RNA中的一種序列，只是達(dá)到30％的堿基可以為搖擺堿基以及達(dá)到10％的連續(xù)堿基可以是非互補(bǔ)的。本發(fā)明還涉及修飾的單鏈微小RNA分子、分離的單鏈抗微小RNA分子和分離的微小RNP分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種用于抑制細(xì)胞內(nèi)微小RNP活性的方法。
文檔編號(hào)C07H21/02GK101535331SQ200680021938
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2006年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者托馬斯·圖斯赫爾, 巴勃羅·蘭德格拉夫 申請(qǐng)人:洛克菲勒大學(xué)