專(zhuān)利名稱：：使用修飾的成孔蛋白治療或預(yù)防良性前列腺增生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及良性前列腺肥大領(lǐng)域，且特別涉及修飾的成孔蛋白用于治療良性前列腺增生(BPH)的用途。
背景技術(shù)：
：許多溶細(xì)胞蛋白已有描述(Lesieur等，Mol.Membr.Biol.14:45064,1997)。這些天然存在的細(xì)胞毒蛋白包括哺乳動(dòng)物蛋白(例如穿孔素)，和細(xì)菌蛋白，例如氣單胞菌溶素(由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydr叩hila)產(chǎn)生)、a-溶血素(由金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)產(chǎn)生)、a-毒素(由敗血梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsepticum)產(chǎn)生)、S-毒素(由蘇蕓金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)產(chǎn)生)、炭疽保護(hù)性抗原、霍亂弧菌(Vibriocholerae)VCC毒素、葡萄球菌(Staphylococcus)殺白細(xì)胞素、硫磺菌(Laetiporussulphureus)的LSL毒素、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridiumperfringens)的"毒素，以及剌胞動(dòng)物(Cnidariaspp)產(chǎn)生的水螅溶素(hydralysin)。這些細(xì)胞毒蛋白中的某些，例如氣單胞菌溶素原(proaerolysin)和仏毒素，作為無(wú)活性的毒素原合成。這些毒素原含有不連續(xù)的官能團(tuán)，所述官能團(tuán)包括使得毒素原與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域、毒素結(jié)構(gòu)域，以及或者是含有蛋白酶切割位點(diǎn)的N末端或C末端抑制性肽結(jié)構(gòu)域。蛋白酶切割位點(diǎn)上的抑制性肽結(jié)構(gòu)域的切割使得毒素原活化，導(dǎo)致質(zhì)膜中的細(xì)胞毒素寡聚化，產(chǎn)生了導(dǎo)致快速的溶細(xì)胞性細(xì)胞死亡的孔(Rossjohn等，J.Struct.Biol.121:92-100,1998)?？椎男纬晌锢砩掀茐募?xì)胞膜，且在細(xì)胞周期的所有階段導(dǎo)致細(xì)胞死亡，包括非增殖性細(xì)胞(即G。阻滯)。這些細(xì)胞毒素對(duì)它們能夠殺傷的細(xì)胞類(lèi)型而言是非特異性的，這是因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向存在于大多數(shù)細(xì)胞上的分子，且它們通常由非細(xì)胞特異性的蛋白酶活化。溶細(xì)胞成孔蛋白或這些蛋白的修飾形式已被建議作為用于治療癌癥的潛在治療劑。例如，美國(guó)專(zhuān)利第5，777，078號(hào)描述了在細(xì)胞表面受到多種條件(包括蛋白水解)活化而溶解細(xì)胞的成孔劑。這些成孔劑通?？捎糜谄茐呐c動(dòng)物的病理狀況有關(guān)的非期望的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括，但不限于腫瘤細(xì)胞、病毒慢性感染的細(xì)胞，或當(dāng)被不適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)或表達(dá)時(shí)而導(dǎo)致疾病狀態(tài)的細(xì)胞，例如免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。wo98/020135描述了與被修飾而具有選擇性毒性的假單胞菌外毒素前蛋白有關(guān)的方法和組合物。通過(guò)在所述前蛋白中插入蛋白酶敏感性序列而使得此外毒素被修飾成由所需的蛋白酶活化。在一個(gè)實(shí)施例中，此外毒素被修飾成插入前列腺特異性抗原(PSA)切割位點(diǎn)，以用于靶向并殺傷前列腺癌細(xì)胞的目的。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第2004/0235095號(hào)描述了修飾的溶細(xì)胞成孔蛋白用于治療前列腺癌和其他癌癥的用途。此溶細(xì)胞蛋白可被修飾成包括前列腺特異性切割位點(diǎn)，和/或前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，并且可用于選擇性耙向并殺傷前列腺癌細(xì)胞。癌癥的特征為衍生自正常組織的異常細(xì)胞或贅生性細(xì)胞的數(shù)量增加，其增殖形成腫瘤塊，這些贅生性腫瘤細(xì)胞侵犯鄰近組織，并產(chǎn)生惡性細(xì)胞，所述惡性細(xì)胞最終通過(guò)血液或淋巴系統(tǒng)播散至區(qū)域淋巴結(jié)和通過(guò)所謂的轉(zhuǎn)移的過(guò)程播散至遠(yuǎn)距離部位。在癌性的狀態(tài)中，細(xì)胞在正常細(xì)胞不能生長(zhǎng)的條件下增殖。與正常細(xì)胞不同的是，癌細(xì)胞通常持續(xù)增殖，它們不特化或變得成熟，且它們具有從機(jī)體內(nèi)的起源組織向其他部位播散的能力。癌細(xì)胞的這些特征通常起因于與正常細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)模式相比這些細(xì)胞的基因表達(dá)相關(guān)模式的變化。開(kāi)發(fā)用于治療癌癥的治療劑的許多策略集中在利用正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間基因表達(dá)的差異，且使用癌細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物靶向癌細(xì)胞。相比較而言，良性前列腺增生(BPH，也稱為良性前列腺肥大)為非癌性病癥，其由前列腺生長(zhǎng)隨年齡自然進(jìn)展的增大所造成。前列腺增大可以是前列腺細(xì)胞增殖增加或前列腺細(xì)胞大小增加的結(jié)果。這種進(jìn)展性前列腺生長(zhǎng)通常直到生命晚期才引起問(wèn)題。國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)估計(jì)，60X的60多歲的美國(guó)男性具有一些BPH的癥狀，并且此病癥影響超過(guò)卯％的70多歲和80多歲的男性。世界上大約1億1千5百萬(wàn)的50歲年齡以上組的男性具有不同程度的BPH。由于人口的老齡化，預(yù)期患病率在以后的20年內(nèi)會(huì)顯著增加。嚴(yán)重的BPH可引起嚴(yán)重的問(wèn)題，例如尿路感染，膀胱和腎臟損壞，包括膀胱結(jié)石，尿失禁，且最嚴(yán)重的是梗阻性尿路病引起的肉眼血尿和腎衰竭。目前有幾種用于治療BPH的策略。這些包括觀察等待，醫(yī)學(xué)療法，例如a阻斷劑療法和非那司提(finasteride)療法，氣囊擴(kuò)張術(shù)和各種手術(shù)操作，例如經(jīng)尿道前列腺切開(kāi)術(shù)(TUIP)，經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)(TURP)，以及開(kāi)放性前列腺切除術(shù)。很少有治療方法不具有任何的不良后果，且特別是對(duì)于BPH的治療方法來(lái)說(shuō)更是如此，其中在可使用的治療方法的益處和缺點(diǎn)之間具有微妙的平衡方案。在釆用目前可使用的BPH治療方法后的不良事件包括陽(yáng)痿(對(duì)于各種手術(shù)操作來(lái)說(shuō)，大約4%至40%，在一些內(nèi)科治療之后陽(yáng)痿的發(fā)生率也增加)，尿失禁(手術(shù)后大約3%的壓迫性尿失禁，總體的尿失禁接近1。％)，以及需要復(fù)治。對(duì)于所公布的數(shù)據(jù)的綜合分析估計(jì)，TURP的手術(shù)期間死亡率(手術(shù)操作的90天內(nèi)死亡)的平均概率為1.5%。對(duì)于開(kāi)放性手術(shù)來(lái)說(shuō)，為2.4%，對(duì)于氣囊擴(kuò)張術(shù)來(lái)說(shuō)，為3.5%。目前，最常用的激素療法是口服施用非那司提。非那司提，可自Merck&Co.Inc.,WhitehouseStation,N丄以商業(yè)名稱ProscarTM商購(gòu)獲得，其為一種合成的4-氮雜類(lèi)固醇化合物，類(lèi)固醇II型5a-還原酶的特異性抑制劑，以及將雄激素睪酮轉(zhuǎn)化為5a-雙氫睪酮(DHT)的胞內(nèi)酶。非那司提有助于縮小增大的前列腺，并降低良性前列腺病癥導(dǎo)致的PSA升高。然而，據(jù)知非那司提引起非期望的副作用，包括陽(yáng)痿或性欲降低，射精的問(wèn)題，以及乳房增大，禾Q/或乳房壓痛。度他雄胺(Dutasteride，Duagen)是用于治療BPH的另一種藥物，它能夠阻斷I型和II型5a-還原酶。性副作用與非那司提的性副作用相似。目前，a-l腎上腺素受體阻斷劑也用于良性前列腺增生的臨床治療。其實(shí)例包括鹽酸坦索洛新、鹽酸特拉唑嗪、鹽酸阿夫唑嗪和甲磺酸多沙唑嗪。在施用a-l腎上腺素受體阻斷劑之后，BPH的癥狀減輕和尿流率的改善與膀胱頸和前列腺中的a-l腎上腺素受體的阻斷產(chǎn)生的平滑肌松弛有關(guān)。另外，植物甾醇和提取物也已用于治療良性前列腺增生。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040081659號(hào)描述了用于治療BPH的偶聯(lián)物，其包括1)帶有被PSA選擇并蛋白水解切割的氨基酸序列的寡肽，2)長(zhǎng)春花生物堿細(xì)胞毒素劑，1)與2)化學(xué)連接。理論上，此偶聯(lián)物中生物堿的細(xì)胞毒活性低，并當(dāng)連接鍵被PSA切割時(shí)增加。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0652014描述了一種BPH的治療方法，其包括施用與免疫原性載體連接的PSA(前列腺特異性抗原)，以誘導(dǎo)抗PSA抗體的產(chǎn)生。也可以使用抗PSA抗體。所述免疫原性載體可為破傷風(fēng)毒素、白喉毒素或霍亂毒素B鏈。美國(guó)專(zhuān)利第6,379,669號(hào)描述了一種將治療劑與抗體或其片斷偶聯(lián)而靶向特異性器官的方法。這些偶聯(lián)的治療劑(或免疫偶聯(lián)物)可用于治療前列腺癌、BPH或前列腺炎。所包括的免疫偶聯(lián)物為與不同生物活性劑連接的抗PSA的抗體。所述生物活性劑可以包括細(xì)菌毒素。相似地，在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20020001588號(hào)中，還探討了抗體和不同的生物活性治療劑的化學(xué)連接鍵。提供此
背景技術(shù)：
信息的目的是為了公開(kāi)申請(qǐng)人所相信與本發(fā)明可能相關(guān)的信息。不是打算承認(rèn)，而且也不應(yīng)該解釋為任何先前的信息構(gòu)成了抵觸本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種使用修飾的成孔蛋白治療或預(yù)防良性前列腺增生的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于減小受治療者的前列腺大小的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自能夠被前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性的靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于治療良性前列腺增生(BPH)的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自能夠被前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了修飾的成孔蛋白在制備用于減小受治療者的前列腺大小的藥劑中的用途，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自能夠被前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了修飾的成孔蛋白在制備用于治療良性前列腺增生(BPH)的藥劑中的用途，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自能夠被前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種減小受治療者的前列腺大小的方法，其包括給所述受治療者施用有效量的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自能夠被前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種治療受治療者的良性前列腺增生(BPH)的方法，其包括給所述受治療者施用有效量的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自能夠被前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其包括大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變和一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性修飾，所述前列腺特異性修飾選自能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域和能夠被前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列，其中所述修飾的氣單胞菌溶素原能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。在下述參考附圖的詳細(xì)說(shuō)明中，本發(fā)明的這些和其他特征將變得更加明顯。'圖1描述了氣單胞菌溶素原結(jié)構(gòu)域的示意圖(沒(méi)有按比例畫(huà))，并顯示了被弗林蛋白酶活化的結(jié)果。圖2描述了顯示溶血測(cè)定的結(jié)果的條形圖，其中MPP1與人血漿或添加有酶活性的PSA的人血漿(10,000ng/ml)預(yù)溫育。圖3描述了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案將幾種MPP的體外毒性與氣單胞菌溶素原的體外毒性進(jìn)行對(duì)比的曲線圖。MPP衍生自氣單胞菌溶素原，且包括置換天然弗林蛋白酶位點(diǎn)的PSA切割位點(diǎn)。圖4A-4E為示意圖(未按比例)，其顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，如何能將氣單胞菌溶素原蛋白改變以產(chǎn)生衍生自氣單胞菌溶素原的幾種不同的MPP。"*"符號(hào)表示一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，和/或一個(gè)或多個(gè)缺失，它們降低氣單胞菌溶素原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能(即在細(xì)胞膜中集中的能力)。圖4A描述了野生型氣單胞菌溶素原的示意圖。圖4B描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列。圖4C描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列。圖4D描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列和功能性缺失的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此功能性缺失的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變或一個(gè)或多個(gè)缺失產(chǎn)生。圖4E描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列和功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此功能性缺失的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域如圖4D所述產(chǎn)生。在該實(shí)施方案中，在MPP的N末端或MPP的毒素結(jié)構(gòu)域的C末端可以連接一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。圖5A描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列和功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變或一個(gè)或多個(gè)缺失修飾。一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域可任選地在Y215C或A300C處與MPP連接。圖5B描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列和功能性缺失的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氣單胞菌溶素原的一個(gè)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失而功能性缺失。圖5C描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列和功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在該實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域可與MPP的毒素結(jié)構(gòu)域的N末端或MPP的毒素結(jié)構(gòu)域的C末端連接。MPP的一個(gè)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域如圖5B所述缺失。圖5D描述了一種衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有被修飾成包括前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的活化序列和功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域可在Y215C或A300C處與MPP連接。MPP的一個(gè)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域如圖5B所述缺失。圖6A描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此MPP還包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。此MPP的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域因一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變或缺失而功能性缺失。圖6B描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此MPP還包括在Y215C或A300C處與氣單胞菌溶素原連接的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。此MPP的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域因一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變或缺失而功能性缺失。圖6C描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此MPP還包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。此天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域因氣單胞菌溶素原的一個(gè)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失而功能性缺失。圖6D描述了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的示意圖，其帶有功能性置換的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此MPP還包括在Y215C或A300C處與氣單胞菌溶素原連接的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。此天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域因氣單胞菌溶素原的一個(gè)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失而功能性缺失。圖7描述了野生型氣單胞菌溶素原的cDNA序列(SEQIDNO:l)。圖8描述了野生型氣單胞菌溶素原的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖9描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP1)的cDNA序列(SEQIDNO:3)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖10描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP1)的氨基酸序列(SEQIDNO:4)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖11描述了見(jiàn)于人精液凝固蛋白I和蛋白II的PSA切割位點(diǎn)的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。圖12描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP2)的cDNA序列(SEQIDNO:6)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖13描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP2)的氨基酸序列(SEQIDNO:7)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖14描述了PSA切割位點(diǎn)的一個(gè)例子(SEQIDNO:8)。圖15描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP3)的cDNA序列(SEQIDNO:9)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖16描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP3)的氨基酸序列(SEQIDNO:10)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖17描述了PSA切割位點(diǎn)的另一個(gè)例子(SEQIDNO:ll)。圖18描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP4)的cDNA序列(SEQIDNO:12)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖19描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP4)的氨基酸序列(SEQIDNO:13)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換。圖20-27描述了根據(jù)本發(fā)明另外的PSA切割位點(diǎn)的氨基酸序列(分別是SEQIDNO:14-21)。圖28描述了天然的促黃體激素釋放激素(LHRH)的氨基酸序列(SEQIDNO:22)。圖29描述了修飾的促黃體激素釋放激素(LHRH)的氨基酸序列(SEQIDNO:23)。圖30描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP6)的氨基酸序列(SEQIDNO.'24)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)被PSA切割位點(diǎn)置換，且氣單胞菌溶素原的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域被修飾。圖31描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP7)的氨基酸序列(SEQIDNO:25)，其中氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶位點(diǎn)保留，且氣單胞菌溶素原的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失并被SEQIDNO:23置換。圖32描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP5)在猴的前列腺中治療3天后的作用。A和B描述了單獨(dú)使用載體治療的對(duì)照猴的前列腺，C和D描述了使用1的MPP治療的猴的前列腺，E和F描述了使用5/xg的MPP治療的猴的前列腺，G和H描述了使用25/ig的MPP治療的猴的前列腺。圖33描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的MPP(MPP5)在猴的前列腺中治療15天后的作用。A和B描述了單獨(dú)使用載體治療的對(duì)照猴的前列腺，C和D描述了使用1/xg的MPP治療的猴的前列腺，E和F描述了使用5/xg的MPP治療的猴的前列腺，G和H描述了使用25/ig的MPP治療的猴的前列腺。圖34描述了MPP5的核苷酸序列(SEQIDNO:30)。ATG起始密碼子和TAA終止密碼子加有下劃線并用黑體表示。Hind111和EcoRI限制性位點(diǎn)為黑體文本。PSA切割位點(diǎn)加有下劃線，且6His標(biāo)簽為黑體斜體文本。圖35描述了MPP5的氨基酸序列(SEQIDNO:31)。此氨基酸序列衍生自圖34所示的核苷酸序列。427-432位氨基酸(PSA切割位點(diǎn))加有下劃線并用黑體表示。6His標(biāo)簽為黑體文本。圖36描述了通過(guò)洗滌的紅細(xì)胞的水解度測(cè)定的MPP5在前列腺組織片段的條件培養(yǎng)基中的活化。圖37描述了多種物種的血清切割MPP5的能力。圖38描述了MPP5對(duì)猴前列腺的作用。圖39描述了在猴中對(duì)施用MPP5的體液反應(yīng)。圖40描述了野生型敗血梭狀芽胞桿菌o;-毒素的核苷酸序列(SEQIDNO:73)。圖41描述了野生型敗血梭狀芽胞桿菌a-毒素的氨基酸序列(SEQIDNO:74)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及修飾的成孔蛋白用于治療BPH的用途。所述MPP衍生自天然存在的成孔蛋白(nPP)，所述天然存在的成孔蛋白通過(guò)插入靶細(xì)胞的細(xì)胞膜中并在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜中形成孔或通道而殺傷細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述MPP不可逆地插入細(xì)胞膜中，且由此使得旁觀細(xì)胞(bystandercell)不受影響。所述MPP包括前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾導(dǎo)致MPP具有相對(duì)于其他組織的細(xì)胞而選擇性靶向正常前列腺細(xì)胞的能力。所述MPP在體內(nèi)能夠選擇性殺傷正常前列腺細(xì)胞，并且在體內(nèi)能夠減小正常前列腺的重量或體積。因此，根據(jù)本發(fā)明，所述MPP可單獨(dú)使用或與其他療法結(jié)合使用用于治療BPH。這與美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040235095號(hào)所述的分子大不相同，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040235095號(hào)描述了修飾的溶細(xì)胞蛋白治療局限性前列腺癌或轉(zhuǎn)移性前列腺癌的用途。定義除非另有定義，本申請(qǐng)所使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。技術(shù)和操作通常根據(jù)本領(lǐng)域和各種常見(jiàn)的參考文獻(xiàn)的傳統(tǒng)方法進(jìn)行(通常參見(jiàn)Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，和Lakowicz,J.R.PrincipledofFluorescenceSpectroscopy,NewYork:PlenumPress(1983)forfluorescencetechniques)。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析，以及生物學(xué)測(cè)定。如貫穿公開(kāi)內(nèi)容所應(yīng)用的，下述術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為具有下述含義，除非另有指明。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"大約"是指正常值的+/-10%變化。應(yīng)理解，在本申請(qǐng)所提供的任何給定值中總是包括這種變化，不管是否特別提及。本申請(qǐng)?jiān)谔峒皩?shí)體(entity)或部分(moiety)時(shí)所使用的術(shù)語(yǔ)"前列腺特異性"是指實(shí)體/部分或?qū)嶓w/部分的性質(zhì)與其他細(xì)胞類(lèi)型相比時(shí)對(duì)于前列腺細(xì)胞的選擇性。例如，前列腺特異性實(shí)體/部分可選擇性地由前列腺細(xì)胞表達(dá)、選擇性地與前列腺細(xì)胞相關(guān)、選擇性地由前列腺細(xì)胞活化、能夠選擇性地結(jié)合前列腺細(xì)胞，等等。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"前列腺特異性活化序列"是指摻入一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸殘基的序列，其被前列腺特異性蛋白酶選擇性切割或水解。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域"是指諸如肽配體、毒素或抗體的分子，當(dāng)與其結(jié)合其他細(xì)胞類(lèi)型的能力相比時(shí)，能夠選擇性結(jié)合前列腺細(xì)胞。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"基因"是指編碼各蛋白或RNA的核苷酸片段(也稱為"編碼序列"或"編碼區(qū)")，連同可位于所述編碼序列的上游或下游的相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)，例如啟動(dòng)子、操縱子、終止子等。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"選擇性雜交"是指核苷酸可檢測(cè)地和特異性地與另一核苷酸結(jié)合的能力。多核苷酸、寡核苷酸及其片段與靶核苷酸鏈在最小化可檢測(cè)地結(jié)合非特異性核苷酸的可評(píng)估量的雜交和洗漆條件下選擇性地雜交。高嚴(yán)緊性條件可用于獲得如本領(lǐng)域已知和本申請(qǐng)所述的選擇性雜交條件。通常，根據(jù)傳統(tǒng)的雜交方法在高嚴(yán)緊性條件下實(shí)施雜交和洗滌條件。洗滌條件通常為l-3XSSC，0.1-1%SDS，50-70°C，大約5-30分鐘后更換洗滌液。術(shù)語(yǔ)"相應(yīng)于"或"對(duì)應(yīng)于"是指多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的所有或一部分具有同一性。相比之下，本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)于"是指多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的互補(bǔ)鏈的所有或一部分具有同一性。為了描述起見(jiàn)，核苷酸序列"TATAC"對(duì)應(yīng)于參考序列"TATAC"，并互補(bǔ)于參考序列"GTATA"。下列術(shù)語(yǔ)在本申請(qǐng)中用于描述在兩個(gè)或更多多核苷酸或兩個(gè)或更多多肽之間的序列關(guān)系"參考序列"、"對(duì)比窗"、"序列同一性"、"序列同一性百分?jǐn)?shù)"以及"顯著同一性"。"參考序列"是用作序列對(duì)比基礎(chǔ)的確定序列，參考序列可以為較大序列的亞組，例如作為全長(zhǎng)cDNA、基因或蛋白質(zhì)序列的片段，或可以包括完整的cDNA、基因或蛋白質(zhì)序列。通常，參考多核苷酸序列為至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且通常為至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。參考多肽序列通常為至少7個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，并且通常為至少17個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。本申請(qǐng)所使用的"對(duì)比窗"是指至少15個(gè)連續(xù)核苷酸位置或至少5個(gè)連續(xù)氨基酸位置的參考序列的概念片段，候選序列可通過(guò)該片段與參考序列對(duì)比，且其中對(duì)于所述兩個(gè)序列的最佳比對(duì)來(lái)說(shuō)，經(jīng)對(duì)比窗的候選序列的部分可包括相對(duì)于參考序列(不含有添加或缺失)20%或更少的添加或缺失(即間隔)。本發(fā)明考慮了用于對(duì)比窗的不同長(zhǎng)度的參考序列或候選序列，以至包括全長(zhǎng)的參考序列或候選序列。用于比對(duì)對(duì)比窗的序列的最佳比對(duì)可以使用下述方法來(lái)進(jìn)行Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.(1981)2:482)，Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法(J.Mol.Biol.(1970)48:443)，Pearson和Lipman的相似性檢索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)(1988)85:2444)，以及使用這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施方法(例如WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7,0，GeneticsComputerGroup,573ScienceDr.，Madison,WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件例如ALIGN或Megalign(DNASTAR)進(jìn)行，或通過(guò)目測(cè)進(jìn)行。然后選擇最佳比對(duì)(即導(dǎo)致經(jīng)對(duì)比窗的最高同一性百分?jǐn)?shù))。術(shù)語(yǔ)"序列同一性"是指兩個(gè)多核苷酸序列或多肽序列經(jīng)過(guò)對(duì)比窗的同一性(即，基于核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸)。本申請(qǐng)所使用的關(guān)于參考序列的術(shù)語(yǔ)"序列同一性百分?jǐn)?shù)(％)"被定義為候選序列中與參考多肽序列中的殘基具有同一性的核苷酸或氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，所述候選序列經(jīng)對(duì)比窗在所述序列的最佳比對(duì)，和如有必要，引入間隔，以獲得最大的序列同一性百分?jǐn)?shù)，不考慮作為部分序列同一性的任何保守置換。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"顯著同一性"表示多核苷酸或多肽序列的特征，其中所述多核苷酸或多肽包括經(jīng)對(duì)比窗與參考序列相比具有至少50%序列同一性的序列。經(jīng)對(duì)比窗與參考序列相比具有至少60%序列同一性、至少70%序列同一性、至少80%序列同一性或至少90%序列同一性的多核苷酸和多肽序列也被認(rèn)為與參考序列具有顯著同一性。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"功能性缺失"表示對(duì)基因序列做出的使得部分基因序列無(wú)功能的突變、部分或完全缺失、插入或其他改變。例如，氣單胞菌溶素原(PA)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能性缺失導(dǎo)致PA結(jié)合細(xì)胞膜并在細(xì)胞膜上集中的能力降低。此功能性缺失可通過(guò)將諸如前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域(例如LHRH肽)的另一功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域插入氣單胞菌溶素原而逆轉(zhuǎn)。本申請(qǐng)中這種功能性缺失的逆轉(zhuǎn)被稱為"功能性置換"。在另一個(gè)實(shí)施例中，天然PA弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的功能性缺失導(dǎo)致與野生型PA分子相比PA被弗林蛋白酶切割和活化的能力降低。本申請(qǐng)可互換使用的術(shù)語(yǔ)"治療"和"處置"是指為改善受治療者的狀況而進(jìn)行的介入。所述改善可為主觀的或客觀的，并與緩解有關(guān)預(yù)防受治療的疾病或病癥的發(fā)展或改變其病理的癥狀相關(guān)。因此，術(shù)語(yǔ)"治療"和"處置"以最廣的含義使用，且包括在不同階段預(yù)防(防止)、緩解、減輕和治愈疾病或病癥。此術(shù)語(yǔ)還包括預(yù)防受治療者的狀況的惡化。因此，需要治療/處置的受治療者包括已患有疾病或病癥的那些，具有發(fā)展所述疾病或病癥的傾向或處于發(fā)展所述疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的那些，以及要預(yù)防所述疾病或病癥的那些。術(shù)語(yǔ)"緩解"包括受治療的疾病或病癥的一種或多種癥狀、體征和特征的臨時(shí)和長(zhǎng)期的阻斷、預(yù)防、減輕或改善。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"受治療者"或"患者"是指需要治療的動(dòng)物。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"是指人類(lèi)和非人類(lèi)的動(dòng)物，包括，但不限于哺乳類(lèi)、禽類(lèi)和魚(yú)類(lèi)。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽"聯(lián)合"一種或多種其他治療劑或另外的治療而施用，意在包括同時(shí)(并行)施用和連續(xù)施用。連續(xù)施用意在包括根據(jù)不同順序和通過(guò)不同途徑將本發(fā)明的治療劑或其他治療和化合物施用于受治療者。本申請(qǐng)可互換使用的術(shù)語(yǔ)"抗原"和"抗原物質(zhì)"是指能夠誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫反應(yīng)的一個(gè)分子，多個(gè)分子，分子的一部分或多部分，或分子組合，以至包括整個(gè)細(xì)胞和組織?？乖镔|(zhì)可包括單個(gè)抗原表位或抗原決定簇，或可包括多個(gè)抗原表位或抗原決定簇。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)"是指動(dòng)物的免疫系統(tǒng)響應(yīng)抗原或抗原物質(zhì)的反應(yīng)性的改變，并可涉及抗體產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、補(bǔ)體活'化和/或免疫耐受的發(fā)展。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"抑制"是指減小、減輕、減緩或預(yù)防。"結(jié)合對(duì)"是指相互具有親和力的兩個(gè)部分(如化學(xué)或生物化學(xué)的)。結(jié)合對(duì)的實(shí)例包括同型二聚體、異型二聚體、抗原/抗體、凝集素/親和素、靶多核苷酸/探針、寡核苷酸、抗體/抗抗體、受體/配體、酶/配體，等等。"結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員"是指所述對(duì)的一個(gè)部分，例如抗原或配體。"分離的多核苷酸"是指基因組、CDNA或合成起源的多核苷酸或它們的組合，其中就其起源來(lái)說(shuō)，"分離的多核苷酸"(l)與"分離的多核苷酸"天然存在的細(xì)胞無(wú)關(guān)聯(lián)，或(2)可操作性地與并非天然連接的多核苷酸連接。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"作為通用術(shù)語(yǔ)是指至少20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列，其可為野生型(天然存在的)蛋白質(zhì)序列、野生型蛋白質(zhì)序列的片段、野生型蛋白質(zhì)序列的變異體、野生型蛋白質(zhì)序列的衍生物，或野生型蛋白質(zhì)序列的類(lèi)似物。因此，如本申請(qǐng)所定義的，認(rèn)為天然蛋白質(zhì)序列和天然蛋白質(zhì)序列的片段、變異體、衍生物和類(lèi)似物為多肽上位概念的下位概念。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"是指就其起源來(lái)說(shuō)與正常情況下與之天然相關(guān)聯(lián)的其他多肽無(wú)關(guān)聯(lián)的多肽，和/或分離自正常情況下存在的細(xì)胞的多肽，和/或不含來(lái)自相同細(xì)胞來(lái)源的其他多肽的多肽，和/或由不同物種的細(xì)胞表達(dá)的多肽，和/或天然不存在的多肽。當(dāng)本文所使用的"天然存在的"或"天然的"應(yīng)用于對(duì)象時(shí)，是指對(duì)象可天然存在的事實(shí)。例如，可分離自天然來(lái)源并且未在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行有意人工修飾的存在于生物體(包括病毒)的多肽或多核苷酸序列為天然存在的。"可操作性連接"是指并列(juxtaposition)，其中所述組件(components)處于使得它們以所期望的方式行使功能的關(guān)系。"可操作性連接"至編碼序列的對(duì)照序列以下述方式連接在與對(duì)照序列相匹配的條件下獲得編碼序列的表達(dá)。"對(duì)照序列"是指必然影響它們所連接的編碼序列和非編碼序列的表達(dá)的多核苷酸序列。這些對(duì)照序列的性質(zhì)根據(jù)宿主生物體而不同，在原核生物中，這些對(duì)照序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，這些對(duì)照序列通常包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)"對(duì)照序列"意在至少包括其存在可影響表達(dá)的組件，且還可包括其存在為有利的其他組件，例如，前導(dǎo)序列和融合的配偶體序列。"多核苷酸"是指至少I(mǎi)O個(gè)堿基長(zhǎng)度的核苷酸的多聚體形式，或核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類(lèi)型的核苷酸的修飾形式。此術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的DNA或RNA。"多肽片段"是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其余氨基酸序列通常與所推導(dǎo)的天然存在的序列(例如全長(zhǎng)的cDNA序列)中的相應(yīng)位置同一的多肽。片段通常為至少5、6、8或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段為至少14個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段為至少20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在又一個(gè)實(shí)施方案中，片段為至少50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在又一個(gè)實(shí)施方案中，片段為至少70個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"或"標(biāo)記的"是指摻入可檢測(cè)的標(biāo)記物，例如摻入放射性標(biāo)記的氨基酸或連接至可通過(guò)標(biāo)記的親和素(例如含有熒光標(biāo)記物或可通過(guò)光學(xué)或比色方法檢測(cè)酶活性的鏈親和素)檢測(cè)的多肽的生物素基部分。各種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法為本領(lǐng)域已知且可以被使用。用于多肽的標(biāo)記物的實(shí)例包括，但不限于下列放射性同位素(例如3H、14C、35S、125I、131I)，熒光標(biāo)記物(例如FITC、若丹明、稀土元素-磷光體)，酶標(biāo)記物(或報(bào)道基因)(例如辣根過(guò)氧化物酶、i5-半乳糖苷酶、/3-內(nèi)酰胺酶(latamase)、熒光素酶、堿性磷酸酶)，化學(xué)發(fā)光體，生物素基，二級(jí)報(bào)道基因識(shí)別的預(yù)先確定的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、二級(jí)抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽被通過(guò)不同長(zhǎng)度的間隔臂連接而減小潛在的空間位阻。天然存在的氨基酸完全通過(guò)下文指明的傳統(tǒng)的3-字母或1-字母縮寫(xiě)形式識(shí)別，所述縮寫(xiě)形式通常為肽領(lǐng)域所接受，并為IUPAC-IUB的生物化學(xué)命名委員會(huì)所推薦表1.氨基酸代碼<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>本申請(qǐng)所列出的肽序列根據(jù)通常接受的慣例書(shū)寫(xiě)，由此N末端氨基酸在左，C末端氨基酸在右。按照慣例，L氨基酸由大寫(xiě)字母表示，D氨基酸由小寫(xiě)字母表示。修飾的成孔蛋白(MPP)本發(fā)明的修飾的成孔蛋白(MPP)衍生自天然存在的成孔蛋白(IlPP),且被修飾成包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，使得它們能夠相對(duì)于來(lái)自其他正常組織的細(xì)胞選擇性殺傷正常的前列腺細(xì)胞。相對(duì)于來(lái)自其他正常組織的細(xì)胞選擇性殺傷正常的前列腺細(xì)胞是指，比起其他類(lèi)型的正常細(xì)胞例如肺臟、脾臟或血液細(xì)胞，MPP能夠更有效地殺傷正常的前列腺細(xì)胞。合適的MPP包括美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20040235095號(hào)中所述的那些。1.天然存在的成孔蛋白(nPP)可衍生本發(fā)明的MPP的合適的mPP包括能夠在耙細(xì)胞膜中形成孔或通道而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的各種細(xì)菌毒素。合適的細(xì)菌毒素包括作為毒素原產(chǎn)生并接著由溶蛋白性切割活化的那些，以及以活性形式產(chǎn)生且不需要另外加工的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述nPP是作為毒素原合成的大細(xì)胞毒蛋白，其在活化序列處由蛋白酶切割活化，以在耙細(xì)胞的細(xì)胞膜中形成孔或通道，由此導(dǎo)致快速的溶細(xì)胞性細(xì)胞死亡。根據(jù)該實(shí)施方案的合適的nPP具有下列特征通過(guò)蛋白酶切割去除抑制性結(jié)構(gòu)域而活化的成孔活性，和通過(guò)一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合存在于細(xì)胞膜上的受體的能力。已克隆了許多這樣的nPP，并且制備了重組形式(見(jiàn)，例如，Imagawa等，F(xiàn)EMS.Microbiol.Lett.17:287-92，1994;Meza等，F(xiàn)EMSMicrobiol丄ett.145:333-9,1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP衍生自諸如氣單胞菌溶素或氣單胞菌溶素相關(guān)的多肽的nPP。其實(shí)例包括，但不限于氣單胞菌溶素同系物，例如嗜水氣單胞菌、易損氣單胞菌(Aeromonastrota)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)的氣單胞菌溶素原，和敗血梭狀芽胞桿菌的a-毒素(Ballard等，Infect.Immun.63:340-4，1995;Gordon等，J.Biol.Chem.274:27274-80，1999;Genbank登錄號(hào)S75954),以及下述多肽炭疽芽胞桿菌保護(hù)性抗原、霍亂弧菌VCC毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌的e-毒素和蘇蕓金芽胞桿菌的S-毒素(Genbank登錄號(hào)D00117)。上述的氣單胞菌種的氣單胞菌溶素原(PA)多肽已被表征。這些多肽之間表現(xiàn)出大于80%的序列配對(duì)同一性(Parker等，ProgressinBiophysics&MolecularBiology88(2005)91-142)。這些PA多肽中的每一種均為具有大約470個(gè)氨基酸殘基的大約52kDa的毒素原。嗜水氣單胞菌的野生型PA的cDNA序列示于SEQIDNO:1(圖7)，且此野生型PA的相應(yīng)的氨基酸序列示于SEQIDNO:2(圖8)。許多天然存在的nPP的核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列為本領(lǐng)域已知。其非限制性實(shí)例列于下列表格中表2:示例的nPP和相應(yīng)的GenBankTM登錄號(hào)nPP核苷酸序列(GenBank頂?shù)卿浱?hào))氨基酸序列(GenBankTM登錄號(hào))嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素BuckleyAerA,未校正M16495BuckleyAerA校正的P09167溫和氣單胞菌(A.sobria)的氣單胞菌溶素原1Y00559CAA68642溫和氣單胞菌的溶血素2X65046CAA46182易損氣單胞菌的氣單胞菌溶素原3AF064068AAC26217殺鮭氣單胞菌的溶血素4X65048CAA46184Husslein等，Mol.Microbiol.2(4)，507-517(1988):Hirono等，Microb.Pathog.13(6)，433-446(1992)3Kahn等，Appl.Environ.Microbiol.64(7),2473-2478(1998)4Hirono等，Microb.Pathog.15(4),269-282(1993)嗜水氣單胞菌PA蛋白包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2的大約1-83位氨基酸)和C末端抑制性肽(CIP)結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2的大約427-470位氨基酸)，其中結(jié)合結(jié)構(gòu)域據(jù)知為多肽的小片(smalllobe)，且在本申請(qǐng)中被稱為小片結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)，C末端抑制性肽(CIP)結(jié)構(gòu)域在活化序列處由蛋白酶切割去除而活化PA。在活化序列處切割而去除CIP結(jié)構(gòu)域可由多種普遍存在的蛋白酶(包括弗林蛋白酶和胰蛋白酶)進(jìn)行。SEQIDNO:2的大約84-426位氨基酸殘基據(jù)知為PA多肽的大葉(largelobe)，且含有毒素結(jié)構(gòu)域和其他功能性的結(jié)構(gòu)域一一包括第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其在本申請(qǐng)中被稱為大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)。野生型嗜水氣單胞菌PA的cDNA序列示于SEQIDNO:1?；陲@著的序列同一性和其他相似性，敗血梭狀芽胞桿菌的o;-毒素被認(rèn)為是氣單胞菌溶素原的同系物(Parker等，見(jiàn)上文)。a-毒素作為46,450Da的毒素原(大約443個(gè)氨基酸)分泌，該毒素原在活化序列處由蛋白酶切割去除C末端抑制性肽(CIP)結(jié)構(gòu)域而活化，并且a-毒素還結(jié)合糖基-磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白。然而，o;-毒素不具有對(duì)應(yīng)于PA的小片的區(qū)域。該多肽的活化通過(guò)在弗林蛋白酶切割位點(diǎn)處由蛋白酶切割而發(fā)生(Gordon等，Infect.Immun.65:4130-4，1997)。敗血梭狀芽胞桿菌a-毒素核苷酸序列的一個(gè)實(shí)例在GenBankTM登錄號(hào)S75954(SEQIDNO:73,圖40)中提供，敗血梭狀芽胞桿菌a-毒素蛋白質(zhì)序列的一個(gè)實(shí)例在GenBankTM登錄號(hào)AAB32892(SEQIDNO:74,圖41)中提供?；谛蛄型葱?，a-毒素被認(rèn)為具有相似的結(jié)構(gòu)和相似的結(jié)合GPI錨定蛋白的能力。蘇蕓金芽胞桿菌S-毒素的活化序列由某些昆蟲(chóng)的中腸蛋白酶切割而產(chǎn)生活性的內(nèi)毒素(Miranda等，InsectBiochem.Mol.Biol.31:1155-63,2001)。該內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)已經(jīng)解決，并顯示由三個(gè)結(jié)構(gòu)域一通道形成結(jié)構(gòu)域、結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的MPP衍生自氣單胞菌溶素原多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP衍生自嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素原多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP衍生自a-毒素多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP衍生自不需要蛋白酶切割活化的nPP，且因此不具有活化序列。這些nPP可被修飾成向所述nPP插入前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)，以產(chǎn)生能夠被選擇性活化而殺傷前列腺細(xì)胞的MPP。這些nPP的實(shí)例包括金黃色葡萄球菌a-溶血素。對(duì)于所述nPP，如本領(lǐng)域已知，活化序列可被插入成孔結(jié)構(gòu)域的中心(Panchal等，(1996)Nat.Biotech.14:852-856)。本發(fā)明還包括衍生自nPP的生物活性片段的MPP。nPP的生物活性片段為能夠形成孔并殺傷細(xì)胞的那些。合適的片段包括能夠在靶細(xì)胞中通過(guò)去除CIP結(jié)構(gòu)域而被活化形成孔的那些。例如，對(duì)于PA，合適的片段為包括蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和CIP結(jié)構(gòu)域以及活化序列的片段。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，MPP衍生自包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域、CIP結(jié)構(gòu)域以及活化序列的氣單胞菌溶素原的片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP衍生自包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域、活化序列，僅部分CIP結(jié)構(gòu)域的氣單胞菌溶素原的片段。2.前列腺特異性修飾根據(jù)本發(fā)明，所選的nPP被修飾形成包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性修飾的MPP。本發(fā)明所考慮的前列腺特異性修飾包括摻入前列腺特異性活化序列，和/或一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能性缺失(包括功能性置換)，和/或添加前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的MPP包括使得前列腺細(xì)胞的MPP選擇性活化的前列腺特異性活化序列。前列腺特異性活化序列可通過(guò)對(duì)nPP的天然存在的活化序列修飾而產(chǎn)生，或它可以通過(guò)向不具有天然存在的活化序列的nPP添加前列腺特異性活化序列而產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性活化序列和一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性活化序列和對(duì)SBD的修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性活化序列和對(duì)LBD的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的MPP包括使得前列腺細(xì)胞的MPP選擇性活化的一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域和對(duì)SBD的修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域和對(duì)LBD的修飾。在又一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性活化序列、一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域以及對(duì)LBD的修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性活化序列、一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域以及對(duì)SBD的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性活化序列和對(duì)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域和對(duì)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)修飾。在又一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括前列腺特異性活化序列、前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域和對(duì)天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)修飾?？蓪?duì)氣單胞菌溶素原進(jìn)行的前列腺特異性修飾的組合的代表性非限制性實(shí)例示于圖4、5和6。活化序列的修飾如上所述，nPP可通過(guò)對(duì)天然存在的活化序列修飾以提供前列腺特異性活化序列而被修飾成摻入前列腺特異性活化序列，或前列腺特異性活化序列可被添加至不具有天然存在的活化序列的nPP。根據(jù)本發(fā)明的前列腺特異性活化序列是摻入一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸序列。前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)是被前列腺特異性蛋白酶識(shí)別并選擇和有效水解(切割)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺特異性蛋白酶是較其他細(xì)胞類(lèi)型在前列腺細(xì)胞中更高水平表達(dá)的蛋白酶。前列腺特異性蛋白酶的實(shí)例包括，但不限于PSA(前列腺特異性抗原)，PSMA(前列腺特異性膜抗原)，以及HK2(人腺體激肽釋放酶2)切割序列。由這些前列腺特異性蛋白酶識(shí)別的切割位點(diǎn)的許多實(shí)例為本領(lǐng)域已知，并將在下文進(jìn)一步描述。對(duì)天然存在的活化序列修飾而提供前列腺特異性蛋白酶活化序列可如本領(lǐng)域已知的來(lái)實(shí)現(xiàn)。天然存在的活化序列的修飾導(dǎo)致天然活化序列功能性缺失。功能性缺失可通過(guò)突變、部分或完全缺失、插入或?qū)μ烊淮嬖诘幕罨蛄凶龀龅膶?dǎo)致其失活的其他變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，nPP的天然存在的活化序列通過(guò)插入前列腺特異性活化序列而功能性缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，天然存在的活化序列的功能性缺失通過(guò)產(chǎn)生前列腺特異性活化序列的天然活化序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，nPP的天然存在的活化序列通過(guò)使用前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)取代活化序列的天然蛋白酶切割位點(diǎn)而功能性缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)功能性置換MPP的天然蛋白酶切割位點(diǎn)。例如，前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)可功能性置換PA的天然弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(見(jiàn)圖4B)。該置換產(chǎn)生了在具有酶活性的前列腺特異性蛋白酶(例如PSA、PSMA或HK2)存在下變得具有溶細(xì)胞活性的MPP。合適的PSA、PSMA或HK2切割位點(diǎn)為本領(lǐng)域已知，并在下文描述。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的MPP可通過(guò)缺失nPP的天然蛋白酶切割位點(diǎn)和插入前列腺特異性活化序列而產(chǎn)生。例如，可缺失PA的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(SEQIDNO:2的427-432位氨基酸)，和插入前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)——例如PSA切割位點(diǎn)(見(jiàn)圖4B)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，nPp的天然蛋白酶切割位點(diǎn)被突變，使得它不再具有功能，且前列腺特異性活化序列被插入突變的蛋白酶切割位點(diǎn)內(nèi)，或添加至天然的蛋白酶切割位點(diǎn)的N末端或C末端。例如，PA的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)可被致突變，并且前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)(例如PSA切割位點(diǎn))可插入突變的弗林蛋白酶位點(diǎn)內(nèi)或添加至突變的弗林蛋白酶位點(diǎn)的N末端或C末端(見(jiàn)圖4C)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺特異性活化序列被添加至不具有天然存在的活化序列的nPP。例如，不需要蛋白酶切割以活化而殺傷細(xì)胞的金黃色葡萄球菌a-溶血素，可被設(shè)計(jì)成包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)，由此使得它能夠被選擇性活化而殺傷前列腺細(xì)胞。前列腺特異性切割位點(diǎn)如上所述，各種前列腺特異性蛋白酶及其識(shí)別的蛋白酶切割位點(diǎn)為本領(lǐng)域已知。其實(shí)例包括，但不限于PSA、PSMA以及HK2。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP被修飾成包括含有PSA特異性切割位點(diǎn)的前列腺特異性活化序列。PSA特異性切割位點(diǎn)為由前列腺特異性抗原(PSA)識(shí)別并選擇和有效水解(切割)的氨基酸序列。PSA是具有識(shí)別和水解特異性肽序列能力的絲氨酸蛋白酶。它以酶活性形式由前列腺細(xì)胞分泌，并當(dāng)進(jìn)入循環(huán)時(shí)失活。由于血液或除前列腺以外的正常組織均不含有具有酶活性的PSA,因此PSA的蛋白水解活性可用于活化前列腺的MPP。各PSA特異性切割位點(diǎn)為本領(lǐng)域已知。其實(shí)例包括，但不限于SEQIDNO:5、8、11和14-21所示的那些，以及美國(guó)專(zhuān)利第5,866,679、5,948,750、5，998，362、6，265，540、6,368,598和6，391，305所公開(kāi)的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP具有包括SEQIDNO:5所示的PSA切割位點(diǎn)的活化序列。根據(jù)人精液凝固蛋白I和蛋白II的PSA切割圖譜和基于纖維素膜的測(cè)定(見(jiàn)表3和Denmeade等，CancerRes.，57:4924-30，1997)，其他的PSA特異性切割位點(diǎn)為已知，并可用于產(chǎn)生本發(fā)明的修飾的MPP。例如，本發(fā)明的MPP可被修飾成包括表3所示的PSA切割位點(diǎn)中的一個(gè)，如本領(lǐng)域已知，該P(yáng)SA切割位點(diǎn)可取代氣單胞菌溶素原的野生型弗林蛋白酶活化位點(diǎn)(SEQIDNO:2的427-432位氨基酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP具有SEQIDNO:3、4、6、7、9、10、12、13和24的任一個(gè)的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括含有PSA切割位點(diǎn)的活化序列。表3:PSA底物(PSA切割位點(diǎn))和PSA水解的動(dòng)力學(xué)f<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*肽被熒光標(biāo)記(氨甲基香豆素)。在50mMTris，0.1MNaCl，pH7.8中進(jìn)行測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括含有PSMA特異性切割位點(diǎn)的前列腺特異性活化序列。合適的PSMA特異性切割位點(diǎn)的實(shí)例為本領(lǐng)域已知，且可見(jiàn)于例如國(guó)際公布第WO02/43773號(hào)。一般來(lái)說(shuō)，PSMA切割位點(diǎn)包括至少二肽X,X2。該二肽在X,位置處含有氨基酸Glu或Asp。X2可為Glu、Asp、Gln或Asn。三肽X!X2X3也是合適的，其中Xi和X2為如上所定義的，乂3為Glu、Asp、Gln或Asn。四肽X^2X3X4也是合適的，其中Xw為如上所定義的，X4為Glu、Asp、Gln或Asn。五肽X,X2X3X4Xs也是合適的，其中XM為如上所定義的，Xs為Glu、Asp、Gln或Asn。六肽X1X2X3X4X5X6也是合適的，其中X!.5為如上所定義的，X6為Glu、Asp、Gln或Asn。更長(zhǎng)序列長(zhǎng)度的其他肽可以以相似方式構(gòu)建。通常，所述肽具有下列序列X1..Xn，其中n為2至30、2至20、2至15或2至6，其中X！為Glu、Asp、Gln或Asn。在一個(gè)實(shí)施方案中，X,為Glu或Asp，且XrXn獨(dú)立選自Glu、Asp、Gln和Asn。其他可能的肽序列如上所述，除了X2-X^獨(dú)立選自Glu和Asp，以及Xn獨(dú)立選自Glu、Asp、Gln和Asn。PSMA切割位點(diǎn)的實(shí)例為Asp-Glu、Asp-Asp、Asp-Asn、Asp-Gln、Glu-Glu-Glu、Glu-Asp-Glu、Asp-Glu-Glu、Glu-Glu-Asp、Glu-Asp-Asp、Asp-Glu-Asp、Asp-Asp-Glu、Asp-Asp-Asp、Glu-Glu-Gln、Glu-Asp-Gln、Asp-Glu-Gln、Glu-Glu-Asn、Glu-Asp-Asn、Asp-GIu-Asn、Asp-Asp-Gln，以及Asp-Asp-Asn。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括含有HK2特異性切割位點(diǎn)的前列腺特異性活化序列。HK2特異性切割位點(diǎn)的實(shí)例也為本領(lǐng)域已知，且在例如國(guó)際公布第WO01/09165號(hào)中有所描述。HK2識(shí)別的切割位點(diǎn)側(cè)翼至少氨基酸序列X4X3X2X"該氨基酸序列在XJ立置處含有氨基酸精氨酸、組氨酸或賴氨酸。X2可為精氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸或組氨酸。X3可為賴氨酸、絲氨酸、丙氨酸、組氨酸或谷氨酰胺。乂4可為0至20個(gè)其他的氨基酸，并可為至少兩個(gè)其他的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，HK2切割位點(diǎn)包括X4的序列，該序列與野生型精液凝固蛋白I或精液凝固蛋白II序列的20個(gè)氨基酸基本同一，所述20個(gè)氨基酸為被識(shí)別的精液凝固蛋白切割位點(diǎn)的N末端側(cè)的第4至第24個(gè)氨基酸。所述氨基酸序列可進(jìn)一步包括X.p它與X,的羧基端連接形成氨基酸序列X4X3X2X!X^X-i具有達(dá)IO個(gè)的其他氨基酸，并可包括不同的氨基酸。Xi可具有與X,的羧基端連接的亮氨酸、丙氨酸或絲氨酸?？砂↙或D氨基酸。HK2切割位點(diǎn)位于X,的羧基端側(cè)。HK2切割位點(diǎn)的實(shí)例示于表4(注意符號(hào))[表示HK2切割位點(diǎn)]]:表4:示例的HK2切割位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的添加在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域，它們?cè)试S選擇性靶向前列腺細(xì)胞。前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域能夠引導(dǎo)MPP至前列腺細(xì)胞，在那里使MPP活化，并隨后殺傷前列腺細(xì)胞。靶向結(jié)構(gòu)域可以位于MPP的N末端或C末端，或者同時(shí)位于兩者?？蛇x地，靶向結(jié)構(gòu)域可以位于MPP的其他區(qū)域，前提是其不影響MPP的成孔活性。合適的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括，但不限于諸如肽配體、毒素或者抗體這些對(duì)前列腺細(xì)胞比對(duì)其他細(xì)胞類(lèi)型具有更高特異性的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域在前列腺組織或細(xì)胞中具有比在其他細(xì)胞類(lèi)型中更低的kd值(即與其他正常組織相比能夠選擇性地結(jié)合前列腺組織)，例如至少低10倍的Kd，至少低20倍、50倍、75倍、100倍或甚至低200倍的Kd。這些分子可用于將MPP耙向至前列腺。其實(shí)例包括，但不限于識(shí)別具有相對(duì)前列腺特異性的蛋白質(zhì)(諸如PSA、PSMA、HK2、prostasin和hepsin)的抗體；具有前列腺特異性受體的配體一一諸如天然和人工合成的促黃體激素釋放激素(LHRH);以及內(nèi)皮素(與同源的內(nèi)皮素受體結(jié)合)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的添加導(dǎo)致nPP的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能性缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氣單胞菌溶素原的天然非特異性GPI錨定蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能性缺失，并置換為前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。圖4D和圖5B描述了衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的具體實(shí)例，這些MPP具有功能性缺失的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域。圖4E、圖5A、圖5C和圖5D以及圖6A-6D顯示了衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的實(shí)例，這些MPP包括能夠功能性取代氣單胞菌溶素原的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。一個(gè)或多個(gè)前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與MPP的一個(gè)或多個(gè)氨基酸連接，而且理想地不明顯干擾在細(xì)胞膜中形成孔的能力，或在適用的情況下，不明顯干擾MPP被前列腺特異性的蛋白酶如PSA活化的能力。蛋白質(zhì)或肽與MPP的接合方法為本領(lǐng)域已知，并包括，例如，在與前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接之前改變蛋白質(zhì)的N末端氨基酸修飾成Cys或其他氨基酸的，以有助于前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域與MPP的連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至或是插入至衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的N末端和/或C末端(例如，見(jiàn)圖4E和圖5C)。在一些實(shí)施例中，氣單胞菌溶素原的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失(即SEQIDN0:2或4的l-83位的氨基酸)，使得前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域與N末端的連接或相連導(dǎo)致連接至SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的84位氨基酸(例如，見(jiàn)圖5C和圖6C)。在其他的實(shí)施例中，向氣單胞菌溶素原的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域中引入較小的缺失或點(diǎn)突變，使得前列腺組織特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域與N末端的連接或相連導(dǎo)致連接至SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的第1位氨基酸(或任何一個(gè)在氣單胞菌溶素原天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能性缺失之后的N末端的氨基酸)(例如，見(jiàn)圖4E和圖5D)。作為前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域是一種特異性結(jié)合于與前列腺細(xì)胞相關(guān)的抗原的抗體或者抗體片段，由此將MPP靶向前列腺細(xì)胞?？梢员凰銮傲邢偬禺愋园邢蚪Y(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的與前列腺細(xì)胞相關(guān)的抗原包括PSA、PSMA和LHRH受體，它們?cè)谇傲邢偌?xì)胞中的表達(dá)量升高?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的基因融合的方法將抗體與MPP的N末端或C末端相連(例如，參見(jiàn)Debinski和Pastan,Clin.CancerRes.1:1015-22，1995)。可選地，可以通過(guò)共價(jià)交聯(lián)將抗體與MPP相連(例如，參見(jiàn)Woo等，Arch.Pharm.Res.22(5):459-63,1999;Debinski禾卩Pastan，Clin.CancerRes.1(9):1015-22,1995)。交聯(lián)可以是非特異性的，如利用同型雙功能-賴氨酸反應(yīng)性交聯(lián)劑；或者，交聯(lián)也可以是特異性的，如利用與抗體上的氨基和與位于MPP上的半胱氨酸殘基反應(yīng)的交聯(lián)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，氣單胞菌溶素原的氨基酸諸如SEQIDNO:2的Cysl9、Cys75、Cysl59和/或Cysl64可用于將抗體與修飾的氣單胞菌溶素原分子交聯(lián)。例如，抗體可以取代待被修飾的nPP的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或者抗體能夠添加至天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域中已經(jīng)具有突變的MPP。這樣的MPP還可以包括增加其特異性的前列腺特異性活化序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是與PA毒素結(jié)構(gòu)域融合的PSMA的單鏈抗體。合適的抗體包括完整的抗體以及抗體片段，例如，諸如(i)由VL、VH、CL和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等，Nature341:544-6，1989);(v)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);和(vi)F(ab')2片段，其為包括兩條在絞鏈區(qū)通過(guò)二硫橋鍵連接起來(lái)的Fab片段的二價(jià)片段。合適的抗體包括單鏈的Fv抗體和駱駝化抗體(例如，見(jiàn)Tanha等，J.Biol.Chem.276:24774-80,2001)，其中單鏈的Fv抗體是通過(guò)重組的方法使Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)合成的連接體(linker)連接來(lái)制備的(Bird等，Science242:423-6，1988;和Huston等，Pro"Natl.Acad.Sci.85:5879-83,1988)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段能夠交聯(lián)其靶抗原，例如，諸如F(ab')2片段的二價(jià)片段?；蛘?，本身不能跟其靶抗原交聯(lián)的抗體片段(如Fab片段)可連同用以交聯(lián)抗體片段的二級(jí)抗體一起使用，從而與靶抗原交聯(lián)。可使用常規(guī)技術(shù)使抗體片段化，并如針對(duì)完整抗體所述的和本領(lǐng)域已知的相同方法篩選片段的實(shí)用性?？贵w還意在包括特異性結(jié)合靶抗原的納米抗體、雙特異性分子和嵌合體分子。"特異性結(jié)合"，當(dāng)用于提及抗體時(shí)，是指各抗體與特定抗原特異性地發(fā)生免疫反應(yīng)的能力?？贵w分子與抗原的抗原決定簇的結(jié)合是非隨機(jī)的結(jié)合反應(yīng)。合需的結(jié)合特異性一般是由抗體對(duì)特定的和無(wú)關(guān)的抗原的不同結(jié)合能力的參考點(diǎn)來(lái)決定的，并因此區(qū)別兩種不同的抗原，尤其是兩種具有獨(dú)特表位的抗原。特異性結(jié)合特定表位的抗體被稱為"特異性抗體"。作為前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的小肽配體在一個(gè)實(shí)施方案中，前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域是與表達(dá)于前列腺細(xì)胞膜上的關(guān)聯(lián)(cognate)的前列腺特異性受體相結(jié)合的小肽配體。其實(shí)例包括，但不限于以高親和力與LHRH受體結(jié)合的天然和合成的促黃體激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑肽(例如，見(jiàn)Genbank登錄號(hào)CAA25526和SEQIDNO:22和SEQIDNO:23)，和能夠選擇性地結(jié)合PSMA的肽。前列腺細(xì)胞以及僅少數(shù)其他細(xì)胞展示有LHRH受體。這種差異性表達(dá)提供了結(jié)合的特異性?？扇绫绢I(lǐng)域已知對(duì)小肽配體進(jìn)行修飾，以促進(jìn)其與MPP連接。例如，LHRH的某些殘基，如第6位的Gly(Gly6)可以被取代而不影響受體結(jié)合親和力(Janaky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:972-6，1992;Nechushtan等，J.Biol.Chem.，272:11597-603,1997)。因此，MPP(其中天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能性缺失)可以通過(guò)與純化的LHRHD-Lys6(該賴氨酸的e-胺)共價(jià)偶聯(lián)而產(chǎn)生。LHRHD-Lys6(SEQIDNO:23)可以在nPP內(nèi)的不同位置連接而提供具有前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的MPP。如上所述，小肽配體的連接不會(huì)顯著干擾毒素插入膜形成孔的能力。例如，可使用本領(lǐng)域已知的方法如通過(guò)二羧酸連接體將D-Lys6類(lèi)似物的。胺與MPP的氨基末端偶聯(lián)。通過(guò)活化序列的切割而引起的MPP的活化將導(dǎo)致C末端抑制性部分的釋放，而毒素仍然與LHRH受體結(jié)合?？蛇x地或另外，小肽配體可以直接與MPP的C末端偶聯(lián)。例如，LHRH的D-Lys6類(lèi)似物的e-胺能夠通過(guò)下述方式直接與MPP的C末端羧基偶聯(lián)在MPP的C末端添加Cys，然后使這個(gè)Cys與LHRH的D-Lys6類(lèi)似物的￡-胺交聯(lián)。這種偶聯(lián)將產(chǎn)生其中LHRH肽與C末端抑制性結(jié)構(gòu)域相連的MPP。通過(guò)活化序列的切割引起的MPP的活化將釋放出MPP，并且留下抑制性片段與LHRH受體結(jié)合。另外，可以制備其中修飾的LHRH肽與MPP的N末端和C末端兩者融合的重組融合蛋白。還考慮了小肽配體可以通過(guò)二硫橋鍵與MPP連接。例如，向LHRH肽的第6位引入半胱氨酸殘基，并且該肽通過(guò)二硫橋鍵與MPP連接。天然的nPP序列中可以存在肽與之形成二硫橋鍵的半胱氨酸，或者nPP可突變成包括半胱氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自PA的MPP可以在例如SEQIDNO:2的215和/或300位氨基酸處引入半胱氨酸殘基，其中215和/或300位氨基酸突變成半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備了其中LHRH肽與MPP的氨基末端融合的重組蛋白?？蛇x地或另外，MPP可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域與MPP的其他氨基酸的連接或相連而產(chǎn)生。例如，對(duì)于衍生自氣單胞菌溶素原的MPP而言，諸如SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的215或300位氨基酸的氨基酸(例如，見(jiàn)圖5A、圖5D、圖6B和圖6D)可以用于與一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域連接。在一些實(shí)施例中，Cys氨基酸取代了原有位置的天然氨基酸。例如，可以對(duì)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4做如下改變Tyr215Cys或Ala300Cys?？蛇x地，可以利用存在于nPP天然序列的半胱氨酸殘基。對(duì)于衍生自氣單胞菌溶素原的MPP而言，諸如SEQIDNO:2的Cysl9、Cys75、Cysl59和/或Cysl64氨基酸的氨基酸適用于此目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP衍生自氣單胞菌溶素原，且具有選自SEQIDNO:24和SEQIDNO:25的序列，它們包括作為前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的LHRH。'MPP天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾本發(fā)明的MPP衍生自本領(lǐng)域已知的含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的nPP。在本發(fā)明的全文中，當(dāng)nPP包括一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，則被認(rèn)為是"大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域"。根據(jù)適用范圍，本發(fā)明的MPP可以包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾。例如，氣單胞菌種的天然的氣單胞菌溶素原包括兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域小片結(jié)合結(jié)構(gòu)域和大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。相比之下，敗血梭狀芽胞桿菌的天然的a-毒素僅包括大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能性缺失。MPP中功能性缺失的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)е翸PP與其細(xì)胞表面受體結(jié)合能力減退，但是仍然保留成孔能力。功能性缺失可以通過(guò)MPP的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的缺失或突變而產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，整個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分可缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將異源序列插入至結(jié)合結(jié)構(gòu)域，也可以用于使結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能性缺失。這些異源序列的添加可以賦予MPP其他的功能(即結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能性置換)。例如，異源序列的添加可以導(dǎo)致添加作為本申請(qǐng)所述的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域而起作用的區(qū)域。在又一個(gè)實(shí)施方案中，也可以對(duì)nPP天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變，以降低結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其受體結(jié)合的能力。有關(guān)這些修飾的其他細(xì)節(jié)在下文描述。缺乏結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MPP保留其溶細(xì)胞活性，但是需要以較高劑量施用以確保細(xì)胞膜中毒素的濃度。可使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能性缺失的MPP。這些方法包括如Sambrook等(如上文所述)所述的DNA重組技術(shù)的使用?？蛇x地，還可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)蛋白質(zhì)自身的直接修飾實(shí)現(xiàn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能性缺失，例如蛋白水解產(chǎn)生MPP片段，然后這些片段可以利用化學(xué)方法連接在一起。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，MPP通過(guò)它的小片結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)的功能性缺失而被修飾。示例的SBD的功能性缺失可以如下文所述在嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素原多肽中進(jìn)行。整個(gè)SBD，即對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的1-83位氨基酸可以缺失，或者該區(qū)域的部分如SEQIDNO:2的45-66位氨基酸可以缺失?？蛇x地，可以如下文所述在W45A、147E、M57A、Y61A、K66Q(氨基酸編號(hào)涉及SEQIDNO:2或SEQIDNO:4)并如Mackenzie等，J.Biol.Chem.274:22604-22609，1999中所述進(jìn)行點(diǎn)突變。描述在結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變的MPP的實(shí)例的示意圖示于圖4D，其中*表示一個(gè)或多個(gè)突變或缺失。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，nPP通過(guò)其大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)的功能性缺失而被修飾。氣單胞菌溶素原的LBD(含在SEQIDNO:2的大約84-426位氨基酸殘基中)的典型功能性缺失可以按下述方法來(lái)提供MPP。氣單胞菌溶素原的整個(gè)LBD可以缺失。可選地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自氣單胞菌溶素原的MPP的LBD區(qū)域包括氨基酸殘基Y162、W324、R323、R336和/或W127的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，衍生自氣單胞菌溶素原的MPP在W127和/或R336位置包括一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。在又一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自氣單胞菌溶素原的MPP包括點(diǎn)突變Y162A和/或W324A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自氣單胞菌溶素原的MPP包括點(diǎn)突變R336A、R336C和/或W127T。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP包括與GPI蛋白配體直接相互作用的其他殘基的突變。衍生自a-毒素的MPP的LBD的典型突變?nèi)缦滤?，并包括a-毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)取代的氨基酸，所述a-毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNO:33所示的天然的a-毒素序列的53、54、62、84-102、259-274和309-315位氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自a-毒素的MPP包括如下一個(gè)或多個(gè)殘基的突變W85、Y128、R292、Y293和詣5。MPP的進(jìn)一步修飾本發(fā)明考慮了不影響MPP選擇性靶向前列腺細(xì)胞的能力的MPP的進(jìn)一步修飾。這些修飾包括氨基酸的取代、插入或者缺失、減少M(fèi)PP抗原性的修飾，以及增強(qiáng)MPP穩(wěn)定性或改善MPP的藥代動(dòng)力學(xué)的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)MPP的進(jìn)一步修飾產(chǎn)生僅少數(shù)氨基酸與MPP不同的多肽。這些修飾包括缺失(例如1-3或更多的氨基酸)、插入(例如l-3或更多的殘基)或取代，它們不影響MPP選擇性靶向并殺傷正常前列腺細(xì)胞的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)MPP的進(jìn)一步修飾產(chǎn)生下述多肽即其保留與MPP具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列同一性，并維持MPP選擇性靶向并殺傷正常前列腺細(xì)胞的能力。MPP可以通過(guò)取代來(lái)進(jìn)行修飾，借此，氨基酸序列中的至少一個(gè)殘基被去除，且不同的殘基在其位置插入。在一個(gè)實(shí)施方案中，取代為保守置換。保守置換是指用具有相似生化特性的氨基酸殘基來(lái)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如2、5或10個(gè)殘基)。通常，保守置換對(duì)產(chǎn)生的多肽的活性幾乎沒(méi)有影響。例如，理想地，含有一個(gè)或多個(gè)保守置換的MPP保留對(duì)應(yīng)的nPP的活性。用于取代蛋白質(zhì)的初始氨基酸并被認(rèn)為是保守置換的氨基酸的實(shí)例包括Ser取代Ala;Lys取代Arg;Gln或His取代Asn;Glu取代Asp;Ser取代Cys;Asn取代Gin;Asp取代Glu;Pro取代Gly;Asn或Gin取代His;Leu或Val取代lie;lie或Val取代Leu;Arg或Gin取代Lys;Leu或lie取代Met;Met、Leu或Tyr取代Phe;Thr取代Ser;Ser取代Thr;Tyr取代Trp;Trp或Phe取代Tyr;以及Ile或Leu取代Vd?？墒褂美鐦?biāo)準(zhǔn)方法如定點(diǎn)誘變或PCR對(duì)編碼多肽的核苷酸序列進(jìn)行操作來(lái)將MPP修飾成包括一個(gè)或多個(gè)保守置換。關(guān)于保守置換的其他信息除了其他處以外還可見(jiàn)于Ben-Bassat等，(J.Bacteriol.169:751-7,1987);O'Regan等，(Gene77:237-51,1989);Sahin-Toth等,(ProteinSci.3:240-7，1994);Hochuli等，(Bio/Technology6:1321-5,1988);WO00/67796(Curd等)以及遺傳學(xué)和分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這種取代是允許的取代。允許的取代是氨基酸的非保守置換，但是也不明顯改變MPP活性。例如，在氣單胞菌溶素原多肽序列SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的第300位用Cys取代Ala。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP被修飾成包括單個(gè)殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP被修飾成包括一個(gè)氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP被修飾成包括大約2個(gè)至大約IO個(gè)氨基酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP被修飾成包括大約3個(gè)至大約5個(gè)氨基酸取代。衍生自氣單胞菌溶素原的MPP進(jìn)一步修飾的非限制性實(shí)例列于表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>還考慮了擬肽(peptidomimetic)和擬有機(jī)物(organomimetic)的實(shí)施方案，由此所述擬肽和擬有機(jī)物的化學(xué)組分的三維排列模擬多肽骨架和多肽的氨基酸側(cè)鏈組件的三維排列，從而產(chǎn)生具有溶解前列腺細(xì)胞的能力的MPP的所述擬肽和擬有機(jī)物。對(duì)于計(jì)算機(jī)模型的應(yīng)用，藥效基團(tuán)是理想化的，具有生物學(xué)活性需要的結(jié)構(gòu)的三維空間定義。利用目前的計(jì)算機(jī)模型軟件(使用計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì)或CADD)來(lái)設(shè)計(jì)擬合各藥效基團(tuán)的擬肽和擬有機(jī)物，見(jiàn)Walters,"Computer-AssistedModelingofDrugs",inKlegerman&Groves,eds.,1993,PharmaceuticalBiotechnology,InterpharmPress:BuffaloGrove,I1L第165-174頁(yè)和PrinciplesofPharmacology(ed.Munson,1995),102章關(guān)于CADD使用技術(shù)的描述。對(duì)MPP所做的其他修飾包括，例如，對(duì)于MPP的無(wú)論位于羧基末端或側(cè)鏈的羧酸基團(tuán)的修飾，其中這些基團(tuán)為藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的鹽形式，或被酯化形成Crd6酯，或轉(zhuǎn)化為式NR,R2的酰胺，其中R,和R2為各自獨(dú)立的H或者d-C,6垸基，或組合形成雜環(huán)，諸如5元環(huán)或6元環(huán)。不管是氨基末端還是側(cè)鏈的多肽的氨基，都可為藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的形式，諸如HC1鹽、HBr鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、甲苯磺酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽以及其他有機(jī)鹽，或可以修飾成d-d6垸基或二烷基氨基或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酰胺。其他修飾包括使用公知技術(shù)將多肽側(cè)鏈的羥基轉(zhuǎn)化成Q-C,6垸氧基或轉(zhuǎn)化成Q-d6酯。多肽側(cè)鏈的苯環(huán)和酚環(huán)可以用諸如F、Cl、Br或者I的一個(gè)或多個(gè)鹵素原子來(lái)取代，或者用Q-d6烷基、d-de烷氧基、羧酸及其酯類(lèi)，或這些羧酸的酰胺來(lái)取代。多肽側(cè)鏈的亞甲基可以擴(kuò)展至同系的CVC4亞垸基。巰基可以用許多公知的保護(hù)基團(tuán)中的任何一種來(lái)保護(hù)，如乙酰胺基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會(huì)知道將環(huán)狀結(jié)構(gòu)引入本申請(qǐng)所述的多肽以選擇和提供導(dǎo)致穩(wěn)定性增強(qiáng)的對(duì)于結(jié)構(gòu)的構(gòu)象約束的方法。例如，可以將羧基末端或氨基末端半胱氨酸殘基添加至多肽，使得當(dāng)多肽被氧化時(shí)含有二硫鍵，從而產(chǎn)生環(huán)肽。其他肽環(huán)化的方法包括硫醚、羧基末端和氨基末端酰胺以及酯類(lèi)的形成。本發(fā)明還考慮到對(duì)MPP進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，其中將MPP連接或者固定至諸如珠的表面。所述珠還可包括增加對(duì)前列腺細(xì)胞靶向性的前列腺特異性配體。固定化的指的是結(jié)合至表面，如固體表面。固體表面可以是聚合物的，如聚苯乙烯或聚丙烯。固體表面可以是珠的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面包括固定化的MPP，而在其他實(shí)施方案中還包括一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性結(jié)合配體，如LHRH肽、PSMA抗體以及PSMA單鏈抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一旦所述珠到達(dá)前列腺細(xì)胞耙，MPP就從所述珠上釋放出來(lái)。在固體表面固定化肽的方法為本領(lǐng)域已知，并可見(jiàn)于WO94/29436和美國(guó)專(zhuān)利第5,858,358號(hào)。本發(fā)明還考慮了MPP可以包括進(jìn)一步的修飾，所述修飾的目的是當(dāng)MPP施用于受治療者時(shí)，改善分子的藥代動(dòng)力學(xué)特性。能夠降低治療蛋白的免疫原性和/或增加治療蛋白質(zhì)的半衰期的各種修飾為本領(lǐng)域己知。例如，根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，MMP可以經(jīng)受糖基化、異構(gòu)化或去糖基化。類(lèi)似地，MPP可以通過(guò)非天然存在的共價(jià)修飾來(lái)修飾，如通過(guò)添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)或者脂化。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的MPP能夠與聚乙二醇結(jié)合(PEG化)以促進(jìn)其藥物代謝分布。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行結(jié)合(參見(jiàn)，例如Deckert等，Int.J.Cancer87:382-390，2000;Knight等，Platelets15:409-418，2004;Leong等，Cytokine16:106-119，2001;禾口Yang等，ProteinEng.16:761-770,2003)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)誘變來(lái)鑒定和改變抗原表位。如同使這些抗原表位突變的方法一樣，鑒定抗原表位的方法也為本領(lǐng)域所已知(參見(jiàn)，例如Sette等，Biologicals29:271-276)。制備MPP的方法本發(fā)明的MPP可以通過(guò)許多本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)制備。可通過(guò)例如使用DNA重組技術(shù)對(duì)編碼MPP的核苷酸改造而修飾MPP。或者，對(duì)MPP的修飾可以用化學(xué)修飾和/或限制性蛋白水解對(duì)MPP多肽自身進(jìn)行修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。如同樣為本領(lǐng)域所已知的，這些方法的組合也可用于制備本發(fā)明的MPP。使用重組方法制備MPP如本領(lǐng)域已知的，蛋白質(zhì)的基因工程一般需要首先將編碼蛋白質(zhì)的核苷酸進(jìn)行分離和克隆。不同nPP的序列可以從如本申請(qǐng)所述的GenBank獲得。分離和克隆編碼這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以因此通過(guò)采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)，例如Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley&Sons,NY(1997andupdates);Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,Cold-SpringHarborPress,NY(2001))。例如，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取mRNA，然后從tnRNA模板合成cDNA(例如通過(guò)RT-PCR),可以直接從合適的生物體如嗜水氣單胞菌獲得核苷酸序列?；蛘?，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序可以從適當(dāng)?shù)腸DNA或基因組DNA文庫(kù)獲得編碼nPP的核苷酸序列。然后將分離的cDNA或基因組DNA插入至合適的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解所用的精確載體對(duì)于本發(fā)明而言不是關(guān)鍵要素。合適載體的實(shí)例包括，但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或者DNA病毒。載體可以是克隆載體，或可以是表達(dá)載體。一旦獲得了編碼nPP的核苷酸序列，就可通過(guò)本領(lǐng)域公知的體外定點(diǎn)誘變技術(shù)在特定的預(yù)選位置引入一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域或活化序列的突變。可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)組成編碼序列的合適核苷酸的缺失、插入、取代、倒位或其組合來(lái)引入突變。例如，這可通過(guò)將引物設(shè)計(jì)為引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸的錯(cuò)配、插入或缺失等基于PCR的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。突變的存在可以通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如限制酶切分析或DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)。如果需要的話，在引入一個(gè)或多個(gè)合適的突變之后，可以將編碼MPP的核酸序列插入至合適的表達(dá)載體。合適的表達(dá)載體的實(shí)例包括，但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及DNA病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體還可包括調(diào)控元件，如MPP編碼序列有效轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄元件?？蓳饺胼d體的調(diào)控元件的實(shí)例包括，但不限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和多聚腺苷酸化信號(hào)。因此，本發(fā)明提供了含有與編碼基因工程MPP的核苷酸序列操作性連接的調(diào)控元件的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解對(duì)合適的調(diào)控元件的選擇取決于所選用于表達(dá)基因工程MPP的宿主細(xì)胞，并且這些調(diào)控元件可來(lái)自多種來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、病毒、哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)基因。例如，對(duì)睪酮和其他雄激素起反應(yīng)的前列腺特異性啟動(dòng)子，可用于啟動(dòng)前列腺細(xì)胞中的基因的表達(dá)。其實(shí)例包括，但不限于probaski啟動(dòng)子、前列腺特異性抗原(PSA)啟動(dòng)子、前列腺特異性膜抗原(PSMA)啟動(dòng)子，以及人腺體激肽釋放酶2(HK2)啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，表達(dá)載體還可以含有利于純化表達(dá)的MPP的異源核苷酸序列。這些異源核苷酸序列的實(shí)例包括，但不限于親和標(biāo)簽如金屬親和標(biāo)簽、組氨酸標(biāo)簽、親和素/鏈親和素編碼序列、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼序列以及生物素編碼序列。根據(jù)本領(lǐng)域已知方法可以在使用前將對(duì)應(yīng)于核苷酸表達(dá)的氨基酸從表達(dá)的MPP去除?；蛘?，對(duì)應(yīng)于異源核苷酸序列表達(dá)的氨基酸可以保留在MPP上，前提是它們不干擾MPP靶向和殺傷前列腺細(xì)胞的能力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，MPP作為具有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組氨酸標(biāo)簽位于MPP的羧基末端?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法之一將表達(dá)載體引入至合適的宿主細(xì)胞或組織。這些方法通?？梢?jiàn)于Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley&Sons,NY(1997andupdates);Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,Cold-SpringHarborPress,NY(2001)，并包括例如穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔以及使用重組病毒載體的感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)用于MPP表達(dá)的合適宿主細(xì)胞的選擇取決于所選載體。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括，但是不限于細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、植物以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以特定的所需方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這些修飾(如糖基化)和加工(如切割)對(duì)于蛋白質(zhì)的功能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有用于蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物翻譯后加工以及修飾的特征性的和特定的機(jī)制?？蛇x擇適合的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)的外源蛋白的正確修飾以及加工。為此，可使用具有對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行適當(dāng)加工以及翻譯后修飾(如基因產(chǎn)物的糖基化以及磷酸化)的細(xì)胞機(jī)制(cellmachinery)的真核宿主細(xì)胞。這些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38?？寺∫约氨磉_(dá)蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域所公知，重組蛋白表達(dá)的技術(shù)以及系統(tǒng)的詳細(xì)說(shuō)明可見(jiàn)于例如CurrentProtocolsinProteinScience(Coligan，J.E.，等，Wiley&Sons,NewYork)。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，多種多樣的表達(dá)系統(tǒng)可用于提供重組蛋白。所用的宿主細(xì)胞對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)不是關(guān)鍵的。因此，本發(fā)明考慮到可以在原核宿主(如大腸桿菌(E.coli)，殺鮭氣單胞菌或枯草芽胞桿菌)或真核宿主(如酵母菌或畢赤酵母菌(Pichia);哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如COS、NIH3T3、CHO、BHK、293或HeLa細(xì)胞；或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中制備MPP?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從宿主細(xì)胞中純化MPP。如果需要，可通過(guò)使用完整蛋白質(zhì)或其蛋白水解片段的標(biāo)準(zhǔn)肽測(cè)序技術(shù)來(lái)測(cè)定設(shè)計(jì)入蛋白質(zhì)的氨基酸序列的改變。作為將突變引入天然存在的成孔蛋白的定向方法的替代方法，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)使得表達(dá)成孔蛋白的克隆基因經(jīng)受隨機(jī)誘變。接著表達(dá)和篩選由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)突變體形式，使得能夠鑒定和分離本發(fā)明的MPP。本發(fā)明的MPP還可以制備成片段或融合蛋白。融合蛋白是包括與不抑制MPP選擇性耙向和殺傷正常前列腺細(xì)胞能力的其他氨基酸序列相連的MPP的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其他氨基酸序列為不超過(guò)5、6、7、8、9、10、20、30或50個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度。制備融合蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如美國(guó)專(zhuān)利第6，057，133號(hào)公開(kāi)了制備融合分子的方法，所述融合分子由人白細(xì)胞介素-3(hlL-3)變異體或突變體蛋白與另一集落刺激因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、白細(xì)胞介素、造血生長(zhǎng)因子或IL-3變異體功能性連接而構(gòu)成。授予Davis等的美國(guó)專(zhuān)利第6,072,041號(hào)公開(kāi)了包括單鏈Fv分子的融合蛋白的生成，其中所述單鏈Fv分子定向于與治療蛋白共價(jià)連接的胞轉(zhuǎn)受體(transcytoticreceptor)。相似的方法可用于生成包括連接其他氨基酸序列如前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域(如LHRH或抗體)的MPP(或其變異體、片段等)的融合蛋白。連接區(qū)可用于使蛋白質(zhì)的兩個(gè)部分彼此隔開(kāi)并提供它們之間的柔性。連接區(qū)通常是1-500個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽，如小于30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。一般而言，連接兩分子的連接體可被設(shè)計(jì)成(1)允許兩分子能夠彼此獨(dú)自折疊和起作用，(2)不具有形成會(huì)干擾兩個(gè)蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)的偏向性，(3)具有最低的與蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域相互作用的疏水性或帶電特性，和/或(4)提供兩個(gè)區(qū)域的空間上的分離。柔性蛋白區(qū)域的典型表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。其他的中性氨基酸(如Thr和Ala)也可用于連接序列。連接體還可包括提供連接序列中的獨(dú)特性位點(diǎn)以利于構(gòu)建融合體。根據(jù)需要，還可包括其他部分。這些可包括可用于純化和加工融合蛋白的結(jié)合區(qū)，(如親和素或表位)或標(biāo)簽(如多組氨酸標(biāo)簽)。另外，可將可檢測(cè)的標(biāo)記物與融合蛋白連接，這樣可以方便地監(jiān)測(cè)融合蛋白經(jīng)過(guò)機(jī)體或細(xì)胞的運(yùn)送(traffic)。這些標(biāo)記物包括放射性核素、酶、熒光團(tuán)等等。MPP核苷酸序列與其他蛋白質(zhì)(或變異體，其片段)核苷酸序列的融合可以通過(guò)使用中間的載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。或者，可以將一個(gè)基因直接克隆至含有其他基因的載體中。連接體和適體(adapter)可用于連接核苷酸序列和取代丟失序列(losssequence)，其中限制性酶切位點(diǎn)在感興趣的區(qū)域內(nèi)。將編碼一種多肽、肽連接體以及其他多肽的基因物質(zhì)(DNA)插入至合適的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化原核或真核細(xì)胞，所述原核或真核細(xì)胞如細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的生物體，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離蛋白質(zhì)，例如，如果使用了多組氨酸標(biāo)簽，則通過(guò)使用可檢測(cè)標(biāo)記物的如鎳-螯合物親和層析來(lái)分離蛋白質(zhì)。因此，所產(chǎn)生的產(chǎn)物是一種新蛋白質(zhì)——具有任選通過(guò)連接體與另一蛋白質(zhì)連接的MPP的融合蛋白。為了確認(rèn)融合蛋白被表達(dá)，純化的蛋白質(zhì)例如可進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及用已建立的方法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜濾器上。通過(guò)蛋白質(zhì)印記分析，使用針對(duì)各組分即多組氨酸標(biāo)簽和/或MPP的抗體來(lái)鑒定蛋白產(chǎn)物。如果本發(fā)明的MPP通過(guò)表達(dá)融合基因而產(chǎn)生，那么肽鍵就作為MPP與前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域的連接體起作用。例如，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如Huston等，Meth.Enzymol.203:46-88,1991，來(lái)制備抗體的單鏈Fv片段與成孔蛋白毒素的重組融合蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以使用多種方法對(duì)DNA進(jìn)行改變，而不影響所編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。例如，PCR可用于使編碼MPP的DNA序列產(chǎn)生變異。這些編碼MPP的DNA序列的變異，可用于優(yōu)化用于表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中密碼子的偏愛(ài)性，或可以含有其他有利于表達(dá)的序列改變。制備MPP的其他方法前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域和上文所述的任選的連接體可以通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵或兩者一起連接至本發(fā)明的MPP。非共價(jià)相互作用可以是離子、疏水或者親水的，諸如涉及亮氨酸拉鏈的相互作用或抗體-蛋白G相互作用(Derrick等，Nature359:752，1992)。其他非共價(jià)相互作用的實(shí)例包括但不限于下列結(jié)合對(duì)抗原或半抗原和抗體；抗體和抗-抗體；受體和配體；酶或酶片段和底物，底物類(lèi)似物或配體；生物素或凝集素和親和素或鏈親和素；凝集素和碳水化合物；亮氨酸對(duì)拉鏈基序(見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利第5,643,731號(hào))，以及本領(lǐng)域已知的各種同型二聚體以及異型二聚體。如本領(lǐng)域已知，MPP可以被修飾成包括結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員，且前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域可以被修飾成包括結(jié)合對(duì)的另一個(gè)成員。共價(jià)鍵可以采用二硫鍵的形式。編碼這些組分之一的DNA序列可以被設(shè)計(jì)為含有唯一的半胱氨酸密碼子?？蛇x地，可以使用天然存在的半胱氨酸殘基。第二組分可以使巰基與第一組分的半胱氨酸反應(yīng)而衍生。可選地，巰基自身或作為半胱氨酸殘基部分的巰基可以使用固相多肽技術(shù)引入。例如，Hiskey(Peptides3..137,簡(jiǎn))所述的將巰基引入肽。蛋白質(zhì)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)添加巰基來(lái)進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，Traut's試齊U(2-亞氨基硫醇(iminothiolane)-HCl)(PierceChemicals,Rockford，111.)可用于在伯胺諸如賴氨酸殘基或N末端胺上引入巰基。然后用Traut's試劑修飾過(guò)的蛋白質(zhì)或肽可與用試劑諸如N-琥珀酰亞胺基(succinimidyl)3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)或琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己垸-l-羧酸酯(SMCC)修飾過(guò)的蛋白質(zhì)或肽發(fā)生反應(yīng)(PierceChemicals,Rockford,111.)。.一旦各組分存在恰當(dāng)?shù)膸€基，則純化這兩個(gè)組分，還原各組分的硫基；將組分混合；并在室溫下完成二硫鍵的形成。為了提高偶聯(lián)反應(yīng)的效率，可在如半胱氨酸-MPP的組分之一半胱氨酸殘基添加至反應(yīng)混合物之前，通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，使用5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲)酸(DTNB)或2,2'-二硫代吡啶對(duì)其進(jìn)行活化。反應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖生理鹽水將混合物進(jìn)行透析，以去除未偶聯(lián)的分子。然后，進(jìn)行葡聚糖凝膠層析等來(lái)基于大小而分離本發(fā)明化合物與其組分。還可以使用Maiti等，Int.J.CancerSuppl.3:17-22,1988所述的聚合體-單甲氧基聚乙二醇(mPEG)來(lái)連接組分。前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域與nPP或MPP也可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)化學(xué)方法進(jìn)行偶聯(lián)，諸如碳化二亞胺介導(dǎo)的偶聯(lián)(例如，DCC、EDC或活化的EDC)，以及使用2-亞氨基硫醇來(lái)將e-氨基轉(zhuǎn)化成用于交聯(lián)的巰基，并使用m-馬來(lái)酰亞胺苯甲酰基-n-羥基琥珀酰亞胺基酯(MBS)作為交聯(lián)劑。本領(lǐng)域已知的各種其他的偶聯(lián)方法可用于結(jié)合前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域與nPP或MPP。MPP的大量制備MPP的制備也可使用本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)大量進(jìn)行，以便用于例如生產(chǎn)的目的，其中所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如用于生產(chǎn)重組蛋白的大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程，以及用于重組蛋白純化的超濾法、離子交換層析法、固定化的金屬離子親和層析法。檢測(cè)MPP的方法本發(fā)明的MPP保留其成孔活性并且選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)MPP選擇性殺傷前列腺細(xì)胞的能力。下文及本申請(qǐng)包括的實(shí)施例中提供了檢測(cè)候選MPP的示例方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，檢測(cè)候選MPP的其他方法為本領(lǐng)域己知且也適于檢測(cè)本發(fā)明的MPP。體外方法含有前列腺特異性活化序列的本發(fā)明的MPP，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)其被合適的前列腺特異性蛋白酶切割的能力。例如，將不同濃度的合適的蛋白酶與MPP—起溫育，然后將溫育產(chǎn)物在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，且通過(guò)檢測(cè)凝膠上多肽的大小來(lái)評(píng)定MPP的切割。為了確定與蛋白酶溫育的MPP是否保留成孔活性，以及由此在與蛋白酶溫育后保留殺傷細(xì)胞的能力，可使用本領(lǐng)域已知的溶血測(cè)定來(lái)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。合適的測(cè)定的實(shí)例在Howard,S.P.，andBuckley,J.T.1985.Activationofthehole-formingtoxinaerolysinbyextracellularprocessing.J.Bacteriol.163:336-340中有描述?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的MPP殺傷前列腺細(xì)胞的能力。例如，可以使用合適的前列腺細(xì)胞系在體外測(cè)定MPP殺傷前列腺細(xì)胞的能力。通常，將所選的檢測(cè)細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)拿芏?，并添加候選MPP。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間后(例如，大約48-72小時(shí))，評(píng)定細(xì)胞存活率。測(cè)定細(xì)胞存活率的方法為本領(lǐng)域所公知，并且其包括，但不限于刃天青還原試驗(yàn)(見(jiàn)Fields&Lancaster(1993)Am.Biotechnol.Lab.11:48-50;O'Brien等，(2000)Eur.J.Biochem.267:5421-5426以及美國(guó)專(zhuān)利第5，501，959號(hào))，硫代若丹明分析法(Rubinstein等，(1990)J.Natl.CancerInst.82:113-118)，或者中性紅染料試驗(yàn)(Kitano等，(1991)Euro.J.Clin.Investg.21:53-58;West等(1992)J.InvestigativeDerm.99:95-100)，或臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定。也可以使用多種可商購(gòu)獲得的試劑盒，例如CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)。將處理的培養(yǎng)物與一種或多種對(duì)照培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞存活率對(duì)比來(lái)測(cè)定細(xì)胞毒性，所述對(duì)照培養(yǎng)物例如未處理的培養(yǎng)物，和/或使用對(duì)照化合物(通常是已知的治療劑)預(yù)處理的培養(yǎng)物，或其他合適的對(duì)照。被認(rèn)為有效殺傷正常前列腺細(xì)胞的MPP能夠?qū)⒓?xì)胞存活率減小，例如，至少10。％,至少20%，至少30%，至少40%或至少50%。可對(duì)包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的MPP評(píng)定它們的選擇性靶向前列腺細(xì)胞的能力，例如通過(guò)將MPP殺傷正常前列腺細(xì)胞的能力與其殺傷其他組織細(xì)胞的能力進(jìn)行比較?？蛇x地，本領(lǐng)域已知的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，可以用于確定包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域的MPP是否能夠選擇性地靶向前列腺細(xì)胞。另外可選地，前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配體可以摻入人工脂膜，且可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法來(lái)檢測(cè)MPP形成通道的能力?？捎糜跈z測(cè)本發(fā)明的MPP的特異性溶解前列腺細(xì)胞的能力的測(cè)定方法在例如實(shí)施例2和3中描述。例如，可對(duì)具有PSA切割位點(diǎn)的MPP評(píng)定相對(duì)于其溶解不生成PSA的細(xì)胞能力的特異性溶解生成PSA的細(xì)胞的能力。本發(fā)明的MPP，在比殺傷不生成PSA的細(xì)胞所需更低的濃度下，例如低至少2倍、5倍、10倍或100倍的濃度，與生成PSA的細(xì)胞(諸如前列腺細(xì)胞)接觸時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞的溶解和死亡。適合于檢測(cè)候選MPP的多種前列腺細(xì)胞系為本領(lǐng)域己知且許多可商購(gòu)獲得(例如，來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)，馬納薩斯，VA)。用于體外檢測(cè)的合適的前列腺細(xì)胞系的實(shí)例包括，但不限于PNT1A、PNT2、BPH-1、DuK50、NRP152、PS-1細(xì)胞系。如有必要，MPP對(duì)非前列腺細(xì)胞的毒性也可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體外進(jìn)行最初評(píng)定。例如，在體外可以用MPP轉(zhuǎn)染人初級(jí)成纖維細(xì)胞，然后在處理后不同時(shí)間點(diǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)的成活力測(cè)定來(lái)檢測(cè)它們的成活力，其中所述成活力測(cè)定諸如上述測(cè)定方法，或臺(tái)盼藍(lán)拒染法。還可以使用例如胸腺嘧啶核苷摻入法對(duì)細(xì)胞合成DNA的能力進(jìn)行測(cè)定，和例如使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞分類(lèi)法結(jié)合熒光計(jì)數(shù)細(xì)胞分選儀(fluorocytometercellsorter)(FACS)來(lái)評(píng)定細(xì)胞的細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)變化。還可如本領(lǐng)域已知檢測(cè)本發(fā)明的MPP在血漿或血清中的活性。例如，將MPP與血清溫育適當(dāng)時(shí)間，然后用例如電泳和與活化的MPP相應(yīng)的電泳條帶的光密度分析來(lái)測(cè)定MPP的活化程度。體內(nèi)方法本發(fā)明的MPP的毒性可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)檢測(cè)。例如，MPP的全部全身毒性可以如實(shí)施例4所述，通過(guò)測(cè)定單次靜脈內(nèi)注射后殺傷100%小鼠的劑量(即LD，)來(lái)檢測(cè)。由于全身或前列腺內(nèi)施用MPP導(dǎo)致的毒性也可通過(guò)例如將MPP施用于狗、大鼠或者猴來(lái)進(jìn)行體內(nèi)評(píng)定。本發(fā)明的MPP減小前列腺大小而由此提示適用于治療BPH的能力可使用本領(lǐng)域已知的動(dòng)物模型在體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。例如，可以使用狗，或諸如食蟹猴、猩猩和狒狒的非人靈長(zhǎng)類(lèi)，檢測(cè)MPP的體內(nèi)活性。例如通過(guò)肛門(mén)周?chē)傲邢賰?nèi)注射施用MPP。在施用后前列腺體積的變化可通過(guò)例如，磁共振成像或前列腺組織尸體剖檢和/或前列腺重量測(cè)定來(lái)評(píng)估。如上所述，能夠減小動(dòng)物模型的前列腺大小，或減緩前列腺的進(jìn)一步生長(zhǎng)的MPP被認(rèn)為適于治療BPH。減小前列腺大小是指減小前列腺的重量或體積，以及減緩前列腺的進(jìn)一步生長(zhǎng)是指其中在動(dòng)物中施用受試化合物之后前列腺的重量或體積增加最少或沒(méi)有增加的情況。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明所涉及的MPP施用于動(dòng)物后，能夠減小前列腺大小，例如，至少10%、20%、30%、40°/?；?0%。MPP抗原性的測(cè)定以及減少當(dāng)治療蛋白施用于受治療者時(shí)，可引起一定水平的抗體反應(yīng)，其中在一些情況下可導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重副作用。因此，如有必要，MPP的抗原性可如本領(lǐng)域已知和下文所述來(lái)進(jìn)行評(píng)定。另外，描述了減少潛在抗原性的方法。本申請(qǐng)所述的MPP的抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)以及強(qiáng)度可在例如具有免疫能力的小鼠中測(cè)定，并可用于促進(jìn)開(kāi)發(fā)可用于具有免疫能力的人的給藥方案。對(duì)具有免疫能力的小鼠諸如C57-BL6系施用靜脈劑量的MPP。在不同間期(例如單次給藥后，多次給藥后)將小鼠處死，并獲得血清。通過(guò)基于ELISA的測(cè)定方法檢測(cè)抗MPP抗體的存在。為了減少本發(fā)明的MPP的抗原性，MPP的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域可功能性缺失并例如使用如上所述的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域取代。這些MPP的抗原性可使用上述方法在暴露于缺失部分天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MPP的不同方案之后進(jìn)行測(cè)定。可用于允許使用MPP持續(xù)治療的另一種方法是使用依序施用的衍生自具有無(wú)重疊抗原性的其他nPP的可選MPP。例如，衍生自氣單胞菌溶素原的MPP可以與衍生自敗血梭狀芽胞桿菌a-毒素或蘇蕓金芽胞桿菌S-毒素的MPP交替使用。所有這些MPP可靶向前列腺細(xì)胞，但是不能被相同抗體識(shí)別或中和。另一個(gè)實(shí)施例是使用衍生自人組織的MPP，諸如溶細(xì)胞的人T細(xì)胞產(chǎn)生的人穿孔素。這些MPP可以被施用，并且因?yàn)樗龅鞍踪|(zhì)為人源性而不會(huì)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。藥物組合物本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括MPP和一種或多種無(wú)毒性的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或助劑。如果需要，所述組合物中可以包括其他活性組分。如上所述，所述組合物用于治療BPH。藥物組合物可以包括大約1%至大約95%的本發(fā)明的MPP。配制用于以單一劑量形式施用的組合物可包括，例如大約20%至大約90%的本發(fā)明的MPP;而非單一劑量形式的組合物可包括，例如大約5%至大約20%的本發(fā)明的MPP。最終制劑中的MPP濃度可以低至0.01jug/mL。例如，最終制劑中的濃度可在大約0.01/xg/mL和大約1,000Mg/mL之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，最終制劑中的濃度在大約0.01pg/mL和大約100pg/mL之間。單位劑量形式的非限制性實(shí)例包括錠劑(dragees)、片劑、安瓿(ampoules)、小瓶(vials)、栓劑和膠囊劑。所述組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或散劑。對(duì)于固體組合物(如，散劑、丸劑、片劑或膠囊劑形式)而言，傳統(tǒng)的無(wú)毒固體載體包括，例如藥用級(jí)甘露糖、乳糖、淀粉、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或硬脂酸鎂。所述組合物可以使用常規(guī)的粘合劑和載體(如甘油三酯)配制成栓劑。對(duì)于動(dòng)物施用而言，所述藥物組合物可配制用于多種途徑施用。例如，所述組合物可配制用于口服、局部、直腸或胃腸外給藥，或用于吸入或噴霧給藥。這里所用的術(shù)語(yǔ)"胃腸外"包括皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、鞘內(nèi)注射、胸骨內(nèi)注射或者輸注技術(shù)。還考慮了向前列腺內(nèi)直接注射或輸注。本發(fā)明還考慮了蛋白毒素的標(biāo)準(zhǔn)給藥方式-對(duì)流增強(qiáng)型遞送。MPP可以與藥學(xué)上可接受的載體一起給藥。理想地，這類(lèi)載體可增強(qiáng)穩(wěn)定性和/或改善輸送的特性。因此，本發(fā)明還提供了MPP與合適載體諸如人工膜泡(包括脂質(zhì)體、囊泡體(noisome)、納米體等)、微粒或微囊的制劑，或包括藥學(xué)上可接受的聚合物的膠體制劑。使用這些載體/聚合物對(duì)實(shí)現(xiàn)MPP的持續(xù)釋放是有益的。可選地，或另外，MPP制劑可包括穩(wěn)定諸如人血清白蛋白的體內(nèi)蛋白的添加劑，或本領(lǐng)域已知的用于蛋白質(zhì)治療劑的其它穩(wěn)定劑。口服使用的藥物組合物可配制成例如片劑、糖錠劑、錠劑、水性或油性懸浮液、可分散的散劑或顆粒劑、乳劑、硬膠囊或軟膠囊、或糖漿劑或酏劑。所述組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的制備藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)制備，并可含有選自甜味劑、調(diào)味劑、著色劑以及防腐劑的組中的一種或多種試劑，以提供藥學(xué)上美觀和適口的制劑。片劑含有活性組分，所述活性組分與下述組分混合合適的藥學(xué)上可接受的無(wú)毒性賦形劑，其包括，例如惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；?；瘎┘氨澜鈩T如玉米淀粉或海藻酸；粘合劑，諸如淀粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤(rùn)滑劑'，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以不用包衣，或者通過(guò)己知技術(shù)進(jìn)行包衣，以延緩其在胃腸道中的崩解和吸收，并由此提供在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的持續(xù)作用。例如，可使用諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延時(shí)材料。口服使用的藥物組合物還可以是其中活性組分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合的硬明膠膠囊，或者是其中活性組分與水或諸如花生油、液體石蠟或橄欖油的油性介質(zhì)混合的軟明膠膠囊。配制成水性懸浮液的藥物組合物包括與一種或多種合適的賦形劑混合的活性化合物，其中所述賦形劑例如懸浮劑，諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基-/3-環(huán)糊精、黃蓍樹(shù)膠和阿拉伯樹(shù)膠；分散劑或潤(rùn)濕劑，諸如天然存在的磷脂，如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙垸與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，如十七垸乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙垸與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯類(lèi)的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯類(lèi)的縮合產(chǎn)物，如聚乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。水性懸浮液還可以含有一種或多種防腐劑，例如乙基或n-丙基、p-羥基-苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑，或一種或多種甜味劑，諸如蔗糖或糖精。藥物組合物可以通過(guò)將活性化合物懸浮于諸如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油的植物油或諸如液體石蠟的礦物油中而制備成油性懸浮液。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或十六醇?？商砑尤缟纤龅奶鹞秳┖?或調(diào)味劑，以提供適口的口服制劑。這些組合物可通過(guò)添加抗氧化劑例如抗壞血酸加以保護(hù)。所述藥物組合物可以配制為可分散的散劑或顆粒劑，所述散劑或顆粒劑隨后可通過(guò)加水用于制備水性懸浮液。這些可分散的散劑或顆粒劑提供了與一種或多種分散劑或濕潤(rùn)劑、懸浮劑和/或防腐劑混合的活性組分。合適的分散劑或潤(rùn)濕劑和懸浮劑由上文所提到的那些舉例說(shuō)明。在這些組合物中，還可以包括其他賦形劑，例如甜味劑、調(diào)味劑以及著色劑。本發(fā)明藥物組合物還可以配制成水包油乳劑。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，或是如液體石蠟的礦物油，或可以是這些油的混合物。這些組合物中所包含的合適乳化劑包括天然存在的樹(shù)膠，如阿拉伯樹(shù)膠或黃蓍樹(shù)膠；天然存在的磷脂，如大豆、卵磷脂；或衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯類(lèi)或部分酯類(lèi)，例如脫水山梨糖醇單油酸酯，以及所述部分酯類(lèi)與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。所述乳劑還可任選地含有甜味劑和調(diào)味劑。所述藥物組合物可通過(guò)將活性組分與一種或多種甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖組合而配制成糖漿劑或酏劑。這些制劑還可任選地含有一種或多種緩和劑(demulcents)、防腐劑、調(diào)味劑和/或著色劑。所述藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法并使用合適的如上所述的一種或多種分散劑或潤(rùn)濕劑和/或懸浮劑配制成無(wú)菌可注射水性懸浮液或油性懸浮液。無(wú)菌注射劑可以是溶于無(wú)毒性的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑的無(wú)菌的可注射溶液或懸浮液，例如溶于1,3-丁二醇的溶液。所用的可接受載體和溶劑包括；但不限于水、林格氏溶液、乳酸鹽林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。其他實(shí)例包括常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)的無(wú)菌非揮發(fā)性油，和多種溫和的非揮發(fā)性油，包括例如合成的單酸甘油酯或甘油二酯。諸如油酸的脂肪酸也可以用于注射劑的制備。其它藥物組合物及制備藥物組合物的方法為本領(lǐng)域已知，并在例如"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy"(先前為"RemingtonsPharmaceuticalSciences");Gennaro,A.,Lippincott,Williams&Wilkins，Philidelphia,PA(2000)中有所描述。上述本發(fā)明藥物組合物包括一種或多種有效量的本發(fā)明MPP以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的。因此，術(shù)語(yǔ)"治療有效劑量"是指改善BPH癥狀或特征的MPP的量?；衔锏闹委熡行┝康臏y(cè)定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。例如，治療有效劑量最初可以使用細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定，或諸如本申請(qǐng)所述的那些動(dòng)物模型來(lái)評(píng)定。動(dòng)物模型也可用于測(cè)定合適的濃度范圍和給藥途徑。然后，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，可將這些信息用于確定在其他動(dòng)物(包括人)中給藥的有用劑量和途徑。治療效果和毒性還可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法如通過(guò)測(cè)定半數(shù)有效劑量或ED5Q(即在群體的50%中治療有效的劑量)和半數(shù)致死量或LD5o(即導(dǎo)致群體的50%死亡的劑量)來(lái)測(cè)定。治療效果與毒性效應(yīng)之間的劑量比被稱為"治療指數(shù)"，它可以表示為L(zhǎng)Dso/ED5o的比值。從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制人或動(dòng)物用的劑量范圍。這些組合物中含有的劑量通常在包括ED5Q和表現(xiàn)少許毒性或無(wú)毒性的濃度范圍內(nèi)。在這個(gè)范圍內(nèi)的劑量隨所使用的劑型、受治療者的敏感性以及給藥途徑等而變化。醫(yī)生可根據(jù)需要治療的受治療者的有關(guān)因素來(lái)確定給藥于受治療者的精確劑量。將劑量和給藥調(diào)整到提供足夠水平的MPP和/或維持預(yù)期效應(yīng)。確定合適的劑量時(shí)可考慮的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、受治療者的一般健康狀況、年齡、體重，以及受治療者的性別、飲食、給藥時(shí)間以及頻率、藥物聯(lián)合、對(duì)治療的反應(yīng)敏感性和耐受性/反應(yīng)。醫(yī)生可以根據(jù)上述因素和諸如特定制劑的半衰期和清除率的因素來(lái)設(shè)計(jì)給藥方案。根據(jù)常規(guī)方法，藥物有效量的本發(fā)明的MPP可以與藥學(xué)上可接受的載體一起配制，以用于胃腸外、口、鼻、直腸、局部以及經(jīng)皮給藥等。所述制劑還可包括一種或多種稀釋劑、填充劑、乳化劑、防腐劑、緩沖劑、賦形劑等，并且可以以如液體、散劑、乳劑、栓劑、脂質(zhì)體、透皮貼劑和片劑的形式提供。緩釋或延長(zhǎng)釋放遞送系統(tǒng)，包括多種生物聚合物(基于生物學(xué)的系統(tǒng))中的任何一種、應(yīng)用脂質(zhì)體的系統(tǒng)以及聚合物遞送系統(tǒng)，也可與本申請(qǐng)所述的組合物一起使用，以提供MPP的持續(xù)或長(zhǎng)期來(lái)源。這些緩釋系統(tǒng)適用于例如口服、局部和胃腸外使用的制劑。術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"是指不影響活性組分的生物活性作用，并對(duì)宿主或患者沒(méi)有毒性的載體介質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)適當(dāng)?shù)姆椒ú凑湛山邮艿牟僮鱽?lái)配制本發(fā)明的化合物，例如RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro,ed.,MackPublishingCo.,EastonPa.，第19版，1995所揭示的。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP與水溶性聚合物偶聯(lián)，例如，以增加穩(wěn)定性或循環(huán)半衰期或減少免疫原性。臨床上可接受的水溶性聚合物包括，但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙二醇均聚物(PPG)、聚氧乙基化多元醇(POG)(如丙三醇)和其他聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨醇，或聚氧乙基化葡萄糖，和其他的碳水化合物聚合物。將多肽與水溶性聚合物如PEG偶聯(lián)的方法，例如在美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20050106148及其引用的參考文獻(xiàn)中有所描述。MPP用于治療良性前列腺增生(BPH)的用途相對(duì)于其他正常組織的細(xì)胞，本發(fā)明的MPP選擇性殺傷正常前列腺細(xì)胞。因此，本發(fā)明的MPP可用于治療或預(yù)防BPH。在一個(gè)實(shí)施方案中，BPH的治療是指減小患有BPH的受治療者的前列腺大小。前列腺的大小可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法包括如測(cè)面積法、扁長(zhǎng)橢圓體積計(jì)算(HWL)以及橢圓體體積測(cè)量技術(shù)測(cè)定其體積來(lái)確定。前列腺大小還可以通過(guò)例如直腸指檢或直腸超聲或細(xì)胞檢查來(lái)直接測(cè)量，或例如通過(guò)測(cè)量血液PSA水平的變化或血液游離PSA和總PSA的比例變化來(lái)間接測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，MPP的給藥減小受治療者的前列腺體積。例如，所揭示的方法能夠減小前列腺的體積，例如至少10%，至少20%，或至少30%，至少40%，或至少50%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BPH的治療涉及降低BPH的一個(gè)或多個(gè)癥狀的嚴(yán)重程度。BPH的癥狀包括排尿變化或排尿問(wèn)題，諸如尿流遲疑、中斷或變?nèi)?、尿急和滲漏或滴瀝，或尿頻(特別是夜間)。這些癥狀也稱為下尿路癥狀(LUTS)。LUTS可以如本領(lǐng)域已知使用美國(guó)泌尿?qū)W會(huì)(AUA)癥狀指數(shù)、Madsen-Iversen評(píng)分系統(tǒng)或Boyarsky系統(tǒng)來(lái)測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BPH的治療涉及預(yù)防或抑制前列腺的繼續(xù)生長(zhǎng)，并且可以如上所述通過(guò)體積增長(zhǎng)率或血液PSA增長(zhǎng)率的減少或BPH癥狀的減輕來(lái)測(cè)定。聯(lián)合治療本發(fā)明的MPP可以單獨(dú)使用或聯(lián)合一種或多種用于BPH的其他治療方法。BPH的其他治療方法包括施用諸如a-l-腎上腺素受體拮抗劑和5-a還原酶抑制劑的藥物、植物藥療法、外科手術(shù)以及微創(chuàng)技術(shù)。a-l-腎上腺素受體拮抗劑的實(shí)例有阿夫唑嗪/哌唑嗪、坦索洛新、特拉唑嗪以及多沙唑嗪。5-a還原酶抑制劑的實(shí)例有非那司提和度他雄胺。植物藥療法的實(shí)例包括鋸葉棕漿果/矮棕櫚(Serenoar印ens)，非洲李子樹(shù)皮(Pygeumafricanum)，南非星草/j3-谷固醇(Hipoxisrooperi)，紫錐花(Echinaceapurpurea)，南瓜籽(Cucurbitap印o),黑麥(Secalecereale)，以及剌蕁麻(Uriticadioica)。外科手術(shù)的實(shí)例包括經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)(TURP)、經(jīng)尿道針剌消融術(shù)(TUNA)、經(jīng)尿道前列腺切開(kāi)術(shù)(TUIP)、經(jīng)尿道微波熱療(TUMT)、激光前列腺切除術(shù)、氣囊擴(kuò)張術(shù)、電汽化前列腺切除術(shù)和開(kāi)放性前列腺切除術(shù)。如果需要減輕對(duì)MPP的全身免疫反應(yīng)，可在使用MPP同時(shí)聯(lián)合施用免疫抑制療法。免疫抑制療法的實(shí)例包括，但不限于全身或局部用皮質(zhì)類(lèi)固醇(Suga等，Ann.Thorac.Surg.73:1092-7，2002)、環(huán)孢霉素A(Fang等，Hum.GeneTher.6:1039-44，1995)、環(huán)磷酰胺(Sm池等，GeneTher.3:496-502,1996)、脫氧精胍菌素(Kaplan等，Hum.GeneTher.8:1095-1104，1997)以及T細(xì)胞和/或B細(xì)胞抗體[如抗-CD40配體、抗CD4抗體、抗-CD20抗體(利妥昔單抗)](Manning等，Hum.GeneTher.9:477-85,1998)?？稍贛PP給藥之前、給藥期間或給藥之后施用這些藥劑。本發(fā)明的MPP可以與上述的治療方法分開(kāi)、依序或同時(shí)給藥。MPP的給藥可以使用本領(lǐng)域已知的方法將治療有效量的本發(fā)明MPP或編碼MPP的核苷酸局部或全身施用于患有BPH的受治療者。在一個(gè)實(shí)施方案中，將MPP注射到患有BPH的受治療者的前列腺內(nèi)(前列腺內(nèi)注射)。例如，可使用類(lèi)似于近距離放療的多次注射途徑的給藥途徑，其中適于作為組合物或制劑并以合適劑型存在的多等份純化的肽可以使用針通過(guò)會(huì)陰注射。此外，或可選地，MPP可以全身施用于患有BPH的受治療者，例如通過(guò)靜脈注射、肌肉注射、皮下注射或口服。MPP的治療有效量是指足夠產(chǎn)生所需的生物學(xué)效應(yīng)的量，例如有效減小前列腺大小(即體積和/或重量)，或減緩前列腺的進(jìn)一步生長(zhǎng)，或減輕BPH的癥狀的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，它是足夠減輕受治療者的BPH的體征或癥狀的量。在特定實(shí)施例中，它是有效減小前列腺體積至少10%、20%、30%、40%或50%的量。在另一實(shí)施方案中，它是足夠預(yù)防前列腺體積或重量進(jìn)一步增加的量。有效劑量可以從來(lái)源于體外或動(dòng)物模型試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量效應(yīng)曲線來(lái)外推。在治療過(guò)程中，MPP的有效量可以單次劑量或多次劑量(例如每天)給藥。然而，MPP的有效量取決于受治療者、受治療病癥的嚴(yán)重性以及類(lèi)型，以及給藥方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于前列腺內(nèi)給藥，MPP的治療有效量為大約0.01ptg/g前列腺重量至50/ig/g前列腺重量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于前列腺內(nèi)給藥，MPP的治療有效量為大約0.02Mg/g前列腺重量至40Mg/g前列腺重量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于前列腺內(nèi)給藥，MPP的治療有效量為大約0.02/xg/g前列腺重量至35Mg/g前列腺重量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于前列腺內(nèi)給藥，MPP的治療有效量為大約0.03/ig/g前列腺重量至25pg/g前列腺重量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于前列腺內(nèi)給藥，MPP的治療有效量為大約0.04/xg/g前列腺重量至20/xg/g前列腺重量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于前列腺內(nèi)給藥，MPP的治療有效量為大約0.04pg/g前列腺重量至10/xg/g前列腺重量。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于70kg的人，MPP的前列腺內(nèi)有效靜脈劑量為大約1mg至大約10mgMPP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP的有效靜脈劑量為大約1mg至大約5mg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MPP的有效靜脈劑量為大約1mg至大約3mg。在又一個(gè)實(shí)施方案中，MPP的有效靜脈劑量為大約2.8mg。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于70kg的人，MPP的有效前列腺內(nèi)劑量為大約10mg至大約100mgMPP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于70kg的人，MPP的有效前列腺內(nèi)劑量為大約10mg至大約50mgMPP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于70kg的人，MPP的有效前列腺內(nèi)劑量為大約10mg至大約30mgMPP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于70kg的人，MPP的有效前列腺內(nèi)劑量為大約28mg。MPP的體內(nèi)表達(dá)為替代MPP給藥(或在此之外)來(lái)治療BPH,可通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)編碼MPP的核苷酸而實(shí)現(xiàn)BPH的長(zhǎng)期或全身治療。編碼MPP的核苷酸本發(fā)明考慮到使用編碼MPP的核苷酸或DNA分子來(lái)治療BPH。這些DNA分子可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和本申請(qǐng)所揭示的序列信息來(lái)獲得。合適的DNA分子和核苷酸包括在嚴(yán)緊性條件下與所揭示的DNA序列雜交的那些或其片段，前提是它們編碼功能MPP。導(dǎo)致特定程度嚴(yán)緊性的雜交條件根據(jù)雜交方法的特性以及所使用的雜交DNA的組成和長(zhǎng)度而不同。通常，雜交的溫度和雜交緩沖劑的離子強(qiáng)度(特別是Na+濃度)決定雜交的嚴(yán)緊性。關(guān)于達(dá)到特定量的嚴(yán)緊性所需的雜交條件的計(jì)算在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989，第9和11章)中有描述。使用標(biāo)記有pP]-dCTP的耙探針的雜交通常在高離子強(qiáng)度溶液(如6倍的SSC)中以低于解鏈溫度Tm約5-25°C的溫度進(jìn)行。嚴(yán)緊性條件的實(shí)例是對(duì)于短探針(例如10-50個(gè)核苷酸)而言，在pH7.0-8.3以及至少大約30。C的溫度下，至少大約0.01M到l.OM的鈉離子(或其他鹽)的鹽濃度。嚴(yán)緊性條件可以通過(guò)添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，在25-30°C，5倍SSPE(750mMNaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA,pH7.4)的條件適于等位基因特異性探針雜交。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性還允許DNA分子核苷酸序列內(nèi)的變異，同時(shí)維持所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。例如，氨基酸Ala由核苷酸密碼子三聯(lián)體GCT、GCG、GCC和GCA編碼。因此，可以改變核苷酸序列而不影響所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成或該蛋白質(zhì)的特征。根據(jù)遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，使用上述的標(biāo)準(zhǔn)的DNA誘變技術(shù)或通過(guò)DNA序列合成可以從參考DNA分子獲得變異體DNA分子。本公開(kāi)內(nèi)容還包括由于基于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的序列變異而在嚴(yán)緊性條件下不與所揭示的DNA序列雜交的DNA序列。本發(fā)明提供了表達(dá)MPP的方法，例如在細(xì)胞或組織內(nèi)體內(nèi)表達(dá)修飾的氣單胞菌溶素原多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)染在體外進(jìn)行。在該實(shí)施例中，細(xì)胞或組織(諸如移植物)取自受治療者，并用含有編碼目標(biāo)蛋白的cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生功能蛋白，并且可以再導(dǎo)入受治療者中。在另一個(gè)實(shí)施例中，將編碼目標(biāo)蛋白的核酸直接施用于(諸如靜脈內(nèi)或前列腺內(nèi))受治療者，并在體內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)染。目前，人細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需的科學(xué)和醫(yī)學(xué)操作是常規(guī)方法。美國(guó)專(zhuān)利第5,529,774號(hào)公開(kāi)了將基因轉(zhuǎn)入供體細(xì)胞內(nèi)的一般策略。通常，將編碼具有所需治療效果的蛋白質(zhì)的基因克隆至病毒表達(dá)載體中，然后將該載體引入耙生物體。病毒感染細(xì)胞，并在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列，其中所述蛋白質(zhì)具有所需的治療效果(Zabner等，Cell75:207-16,1993)。只需將DNA或蛋白質(zhì)元件導(dǎo)入某些細(xì)胞或組織，例如，前列腺即可。然而，在一些情況下，例如通過(guò)血管內(nèi)(i.v.)或口服施用可更治療有效和更簡(jiǎn)單地治療所有受治療者的細(xì)胞或更廣泛地分散載體。編碼MPP的核苷酸序列受合適的啟動(dòng)子的調(diào)控?？墒褂玫暮线m的啟動(dòng)子包括，但不限于基因天然啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR啟動(dòng)子或腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；CMV啟動(dòng)子；RSV啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如MMTV啟動(dòng)子；金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；組蛋白啟動(dòng)子；(x-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；TK啟動(dòng)子；B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子；以及ApoAI啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，啟動(dòng)子是前列腺特異性啟動(dòng)子，如probasin啟動(dòng)子。然而，公開(kāi)內(nèi)容不限于特異性的外源基因或啟動(dòng)子?？赏ㄟ^(guò)使得重組核苷酸到達(dá)合適細(xì)胞的已知方法將重組的核苷酸給藥于受治療者。這些方法包括注射、輸注、沉積、移植或局部給藥。注射可以是皮內(nèi)或皮下注射。如下文進(jìn)一步描述，重組核苷酸可以作為病毒載體的部分或作為諸如裸DNA或脂質(zhì)體包被的DNA的非感染形式進(jìn)行遞送，所述病毒載體諸如禽痘病毒、重組痘苗病毒、復(fù)制缺陷腺病毒毒株或脊髓灰質(zhì)炎病毒。腺病毒載體基本上包括全部的腺病毒基因組(Shenk等，Curr.T叩.Microbiol.Immunol.111:1-39，1984)?？蛇x地，腺病毒載體為其中至少一部分腺病毒基因組缺失的修飾的腺病毒載體。在一個(gè)實(shí)施例中，所述載體包括腺病毒5'ITR;腺病毒3'ITR;腺病毒殼體化信號(hào)；編碼治療劑的DNA序列；以及表達(dá)編碼治療劑的DNA序列的啟動(dòng)子。該載體沒(méi)有腺病毒El和E3DNA序列的至少大部分，并且不一定全沒(méi)有E2和E4DNA序列，而且編碼腺病毒蛋白的DNA序列由腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述載體為諸如美國(guó)專(zhuān)利第4,797,368號(hào)(Carter等)禾卩McLaughlin等(丄Virol.62:1963-73，1988)所述的腺相關(guān)病毒(AVV)，和4型AAV(Chiorini等，丄Virol.71:6823-33,1997)以及5型AAV(Chiorini等，J.Virol.73:1309-19,1999)。這種載體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用穿梭質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建，所述穿梭質(zhì)粒5'末端起始含有腺病毒5'ITR，腺病毒殼體化信號(hào)，以及Ela增強(qiáng)子序列，啟動(dòng)子(可以是腺病毒啟動(dòng)子或外源啟動(dòng)子)，三聯(lián)前導(dǎo)序列，多克隆位點(diǎn)(可以是本申請(qǐng)所述)，多聚腺苷酸(polyA)信號(hào)，以及對(duì)應(yīng)于腺病毒基因組片段的DNA片段。所述DNA片段作為與修飾或突變的腺病毒同源重組的底物，且可以包括例如腺病毒5'基因組不超過(guò)堿基3329到堿基6246的片段。所述質(zhì)粒還可以包括可選擇的標(biāo)記物和復(fù)制起始區(qū)。所述復(fù)制起始區(qū)可以是細(xì)菌的復(fù)制起始區(qū)。編碼治療劑的所需DNA序列可以插入至質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)?？捎糜趯?shí)踐本申請(qǐng)所述方法的載體的實(shí)例包括，但不限于下列文獻(xiàn)中公開(kāi)的那些Woo等的WO95/27512;Walsh等的WO01/127303;Couto等的美國(guó)專(zhuān)利第6,221,349號(hào)；High等的美國(guó)專(zhuān)利第6，093，392號(hào)。臨床試驗(yàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在體外和動(dòng)物模型中證實(shí)了MPP用于治療BPH的有效性之后，應(yīng)在臨床試驗(yàn)中對(duì)MPP進(jìn)行試驗(yàn)以進(jìn)一步評(píng)價(jià)MPP在治療BPH中的效果以及獲得治療用途的監(jiān)管審批。如本領(lǐng)域己知，臨床試驗(yàn)經(jīng)過(guò)幾期試驗(yàn)，它們分為I期、II期、III期和IV期。最初，在I期試驗(yàn)中評(píng)價(jià)MPP。通常，I期試驗(yàn)用于確定給藥的最佳模式(例如通過(guò)丸劑或通過(guò)注射)、給藥頻率以及化合物的毒性。I期研究常常包括實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如驗(yàn)血和活檢，以評(píng)價(jià)患者體內(nèi)的潛在治療效果。對(duì)于I期試驗(yàn)，小組的BPH患者用特定劑量的MPP來(lái)治療。在試驗(yàn)期間，通常挨組增加劑量，以確定與所述化合物相關(guān)的最大耐受劑量(MTD)和劑量限制性毒性(DLT)。這個(gè)過(guò)程確定用于隨后II期試驗(yàn)的合適劑量。II期試驗(yàn)用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)MPP的效果和安全性。在II期試驗(yàn)中，將MPP以I期試驗(yàn)中有效的劑量給藥于多組BPH患者。III期試驗(yàn)集中于確定與標(biāo)準(zhǔn)或最廣泛接受的治療相比MPP的治療效果如何。在III期試驗(yàn)中，隨機(jī)將患者分入兩個(gè)或更多"分組(arm)"之一中。在具有兩個(gè)分組的試驗(yàn)中，例如一個(gè)分組接受標(biāo)準(zhǔn)治療(對(duì)照組)，另外一個(gè)分組接受MPP治療(研究組)。IV期試驗(yàn)用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)MPP的長(zhǎng)期安全性和效果。IV期試驗(yàn)不如I、II、III期試驗(yàn)常見(jiàn)，且在MPP被批準(zhǔn)用于標(biāo)準(zhǔn)用途之后進(jìn)行。用于臨床試驗(yàn)的患者的中選條件參與者的中選標(biāo)準(zhǔn)可以從一般(例如年齡、性別、疾病類(lèi)型)到具體(例如先前治療的類(lèi)型和數(shù)目、疾病特征、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、器官機(jī)能)。在一個(gè)實(shí)施方案中，中選的患者已經(jīng)被診斷為BPH。中選標(biāo)準(zhǔn)還可隨著試驗(yàn)期不同而不同。臨床試驗(yàn)的中選患者也可以根據(jù)尿路梗阻的客觀測(cè)量，以及對(duì)口服治療BPH無(wú)反應(yīng)來(lái)選擇。例如，在I期和II期試驗(yàn)中，所述標(biāo)準(zhǔn)常排除那些由于器官功能異常或其他因素而對(duì)研究性治療有危險(xiǎn)的患者。在n期和m期試驗(yàn)中，常包括有關(guān)疾病的類(lèi)型和階段以及先前治療的數(shù)目和類(lèi)型的其他標(biāo)準(zhǔn)。I期試驗(yàn)通常包括15-30名對(duì)其他治療選擇無(wú)效果的參與者。II期試驗(yàn)通常包括達(dá)100名已接受藥物治療或手術(shù)但是治療沒(méi)有效果的參與者。II期試驗(yàn)的參與者常常由于先前所接受的治療而受限制。III期試驗(yàn)通常包括成百上千的參與者。為了確定MPP與標(biāo)準(zhǔn)治療的效果是否存在真正差異，大量的參與者是必需的。ni期包括從新診斷患有BPH的患者到患有廣泛性疾病的患者，以覆蓋疾病連續(xù)帶(diseasecontinuum)0本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能地全面，而不使受研究群體差異太大以致于不能確定治療對(duì)較精細(xì)定義的群體是否有效。試驗(yàn)中包括的受研究群體差異越大，結(jié)果對(duì)于一般群體更為適用，尤其是在III期試驗(yàn)中。認(rèn)為臨床試驗(yàn)各期的合適的參與者的選擇是在本領(lǐng)域工作者的普通技能范圍之內(nèi)。治療前患者的評(píng)定在研究開(kāi)始之前，可使用本領(lǐng)域已知的幾種測(cè)定方法對(duì)患者進(jìn)行初分類(lèi)。例如，首先使用見(jiàn)于家庭醫(yī)療手冊(cè)(FamilyPracticeNotebook)網(wǎng)頁(yè)上的良性增生癥狀指數(shù)來(lái)評(píng)定患者。也可以根據(jù)患者疾病的類(lèi)型和/或其疾病的階段和/或前列腺的大小對(duì)患者進(jìn)行分類(lèi)。臨床試驗(yàn)中MPP的給藥通常，通過(guò)注射將MPP給藥于試驗(yàn)參與者。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)前列腺內(nèi)注射進(jìn)行MPP的給藥?？蓪?duì)MPP的劑量范圍進(jìn)行試驗(yàn)。只要具有臨床前試驗(yàn)的信息，熟練的醫(yī)生就能容易地確定用于臨床試驗(yàn)的MPP的合適劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.01Mg/g前列腺至大約50pg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.02昭/g前列腺至大約40Mg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.02Mg/g前列腺至大約35/xg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.03/ig/g前列腺至大約25Mg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.04pg/g前列腺至大約20/xg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.04pg/g前列腺至大約10Mg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.1)Ug/g前列腺至大約5Mg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.2/xg/g前列腺至大約3/xg/g前列腺。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.5//g/g前列腺至大約2/ig/g前列腺。藥物代謝動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)為了符合I期標(biāo)準(zhǔn)，例如，通過(guò)對(duì)定時(shí)采集的諸如血液或尿的樣品進(jìn)行化學(xué)分析來(lái)監(jiān)測(cè)MPP的分布。例如，可以定時(shí)采集樣品直到輸注開(kāi)始后大約72小時(shí)為止。如果不立即進(jìn)行分析，可以將樣品采集后置于千冰上，然后轉(zhuǎn)到冰箱一70。C保存，直到可以進(jìn)行分析。用于分析的樣品可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制備，并且所存在的MPP的量可以通過(guò)例如高效液相色譜方法(HPLC)來(lái)測(cè)定。藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可以通過(guò)與臨床藥理學(xué)專(zhuān)家合作來(lái)獲取和分析，并用于確定如清除率、半衰期以及最大血漿濃度?；颊呓Y(jié)果的監(jiān)測(cè)臨床試驗(yàn)的終點(diǎn)為表明所評(píng)估的化合物的效果的可檢測(cè)結(jié)果。終點(diǎn)在臨床試驗(yàn)開(kāi)始之前確定，并且根據(jù)臨床試驗(yàn)的類(lèi)型和時(shí)期而不同。終點(diǎn)的實(shí)例包括，例如前列腺體積減小，血PSA水平降低，泌尿道癥狀改善，尿流量改善，以及急性尿潴留減輕。其他終點(diǎn)包括毒性和生活質(zhì)量。藥物試劑盒本發(fā)明還提供了治療試劑盒或試劑包，其含有用于治療BPH的一種或多種MPP或包括一種或多種MPP的藥物組合物。所述MPP可以以單位劑型在試劑盒中提供。試劑盒的各組分可以用單獨(dú)的包裝物包裝，當(dāng)適用時(shí)，與之相關(guān)的可以有由管理藥物或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的通告，所述通告反映了用于人或動(dòng)物給藥的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。所述試劑盒還可任選包括與本發(fā)明的MPP聯(lián)合使用的一種或多種其他治療劑。所述試劑盒可任選包括說(shuō)明MPP和/或其他治療劑的使用方法或給藥方案的指導(dǎo)書(shū)或說(shuō)明書(shū)。當(dāng)試劑盒的組分以一種或多種液體溶液提供時(shí)，所述液體溶液可以是水溶液，例如無(wú)菌的水溶液。在這種情況下，包裝物裝置本身可以是吸入器、注射器、吸量管、眼滴管，或其他類(lèi)似的器械，所述組合物可以從這些裝置給藥于患者或用于與試劑盒內(nèi)的其他組分混合。所述試劑盒的組分還可以以干燥或凍干形式提供，并且所述試劑盒還可含有用于重溶凍干組分的合適的溶劑。不考慮包裝物的數(shù)量或類(lèi)型，本發(fā)明的試劑盒還可含有輔助組合物給藥于患者的工具。這種工具可以是吸入器、注射器、吸量管、鑷子、測(cè)量勺、眼滴管，或類(lèi)似的醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的遞藥工具?，F(xiàn)在將參考具體實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，下述實(shí)施例意在描述本發(fā)明的實(shí)施方案而非意在以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:制備由PSA活化的MPP本實(shí)施例描述用來(lái)根據(jù)如表6內(nèi)所示的本發(fā)明實(shí)施方案制備由PSA活化的MPP的方法。這些MPP衍生自氣單胞菌溶素原。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以使用相似的方法來(lái)制備由PSA或任何其它的前列腺特異性蛋白酶活化的其它MPP。此類(lèi)蛋白質(zhì)可以通過(guò)將氣單胞菌溶素原的弗林蛋白酶序列取代為前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)如PSA特異性切割序列而產(chǎn)生。表6具有活化序列的MPP與野生型氣單胞菌溶素原的比較，其中所述的活化序列含有由PSA切割的蛋白酶切割位點(diǎn)MPP與野生型氣單胞菌溶素原(SEQIDNO:)所產(chǎn)生的變化(SEQIDNO:)ADSKVRRARSVDGAGQGLRLEIPLD(SEQIDNO:2的氨基酸424-448)相比MPP1(3和4)KVRRAR(SEQIDNO:2的氨基ADSHSSKLQSVDGAGQGLRL酸427-432)變成HSSKLQ(5)EIPLD(SEQIDNO:4的氨基酸424-448)MPP2(6和7)KVRRARSV(SEQIDNO:2的氨ADSHSSKLQSADGAGQGRLE基酸427-434)變成HSSKLQSA(8)IPLD(SEQIDNO:7的氨基酸424-448)MPP3(9禾n10)KVRRAR(SEQIDNO:2的氨基ADSQFYSSNSVDGAGQGLRL酸427-432)變成QFYSSN(ll)EIPLD(SEQIDNO:10的氨基酸424-448)MPP4(12禾口13)KVRRAR(SEQIDNO:2的氨基ADSGISSFQSSVDGAGQGLR酸427-432)變成GISSFQS(14)LEIPLD(SEQIDNO:13的氨基酸424-448)表6內(nèi)所示的MPP包括氣單胞菌溶素原序列(SEQIDNO:1和2內(nèi)所示的野生型PA)，其中弗林蛋白酶的6氨基酸識(shí)別位點(diǎn)(SEQIDNO:2的氨基酸427-432)由PSA切割位點(diǎn)替換。例如，MPP1(SEQIDNO:3和4)包括其中弗林蛋白酶切割位點(diǎn)由PSA底物HSSKLQ(SEQIDNO:5)替換的氣單胞菌溶素原序列。使用如前所述的方法(Vallette等，Nucl.AcidsRes.17:723-33，1988)，使用重組PCR來(lái)將氣單胞菌溶素的弗林蛋白酶位點(diǎn)(SEQIDNO:2的氨基酸427-432)取代成PSA特異性切割位點(diǎn)(SEQIDNO:5、8、11或14)。簡(jiǎn)而言之，使用50pi終體積進(jìn)行重組PCR，其中所述的終體積含有0.2mM脫氧核苷三磷酸(dNTP)、0.5/iM正向引物和反向引物、0.1/xg模板DNA和在pfu反應(yīng)緩沖液[20mMTris-HCl(pH8.8)、10mMKC1、10mM(NH4)2S04、2mMMgS04、0.1%TritonX-100和0.1mg/mlBSA]的2.5單位克隆的pfu聚合酶。通過(guò)使用Taq聚合酶的PCR來(lái)篩選具有氣單胞菌溶素原插入物的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。使用含有0.2mMdNTP、0.5pM正向引物和反向引物和5單位Taq聚合酶的PCR反應(yīng)緩沖液[50mMKCl、1.5mMMgCl2和10mMTris-HCl(pH9.0)]制備混合物。將這種混合物的10pl樣品等分至0.2ml管內(nèi)并且使用無(wú)菌牙簽添加轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。PCR終產(chǎn)物使用適宜的限制酶切消化，隨后連接至克隆載體pTZ18u(BioRad訴于擴(kuò)增。簡(jiǎn)而言之，限制酶切消化在37°C在含有每MgDNA大約1單位限制酶的PharmaciaOne-Phor-All緩沖液[IOmMTris-乙酸鹽(pH7.5)、10mM乙酸鎂和50mM乙酸鉀](méi)內(nèi)進(jìn)行90分鐘。得到的插入物和pTZ18u載體DNA以大約5:1的比率進(jìn)行混合并在45。C加熱15分鐘。隨后，將樣品使用One-PhorAll緩沖液稀釋并且添加ATP至終濃度1mM用于粘端連接或至終濃度0.5mM用于平端連接。隨后，將11單位的T4DNA連接酶添加至每份樣品內(nèi)并且溫和地混合樣品。連接在13。C實(shí)施4小時(shí)(粘端連接)或16小時(shí)(平端連接)。分離并亞克隆至廣范宿主性質(zhì)粒pMMB66HE(Furste等，Gene48:119-131，1986)用于在大腸桿菌中表達(dá)。使用前述的(Cohen等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA69:2110-4，1972)CaCl2洗滌法使大腸桿菌DH5a細(xì)胞變成感受態(tài)。通過(guò)離心收獲對(duì)數(shù)期內(nèi)的細(xì)胞(OD60()-0.4-0.7)并在1/4體積的冰冷100mMMgCl2內(nèi)洗滌。使細(xì)胞再次沉淀(pelleted)并重懸于2體積的冰冷100mMCaCl2。細(xì)胞隨后在冰上溫育大約45分鐘。隨后將細(xì)胞離心并重懸于1/10體積的100mMCaCl2。繼續(xù)溫育額外的45分鐘，隨后添加甘油至15%終濃度。感受態(tài)細(xì)胞貯存在-70。C直至使用。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞根據(jù)Itiovie等(Gene96:23-8，1990)的方法進(jìn)行。感受態(tài)細(xì)胞(200]Ld等分試樣)與0.5-10ng的DNA在冰上溫育1小時(shí)。隨后使細(xì)胞在42。C熱休克4分鐘。將細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移回到冰上5分鐘。隨后，將500Ml的LB培養(yǎng)基添加至每份樣品并將細(xì)胞在37。C溫育1小時(shí)，同時(shí)溫和地?cái)嚢?。將等分試?150pl)涂布在含有50/ig/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上。這些平板在37°C溫育過(guò)夜。使用Harayama等(Mol.Gen.Genet.180:47-56，1980)的濾膜接合技術(shù)，使重組pMMB66HE克隆通過(guò)接合而轉(zhuǎn)移至殺鮭氣單胞菌菌株CB3(見(jiàn)Buckley,Biochem.Cell.Biol.68:221-4,1990)。使用殺鮭氣單胞菌的這種蛋白酶缺陷菌株導(dǎo)致產(chǎn)生不混雜已活化的氣單胞菌溶素的MPP并導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)產(chǎn)生。MPP通過(guò)如前(Buckley,Biochem.Cell.Biol.68:221-4,1990)所述的羥基磷灰石層析法和離子交換層析法加以純化。這種方法產(chǎn)生批次與批次之間相同的MPP制品。實(shí)施例2:MPP1在體外特異性裂解產(chǎn)生PSA的細(xì)胞本實(shí)施例描述用來(lái)測(cè)定根據(jù)如實(shí)施例1內(nèi)所述的本發(fā)明實(shí)施方案的MPP特異性的方法。此類(lèi)方法可以用來(lái)檢驗(yàn)包含PSA特異性切割位點(diǎn)的MPP的特異性。檢測(cè)MPP1對(duì)產(chǎn)生PSA的LNCaP細(xì)胞(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，馬納薩斯，Va.)和不產(chǎn)生PSA的TSU細(xì)胞(T.Itzumi博士，日本帝京大學(xué))的對(duì)抗。細(xì)胞在10"M至10-SMMPP1存在下溫育24小時(shí)。隨后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并基于排出臺(tái)盼藍(lán)的能力評(píng)定活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。測(cè)定MPP1相對(duì)于LNCaP和TSU系殺死50%細(xì)胞所需要的濃度(1(:50)。MPPl針對(duì)產(chǎn)生PSA的細(xì)胞的LDso是1(T1()M。相反，針對(duì)不產(chǎn)生PSA的TSU細(xì)胞的LDso是大約5x10—8M。如同對(duì)產(chǎn)生PSA的人細(xì)胞系與對(duì)不產(chǎn)生PSA的人細(xì)胞系的毒性相差500倍所證實(shí)的一樣，該結(jié)果表明MPP1被PSA特異性地活化。實(shí)施例3:MPP1不在含有PSA的血液內(nèi)活化包含PSA切割位點(diǎn)的MPP不應(yīng)在血液內(nèi)活化，原因是血液內(nèi)因存在摩爾大為過(guò)量的血清蛋白酶抑制物如a-l-抗胰凝乳蛋白酶和"-2-巨球蛋白而使PSA受到酶滅活。為檢驗(yàn)人血清內(nèi)其它血清蛋白酶和PSA對(duì)MPP1的非特異性活化，敏感的溶血測(cè)定如下進(jìn)行。添加血液紅細(xì)胞(RBC，2。/。v/v)至含有MPP1士PSA的血漿或緩沖液。溶血的程度通過(guò)測(cè)量釋放至上清液內(nèi)的血紅蛋白進(jìn)行分析。添加0.1。/。Triton在數(shù)秒內(nèi)引起100%溶血并且用作陽(yáng)性對(duì)照。水解的量表述為540nm處樣品吸光度與Triton處理的樣品的吸光度的比率。在添加RBC前，MPPl(l(y8M)與PSA在含水緩沖液內(nèi)單獨(dú)預(yù)溫育l小時(shí)，引起大約45%溶血(圖2)。為確定MPP1是否在人血漿內(nèi)被活化，將MPP1(1(T8M)在50%人血漿內(nèi)溫育1小時(shí)。在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，首先添加過(guò)量的PSA(10，000ng/ml)至人血漿內(nèi)并允許溫育數(shù)小時(shí)。含有MPP1的血漿±PSA隨后與人RBC(2%v/v)溫育。添加MPP1的人血漿或添加高濃度PSA的人血漿未導(dǎo)致可察覺(jué)的溶血(即<Triton對(duì)照的1%，圖2)。這些結(jié)果表明MPP1可以全身性施用而在血液內(nèi)無(wú)任何顯著活化，即便血液含有可測(cè)量的PSA。實(shí)施例4:MPP1、MPP2和MPP3的體外毒性和體內(nèi)毒性本實(shí)施例描述用來(lái)測(cè)定MPP體外毒性和體內(nèi)毒性的方法。為測(cè)定體外毒性，如下進(jìn)行細(xì)胞生存力測(cè)定。EL4小鼠T-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(ATCCTIB-39)在MTS/PMSCellTiter96(Promega)內(nèi)以每孔105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。如圖3內(nèi)所示，將MPP1、MPP2和MPP3以lxl(T13M-lxl(T7M添加并與細(xì)胞在37。C溫育4小時(shí)。隨后根據(jù)MTS/PMS試劑盒的制造商的指導(dǎo)，通過(guò)在平板讀數(shù)儀上對(duì)平板讀數(shù)而測(cè)定細(xì)胞生存力。如圖3內(nèi)所示，MPP毒性比野生型氣單胞菌溶素原低，其LCm是4xlO-9(MPPl)、lxlO-9(MPP2)和lxlO-7(MPP3)，相反，野生型的LC50是1.5xl(T10。為測(cè)定體內(nèi)毒性，將MPP靜脈內(nèi)施用至小鼠。野生型氣單胞菌溶素原(SEQIDN0:2)對(duì)小鼠的毒性高；1pg劑量在1小時(shí)內(nèi)引起死亡并且在單次IV注射24小時(shí)后的LD咖(即在24小時(shí)內(nèi)殺死100%動(dòng)物的劑量)是O.lAtg。與之相比，MPP1(SEQIDNO:4)在注射24小時(shí)后的LD咖高25倍(即2.5pg總劑量)。實(shí)施例5:MPP5(組氨酸標(biāo)記的MPP)的制備本發(fā)明組氨酸標(biāo)記的MPP(MPP5)如下制備。對(duì)含有編碼MPP1的基因的質(zhì)粒插入物進(jìn)行修飾以使純化更簡(jiǎn)易并提高產(chǎn)量。對(duì)35個(gè)核苷酸的片段(stretch)進(jìn)行修飾以防止環(huán)形成，并留出ATG起始密碼子上游的23個(gè)核苷酸(Diep等，Mol.Microbiol.30:341-52，1998)，其中所述35個(gè)核苷酸的片段包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)和ATG起始密碼子，而且其在轉(zhuǎn)錄時(shí)形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量減少的二級(jí)環(huán)結(jié)構(gòu)(Burr等，J.Bacteriol.183:5956-63，2001)。這增加了可以釋放至CB3的培養(yǎng)上清液內(nèi)的MPP的量(Burr等，J.Bacteriol.183:5956-63，2001)。將具有這種新上游序列的構(gòu)建體命名為7123啟動(dòng)子構(gòu)建體。通過(guò)用Kpnl和EcoRI消化MPP1構(gòu)建體，隨后連接所得片段至yl23-aerA::pTZ18U的Kpnl/EcoRI位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)變化。所得構(gòu)建體稱作7l23-MPPl::pTZ18U。使用2步法QuikChange(Stratagene)方案完成添加His標(biāo)簽。在第一步驟內(nèi)，3個(gè)His殘基通過(guò)合成兩種引物(3個(gè)CAT密碼子編碼額外的His殘基)而添加到t423-MPP1DNA的末端EndHisl(有義)5'-GCTGCCAATCAACATCATCATTAACGGCAGCGC-3,(SEQIDNO:26)EndHisl(反義)5，-GCGCTGCCGTTAATGATGATGTTGATTGGCAGC-3，(SEQID:27)這些引物按照Stratagene對(duì)QuikChange試劑盒所建議的方案使用。一旦3個(gè)His殘基的DNA的加入通過(guò)測(cè)序得到證實(shí)，則進(jìn)行第二次QuikChange反應(yīng)以便添加最后3個(gè)His殘基的核苷酸。在該步驟內(nèi)，所用的引物是EndHis2(有義)5'墨GCCAATCAACATCATCATCATCATCATTAACGGCAGCGC-3，(SEQIDNO:28)EndHis2(反義)5，-GCCAATCAACATCATCATCATCATCATTAACGGCAGCGC-3，(SEQIDNO:29)。在第二輪PCR后，篩選克隆并對(duì)其測(cè)序以證實(shí)6個(gè)His殘基在7123-MPPl末端以正確的可讀框內(nèi)正確插入，并對(duì)7123-MPP1序列沒(méi)有造成其它變化。得到的質(zhì)粒命名為7l23-MPP5::pTZ18U，并對(duì)7123-PSAH6插入?yún)^(qū)測(cè)序(見(jiàn)圖34)。7123-MPP5的核苷酸序列與MPPl構(gòu)建體核苷酸序列在ATG起始密碼子之前的區(qū)域內(nèi)的差異是7123啟動(dòng)子替換正常aerA上游序列。7123-MPP5的核苷酸序列還具有緊鄰TAA終止密碼子之前的額外CAT重復(fù)序列。當(dāng)7123-MPP5的可讀框翻譯成氨基酸序列時(shí)，與MPPl氨基酸序列比較可見(jiàn)的僅存差異是在蛋白質(zhì)的C末端添加了6個(gè)組氨酸殘基。123-MPP5克隆至pMMB208表達(dá)載體將通過(guò)添加7123啟動(dòng)子和His標(biāo)簽產(chǎn)生的7123-MPP5克隆至質(zhì)粒pMMB208內(nèi)。該質(zhì)粒因其賦予氯霉素抗性而選擇，它含有IPTG誘導(dǎo)型tac啟動(dòng)子并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)接作用轉(zhuǎn)移至殺鮭氣單胞菌內(nèi)。因此，將7123-PSAPAH6插入物克隆至pMMB208質(zhì)粒的HindIII和EcoRI位點(diǎn)內(nèi)。得到的質(zhì)粒7123-MPP5::208轉(zhuǎn)接至殺鮭氣單胞菌菌株CB3用于產(chǎn)生MPP5。為純化GLPMPP5，用大約1。/。v/v搖瓶接種物接種初始pH設(shè)定為6.90±0.15及溫度27。C的30L無(wú)菌確定成分培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的pH通過(guò)發(fā)酵期間自動(dòng)添加無(wú)菌的酸/堿而維持在6.90±0.15。調(diào)節(jié)發(fā)酵罐RPM和SLM以便在全部時(shí)間內(nèi)維持容器內(nèi)的溶氧濃度(DOT)^20。/。。細(xì)胞密度達(dá)到600nmOD0.3-0.6時(shí)，添加異丙基硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)MPP5表達(dá)。表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌至培養(yǎng)基并在誘導(dǎo)數(shù)小時(shí)后得以收獲。使用60SPCUNO濾器回收含有MPP5的上清液。細(xì)胞分離后，上清液使用30,000NMWCTFF膜濃縮。濃縮的上清液使用兩個(gè)層析步驟加以純化產(chǎn)生可接受純度蛋白質(zhì)鎳螯合層析，隨后陰離子交換層析。合并來(lái)自陰離子交換層析步驟中的含有MPP5的部分，并且將得到的材料通過(guò)超濾作用濃縮至大約1mg/mL并且隨后透析濾過(guò)(diafiltered)至制劑緩沖液內(nèi)。純化的MPP5使用0.22/mi絕對(duì)過(guò)濾器在鑒定的生物安全柜內(nèi)無(wú)菌過(guò)濾并冷凍至-70。C直至需要時(shí)。使用該方法純化的MPP5終產(chǎn)率是大約100mg/L。實(shí)施例6:在白化大鼠內(nèi)MPP5的急性前列腺內(nèi)或靜脈內(nèi)推注的毒性研究。本實(shí)施例顯示表明對(duì)大鼠前列腺內(nèi)施用組氨酸標(biāo)記的MPP(MPP5)能夠減少前列腺重量的研究的初步結(jié)果。結(jié)果簡(jiǎn)述本研究的目的旨在證實(shí)單次前列腺內(nèi)注射或靜脈內(nèi)推注至雄性大鼠，隨后觀察1、14或28日時(shí)間后，MPP(MPP5)的最大耐受劑量(MTD)并旨在研究MPP(MPP5)的潛在毒性和毒性動(dòng)力學(xué)。MPP5是包含PSA切割位點(diǎn)的組氨酸標(biāo)記的氣單胞菌溶素原分子。研究設(shè)計(jì)詳述于表7和8內(nèi):表7:研究設(shè)計(jì)MTD研究<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>IP-前列腺內(nèi)，IV-靜脈內(nèi)，動(dòng)物在48小時(shí)觀察時(shí)間后被處死。表8:主要研究設(shè)計(jì)和毒物動(dòng)力學(xué)研究設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>IP-前列腺內(nèi)(20ptL)，IV-靜脈內(nèi)(0.05mL)、TK-毒物動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)如下項(xiàng)目臨床征兆、體重、食物消耗、眼科學(xué)、血液學(xué)、血清化學(xué)、尿分析、毒物動(dòng)力學(xué)、尸體剖檢的大體觀察、器官重量和組織病理學(xué)。體重、體重增加、食物消耗、眼科學(xué)或尿分析參數(shù)不受影響。在第2日發(fā)現(xiàn)一只使用40pg做前列腺內(nèi)處理的MTD動(dòng)物死亡。其在死亡之前不存在與處理相關(guān)的臨床征兆。胃內(nèi)見(jiàn)深色病灶并且在注射部位(前列腺)處有明顯暗色區(qū)域和腫脹。在第2日發(fā)現(xiàn)兩只使用25pg做前列腺內(nèi)處理的主要研究動(dòng)物死亡。在死亡之前，其中一只動(dòng)物不存在處理相關(guān)性臨床征兆，而另一只動(dòng)物觀察到絨毛染色(furstaining)(口鼻部)、藍(lán)色皮膚、活動(dòng)性降低、虛弱、下降的肌肉張力、清亮液體排出物(眶周)、蒼白眼(paleeyes)、呼吸費(fèi)力、側(cè)臥和觸感冰涼。其中一只動(dòng)物的肉眼檢查結(jié)果包括在注射部位(前列腺)處的暗色區(qū)域；睪丸內(nèi)的深色病灶；腹腔內(nèi)蒼白色的清亮流體，包括靠近肝臟的蒼白色物質(zhì)。在另一只動(dòng)物中，脂肪和空腸內(nèi)見(jiàn)損害，包括變色。肝臟內(nèi)見(jiàn)粘連，胰臟增厚，胃和胸腺內(nèi)有多個(gè)暗色區(qū)域并且在靠近附睪的腹部脂肪內(nèi)有深色病灶。然而，沒(méi)有確定這兩只雄性大鼠的具體死因，據(jù)推測(cè)接近腎臟的前列腺炎癥的嚴(yán)重性和并發(fā)的全身性退化改變導(dǎo)致這些動(dòng)物死亡。在以全部MTDIP劑量水平處理的動(dòng)物內(nèi)均可見(jiàn)到處理相關(guān)性臨床征兆。第1日和第4日間，在全部組的一些動(dòng)物中的一個(gè)或多個(gè)部位(包括口鼻部、顎、前爪、眶周和腹側(cè)/背側(cè)的頸部)內(nèi)見(jiàn)到了紅色的絨毛染色。注意到在使用20Aig和40M時(shí)，分別具有l(wèi)/3的動(dòng)物出現(xiàn)藍(lán)色皮膚變色(手術(shù)部位、腹部部位、泌尿生殖器部位或腹股溝部位)，其中包括使用40/xg的一只動(dòng)物內(nèi)的泌尿生殖器腫脹。據(jù)記錄，在靜脈內(nèi)處理的MTD動(dòng)物內(nèi)，使用50/xg處理的動(dòng)物中紅色絨毛染色(口鼻部和/或眶周)的發(fā)生率更高。紅色絨毛染色(口鼻部)主要在來(lái)自全部IP劑量水平的主要研究動(dòng)物(包括對(duì)照)內(nèi)見(jiàn)到，但是通常在處理的動(dòng)物內(nèi)具有更高的發(fā)生率。認(rèn)為此臨床征兆可能是處理相關(guān)的。紅色的絨毛染色(口鼻部)還在全部IV的主要研究動(dòng)物內(nèi)觀察到。在注射部位(尾部)記錄到了其它的臨床征兆，其包括皮膚結(jié)痂和/或發(fā)紅或其它變色。此外，由于損害和懷疑其自殘，必須對(duì)兩只動(dòng)物進(jìn)行斷尾。這些稍后的變化提示了在組織病理學(xué)檢查后得以進(jìn)一步證實(shí)的檢品制劑的潛在刺激性。第2天，在主要研究的IP動(dòng)物中，觀察到一些白細(xì)胞參數(shù)具有劑量相關(guān)性增加。在所有使用10Mg和/或25jug處理的組中，WBC計(jì)數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均增加。在使用25pg的MCHC內(nèi)以及在全部劑量水平的MPV內(nèi)也見(jiàn)到了增加。在全部的劑量水平均記錄到網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值的減少。在活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間內(nèi)記錄到全部IP劑量水平均具有輕微而劑量相關(guān)性的增加。在使用25Mg靜脈內(nèi)處理的動(dòng)物中觀察到相似的變化。WBC計(jì)數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。MCHC、MPV和紅細(xì)胞分布寬度(RDW)也增加并且網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值減少。在14日觀察后處死的動(dòng)物內(nèi)，僅見(jiàn)到RDW和MPV增加并且在28日后，在血液學(xué)參數(shù)方面沒(méi)有記錄到差異。認(rèn)為在觀察1日后處死的動(dòng)物內(nèi)所記錄到的變化與檢品相關(guān)。在15日和28日觀察時(shí)間后所示的結(jié)果證實(shí)了從這些變化中的恢復(fù)。使用25/xg時(shí)，在第2日見(jiàn)到平均天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度和平均丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度的劑量相關(guān)性增加，并認(rèn)為是明顯的。在使用25jWglP時(shí)，也記錄到直接膽紅素、尿素、肌酸酐和三酰甘油濃度的增加。在25Mg時(shí)見(jiàn)到葡萄糖濃度減少并且在SO/xg時(shí)白蛋白濃度減少，但是僅在25Mg時(shí)才會(huì)使相關(guān)的白蛋白對(duì)球蛋白比率減少和使總蛋白濃度減少。在25/xglV處理的動(dòng)物內(nèi)，見(jiàn)尿素和鈣濃度的輕微增加，并且還記錄到球蛋白濃度的輕微增加，因而使得白蛋白對(duì)球蛋白的比率相應(yīng)減少。認(rèn)為這些變化與在注射部位處觀察到的炎癥相關(guān)。在第29日，只有25/xgIP記錄到了丙氨酸氨基磷酸酶濃度的增加和間接膽紅素濃度的減少。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，估計(jì)復(fù)合的消除半衰期為12.8小時(shí)。Q^可以反向外推出0小時(shí)時(shí)具有的值為S1.3ng/mL。觀察到的峰值(在首次釆樣時(shí)間)是74.3ng/mL。全身清除率(CL)和分布容積(V。據(jù)估計(jì)分別為46.3mL/h和841mL。前列腺內(nèi)施用后，對(duì)于所有的情況而言，所觀察到的t,均在給藥4小時(shí)后出現(xiàn)，其中10/xg的峰值是2.95ng/mL，25pg的峰值是3.51ng/mL。觀察到的AUQ).t^似乎在較高劑量時(shí)減少，原因是所觀察到的t"-不同。使用C,和AUQ.tSB評(píng)估用于前列腺內(nèi)途徑的劑量線性。經(jīng)劑量歸一化的兩種暴露參數(shù)均從10Mg減少至25/xg，并且估計(jì)的相應(yīng)生物利用率是23.7%和4.38%，全部這些參數(shù)表示隨劑量水平漸增，MPP5從前列腺被有限地吸收至全身循環(huán)內(nèi)。在MTD相期間，MPP5在雄性大鼠內(nèi)以40/xg的單次IP劑量給藥與具體死因不明的死亡有關(guān)。MPP5在雄性大鼠內(nèi)單次IV給藥的最大耐受劑量高達(dá)50/xg。在主要研究相期間，MPP5在雄性大鼠內(nèi)以25/xg單次IP注射引起2只大鼠死亡，在22pg時(shí)引起前列腺注射部位大體變化、微觀變化和器官重量變化。不能確定地找到兩只雄性大鼠的死因，但是推測(cè)前列腺炎癥的嚴(yán)重性和相關(guān)變化對(duì)這些動(dòng)物的惡化/死亡有作用。另一個(gè)檢品相關(guān)性變化在恢復(fù)期的第2、15禾B/或29日觀察到。認(rèn)為在其它組織內(nèi)的大體變化、微觀變化和器官重量變化繼發(fā)于前列腺注射部位變化。MPP5在雄性大鼠內(nèi)以225Mg的劑量單次IV注射引起尾靜脈注射部位的大體變化和/或微觀變化。這些在25//g時(shí)所產(chǎn)生的變化于恢復(fù)期的第2、15和29日隨進(jìn)行性恢復(fù)而被觀察到，并說(shuō)明檢品的刺激性效應(yīng)。認(rèn)為其它組織內(nèi)的大體變化和微觀變化繼發(fā)于注射部位變化。第2日的肝臟和脾臟的器官重量變化沒(méi)有微觀的相關(guān)性并在第15曰恢復(fù)。結(jié)論是MPP5通過(guò)在多達(dá)40pg劑量水平上的單次前列腺內(nèi)注射或在多達(dá)50/ig劑量水平上的單次靜脈內(nèi)注射施用引起以25iug和40pgIP的無(wú)清晰死因的死亡，然而，認(rèn)為檢品相關(guān)性前列腺炎癥的程度和與腎臟接近和并發(fā)的全身性退化是死亡的促進(jìn)性因素。20/Xg時(shí)可見(jiàn)可逆變化大多在臨床征兆(2/Ig)、血液學(xué)和臨床生物化學(xué)參數(shù)。病理學(xué)變化在全部劑量水平上以劑量相關(guān)性方式持續(xù)存在，但是在靜脈內(nèi)處理的動(dòng)物內(nèi)顯示出衰退跡象。因此，未對(duì)前列腺內(nèi)途徑或靜脈內(nèi)途徑確定不可觀察的效應(yīng)水平(NOEL)。實(shí)驗(yàn)方法3.1試驗(yàn)系統(tǒng)使用總共180只雄性SpragueDawley(Crl:CD(SD)IGSBR)大鼠(褐鼠)。在處理開(kāi)始時(shí)，動(dòng)物為12至15周齡并且體重范圍是399g至495g。3.2獸醫(yī)學(xué)處理在第4日和第7日，分別對(duì)動(dòng)物5010和5004實(shí)施斷尾，原因是懷疑其自殘。當(dāng)這些動(dòng)物進(jìn)行靜脈內(nèi)處理時(shí)，將切斷的組織保留在中性緩沖的10%福爾馬林內(nèi)用于病理學(xué)評(píng)價(jià)。在處理之前，將全部動(dòng)物稱重并使用基于計(jì)算機(jī)的隨機(jī)化方法將其隨機(jī)分配到處理組內(nèi)。使用體重作為參數(shù)，通過(guò)分層進(jìn)行隨機(jī)化。不將健康狀況不良的動(dòng)物分配到組內(nèi)。研究設(shè)計(jì)詳述于表9(MTD)和表7(主要)。表9:MTD研究組處理劑量水平(M)劑量體積0tL)雄性動(dòng)物數(shù)IPIVIPIV6MPP5102050037MPP5202050038MPP54020500339MPP550-500-5IP-前列腺內(nèi)，IV-靜脈內(nèi)分配到MTD研究的動(dòng)物在48小時(shí)觀察時(shí)間后處死。在第1日，分配到IP劑量方案的動(dòng)物6001和8001因技術(shù)失誤(給藥超過(guò)分配給它們的劑量10倍)而分別由備用動(dòng)物6101和8101替換。同一日稍后，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物8001(400/xg)在給藥大約4小時(shí)后死亡，并且動(dòng)物6001(100pg)在第1日結(jié)束時(shí)因不良狀態(tài)而進(jìn)行安樂(lè)死。這些動(dòng)物接受尸體剖檢，包括詳細(xì)的外部檢查和內(nèi)部檢查，然而，未保留用于組織病理學(xué)檢查的組織。在死亡之前，動(dòng)物6001的臨床征兆包括虛弱、下降的肌肉張力、部分閉眼、觸感冰涼、減少的活動(dòng)和異常步態(tài)。動(dòng)物8001的臨床征兆包括側(cè)臥、呼吸費(fèi)力、減少的呼吸頻率、藍(lán)色皮膚、蒼白眼、觸感冰涼、減少的活動(dòng)、虛弱和下降的肌肉張力。對(duì)動(dòng)物6001的大體檢查顯示在施用部位(前列腺)處僅有暗色區(qū)域。對(duì)動(dòng)物8001而言，在下頜骨淋巴結(jié)內(nèi)兩側(cè)具有深色變色并且在注射部位(前列腺)具有腫脹。認(rèn)為這些死亡可能與高劑量MPP5施用相關(guān)并且加以報(bào)道以便為本研究?jī)?nèi)的MTD提供進(jìn)一步參考。因?yàn)樵赟Opg時(shí)所見(jiàn)到的觀察結(jié)果有限，故在第13日(MTD研究)添加了以50pg的劑量水平經(jīng)靜脈內(nèi)途徑給藥的額外動(dòng)物，目的是進(jìn)一步探測(cè)經(jīng)過(guò)該途徑的MPP5毒性。在開(kāi)始給藥之前，認(rèn)為動(dòng)物1025因錯(cuò)位咬合而不適合研究用途，并由備用動(dòng)物替換，此備用動(dòng)物變成動(dòng)物1125。遣散來(lái)自該研究的仍未分配至組內(nèi)的全部動(dòng)物并且記錄對(duì)它們的處置。3.3.檢品和載體對(duì)照品檢品是濃度3.2mg/mL的MPP5(批號(hào)PTIC-MF-PAL-DS-001)。該檢品冷凍時(shí)是無(wú)色固體并且在-20。C避開(kāi)直射光線進(jìn)行貯存。載體對(duì)照是磷酸鹽緩沖鹽水-EDTA(pH7.4)。3.4給藥制劑的制備劑量制劑在使用當(dāng)日制備。在每一日，量取適宜量的3.2mg/mLMPP5貯存液并將其用適宜量的PBS，lmMEDTA稀釋。3.5施用檢品/對(duì)照品MTD研究具有三只大鼠的組如3,2部分和表9內(nèi)所述在單日內(nèi)以前列腺內(nèi)或靜脈內(nèi)方式給藥，并觀察臨床征兆和潛在毒性直至給藥后48小時(shí)。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，檢品以0.5mL的劑量體積經(jīng)尾靜脈靜脈內(nèi)注射施用。對(duì)于前列腺內(nèi)組，在劑量施用前，使用異氟垸麻醉動(dòng)物。在手術(shù)前至少1小時(shí)并在手術(shù)后多達(dá)2日，動(dòng)物接受抗生素芐星青霉素G和普魯卡因青霉素G(0.1mL)肌內(nèi)注射。動(dòng)物還在手術(shù)當(dāng)日接受丁丙諾啡(0.05mg/kg)皮下注射。使用手術(shù)刀片，從陰莖顱側(cè)0.5cm開(kāi)始，行大約2cm的正中切口。將腹部切開(kāi)同樣長(zhǎng)度。定位前列腺的兩片腹葉并使用適宜的注射器將20/iL配制的MPP5或PBS/EDTApH7.4注射至右側(cè)腹葉。在縫合前，該部位用溫?zé)?大約37。C)的0.9%氯化鈉注射液(U.S.P.)沖洗。使用適宜的縫合材料分層縫合該部位。對(duì)于分配至靜脈內(nèi)途徑組的動(dòng)物，經(jīng)尾靜脈，靜脈內(nèi)施用0.5mL劑量體積的檢品。主要研究根據(jù)在MTD相期間建立的方法對(duì)動(dòng)物劑量給藥。對(duì)于分配至靜脈內(nèi)途徑組的動(dòng)物，經(jīng)尾靜脈，靜脈內(nèi)施用0.5mL劑量體積的檢品。處理完成后，對(duì)主要研究動(dòng)物在第l、14或28日恢復(fù)期內(nèi)保持不劑量給藥。3.6觀察臨床觀察在整個(gè)研究期間，每日均對(duì)全部動(dòng)物觀察兩次(在抵達(dá)日和尸體剖檢日，觀察一次)死亡率和不良健康征兆和/或?qū)μ幚淼姆磻?yīng)。此外，在處理開(kāi)始前進(jìn)行至少一次詳細(xì)檢查以及在整個(gè)處理和恢復(fù)期期間每日均進(jìn)行詳細(xì)檢查(主要研究動(dòng)物和MTD研究動(dòng)物)。體重在隨機(jī)分配的當(dāng)日對(duì)全部動(dòng)物測(cè)量個(gè)體體重并在整個(gè)處理和恢復(fù)期期間每周測(cè)量?jī)纱蝹€(gè)體體重(主要研究動(dòng)物)。此外，在計(jì)劃尸體剖檢前對(duì)每只主要研究動(dòng)物/恢復(fù)動(dòng)物稱重(禁食)。在劑量給藥前和在終末期處死前對(duì)MTD研究動(dòng)物稱重。食物消耗從預(yù)處理期的最后一周開(kāi)始并在整個(gè)處理期和恢復(fù)期期間，對(duì)全部主要研究動(dòng)物每周測(cè)量個(gè)體食物消耗。眼科學(xué)眼底鏡檢查(間接的眼底檢査法)和生物顯微鏡(裂隙燈)檢查由委員會(huì)認(rèn)為合格的獸醫(yī)眼科醫(yī)師在開(kāi)始處理(全部動(dòng)物)前進(jìn)行一次并在尸體剖檢(主要研究動(dòng)物)前再進(jìn)行一次。實(shí)驗(yàn)室研究對(duì)全部主要研究動(dòng)物在第2、15和29日尸體剖檢時(shí)進(jìn)行用于血液學(xué)和血清化學(xué)檢驗(yàn)的血液采樣。在血液采樣前對(duì)動(dòng)物禁食過(guò)夜。在異氟垸麻醉下從腹主動(dòng)脈內(nèi)收集血液樣品。尿樣品在尸體剖檢前在第2、15和29日從置于代謝籠內(nèi)的主要研究動(dòng)物內(nèi)收集大約16小時(shí)時(shí)間，在此期間對(duì)動(dòng)物禁食。所檢查的血液學(xué)參數(shù)是活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間、血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)、紅細(xì)胞指數(shù)(MCV、MCH、MCHC和RDW)、紅細(xì)胞比積、血紅蛋白、平均血小板體積、血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(絕對(duì)值和百分?jǐn)?shù))、血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)(總數(shù)、絕對(duì)值和百分?jǐn)?shù)的微分)。所檢查的血清化學(xué)參數(shù)是(計(jì)算的)A/G比率、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、堿性磷酸酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血液尿素氮、氯化鈣、膽固醇、肌酸酐、(計(jì)算的)球蛋白、葡萄糖、無(wú)機(jī)磷、鉀、鈉、總膽紅素、總蛋白、三酰甘油。所檢查的尿分析參數(shù)是膽紅素、血液顏色和外觀、肌酸酐、葡萄糖、酮、顯微鏡檢查亞硝酸鹽的離心沉積物、pH、蛋白質(zhì)、比重、尿膽素原、體積。免疫原性評(píng)估(僅在主要研究的第14日和第28日進(jìn)行)給藥前(基線)從每只主要研究大鼠的頸靜脈中收集血液樣品并在終末期處死時(shí)異氟烷麻醉后(隨用于臨床病理學(xué)的血液釆樣一起)自腹主動(dòng)脈收集血液樣品。樣品放置在血清分離管內(nèi)，顛倒數(shù)次，允許在室溫凝固20分鐘至30分鐘，且隨后在大約4°C下以大約1200g離心10分鐘。3.7毒性動(dòng)力學(xué)在研究第1日，在給藥前，給藥后15分鐘和30分鐘及1、2、4、8、24和48小時(shí)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次從每組的三只毒物動(dòng)力學(xué)研究大鼠中，通過(guò)頸靜脈穿剌收集血液樣品(0.5mL)至K3EDTA管內(nèi)。血液樣品立即置于濕冰(wetice)上直至通過(guò)大約2700rpm冷凍(大約2。C至8。C)離心IO分鐘進(jìn)行分離。將血漿分離，轉(zhuǎn)移至第二個(gè)管內(nèi)并置于干冰上。血漿樣品貯存在大約-20。C并對(duì)MPP5的水平進(jìn)行分析。通過(guò)基于抗體夾心原理的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)分析血漿樣品。對(duì)MPP5特異的捕獲抗體(小鼠抗氣單胞菌溶素單克隆抗體)包被在96孔微量滴定平板上以產(chǎn)生捕獲標(biāo)準(zhǔn)物和質(zhì)控樣品內(nèi)存在的分析物的固相。隨后添加與分析物分子的不同表位結(jié)合的第二抗體(兔抗氣單胞菌溶素多克隆抗體)以完成抗體-分析物-抗體夾心。隨后添加與兔IgG抗體恒定區(qū)結(jié)合的檢測(cè)抗體酶綴合物(山羊抗兔IgG,馬辣根過(guò)氧化物酶綴合物)。捕獲的綴合物使用四甲基聯(lián)苯胺底物進(jìn)行顯像并使用SpectraMAX平板讀數(shù)儀在450nm測(cè)量。對(duì)于前列腺內(nèi)給藥途徑，根據(jù)血漿濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)房室毒物動(dòng)力學(xué)分析。作為慣例，毒物動(dòng)力學(xué)分析包括評(píng)估tmax、Cmax、AUC、k和t1/2。t咖x和Cmax是觀察值。如果可能，通過(guò)梯形法則(Gibaldi和Perrier，1982)，使用標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算機(jī)軟件程序WinNonlin(3.2版本)計(jì)算AUC參數(shù)。通過(guò)濃度-時(shí)間曲線的表觀終末期內(nèi)所選時(shí)點(diǎn)的線性回歸分析確定K。表觀終末半衰期如下計(jì)算t1/2=ln2/k。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥途徑，根據(jù)血漿濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)房室毒物動(dòng)力學(xué)分析。作為慣例，毒物動(dòng)力學(xué)分析包括評(píng)估Uax、Cmax、AUC、k、t1/2、Vz和CL。Cmax將反向外推至?xí)r間0小時(shí)。通過(guò)梯形法則(Gibaldi和Perrier，1982)，使用標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算機(jī)軟件程序WinNonlin(3.2版本)計(jì)算AUC參數(shù)。通過(guò)濃度-時(shí)間曲線的表觀終末期內(nèi)的所選時(shí)點(diǎn)的線性回歸分析確定K。表觀終末半衰期如下計(jì)算t1/2=ln2/k。清除率(CL)由劑量/AUC計(jì)算并且分布的表觀容積(Vz)計(jì)算為CL/k。3.8.處死方法大體病理學(xué)使研究期間發(fā)現(xiàn)死亡的MTD研究動(dòng)物接受尸體剖檢處理，不保存組織。使研究期間發(fā)現(xiàn)死亡的全部主要研究動(dòng)物和恢復(fù)動(dòng)物接受尸體剖檢處理并且保留組織樣品。在處理和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，全部存活的動(dòng)物在異氟垸麻醉后從腹主動(dòng)脈放血并且收集血液樣品用于實(shí)驗(yàn)室研究。為了避免自體溶解變化，使全部的主要研究動(dòng)物在安樂(lè)死后，盡可能快地進(jìn)行尸體的完整大體病理學(xué)檢查。器官重量對(duì)于計(jì)劃尸體剖檢時(shí)進(jìn)行安樂(lè)死的每只主要研究動(dòng)物，切下不帶脂肪的如下器官并稱重腎上腺、腦、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、睪丸、垂體、前列腺、脾臟、胸腺、甲狀腺葉(和甲狀旁腺)。成對(duì)的器官一起稱重并計(jì)算相對(duì)于體重的器官重量比率。組織保存在每只主要研究動(dòng)物的尸體剖檢結(jié)束時(shí)，保留如下的組織和器官異常物、動(dòng)物標(biāo)識(shí)、腎上腺、主動(dòng)脈(胸廓)、骨和骨髓(胸骨)、腦(大腦、小腦、中腦和延髓)、盲腸、結(jié)腸、十二指腸、附睪、食管、眼、哈德氏腺、心臟(包括主動(dòng)脈部分)、回腸、組1至4的注射部位(前列腺)、組5的注射部位(尾靜脈)、空腸、腎臟、淚腺、肝臟(2片葉的樣品)、肺臟(2片葉的樣品)、(下頜骨和腸系膜)淋巴結(jié)、(腹股溝)乳腺、鼻腔和鼻竇(3個(gè)水平)、視神經(jīng)、胰臟、垂體、前列腺(未注射的葉)、直腸、唾液腺、坐骨神經(jīng)、精囊、骨骼肌、(腹股溝)皮膚、(頸部)脊髓、脾臟、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺葉(和甲狀旁腺)、舌、氣管、(雙側(cè))輸尿管、膀胱。中性緩沖的10%福爾馬林用于組織固定和保存，除了在岑克爾固定液(Zenker'sfluid)內(nèi)固定(僅安樂(lè)死的動(dòng)物)的附睪、眼、視神經(jīng)和睪丸之外。對(duì)于全部安樂(lè)死的動(dòng)物，制備并染色三張股骨骨髓涂片。保留涂片但不進(jìn)行評(píng)價(jià)。組織病理學(xué)將組織包埋在石蠟內(nèi)、切片(鼻腔和鼻竇、胸骨和尾靜脈注射部位在切片前進(jìn)行脫鈣)并用蘇木精及伊紅染色并做如下組織病理學(xué)檢查組l、4和5:列于組織保存下的組織(除了動(dòng)物標(biāo)識(shí)和直腸)組2和組3:顯示處理相關(guān)性結(jié)果的組織，以下列出全部大體損害和耙組織對(duì)于全部劑量組內(nèi)的全部主要研究動(dòng)物，將靶組織的組織樣品進(jìn)行加工并檢查，其中所述的靶組織包括腦、心臟、腎臟、肝臟、淋巴結(jié)、注射部位(前列腺)、前列腺(未注射的葉)、脾臟、甲狀腺葉(和甲狀旁腺)、輸尿管和膀胱。視神經(jīng)、甲狀旁腺和乳腺如果分別存在于眼、甲狀腺和皮膚的常規(guī)切片內(nèi)，則僅做組織病理學(xué)檢查。統(tǒng)計(jì)分析對(duì)研究進(jìn)行期間所獲得的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)計(jì)算組均值和標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)于每種目的參數(shù)，使用Levene氏檢驗(yàn)在0.05顯著性水平上比較組方差。當(dāng)組方差間的差異未見(jiàn)顯著時(shí)，則進(jìn)行參數(shù)的單因素方差分析(ANOVA)。若ANOVA(p《0.05)顯示均值間差異顯著，隨后使用Dunnett's"t"檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行對(duì)照組和每個(gè)處理組間的組均值比較。無(wú)論如何當(dāng)Levene氏檢驗(yàn)顯示非均勻的組方差(p《0.05)時(shí)，則使用無(wú)參數(shù)Kmskal-Wallis檢驗(yàn)來(lái)比較所考慮的全部組。如果Kmskal-Wallis檢驗(yàn)是顯著的(p《0.05)，隨后使用Dunn氏檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組和每個(gè)處理組間差異的顯著性。對(duì)于每一目的配對(duì)組比較，顯著性在0.05、0.01和0.001水平上報(bào)道。結(jié)果和討論1.劑量制劑分析在表10內(nèi)顯示對(duì)研究中所用的給藥制劑的pH、摩爾滲透壓濃度和密度評(píng)估的結(jié)果。表10:劑量制劑的pH、摩爾滲透壓濃度和密度<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>2.死亡率MTD研究在第2日，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物8101(40/xg、IP)死亡。其在死亡前，不存在處理相關(guān)的臨床征兆。在尸體剖檢時(shí)，在胃內(nèi)見(jiàn)到深色病灶并且在注射部位(前列腺)記錄到暗色區(qū)域和腫脹。未確定清晰死因。主要研究在第2日，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物4005和4013(25pg、IP)死亡。在死亡前，未記錄到動(dòng)物4013存在處理相關(guān)的臨床征兆。對(duì)于動(dòng)物4005而言，記錄到絨毛染色(口鼻部)、藍(lán)色皮膚、減少的活動(dòng)、虛弱、下降的肌肉張力、清亮液體排出物(眶周)、蒼白眼、呼吸費(fèi)力、側(cè)臥和觸感冰涼。在對(duì)動(dòng)物4005尸體剖檢時(shí)，大體尸檢結(jié)果包括在注射部位(前列腺)的暗色區(qū)域、睪丸內(nèi)深色病灶、腹腔內(nèi)蒼白色的清亮流體，包括毗鄰肝臟的蒼白色物質(zhì)。對(duì)于動(dòng)物4013，在脂肪和空腸內(nèi)見(jiàn)到損害，包括變色。肝臟內(nèi)見(jiàn)粘連、胰臟增厚，胃和胸腺內(nèi)的多個(gè)暗色區(qū)域和在腹部脂肪內(nèi)毗鄰附睪的深色病灶。然而，死因在兩例動(dòng)物內(nèi)不確定，據(jù)推測(cè)組織病理學(xué)所觀察到的接近腎臟的前列腺炎癥的嚴(yán)重性和并發(fā)的全身性退化改變對(duì)這些動(dòng)物死亡有作用。3.臨床觀察MTD研究在全部MTDIP劑量水平(IO/ig至40pg)處理的動(dòng)物內(nèi)均見(jiàn)到處理相關(guān)的效應(yīng)。在第1日和第4日之間，在全部組的2/3動(dòng)物中的一個(gè)或多個(gè)部位(包括口鼻部、顎、前爪、眶周和腹側(cè)/背側(cè)的頸部)內(nèi)見(jiàn)到了紅色絨毛染色。注意到在使用20Mg和40/xg時(shí)，分別具有l(wèi)/3的動(dòng)物出現(xiàn)藍(lán)色皮膚變色(手術(shù)部位、腹部部位、泌尿生殖器部位或腹股溝部位)，其中包括在動(dòng)物8002(40Mg)內(nèi)的泌尿生殖器腫脹。雖然這些觀察可能與手術(shù)操作相關(guān)，但是使用40pg時(shí)其發(fā)生率和嚴(yán)重性增加。在靜脈內(nèi)處理的動(dòng)物中，處理相關(guān)性臨床征兆限于紅色絨毛染色(口鼻部和/或眶周)，據(jù)記錄在使用50pg處理的動(dòng)物內(nèi)具有更高的發(fā)生率。在第1日和第4日期間，與在"0/xg觀察到的1/3動(dòng)物具有這些征兆相比，多達(dá)5/5的給予高劑量的動(dòng)物觀察到具有這些征兆。主要研究第2日結(jié)束據(jù)記錄，來(lái)自全部IP劑量水平的一些動(dòng)物具有紅色絨毛染色(口鼻部、眶周和/或顱)，其中這些動(dòng)物包括3/7對(duì)照動(dòng)物、使用2/xg的1/7動(dòng)物、使用10pg的5/7動(dòng)物和使用25pg的3/7動(dòng)物。觀察到動(dòng)物4014(25pg)具有來(lái)自雙眼的紅色排出物，并且動(dòng)物4015在第2日尸體剖檢前活動(dòng)減少而且觸感冰涼。4.食物消耗對(duì)食物消耗沒(méi)有影響。5.眼科學(xué)無(wú)眼科學(xué)結(jié)果。6.血液學(xué)在第2日處死的IP動(dòng)物內(nèi)，觀察到一些白細(xì)胞參數(shù)具有2倍或更高倍數(shù)的劑量相關(guān)性增加。全部處理組的血液白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均增加，并且在10Mg和/或25pg吋達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性。在25/xg上的平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)及在全部劑量水平上的平均血小板體積(MPV)內(nèi)也見(jiàn)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。記錄到在全部劑量水平的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值減少。據(jù)記錄，活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間在全部IP劑量水平上均具有輕微而劑量相關(guān)性的增加，并且在25/zg上達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性。在用25iugMPP5靜脈內(nèi)處理的動(dòng)物內(nèi)觀察到相似變化。WBC計(jì)數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。MCHC、MPV和紅細(xì)胞分布寬度(RDW)也增加并且網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值減少。在觀察14日后處死的動(dòng)物內(nèi)，僅見(jiàn)到RDW和MPV增加。在觀察28日后，血液學(xué)參數(shù)方面不存在差異。在觀察1日后處死的動(dòng)物內(nèi)記錄到的變化被認(rèn)為是檢品相關(guān)性的并且與組織病理學(xué)相關(guān)。在15日和28日觀察時(shí)間后所示的結(jié)果顯示了從這些變化中恢復(fù)的跡象。認(rèn)為其它微小差異是偶然的并且與處理不相關(guān)。7.血清化學(xué)在第2日，見(jiàn)到平均天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度和平均丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度劑量相關(guān)性增加在25jugIP時(shí)達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性。認(rèn)為這些是在25pg上的明顯變化。在使用25/xgIP時(shí)，也記錄到直接膽紅素濃度、尿素濃度、肌酸酊濃度和三酰甘油濃度的增加。在25pg時(shí)見(jiàn)到葡萄糖濃度減少。在20pg時(shí)白蛋白濃度減少，但是僅在25/ig時(shí)才會(huì)使白蛋白對(duì)球蛋白的相關(guān)的比率減少和使總蛋白濃度減少。在25IV處理的動(dòng)物內(nèi)，見(jiàn)到尿素濃度和鈣濃度的輕微增加。還記錄到球蛋白濃度的輕微增加，伴隨白蛋白/球蛋白(A/G)比率相應(yīng)減少。認(rèn)為球蛋白(及因此A/G比率)的變化可能與注射部位處的炎癥相關(guān)。在第15日，在全部劑量水平上(包括IV處理動(dòng)物)均見(jiàn)到了三酰甘油濃度的統(tǒng)計(jì)顯著的減少。認(rèn)為這些減少不是毒理學(xué)顯著性的并且可能與脂代謝方面的微小變動(dòng)相關(guān)。在第29日，僅在25/xglP時(shí)記錄到丙氨酸氨基磷酸酶濃度的增加和間接膽紅素濃度的減少。這些變化可能與組織病理學(xué)描述的繼發(fā)變化相關(guān)。沒(méi)有其它毒理學(xué)顯著的變化。8.尿分析對(duì)尿分析參數(shù)沒(méi)有明顯影響。9.毒性動(dòng)力學(xué)MPP5的血漿濃度通常在每組的單只動(dòng)物之間在每一時(shí)點(diǎn)上是相似的。由于劑量水平?jīng)]有根據(jù)體重或前列腺重進(jìn)行歸一化，因而預(yù)期到在血漿濃度值上的某些變動(dòng)。在從對(duì)照動(dòng)物中收集的樣品內(nèi)或在給藥前所收集的樣品內(nèi)的MPP5是不可定量的。在試驗(yàn)組內(nèi)，MPP5的血漿濃度通常隨前列腺內(nèi)所施用的檢品的劑量水平增加而增加，在從給予2Mg的動(dòng)物中收集的任意樣品中無(wú)可檢測(cè)到的濃度的MPP5。直至24小時(shí)在10pg處理的動(dòng)物內(nèi)是可檢測(cè)的，直至8小時(shí)在25pig處理的動(dòng)物內(nèi)是可檢測(cè)MPP5的并且直至48小時(shí)在組5(25/ig，靜脈內(nèi))是可檢測(cè)的。總之，獲得三條復(fù)合曲線并考慮對(duì)其做出進(jìn)一步評(píng)價(jià)。可以對(duì)復(fù)合的IV曲線估計(jì)終末期，其中估計(jì)終末半衰期是12.8小時(shí)。對(duì)于其余曲線，不能可靠地估計(jì)終末期。因此，未報(bào)告衍生自k的全部參數(shù)(t1/2、AUCo.inf和Q/o外推)。對(duì)于IV曲線，從AUQ).ts后外推的AUCVirf的百分?jǐn)?shù)小于6。/c)，標(biāo)示該曲線從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中得以良好表征。在前列腺內(nèi)給藥后，對(duì)于所有的情況而言，所觀察到的tn^在給藥后4小時(shí)均出現(xiàn)，其中10pg和25/xg的峰水平分別是2.95ng/mL和3.51ng/mL。觀察到的AUCQ—t最后在較高劑量時(shí)減少(48.5對(duì)22.4ngh/mL)。然而，在25/iglP時(shí)觀察到的較短t通后(8小時(shí)對(duì)在10pglP的24小時(shí))使該結(jié)果偏倚。在IV給藥后，C,可以反向外推至?xí)r間0小時(shí)，得到81.3ng/mL的值。觀察到的峰值(在首次采樣時(shí)間)是74.3ng/mL。全身清除率(CL)和分布容積(Vz)據(jù)估計(jì)分別為46.3mL/h和841mL。前列腺內(nèi)給藥后的劑量線性用劑量歸一化的平均血漿峰濃度和暴露參數(shù)曲線下的面積(分別是CmaxfPAUQ).t最后)，在10pg至25Mg劑量水平上進(jìn)行評(píng)估。來(lái)自10pg至25/ig的經(jīng)劑量歸一化的兩種暴露參數(shù)減少。這可能表示MPP5從前列腺被有限地吸收至全身循環(huán)內(nèi)?；谇傲邢賰?nèi)施用后在中等劑量至高劑量觀察到的面積(AUCo-t雖rs)，通過(guò)將這些面積(對(duì)劑量水平歸一化)與靜脈內(nèi)施用后所獲得的劑量歸一化面積相比，測(cè)定生物利用率百分?jǐn)?shù)。估計(jì)的生物利用率是23.7%和4.38%。10.器官重量前列腺內(nèi)注射偶爾達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性的絕對(duì)器官重量和相對(duì)器官重量(器官重量對(duì)體重)的變化在全部處死日的前列腺內(nèi)及在處死第2日的脾臟內(nèi)被記錄到。與對(duì)照比較，使用10Mg和25Mg的動(dòng)物內(nèi)前列腺重量在第2日增加26%至45%。與對(duì)照比較，在以》10]Ltg處理的動(dòng)物內(nèi)前列腺重量在第15日降低16%至24%并且在第29日降低19%至21%。這些變化與觀察到的微觀結(jié)果一致。與對(duì)照比較，脾臟重量在25Mg時(shí)在第2曰降低大約36%。認(rèn)為該變化是繼發(fā)變化并且此變化在第15日恢復(fù)。靜脈內(nèi)注射與對(duì)照相比，以25^glV的動(dòng)物在第2日具有高大約21%的肝臟重量和脾臟重量，但是其沒(méi)有組織學(xué)相關(guān)性，并在第15日恢復(fù)。11.大體病理學(xué)MTD研究在全部IP劑量水平上鑒定前列腺注射部位變化。變動(dòng)包括深度變色/分布區(qū)、斑紋和肥大/腫脹。在第l日替換的動(dòng)物(編號(hào)6001、8001)或IP注射后在第2日發(fā)現(xiàn)死亡的動(dòng)物(編號(hào)8101)具有一些如上所述的前列腺注射部位變化。未確定具體死因。在尾靜脈進(jìn)行靜脈內(nèi)(IV)注射與組8和組9動(dòng)物的尾部上的痂有關(guān)。認(rèn)為其它變化是散在的、與操作相關(guān)的或者是末期的(agonal)而且不與處理相關(guān)的。主要研究前列腺注射部位變化在全部處死日進(jìn)行鑒定。第2日變化以全部劑量水平上的深度變色/分布區(qū)/病灶、粘連和肥大/腫脹為特征。在以aopg處理的動(dòng)物中，第15日和第29日的變化描述為蒼白區(qū)、隆起、堅(jiān)硬和/或細(xì)小。以20/xg處理時(shí)，在第15和29處死日時(shí)往往在肝臟和脾臟上看到粘連和蒼白區(qū)，并且所述粘連和蒼白區(qū)可能繼發(fā)于前列腺注射部位變化。在(25MglP)第2日發(fā)現(xiàn)死亡的動(dòng)物4005具有一些如上所述的前列腺注射部位變化。未確定具體死因。日觀察到肝臟增大。認(rèn)為其它變化是散在的、與操作相關(guān)的或者是瀕死的而且不與處理相關(guān)的。12.組織病理學(xué)前列腺內(nèi)注射在前列腺注射部位以2i^g施用時(shí)，第2、15和29日觀察到歸因于MPP5的微觀變化。在第2日，全部劑量均觀察到了細(xì)微至嚴(yán)重的急性炎癥，所述急性炎癥的嚴(yán)重性通常具有劑量依賴性的增加。炎癥以血纖蛋白、混合的細(xì)胞浸潤(rùn)和腺泡壞死為特征。水腫和出血均在處理動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中觀察到，因此認(rèn)為這具有部分的操作相關(guān)性。在第15日和第29日，全部劑量均觀察到細(xì)微至鄰顯的慢性炎癥和/或纖維變性，所述慢性炎癥和/或纖維變性的嚴(yán)重性通常具有劑量依賴性的增加。纖維變性、單核細(xì)胞浸潤(rùn)和腺泡壞死是炎癥的特征。這些變化常常伴隨并發(fā)的腺泡萎縮/腺泡擴(kuò)張。在第29日，對(duì)照內(nèi)罕見(jiàn)地觀察到了細(xì)微的纖維變性和腺泡萎縮/腺泡擴(kuò)張，并且由此認(rèn)為這主要與處理相關(guān)。還在相鄰的前列腺葉內(nèi)觀察到急性變化和慢性變化，所述急性變化和慢性變化通常具有較低的發(fā)生率和較弱的變化嚴(yán)重性。急性炎癥、水腫和出血與第2日較高的前列腺重量相關(guān)，而慢性炎癥、纖維變性和腺泡萎縮/腺泡擴(kuò)張與第15日和第29日較低的前列腺重量相關(guān)，并且通常與大體尸檢結(jié)果相關(guān)。這些變化顯示MPP5在前列腺注射部位的刺激性效應(yīng)。認(rèn)為其它組織內(nèi)的大量微觀觀察結(jié)果繼發(fā)于前列腺注射部位炎癥，或因其擴(kuò)展至毗鄰盆腔器官并遍及整個(gè)腹腔，或因其產(chǎn)生全身反應(yīng)性變化和/或退化性變化。分別在脂肪、肝臟、大腸和小腸、胰臟、脾臟、胃、精囊、附睪、睪丸和膀胱內(nèi)觀察到具有或不具有囊表面或漿膜表面出血及纖維變性的急性炎癥和慢性炎癥。反應(yīng)性變化和/或退化性變化包括骨髓髓細(xì)胞樣增生；脾臟內(nèi)增加的髓外血細(xì)胞生成作用；淋巴結(jié)、脾臟和胸腺的淋巴萎縮和/或增生；肝單核細(xì)胞浸潤(rùn)、單個(gè)細(xì)胞壞死和增加的有絲分裂象；以及睪丸萎縮(并發(fā)附睪過(guò)小(epididymisoligo)/無(wú)精)。脾淋巴萎縮可以用于解釋所記錄到的施用25/xg的雄性大鼠在第2日內(nèi)的低脾臟重量，并且因此認(rèn)為其是繼發(fā)性的。未對(duì)第2日發(fā)現(xiàn)死亡的兩只雄性大鼠(25pg)確定具體死因。然而，推測(cè)接近腎臟的前列腺炎癥的嚴(yán)重性和并發(fā)的全身性退化改變可能對(duì)這些動(dòng)物死亡有作用。其它變化是散在的、偶然的、瀕死的或是在該年齡和品種的大鼠內(nèi)可預(yù)期的并且不直接與處理相關(guān)的。靜脈內(nèi)注射在第2、15和29日，在尾靜脈注射部位觀察到歸因于MPP5的微觀變化。在第2日觀察到的細(xì)微至明顯的真皮及皮下組織急性炎癥以血纖蛋白、出血、壞死和混合的細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，伴隨大多數(shù)動(dòng)物具有或不具有表皮潰瘍和痂形成。其中一只動(dòng)物具有擴(kuò)展到臨近組織和局部淋巴結(jié)的中等程度壞死。在第15日和第29日變化發(fā)生率和嚴(yán)重性的降低顯示進(jìn)行性恢復(fù)。觀察到以纖維變性和單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性炎癥，其產(chǎn)生或不產(chǎn)生表皮潰瘍及痂形成以及附近骨罕見(jiàn)的壞死和炎癥。微觀結(jié)果通常與宏觀變化相關(guān)。這些變化顯示MPP5的刺激性效應(yīng)，尤其在注射部位的血管周?chē)M織內(nèi)。認(rèn)為其它組織內(nèi)的低發(fā)生率的變化繼發(fā)于在第2日觀察到的注射部位炎性變化，并且這些變化通常在第15日和第29日恢復(fù)。這些變化包括脾臟內(nèi)的壞死和炎癥；附睪、精囊、睪丸和肝臟內(nèi)血管周?chē)氖戎行粤＜?xì)胞浸潤(rùn)、單核細(xì)胞浸潤(rùn)或混合的細(xì)胞浸潤(rùn)；骨髓髓細(xì)胞樣增生；淋巴結(jié)水胂；淋巴結(jié)、脾臟和胸腺內(nèi)淋巴萎縮；以及在第29日觀察到的睪丸萎縮。在第2日增加的肝臟重量和脾臟重量沒(méi)有微觀相關(guān)性。結(jié)論總之，通過(guò)單次在多達(dá)40/ig劑量水平上的前列腺內(nèi)注射或單次在多達(dá)50/ig劑量水平上的靜脈內(nèi)注射施用MPP5引起以25]Ug和40ggIP的無(wú)清晰死因的死亡率，然而，認(rèn)為檢品相關(guān)性的前列腺炎癥的程度及與腎臟接近和并發(fā)的全身性退化是死亡的潛在促進(jìn)性因素。可逆變化大多在臨床征兆(^Mg)、血液學(xué)和臨床生物化學(xué)參數(shù)(SO/Ag)內(nèi)見(jiàn)到。病理學(xué)變化在全部劑量水平上以劑量相關(guān)性方式持續(xù)存在，但是在靜脈內(nèi)處理的動(dòng)物內(nèi)顯示出衰退跡象。因此，未對(duì)前列腺內(nèi)途徑或靜脈內(nèi)途徑確定不可觀察的效應(yīng)水平(NOEL)。參考文獻(xiàn)Dunn，OJ.1964，MultipleComparisonsusingRankSums，Technometrics，6，241-256。SASInstituteInc.,1999.SAS/STATUser'sGuide,Version8，Cary，NC:SASInstituteInc.,第3884頁(yè)。實(shí)施例7:MPP5在猴中的急性毒性本實(shí)施例顯示研究的初步結(jié)果，其中所述的研究表明前列腺內(nèi)施用包含PSA切割位點(diǎn)的組氨酸標(biāo)記的MPP(MPP5)導(dǎo)致對(duì)前列腺的劑量依賴性損傷。本研究的目的是在性成熟雄性獼猴(食蟹猴)中經(jīng)過(guò)兩周時(shí)間評(píng)估單次前列腺內(nèi)注射MPP5的潛在局部毒性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述一般描述將總共16只雄性獼猴(食蟹猴)分配到下表11內(nèi)所示的處理組內(nèi)。動(dòng)物大約3.6歲至11.7歲并且重量是大約2.8kg至7.9kg。動(dòng)物從中國(guó)、越南、印度尼西亞和毛里求斯進(jìn)口。表11:<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>1前列腺重量將從先前建立的前列腺重量與體重之間的關(guān)系中估計(jì)。將一半劑量注射到前列腺的每一葉內(nèi)。全部動(dòng)物一旦全身麻醉即經(jīng)肛周的前列腺內(nèi)注射給藥。劑量給藥首日稱為第1日。對(duì)動(dòng)物評(píng)價(jià)臨床征兆(每日兩次)、食物消耗(每曰一次)、體重(第l、3、8和15日)、心電圖(研究前和第2和14日)和眼狀況(研究前和第14日)的變化。研究前和在第3和14日測(cè)定臨床病理學(xué)指數(shù)(血清化學(xué)[包括C反應(yīng)蛋白]、血液學(xué)和血凝固)。在劑量施用后，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集用于毒性動(dòng)力學(xué)分析的血液樣品、對(duì)檢品和前列腺特異性抗原(PSA)的抗體。如表11內(nèi)所示在第3和15日使8只動(dòng)物安樂(lè)死。在處死時(shí)，對(duì)全部動(dòng)物進(jìn)行全面尸體剖檢并且收集、保留、處理和顯微鏡法檢查組織(包括選擇的前列腺周?chē)M織)。本研究評(píng)價(jià)MPP5的急性局部毒性。檢品是MPP5(批號(hào)PTIC-MF-PAL-DS-001)并且對(duì)照品是PBS-EDTA?；钚猿煞譂舛?.2mg/mL的檢品貯存品在制備日于給藥溶液制備前經(jīng)合適的0.22微米PVDF濾器過(guò)濾。在給藥日，用對(duì)照載體稀釋過(guò)濾的檢品貯存液以獲得具有適合實(shí)現(xiàn)預(yù)期劑量的濃度的給藥溶液。如USDA動(dòng)物福利法案(9CFR、第1、2和3部分)內(nèi)規(guī)定及如GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals(ILARpublication,1996，NationalAcademyPress)內(nèi)所述詞養(yǎng)動(dòng)物。起初如下表內(nèi)所示賦予動(dòng)物反映猴來(lái)源的Provantis編號(hào)。賦予Provantis編號(hào)6001-6008的動(dòng)物來(lái)自中國(guó)。賦予Provantis編號(hào)7001-7004的動(dòng)物來(lái)自印度尼西亞。賦予Provantis編號(hào)8001-8003的動(dòng)物來(lái)自毛里求斯。賦予Provantis編號(hào)9001的動(dòng)物來(lái)自越南。因?yàn)閯?dòng)物來(lái)源及體重的廣泛范圍，根據(jù)下表將動(dòng)物隨機(jī)分配到處理組內(nèi)。<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>檢品和對(duì)照品的施用、組分配和劑量水平<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>1前列腺重量從先前建立的前列腺重量與體重之間的關(guān)系中估計(jì)。2將一半劑量注射到前列腺的每一葉內(nèi)，即大約25/xl/g前列腺/葉。如下實(shí)施給藥。注射途徑是肛周前列腺內(nèi)推注并且頻率是一次。最初以肌內(nèi)注射氯胺酮對(duì)猴進(jìn)行鎮(zhèn)靜并放置臨時(shí)靜脈內(nèi)導(dǎo)管以在手術(shù)操作期間施用鎮(zhèn)靜藥和/或麻醉藥。在肛門(mén)下的肛周區(qū)取一個(gè)皮膚小切口并鈍性分離肌肉組織和皮下組織以允許露出(visualization)前列腺并對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)?；谇傲邢僦亓渴┯脵z品和對(duì)照品。前列腺的大致重量根據(jù)動(dòng)物體重和先前建立的前列腺重量與體重之間的關(guān)系中估計(jì)(前列腺重量(g"0.07294+(-0.2309xkg)+(0.06296xkg2)，其中kg是體重)。檢品和對(duì)照品以大約相等的體積施用至前列腺左葉和右葉中的每一葉內(nèi)。選擇肛周途徑是因?yàn)檫@是直接施用檢品至前列腺的最精確手段。檢品還將局部地施用至人內(nèi)的前列腺?；\旁觀察每日觀察兩次(上午和下午)，在給藥日之前至少7日開(kāi)始并持續(xù)直到樣品收集的最后一日。對(duì)每只動(dòng)物觀察整體外觀和行為的變化。作為日?；\旁觀察的部分，每日一次投食，給藥日之前至少7日開(kāi)始并持續(xù)直到樣品收集的最后一日(除下文說(shuō)明之外)。觀察從前一曰飼喂留下的餅干數(shù)量。對(duì)于該方法而言，用于研究方法的禁食日例外。體重測(cè)量值在首次給藥(第1日)前并在第3、8和15日根據(jù)如下方法獲得。在測(cè)量體重前撤除食物。心電圖使用導(dǎo)聯(lián)I、II、III、aVR、aVL和aVF在研究前、在第2日和第14日記錄。為了進(jìn)行該操作，將猴在籠外暫時(shí)禁錮在猴椅內(nèi)，但不加以鎮(zhèn)靜。由獸醫(yī)師在研究前(在3周內(nèi)的第1日)并在第14日實(shí)施眼部檢査。在用氯胺酮淺表鎮(zhèn)靜下，使用直接檢眼鏡來(lái)檢查眼前房和眼后房。將幾滴擴(kuò)瞳藥溶液(通常為1%托吡卡胺)滴入每只眼內(nèi)以輔助檢查。用于評(píng)價(jià)血清化學(xué)、血液學(xué)和血凝固參數(shù)的血液樣品在第1周期間并在第3日(在尸體剖檢前)和第14日(在眼部檢查前)從全部動(dòng)物中收集。在用于血清化學(xué)的血液收集前將動(dòng)物禁食至少8小時(shí)(但是不超過(guò)16小時(shí)，無(wú)合適的證明)。尿通過(guò)籠盤(pán)收集法在研究前和在給藥后早晨(第2日、在給藥后大約24小時(shí))和在每次尸體剖檢(第3和15日)時(shí)在處死的動(dòng)物內(nèi)通過(guò)膀胱穿刺收集用于尿分析。a)血清化學(xué)收集法收集方法靜脈穿剌-任何可用的靜脈，優(yōu)選股骨靜脈。表12:血清化學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>*如果出現(xiàn)總膽紅素發(fā)生可疑檢品相關(guān)性增加，則將測(cè)定直接膽紅素濃度和間接膽紅素濃度。b)血液學(xué)血液樣品通過(guò)靜脈穿刺任何可用的靜脈(優(yōu)選股骨靜脈)而收集。收集體積為lml并且所用的抗凝劑是EDTA。分析的參數(shù):表13:<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>*包括總白細(xì)胞、分葉核嗜中性粒細(xì)胞、帶狀嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和根據(jù)需要的其它細(xì)胞計(jì)數(shù)。**來(lái)自全部動(dòng)物的血液涂片將在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(包括研究前)上進(jìn)行檢查。c)血凝固參數(shù)樣品通過(guò)靜脈穿刺任何可用的靜脈(優(yōu)選股骨靜脈)而收集。收集體積為1.8ml并且所用抗凝劑是檸檬酸鈉。將樣品處理成血漿并分析如下參數(shù)活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和血纖蛋白原。d)尿分析樣品通過(guò)籠盤(pán)收集法(在研究前和在給藥后大約24小時(shí))收集和在尸體剖檢時(shí)通過(guò)膀胱穿刺獲得。收集體積當(dāng)可獲得時(shí)多達(dá)5mL。樣品根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法處理。分析如下參數(shù):<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>F.所實(shí)施的分析1.毒性動(dòng)力學(xué)樣品樣品通過(guò)靜脈穿刺任何可用的靜脈(優(yōu)選股骨靜脈)而收集。樣品在給藥前并在給藥后1、2、4、8、24和48小時(shí)采取。收集體積是2mL并且不使用抗凝劑。將樣品處理成血清。血清分成大約等體積的兩個(gè)等分試樣。每一樣品標(biāo)上動(dòng)物編號(hào)、劑量組、收集日、日期、標(biāo)稱的收集時(shí)間、研究編號(hào)和等分試樣編號(hào)。樣品貯存在大約-70。C并通過(guò)ELISA分析MPP5濃度。2.抗體樣品檢測(cè)來(lái)自全部可獲得的組/動(dòng)物的樣品。樣品通過(guò)靜脈穿刺任何可用的靜脈(優(yōu)選股骨靜脈)在給藥前和在第14日進(jìn)行收集。收集體積是2mL。未使用抗凝劑。將樣品處理成血清。樣品貯存在大約-70。C。前列腺特異性抗原分析檢測(cè)來(lái)自全部可獲得的組/動(dòng)物的樣品。樣品通過(guò)靜脈穿刺任何可用的靜脈(優(yōu)選股骨靜脈)在給藥前和在第2、3和10日迸行收集。收集體積是2mL。未使用抗凝劑。將樣品處理成血清并貯存在大約-70。C。處死方法和解剖病理學(xué)處死動(dòng)物在用氯胺酮和Beuthanasia-D或等效物所誘導(dǎo)的深度麻醉下通過(guò)放血處死。在處死日前一夜撤除食物供應(yīng)。根據(jù)以下計(jì)劃處死動(dòng)物<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>終體重在尸體剖檢時(shí)獲得全部計(jì)劃處死動(dòng)物和非計(jì)劃處死動(dòng)物的最終體重。使用該體重來(lái)計(jì)算器官/身體重量比和器官/腦重量比。大體尸體剖檢對(duì)研究期間發(fā)現(xiàn)死亡的或被處死(計(jì)劃處死和非計(jì)劃處死)的全部動(dòng)物實(shí)施完整的大體尸體剖檢。尸體剖檢包括檢查軀體和肌與骨骼系統(tǒng)、全部外表面和孔洞、顱腔和腦的外表面、頸及附屬器官和組織、胸腔、腹腔和盆腔及附屬器官和組織。尿樣品尿(當(dāng)可獲得時(shí)最多5mL)在尸體剖檢從膀胱內(nèi)收集并如本方法的臨床病理學(xué)部分內(nèi)所述進(jìn)行分析。器官重量如下器官(當(dāng)存在時(shí))在固定前進(jìn)行稱重。成對(duì)器官將在一起稱重，除非存在明顯異常，此時(shí)將對(duì)它們分別稱重。垂體在固定后進(jìn)行稱重。<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>(使用尸體剖檢前獲得的終體重)計(jì)算器官/體重比率，以及器官/腦重量比率。組織收集和保存收集如下組織和器官(或其部分)并保存在中性緩沖液的10%福爾馬林內(nèi)(眼除外，其在用于最佳固定的Davidson氏<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>甲狀旁腺?gòu)某Ｒ?guī)組織切片中的偶然缺失不需要重新切片。組織病理學(xué)對(duì)于全部的尸體剖檢動(dòng)物，將上表內(nèi)所列的組織(除紋身以外)包埋在石蠟內(nèi)、切片、用蘇木精和伊紅染色并由ACVP認(rèn)證的獸醫(yī)病理學(xué)家檢查。統(tǒng)計(jì)分析對(duì)由Sierra獲得的全部數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)計(jì)算組均值和標(biāo)準(zhǔn)差，包括體重、臨床病理學(xué)參數(shù)(排除非數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))和器官重量數(shù)據(jù)。用SAS⑧系統(tǒng)8.1版本進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。顯著組間差異將使用方差分析(ANOVA)，隨后進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)加以評(píng)價(jià)。允許使用參數(shù)ANOVA的假設(shè)將使用用于數(shù)據(jù)正態(tài)性的Shapiro-Wilkes檢驗(yàn)和用于方差齊性的Levene氏檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，其中以任一檢驗(yàn)所需要的p^O.OOl顯著性水平來(lái)排除該假設(shè)。如果兩種假設(shè)均滿足，則應(yīng)用單因素ANOVA，以動(dòng)物分組作為因子，使用p3.05顯著性水平。如參數(shù)ANOVA在p^).05上是顯著的，將使用Dunnett氏檢驗(yàn)來(lái)在0.05顯著性水平上確定對(duì)照組與每個(gè)檢品處理組間的統(tǒng)計(jì)性顯著差異。如果任一個(gè)參數(shù)假設(shè)不滿足，則使用Kruskal-Wallis非參數(shù)ANOVA方法來(lái)評(píng)價(jià)組間差異(pa.05)。如果這個(gè)ANOVA是顯著的(再利用顯著性水平pa.05)，則應(yīng)用Dunn氏多重比較檢驗(yàn)。初步結(jié)果前列腺全部處理的動(dòng)物均在其前列腺內(nèi)具有損害(見(jiàn)圖32C-H和33C-H)。組l(對(duì)照)動(dòng)物在第3日具有細(xì)微的炎癥、出血和纖維變性并在第15日具有纖維變性，這與對(duì)注射的反應(yīng)和痊愈相一致。組3和組4內(nèi)存在明顯的嚴(yán)重?fù)p害(圖32E-32H、圖33E-H)和33F)。組3(5pg/g前列腺)和組4(25Mg/g前列腺)間在損害的范圍或嚴(yán)重性上沒(méi)有差異。組2(1pg/g前列腺)內(nèi)存在明顯的、嚴(yán)重性較輕的損害(圖32C、32D、33C、33D)。在第3日，對(duì)檢品的主要反應(yīng)是大部分的前列腺凝集性壞死，同時(shí)具有廣泛出血、混合的細(xì)胞炎癥。炎癥主要是嗜中性粒細(xì)胞性的，較少數(shù)目的炎癥是嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞性的。在某些區(qū)域內(nèi)，存在液化性壞死。凝集性壞死在組2內(nèi)是輕微的而在組3和組4內(nèi)是中度至明顯的。第3日在組2內(nèi)，廣泛的修復(fù)正在發(fā)生，其中在凝集性壞死區(qū)域的邊緣具有向鱗狀化生進(jìn)展的腺上皮的明顯再生性增生，并且間質(zhì)細(xì)胞具有輕微至明顯的活化和增殖。第3日于組3和組4內(nèi)，修復(fù)剛開(kāi)始，由間質(zhì)細(xì)胞的輕微活化和增殖所顯示。第15日在組2內(nèi)，壞死和出血已經(jīng)消退。未觀察到前列腺的空腔形成。損害已經(jīng)形成纖維性組織，腺體繼續(xù)進(jìn)行細(xì)微至輕微的再生性增生和鱗狀化生。炎癥主要是巨噬細(xì)胞性的和淋巴細(xì)胞性的，較少數(shù)目的炎癥是多形核白細(xì)胞性的。在一只動(dòng)物內(nèi)，這些炎癥主要是嗜酸性粒細(xì)胞性的。在第15日在組3和組4內(nèi)，存在繼續(xù)進(jìn)行的凝集性壞死和出血，其中具有更嚴(yán)重的液化性壞死和前列腺空腔形成，以及繼續(xù)進(jìn)行的混合細(xì)胞炎癥。在這些組內(nèi)的修復(fù)由壞死性損害邊緣間質(zhì)的中度至明顯的纖維變性和纖維組織形成所組成，其中具有進(jìn)展至鱗狀化生的腺體再生性增生。炎癥在繼續(xù)發(fā)生壞死的區(qū)域內(nèi)主要是嗜中性粒細(xì)胞性的，但是在纖維變性區(qū)域內(nèi)的損害邊緣具有相對(duì)較高的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。前列腺周?chē)M織精囊第3日，在5/6的處理動(dòng)物中，精囊在腺體腔內(nèi)具有細(xì)微至中度的分泌物礦化作用。該現(xiàn)象作為背景偶爾會(huì)見(jiàn)到，但是不至于到這種程度或不如此處那樣頻繁見(jiàn)到。因此，這可能繼發(fā)于前列腺內(nèi)的變化。在第15日，唯一受到影響的是對(duì)照動(dòng)物。前列腺尿道具有一些炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其可能繼發(fā)于前列腺內(nèi)的變化。實(shí)施例8:MPP5由前列腺組織活化考查了來(lái)自多種動(dòng)物的前列腺的提取物活化本發(fā)明MPP的能力。進(jìn)行這樣的體外研究，其中將大鼠、狗、猴和人的前列腺組織提取物與MPP5溫育以測(cè)定MPP的活化百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)方法如下。從SpragueDawley大鼠和單只beagle狗中獲得新鮮前列腺組織。冰凍的前列腺組織從單只獼猴和從單人中獲得。人前列腺組織作為存檔研究材料從約翰霍普金斯大學(xué)IRB批準(zhǔn)的臨床研究中獲得。對(duì)于本分析，將前列腺切片(每片100-500mg)并以每個(gè)組織體積對(duì)等體積培養(yǎng)基的濃度在無(wú)血清RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)混懸。組織樣品在該培養(yǎng)基內(nèi)于37°C溫育2小時(shí)。離心后，上清液在-80。C冷凍。溶血測(cè)定樣品在37。C融化，離心并收集上清液。使用Bradford測(cè)定法測(cè)定每份上清液的蛋白濃度。將樣品稀釋到相同的初始蛋白濃度。獲得來(lái)自猴樣品和人樣品內(nèi)的上清液的等分試樣以便使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA(Hybritech，BeckmanCoulter)法測(cè)定PSA。每日制備混懸于無(wú)酚紅的Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)內(nèi)的2。/。新鮮人血液紅細(xì)胞(RBC)溶液。使血液紅細(xì)胞沉淀，重懸于3體積的HBSS以除去多余血清并重懸以產(chǎn)生在無(wú)酚紅HBSS內(nèi)的50%溶液。為制備檢測(cè)樣品，溫和地渦旋混合50%RBC樣品以混懸RBC。將RBC的等分試樣添加至230/xL無(wú)酚紅HBSS以產(chǎn)生4。/。(v/v)溶液。向該混懸液添加240/iL前列腺切片條件RPMI培養(yǎng)基的等分試樣，隨后添加來(lái)自100pg/mL貯存液的10pLMPP5等分試樣，以使每個(gè)試樣內(nèi)添加的總MPP5是1/xg并且試樣終體積是500/iL。這種RBC/MPP5/組織溶液在室溫下溫育1小時(shí)。隨后對(duì)樣品離心以沉淀未裂解的RBC，并且獲得來(lái)自每個(gè)樣品內(nèi)的上清液的100等分試樣，并且立即對(duì)該試樣以分光光度方式在540rim處測(cè)量由于RBC裂解所致的血紅蛋白釋放。對(duì)照包括偽處理的RBC(陰性對(duì)照)和用1%Triton-xlOO裂解的RBC(陽(yáng)性對(duì)照)。為了比較水解的程度，分析經(jīng)前列腺組織調(diào)理的培養(yǎng)基的每種樣品的連續(xù)稀釋物。在本研究中，使用提取物1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32的稀釋物。全部樣品一式三份對(duì)溶血進(jìn)行分析。結(jié)果顯示人前列腺組織對(duì)切割MPP5最具活性，與此同時(shí)大鼠前列腺組織和猴前列腺組織只產(chǎn)生較低的反應(yīng)，而狗前列腺組織不對(duì)MPP5顯示任何活性(圖36)。雖然大鼠缺少PSA基因，但是已經(jīng)證實(shí)大鼠擁有人PSA的S3激肽釋放酶同系物(Onozawa等，2001)。在大鼠腹側(cè)前列腺內(nèi)鑒定的這種PSA樣蛋白與人PSA分別顯示64。/。的核苷酸序列同源性和49%的氨基酸序列同源性。此外，大鼠S3激肽釋放酶與人PSA具有相似的等電點(diǎn)和分子量。因此MPP5在大鼠前列腺組織內(nèi)有可能由這種PSA樣S3激肽釋放酶活化。狗前列腺缺乏活化能力與狗沒(méi)有PSA基因的觀察相一致。實(shí)施例9:MPP5由血漿/血清活化如下測(cè)定來(lái)自人、猴、狗、大鼠或小鼠的血清切割MPP5的能力。MPP5(1.073mg/mL)在4°C于冰上融化，等分和在-80。C再冷凍。對(duì)每種條件進(jìn)行兩次分析。將5/igMPP5在總體積250uL的、含有150mMNaCl和25jliL人、猴、狗、大鼠或小鼠血清的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)于37。C溫育IO分鐘。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，將25/ig胰凝乳蛋白酶在添加血清(陽(yáng)性對(duì)照)前添加至反應(yīng)混合物內(nèi)。在其它對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，血清以等體積的緩沖液(陰性對(duì)照)替換。反應(yīng)通過(guò)添加5jaL的100mMPMSF異丙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15/xL等分試樣添加至含有0.5%)3-巰基乙醇的等量2xBioRad加樣緩沖液內(nèi)，并在95°C加熱5分鐘以便使全部蛋白質(zhì)變性并阻斷蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。5/xL樣品在預(yù)制的4-12%Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上，使用XTMOPS電泳緩沖液(BioRadLaboratories)在100V下電泳60分鐘。凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(BioRadLaboratories)并且該膜以脫脂乳(含有0,1。/0Tween20(TBST)的5%tris-緩沖鹽水)在室溫封閉1小時(shí)。MPP5通過(guò)將膜在純化的大鼠多克隆抗MPP5的TBST溶液(稀釋度為l:250，000)內(nèi)室溫溫育1小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。印跡物用TBST洗滌三次后，在HRP連接的山羊抗大鼠抗體(JacksonImmunoResearch)的TBST溶液(稀釋度為1:20,000)中溫育。與膜結(jié)合的抗體根據(jù)試劑盒制造商(CellSignaling)說(shuō)明，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，并使用具有避免飽和作用的化學(xué)發(fā)光自動(dòng)曝光設(shè)置的AlphaInnotechFluorChemSP，用4百萬(wàn)像素CCD照相機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄。使用基于voxel的程序(ImageQuantsoftware;Alphalnnotech，SanLeandro,CA)，以密度測(cè)定方式定量印跡物。在對(duì)背景進(jìn)行校正后，通過(guò)將已切割條帶的密度除以完整條帶密度及已切割條帶密度的總和來(lái)測(cè)定每個(gè)泳道剩下的已切割蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。切割百分?jǐn)?shù)隨后與無(wú)血清和加血清的胰凝乳蛋白酶對(duì)照進(jìn)行比較。MPP5切割百分?jǐn)?shù)的估計(jì)通過(guò)電泳和蛋白質(zhì)印跡的密度測(cè)定定量完成。切割百分?jǐn)?shù)隨后與僅有MPP5(陰性)的對(duì)照和MPP5+胰凝乳蛋白酶(陽(yáng)性)對(duì)照比較，以確定MPP5是否被血清酶切割。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)不到人、猴、狗、大鼠或小鼠血清對(duì)MPP5的切割。表14顯示與多種血清溫育后被切割的MPP5的百分?jǐn)?shù)。圖37顯示MPP5在多種血清存在或不存在下溫育10分鐘后的蛋白質(zhì)印跡。圖板A顯示以250jitL試樣體積與來(lái)自男性(H)(泳道2-5)或獼猴(Mk)(泳道6-7)的25血清溫育的MPP5。泳道3含有MPP5、人血清和胰凝乳蛋白酶，但未溫育。泳道8是分子量標(biāo)記物。(B)以250pL試樣體積與來(lái)自小鼠(Mu)(泳道2-5)、狗(D)(泳道6-7)或大鼠(R)(泳道8-9)的25/xL血清溫育的MPP5。泳道3含有MPP5、人血清和胰凝乳蛋白酶，但未溫育。泳道10是分子量標(biāo)記物。表14:血清內(nèi)MPP5的切割百分?jǐn)?shù)的物種比較<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>這些結(jié)果顯示MPP5在正常人血清內(nèi)不被活化，并且還顯示在前列腺內(nèi)注射后泄露至血液內(nèi)時(shí)，MPP5將不會(huì)變成活化的，甚至在具有異乎尋常高水平的血清PSA的男性中也是如此。這些結(jié)果與公開(kāi)的數(shù)據(jù)一致，其中所述的數(shù)據(jù)證實(shí)PSA在血液內(nèi)通過(guò)血清蛋白酶抑制物(主要是cd-抗胰凝乳蛋白酶和o;2-巨球蛋白)以酶方式滅活(Lilja等，1991;Otto等，1998)。實(shí)施例10:MPP5由非PSA蛋白酶活化進(jìn)行體外研究以測(cè)定MPP5對(duì)于前體藥物在與前列腺以外的組織無(wú)意接觸時(shí)可能潛在遇到的非PSA蛋白酶的敏感性。具體而言，評(píng)估了數(shù)種常見(jiàn)蛋白酶切割MPP5的效力，這些蛋白酶包括PSA、弗林蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶、MMP-7、組織蛋白酶B(半胱氨酸蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶hKl、hK2和uPA。如下實(shí)施分析。將天然氣單胞菌溶素原(野生型PA;0.84mg/mL)和1.073mg/mL的MPP5用于檢驗(yàn)全部蛋白酶的分析，其中使用弗林蛋白酶的分析#2例外，在分析#2中使用批號(hào)為#N-PTIC-MF-PAL-BX的1mg/ml的MPP5。為測(cè)量因PSA切割所致的活化，將5/ig天然氣單胞菌溶素原或MPP5在含有150mMNaCl的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)溫育。添加不同量的PSA(根據(jù)對(duì)數(shù)比例的0-10pgPSA)并以250pcL總體積于37。C溫育60分鐘。反應(yīng)通過(guò)添加5mL的100mMPMSF的異丙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15/xL等分試樣添加至含有0.5%)3-巰基乙醇的等量2xBioRad加樣緩沖液內(nèi)并在95°C加熱5分鐘。樣品在預(yù)制的10%Tris-HCl凝膠上，使用XTMOPS電泳緩沖液(BioRadLaboratories)在200V下電泳30分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為在研究#1內(nèi)測(cè)量因弗林蛋白酶切割所致的活化，將5/ig天然PA或MPP5在含有150mMNaCl和不同量的弗林蛋白酶(根據(jù)對(duì)數(shù)比例的0-3.2ng弗林蛋白酶)的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250pL總體積于37。C溫育IO分鐘。反應(yīng)通過(guò)添加5/iL的100mMPMSF異丙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15/iL等分試樣添加至含有0.5%/3-巰基乙醇的等量2xBioRad加樣緩沖液內(nèi)并在95°C加熱5分鐘。樣品在預(yù)制的10%Tris-HCl凝膠上，使用XTMOPS電泳緩沖液(BioRadLaboratories)在200V下電泳30分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為在研究#2內(nèi)測(cè)量因弗林蛋白酶切割所致的活化，將5/xg天然PA或MPP5在含有150mMNaCl、1mMCaCl2和0至3單位弗林蛋白酶的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250總體積于37°C溫育60分鐘。注意在前一個(gè)實(shí)驗(yàn)(弗林蛋白酶，研究#1)中，相同酶濃度的溫育時(shí)間是10分鐘。反應(yīng)通過(guò)添加2.5pL的100mMPMSF乙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15mL等分試樣添加至含有0.5%/3-巰基乙醇的等量2xBioRad加樣緩沖液內(nèi)并在95°C加熱5分鐘。樣品在預(yù)制的10%NovexBis-TrisNupage凝膠(Invitrogen)上，使用lxMOPS-SDS電泳緩沖液在200V下電泳50分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為測(cè)量因胰凝乳蛋白酶所致的活化，將5iag天然PA或MPP5在含有150mMNaCl和不同量的胰凝乳蛋白酶(根據(jù)對(duì)數(shù)比例的0-500ng胰凝乳蛋白酶)的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250總體積于37。C溫育IO分鐘。反應(yīng)通過(guò)添加5pL的lOOmMPMSF異丙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15/iL等分試樣添加至含有0.5%iS-巰基乙醇的等量2xBioRad加樣緩沖液內(nèi)并在95°C加熱5分鐘。樣品在預(yù)制的10%Tris-HCl凝膠上，使用XTMOPS電泳緩沖液(BioRadLaboratories)在200V下電泳30分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢為在研究#1內(nèi)測(cè)量因凝血酶所致MPP5的活化，將5/ig氣單胞菌溶素相關(guān)蛋白質(zhì)(天然PA或MPP5)在含有150mMNaCl和不同量的凝血酶(根據(jù)對(duì)數(shù)比例，0-12pg的0.23單位/]iig凝血酶)的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250piL總體積于37。C溫育IO分鐘。反應(yīng)通過(guò)添加5/xL的100mMPMSF異丙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15等分試樣添加至含有0.5%/3-巰基乙醇的等量2xBioRad加樣緩沖液內(nèi)并在95°C加熱5分鐘。樣品在預(yù)制的10%Tris-HCl凝膠上，使用XTMOPS電泳緩沖液(BioRadLaboratories)在200V下電泳30分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為在研究#2內(nèi)測(cè)量因凝血酶所致MPP5的活化，用這些實(shí)驗(yàn)內(nèi)使用的凝血酶試劑盒(Novagen)所提供的凝血酶稀釋緩沖液來(lái)制備兩份凝血酶稀釋物1/66和1/25。用凝血酶試劑盒所提供的lx切割緩沖液來(lái)制備含有10MgMPP5(N-PTIC-MF-PAL-BX)的兩份反應(yīng)混合物。以相同方式制備含有帶His標(biāo)簽的天然氣單胞菌溶素原(PA-EndHis)的兩份反應(yīng)混合物。凝血酶以0.15單位添加至其中一份PA-EndHis混合物中并以0.4單位添加至其中一份MPP5混合物中。溫育總體積在每一例子中是50Ml。反應(yīng)混合物在室溫下溫育6.5小時(shí)，并且隨后通過(guò)添加苯甲基磺酰氟(Sigma)至終濃度1mM而抑制蛋白水解。樣品在4°C在冰上]C存過(guò)夜。樣品隨后在lxLDS樣品緩沖液(Invitrogen)內(nèi)準(zhǔn)備并在70°C加熱10分鐘，隨后上樣并在10%Bis-TrisNuPAGE凝膠(Invitrogen)上，在非還原條件下于200V恒定電壓的lxMOPS-SDS電泳緩沖液內(nèi)電泳50分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為測(cè)量因胰蛋白酶所致的活化，將5/xg氣單胞菌溶素相關(guān)蛋白質(zhì)(野生型PA或MPP5)在含有150mMNaCI和不同量的I型胰蛋白酶(根據(jù)對(duì)數(shù)比例的0-500ng胰蛋白酶)的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250總體積于37°C溫育10分鐘。反應(yīng)通過(guò)添加5/xL的100mMPMSF異丙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15ML等分試樣添加至含有0.5%/3-巰基乙醇的等量2xBioRad加樣緩沖液內(nèi)并在95。C加熱5分鐘。樣品在預(yù)制的10。/。Tris-HCl凝膠上，使用XTMOPS電泳緩沖液(BioRadLaboratories)在200V下電泳30分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為測(cè)量因uPA所致的活化，將5pgPA和MPP5分別在含有150mMNaCI和10-0.16piguPA的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250ptL總體積于37°C溫育4小時(shí)。反應(yīng)通過(guò)添加5的100mMPMSF異丙醇溶液，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15pL等分試樣在含有0.5%2-巰基乙醇的lx樣品緩沖液(Invitrogen)內(nèi)準(zhǔn)備并在95°C加熱5分鐘。樣品(IOOng)在預(yù)制的10%NovexBis-TrisNuPAGE凝膠(Invitrogen)上，使用lxMOPS-SDS電泳緩沖液在還原條件下，于200V電泳50分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為測(cè)量因組織蛋白酶B所致的活化，將5/xgPA和MPP5分別在含有150mMNaCl、1mMEDTA、5mML-半胱氨酸和24-0.375單位組織蛋白酶B的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250jLtL總體積于37°C溫育4小時(shí)。反應(yīng)通過(guò)添加亮抑蛋白酶肽至終濃度2ptM(Sigma法)，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15等分試樣在含有0.5%2-巰基乙醇的lx樣品緩沖液(Invitrogen)內(nèi)準(zhǔn)備并在95°C加熱5分鐘。樣品(IOOng)在預(yù)制的10%NovexBis-TrisNuPAGE凝膠(Invitrogen)上，使用lxMOPS-SDS電泳緩沖液在還原條件下，于200V電泳50分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為測(cè)量因MMP-7所致的活化，將PA和MPP5分別在含有150mMNaCl、10mMCaCl2#Q1.5-0.0234jagMMi-7的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以250/xL總體積于37。C溫育3小時(shí)。反應(yīng)通過(guò)添加8.4aiL的31mM1,10-菲咯啉一水合物的乙醇溶液(最終1/iM)，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的15pL等分試樣在含有0.5%2-巰基乙醇的lx樣品緩沖液(Invitrogen)內(nèi)準(zhǔn)備并在95°C加熱5分鐘。樣品(IOOng)在預(yù)制的10%NovexBis-TrisNuPAGE凝膠(Invitrogen)上，使用lxMOPS-SDS電泳緩沖液在還原條件下，于200V電泳50分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為測(cè)量因hKl所致的活化，5/xghKl由在終體積50pi的TCN緩沖液(50mMTri、10mMCaCl2、0.15MNaCl、pH7.5)內(nèi)的0.05]Ug嗜熱菌蛋白酶活化，在37。C溫育1小時(shí)并用2.5/il的200mM1,10-菲咯啉一水合物的95。/q乙醇抑制(R&DSystems法)。1jugPA和PSA-PAH1分別在含有150mMNaCl、1mMEDTA和1]Ug-0.015625pg活化的hKl的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以50/iL總體積于37°C溫育4小時(shí)。反應(yīng)通過(guò)添加PMSF的異丙醇溶液至終濃度2mM，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的5mL等分試樣在含有0.5%2-巰基乙醇的lx樣品緩沖液(Invitrogen)內(nèi)準(zhǔn)備并在95°C加熱5分鐘。樣品(100ng)在預(yù)制的10%NovexBis-TrisNuPAGE凝膠(Invitrogen)上，使用lxMOPS-SDS電泳緩沖液在還原條件下，于200V電泳50分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。為測(cè)量因hK2所致的活化，1/igPA和MPP5分別在含有150mMNaCl和0.25-0.0039pghK2的20mMHEPES緩沖液(pH7.4)內(nèi)，以50ML總體積于37。C溫育1小時(shí)。反應(yīng)通過(guò)添加PMSF的異丙醇溶液至終濃度2mM，隨后在冰上冷卻而終止。將終止的反應(yīng)混合物的10pL等分試樣在含有0.5%2-巰基乙醇的lx樣品緩沖液(Invitrogen)內(nèi)準(zhǔn)備并在95°C加熱5分鐘。樣品(IOOng)在預(yù)制的10%NovexBis-TrisNuPAGE凝膠(Invitrogen)上，使用lxMOPS-SDS電泳緩沖液在還原條件下，于200V電泳50分鐘。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法檢測(cè)。本研究的結(jié)果表明在MPP5與氣單胞菌溶素原(PA)之間的敏感性曲線差異明顯，其中天然氣單胞菌溶素原(PA)比MPP5對(duì)多種蛋白酶(PSA例外)更敏感(表15)。表15:體外蛋白酶敏感性研究結(jié)果蛋白酶名稱切割50%MPP5所需要的量切割50%天然氣單胞菌溶素原所需要的量對(duì)MPP5的特異性活性對(duì)氣單胞菌溶素原的特異性活性弗林蛋白酶".2ng1.2ng0.24nM/jxg/min9.69nM/pg/min胰蛋白酶813ng9.5ng5,700nM/(ig/min489,000nM/pg/min胰凝乳蛋白酶31Mg3.0/ig150nM/fig/min1550nM/jig/min凝血酶>12pg>12pg<0.00000078nM/ng/min<0.00000078nM/pg/minMMP-7無(wú)活性無(wú)活性00組織蛋白酶B170單位51.6單位1.2fmol/|ig/min3.9fmol/pg/minhKl無(wú)活性015.3fmol/|ig/minhK2無(wú)活性0.1Mg01.61pmol/jag/min前列腺特異性抗原(PSA),又稱作hK312.2pg/xg0.0635nM/ng/min0.0156nM/ng/minuPA173pg7.79pg1,1fmol/ng/min25.8fmol/ng/min注意報(bào)道的單位反映如原始數(shù)據(jù)內(nèi)所記錄的那些單位實(shí)施例11:MPP5在大鼠內(nèi)的生物分布為了確定單次劑量前列腺內(nèi)施用后MPP5在前列腺內(nèi)的生物分布及其在周?chē)M織的潛在分布，在雄性Sprague-Dawley大鼠中進(jìn)行使用125I-MPP5的放射標(biāo)記的定量性完整身體放射自顯影法研究。給藥制劑內(nèi)的放射性活度濃度(士S.D.)是1.6xl09±44.02x106dpm/g(730.94pC/g)。基于平均濃度值附近的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，認(rèn)為給藥制劑是均勻的。通過(guò)注射而施用至前列腺內(nèi)的所配制125I-MPP5的平均劑量是8.73Mg/動(dòng)物(5.86/xCi/動(dòng)物/10體積)。取兩等分試樣的血液(2x50iiiL)用于放射性活度分析。血液在3500rpm和4。C離心大約IO分鐘(在采集的60分鐘內(nèi))，并且取兩等分試樣的血漿(2x50pL)用于放射性活度分析。使已稱重的兩等分試樣的全血增溶(Soluene-350)并用過(guò)氧化氫(30。/。w/v)脫色，隨后與用于放射性活度測(cè)量的液體閃爍流體混合。將兩等分試樣的血漿直接與用于放射性活度測(cè)量的液體閃爍流體混合。對(duì)于定量性整體自放射發(fā)光照相技術(shù)，將動(dòng)物在己垸與干冰的混合物內(nèi)深度冷凍20分鐘。隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作方法使用冷凍支架將動(dòng)物右側(cè)臥地包埋在2%CMC介質(zhì)內(nèi)以便收集完整身體矢狀切片。在每個(gè)冷凍的CMC塊內(nèi)打十二個(gè)孔以便引入10種1251標(biāo)準(zhǔn)溶液和兩種質(zhì)控液。將添加"C或^I的血液擠入每個(gè)CMC塊內(nèi)的4個(gè)鉆孔內(nèi)，所述的血液根據(jù)需要作為用于鑒定呈現(xiàn)低放射性活度水平或低反差的結(jié)構(gòu)的參考點(diǎn)使用。每個(gè)動(dòng)物標(biāo)本塊使用LeicaCM3600低溫恒冷冰凍切片機(jī)(LeicaCM3600cryomicrotome)切片。收集30pm切片并確定動(dòng)物編號(hào)、時(shí)點(diǎn)、切片編號(hào)、切片日期和刀片位置。結(jié)果顯示在單次劑量前列腺內(nèi)施用后，血液和血漿內(nèi)放射性活度的濃度低，表明前列腺內(nèi)施用后微弱的表觀吸收。放射性活度的最高濃度(9.445pigEq/g)在首次采樣時(shí)點(diǎn)(3h)從右腹側(cè)前列腺注射部位中獲得。高水平的放射性活度也在前列腺的其它葉(左腹側(cè)葉、右背側(cè)葉和左背側(cè)葉)內(nèi)觀察到，但是隨時(shí)間至終末采樣時(shí)點(diǎn)96小時(shí)而減少。在所述終末時(shí)點(diǎn)上，前列腺內(nèi)放射性活度的濃度在前列腺的全部區(qū)域內(nèi)是低的，除了右腹側(cè)前列腺注射部位(0.268/zgEq/g)以外。除了前列腺之外，僅膀胱和甲狀腺顯示比血液或血漿更高的放射性活度的濃度。甲狀腺的放射性活度(1251)水平在給藥后12至48小時(shí)時(shí)間范圍內(nèi)增加并保持高水平直至在處理后96小時(shí)的最終時(shí)點(diǎn)。甲狀腺內(nèi)|251的隔離可能指示分布至甲狀腺的游離1251。在下列中觀察到低濃度的放射性活度腎上腺(《0.034iugEq/g)、腎臟(《0.032pgEq/g)、肝臟(《0.045pgEq/g)、肺臟(《0.041MgEq/g)和胰臟(《0.022/>tgEq/g)。腦顯示最低濃度的放射性活度(《0.003/xgEq/g)。在所有的其它主要器官中，總是觀察到極低水平的放射性活度，其表明沒(méi)有出現(xiàn)明顯的全身分布。組織水平對(duì)血漿水平隨時(shí)間增加，表明MPP5從血漿中比從組織中更快地得到清除。因此，這項(xiàng)生物分布研究表明MPP5主要停留在施用的局部位置，其對(duì)周?chē)募?xì)胞僅有有限的周邊分布和毒性。實(shí)施例12:MPP5在猴內(nèi)的毒性動(dòng)力學(xué)MPP5的毒性動(dòng)力學(xué)也在前列腺內(nèi)施用后，如實(shí)施例7內(nèi)所述在性成熟的雄性獼猴內(nèi)確定。每組4只猴使用2x25ML注射(25/iL/葉)，以對(duì)照鹽水或0.35、4.14或25.79/igMPP5/g前列腺組織進(jìn)行前列腺內(nèi)給藥。血液樣品在給藥之前并在給藥后1、2、4、8、24和48小時(shí)從全部猴(16只)內(nèi)獲得。本研究的初步結(jié)果還在實(shí)施例7內(nèi)描述。如下代表本研究最終完成的毒性動(dòng)力學(xué)結(jié)果。使用己驗(yàn)證的ELISA方法對(duì)研究樣品分析MPP5。使用50/iL血清重復(fù)分析，ELISA方法的最低定量限(LLOQ)是5ng/mL。在前列腺內(nèi)施用后未檢測(cè)到可評(píng)估的MPP5全身水平。組2內(nèi)的一只動(dòng)物在全部時(shí)間點(diǎn)均顯示出高于LL0Q(5ng/mL)的濃度。與來(lái)自相同劑量組的動(dòng)物相比，認(rèn)為該動(dòng)物是特殊的，并且來(lái)自該動(dòng)物的全部樣品在后續(xù)的分析內(nèi)進(jìn)行重復(fù)分析以便證實(shí)。全部原始結(jié)果在重復(fù)分析內(nèi)得到證實(shí)。由于給藥前的樣品也超過(guò)LLOQ，因而確定在該只動(dòng)物內(nèi)所觀察到的濃度可能歸因于基質(zhì)干擾并且與處理無(wú)關(guān)。實(shí)施例13:評(píng)價(jià)MPP5處理的猴的前列腺形態(tài)學(xué)對(duì)實(shí)施例7和12內(nèi)所述的研究中收集的猴前列腺切片進(jìn)行進(jìn)一步分析。進(jìn)行蘇木精&伊紅(H&E)染色以檢查所處理前列腺的形態(tài)學(xué)，對(duì)PSA進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以檢查PSA的分布，并且進(jìn)行MPP5染色以便檢査MPP5的分布。所用的方法描述如下。材料和試劑來(lái)自對(duì)照和來(lái)自MPP5處理的猴前列腺中的96張(每只猴6張)切片貯存在室溫密封的容器內(nèi)。制備前列腺組織的切片并用H&E染色，其中所述的前列腺組織來(lái)自用載體或0.35、4.1或25/igMPP5/g前列腺經(jīng)前列腺內(nèi)給藥的猴。切片還根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知方法對(duì)PSA和MPP5進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。圖像分析猴前列腺組織切片使用1.25x物鏡評(píng)價(jià)。使用Metamorph軟件包(MolecularDevice,Sunnyvale,CA)來(lái)畫(huà)出前列腺總面積和MPP5誘導(dǎo)性損傷總面積的輪廓。該軟件提供作為像素?cái)?shù)的總面積。將lxlcm的正方形置于每張載玻片上作為測(cè)定每cmM象素?cái)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)。隨后測(cè)定來(lái)自每個(gè)MPP5劑量的損傷面積并轉(zhuǎn)換成損傷的cm2。損傷面積百分?jǐn)?shù)由受損面積/前列腺總面積的比率乘以100確定。對(duì)照(正常)猴前列腺的分析顯示獼猴前列腺就腺的形態(tài)學(xué)而言與人前列腺相似，并且PSA的分布限于導(dǎo)管內(nèi)層的柱狀上皮細(xì)胞。象人一樣，猴前列腺包圍尿道。因此，猴前列腺代表了在前列腺內(nèi)注射PSA活化的蛋白質(zhì)毒素MPP5時(shí)，用于研究MPP5活化和毒性的可獲得的最佳動(dòng)物模型。來(lái)自本研究中前列腺組織的形態(tài)學(xué)表征以及前列腺內(nèi)PSA和MPP5的分布顯示在0.35;ig/g前列腺至4.14jng/g前列腺的劑量時(shí)，前列腺損傷面積/百分?jǐn)?shù)存在劑量-反應(yīng)；然而，在4.14Mg/g前列腺至25.79pg/g前列腺時(shí)，劑量-反應(yīng)沒(méi)有明顯增加(表15)。在接受劑量4.14gg/g前列腺的猴內(nèi)觀察到了所計(jì)算的最大損傷面積，在所述的猴內(nèi)每葉單次注射25/xL損傷總腺體的大約50%。該結(jié)果表明最大損傷可能受限于前列腺每葉25pL注射體積的總分布。在MPP5誘導(dǎo)正常腺組織明顯梗死的處理區(qū)域內(nèi)，PSA染色明顯減弱，而在前列腺的鄰近未受損區(qū)域內(nèi)，PSA染色在分布和程度方面是正常的。這些結(jié)果表明MPP5對(duì)腺體內(nèi)柱狀上皮細(xì)胞的殺傷消除PSA產(chǎn)生。該結(jié)果還顯示在中等劑量水平和高劑量水平上MPP5的分布與梗死區(qū)域重疊，如圖38內(nèi)所示。在給藥后第15日，在中等劑量水平上沒(méi)有觀察到殘余MPP5。此外，MPP5在本研究?jī)?nèi)已評(píng)價(jià)的任意切片內(nèi)似乎未穿透前列腺包膜。表15:因MPP5所致前列腺損傷'的面積和百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>在每葉注射25mL后的損傷(總腺體的面積/百分?jǐn)?shù))在MPP5誘導(dǎo)正常腺組織明顯梗死的處理區(qū)域內(nèi)，PSA染色明顯減弱。在鄰近未受損區(qū)域內(nèi)，PSA染色在分布和程度方面是正常的。這些結(jié)果表明MPP5對(duì)腺體內(nèi)柱狀上皮細(xì)胞的殺傷消除PSA產(chǎn)生。然而，MPP5不改變未損害區(qū)域內(nèi)的PSA產(chǎn)生，MPP5也不選擇產(chǎn)生較低水平PSA的上皮細(xì)胞。在環(huán)繞尿道的肌肉套(cuff)內(nèi)未觀察到PSA染色。尿道組織內(nèi)PSA的缺少可以部分地解釋尿道沒(méi)有任何明顯的損傷。因此，小體積(25/xL)注射MPP5至前列腺的單葉可以在猴正常前列腺內(nèi)導(dǎo)致產(chǎn)生PSA的腺組織大面積明顯梗死，而對(duì)不產(chǎn)生PSA的結(jié)構(gòu)(例如尿道)沒(méi)有明顯損傷。實(shí)施例14:MPP5在狗內(nèi)的毒性在雄性beagle狗內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)性質(zhì)的毒理學(xué)研究，以便確定MPP5單次前列腺內(nèi)給藥后的潛在的直接前列腺內(nèi)毒性和MTD。MPP5經(jīng)前列腺內(nèi)注射(左葉)100i^L劑量體積的0、50、107、200或400]Ug(基于前列腺重量，這些劑量分別等同于0、22、24.4、40和72.2^g/g前列腺)施用至雄性beagle狗(l只/組)。動(dòng)物在給藥后觀察1周。不存在死亡或不存在對(duì)臨床觀察、體重、食物消耗或臨床病理學(xué)的處理相關(guān)性影響。不存在對(duì)前列腺重量的明顯MPP5相關(guān)性效應(yīng)。大體病理學(xué)變化在前列腺左葉和鄰近的腹部脂肪內(nèi)確定，并由延伸至前列腺實(shí)質(zhì)的前列腺暗色區(qū)域組成。腹部脂肪的粘連和/或在腹部脂肪內(nèi)的暗色區(qū)域與前列腺內(nèi)觀察到的MPP5相關(guān)性效應(yīng)有關(guān)。在用400/ig處理的狗中，暗色區(qū)域數(shù)量更多并且前列腺左葉增大。認(rèn)為這些病理學(xué)變化的嚴(yán)重性的增加對(duì)預(yù)期的MPP5藥理學(xué)效應(yīng)有作用。似乎不存在任何明顯的前列腺外毒性?？偠灾?，在前列腺內(nèi)觀察到明顯的處理相關(guān)性大體變化，其中在環(huán)繞的或鄰近的腹部脂肪組織具有有限的相關(guān)性效應(yīng)，在400ptg水平上嚴(yán)重性增加。狗前列腺與人前列腺具有結(jié)構(gòu)相似性，它們都包括2葉結(jié)構(gòu)、本質(zhì)上是腺泡導(dǎo)管和存在豐富的間質(zhì)(Wientjes等，2005)。雖然人前列腺比狗前列腺具有更高比例的間質(zhì)性組織，但是不知道人前列腺與狗前列腺之間纖維隔膜(fibrouspartition)結(jié)構(gòu)和血液及淋巴引流模式的差異達(dá)到何種程度。不過(guò)，以前已經(jīng)證實(shí)狗可以作為研究前列腺內(nèi)注射效應(yīng)的有用模型(Rosser等，2004)。然而，在MPP5的例子中，beagle狗似乎沒(méi)有清楚地顯出對(duì)這種化合物的細(xì)胞溶解性效應(yīng)敏感。其原因可能在于狗中缺乏PSA表達(dá)(或能夠切割MPP5的其它非特異性酶)。狗模型顯示在PSA不存在下，MPP5在極高的劑量上不活化，其證實(shí)了非活化前體藥物的安全性。相反，已知大鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)分別表達(dá)PSA樣激肽釋放酶和PSA，并且已經(jīng)證實(shí)甚至對(duì)低濃度的MPP5敏感。因此，雖然狗前列腺在解剖上與人前列腺相似，但是狗前列腺似乎沒(méi)有在MPP5活化方面顯示與人前列腺的功能性相關(guān)，因而不再繼續(xù)以狗作為MPP5的毒理學(xué)模型。然而，對(duì)狗的研究顯示MPP5在不被PSA切割時(shí)似乎無(wú)藥理學(xué)活性，這就為其提供了依據(jù)——即當(dāng)MPP5在不產(chǎn)生PSA的組織內(nèi)存在時(shí)，它不會(huì)產(chǎn)生顯著的毒性。實(shí)施例15:MPP5在猴內(nèi)的毒性為明確MPP5在產(chǎn)生內(nèi)源性PSA的非嚙齒類(lèi)物種內(nèi)的毒性，前列腺內(nèi)毒性研究如實(shí)施例7內(nèi)所述在注射0.35、4.14或25.79jugMPP5/g前列腺組織的雄性獼猴(4只/組)內(nèi)實(shí)施。施用兩次會(huì)陰注射，對(duì)前列腺的每葉(25pL/葉)注射一次。本研究的初步結(jié)果在實(shí)施例7內(nèi)顯示。如下是最終結(jié)果的描述。在前列腺內(nèi)直接施用并觀察2日或14日時(shí)間后，與MPP5有關(guān)的毒性限于前列腺，同時(shí)周?chē)慕M織幾乎沒(méi)有損傷或具有其它明顯的全身效果。血液分析的結(jié)果表明雄性獼猴表達(dá)可檢測(cè)水平的PSA，并且MPP5的前列腺內(nèi)施用釋放顯著量的PSA至血液/血清內(nèi)。PSA水平在處理后10日返回至接近基線水平。在任何劑量水平均沒(méi)有觀察到對(duì)臨床征兆、體重、眼狀況、尿分析或心電圖(ECG)評(píng)價(jià)的處理相關(guān)性效應(yīng)。血清化學(xué)和血液學(xué)評(píng)估揭示短暫的細(xì)胞反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。在研究第3日，全部組均觀察到短暫的急性期免疫學(xué)應(yīng)答并且其歸因于與手術(shù)方法有關(guān)的炎癥和局限于前列腺的炎癥。在研究第3日記錄到的C反應(yīng)蛋白(CRP)增加通常是劑量相關(guān)性的并且與混合的細(xì)胞炎癥和顯微鏡觀察到的前列腺壞死的程度相一致。大體病理變化和微觀病理變化在全部MPP5劑量水平上于第3日在前列腺觀察。這些變化以壞死、出血和混合的細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，并且在接受中等劑量和高劑量MPP5的動(dòng)物內(nèi)更嚴(yán)重。低劑量組的猴還在第3日顯示組織學(xué)變化，其中所述變化與修復(fù)一致，該修復(fù)包括上皮組織內(nèi)的再生性增生和鱗狀化生以及在間質(zhì)(間質(zhì)(mesenchymal))組織內(nèi)的纖維組織形成。在中等劑量組和高劑量組內(nèi)的修復(fù)在第3曰是微弱至缺乏的。在第15日，低劑量組內(nèi)的壞死已經(jīng)消退并且修復(fù)繼續(xù)進(jìn)行。在中等劑量組和高劑量組內(nèi)，壞死在第15日繼續(xù)進(jìn)行并且與修復(fù)相一致的變化限于壞死性損害的邊緣。相反，在前列腺周?chē)M織或全身組織內(nèi)在第3日或第15日沒(méi)有可歸因于MPP5的變化。實(shí)施例16:MMP5在猴內(nèi)的免疫應(yīng)答還對(duì)MPP5的潛在免疫應(yīng)答進(jìn)行了評(píng)價(jià)。動(dòng)物如實(shí)施例7內(nèi)所述用MPP5處理。對(duì)MPP5的潛在免疫應(yīng)答如下測(cè)定。猴組根據(jù)下表接受MPP5的多種劑量直接施用至前列腺。在注射日前從動(dòng)物中收集血清(大約0.5mL)并在注射后第14日再次收集。血清IC存在-70。C直至分析。免疫球蛋白反應(yīng)如單獨(dú)所述通過(guò)ELISA測(cè)量。簡(jiǎn)而言之，氣單胞菌溶素原(0.5pg/mL的磷酸鹽緩沖鹽水)通過(guò)在4°C包被過(guò)夜而結(jié)合至EIA平板。非特異性結(jié)合通過(guò)用5%BSA(Sigma)在室溫包被而抑制。將匯集的正常猴血清的連續(xù)十倍稀釋物(1:100-1:1，000,000)分成一式四份使用，以形成用于在MPP5施用后于多個(gè)時(shí)間采集的動(dòng)物血清內(nèi)測(cè)定滴度的比較曲線。將來(lái)自MPP5處理的猴中的血清樣品稀釋十倍(I:IOO-1:1，000，000)以提供對(duì)應(yīng)于正常血清的濃度。過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗大鼠IgG(JacksonImmunoResearch)與結(jié)合至氣單胞菌溶素原包被的孔的抗體結(jié)合。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)添加OPD過(guò)氧化物酶底物使顏色顯現(xiàn)。在MolecularDynamicsVERSAmax微量平板讀數(shù)儀上測(cè)量490nm處的吸光度。滴度被定義為以上的稀釋度，其中吸光度讀數(shù)小于在相同稀釋度下的匯集的正常血清的吸光度讀數(shù)+2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。在MPP5施用前，除一只載體對(duì)照動(dòng)物之外的全部猴均沒(méi)有可檢測(cè)的滴度。那只對(duì)照動(dòng)物似乎在研究之前已經(jīng)接觸免疫原，因?yàn)榈偷味鹊某霈F(xiàn)在第14日樣品內(nèi)得以證實(shí)并在再次分析中再次證實(shí)。接受1/ig/gMPP5的兩只動(dòng)物中的一只動(dòng)物顯示滴度。類(lèi)似地，接受5pg/gMPP5的兩只動(dòng)物中的一只動(dòng)物顯示滴度。接受25ptg/gMPP5的兩只動(dòng)物均顯示滴度。將每只劫物在施用前和施用后所抽取的血液的滴度列于表16。說(shuō)明書(shū)第120/123頁(yè)表16:施用MPP5后猴內(nèi)的抗體滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>*該動(dòng)物在施用前顯示相同的微小滴度圖39顯示施用MPP5后猴內(nèi)的抗體滴度。沒(méi)有滴度高于104。這表明前列腺內(nèi)施用MPP5沒(méi)有激發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。然而，6只已處理動(dòng)物中的4只顯示高于匯集血清的滴度。在用0.35/xg/g前列腺或4.14Mg/g前列腺處理的兩只猴中處理的兩只猴中，均觀察到其中的一只猴具有抗體滴度，并且接受25.79gg/g前列腺的兩只動(dòng)物均顯示滴度。因此，MPP5的施用在一些猴內(nèi)誘導(dǎo)了可檢測(cè)但滴度低的免疫應(yīng)答。基于實(shí)施例11、12和15內(nèi)的結(jié)果，任何劑量水平都不存在前列腺外毒性的跡象；因此，全身性無(wú)可見(jiàn)不良作用劑量水平(NOAEL)是已檢測(cè)的最高M(jìn)PP5劑量一一即25.79pig/g前列腺(基于實(shí)際前列腺重量)。在前列腺內(nèi)所觀察到的效應(yīng)既是劑量依賴的，又是基于MPP5的已知作用機(jī)制可預(yù)測(cè)的。在全部劑量水平上觀察前列腺內(nèi)的效應(yīng)，其中所述劑量水平包括已檢測(cè)的最低劑量0.35/ig/g前列腺，該劑量損傷大約25%的前列腺。因此，對(duì)于局部前列腺效應(yīng)的最低可觀察不良作用水平(LOAEL)在本研究中是0.35/ig/g前列腺。前述實(shí)施例描述了MPP5在雄性白化大鼠中靜脈內(nèi)施用或前列腺內(nèi)施用后以及在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中前列腺內(nèi)注射后的藥物代謝和毒性動(dòng)力學(xué)的研究。用MPP5實(shí)施的非臨床性藥物代謝和藥物代謝動(dòng)力學(xué)(DMPK)研究的總結(jié)示于表17。表17:用MPP5實(shí)施的非臨床性藥物代謝和藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究列表研究題目結(jié)果MPP5在白化大鼠中經(jīng)前列腺內(nèi)或靜脈內(nèi)推注的急性毒性研究(觀察時(shí)間為第1日、第14日或第28日)[實(shí)施例6]在單次前列腺內(nèi)注射(2、10或25/xg)或IV注射(25pg)后提供毒性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。MPP5在前列腺內(nèi)注射2Mg后檢測(cè)不到。C咖x隨10/ig和25/ig上的劑量增加而增加然而在10/ig上的AUC是在25/ig上的AUC的兩倍。在IV注射后，tmw是O(即時(shí))。單次注射'"I-MPP5至前列腺內(nèi)后雄性Sprague-Dawley大鼠內(nèi)放射性活度的組織分布[實(shí)施例11〗證實(shí)在前列腺內(nèi)施用后，MPP5具有有限的全身性生物利用率/分布，并且在前列腺范圍內(nèi)分布不均勻。MPP5:在性成熟的雄性獼猴內(nèi)進(jìn)行2周的前列腺內(nèi)急性毒性研究[實(shí)施例7、12、13和15]證實(shí)在前列腺內(nèi)注射(1、5或25pg/g前列腺)后缺少全身性暴露。全部血清濃度均在LLOQ(5.00ng/mL)以下，例外的是1只低劑量動(dòng)物在全部時(shí)點(diǎn)(包括給藥前)具有高于LLOQ的濃度。實(shí)施例17:MPP5在臨床試驗(yàn)中用于BPH的劑量選擇和施用方法以下描述了MPP5在臨床試驗(yàn)中用于BPH的起始劑量選擇示例性原理。還描述了施用MPP5的示例性方法?；赑SA的表達(dá)以及獼猴前列腺與人前列腺間的生理相似性，選擇本文中所述的單劑量的猴研究作為估計(jì)在人前列腺內(nèi)安全起始劑量的基礎(chǔ)。與大鼠和猴相比，狗對(duì)MPP5的效應(yīng)不敏感；因此，認(rèn)為狗不是用于估計(jì)MPP5的安全起始劑量的適宜模型。來(lái)自本文中所述大鼠研究的數(shù)據(jù)表明盡管大鼠沒(méi)有編碼PSA的基因，但是MPP5可能由大鼠腹側(cè)前列腺內(nèi)所鑒定的PSA樣S3激肽釋放酶活化(Onozawa等，2001)。BPH臨床試驗(yàn)內(nèi)MPP5的起始劑量選自0.03Mg/g前列腺至0.25Mg/g前列腺的范圍?；趩蝿┝亢镅芯?jī)?nèi)已檢驗(yàn)的最低劑量(0.35yg/g前列腺)應(yīng)用IO倍的安全系數(shù)，將有效起始劑量設(shè)置在0.03/ig/g前列腺。在接受0.35pg/g前列腺劑量的猴內(nèi)，未觀察到全身毒性，但是觀察到了局部前列腺變化。雖然在注射14日后全部3種劑量均顯示前列腺組織局部剝離，但是中等劑量和較高劑量顯示的變化最明顯而且缺乏痊愈。得出的結(jié)論是最低劑量(0.35/ig/g前列腺組織)具有無(wú)全身性后果(通過(guò)組織學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)室分析)和有限但清晰可觀察的局部前列腺效應(yīng)(前列腺剝離大約25%)的治療可用組合。認(rèn)為該劑量是猴內(nèi)的安全劑量。使用這些數(shù)據(jù)，應(yīng)用至少I(mǎi)O倍的安全系數(shù)并選擇用于BPH試驗(yàn)第一組群的起始劑量(每克人前列腺0.03/xgMPP5)。BPH試驗(yàn)內(nèi)施用MPP5的示例性方法是常見(jiàn)的經(jīng)尿道施用途徑，其中每種劑量?jī)H進(jìn)行4次注射(每個(gè)側(cè)葉進(jìn)行2次注射)。為了在注射期間進(jìn)行引導(dǎo)，例如，可以使用經(jīng)直腸超聲法。BPH試驗(yàn)中待施用的總體積是50/zL/g前列腺。為了減少注射期間的回流，例如，可以使用凝膠制劑或粘性制劑。雖然本發(fā)明己經(jīng)參考某些具體實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是本發(fā)明的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，并且不脫離如所附權(quán)利要求書(shū)內(nèi)所描述的本發(fā)明的精神和范圍。本說(shuō)明書(shū)中所參考的全部專(zhuān)利、公布文本(包括已公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng))和數(shù)據(jù)庫(kù)條目的所有內(nèi)容被明確地以引用方式并入本文，就如同上述單獨(dú)專(zhuān)利、公布文本和數(shù)據(jù)庫(kù)條目中的每一個(gè)都被明確地和單獨(dú)地以引用方式并入本文一樣。權(quán)利要求1.一種用于減小受治療者前列腺大小的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列和一個(gè)或多個(gè)能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。2.—種用于治療良性前列腺增生(BPH)的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列和一個(gè)或多個(gè)能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白與用于良性前列腺增生的一種或多種其他治療聯(lián)合使用。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述天然存在的成孔蛋白為氣單胞菌溶素原或a-毒素。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列，和一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。8.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5或7任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列功能性取代所述天然存在的成孔蛋白的天然活化序列。9.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5或7任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述前列腺特異性蛋白酶是前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)或人腺體激肽釋放酶2(hK2)。10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或7任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述前列腺特異性蛋白酶是前列腺特異性抗原。11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、6或7任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域是促黃體激素釋放激素，或前列腺特異性膜抗原的抗體。12.根據(jù)權(quán)利要求l至ll任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白還包括在所述天然存在的成孔蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白還包括親和標(biāo)簽。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白被配制成用于前列腺內(nèi)給藥的制劑。15.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白被配制成用于靜脈內(nèi)給藥的制劑。16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的修飾的成孔蛋白，其中所述天然存在的成孔蛋白為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的氣單胞菌溶素原。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白還包括在氣單胞菌溶素原的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變。19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白包括SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列。20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白包括親和標(biāo)簽。21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的修飾的成孔蛋白，其中所述修飾的成孔蛋白包括SEQIDNO:31中所列的氨基酸序列。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的修飾的成孔蛋白，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變選自在Y162位置的突變、在W324位置的突變、在R323位置的突變、在R336位置的突變以及在W127位置的突變。23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的修飾的成孔蛋白，其中至少一個(gè)所述突變是R336A。24.—種修飾的成孔蛋白在制備用于減小受治療者前列腺大小的藥劑中的用途，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列和一個(gè)或多個(gè)能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。25.—種修飾的成孔蛋白在制備用于治療良性前列腺增生(BPH)的藥劑中的用途，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列和一個(gè)或多個(gè)能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白與用于良性前列腺增生的一種或多種其他治療聯(lián)合使用。27.根據(jù)權(quán)利要求24至26任一項(xiàng)所述的用途，其中所述天然存在的成孔蛋白為氣單胞菌溶素原或a-毒素。28.根據(jù)權(quán)利要求24至27任一項(xiàng)所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。29.根據(jù)權(quán)利要求24至27任一項(xiàng)所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。30.根據(jù)權(quán)利要求24至27任一項(xiàng)所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列，和一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。31.根據(jù)權(quán)利要求24、25、26、27、28或30任一項(xiàng)所述的用途，其中所述可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列功能性取代所述天然存在的成孔蛋白的天然活化序列。32.根據(jù)權(quán)利要求24、25、26、27、28或30任一項(xiàng)所述的用途,其中所述前列腺特異性蛋白酶是前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)或人腺體激肽釋放酶2(hK2)。33.根據(jù)權(quán)利要求24、25、26、27、28或30任一項(xiàng)所述的用途，其中所述前列腺特異性蛋白酶是前列腺特異性抗原。34.根據(jù)權(quán)利要求24、25、26、27、29或30任一項(xiàng)所述的用途，其中所述前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域是促黃體激素釋放激素，或前列腺特異性膜抗原的抗體。35.根據(jù)權(quán)利要求24至34任一項(xiàng)所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白還包括在所述天然存在的成孔蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變。36.根據(jù)權(quán)利要求24至35任一項(xiàng)所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白還包括親和標(biāo)簽。37.根據(jù)權(quán)利要求24至35任一項(xiàng)所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白被配制成用于前列腺內(nèi)給藥的制劑。38.根據(jù)權(quán)利要求24至36任一項(xiàng)所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白被配制成用于靜脈內(nèi)給藥的制劑。39.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的用途，其中所述天然存在的成孔蛋白為嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素原。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白還包括在氣單胞菌溶素原的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變。42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白包括SEQIDN0:4中所列的氨基酸序列。43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白包括親和標(biāo)簽。44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的用途，其中所述修飾的成孔蛋白包括SEQIDNO:31中所列的氨基酸序列。45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變選自在Y162位置的突變、在W324位置的突變、在R323位置的突變、在R336位置的突變以及在W127位置的突變。46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的用途，其中至少一個(gè)突變是R336A。47.—種減小受治療者前列腺大小的方法，其包括對(duì)所述受治療者給藥有效量的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列，和一個(gè)或多個(gè)能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。48.—種治療受治療者的良性前列腺增生(BPH)的方法，其包括對(duì)所述受治療者給藥有效量的修飾的成孔蛋白，所述修飾的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一個(gè)或多個(gè)前列腺選擇性修飾，所述前列腺選擇性修飾選自可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列，和一個(gè)或多個(gè)能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的成孔蛋白能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白與用于良性前列腺增生的一種或多種其他治療聯(lián)合給藥。50.根據(jù)權(quán)利要求47至49任一項(xiàng)所述的方法，其中所述天然存在的成孔蛋白為氣單胞菌溶素原或a-毒素。51.根據(jù)權(quán)利要求47至50任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。52.根據(jù)權(quán)利要求47至50任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。53.根據(jù)權(quán)利要求47或50任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列，和一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。54.根據(jù)權(quán)利要求47、48、49、50、51和53任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列功能性取代所述天然存在的成孔蛋白的天然活化序列。55.根據(jù)權(quán)利要求47、48、49、50、51和53任一項(xiàng)所述的方法，其中所述前列腺特異性蛋白酶是前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)或人腺體激肽釋放酶2(hK2)。56.根據(jù)權(quán)利要求47、48、49、50、51和53任一項(xiàng)所述的方法，其中所述前列腺特異性蛋白酶是前列腺特異性抗原。57.根據(jù)權(quán)利要求47、48、49、50、52和53任一項(xiàng)所述的方法，其中所述前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域是促黃體激素釋放激素，或前列腺特異性膜抗原的抗體。58.根據(jù)權(quán)利要求47至57任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白還包括在所述天然存在的成孔蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變。59.根據(jù)權(quán)利要求47至58任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白還包括親和標(biāo)簽。60.根據(jù)權(quán)利要求47至59任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白被配制成用于前列腺內(nèi)給藥的制劑。61.根據(jù)權(quán)利要求47至59任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白被配制成用于靜脈內(nèi)給藥的制劑。62.根據(jù)權(quán)利要求47或48所述的方法，其中所述天然存在的成孔蛋白為嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素原。63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白還包括在氣單胞菌溶素原的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變。65.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白包括SEQIDN0:4中所列的氨基酸序列。66.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白包括親和標(biāo)簽。67.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述修飾的成孔蛋白包括SEQIDN0:31中所列的氨基酸序列。68.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變選自在Y162位置的突變、在W324位置的突變、在R323位置的突變、在R336位置的突變以及在W127位置的突變。69.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中至少一個(gè)突變是R336A。70.—種修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其包括在大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變，和一個(gè)或多個(gè)前列腺特異性修飾，所述前列腺特異性修飾選自能夠選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域，和可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列，其中所述修飾的氣單胞菌溶素原能夠選擇性殺傷前列腺細(xì)胞。71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述修飾的氣單胞菌溶素原蛋白是修飾的嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素原。72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域被定義為SEQIDNO:2的第84至426位氨基酸。73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述在大葉結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)突變選自在Y162位置的突變、在W324位置的突變、在R323位置的突變、在R336位置的突變以及在W127位置的突變。74.根據(jù)權(quán)利要求70至73任一項(xiàng)所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述修飾的氣單胞菌溶素原蛋白包括前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。75.根據(jù)權(quán)利要求70至73任一項(xiàng)所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述修飾的氣單胞菌溶素原蛋白包括可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。76.根據(jù)權(quán)利要求70至73任一項(xiàng)所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述修飾的氣單胞菌溶素原蛋白包括前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域和可由前列腺特異性蛋白酶切割的活化序列。77.根據(jù)權(quán)利要求70、71、72、73、74或76任一項(xiàng)所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述前列腺特異性耙向結(jié)構(gòu)域是促黃體激素釋放激素或前列腺特異性膜抗原的抗體。78.根據(jù)權(quán)利要求70、71、72、73、75或76任一項(xiàng)所述的修飾的氣單胞菌溶素原蛋白，其中所述前列腺特異性蛋白酶是前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原或人腺體激肽釋放酶2。全文摘要本發(fā)明提供了一種使用修飾的成孔蛋白(MPP)治療BPH(良性前列腺增生)的方法。這些MPP衍生自天然存在的細(xì)胞毒蛋白(nPP)，所述天然存在的細(xì)胞毒蛋白通過(guò)在細(xì)胞膜中形成孔或通道而殺傷細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。MPP是通過(guò)nPP的修飾而產(chǎn)生的，其使得MPP能夠在正常前列腺細(xì)胞上被選擇性活化。所述修飾可包括將前列腺特異性蛋白酶切割位點(diǎn)添加至活化序列，和/或添加使得選擇性靶向前列腺細(xì)胞的前列腺特異性靶向結(jié)構(gòu)域。這些MPP能夠在體內(nèi)選擇性地靶向和殺傷正常的前列腺細(xì)胞。MPP可以單獨(dú)使用或與其他療法結(jié)合用于治療BPH。文檔編號(hào)C07K14/195GK101238145SQ200680028473公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2006年6月14日優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日發(fā)明者詹姆士·托馬斯·巴克雷申請(qǐng)人:普羅陶克斯有限公司