專(zhuān)利名稱(chēng)：菊花水孔蛋白編碼基因CmAQP 及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及菊花水孔蛋白編碼基因CmAQP及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
菊花是世界四大切花之一，切花菊約占世界切花總量的30%，在花卉產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要的地位。隨著菊花產(chǎn)業(yè)化的快速發(fā)展，其設(shè)施栽培面積不斷增加，土壤鹽潰化逐漸成為菊花周年供應(yīng)的主要限制因素。然而目前的土壤改良措施存在著許多不足，同時(shí)巨大的水資源消耗也成為當(dāng)前菊花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。菊花抗逆育種一直是國(guó)內(nèi)外園藝工作者致力的重要課題之一。 水孔蛋白作為一種功能性跨膜輸水蛋白，對(duì)植物體形成水選擇性運(yùn)輸通道并實(shí)現(xiàn)水分的跨膜運(yùn)輸起到重要的作用。當(dāng)植物處于鹽、干旱、低溫等逆境脅迫狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)的水分平衡被打破，水孔蛋白在水分運(yùn)輸和胞內(nèi)滲透壓的調(diào)控等方面表現(xiàn)出重要作用。研究表明，植物種子的萌發(fā)過(guò)程中，伴隨細(xì)胞質(zhì)滲透勢(shì)的改變，需要迅速調(diào)節(jié)滲透勢(shì)從而達(dá)到滲透平衡以提供最佳的發(fā)育環(huán)境，AQPs在調(diào)節(jié)滲透平衡中起著非常重要的作用，如轉(zhuǎn)人參PgTIPl基因的擬南芥的發(fā)育速度遠(yuǎn)高于野生擬南芥發(fā)育速度(Lin et al.，2007)。鹽脅迫可降低根的水分輸導(dǎo)能力，Zhu等研究表明，200mmol/L NaCl鹽脅迫處理24h后可抑制玉米水孔蛋白基因ZmPIPs和ZmTIPs的表達(dá)，且葉片含水量快速、持續(xù)下降(Zhu et al.，2005)。迄今，鹽脅迫對(duì)AQP的表達(dá)調(diào)控研究主要集中在PIPs和TIPs等亞類(lèi)，并推測(cè)PIPs與TIPs可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)協(xié)同微調(diào)水分的跨膜運(yùn)輸，進(jìn)而維持鹽脅迫和高滲條件下的水分平衡(Shao et al.，2008)。在作物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達(dá)載體至關(guān)重要。將抗逆基因基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得具有耐逆特性的新種質(zhì)。對(duì)于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用具有重要意義。[I]Zhu C F，Schraut D, Hartung W. (2005). Differential responses ofmaizeMIP genes to salt stress and ABA. J Exp Bot. 56(421):2971-2981.[2] Lin W, Peng Y，Li G，et al. (2007). Isolation and functionalcharacterization of PgTIPl，ahormone—autotrophic cells—specific tonoplastaquaporin in ginseng. J ExP Bot.58:947-956.[3] Shao H B，Chu L Y，Shao M A et al. (2008). Advances in functionalregulation mechanisms of plant aquaporins:Their diversity, gene expression, Iocalization,structure and roles in plant soi1-water relations(Review). Mol MembrBiol. 25(3) :179-191.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決提高植物耐逆性的問(wèn)題，提供一個(gè)新的菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP。本發(fā)明還提供該抗逆基因CmAQP的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)，可用于植物品種改良。本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題可通過(guò)如下技術(shù)方案解決菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP，該基因的序列為SEQ ID NO. I。菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP的植物表達(dá)載體，由本發(fā)明所述的菊花‘神馬’抗逆 基因CmAQP與中間植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301構(gòu)成。菊花‘神馬’抗逆基因植物表達(dá)載體，其構(gòu)建方法如下I)菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP的克隆以‘神馬’幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CmAQP基因，上游弓丨物CmAQP-F: 5' -ATGACTAAAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 2)下游引物CmAQP-Rj' -CAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 3)以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測(cè)定；2)植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CmAQP的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物以菊花‘神馬’ cDNA為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CmAQP基因的上游和下游分別引入BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)，上游弓 I 物 CmAQP-TF: 5' -CGGGATCCATGACTMAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 4)下游引物CmAQP-TR:5'-GCTCTAGACAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 5)PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，BamH I和Xba I雙酶切的CmAQP片段與BamH I和Xba I雙酶切的pCAMBIA 1301連接轉(zhuǎn)化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CmAQP構(gòu)建成功。本發(fā)明所述的菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP在創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP植物表達(dá)載體在創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用.CmAQP的植物表達(dá)載體用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發(fā)率，方法如下農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化擬南芥花序浸染及種子篩選PCR鑒定及耐鹽性評(píng)價(jià)本發(fā)明的有益效果I.本發(fā)明提供的菊花‘神馬’CmAQP是一個(gè)新的抗逆基因，該基因可提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發(fā)率。2.本發(fā)明構(gòu)建的菊花‘神馬’CmAQP基因植物表達(dá)載體為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)，提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發(fā)率，可進(jìn)行植物品種改良。


圖I為CmAQP瓊脂糖凝膠電泳分析M DNA MarkerI :CmAQP ；2 :pMD19_T Simple-CmAQP 質(zhì)粒 BamH I 和 Xba I 雙酶切；3 pCAMBIA 1301-CmAQP 表達(dá)載體 BamH I 和 Xba I 雙酶切檢測(cè)2植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CmAQP構(gòu)建方法示意3野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定圖4野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥種子鹽脅迫下的萌發(fā)率評(píng)價(jià)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I. CmAQP的克隆選用菊花‘神馬’作為材料，取0.05g幼嫩葉片，參照Trizol RNA提取試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)方法，提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)取I y g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用RNase消化cDNA產(chǎn)物,參照菊花CmAQP序列信息,經(jīng)Primer 5軟件分析設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CmAQP ；上游弓丨物CmAQP-F: 5' -ATGACTAAAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 2)下游引物CmAQP-Rj' -CAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 3)以提取的葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，50 ii L 反應(yīng)體系10 X RCR Buffer 5. 0 u L, dNTP mix 4. 0 u L (2. 5mmol L-1)，CmAQP-F、CmAQP-R 弓丨物各 LOyL (20 u mo I L-1)，Taq DNAPolymerase 0. 2 u L, cDNA模板I y L，ddH2037. 8 ii L ;反應(yīng)程序95 °C預(yù)變性4min，然后94 °C解鏈30sec，55 °C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接到pMD19_T Simple載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測(cè)定，CmAQP序列如SEQ ID NO. I所示。實(shí)施例2.植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301_CmAQP的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在目的基因CmAQP的上游和下游分別引入酶切位點(diǎn)BamHI和Xba 1沖0 產(chǎn)物連接到？1 191 Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，BamHI和Xba I雙酶切的CmAQP片段與BamH I和Xba I雙酶切的pCAMBIA 1301連接轉(zhuǎn)化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證(圖I)。上游弓丨物CmAQP-TF: 5' -CGGGATCCATGACTMAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 4)下游引物CmAQP-TR:5'-GCTCTAGACAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 5)①以菊花‘神馬’葉片cDNA作為模板，用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，50 y L 反應(yīng)體系10XHS RCR Buffer 5. 0 u L,CmAQP-TF、CmAQP-TR 引物各 I. Ou L(20umol L-1)，dNTP mix 4. Ou L(2. 5mmol L-1)，PrimeSTAR HS DNA PolymeraseO. 4u L, cDNA 模板 I y L, ddH20 37. 6 u L ;反應(yīng)程序95°C預(yù)變性4min，然后94°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，USA)回收，連接到pMD19_T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T Simple-CmAQP ；②取載體pCAMBIA 1301 (Invitrogen, USA)和 pMD 19-T Simple-CmAQP 用 BamH I和 XbaI 雙酶切，雙酶切體系(50 ii L) :10 X H Buffer 5u L,pMD19-T Simple-CmAQP 15 u L,BamH I 2 u L, Xba I 2 u L, ddH20 26 u L ;37°C反應(yīng)3h ;雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒pCAMBIA 1301大片段和pMD19_T Simple-CmAQP小片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接兩個(gè)回收的產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系(10 y L)IOXT4IigaseBuffer IuL, pCAMBIA 1301 大片段 2 y L，pMD19_T Simple-CmAQP 小片段6uL, T4DNA連接酶IuL ;16°C過(guò)夜連接反應(yīng)，取5 ii L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞。37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pCAMBIA 1301-CmAQP,進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CmAQP的構(gòu)建成功(圖2)。實(shí)施例3.植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CmAQP遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及其耐鹽性鑒定①農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化從YEB (50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50ug/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm，28°C培養(yǎng)至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，離心收集菌 體，懸浮于2mL預(yù)冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200uL/管分裝，待用。取IOuL pCAMBIA 1301-CmAQP載體質(zhì)粒，加入200uL農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800uLYEB液體培養(yǎng)基，28°C 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h，菌液涂板于YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測(cè)，選取陽(yáng)性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。②擬南芥花序浸染及種子篩選將陽(yáng)性單克隆接到50mL的YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)，5000rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，調(diào)pH為5. 8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中I分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng)12小時(shí)，打開(kāi)保鮮膜，待種子成熟時(shí)米收。種子消毒與播種將種子放入2mL的離心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. 1%的TritonX-IOO搖晃15分鐘，然后在超凈臺(tái)中用95%的酒精洗兩次，而后直接把種子連同酒精倒在滅菌過(guò)的濾紙上，以吹干種子(放置30分鐘)，輕輕敲擊濾紙將干種子均勻撒播到篩選培養(yǎng)基上(l/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨芐青霉素)篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗I周以保濕。③PCR鑒定及耐鹽性評(píng)價(jià)待抗性苗7 8片葉，提取擬南芥葉片DNA，進(jìn)行PCR (引物CmAQP-F和CmAQP-R)鑒定(圖3)。經(jīng)PCR鑒定的T1代轉(zhuǎn)基因苗繼續(xù)生長(zhǎng)，采收T2代種子。對(duì)野生型和T2代抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進(jìn)行鹽脅迫處理(200mM NaCl),比較抗鹽性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率(47. 92%)高于野生型擬南芥(26. 53%)(圖4)。綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有抗逆基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CAQP，其中CmAQP為首次報(bào)道。所構(gòu)建的載體可導(dǎo)入植物中，提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發(fā)率。
權(quán)利要求
1.菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP，其特征在于該基因的序列為SEQID NO. I。
2.菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP植物表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求I所述的菊花 ‘神馬’抗逆基因CmAQP與植物表達(dá)載體構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP植物表達(dá)載體，其特征在于所述 的植物表達(dá)載體為BamH I和Xba I雙酶切CmAQP后插入到表達(dá)載體pCAMBIA 1301質(zhì)粒 進(jìn)行重組反應(yīng)得到。
4.權(quán)利要求3所述的菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在 于包括如下步驟設(shè)計(jì)引物以菊花‘神馬’ cDNA為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CmAQP基因的上游 和下游分別引入BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)，上游引物 CmAQP-TF: SEQ ID NO. 2下游引物 CmAQP-TR: SEQ ID NO. 3PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，BamH I 和Xba I雙酶切的CmAQP片段與BamH I和Xba I雙酶切的pCAMBIA 1301連接轉(zhuǎn)化，提取 陽(yáng)性質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CmAQP構(gòu)建成功。
5.權(quán)利要求I所述的菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP在創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)和/或植物品種 改良中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的菊花‘神馬’抗逆基因CmAQP植物表達(dá)載體在創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)和 /或植物品種改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了菊花水孔蛋白編碼基因CmAQP及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法。本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA 1301-CmAQP是由CmAQP基因插入到克隆載體pMD19-T simple vector，經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切后連接到載體pCAMBIA 1301的BamH I和Xba I位點(diǎn)而得到的重組質(zhì)粒。將該植物表達(dá)載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，CmAQP基因在CaMV35S啟動(dòng)子的啟動(dòng)下超量表達(dá)，大量合成CmAQP蛋白，從而提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發(fā)率。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102660557SQ20121017152
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者劉兆磊, 劉浦生, 房偉民, 李佩玲, 滕年軍, 王紅賓, 管志勇, 蔣甲福, 陳發(fā)棣, 陳素梅 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)