專利名稱：一種從生姜中制備6－姜酚和8－姜酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，尤其涉及一種從生姜中提取、分離和純化6-姜酚和8-姜酚的制備方法，屬于天然活性產(chǎn)物制備方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生姜是日常生活中必不可少的一種常用食物，也是中醫(yī)藥學(xué)中一味重要中藥。藥用生姜是姜的新鮮根莖，亦即鮮姜，味辛，性微溫，歸肺、脾、胃經(jīng)。解表散寒，溫中止嘔，化痰止咳。主治風(fēng)寒感冒、胃寒嘔吐、寒痰咳嗽。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，生姜具有提高消化酶活性、保護(hù)胃粘膜細(xì)胞、抑制血小板凝聚、降血脂、抗腫瘤、抗運(yùn)動(dòng)病、消除自由基、抗氧化、防腐抑菌等多方面生物活性。生姜的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、姜辣素和二苯基庚烷三大類。揮發(fā)油中含有近百種成分，主要為萜類物質(zhì)。姜辣素為多種物質(zhì)構(gòu)成的混合物，結(jié)構(gòu)中多含有3-甲氧基-4-羥基苯基官能團(tuán)，根據(jù)該官能團(tuán)連接的脂肪鏈不同分為姜醇類、姜烯酚類、姜酮類、姜二酮類、姜二醇類等不同的類型。二苯基庚烷類化合物是一類具有1，7-二取代苯基并以庚烷骨架為母體結(jié)構(gòu)的化合物的統(tǒng)稱，可分為線性二苯基庚烷類和環(huán)狀二苯基庚烷類化合物。
姜酚類化合物是生姜的辛辣成分，也是姜的重要活性部位。其結(jié)構(gòu)中包含3-甲氧基-4-羥基苯基官能團(tuán)、側(cè)鏈β-羥基酮基官能團(tuán)及飽和烴鏈。側(cè)鏈n＝4時(shí)即為6-姜酚，n＝6時(shí)為8-姜酚。6-姜酚亦稱6-姜酮醇、姜酚、6-姜醇，在生姜中含量較高，其結(jié)構(gòu)如下
國內(nèi)外對(duì)姜酚及其同系物的分子結(jié)構(gòu)、藥理作用作了大量研究，證實(shí)姜酚具有抗暈、心血管、降壓、降血脂、抗血小板、中樞神經(jīng)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、防腐殺蟲、驅(qū)蟲、護(hù)膚美容等廣泛的作用。構(gòu)效關(guān)系研究表明其生物活性與烴鏈的長度、烴基的親脂性、側(cè)鏈羥基、羰基的取代形式、芳香環(huán)上烴基、甲氧基的取代形式密切相關(guān)，其中以6-姜酚和8-姜酚的效果最為顯著。因此，姜酚類化合物可以開發(fā)用于藥品、保健食品、化妝品和綠色農(nóng)藥等。
目前，國內(nèi)外對(duì)姜酚類化合物的活性研究較多，對(duì)其分離純化的研究較少。因此，開展姜酚類化合物的提取、富集和分離純化研究對(duì)該類化合物的進(jìn)一步開發(fā)具有重要的價(jià)值和實(shí)用意義。文獻(xiàn)查新發(fā)現(xiàn)，中國專利CN1651383A公布了一種天然結(jié)晶姜酚的制備方法。該方法采用含水有機(jī)溶劑(乙醇、甲醇、丙酮等)提取鮮姜或干姜的姜酚成分，通過預(yù)處理獲得高姜酚含量的粗提取物，再經(jīng)柱層析、重結(jié)晶等步驟得到高純度姜酚結(jié)晶。但該法中提取物須經(jīng)溶劑萃取預(yù)處理，重結(jié)晶方法存在收率不高的問題。中國專利CN1616391A公布了一種從生姜中分離6-姜酚的方法。采用丙酮浸泡得到姜油樹脂，硅膠柱分離制備粗姜酚，再經(jīng)高效液相分離、大孔樹脂分離得到較純6-姜酚。該法工藝路線較長，其中高效液相分離容易受儀器條件限制，制備量較少，不適合工業(yè)化生產(chǎn)；大孔樹脂純化方法存在吸附導(dǎo)致的收率下降的缺點(diǎn)。以上兩種方法均為6-姜酚單一成分的分離制備，現(xiàn)有文獻(xiàn)未涉及同時(shí)制備6-姜酚和8-姜酚的工藝方法。
以上可知，現(xiàn)有制備工藝步驟相對(duì)較長，操作繁瑣，產(chǎn)品得率不高，可作為實(shí)驗(yàn)室小量產(chǎn)品的制備，較難應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)，且均為6-姜酚單一產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，產(chǎn)品收率高的從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法。
為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，采用有機(jī)溶劑提取生姜成分、提取物經(jīng)硅膠柱層析得粗品，粗品經(jīng)Sephadex LH20凝膠柱層析純化后得到高純度的6-姜酚和8-姜酚兩個(gè)活性天然產(chǎn)物，其工藝步驟為第一步.原料處理將新鮮生姜洗凈切片，低溫烘干后粉碎，過100目篩；第二步.姜酚的提取姜粉置于圓底燒瓶或回流提取裝置，用有機(jī)溶劑加熱回流或浸泡提取，按姜粉∶有機(jī)溶劑1∶2～3，V/V的比例，加熱回流的時(shí)間為每次1-3小時(shí)；浸泡期間采用有機(jī)溶劑循環(huán)或攪拌，單次浸泡時(shí)間不少于24小時(shí)，每批姜粉提取2-4次，合并提取液；第三步.回收溶劑在0～40℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收步驟(2)收得到的提取液得到姜的提取物，壓力為0.07-0.1Mpa；第四步.硅膠柱層析將步驟(3)所得提取物，以1∶2～3比例加入乙酸乙酯溶解，以層析用硅膠拌樣，提取物與拌樣硅膠的重量比為1∶3～5；待乙酸乙酯揮發(fā)干凈后，干法上裝柱硅膠，提取物與裝柱硅膠的重量比為1∶20～30，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，柱層析洗脫劑石油醚沸點(diǎn)為60～90℃，石油醚與乙酸乙酯的體積比為1∶0→10∶1。薄層層析(TLC)檢測，收集含8-姜酚和6-姜酚的洗脫液部分，按步驟(3)方法回收溶劑后分別得到8-姜醇和6-姜醇粗品；第五步.Sephadex LH20凝膠柱純化步驟(4)所得8-姜醇和6-姜醇粗品，用粗品重量與流動(dòng)相(氯仿-甲醇1∶1，V/V)的體積比為1∶2～3溶解、過濾，分別濕法上Sephadex LH20凝膠柱，以甲醇-氯仿1∶1，V/V為流動(dòng)相洗脫，流速為自然流速，TLC檢測洗脫進(jìn)程，收集較純組分，回收溶劑，得8-姜醇和6-姜醇純品，高效液相法(HPLC)測定含量。
所述提取用有機(jī)溶劑為乙酸乙酯或丙酮；所述硅膠為100～200目或200～300目柱層析用硅膠；所述的步驟(4)和步驟(5)中，TLC的條件為硅膠GF254板，展開劑為環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶甲醇(8∶4∶0.5，V/V/V)，以8-姜醇和6-姜醇為對(duì)照，直立上行展開，紫外254nm或碘蒸汽顯色；所述的步驟(5)中，柱層析流動(dòng)相為甲醇與氯仿混和溶劑，氯仿與甲醇的體積比為1∶0.8→1∶1.2，Sephadex LH20預(yù)先用流動(dòng)相浸泡24小時(shí)，濕法裝柱，流動(dòng)相平衡后備用，裝量的徑高比為1∶30→1∶40；所述的步驟(5)中溶解粗品的溶劑為甲醇-氯仿流動(dòng)相；所述的步驟(5)中的HPLC條件為C18250×4.6mm色譜柱，甲醇∶水(65∶35，V/V)為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1，檢測波長280nm。
按本發(fā)明所述制備方法，8-姜酚的得率為0.096％(以鮮姜計(jì)算)，純度≥99.0，6-姜酚的得率為0.326％(以鮮姜計(jì)算)，純度≥99.5。所得的8-姜酚和6-姜酚可用于藥品、食品和化妝品等。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，對(duì)儀器和設(shè)備要求低，提取物直接進(jìn)行硅膠柱分離，避免溶劑萃取、高效液相分離等手段。凝膠柱層析純化具備上樣量大，無吸附，可多次快速重復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)，不純產(chǎn)物可作為粗品重復(fù)進(jìn)入下一循環(huán)。經(jīng)本方法可分別得到高純度的8-姜酚和6-姜酚，產(chǎn)品收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1將鮮姜5kg洗凈，切成薄片，60℃以下烘干，置粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩。將上述姜酚置于2L圓底燒瓶，按姜粉∶乙酸乙酯(1∶2～3，V/V)的比例，加入乙酸乙酯，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，40℃以下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回提取液，壓力為0.08-0.1Mpa，得提取物浸膏250g；以上浸膏用400mL乙酸乙酯溶解，加入750g 200～300目柱層析用硅膠拌樣，水浴加熱使乙酸乙酯揮干后，裝入直徑為φ10cm預(yù)先加入5.0kg空白硅膠(200～300目)的柱中，先用10 BV石油醚(60～90℃)洗脫，再用8 BV石油醚∶乙酸乙酯(20∶1，V/V)洗脫，最后用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1，V/V)洗脫，TLC檢測洗脫進(jìn)程(硅膠GF254板，展開劑環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶甲醇8∶4∶0.5，V/V/V，直立上行展開，紫外254nm或碘蒸汽顯色)，分別合并收集較純的8-姜酚和6-姜酚組分，40℃以下減壓回收溶劑，得到8-姜酚粗品7.2g，6-姜酚粗品20.4g。
分別取8-姜酚和6-姜酚粗品7.2g，用20mL流動(dòng)相(甲醇-氯仿1∶1，V/V)溶解，過濾，濕法上預(yù)先用流動(dòng)相平衡好的φ5cm×150cm Sephadex LH20凝膠柱(裝量高120cm)，以自然流速洗脫，TLC檢測洗脫進(jìn)程，收集較純的8-姜酚或6-姜酚組分，40℃以下減壓回收溶劑，分別得到終產(chǎn)物8-姜酚4.8g，6-姜酚粗品經(jīng)重復(fù)上樣、層析，得純品16.3g。經(jīng)HPLC檢測，8-姜酚的含量為99.14％，得率為0.096％(以鮮姜計(jì)算)，1.92％(以提取物計(jì)算)。6-姜酚的含量為99.72％，得率為0.326％(以鮮姜計(jì)算)，6.53％(以提取物計(jì)算)。
Sephadex LH20凝膠柱以流動(dòng)相洗脫至無洗脫物后再重復(fù)使用。
本實(shí)施例中，提取溶劑可用丙酮代替乙酸乙酯。
實(shí)施例2將鮮姜2kg洗凈，切成薄片，60℃以下烘干。置粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩，裝入1000mL三角燒瓶。按姜粉∶丙酮(1∶2-3，V/V)的比例，加入丙酮，密閉浸泡24小時(shí)，浸泡期間每隔4小時(shí)振搖1次；重復(fù)浸泡3次，合并提取液，40℃以下減壓回收溶劑，得提取物浸膏80g。
以上浸膏用200mL乙酸乙酯溶解，加入250g 200～300目柱層析用硅膠拌樣，水浴加熱使乙酸乙酯揮干后，裝入直徑為φ6.0cm預(yù)先加入2kg空白硅膠(200～300目)的柱中，先用10 BV石油醚(60～90℃)洗脫，再用8 BV石油醚∶乙酸乙酯(20∶1，V/V)洗脫，最后用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1，V/V)洗脫，TLC檢測洗脫進(jìn)程。分別合并收集較純的8-姜酚和6-姜酚組分，40℃以下減壓回收溶劑，得到8-姜酚粗品2.5g，6-姜酚粗品6.8g。
分別取8-姜酚和6-姜酚粗品2.5g，用少量5mL流動(dòng)相(甲醇-氯仿1∶1，V/V)溶解。濕法上預(yù)先用流動(dòng)相平衡好的φ3.0cm×120cm Sephadex LH20凝膠柱(裝量高100cm)，以自然流速洗脫，TLC檢測洗脫進(jìn)程，收集較純的8-姜酚或6-姜酚組分，40℃以下減壓回收溶劑，分別得到終產(chǎn)物8-姜酚1.48g，6-姜酚5.4g。經(jīng)HPLC檢測，8-姜酚的含量為99.26％，得率為0.074％(以鮮姜計(jì)算)，1.85％(以提取物計(jì)算)。6-姜酚的含量為99.64％，得率為0.27％(以鮮姜計(jì)算)，6.75％(以提取物計(jì)算)。
Sephadex LH20凝膠柱以流動(dòng)相洗脫至無洗脫物后再重復(fù)使用。
本實(shí)施例中，提取溶劑可用乙酸乙酯代替丙酮。
產(chǎn)物I(6-姜酚)無色油狀液體，有辛辣氣味。EI-MSm/z(％)294(M+)，276，194，150，137(100)，122。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ7.10(1H，d，J＝8.8Hz，H-5’)，6.96(1H，s，H-2’)，6.70(1H，d，J＝8.8Hz，H-6’)，3.90(1H，m，H-6)，3.85(3H，s，H-OCH3)，2.94(2H，dd，J＝7.2，4.4Hz，H-9)，2.85(2H，dd，J＝7.2，4.4Hz，H-10)，2.56(2H，m，H-7)，1.78-1.52(8H，m)，0.71(3H，t，J＝7.2Hz，H-1)。13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ13.80(C-1)，22.37(C-2)，29.02(C-3)，24.93(C-4)，36.36(C-5)，67.58(C-6)，49.24(C-7)，211.24(C-8)，45.16(C-9)，31.52(C-10)，132.43(C-1’)，111.13(C-2’)，146.55(C-3’)，143.88(C-4’)，114.53(C-5’)，120.50(C-6’)，55.64(C-OCH3)。
產(chǎn)物II(8-姜酚)淺黃色固體，有辛辣氣味，mp 32～35℃。EI-MS m/z(％)322(M+)，308，276，194，150，137(100)，122，91。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ7.10(1H，d，J＝8.8Hz，H-5’)，6.75(1H，s，H-2’)，6.69(1H，d，J＝8.8Hz，H-6’)，4.29(1H，m，H-8)，3.89(3H，s，H-OCH3)，2.76(2H，dd，J＝7.2，4.4Hz，H-11)，2.75(2H，dd，J＝7.2，4.4Hz，H-12)，2.55(2H，m，H-9)，1.59-1.40(12H，m)，0.78(3H，t，J＝7.2Hz，H-1)。13C-NMR(CDCl3，125MHz)δ13.95(C-1)，22.47(C-2)，28.97(C-3)，25.80(C-4)，29.05(C-5)，29.41(C-6)，36.33(C-7)，67.558(C-8)，49.18(C-9)，211.31(C-10)，45.23(C-11)，31.71(C-12)，132.42(C-1’)，110.94(C-2’)，146.40(C-3’)，143.848(C-4’)，114.40(C-5’)，120.510(C-6’)，55.64(C-OCH3)。
權(quán)利要求
1.一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，采用有機(jī)溶劑提取生姜成分、提取物經(jīng)硅膠柱層析得粗品，粗品經(jīng)Sephadex LH20凝膠柱層析純化后得到高純度的6-姜酚和8-姜酚兩個(gè)活性天然產(chǎn)物，其工藝步驟為第一步.原料處理將新鮮生姜洗凈切片，低溫烘干后粉碎，過100目篩；第二步.姜酚的提取姜粉置于圓底燒瓶或回流提取裝置，用有機(jī)溶劑加熱回流或浸泡提取，按姜粉有機(jī)溶劑1∶2～3，V/V的比例，加熱回流的時(shí)間為每次1-3小時(shí)；浸泡期間采用有機(jī)溶劑循環(huán)或攪拌，單次浸泡時(shí)間不少于24小時(shí)，每批姜粉提取2-4次，合并提取液；第三步.回收溶劑在0～40℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收步驟(2)收得到的提取液得到姜的提取物，壓力為0.07-0.1Mpa；第四步.硅膠柱層析將步驟(3)所得提取物，以重量體積比1∶2～3加入乙酸乙酯溶解，以層析用硅膠拌樣，提取物與拌樣硅膠的重量比為1∶3～5；待乙酸乙酯揮發(fā)干凈后，干法上裝柱硅膠，提取物與裝柱硅膠的重量比為1∶20～30，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，柱層析洗脫劑石油醚沸點(diǎn)為60～90℃，石油醚與乙酸乙酯的體積比為1∶0→10∶1，薄層層析(TLC)檢測，收集含8-姜酚和6-姜酚的洗脫液部分，按步驟(3)方法回收溶劑后分別得到8-姜醇和6-姜醇粗品；第五步.Sephadex LH20凝膠柱純化步驟(4)所得8-姜醇和6-姜醇粗品，用粗品重量與流動(dòng)相(氯仿-甲醇1∶1，V/V)的重量體積比為1∶2～3溶解，過濾，分別濕法上Sephadex LH20凝膠柱，以甲醇-氯仿1∶1，V/V為流動(dòng)相洗脫，流速為自然流速，TLC檢測洗脫進(jìn)程，收集較純組分，回收溶劑，得8-姜醇和6-姜醇純品，高效液相法(HPLC)測定含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，所述提取用有機(jī)溶劑為乙酸乙酯或丙酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，所述硅膠為100～200目或200～300目柱層析用硅膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，步驟(4)和步驟(5)中，TLC的條件為硅膠GF254板，展開劑為環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶甲醇(8∶4∶0.5，V/V/V)，以8-姜醇和6-姜醇為對(duì)照，直立上行展開，紫外254nm或碘蒸汽顯色。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，所述的步驟(5)中，柱層析流動(dòng)相為甲醇與氯仿混和溶劑，氯仿與甲醇的體積比為1∶0.8→1∶1.2，溶解粗品的溶劑為甲醇-氯仿流動(dòng)相。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，所述的步驟(5)中，Sephadex LH20預(yù)先用流動(dòng)相浸泡24小時(shí)，濕法裝柱，流動(dòng)相平衡后備用，裝量的徑高比為1∶30→1∶40。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從生姜中制備6-姜酚和8-姜酚的方法，其特征在于，所述的步驟(5)中的HPLC條件為C18250×4.6mm色譜柱，甲醇∶水(65∶35，V/V)為流動(dòng)相，流速1.0mL·min-1，檢測波長280nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從生姜中制備6－姜酚和8－姜酚的方法，其特征在于，鮮姜切片，低溫烘干，粉碎，過100篩，姜粉以乙酸乙酯或丙酮加熱回流提取，或采用浸泡法提取，分別提取三次，合并提取液，減壓回收溶劑，得提取物浸膏，而后用乙酸乙酯溶解，柱層析硅膠拌樣，干法上硅膠柱，以石油醚乙酸乙酯混和溶劑梯度洗脫，TLC檢測洗脫進(jìn)程，減壓回收溶劑，得到8－姜酚和6－姜酚的粗品。以上粗品分別上Sephadex LH20凝膠柱，以氯仿－甲醇混和溶劑為流動(dòng)相洗脫，TLC檢測洗脫進(jìn)程，分別收集含有較純8－姜酚和6－姜酚的洗脫液，減壓回收溶劑，分別得到8－姜酚和6－姜酚的純品，HPLC法檢測含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，產(chǎn)品收率高，能同時(shí)提取兩種產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C07C45/78GK101085727SQ20071004344
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月5日
發(fā)明者宣偉東, 卞俊, 陳海飛, 王朝武, 袁兵, 鮑蕾蕾, 成熙, 周靜靜 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四一一醫(yī)院