專利名稱：含色氨酰-賴(精)氨酰片段肽及其抗癌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的液、固相肽合成中各氨基酸的保護形式為Boc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Phe-OH、Boc-(D)Trp-OH、Boc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Boc-Val-OH、Boc-Tyr-OH、Fmoc-Tyr-OH、Boc-Ser-OH、Boc-Arg(HCl)-OH、Boc-βAla-OH。
縮合試劑為DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)與HOBt(N-羥基苯并三唑)的等mole混合物或HBTU(O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基六氟膦鎓鹽)與HOBt及NMM(N-甲基嗎啉)的等mole混合物。
其它試劑與溶劑的縮寫形式為H2NMe(甲胺)、TEA(三乙胺)、TFA(三氟乙酸)、TESi(三乙基硅)、DMF(二甲基甲酰胺)、Py(吡啶)、DCM(二氯甲烷)、THF(四氫呋喃)、HOAc(乙酸)、EtOH(乙醇)、EtOAc(乙酸乙酯)、Et2O(乙醚)。
脫除Boc試劑3.0N HCl/HOAc或飽和HCl/EtOAc。脫除Fmoc試劑為20％哌啶/DMF。脫除Pac酯(苯羰亞甲基)的試劑為Zn/HOAc。切除固相樹脂的試劑為H2NMe/H2O-THF或H2NEt/H2O-THF。
肽鏈的組裝分為液相逐步、固相逐步、液相片段、固相片段及液-固片段等五種方式。
全部產(chǎn)物均經(jīng)溶劑重結(jié)晶或C-18濾層法純化，并由ESI-MS分析證明最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，所述藥物的給藥方法有例如口服、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、透皮、肌內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、眼內(nèi)、顱內(nèi)、吸入、直腸、陰道給藥等。可以以霜劑、片劑、膠囊、丸劑、可分散粉劑、粒劑、栓劑、糖漿劑、酏劑、錠劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液或乳液、等形式給藥。
可將活性組分與無毒可藥用載體混合，這樣的載體包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯膠、明膠、甘露醇、淀粉粘、三硅酸鎂、滑石粉、玉米淀粉、角蛋白、膠態(tài)二氧化硅、土豆淀粉、尿素、葡聚糖等。
對于非胃腸道給藥液體制劑，合適的載體包括非水溶液、懸浮液、或乳液。對于非胃腸道給藥，實施本發(fā)明所用化合物的溶液還可包含非水溶液、懸浮液、乳液等。非水溶劑或載體的實例有丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射有機酯例如油酸乙酯等。這樣的劑型還可以含有輔料例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？蓪⑺鼈儨缇?，例如通過經(jīng)由細(xì)菌保留濾器過濾、通過向組合物中加入滅菌劑、通過將組合物放射處理、或通過將組合物加熱宋滅菌。還可以在臨用前將它們制成無菌注射介質(zhì)。
可以適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射。所用的無菌介質(zhì)都易于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制得?？蓪⑺鼈儨缇缤ㄟ^經(jīng)由細(xì)菌保留濾器過濾、通過向組合物中加入滅菌劑、通過將組合物放射處理、或通過將組合物加熱宋滅菌。還可以在臨用前將它們制成無菌可注射介質(zhì)。
本發(fā)明不排除胃腸道給藥途徑。為了口服給藥，可使用含有各種賦形劑例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣、磷酸鈉等以及各種制粒劑和崩解劑例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等和粘合劑例如西黃耆膠、玉米淀粉、明膠、阿拉伯膠等的片劑、膠囊、糖錠劑、油懸浮液、可分散粉劑或粒劑、乳液、硬或軟膠囊、或糖漿劑、酏劑和錠劑。還可以加入潤滑劑例如三乙胺硬脂酸鎂、三乙胺硬脂酸、滑石等。口服施用的制劑可依據(jù)本領(lǐng)域已知的制備藥物制劑的任何方法制得，并且這樣的制劑可含有一種或多種選自下述的輔助劑以提供適口的藥物制劑甜味劑例如蔗糖、乳糖、糖精等，矯味劑例如薄荷、冬青油等，著色劑和防腐劑?？诜┯玫闹苿┻€可以含有合適的載體，包括乳液、溶液、懸浮液、糖漿等，并任選含有添加劑例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料等。片劑可以是未包衣的，或者可通過已知技術(shù)將其包衣以延遲其在胃腸道中的崩解和吸收，并由此提供在較長時間內(nèi)的持續(xù)作用。
對于口服液體制劑，合適的載體包括溶液、懸浮液、糖漿等，并任選含有添加劑例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料等。
優(yōu)選的給藥劑量隨臨床適應(yīng)癥的不同而不同。根據(jù)所治療患者的病癥，可能必須對劑量作出某些改變，并且在任何情況下，都由醫(yī)師決定個體患者的合適劑量。每單位劑量中化合物的有效量取決于體重、生理狀況和所選的給藥方案等。單位劑量的化合物是指不包括載體重量在內(nèi)(當(dāng)使用載體時)的化合物的重量。
用于實施本發(fā)明的化合物的給藥途徑取決于疾病和需要治療的部位。因為本發(fā)明化合物的藥動學(xué)和藥效學(xué)特征會有某種程度的不同，因此在組織中獲得治療濃度的最優(yōu)選方法是逐漸增加劑量并監(jiān)測臨床效果。對于這樣的逐漸增加治療劑量，初始劑量將取決于給藥途徑。
對于任何特定患者，具體治療有效劑量水平將取決于多種因素，包括所治療的疾病、疾病嚴(yán)重程度、所用具體化合物的活性、給藥途徑、該具體化合物的清除速度、治療持續(xù)時間、與該具體化合物聯(lián)合或同時使用的具體藥物、患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況等醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域眾所周知的因素。劑量水平通常為約0.01-10mg/kg/天，優(yōu)選為約0.1-1mg/kg/天。
本發(fā)明的優(yōu)點 (a)本發(fā)明的化合物具有結(jié)構(gòu)新穎，制備工藝可行性強。本發(fā)明的肽化合物多數(shù)具有平行雙鏈結(jié)構(gòu)及以氨甲基吡啶或芐胺為C末端的結(jié)構(gòu)。以Lys為支架可方便地進行雙鏈平行組裝，不但具有“一步雙殘基”的合成效率，而且使產(chǎn)物分子具有雙重活性結(jié)構(gòu)段的特點。以氨甲基吡啶或芐胺為C末端的形式可以避免傳統(tǒng)的酯鍵末端存在的中途氨解及需要脫除C末端保護等不利因素。
(b)與尾加壓素(hU II)十一肽(H-Glu-Thr-Pro-Asp-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH)、皮質(zhì)抑素(CST)十四肽(H-Pro-c[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys]-Lys-OH)及生長抑素十四肽(H-Ala-Gly-c[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]-OH)相比，本發(fā)明設(shè)計的化合物結(jié)構(gòu)更為簡短，通式I均在6個殘基長度以內(nèi)。雖然通式II分子內(nèi)共含9～12個殘基，但其雙鏈的結(jié)構(gòu)相同，合成時同步完成，因此制備工藝均比尾加壓素十一肽及生長抑素十四肽要簡單、易行，而且具有雙重的活性結(jié)構(gòu)段。
(c)本發(fā)明還提供了這些新肽化合物作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，尤其是實施例3制備的肽(III)有良好的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，對宮頸癌(HeLa)、皮膚癌(A431)、胃癌(BGC803)及乳腺癌(MDA-MB-468)等的IC50均在10μM以下，明顯強于文獻中生長抑素改造物的活性Keri，G.Y.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，9312513-12518。

具體實施例方式 實施例1H-Pro-Phe-(D)Trp-Lys-Val-Tyr-Ser-NHMe(I)的合成 (a)Boc-Ser-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備 4.1g(20mmol)Boc-Ser-OH、2.76g(20mmol)K2CO3、5mg KI及10g(5mmol)氯甲基樹脂(取代當(dāng)量0.5mmol/g，粒度100-200目，交聯(lián)度1％)共同與100mL DMF混和，經(jīng)70℃空氣浴旋轉(zhuǎn)加熱反應(yīng)24h。然后將反應(yīng)混懸液移入帶抽濾砂板的肽反應(yīng)管中，抽除上清液。樹脂經(jīng)下列溶劑依次洗濾，每次各1min DMF(60-70℃)×3、95％EtOH×3、DMF×3、50％EtOH×3、無水EtOH×3、無水Et2O×2，抽干備用。
(b)脫Boc Boc-AA-樹脂(約5mmol)與100mL含3N HCl的無水HOAc混合，室溫?fù)u動5min。抽除酸液后再加100mL 3N HCl/HOAc，再搖動反應(yīng)40min。抽除酸液后，樹脂依次用下列溶劑洗濾DCM×5、Et2O×2、DMF×2、95％EtOH×2、70℃的DMF×2、70℃的EtOH×3、無水Et2O×2，抽干備用。
(c)脫除Fmoc Fmoc-AA-樹脂與適量20％哌啶/DMF混搖兩次(5+20min)，依次用EtOAc×3、DMF×3、EtOH×3、DMF×2、EtOH×3、Et2O×2，抽干備用。
(d)羧基組分Boc-AA-OH或Fmoc-AA-OH的活化 稱取三倍于樹脂上氨基組分的Boc(或Fmoc)-AA-OH、HBTU及HOBt共溶于適量的干燥DMF中。然后加入四倍摩爾量(當(dāng)氨基組分為·HCl鹽時)或三倍摩爾量(當(dāng)氨基組分為游離胺時)的N-甲基嗎啉(NMM)。溶液澄清全溶后備用。
(e)縮合接肽 將上述預(yù)制的羧基組分活化溶液與適量的氨基組分樹脂混合。室溫?fù)u動反應(yīng)，終點由茚三酮試驗結(jié)果決定。本發(fā)明中多數(shù)接肽反應(yīng)為兩次縮合，每次5～6h。反應(yīng)后樹脂依次用下列溶劑淋洗DMF×3、EtOH×2、DMF×3、EtOH×3、無水Et2O×2。抽干，待下一循環(huán)脫Boc或脫Fmoc用。
(f)Boc-Pro-Phe-(D)Trp-Lys(Boc)-Val-Tyr-Ser-樹脂的制備 按照上述(b)～(e)的條件，在Boc-Ser-樹脂上依次接上各殘基，得到全保護的七肽樹脂。
(g)H-Pro-Phe-(D)Trp-Lys-Val-Tyr-Ser-樹脂的制備 重復(fù)(b)的條件脫除N-末端及Lys上的Boc基，然后用8％TEA/DMF溶液與肽樹脂混搖5min，中和鹽酸鹽。再依次經(jīng)下列溶劑洗濾DMF×2、95％EtOH×2、DMF×2、95％EtOH×5，抽干。
(h)氨解反應(yīng)切除樹脂 取上述肽樹脂，按每克樹脂10mL胺溶液的比例加入5mL含33％H2NMe的醇溶液及5ml的THF。室溫中搖動24h，濾集上清液，殘余樹脂再用60℃95％EtOH洗濾三次，合并濾液在55℃下減壓濃縮至干，再加入甲苯蒸干。殘留物經(jīng)無水Et2O研磨成粉狀，過濾收集沉淀，得產(chǎn)物。FAB-MS分析939.4[M+H]+ 實施例2

(II)的制備 (a)H-Pro-Phe-(D)Trp-Lys-Tyr-Ser-樹脂的制備 依照實施例1中(a)～(g)的實驗條件得到已脫保護的六肽樹脂。
(b)分子內(nèi)Mannich環(huán)化反應(yīng) 取1g六肽樹脂與30％HCHO/H2O-DMF(1∶5)(10mL)及TFA(0.1mL)混和，室溫?fù)u動48h。樹脂依次用DMF×2、95％EtOH×2、DMF×2、95％EtOH×3洗濾，抽干。
(c)氨解切除樹脂 按照實施例1中(h)的實驗條件得到產(chǎn)物II，F(xiàn)AB-MS分析853.3[M]+ 實施例3

(III)的制備 (a)Boc-Lys(Boc)-樹脂的制備 條件同實施例1中(a)的條件 (b)脫除Trt 按照前例條件得到[H-Cys(Trt)-Phe-(d)Trp-Lys-Val]2-Lys-樹脂，此中間體1g與10mLTESi-TFA-DCM(10∶10∶80)溶液混搖10min，抽干后再加入同樣試液，再反應(yīng)10min。抽干溶液后樹脂依次用DCM×3、95％EtOH×3、Et2O×2、8％TEA/DMF×2、95％EtOH×2、DMF×2、95％EtOH×5，抽干。
(c)甲胺解切除樹脂 按照前述條件得到產(chǎn)物III，ESI-MS分析1485.9[M]+ 實施例4

(IV)的制備 (a)BrCH2CH2CO-Phe-(D)Trp-Lys-Val-Cys-βAla-樹脂的制備 按照實施例1中(a)～(f)的條件得到中間體H-Phe-(D)Trp-Lys(Boc)-ValCys(Trt)-βAla-樹脂。再與溴代丙酸進行縮合(條件同前)，得到全保護的七肽樹脂中間體。后者按照實施例3中(b)的實驗條件脫除Cys上的Trt基及Lys上的Boc基。
(b)

的制備 取1g七肽樹脂與TEA-DMSO(0.5∶9.5)混和搖動反應(yīng)50h，然后依次用DMF×2、95％EtOH×2、DMF×2、95％EtOH×5分別洗濾、抽干。
(c)甲胺解切除樹脂 按照實施例1中(h)的條件得到產(chǎn)物IV，ESI-MS分析820.5[M+H]+ 實施例5

(V)的制備 六肽H-Phe-Trp-Arg-Tyr-Lys(Boc)-βAla-樹脂的制備按照實施例1的條件得到六肽樹脂中間體，再與5倍摩爾量的丁二酸酐/吡啶/DMF反應(yīng)，得到中間體HOOCCH2CH2CO-Phe-Trp-Arg-Tyr-Lys(Boc)-βAla-樹脂。后者脫除Lys上的Boc基，再與2倍摩爾量的HBTU/NMM/DMF混和反應(yīng)24h，完成分子內(nèi)環(huán)化。最后按照實施例1中(h)的條件切除樹脂得到產(chǎn)物V。ESI-MS分析965.4[M+H]+ 實施例6

(VI)的制備 按照實施例3的實驗條件得到產(chǎn)物，ESI-MS分析1645.7[M]+。
實施例7

(VII)的制備 按照實施例3的方式得到產(chǎn)物VII，ESI-MS分析1613.8[M]+ 實施例8

(VIII)的制備 (a)按照實施例3中(a)～(b)的方式得到中間體[H-Cys-Lys-Trp-Tyr]2-Lys-樹脂 (b)氧化環(huán)合 將上述雙鏈肽樹脂按每克10mL溶劑的比例與DMSO混和，室溫反應(yīng)60h。
肽樹脂再用下列溶劑洗濾95％EtOH×2、DMF×2、95％EtOH×5，抽干。
(c)甲胺解切除樹脂 按照上述通法進行，得產(chǎn)物VIII。ESI-MS分析1340.6[M+Na]+。
實施例9

(IX)的制備 A

的制備 (a)Boc-Tyr-NHCH2Py的制備 將1.210g Boc-Tyr-OH(4.3mmol)、0.41mL 3-氨甲基吡啶(4.0mmol)和0.581gHOBt(4.3mmol)混和，加DMF20mL溶解，冰水外浴下攪拌，然后加入8mLDMF溶解的0.48mL NMM(4.3mmol)中和的0.824g EDC·HCl(4.3mmol)混懸液，繼續(xù)攪拌至室溫，反應(yīng)過夜。次日結(jié)束反應(yīng)后，加鹽水130mL，用EtOAc提取(50mL×3)，用飽和NaHCO3溶液(60mL×3)、H2O(90mL×2)、鹽水(60mL×3)分別洗滌，無水Na2SO4干燥。抽濾，將濾液減壓濃縮后，以PE-Et2O(V∶V＝1∶1)研磨得白色粉末，產(chǎn)率78％。Mp169～170.5℃，ESI-MS372.3[M+H]+。
(b)2HCL·H-Tyr-NHCH2Py的制備 以飽和HCl/EtOAc溶解Boc-Tyr-NHCH2Py，冰水外浴下攪拌反應(yīng)4小時后減壓蒸出溶劑和酸氣，殘余物以Et2O-EtOAc研磨后抽濾，產(chǎn)物發(fā)粘，直接進行下一步縮合反應(yīng)。
(c)Boc-Val-Tyr-NHCH2Py的制備 將上步反應(yīng)產(chǎn)物2HCL·H-Tyr-NHCH2Py(12.58mmol)、2.738g Boc-Val-OH(12.6mmol)和1.701g HOBt(12.6mmol)混和，加DMF30mL溶解，冰水外浴下攪拌，然后加入10mL DMF溶解的2.8mL NMM(25.16mmol)中和的2.415gEDC·HCl(12.6mmol)混懸液，繼續(xù)攪拌至室溫，反應(yīng)過夜。次日結(jié)束反應(yīng)后，加鹽水180mL，用EtOAc提取(60mL×3)，用飽和NaHCO3溶液(60mL×3)、鹽水(60mL×3)分別洗滌，無水Na2SO4干燥。抽濾，將濾液減壓濃縮后，以PE-Et2O(V∶V＝1∶1)研磨得白色粉末，產(chǎn)率84％。Mp168～170℃，ESI-MS471.3[M+H]+，493.3[M+Na]+。
(d)2HCL·H-Val-Tyr-NHCH2Py的制備 以飽和HCl/EtOAc溶解Boc-Val-Tyr-NHCH2Py，冰水外浴下攪拌反應(yīng)4小時后減壓蒸出溶劑和酸氣，殘余物以EtOAc研磨后抽濾，得白色粉末，產(chǎn)物易吸潮直接進行下一步縮合反應(yīng)。
(e)Fmoc-Lys(Boc)-Val-Tyr-NHCH2Py的制備 按照實施例9中A(c)的條件得到產(chǎn)物IXa，產(chǎn)率78％。Mp181.5～183.5℃，ESI-MS843.5[M+Na]+。
B Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-OH的制備 (a)Boc-(BnN)-Gly-OH的制備 將27.8mL芐胺(250mL)溶于40mL無水Et2O中，冰水外浴下充分?jǐn)嚢?，緩慢滴加?.95g溴乙酸(50mmol)的無水Et2O溶液25mL(約需1h)，反應(yīng)過夜。次日用30％KOH溶液調(diào)PH≈13，然后用Et2O洗滌(70mL×5)。水層加丙酮30mL，猛烈攪拌下緩慢滴加含17.5g(Boc)2O(80mmol)的丙酮溶液30mL(約需1.5h)，反應(yīng)過夜。第三日加水80mL，用PE洗滌(80mL×4)，以2NHCl調(diào)PH≈2，冷藏，抽濾，干燥厚的白色固體，產(chǎn)率50％。Mp95～97℃，ESI-MS265[M]+。
(b)Boc-(D)Trp-OPac的制備 將9.22g Boc-(D)Trp-OH(30.0mmol)與6.30g溴代苯乙酮(31.0mmol)混溶于80mL EtOAc中，冰水外浴下攪拌，滴加4.34mL TEA(31.0mmol)，反應(yīng)過夜。次日加水60mL，EtOAc提取(60mL×3)，有機層分別用飽和NaHCO3溶液(80mL×3)、水(80mL×3)，鹽水(80mL×3)洗滌，無水Na2SO4干燥。抽濾，將濾液減壓濃縮后，以PE研磨得白色粉末，產(chǎn)率92％，Mp64～66℃。
(c)HCl·H-(D)Trp-OPac的制備 以飽和HCl/EtOAc溶解Boc-(D)Trp-OH，冰水外浴下攪拌反應(yīng)4小時后減壓蒸出溶劑和酸氣，殘余物以Et2O研磨后抽濾，得白色粉末，產(chǎn)率97％，Mp144～146℃。
(d)Boc-Phe-(D)Trp-OPac的制備 按照實施例9中A(c)的條件得到橙黃色固體，產(chǎn)率69％，Mp130～132℃，ESI-MS570.3[M+H]+，592.3[M+Na]+。
(e)HCl·H-Phe-(D)Trp-OPac 按照實施例9中B(c)方式得橙黃色固體，產(chǎn)率97％，Mp142～144℃。
(f)Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-OPac的制備 稱取1.272g Boc-(BnN)-Gly-OH(4.8mmol)與0.648g HOBt(4.8mmol)共同溶于20mLTHF中，冰水外浴下加入2mmol/mL DCC的四氫呋喃溶液2.4mL，置于4℃下活化4小時后過濾除去DCU，濾液在0℃下加入到以10mLDMF+10mL THF溶解的2.305g HCl·H-Phe-(D)Trp-OPac(4.56mmol)溶液中，攪拌10分鐘后在冰水外浴下邊攪拌邊滴入0.53mL NMM，反應(yīng)過夜。次日減壓蒸出THF，向所得溶液中加入80ml飽和食鹽水以EtOAc萃取(60mL×3)，合并有機層依次以飽和NaHCO3溶液×3、1N HCl溶液×3、飽和食鹽水×3、蒸餾水×2洗滌(每次100mL)，有機層以無水硫酸鈉干燥后過濾，減壓濃縮后以PE-Et2O研磨得淺橙黃色固體，產(chǎn)率91.3％。Mp88.5～87.5℃，ESI-MS717.3[M+H]+。
(g)Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-OH的制備 以60mL HOAc溶解1.387g Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-OPac(1.94mmol)，油浴40℃下邊攪拌邊加入30倍摩爾量鋅粉攪拌反應(yīng)，1小時后再加入20倍摩爾量鋅粉，繼續(xù)反應(yīng)5小時后過濾除去鋅粉，濾液濃縮后以100mL EtOAc稀釋，以1N HCl溶液(50mL×3)、飽和食鹽水溶液(70mL×2)洗滌，有機層以無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液濃縮至干，以無水Et2O-PE研磨過夜后抽濾得到淺黃色固體，產(chǎn)率55％。Mp130～132℃，ESI-MS621.3[M+Na]+。
C化合物IX的制備 將0.410g Fmoc-Lys(Boc)-Val-Tyr-NHCH2Py(0.5mmol)用適量DMF溶解，攪拌下加入0.116g KF(2.0mmol)和0.15mL TEA(1.05mmol)，得反應(yīng)液①。將0.329g Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-OH(0.55mmol)用適量DMF溶解，攪拌下加入0.074g HOBt(0.55mmol)、0.209g HBTU(0.55mmol)和0.16mLTEA(1.16mmol)，5min后將此混合物加入到反應(yīng)液①中，反應(yīng)過夜。次日加鹽水150mL，EtOAc提取(60mL×3)，有機層分別用飽和NaHCO3溶液(60mL×3)、水(80mL×1)，鹽水(60mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥后過濾，減壓濃縮后以Et2O研磨得棕褐色固體，無水乙醇重結(jié)晶得淺棕褐色固體，產(chǎn)率34％，Mp129～132℃，ESI-MS1179.7[M+H]+，1201.6[M+Na]+。
實施例10

(X)的制備 (a)Boc-Arg-Val-Tyr-NHCH2Py的制備 按照實施例9中A的方式得產(chǎn)物，Mp151.5～153.5℃，ESI-MS627.4[M+H]+，649.3[M+Na]+。
(b)3HCl·H-Arg-Val-Tyr-NHCH2Py的制備 按照實施例9中B(c)方式得產(chǎn)物，產(chǎn)物極易吸潮。
(c)Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-OH的制備 按照實施例9中B的方式制備。
(d)Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-Arg-Val-Tyr-NHCH2Py的制備 按照實施例9中A(c)的條件得到產(chǎn)物，產(chǎn)率85％，ESI-MS1107.6[M+H]+。
(f)3HCl·H-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-Arg-Val-Tyr-NHCH2Py的制備 按照實施例9中B(c)方式得產(chǎn)物，Mp168～170℃， ESI-MS1007.6[M+H]+，1029.5[M+Na]+。
(g)

的制備 將0.08g 3HCl·H-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-Arg-Val-Tyr-NHCH2Py(0.072mmol)溶于80mL HOAc，室溫攪拌，加入0.027mL甲醛(0.36mmol)，38h后將反應(yīng)液減壓濃縮至干，加70mL正丁醇提取，有機層分別用飽和NaHCO3溶液(50mL×3)、水(60mL×2)，鹽水(60mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥后過濾，減壓濃縮后以Et2O研磨得灰褐色固體，產(chǎn)率81％，ESI-MS1019.5[M+H]+。
實施例11

(XI)的制備 (a)Boc-(BnN)-Gly-Phe-(D)Trp-OH的制備 按照實施例9中B的方式制備。
(b)3HCl·H-Arg-Val-NHCH2Py的制備 按照實施例9中A方式得產(chǎn)物，產(chǎn)物易吸潮。
(c)

的制備 按照實施例9中A(c)的條件得到產(chǎn)物，產(chǎn)率41％，Mp144.5～146.5℃， ESI-MS944.5[M+H]+。
實施例12

(XII)的制備 方法見實施例10中<a>～<f>。
實施例13

(XIII)的制備 (a)

的制備 按照實施例3的方法制備。
(b)Fmoc-Tyr-Phe-(D)Trp-OH的制備 按照實施例9中B的方法制備得產(chǎn)物，ESI-MS737.2[M+H]+，759.3[M+Na]+。
(c)

的制備 按照實施例9中A(c)的方法制備。
(d)

的制備 將0.2g(0.0862mmol)

溶于6mLDMF中，加入3mL哌啶，攪拌5h后，加入無水乙醚稀釋，抽濾得棕黃色固體，產(chǎn)率62％，ESI-MS1879.0[M+H]+。
(e)

的制備 按照實施例9中B(c)的方法制備，得灰褐色固體，產(chǎn)率87％，ESI-MS1678.9[M+H]+。
藥理實驗 實施例1. 抗腫瘤細(xì)胞增殖作用 將對數(shù)生長期細(xì)胞按1200-1500個/100μl接種于96孔培養(yǎng)板。24小時后加入不同濃度(0.1-100μmol/L)藥物及相應(yīng)溶劑對照，每組平行4孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，棄上清，每孔加100μl新鮮配制的含0.5mg/ml MTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄培養(yǎng)上清，加100μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，在Bio-Rad 450型酶標(biāo)儀上測定570nm處光密度值(650nm為參考波長)，計算腫瘤細(xì)胞存活率，并計算IC50。
表1.肽化合物對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用
結(jié)果發(fā)現(xiàn)本專利一些肽化合物對多數(shù)腫瘤細(xì)胞系在1-100μmol/L濃度時，產(chǎn)生明顯的抑制作用，一些敏感腫瘤細(xì)胞系的IC50，低于10μmol/L。如表1.所示，一些肽化合物對多數(shù)腫瘤細(xì)胞有良好的細(xì)胞毒性作用，特別對胃癌、宮頸癌、皮膚癌和部分乳腺癌作用較強。
實施例2. 肽化合物III對惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 培養(yǎng)胃癌細(xì)胞BGC803以5000個/100μl接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。24小時后加入不同濃度(0.13，1.23，11.1μmol/L)的肽化合物III，每組2-8個重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。孵育結(jié)束后，加入細(xì)胞透過性DNA結(jié)合染料Hoechst33342至終濃度為1μg/ml，37℃孵育10分鐘。于倒置熒光顯微鏡下，用紫外光激發(fā)，觀察細(xì)胞核的藍色熒光強度與凋亡形態(tài)。藥物作用達72小時時，可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生典型的凋亡核形態(tài)，即核固縮，著色成明亮的藍色，多成碎裂核形態(tài)。在無藥物處理、0.13，1.23，11.1μmol/L藥物處理的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡的百分率分別平均為5.4，13.6，15.8和20.6。
權(quán)利要求
1. 如通式(1)和(II)所示的合成肽化合物，
0＝L型或D型
X＝二十種天然氨基酸中的任何一種或(Bn-N)Gly、Boc-(NBn)Gly、RCO[R＝C1～10]
Y＝Phe、Tyr、Arg
W＝-CH2-、-S-S-、-CH2S-、CO、間三嗪基或缺失(des)
Z＝二十種天然氨基酸中的任何兩種或一種或缺失(des)
R1＝二十種天然氨基酸中的任何一種(aa)、β-Ala及它們的酰胺aa-NHR[R＝H、C1～10、-CH2-Pyridine、Bn]
R2＝NH2、Guanidino
n＝2～6；
W＝-S-S-、二酮哌嗪(DKP)、間三嗪基或缺失(des)
X＝二十種天然氨基酸中的任何一種
Y＝Phe、Tyr、Lys、(Bn-N)Gly、-Tyr-Lys-、-Phe-Lys-、-Tyr-Arg-、-Phe-Arg-或缺失(des)
0＝L型或D型
X′＝Lys、Arg、Tyr、His、Orn
Z＝二十種天然氨基酸中的任何一種或缺失
R1＝二十種天然氨基酸中的任何一種(aa)的酰胺或缺失、或β-Ala的酰胺aa-NHR[R＝H、C1～10、Bn]。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于，包括如下化合物
3. 一種藥物組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求1和2中任一所述的合成肽和藥劑學(xué)上可接受的載體。
4. 權(quán)利要求1和2中任一所述的合成肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤選自胃癌、宮頸癌、皮膚癌、乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了如通式(I)和(II)所示的包含色氨酰-賴(精)氨酰片段肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計與合成。這些化合物的制備方法，其分別是由液相、固相或液-固相配合的方式而制備。這類合成肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，尤其是胃癌、宮頸癌、皮膚癌、乳腺癌。
文檔編號C07K7/06GK101265290SQ20071006439
公開日2008年9月17日 申請日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者王德心, 楠 王, 喜 龔, 征 閆, 香 韓, 楊瀟驍, 馮鶴鶴 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所