專利名稱：：由阿魏酸精氨酸酯和微藻提取物組成的化妝品活性成分及其應(yīng)用的制作方法由阿魏酸精氨酸酯和微藻提取物組成的化妝品活性成分及其應(yīng)用本發(fā)明涉及由微藻提取物和阿魏酸精氨酸酯(femilated'arginine)組成的新穎化妝品活性成分，其用于激活蛋白酶體和產(chǎn)生硫氧還蛋白的應(yīng)用，包含其的化妝品組合物，以及這樣的化妝品組合物用于抗皮膚衰老的應(yīng)用。生物體的不同生理功能的漸進(jìn)的不可逆的衰退稱為衰老，是由各種遺傳因子控制的復(fù)雜過程，但也與外部環(huán)境的影響相關(guān)。臨床上，反映衰老的征兆如下外表有皺紋和細(xì)紋、皮膚和皮下組織松弛、皮膚失去彈性、皮膚肌理缺乏張力，以及變得暗淡并失去光輝的皮膚黃化。這些征兆中，有些更具體地與內(nèi)在或生理衰老即與時間的流逝相關(guān)的衰老有關(guān)，然而其它征兆更具體地是由于外在衰老，即通常由環(huán)境(各種形式的污染廢氣、吸煙、工廠煙塵、化學(xué)制品等)引起的衰老；這種衰老更具體地涉及光誘導(dǎo)的衰老，其因暴露于日光、燈或任何其它輻射而產(chǎn)生。因內(nèi)在或生理衰老產(chǎn)生的皮膚變化是涉及內(nèi)源性因素的遺傳性程序化衰老。年復(fù)一年，由于真皮產(chǎn)生越來越少的膠原和彈性蛋白纖維，皮膚失去彈性。因此，結(jié)締組織逐漸衰退，皮膚逐漸松弛。表皮自我更新的能力也趨于減少，由于其新陳代謝發(fā)生改變，后產(chǎn)生的表皮變得更干燥和更薄。內(nèi)源性衰老因素之一是激素生成減少，導(dǎo)致組織、細(xì)胞和器官功能逐漸減退。諸如生長激素(HGH)、睪酮、DHEA和褪黑激素的激素在20歲以前大量產(chǎn)生，并且它們促進(jìn)細(xì)胞更新。相反，外在衰老導(dǎo)致組織病理學(xué)變化，例如彈性物質(zhì)在真皮淺層中的過度蓄積和膠原纖維的變性。衰老機(jī)制之一是自由基的過度產(chǎn)生，所述自由基將不同的細(xì)胞成分作為目標(biāo)蛋白、脂質(zhì)、糖和DNA。某些外部影響使它們開始反應(yīng)，因?yàn)樗鼈儾粩嗟貙ふ移淠軌蚺c之結(jié)合的其它分子。然后，它們攻擊膠原纖維、細(xì)胞膜和皮膚的脂肪層。它們改變了細(xì)胞的遺傳特性，以至于降低了新皮膚細(xì)胞的質(zhì)量。身體通過抵抗這些氧化反應(yīng)的酶系統(tǒng)(抗氧化劑)來保護(hù)自身不受這些攻擊。但是從20歲起，天然防御機(jī)制逐漸減弱，以至于皮膚不再能夠獨(dú)立進(jìn)行自身防御。受損蛋白的蓄積構(gòu)成細(xì)胞衰老的特征之一。因此，隨著年齡的增長，受損蛋白的蓄積提出了負(fù)責(zé)消除這些蛋白的蛋白水解系統(tǒng)的有效性問題，特別是蛋白酶體系統(tǒng)的有效性問題，這不僅在改變的、特別是氧化蛋白的消除中涉及，而且在細(xì)胞內(nèi)蛋白的連續(xù)更新中涉及。1956年，Harman在"衰老的自由基理論"中提出，由活性氧引起的對不同細(xì)胞成分的損傷代表了衰老過程中的重要因素。因此，細(xì)胞衰老將取決于活性氧的產(chǎn)生、抗氧化防御和負(fù)責(zé)消除受損細(xì)胞成分的系統(tǒng)的有效性。根據(jù)改變的性質(zhì)，受損蛋白能夠被修復(fù)或降解。(cf.圖1)。唯一已知的修復(fù)機(jī)制是能夠還原二硫橋的硫氧還蛋白(T)-硫氧還蛋白還原酶(TR)系統(tǒng)，和能夠還原曱硫氨酸亞砜(曱硫氨酸的氧化產(chǎn)物)的肽曱碌u氨酸亞石風(fēng)還原酶。過去已經(jīng)顯示出，硫氧還蛋白防止UVB誘導(dǎo)的皮膚損傷。在正常狀態(tài)下，TR在NAPDH的存在下還原氧化型石克氧還蛋白。還原型硫氧還蛋白作為疏氧還蛋白過氧化物酶的電子供者用，從而將11202還原為H20。TR是抗自由基損傷的強(qiáng)抗氧化劑。整合到細(xì)胞膜和細(xì)胞溶質(zhì)中的TR的存在已經(jīng)在人的皮膚中證明。在受UVA輻射的人皮膚成纖維細(xì)胞中已經(jīng)顯示出，由于輻射，硫氧還蛋白防止了線粒體膜電位的損失、細(xì)胞的ATP含量的損耗和細(xì)胞活性的損失(Didieretal.，F(xiàn)reeRadicalBiologyandMedicine(自由基生物學(xué)和醫(yī)學(xué))，Vol.31,No.5,p585-598,2001)。還顯示出，在由UVA引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，硫氧還蛋白防止了由UVAi秀導(dǎo)的DNA損傷(Didieretal.,FreeRadicalBiologyandMedicine(自由基生物學(xué)和醫(yī)學(xué))，Vol.30，No.5，p537-546,2001)。因此，硫氧還蛋白對維持基因組的完整性也很重要。其它類型損傷的消除通過蛋白酶體依賴的蛋白細(xì)胞內(nèi)降解途徑進(jìn)行。蛋白酶體系統(tǒng)由催化復(fù)合物、20S蛋白酶體和若干影響其活性和特異性的調(diào)控因子構(gòu)成。蛋白酶體位于哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞核中。20S蛋白酶體由a型或]8型基因編碼的14種不同亞基組成，并且排列成7個亞基的4個環(huán)的圓柱形堆棧。根據(jù)細(xì)胞的新陳代謝，存在不同的蛋白酶體亞基(例如，20S、19S、26S和PA28)，其單獨(dú)或相互聯(lián)合起作用。實(shí)際上，它們能夠是蛋白酶體亞基或類似的蛋白酶體，其性質(zhì)取決于細(xì)胞的新陳代謝。被稱為蛋白酶體的這種蛋白水解復(fù)合物優(yōu)選在堿性、疏水和酸性殘基的羧基末端水平上剪切蛋白。這些肽酶活性通過3種不同的/3亞基來保持，并被定位于結(jié)構(gòu)內(nèi)部。19S調(diào)節(jié)復(fù)合體與20S蛋白酶體結(jié)合形成26S蛋白酶體，其確保泛素化蛋白的降解。隨著年齡的增長，發(fā)生受損蛋白的蓄積，這是一種看起來可能促進(jìn)蛋白酶體系統(tǒng)有效性減少的現(xiàn)象。特別是，一方面，在表皮活組織檢查以及培養(yǎng)中的角質(zhì)形成細(xì)胞中，蛋白的羰基含量已經(jīng)顯示出與年齡相關(guān)的增加，另一方面，已經(jīng)顯示出來源于攜帶羰基的蛋白的碳水化合物和脂質(zhì)的加合物的修飾。由于蛋白酶體的量的減少，氧化蛋白的量隨年齡增長的增加伴隨著蛋白酶體活性的降j氐(Petropoulosetal.，J.GerontolABiolSci2000;55A:B220-7)。兩項(xiàng)最新研究，一項(xiàng)是關(guān)于大鼠骨骼肌細(xì)胞有絲分裂后的衰老，另一項(xiàng)是關(guān)于人成纖維細(xì)胞，其中通過微數(shù)列研究了6000種基因的表達(dá)，已經(jīng)顯示出細(xì)胞衰老過程中小于1%的基因的表達(dá)的改變，包括蛋白酶體系統(tǒng)的表達(dá)減少的基因。(LeeCa/.,Science1999;285:1390-3andLee"Science2000;287:2486-92)對于在老年供者的細(xì)胞中所分析的3種蛋白酶體亞基(X、N3和C2),轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)也已經(jīng)顯示出減少，但是，4名百歲老人的培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)和蛋白酶體活性水平仍然與青年供者的培養(yǎng)細(xì)胞相近。(Chondrogiaimi"a/"ExpGerontol2000;35.721-8)。所有的這些結(jié)果清楚地表明，隨著年齡的增長，蛋白酶體活性降低。衰老機(jī)制還涉及其它種類的"修飾"蛋白。這些是所謂的"糖化"蛋白。糖化是通過用"氨基"型基團(tuán)經(jīng)過美拉德反應(yīng)來縮合還原糖所引發(fā)的蛋白的翻譯后修飾。所得產(chǎn)物通常被稱為高級糖基化終產(chǎn)物(AGEs)。兩種主要的糖化產(chǎn)物羧曱基賴氨酸(CML)和戊糖苷在衰老過程中蓄積，并且在諸如糖尿病的病理學(xué)中以漸進(jìn)的方式蓄積。糖化產(chǎn)物的毒性是已知的。被提出作為其有害影響的實(shí)例包括，例如酶活性的改變、蛋白的交聯(lián)和聚集體的形成、內(nèi)皮基底膜界面的改變、對蛋白水解的敏感性的降低、不能識別分子信號和胞吞作用以及免疫原性的改變。蛋白的糖化促進(jìn)了它們的可氧化性，糖化蛋白能夠與氧發(fā)生反應(yīng)形成氧自由基，其有害影響之前已經(jīng)說明。這些糖化蛋白不能被破壞或者從其蓄積的細(xì)胞中釋放，并被證明通過蛋白酶體來抵抗降解。糖化在生物體的各處都有影響，特別是通過引起細(xì)胞和組織損傷以及組織加速衰老在某些疾病的發(fā)生中起重要作用。因此，需要開發(fā)活性成分來避免蛋白的糖化及其在細(xì)胞體系中的蓄積。通常，獲取用于局部使用的能夠延緩皮膚衰老的制劑特別受關(guān)注，特別是通過提高蛋白酶體活性和通過減少糖化蛋白的量。專利申請F(tuán)R2822701描述了將褐指藻屬藻類(微藻)的提取物用作提高蛋白酶體活性的化妝品制劑，并且用于制備化妝品組合物，所述化妝品組合物保護(hù)皮膚抵抗UV暴露的有害作用，或用于防止和/或延緩皮膚衰老效應(yīng)。專利申請EP0629397Al描述了抗自由基和抗炎的化妝品組合物，其包4舌小^求藻(CA/ore〃a)、才冊藻(Scewed&smw力和螺i走藻(5^z'nz/z'"e)(ARL)的萃取液以及生咖啡的提取物。因此，申請人已經(jīng)開發(fā)出由與三個目的相應(yīng)的化合物的協(xié)同組合產(chǎn)生的活性成分。第一目的對應(yīng)于提高蛋白酶體活性以促進(jìn)依賴后者的蛋白的消除的需要。第二目的對應(yīng)于刺激硫氧還蛋白以協(xié)同方式產(chǎn)生的需要。最后，第三目的對應(yīng)于顯著減少糖化蛋白的產(chǎn)生并因此減少其在細(xì)胞中蓄積的需要。令人驚訝的是，申請人發(fā)現(xiàn)了由阿魏酸精氨酸酯和微藻提取物組成的新穎化妝品活性成分，其激活蛋白酶體和^1氧還蛋白的產(chǎn)生，同時避免蛋白糖化。包含該活性成分的用于局部使用的新穎化妝品制劑也形成本發(fā)明的一部分，并且能夠用于減緩皮膚衰老。本發(fā)明的主要目的在于包含阿魏酸精氨酸酯和微藻提取物的化妝品活性成分。"微藻"表示未分化的單細(xì)胞或多細(xì)胞微型藻類，與生命周期包括分化階段的"巨藻"相對。"微藻提取物，，表示來源于微藻并且能夠用于本發(fā)明的化妝品活性成分的任何細(xì)胞提取物。這樣的提取物能夠是例如，細(xì)胞內(nèi)的、細(xì)胞膜或脂質(zhì)提取物。微藻菌抹在包含諸如錳、銅、硅、硼、硫的痕量元素和水解蛋白的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，全部在pH7至8、通常25°C至30°C的促進(jìn)其生長的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)生長是最適條件，即當(dāng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)目將不再增長時，回收培養(yǎng)基并離心。然后，如果合適，通過在每升培養(yǎng)基中加入1ml至5ml過氧化氬(H202)或通過臭氧對該離心的培養(yǎng)物實(shí)施氧化應(yīng)激，所述臭氧使用臭氧發(fā)生器通過空氣與UV反應(yīng)產(chǎn)生。然后將因此獲得的生物量再次離心，回收沉淀(pellet)。阿魏酸精氨酸酯是來自精氨酸的合成分子。其產(chǎn)生方法詳細(xì)描述于實(shí)施例1中。因此，申請人意外發(fā)現(xiàn)，用這樣的化合物的組合能夠提高蛋白酶體活性，以促進(jìn)依賴于后者的蛋白的消除，同時以協(xié)同方式刺激硫氧還蛋白的產(chǎn)生。這種提高比僅用微藻提取物好4艮多。另外，本發(fā)明的化妝品活性成分能夠顯著減少糖化蛋白的產(chǎn)生，并因此減少其在細(xì)胞中的蓄積。此外，糖化蛋白的減少也引起蛋白酶體活性的提高，使得受損蛋白顯著地大量消除。申請人已經(jīng)觀察到，通過用0.005%至0.02%的阿魏酸精氨酸酯處理細(xì)胞能夠使糖化蛋白減少50%。這代表在細(xì)月包中抑制50%的糖化蛋白形成所需的含量。實(shí)際上，該活性成分似乎具有與藻類提取物和阿魏酸精氨酸酯結(jié)合的特殊優(yōu)勢，當(dāng)與皮膚接觸時，阿魏酸精氨酸酯由于皮膚酶系統(tǒng)而分解成精氨酸和阿魏酸。L-精氨酸是一種堿性氨基酸，通過避免蛋白的糖化作用而對皮膚細(xì)胞具有再生效果，但是仍然具有缺點(diǎn)，例如與空氣中的氧接觸變得不穩(wěn)定，并且其降解成細(xì)胞毒性產(chǎn)物。然而，阿魏酸是能夠吸收紫外線的抗氧化劑。因此，申請人指出，阿魏酸精氨酸酯復(fù)合物(或阿魏酸/精氨酸復(fù)合物)增加了所形成的精氨酸的穩(wěn)定性，并由此提高這種精氨酸的活性。因此，這樣的阿魏酸精氨酸酯復(fù)合物特別地導(dǎo)致精氨酸在組織中的生物利用度增加，特別是當(dāng)直接應(yīng)用于皮膚時。通過存在于細(xì)胞，例如諸如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞類型的人或動物皮膚細(xì)胞中未水解的氧化蛋白水平的減少，觀察到了與僅用微藻提取物相比，本發(fā)明的活性成分提高了蛋白酶體活性。該減少通常在10%至25%之間。此外，阿魏酸精氨酸酯的存在，與優(yōu)選用植物抗毒素富集(如下)的微藻提取物相結(jié)合，使得與單獨(dú)的微藻提取物相比，細(xì)胞中硫氧還蛋白的產(chǎn)生增加。因此，例如，以包含其的產(chǎn)品的重量計，4吏用0.005%至0.1%的量逐漸增加的阿魏酸精氨酸酯，優(yōu)選0.005%至0.05%，特別是0.005%至0.02%,0.995%至0.90%的微藻提取物，優(yōu)選0.995%至0.95%,特別是0.995%至0.98%，能夠顯示出，與按照以重量計的上述值單獨(dú)包含在相同產(chǎn)品中的微藻提取物相比，能夠使辟b氧還蛋白的產(chǎn)生增加約4%至20%，優(yōu)選4%至10%，特別是4%至8%。這構(gòu)成了本發(fā)明的決定性優(yōu)勢。例如，"包含其的產(chǎn)品"表示下文定義的化妝品組合物。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的活性成分的微藻提取物用植物抗毒素富集，通過例如將該微藻置于應(yīng)激狀態(tài)，優(yōu)選由11202或臭氧引起的氧化應(yīng)激，如上所述。植物抗毒素是所謂的"防御"化合物，其由植物合成，特別地，由微藻在被置于應(yīng)激狀態(tài)，優(yōu)選置于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時合成。這些植物抗毒素在性質(zhì)上能夠不同抗生素、酶、酚。在本發(fā)明中，包括酶系統(tǒng)，例如，鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶(FNR)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的活性成分的微藻提取物源自綠藻綱微藻。它們是在湖和池塘中發(fā)現(xiàn)的綠藻，其葉綠素含量高。在特別優(yōu)選的方式中，所使用的微藻屬于柵藻屬和Wrac_yWs屬，前者為淡水藻類。根據(jù)本發(fā)明的活性成分的阿魏酸精氨酸酯與微藻提取物的重量比優(yōu)選為1:1至1:199，優(yōu)選1:19至1:99，更優(yōu)選1:30至1:50，特別優(yōu)選1:19。本發(fā)明的另一目的涉及根據(jù)本發(fā)明的活性成分用于激活諸如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞類型的人或動物的皮膚細(xì)胞的蛋白酶體的體外(in-vitro)或離體(ex-vivo)的應(yīng)用。這種激活在本發(fā)明的活性成分的存在下通過增加氧化蛋白的降解反映出來。本發(fā)明的另一目的涉及根據(jù)本發(fā)明的活性成分用于刺激硫氧還蛋白產(chǎn)生的體外或離體的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的涉及根據(jù)本發(fā)明的活性成分用于制備用于局部使用的化妝品組合物的應(yīng)用。有益地，以化妝品組合物的總重計，該活性成分的量為0.1%至2%，優(yōu)選0.5%至2%，特別是1%至2%。用于局部使用的這樣的化妝品組合物的實(shí)例包括洗劑類型的溶液或分散體、水包油(o/w)或油包水(w/o)乳劑、乳膏和凝力交。更特別地，它們能夠是用于保護(hù)面部、身體和手的組合物或洗劑、日霜、防曬霜、洗面奶、抗皺霜和沐浴組合物。除本發(fā)明的活性成分之外，所有的這些組合物有利地含有用于皮膚的化妝品組合物所用的標(biāo)準(zhǔn)活性成分和常規(guī)賦形劑?？梢蕴峒暗陌ňS生素E亞油酸酯、潤滑藥、香料、防腐劑、著色劑、乳化劑、增稠劑，以及濾光劑，如果適合。本發(fā)明的另一目的涉及用于局部使用的在生理學(xué)可接受的介質(zhì)中包含本發(fā)明活性成分的化妝品組合物以及這樣的組合物用于抗皮膚衰老的應(yīng)用，這種組合物能夠?qū)?yīng)于例如乳膏劑、洗劑、凝膠和面膜或上述其它形式。化妝品組合物的實(shí)例含有1%的本發(fā)明的化妝品活性成分、2%的甘油、0.80%的卡波姆、2.00%的失水山梨糖醇硬脂酸酯、2.00%的聚山梨酯60、8.00%的辛基十二烷醇、0.80%的Trisamino,剩余部分為去離子水。百分?jǐn)?shù)以相對于組合物總重的重量表示。下面的實(shí)施例解釋本發(fā)明，不限制其范圍。實(shí)施例l:阿魏酸精氨酸酯產(chǎn)生方法通過將精氨酸(HN:C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-COOH)和阿魏酸(=3-曱氧基4-羥基肉桂酸)混合，產(chǎn)生阿魏酸精氨酸酯。在粉末混合機(jī)(L6dige)中以20rpm充分混合兩種粉末約48小時。實(shí)施例2:細(xì)胞培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng)物如下獲得人皮膚活組織檢查，然后通過酶消化細(xì)胞膜以在添加EGF("表皮生長因子")的KGM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基，不含血清，其中鈣的終濃度為0.05mM)中保存細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)。在不同的傳代(P2、P4、P6和P8)和UVB輻射之后，研究這些細(xì)阿魏酸胞以評估本發(fā)明的活性成分對衰老細(xì)胞的影響。在本發(fā)明的框架中，術(shù)語"傳代"在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域具有標(biāo)準(zhǔn)意義。傳代Pl表示原代培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到融合所需的時間。此后，在以上定義的介質(zhì)中實(shí)施培養(yǎng)基P1的次培養(yǎng)，以達(dá)到融合所需的時間定義傳代P2，等等，使得能夠定義傳代P4、P6和P8。用來自15歲供者和來自62歲供者的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，將所述15歲供者的角質(zhì)形成細(xì)胞作為最佳蛋白酶體活性的參照，所述62歲供者的蛋白酶體系統(tǒng)功能的有效性低于15歲供者。輻射15歲供者的細(xì)胞以測量蛋白酶體能力，并且將其與62歲供者的蛋白酶體能力相比較。實(shí)際上，UVB輻射引起蛋白酶體系統(tǒng)的功能衰退。在如上定義的用"產(chǎn)品B"代表的活性成分的存在下，在添加EGF的KGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些角質(zhì)形成細(xì)胞，所述"產(chǎn)品B"包括-99.5%的已經(jīng)如上所述用11202或臭氧進(jìn)行過氧化應(yīng)激的柵藻屬微藻的提取物，和-0.5%的阿魏酸精氨酸酯。也在僅包含產(chǎn)品A的活性成分的存在下培養(yǎng)這些角質(zhì)形成細(xì)胞，所述產(chǎn)品A代表已經(jīng)進(jìn)行過上述氧化應(yīng)激的柵藻屬微藻的純提取物。在不存在產(chǎn)品A或B的情況下進(jìn)行相同的試驗(yàn)(所謂的"對照"樣P口J。在添加EGF的KGM的培養(yǎng)基中進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)月包的三種培養(yǎng)正常生理狀態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞來自15歲供者生理學(xué)細(xì)胞衰老狀態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞來自62歲供者光誘導(dǎo)衰老狀態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞來自15歲供者，以100-150mJ/cm2的量級對培養(yǎng)基進(jìn)行UVB輻射。UVB源以UV燈(Biosun,ViberLourmat-法國)的方式獲得，輻射波長約315nm。實(shí)施例3:細(xì)胞活性測量在傳代P2、P4、P6和P8研究在實(shí)施例2的條件下獲得的細(xì)胞。不同的傳代能夠發(fā)現(xiàn)供者的細(xì)胞衰老和由不同的細(xì)胞傳代之后的培養(yǎng)條件引起的衰老。實(shí)際上，在將細(xì)胞從表皮中除去后，從培養(yǎng)起點(diǎn)("對照，，樣品)即已觀察到細(xì)胞活性的差異。在不同的細(xì)胞傳代之后這種差異被強(qiáng)化。通過測量細(xì)胞活性研究了細(xì)胞衰老的影響，所述細(xì)胞活性通過藍(lán)色曱臢結(jié)晶物(MMT)的還原試驗(yàn)來評估。四唑鹽(MTT)具有通過細(xì)胞的線粒體的琥珀酸脫氫酶被還原為藍(lán)色甲臜結(jié)晶物的性質(zhì)。在三羧酸循環(huán)中發(fā)揮重要作用的這種酶催化琥珀酸脫氫變?yōu)檠雍魉?。這種酶的活性通過還原MTT來測量，所述酶是一種牢固粘附于線粒體內(nèi)膜的黃素蛋白。在595nm下采用常規(guī)裝置例如配備數(shù)據(jù)處理計算機(jī)系統(tǒng)的分光光度計通過分光光度法測量吸光度(或光密度)，所述吸光度(或光密度)與琥珀酸脫氫酶的活性直接相關(guān)，所述活性本身與細(xì)胞活性相關(guān)。吸光度值升高時，細(xì)胞活性增加。研究了實(shí)施例2中的三種培養(yǎng)條件。單獨(dú)用產(chǎn)品A重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)，所述產(chǎn)品A代表已經(jīng)經(jīng)歷之前定義的氧化應(yīng)激的柵藻屬微藻的純提取物。正常生理狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>光誘導(dǎo)衰老狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者+UVB100mJ/cn^下的培養(yǎng))<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>%V:%活性，%產(chǎn)品A和B:每100g培養(yǎng)基中產(chǎn)品A或B的含量。結(jié)果表明，在不同的傳代中，細(xì)胞活性降低，在62歲供者的情況下比在15歲供者的情況下更快。此外，來源于15歲供者的細(xì)胞在UVB輻射后細(xì)胞活性的減少與62歲供者的生理減少相當(dāng)。用產(chǎn)品B處理的細(xì)胞的活性顯著地高于用產(chǎn)品A處理的細(xì)胞的活性，與衰老條件無關(guān)-無論是否是在培養(yǎng)期間發(fā)生的細(xì)胞衰老(15歲供者)。-無論是否是依賴于細(xì)胞初始狀態(tài)并在培養(yǎng)期間持續(xù)的細(xì)胞衰老(62歲供者)，-或者是光誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。實(shí)施例4:三個蛋白酶體亞基20S、26S和PA28的各自純化在該實(shí)施例的框架中，20S、26S和PA28蛋白酶體4戈表亞基。將細(xì)胞的提取物在10000g下于4°C離心16小時，所述細(xì)胞在根據(jù)之前的實(shí)施例2定義的培養(yǎng)基中在對應(yīng)于正常生理細(xì)胞(15歲供者)和正常衰老細(xì)胞(62歲供者)的兩種生理狀態(tài)下培養(yǎng)。將沉淀溶解于Tris-HCl緩沖液(25mM，pH7。5)中，然后加載至CNBr瓊脂糖柱(其上植入待純化的針對人蛋白酶體的亞基的單克隆抗體)，其預(yù)先用Tris-HCl緩沖液(25mM,pH7.5)平衡。然后用相同緩沖液沖洗柱，再用含有2MNaCl(pH8)的Tris-HCl洗脫蛋白酶體亞基，并于4°C透析16小時(或加載至凝膠濾過柱(PDIOSephadex))。將純化的蛋白酶體亞基的樣品與變性上樣緩沖液(SDS0.1%)混合，然后于100。C孵育5分鐘。通過12%的丙烯酰胺凝J交電泳(SDS-PAGE)分離包含在洗脫液中的蛋白。于室溫下以80V的恒壓進(jìn)行30分鐘的遷移，然后在120V下進(jìn)行2小時。實(shí)施例5:在實(shí)施例2的三種培養(yǎng)條件下，通過測量三種蛋白酶體亞基(20S、26S、PA28)的活性來測量蛋白酶體活性蛋白酶體的肽酶活性通過使用由合成肽形成的底物來測量，所述合成肽的N末端被封閉，C末端通過異肽鍵連接到熒光基團(tuán)7-氨基-4-甲基-香豆素(MCA)上。這些與肽連接時無熒光性的基團(tuán)在蛋白酶剪切后的游離狀態(tài)下變得有熒光性。將混合物于37°C用肽底物以終體積200/xl孵育30分鐘，所述混合物含有代表實(shí)施例4的沉淀的50pg總蛋白勻漿，或者3/ig純化的蛋白酶體(在25mMTris-HCl中，pH7.5)。反應(yīng)由加入300pl諸如鹽酸的酸或乙醇來終止。加入2ml蒸餾水后，使用可商購的酶標(biāo)儀測量熒光，MCA的激發(fā)和發(fā)射波長為350/440m。蛋白酶體活性被測定為總活性，即在實(shí)-驗(yàn)開始時、加入底物之前測定的活性，與粗提取物的殘余活性，即在底物起反應(yīng)后和純化后的活性之間的差異?；钚砸源嬖谟诩?xì)胞提取物中的總蛋白的蛋白酶體/min/mg的ng來表示。正常生理狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者，傳代P2)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>生理衰老狀態(tài)下的結(jié)杲(62歲供者)20S蛋白酶體(nmol/min/m)26S蛋白酶體(nmol/min/mg)PA28蛋白酶體復(fù)合物(nmol/min/mg)底物7.3±0.752.7±4.0180,2±18.1底物+0.1%的產(chǎn)品B8.4±0.363.0±4.2198.0±10.5底物+0.5°/。的產(chǎn)品B9.6±1.469.4±5.6228.6±13.1底物+l。/。的產(chǎn)品B12.0±1.176.2±2.3264.2±18.4光誘導(dǎo)衰老狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者，UVB100mJ/cm2)20S蛋白酶體(nmol/miti/m)26S蛋白酶體(nmol/min/mg)PA28蛋白酶體復(fù)合物(nmol/min/mg)底物6.2±0.454.8±7.2195.7士21.底物+0.1%的產(chǎn)品B8,5±1.163.7±2.4227.1±17.4底物+0.5%的產(chǎn)品B11.4±1.770.2±3.5244.3±13.6底物+1%的產(chǎn)品B12.1±1.481.2±8.2269.3士11.8結(jié)果表明，三種蛋白酶體亞基在正常生理狀態(tài)下的活性大于在生理和光誘導(dǎo)衰老狀態(tài)下的活性。用產(chǎn)品B處理細(xì)胞導(dǎo)致衰老狀態(tài)下的三個蛋白酶體亞基的活性的重建?；謴?fù)活性以達(dá)到非衰老生理狀態(tài)下測定的總體水平。結(jié)果在圖2、3和4中具體給出，其代表圖2圖415歲供者62歲供者15歲供者+光誘導(dǎo)衰老狀態(tài)(UVB)上述三幅附圖示出樣品的萸光測量作為所采集的純化流份的函數(shù),實(shí)施例6:在實(shí)施例2的三種培養(yǎng)條件下，通過測定未水解的氧化蛋白的量來測量蛋白酶體的活性使用Oxyblot試劑盒(氧化保護(hù)檢測試劑盒，ChemiconInternational)進(jìn)行氧化蛋白的檢測。將角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)提取物，即在根據(jù)實(shí)施例2定義的酶消化之后獲得的細(xì)胞內(nèi)提取物，在產(chǎn)品B的存在下用2,4-二硝基苯肼處理15分鐘，然后用每孔沉積10/xg蛋白的量通過12。/。的丙蹄酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。隨后，將凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上(NitrocelluloseHybond)。形成的腙類用針對2,4-[a]二硝基苯基基團(tuán)(Sigma,RefD-9656)的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫檢測。為了檢測泛素化或被加合物4-羥基-2-丙烯醛修飾的蛋白，在12%的聚丙烯酰胺凝膠上沉積20)iig蛋白，并且使用針對泛素的多克隆抗體來顯影相應(yīng)的蛋白印跡。用與過氧化物酶偶聯(lián)的兔二抗進(jìn)行抗原-抗體復(fù)合物的檢測。用之前定義的產(chǎn)品A進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。正常生理狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)果表明，產(chǎn)品B導(dǎo)致15歲供者和62歲供者中氧化蛋白的量明顯減少。在用產(chǎn)品B進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的情況下效果更明顯。估計這些蛋白的量與單獨(dú)使用產(chǎn)品A的情況相比，能夠減少約12%至15%。實(shí)施例7:硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性的測量來自根據(jù)實(shí)施例2培養(yǎng)的用產(chǎn)品B處理或未處理(對照)的細(xì)胞的細(xì)胞提取物中的TrxR活性，通過在與石危氧還蛋白(Trx)反應(yīng)后釆用雙縮脲法測量TrxR濃度并與純化的TrxR的已知活性相比較來確定。將與50/ig蛋白相應(yīng)的體積的每一細(xì)胞提取物用HEPES、80mMpH7.5,0.9mg/mlNADPH、6mMEDTA、2mg/ml胰島素和10jiiM大腸桿菌的Trx的混合物于37°C以120/iL的終體積孵育20分鐘。反應(yīng)通過加入500/xL溶于鹽酸胍6M/Tris-Cl0.2M(pH8.0)中的DTNB(二硫代-雙-硝基苯曱酸)(0.4mg/ml)來終止。包含除Trx以外的每一物質(zhì)的對照樣品采用與各樣品相同的方式來孵育和處理。在412nm下測量吸光度，并且從樣品的吸光度值中減去相應(yīng)對照的值。使用來自純化的小牛胸腺的TrxR繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述小牛胸腺具有確定的比活度。將樣品的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，推斷出活性。用產(chǎn)品A進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)?；钚杂么嬖谟诩?xì)胞提取物中的總蛋白的TrxR/mg的ng來表示。正常生理狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在石克氧還蛋白還原酶抑制劑丙烯醛的存在下，正常生理狀態(tài)下的<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>丙烯醛(25/iM):培養(yǎng)基中丙稀醛的濃度。生理衰老狀態(tài)下的結(jié)果(62歲供者)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>應(yīng)當(dāng)注意，與不包含產(chǎn)品B的對照相比，如上定義的細(xì)胞提取物中產(chǎn)品B的存在增加了硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的活性。另外，TrxR的活性的增加與所添加的產(chǎn)品B的量成比例。使用產(chǎn)品B的活性大于單獨(dú)用產(chǎn)品A處理這樣的細(xì)胞提取物時的活性。光誘導(dǎo)衰老狀態(tài)下的結(jié)果a5歲供者，UVB100mJ/cn^下的培養(yǎng))<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在上述的應(yīng)用中得出了相同的結(jié)論。實(shí)施例8:硫氧還蛋白水平的測量來自根據(jù)實(shí)施例2培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞提取物中硫氧還蛋白的水平通過ELISA來測量，所述細(xì)胞用產(chǎn)品B或僅用產(chǎn)品A處理或未處理(對照)。用每孔100WpH9.6的碳酸鹽緩沖液中的抗Trx單克隆抗體2G11克隆(5jiig/ml;BDPharmingen)于4°C孵育96孔板16小時。用含有0.05。/。吐溫20的PBS(PBS-T)沖洗該板，并用200/xl含有3%BSA的PBS(PBS-BSA)封閉1小時。孔用PBS-T沖洗4次，并用100/xl含1mMDTT(二辟u蘇糖醇)的PBS-TB于4。C孵育樣品或標(biāo)準(zhǔn)Trx2小時以上，所述樣品或標(biāo)準(zhǔn)Trx以連續(xù)的方式稀釋。板用鋁箔覆蓋?？子肞BS-T沖洗4次，然后用75ng/ml羊抗人Trx(IMCOCo)的生物素化IgG100pi于室溫下在定軌搖床中孵育1小時。然后用PBS-T沖洗孔4次，并用100/xlPBS-BSA-T(0.1%BSA，0.05%吐溫20)中與堿性磷酸酶(AX02-0402X;1:4000)(AmershamBiosciences)結(jié)合的鏈霉親和素在定軌搖床中孵育。板在PBS-T中沖洗4次，并用pH9.0、含0.5mMMgCl2和0.02%NaN3的二乙醇胺中的磷酸對硝基苯酯(SigmaChemCo)孵育40分鐘。在405nm下測量吸光度。在范圍100ng/ml至0.41ng/ml中，使用人重組體Trx(IMCOCo)作為標(biāo)準(zhǔn)品。水平以存在于細(xì)胞提取物中的總蛋白的Trx/mg的ng來表示。正常生理狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在硫氧還蛋白抑制劑N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)的存在下，正常生理狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>生理衰老狀態(tài)下的結(jié)果(62歲供者)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>光誘導(dǎo)衰老狀態(tài)下的結(jié)果(15歲供者，UVB100mJ/cm2下的培養(yǎng))<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>在產(chǎn)品B存在下觀察到的硫氧還蛋白水平的增加高于單獨(dú)使用產(chǎn)品A獲得的增加。實(shí)施例9:由實(shí)施例2的應(yīng)激條件下培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的植物抗毒素的酶活性的測量鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶(FNR)的活性通過基于細(xì)胞色素C的還原的比色法測定。用分光光度計在550nm的波長下測量的細(xì)胞色素C的還原，與酶的活性直接成比例。pH7.5,25°C時，在鐵氧還蛋白和NADPH的存在下，一單元FNR每分鐘還原1毫摩爾的細(xì)胞色素C。超氧化物歧化酶(SOD)的活性通過其抑制由黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧負(fù)離子流的能力來評價。在560nm處，由該系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧自由基還原四唑氮藍(lán)(NBT)以穩(wěn)定藍(lán)色曱臜結(jié)晶物。SOD的酶單位與能夠在NBT的還原中誘導(dǎo)50%抑制的植物提取物的量對應(yīng)。谷胱甘肽還原酶將還原型谷胱甘肽再生為變得可被細(xì)胞利用的谷胱甘肽。結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權(quán)利要求1.化妝品活性成分，其包含阿魏酸精氨酸酯和微藻提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性成分，其特征在于，所述活性成分中的微藻提取物用植物抗毒素富集。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的活性成分，其特征在于，所述微藻屬于綠藻綱。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的活性成分，其特征在于，所述微藻屬于柵藻屬。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的活性成分，其特征在于，所述阿魏酸精氨酸酯與微藻提取物的重量比為1:1至1:199，優(yōu)選1:19至1:99。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的活性成分，其特征在于，所述阿魏酸精氨酸酯與微藻提取物的重量比為1:19。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的化妝品活性成分用于激活細(xì)胞的蛋白酶體的體外或離體的應(yīng)用。8.權(quán)利要求1-6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的化妝品活性成分用于刺激硫氧還蛋白產(chǎn)生的體外或離體的應(yīng)用。9.權(quán)利要求1-6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的化妝品活性成分用于制備局部使用的化妝品組合物的應(yīng)用。10.用于局部使用的化妝品組合物，其在生理學(xué)上可接受的介質(zhì)中包含權(quán)利要求1-6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的化妝品活性成分。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝品組合物用于抗皮膚衰老的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及由微藻提取物和阿魏酸精氨酸酯組成的新穎化妝品活性成分，其用于激活蛋白酶體和產(chǎn)生硫氧還蛋白的應(yīng)用，包含其的化妝品組合物以及這樣的化妝品組合物用于抗皮膚衰老的應(yīng)用。文檔編號A61Q19/08GK101410089SQ200780011381公開日2009年4月15日申請日期2007年3月27日優(yōu)先權(quán)日2006年3月27日發(fā)明者尼科萊·麥琪德徹申請人:碧歐特莫林簡易股份公司