專利名稱：：葎草花粉主要致敏蛋白的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及萚草花粉主要致敏蛋白的分離純化方法。
背景技術(shù)：
：花粉癥在世界各國的發(fā)病率從1%~25%不等[1],多項流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示花粉癥患者約占全世界總?cè)丝诘?0%~15%[2—5]，但我國目前尚無全國普通人群花粉癥發(fā)病率的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。30年前對局部地區(qū)少數(shù)普通人群做花粉癥流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率可達(dá)5%[6]。上世紀(jì)八十年代由葉世泰、喬秉善牽頭全國數(shù)十家醫(yī)院完成的中國氣傳致敏花粉調(diào)查顯示，很多地區(qū)夏秋季空氣中萚草花粉的含量僅次于蒿屬花粉[7]。1989-1992年，尹佳、葉世泰在對北京地區(qū)九種夏秋季花粉的臨床研究中證實萚草花粉是引起我國北方地區(qū)夏秋季花粉癥的重要原因[8],同時在國內(nèi)首次應(yīng)用鼠抗人IgE單克隆抗體建立了人血清萚草花粉特異性IgE的檢測方法，并在1995年美國變態(tài)反應(yīng)和臨床免疫學(xué)年會上向世界首次報告萚草花粉是中國北方地區(qū)夏秋季花粉癥的重要原因,。尹佳等近年對1120例夏秋季花粉癥患者發(fā)病情況研究顯示萚草花粉在我國夏秋季花粉癥患者中的陽性百分比高達(dá)66%(739/1120)，我國夏秋季花粉(蒿和蘀草花粉)誘發(fā)的過敏性鼻炎平均發(fā)病年齡為27歲，哮喘的平均發(fā)病年齡為32歲[11，12，13'14];而趙京等在北京地區(qū)13~14歲兒童呼吸道過敏性疾病流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)蒿屬花粉敏感者為5.7%,萚草花粉敏感者為4.2%[15];據(jù)此推測萚草花粉癥患者在我國普通人群中的比率應(yīng)超過5%,即約超過650萬人患有萚草花粉癥[11'12'13'14]。萚草是一年生纏繞草本植物，花期7-9月，果期9-10月，生于城巿與鄉(xiāng)村的溝邊、路旁、庭院附近及田野間、石礫質(zhì)沙地及灌叢間，生命力極強(qiáng)，為我國常見的雜草，除新疆、青海以外的各個省區(qū)均有分布，日本、朝鮮、俄羅斯也有分布。萚草花粉是我國夏秋季重要的致敏花粉，可誘發(fā)嚴(yán)重的夏秋季鼻炎、結(jié)膜炎和哮喘。在我國人群中，1534歲是夏秋季花粉誘發(fā)鼻炎的高發(fā)年齡段，2544歲是哮喘的高發(fā)年齡段，在全部夏秋季花粉癥患者中，37%在5年內(nèi)，47%在9年內(nèi)可發(fā)展為季節(jié)性哮喘，由于這部分患者由鼻炎發(fā)展至哮喘多集中在2554的青壯年階段，且其進(jìn)程需經(jīng)歷510年，因此在34歲以前，夏秋季花粉癥患者中單純鼻炎的比例較高；35歲以后哮喘的比例增高，但也有18%的患者鼻炎和哮喘在同一年首次發(fā)作，部分患者因夏秋季花粉誘發(fā)的哮喘癥狀非常嚴(yán)重，在其誘發(fā)的季節(jié)性哮喘患者中，77.9%需口服平喘藥物；77.7%夜間不能平臥；30.4%需要急診輸入氨茶堿或糖皮質(zhì)激素類藥物治療[11'12]。近一半的夏秋季花粉癥患者有可能在首次發(fā)病的9年內(nèi)發(fā)展為季節(jié)性過敏性哮喘是一個不容忽視的臨床問題。夏秋季花粉過敏性鼻炎和過敏性哮喘發(fā)病的高峰年齡正值人生精力充沛、為社會創(chuàng)造財富的階段，因此，尋求阻止和干預(yù)夏秋季花粉過敏性鼻炎向哮喘發(fā)展的時機(jī)與方法非常重要。世界衛(wèi)生組織在關(guān)于過敏性疾病免疫治療的指導(dǎo)性文件中指出，特異性免疫治療是目前唯一能夠阻止過敏性疾病自然進(jìn)程的治療方法。因此，對夏秋季花粉誘發(fā)的嚴(yán)重過敏性鼻炎患者應(yīng)盡早開始特異性免疫治療，防止其發(fā)展為哮喘；對已有哮喘的患者，更應(yīng)積極進(jìn)行特異性免疫治療，防止哮喘進(jìn)一步加重。萚草花粉過敏原診斷和治療制劑是診斷和治療因萚草花粉誘發(fā)的鼻炎和哮喘的關(guān)鍵藥劑，而在生產(chǎn)和應(yīng)用此藥劑過程中需確保每一批產(chǎn)品生物效價一致、主要致敏蛋白含量一致，因此，花粉主要致敏蛋白是制定標(biāo)準(zhǔn)化制劑的核心之一。主要致敏蛋白還是未來人工合成花粉診斷和治療制劑的核心。獲得用主要致敏蛋白制備的單克隆抗體，將可檢測藥物和生物制劑中萚草花粉主要致敏蛋白含量，確定藥物劑量和濃度。目前對萚草花粉致敏蛋白的研究很有限。孫秀珍等[^釆用SDS-PAGE、免疫印跡等方法分析萚草花粉致敏蛋白，發(fā)現(xiàn)在含有的至少10種蛋白成分中有5種致敏蛋白，分子量分別為8.0、28.8、35.1、42.0、55.0、65.0、76.2、100.5kDa，其中8.0kDa的蛋白能與84.6%萚草花粉過敏哮喘患者血清中slgE結(jié)合，是主要致敏蛋白，而11.8~23kDa的蛋白雖然含量占優(yōu)勢但此分子量范圍的蛋白既無變應(yīng)原性也無免疫活性，與哮喘和皮試陽性反應(yīng)的關(guān)系不大。ParkJW問等發(fā)現(xiàn)萚草花粉含有10、16、20、29、42kDa的5種致敏蛋白成分；其中10kDa的蛋白質(zhì)可能是主要致敏蛋白(與萚草花粉過敏病人血清slgE的陽性結(jié)合率為72%)，對10kDa致敏蛋白的N端氨基酸序列分析未發(fā)現(xiàn)其與目前所鑒定的致敏蛋白存在同源性，其等電點大致為p15.1。而韓國另一位學(xué)者ParkHS同研究顯示，13、70、80kDa蛋白是萚草花粉的主要致敏蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供萚草花粉的主要致敏蛋白的分離純化方法。本發(fā)明的蛋白是從萚草花粉中分離純化得到，能與89%以上萚草花粉過敏病人血清特異性IgE結(jié)合，通過SDS-PAGE測定其表觀分子量約為12kDa，等電聚焦實驗測定其pl=4.7,N端序列分析表明其N端序列為NH/-MDNPFENGMKA-COCT。本發(fā)明以萚草花粉作為原材料，制備蛋白粗提液，經(jīng)SDS-PAGE電泳及免疫印跡實驗表明12kDa處的蛋白為萚草花粉主要致敏蛋白，其與萚草花粉過敏病人血清sIgE的陽性反應(yīng)率達(dá)到89%。將制備的粗提液通過凝膠分子排阻層析收集得到10~38kDa分子量區(qū)域的蛋白，最后通過陰離子交換層析得到4個洗脫峰，經(jīng)電泳分析表明，第四個洗脫峰蛋白分子量為12kDa,—系列體外免疫學(xué)實驗表明其確為萚草花粉主要致敏蛋白。進(jìn)一步對收集得到的主要致敏蛋白進(jìn)行N末端序列分析，其N端氨基酸序列為NH/-MDNPFENGMKA-COCT,經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)相同蛋白，表明所獲得的蛋白為一個新蛋白，現(xiàn)將該蛋白命名為Humsl。具體地說，本發(fā)明分離純化萚草主要致敏蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟1)制備萚草花粉蛋白粗提液；2)凝膠分子排阻層析；3)強(qiáng)陰離子交換層析。其中步驟l)是以萚草花粉為原料，將萚草花粉脫脂后，用PBS緩沖液提取，離心得上清，經(jīng)鹽析、復(fù)溶、除鹽、濃縮得萚草花粉蛋白粗體液。其中步驟2)的凝膠分子排阻層析的層析柱的填充材料可以為聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，本方法釆用的是Amersham的Sephacryl100預(yù)裝柱，可以用pH7.2的0.05MPBS上柱和洗脫，收集保留體積為87.25±0.65ml的洗脫峰。其中步驟3)強(qiáng)陰離子交換層析的層析柱的填充材料可以為瓊脂糖凝膠，本方法釆用的是Amersham的HiTrapQSepharoseFF預(yù)裝柱，具體方法是將凝膠分子排阻層析的收集液經(jīng)預(yù)處理后加入到平衡后的所述強(qiáng)陰離子交換層析柱中，用含0~0.1MNaCl濃度梯度的pH7.0的0.02MBisTris-HCl進(jìn)行線性梯度洗柱，再用0.1MNaCl的pH7.0的0.02MBisTris-HCl恒定洗柱，最后用0.1-0.2MNaCl的pH7.0的0.02MBisTris-HCl洗脫，收集洗脫峰。本發(fā)明還進(jìn)一步將獲得的蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，最后篩選得到能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。通過上述得到的單克隆抗體，還可以進(jìn)一步構(gòu)建免疫檢測試劑備.pTT-。萚草花粉變應(yīng)原制劑的標(biāo)準(zhǔn)化是以對其中致敏蛋白組分分子水平的深入認(rèn)識為前提，萚草花粉主要致敏蛋白的分離純化為其變應(yīng)原制劑標(biāo)準(zhǔn)化的實現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)，其用途和意義表現(xiàn)在如下幾個方面1)以此作為天然標(biāo)準(zhǔn)品，用于萚草花粉變應(yīng)原制劑標(biāo)準(zhǔn)化中主要致敏蛋白定量方法的建立，從而有利于萚草花粉變應(yīng)原制劑中主要致敏蛋白的定量標(biāo)示，并將主要致敏蛋白的含量作為一個重要參數(shù)衡量各批次變應(yīng)原制劑間的差異；2)將此主要致敏蛋白作為萚草花粉癥特異性診斷的生物標(biāo)記物，并以此開發(fā)相應(yīng)的體內(nèi)/體外特異性診斷用試劑盒，包括被用于變應(yīng)原蛋白芯片檢測技術(shù)；3)用于三維結(jié)構(gòu)的分析和抗原決定簇的測定；4)有利于具有相同致敏性或低致敏性的重組主要致敏蛋白的獲得。圖1是28例萚草花粉陽性血清對萚草花粉粗提液的免疫印跡結(jié)果，其中1~28是28例患者血清各自的免疫印跡條帶，a為來源于28例陽性血清的混合血清,b為健康志愿者血清對照，c為空白對照，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上至下分別為97.0,66.0,45.0,30,0,20.1,14.4kDa;圖2是凝膠分子排阻層析中目標(biāo)收集組分的SDS-PAGE圖，圖中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為萚草花粉粗提液，2為經(jīng)鹽析處理后的萚草花粉粗提液，3凝膠分子排阻層析目標(biāo)組分收集液；圖3是用HiTmpQFF分離純化獲得的第一步和第二步收集液的SDS-PAGE圖，圖中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1~3為第一步收集液，4為第二步收集液；圖4是等電聚焦電泳圖，S-100為凝膠分子排阻層析目標(biāo)收集組分(重復(fù)兩次)，A為主要致敏蛋白；圖5是等電點Mr的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6是交叉反應(yīng)檢測結(jié)果。具體實施例方式下面實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例l萚草花粉主要致敏蛋白的確定1、萚草花粉癥患者血清和健康志愿者血清的釆集對萚草花粉癥患者血清和健康志愿者血清的釆集均有嚴(yán)格的入選標(biāo)準(zhǔn)。本研究共采集到28例萚草花粉癥患者血清，患者入選標(biāo)準(zhǔn)如下l)典型的夏秋季花粉過敏病史季節(jié)性鼻炎、眼結(jié)膜炎和(或)支氣管哮喘，夏秋季節(jié)(7-10月)發(fā)病；2)萚草花粉浸液皮內(nèi)試驗2++同時PharmaciaCAPsystemRASTFEIA檢測萚草花粉slgE^II級(0.70kU/l)。同時本研究共釆集到IO例健康志愿者的血清，入選標(biāo)準(zhǔn)為無過敏性疾病史(包括藥物、食物過敏以及過敏性鼻炎、支氣管哮喘以及其它過敏性疾病)，大籽蒿、萚草、PP(夏秋季混合花粉，含灰藜、大麻、向日葵和蒼耳花粉)皮內(nèi)試驗均陰性，血常規(guī)嗜酸粒細(xì)胞及血清總IgE正常，男性6例，女性4例，年齡22~45歲，平均年齡(32土4)歲。本研究中所有涉及人體血清的體外免疫學(xué)實驗均釆用以上所述的萚草花粉癥患者血清和健康志愿者血清。2、萚草花粉蛋白鹽析粗提液制備用0.01MPBS緩沖液(pH8.0)以l:20(質(zhì)量/體積，w/v)比例于4。C24hr提取丙酮脫脂干燥的萚草花粉，粗提液經(jīng)濃縮達(dá)到至少lmg/ml時用80%飽和度硫酸銨沉淀蛋白，后將沉淀的蛋白復(fù)溶于0.01MPBS緩沖液(pH8.0)中，經(jīng)10000gxl0min離心取上清液，得到萚草花粉蛋白鹽析粗提液。3、主要致敏蛋白的確定(采用免疫印跡方法)將上述制得的萚草花粉蛋白鹽析粗提液經(jīng)SDS-PAGE制備膠分離，方法參照Laemmli法進(jìn)行。將蛋白樣品與樣品緩沖液(2x)按1:1比例混合，10(TC煮5min,后10000gx5min離心取上清上樣。應(yīng)用15%分離膠，5%濃縮膠(根據(jù)《分子克隆》上配方)對樣品進(jìn)行分離(DYCZ-23A型垂直電泳槽，北京市六一儀器廠)。起始電壓80V，待溴酚蘭前沿進(jìn)入分離膠后將電壓升至150V,恒壓電泳，直至溴酚蘭前沿到達(dá)凝膠下邊界，停止電泳。取下凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)印。應(yīng)用DYCP-40C型轉(zhuǎn)移槽(北京巿六一儀器廠)Towbinbuffer(25mMTris,192mM甘氨酸，20%甲醇，pH8.3),恒流轉(zhuǎn)印90min(恒流值=膠面積(cm2)xl.2mA),將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(孔徑0.45|im，MILLIPORE,U.S.A)。將PVDF膜放入盛有封閉液(5。/。BSA/PBS-T)的平皿中4°C過夜封閉。將封閉后的PVDF膜切成3mm寬的小條分別與不同患者血清反應(yīng)(第一抗體與抗原結(jié)合)，溫育血清用PBS-T作L3稀釋，室溫置搖床過夜溫育。一抗溫育結(jié)東后用洗滌液(PBS-T)洗滌3x5min，后進(jìn)行與辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗人IgE抗體(二抗)的溫育，室溫3hr，二抗稀釋度1:1000(PBS-T作稀釋液)。膜二抗溫育結(jié)東后用PBS-T進(jìn)行洗滌3x5min,進(jìn)行DAB底物顯色，待蛋白帶顯色清晰即可用蒸餾水漂洗，終止反應(yīng)。免疫印跡結(jié)果如圖l所示。圖中1~28為28例患者血清各自的免疫印跡條帶，a為來源于28例陽性血清的混合血清，b為健康志愿者血清對照，c為空白對照，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。從上圖結(jié)果可看到12kDa位置蛋白為主要致敏蛋白，陽性反應(yīng)率達(dá)到89%。實施例2主要致敏蛋白的分離純化1、凝膠分子排阻層析層析系統(tǒng)AKTAPurifierlO(Amersham公司)層析柱Sephacry1100預(yù)裝柱(Amersham公司)柱體積120ml長度x直徑60cmxl6mm分離范圍10-lOOkDa1)樣品制備a、將新鮮釆集的萚草花粉用丙酮脫脂,干燥。b、4。C條件下用0.01MPBS(pH8.0)磁力溫和攪拌提取(1/20w/v)24hr。c、10000gx30min進(jìn)行離心(4。C)得到上清液。d、將上清液濃縮至蛋白濃度至少lmg/ml時進(jìn)行80%飽和度的硫酸銨鹽析沉淀，5000gx30min離心處理，棄去上清后將沉淀蛋白復(fù)溶于0.01MPBS(pH8.0)緩沖液中，并用該緩沖液進(jìn)行2d(4°C)的透析處理以去掉其中的硫酸銨，后濃縮使蛋白濃度達(dá)到12mg/ml左右。2)平衡液和洗脫液0.05MPBS(pH7.2)洗脫條件V上樣量lml，流速0.5ml/min目標(biāo)組分是平均保留體積為87.25±0.65ml的洗脫峰，該組分包含了1038kDa范圍的蛋白。該分離步驟有很好的重復(fù)性。蛋白電泳圖譜如圖2所示。2、陰離子交換層析層析系統(tǒng)AKTAPurifierlO(Amersham公司)層析柱HiTrapQFF(Amersham公司)(CV=lml)緩沖系統(tǒng)0.02MBisTris-HCl(pH7.0)(柱平衡緩沖液A,startingbuffer)0.02MBisTris-HCl(pH7.0)+2MNaCl(最大濃度洗脫緩沖液B，dutionbuffer)分離過程將凝膠分子排阻色譜分離得到的目標(biāo)組分收集液經(jīng)蒸餾水透析并濃縮處理后用A緩沖液作5~10倍稀釋以調(diào)整該蛋白溶液的pH值達(dá)到7.0,經(jīng)lOOOOgxlOmin離心后將上清液加入到用A緩沖液平衡好的陰離子交換柱HiTrapQFF中，用含00.1MNaCl濃度梯度的A緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫15ml,再以O(shè).lMNaCl濃度恒定洗脫15ml，接著用含0.10.2MNaCl濃度梯度的A緩沖液進(jìn)行20ml的線性梯度洗脫。其中流速設(shè)定為lml/min。分離結(jié)果在00.1MNaCl濃度范圍的線性梯度洗脫階段(洗脫體積15ml)及隨后的O.lMNaCl恒定濃度洗脫階段(洗脫體積15ml)先后出了三個峰，這三個峰都未達(dá)到基線分離，l為主峰，2、3為連續(xù)的兩個小肩峰。在0.1~0.2MNaCl濃度范圍的線性梯度洗脫階段(洗脫體積20ml)出了一個不尖銳的單峰，被標(biāo)記為4。其中4為主要致敏蛋白的洗脫峰。1、2、3、4各收集組分的電泳圖譜如圖3所示。通過ImageQuantTLv2003.03軟件分析得到該蛋白的分子量為12kDa。將該組分作ELISA分析，發(fā)現(xiàn)其與實施例1中12kDa蛋白的免疫學(xué)實驗結(jié)果一致。說明分離獲得的確為萚草花粉主要致敏蛋白，該蛋白的N端氨基酸序列為NH/-MDNPFENGMKA-COO.，經(jīng)檢索未發(fā)現(xiàn)相同蛋白，因此該蛋白為一個新蛋白。通過IEF(等電聚焦電泳，如圖4所示)分析該蛋白的等電點，由等電點Mr得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖5所示)Y=3.5578x-11.736R2=0.9971表l等電點Mr的pl值及相應(yīng)的遷移距離記錄pi3.754.555.25.856.556.857.358.158.458.659.3d(cm)1.54.76.4911.513.314.716.71819.221.5根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)純化致敏蛋白的等電點:d=5cm,pi=4.7實施例3萚草花粉主要致敏蛋白的單抗制備具體操作參照巴德年主編的《當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用》中第十一章雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體制備。操作過程簡述如下1)免疫動物取3只6周齡的雌性健康BALB/c小鼠同時免疫。第一次免疫每只小鼠注射1015pg抗原。將弗氏完全佐劑與抗原100pl等體積混合，用微量攪拌器充分混勻，腹腔注射。2)2-4周后進(jìn)行第二次免疫，也稱加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫的抗原量減半，并改用弗氏不完全佐劑，但注射體積和方法不變。加強(qiáng)免疫共行4次，直至血清效價達(dá)到要求。符合要求的免疫小鼠在細(xì)胞融合前至少應(yīng)休息一個月，使血清效價有所下降。3)融合前3天進(jìn)行最后一次沖擊免疫，用PBS150pl溶解抗原50ng，經(jīng)小鼠尾靜脈注射。4)免疫效果檢測免疫2~3次后從眼眶取血檢測血清效價。用加樣器吸取血漿2~5pl,用PBS稀釋至100倍，1000倍，2000倍，4000倍。檢測方法采用ELISA。5)細(xì)胞融合分別收集骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞移至一個50ml離心管中，加入一些不含血清的培養(yǎng)基，離心，吸取上清后放在掌心搖動使細(xì)胞團(tuán)成松散的糊狀。將離心管置于37匸水浴中，吸取lml50。/。的PEG溶液，慢慢加入細(xì)胞中，邊加邊攪拌，lmin加完。靜置lmin再吸取預(yù)先準(zhǔn)備好的10ml不含血清的培養(yǎng)基，緩慢加入，以稀釋PEG,減少毒性作用。邊加邊緩慢攪拌，先慢后快，前2min加入2ml，后2min加入剩余的培養(yǎng)基。離心，吸去上清。將細(xì)胞團(tuán)搖散，加入少量的新鮮IMDM培養(yǎng)基。6)將融合細(xì)胞進(jìn)行接種和選擇性培養(yǎng)，融合成功的細(xì)胞可在HAT選擇性培養(yǎng)基中長期存活，其余未雜交細(xì)胞都將死亡。7)雜交瘤細(xì)胞的檢測通過ELISA和免疫印跡的方法將那些能夠分泌目的抗體的雜交瘤細(xì)胞檢測出來。吸取細(xì)胞液體培養(yǎng)基上清進(jìn)行檢測。8)陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)將陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)，釆用半固體培養(yǎng)基法。9)雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)增與凍存將克隆化培養(yǎng)后的陽性雜交瘤細(xì)胞需及時凍存以防止這些細(xì)胞的染色體丟失，發(fā)生變異。擴(kuò)增培養(yǎng)用含10%胎牛血清的普通完全培養(yǎng)基，凍存采用含10%DMSO的普通完全培養(yǎng)基。10)單克隆抗體性質(zhì)的鑒定鑒定內(nèi)容包括親和常數(shù)、特異性(交叉反應(yīng)性)、免疫球蛋白的類型及亞類。11)單克隆抗體的生產(chǎn)將雜交瘤細(xì)胞接種至小鼠腹腔制備腹水，再用腹水分離純化IgG抗體。單抗特異性分析目的旨在檢測抗體是否還與目的抗原之外的其他抗原起反應(yīng)，這是單抗最重要的指標(biāo)。測定方法釆用ELISA(固相酶聯(lián)免疫測定)法，將如下三種抗原進(jìn)行平行包被萚草花粉主要致敏蛋白Hums1，大籽蒿花粉變應(yīng)原浸液，灰藜花粉變應(yīng)原浸液，包被蛋白濃度均為5pg/ml,將獲得的每株單克隆抗體同時與三種包被抗原反應(yīng)，如果某株單克隆抗體與兩種或兩種以上的包被抗原有反應(yīng)，說明該株單克隆抗體具有交叉反應(yīng)性(即除了能與萚草花粉主要致敏蛋白Hums1結(jié)合外還能與大籽蒿花粉和/或灰藜花粉中的某些抗原結(jié)合)，本分析方法的目的旨在篩選出具有高特異性的單克隆抗體(即只與萚草花粉主要致敏蛋白Hums1結(jié)合的抗體)，因此棄用具有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體，實驗結(jié)果如圖6顯示。圖6中每排并列三個孔為一組，從左至右分別包被萚草花粉主要致敏蛋白Humsl,大籽蒿花粉變應(yīng)原浸液，灰藜花粉變應(yīng)原浸液，每組代表不同株單抗同時與包被的三種抗原反應(yīng)，并排三個孔中有兩個或兩個以上孔呈色的表明該株單克隆抗體有交叉反應(yīng)，棄用，最終獲得8株只與萚草花粉主要致敏蛋白Hums1反應(yīng)的抗體。同時，通過免疫印跡的方法分析了通過上述方法篩查出的8株抗體是否在萚草花粉變應(yīng)原浸液所包含的所有抗原中僅與主要致敏蛋白Hums1結(jié)合，方法如下1.跑萚草花粉變應(yīng)原浸液的SDS-PAGE制備電泳；2.將蛋白半干轉(zhuǎn)印到PVDF膜上并用5呢BSA-PBST進(jìn)行封閉；3.將膜切成3mm寬的小條后與各株單克隆抗體進(jìn)行一抗反應(yīng)；4.一抗反應(yīng)結(jié)東后對膜進(jìn)行洗滌再與辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠IgG多克隆抗體進(jìn)行二抗反應(yīng)，最后進(jìn)行DAB顯色。方法的具體操作可參照萚草花粉主要致敏蛋白的確定中釆用的免疫印跡方法。結(jié)果表明這8株單克隆抗體僅與萚草花粉中的Hums1結(jié)合。親和常數(shù)的測定親和常數(shù)(Ka)反映的是抗體與抗原結(jié)合的能力。在特定的條件下，對于特定的抗原抗體系統(tǒng)，Ka是固有的，該值越大反應(yīng)達(dá)到平衡越快，且達(dá)到平衡時抗原抗體復(fù)合物的相對濃度越大，能產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物所需的抗原量也越少，即親和力高的抗體用于臨床檢驗時反應(yīng)快，用量少，靈敏度高。對萚草花粉主要致敏蛋白Hums1單克隆抗體親和常數(shù)的測定釆用稀釋抗體法粗略估計親和常數(shù)，具體操作如下1.將萚草花粉主要致敏蛋白Hums1進(jìn)行包被，包被濃度為5|xg/ml;2.將提純的各株抗體做系列稀釋；3.各株抗體均取不同濃度的抗體lOOpl與包被抗原反應(yīng)，隨著抗體量的下降，結(jié)合率不斷下降，各株抗體均可測得一組吸收值；4.以反應(yīng)孔吸收值為縱坐標(biāo)抗體濃度為橫坐標(biāo)作圖，從圖中找出結(jié)合率從最高點下降50%時相對應(yīng)的抗體濃度。這一濃度的倒數(shù)即為抗體親和常數(shù)。由此得到8株單克隆抗體的親和常數(shù)，具體數(shù)值見表，其中有兩株抗體親和常數(shù)的數(shù)量級達(dá)到109,四株抗體親和常數(shù)的數(shù)量級達(dá)到108,另兩株抗體親和常數(shù)的數(shù)量級為107。單克隆抗體的免疫球蛋白(Ig)類型和亞類鑒定鑒定單克隆抗體Ig類型和亞類釆用免疫雙擴(kuò)散法，具體操作如下1.以磷酸鹽溶液配制1%瓊脂糖溶液，趁熱倒入直徑35mm的小平皿中，凝結(jié)后打孔，中間一個，周圍6個。2.取雜交瘤培養(yǎng)上清液lml加入硫酸銨03g沉淀抗體，10000r/min離心5min吸去上清，加入50^1磷酸鹽溶液，溶解沉淀物。3.取10~15^1加入中央孔中，周邊孔分別加入抗不同Ig類或亞類的抗體10-15W，4。C保濕放置24hr以上，出現(xiàn)沉淀線者為陽性反應(yīng)，表明這種抗體屬于對應(yīng)的Ig類或亞類。結(jié)果表明篩選出的8株單克隆抗體均為IgG，其中有5株抗體的亞類為IgGl。上述實驗方法均是參照巴德年主編的《當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用》中第十一章雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體制備進(jìn)行。通過上述方法共得到了8株理想的雜交瘤細(xì)胞，如表2所示，這些雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的單克隆抗體均可用于構(gòu)建免疫檢測試劑盒，從而用于檢測藥物和生物制劑中萚草花粉主要致敏蛋白含量，確定藥物劑量和濃度。表28株抗體的類型或亞類及相對親和力常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>參考文獻(xiàn)1、Natahn,R,A"'Meltzer，E.O.,Selner，J.C.,Storms,W."PrevalenceofAllergicRhinitisintheUnitedStates."Jowr"flZo/_A〃ergy朋cfC7/w/cfl〃mmimo/ogy(1997)99:S808-14.2、PucM.Characterisationofpollenallergens.AnnAgricEnviroMed2003;10:143-149.3、FlemingDM,CrombieDL.PrevalenceofasthmaandhayfeverinEnglandandWales.BMJ1987;294:279-83.4、SibbaldB.Epidemiologyofallergicrhinitis.In:BurrM，ed.Mowograp/6>印z'(ie/m'oZogy。/a〃erg/cd/seflse.Basel:SKarger,1993:61-79.5、SibbaldB，StrachanDP.Epidemiologyofrhinitis.In:BusseWW,HolgateST,eds.Asf/wwflwdWu'wto.Oxford:BlackwellScientific,1995:32-43.6、張慶松，顧瑞金主編，臨床變態(tài)反應(yīng)學(xué)上海上海科技出版社，1989,110-125。7、葉世泰等。中國氣傳致敏花粉調(diào)查。北京北京出版社，1988,45-148。8、尹佳，葉世泰，顧瑞金等，北京地區(qū)夏秋花粉癥主要致敏花粉的研究。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志.1996,16(增刊1):31-35。9、尹佳，葉世泰，鄒明發(fā)等。用McAb及ELISA法測定人血清萚草花粉特異性IgE。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報。1998:20卷148-153。10、YinJ,etal.AnimportantallergenicpolleninChina:Humulus.JAllergyClinImmuno,1995.95:16.11、尹佳，岳鳳敏，王良錄等，夏秋季花粉癥患者合并過敏性鼻炎和過敏性哮喘關(guān)系的情況及其相互關(guān)系研究。中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85卷1683-1687。12、尹佳，岳鳳敏，王良錄等，夏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