專利名稱：：新的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蟾蜍二烯內(nèi)酯類的新化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及包含該化合物的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物或者藥物組合物。本發(fā)明還涉及該類化合物的制備方法以及在抑制腫瘤細(xì)胞方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蟾蜍屬動物有250多種，分布于世界各地。我國有近10種，主要分布的3種分別是大蟾蜍華西亞禾中(5w/o^/oa"c^ww'Schmidt)、大蟾蜍中華亞種(5w/ogwgar/加附Cantor)以及黑眶蟾蜍C8"/0we/a"cw故^Schneider)。蟾蜍之名首載于《名醫(yī)別錄》，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就載有"蝦蟆"的性味與主治?！侗静菝审堋?味辛、氣涼、微毒"，《本草再新》入心、肝、脾、肺四經(jīng)。古今驗方廣泛應(yīng)用蟾蜍拔毒消腫、定痛殺蟲、強心利尿。以蟾蜍為基原的常用中藥材有蟾酥、蟾皮、干蟾，其化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，按溶解性可分為脂溶性甾族類(蟾毒配基類、蟾蜍毒素類)、水溶性吲哚生物堿類。蟾毒配基屬乙型強心甾族類化合物，在Cn上接有一個A-吡喃酮基，又名蟾蜍二烯類酯(Bufodienolide),主要存在于蟾蜍耳后腺及皮膚腺的分泌物中，現(xiàn)已知有20余種，例如蟾毒靈(bufalin)、日蟾毒它靈(gamabufotalin)、蟾毒它靈(bufotalin)、華蟾毒精(cinobufagin)、脂蟾毒酉己基(resibufogenin)等。蟾蜍毒素由蟾毒配基的C3-羥基與辛二酰、琥珀酰、己二酰、庚二酰精氨酸分別結(jié)合成酯及硫酸酯類化合物，易分解為蟾毒配基。根據(jù)蟾毒配基不同可分為13類。江成亮、竺葉青，蟾蜍抗腫瘤作用研究進(jìn)展，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000.12(1),6772。例如蟾毒它靈-3-丁二酰精氨酸酯、蟾毒靈-3-丁二酰精氨酸酯、華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯、Cinobufotalitoxin等。CinobufotalitoxinStudiesonCardiotonicSteroidsfromtheSkinofJapaneseToads.Shimada，K.，F(xiàn)ujii，Y.，Yamashita，E.，etal.Chemical&PharmaceuticalBulletin,1977.25(4)，714-730結(jié)構(gòu)式如下oNHBBGK-A-EwM95-C03義MolecularFormula=C^H^NPu^J丄C)/\eH2NFormulaWeight=770.90872現(xiàn)已有蟾酥鎮(zhèn)痛膏、蟾酥注射液、華蟾素注射液和復(fù)方蟾皮膠囊等制劑應(yīng)用于臨床抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、利水消腫、增強機(jī)體免疫力。蟾蜍制劑在臨床上用于腫瘤的輔助治療具有標(biāo)本兼治的優(yōu)點，能夠顯著抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移、提高機(jī)體免疫力，與化療藥物相比，具有能夠減輕腫瘤患者痛苦，顯著改善生活質(zhì)量，延長生命周期的特點，同時也能夠與化療藥物聯(lián)合使用增強療效。然而，目前的蟾蜍制劑，都是以粗提取物入藥，成分極為復(fù)雜，除含有蟾毒配基、蟾蜍毒素、吲哚類生物堿(如5-羥色胺，蟾蜍色胺、蟾蜍噻嚀等)夕卜，還含有氨基酸、還原糖、甾類、肽類等多種類型的化學(xué)成分。因此，在臨床使用中，蟾蜍制劑具有以下兩個主要缺點①對腫瘤細(xì)胞的殺傷率低，②出現(xiàn)過敏反應(yīng)，血管刺激癥狀，消化道和心臟毒性等不良反應(yīng)的發(fā)生率高，這都是由于未能去除無效、不良反應(yīng)成分，未能對真正的有效的成份進(jìn)行控制造成的。鑒于以上原因，本發(fā)明人經(jīng)過深入研究，從蟾蜍中提取分離得到了一種新的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物，經(jīng)過體外試驗證明其具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞的作用。并且本發(fā)明人還提供了化合物和蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物適于工業(yè)化生產(chǎn)的提取分離方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種新的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其結(jié)構(gòu)式如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>或R2為CHO或CH3;R3為OH或H;R4為OH，Rs為H;或者R4和R5為-0-R6為H或OAc。所說的化合物具體為-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本發(fā)明所說的鹽是指藥學(xué)上可接受的鹽，例如與鹽酸、硫酸、磷酸等酸形成的鹽，或者與氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿形成的鹽。本發(fā)明還提供了一種含有該化合物或其鹽的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，其中蟾蜍總二烯內(nèi)酯的重量百分含量為30-100%，優(yōu)選為50-100%，更優(yōu)選為90%—100%。本發(fā)明提供了蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的提取方法干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的乙醇洗脫，再用高濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，干燥或精制即得蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物。本發(fā)明所說的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的提取方法優(yōu)選為干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的乙醇洗脫，再用高濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，先以乙酸乙酯萃取，再以正丁醇萃取，收集正丁醇萃取部分，減壓回收溶劑，干燥即得。本發(fā)明所說的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的提取方法更優(yōu)選為干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的乙醇洗脫，再用高濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，上硅膠色譜柱，以氯仿-甲醇梯度洗脫，收集相應(yīng)留份，回收溶劑，干燥即得。其中所說的低濃度乙醇是指10-50%的乙醇，優(yōu)選為30-40%;所說的高濃度乙醇是指60-100%的乙醇，優(yōu)選為70-100%。其中所說的大孔樹脂可以選擇非極性或者極性大孔樹脂，所說的非極性大孔樹脂可以選自HPD-IOO、700，AB-8，DlOl，X-5，D4020等;極性大孔樹脂可以選自HPD400、450、600、HPD800，S-8，NAK-9等。其中優(yōu)選HPD-IOO、AB-8。本發(fā)明還提供了蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的制備方法取蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，上硅膠色譜柱，用氯仿-甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，然后經(jīng)HPLC精制，即得。所述化合物具體制備方法為取蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，上硅膠色譜柱，用氯仿-甲醇-水(CHCl3-MeOH5:l—CHClrMeOH-H2010:3:1—7:3:1—6:4:1—MeOH)進(jìn)行梯度洗脫，分為16個部分(F腦tionl-16);Franction2回收溶劑，所得固體為化合物I粗品，粗品上HPLC(RpC-18色譜柱)精制收集其中主要的色譜峰，回收溶劑，得到化合物I;Franctionl2上0DS柱，以水-甲醇梯度洗脫，得到17個流份(SubFrH7);上述SubFrl4經(jīng)HPLC(RpC-18色譜柱)分離，得到化合物II及化合物III;上述SubFrl2經(jīng)HPLC(RpC-18色譜柱)分離，得到化合物IV;Franctionl4上0DS柱，以水-甲醇梯度洗脫，得到15個流份(SubFrl-15);上述SubFrl4經(jīng)HPLC(RpC-18色譜柱)分離，收集得到化合物V。本發(fā)明還提供了該化合物和蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，以及在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的化合物或含有該化合物的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物可以口服或非口服形式給藥，單元劑量0.01-200mg，優(yōu)選為0.05-100mg，更優(yōu)選為0.l-20mg。經(jīng)口服給藥時，可以與常規(guī)的藥用輔料如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、包衣劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊、軟膠囊、片劑、滴丸或乳劑等形式給藥。非口服形式給藥時，可以制備成注射液、凍干粉針劑、輸液劑等。具體實施例方式以下實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例一蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備取蟾皮10kg用95%的乙醇提取2次，用醇量為8倍，每次提取的時間為60分鐘，合并濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上D101大孔樹脂柱(天津南開大學(xué)化工廠生產(chǎn))，先用水洗脫，再用50%乙醇洗脫，再用95%的乙醇洗脫，收集后者，減壓回收溶劑，干燥得到蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物49g，總二烯內(nèi)酯的含量為32.1%。實施例二蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備取干燥蟾皮10kg用80。/。的乙醇提取4次，用醇量為9倍，每次提取的時間為120分鐘，合并濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上AB-8大孔樹脂柱(天津南開大學(xué)化工廠生產(chǎn))，先用水洗脫，再用30%乙醇洗脫，再用80%的乙醇洗脫，收集后者，減壓回收溶劑，水溶液先以乙酸乙酯等量萃取2次，水層再以等量正丁醇萃取3次，正丁醇層減壓回收溶劑，干燥得到蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物26g，總二烯內(nèi)酯的含量為60.3%。實施例三蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備取干燥蟾皮10kg用95。/。的乙醇提取2次，用醇量為10倍，每次提取的時間為90分鐘，合并濾液，濾液減壓回收乙醇至無醇味，上HPD-100大孔樹脂柱(滄州寶恩化工有限公司生產(chǎn))，先用水洗脫，再用40%乙醇洗脫，再用95%的乙醇洗脫，收集后者，減壓回收溶劑，粗提物上硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇梯度洗脫，收集合并相應(yīng)流份，回收溶劑，千燥得到蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物15g，總二烯內(nèi)酯的含量為90.6%。實施例四化合物I的制備取實施例三所得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物40g，上硅膠色譜柱，用CHCl3-MeOH5:1—CHCl3-MeOH-H2O10:3:l—7:3:1—6:4:1—MeOH進(jìn)行梯度洗脫，分為16個部分(F認(rèn)ctionl-16)。Franction2回收溶劑，所得固體為化合物I粗品。粗品上HPLC精制(PhenomenexLUNAC18，乙腈水30:70，300nM)，收集其中主要的色譜峰，回收溶劑，得到化合物I150mg，HPLC檢測含量為98%。，經(jīng)理化測定數(shù)據(jù)如下白色粉末，ESI-MS，貝A:573(M+H)+，熔點195~196°C。UV=aexOHnm:298.8。IRv=cm":3974.26,3899.98，3854.50,3822.58，3747.44，3524.40,3081.63，2944.36,2870.54，2744.48,1843.15，1718.11,1626.42，1539.85，1497.64，1455.90，1391.85,1317.12，1144.66,1172.16，1132.72，1076.52，1032.80，988.13，948.32,896.54，827.57,751.18,654.72,584.12，547.60，515.67，450.72，411.99;!H-NMR(C5D5N,400MHz)S:10.48(1H,s),8.22(1H，dd,J=2.4,9.7)，7.47(1H，d,J=2.4),6.36(1H,d,J=9.7),5.30(1H,brs)等；13C-NMR(C5D5N，100MHz)S:208.28，172.90,162.03,149.51,147.38,122.96,115.35,84.21,72.77,69.80,54.93,51.29,48.69，42.42,40.64,39.45,37.93，36.85,34.76，34.76，32.08,29.34,29.23,29.15,25.59,25.19,25.08,24.35,22.87，18.87,17.00。實施例五化合物n的制備取實施例三所得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物40g，上硅膠色譜柱，用CHCl3-MeOH5:1—CHCl3-MeOH-H2O10:3:l—7:3:1—6:4:1—MeOH進(jìn)行梯度洗脫，分為16個部分(Franctionl-16)。Franction12(8.9g)上0DS柱(150g)，以水—10%MeOH—30%MeOH—50%MeOH—70%MeOH—MeOH梯度洗脫，得到17個流份(SubFrl-17)。上述SubFrl4(342mg)經(jīng)HPLC分離(PhenomenexLUNAC18,乙腈水40:60，300nM)，收集2號色譜峰，得到化合物II(26mg)，HPLC檢測含量為96。/。。，經(jīng)理化測定數(shù)據(jù)如下白色粉末，ESI-MS，m/z:757(M+H)+，熔點214-215°C。'H-NMR(C5D5N，400MHz)S:10.49(1H，s)，8.15(IH，brd)，7.53(IH,brs),6.43(IH,d,J=9.9Hz)，5.63(IH,d，J=6.92Hz),1.83(3H，s),等；13C-NMR(C5D5N,100MHz)5:208.26,178.18，173.06,169.96,161.44，158.89,152.65，148.78,116.53，113.93,75.24,72.65,72.27,69.60,59.87,57.34,54.81,54.67，50.24，45.06:41.91，41.48,39.60,37.06,36.60,36.57,34.76,33.58,30.63,29.28,29.15,26.09,25.07,24.17,24.03,22.08,20.22，18.87，17.09。實施例六化合物III的制備取實施例三所得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物40g，上硅膠色譜柱，用CHCl3-MeOH5:1—CHCl3-MeOH-H2O10:3:l—7:3:1—6:4:1—MeOH進(jìn)行梯度洗脫，分為16個部分(Franctionl-16)。Franction12(8.9g)上0DS柱(150g)，以水一10%MeOH—30%MeOH—50%MeOH—70%MeOH—MeOH梯度洗脫，得到17個流份(SubFrl-17)。上述SubFrl4(342mg)經(jīng)HPLC分離(PhenomenexLUNAC18，乙腈水40:60，300nM)，收集l號色譜峰，得到化合物III(55mg)，HPLC檢測含量為97y。。經(jīng)理化測定數(shù)據(jù)如下白色粉末，ESI-MS，孤/^:785(M+H)+，熔點177~178°C。UVX=°Hnm:295.0。IRv=cm—1:3900.69，3823.31,3747.63,3436.86，2942.46，1843.82，1735.27，1699.45,1640.63,1541.87,1498.10，1456.50,1384.53，1240.98，1130.36，1036.07，888.57，690.87，618.96，452.25，407.15;^-NMR(C5D5N，400MHz)S:8.16(IH,brd),7.54(IH,brs),6.44(IH，d，J=9.9Hz)，5.66(IH,d,J=9.2Hz),1.84(3H,s),1.17(3H，s)，0.85(3H,s)等;13C-NMR(C5D5N,100MHz)S:178.22，173.10,172.83，169.98,161.46,158.89，152.61，148.88,116.66，113.90，75.32,72.57,72.49,70.86,59.95,54.97,50.35,45.16，42.41,41.49,40.93,39.78,36.64,35.70,35.16，34.74，32.48，30.60，29.35，29.18,26.21,26.03，25.89,25.17，25.07,24.98，23.70,21.44,20.24，17.21,17.08。實施例七化合物IV的制備取實施例三所得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物40g，上硅膠色譜柱，用CHCl3-MeOH5:1—CHCl3-MeOH-H2O10:3:l—7:3:1—6:4:1—MeOH進(jìn)行梯度洗脫，分為16個部分(Franctionl-16)。Franction12(8.9g)上0DS柱(150g)，以水—10%MeOH—30%MeOH—50%MeOH—70%MeOH—MeOH梯度洗脫，得到17個流份(SubFrl-17)。上述SubFrl2(229mg)經(jīng)HPLC分離(PhenomenexLUNAC18，乙腈水35:65，300nM),收集2號色譜峰，得到化合物IV(42mg)，HPLC檢測含量為99。/。。，經(jīng)理化測定數(shù)據(jù)如下白色粉末，ESI-MS，歷A:785(M+H)+，熔點184185°C。UV=:X。Hnm:293.2。IRv=cnT1:3899.92,3854.30，3746.87，3428.08，2938.82，1843.19,1736.16,1639.96，1541.58，1498.70，1456.27，1384.62，1239.79，1131.53,1030.90，889.68，586.24;^-NMR(C5D5N,400MHz)S:10.49(1H,s)，8.18(1H,brd),7.53(1H,brs),6.42(1H,d,J=9.8Hz),5.64(1H,d,J=9.2)，1.83(3H,s)，0.82(3H,s)等;13C-NMR(C5D5N,100MHz)S:208.26，178.10,173.05,169.94，161.43，158.83,152.61,148.76，116.50,113.89，75.19,72.61,72.24，69.55,59.83，54.80，54.64,50.18,45.02,41.85，41.46,39.54,37.01，36.52，34.73,33.54,30.59,29.27，29.14,26.08,25.05，24.12,23.98，22.05,20.19,18.82,17.05。實施例八化合物V的制備取實施例三所得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物40g，上硅膠色譜柱，用CHCl3-MeOH5:1—CHCl3-MeOH-H2O10:3:l—7:3:1—6:4:1—MeOH進(jìn)行梯度洗脫，分為16個部分(Franctionl-16)。Franction14上0DS柱，以水—10%MeOH—30%MeOH—50%MeOH—70%MeOH—MeOH梯度洗脫，得到15個流份(SubFrl-15)。上述SubFrl4經(jīng)HPLC分離(PhenomenexLUNAC18,乙腈水35:65，300nM)，收集2號色譜峰，得到化合物V(15mg)，HPLC檢測含量為99%。經(jīng)理化測定數(shù)據(jù)如下白色粉末，ESI-MS，/z/z:743(M+H)+，熔點198-199°C。UVt0H勤295.2。IRv=cm.1:3901.07,3853.79,3747.97,3420.58，2938.94，2869.45，1721.37,1638.31,1538.36,1451.05，1381.26，1255.46，1146.10，1098.49,1041.61,987.45，956.05，827.92，614.25，536.02;H-NMR(C5D5N,400MHz)S:8.66(2H,brd,J=9.7Hz),7.62(IH，brs),6.39(1H,d,J=9.8Hz),5.76(1H,t-like),1.79(3H,s)，0.96(3H,s),0.99(3H，s)等;13C-NMR(C5D5N,100MHz)S:177.82,172.94，172.31，169.98，161.90,159.07,151.91,150.52,117.97,112.87，83.50,74.59,70.48,57.53,54.61,49.98,42.34,41.31，41.00,40.25,37.47,36.64,35.80，35.41,34.74,31.00,30.81,30.80,29.22,26.93,26.41,25.96,25.32,23.97,21.70，21.50,20.73，17.12。實施例九蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物乳劑的制備將實施例三制備得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物0.5g、200g大豆油、100g大豆磷脂、2g等滲劑等混合，加熱至6080'C，全部溶融，加入高速搗碎機(jī)中，同時加入適量的水，高速攪拌3分鐘以上，反復(fù)3次以上，直到得到均勻的乳劑。實施例十蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物滴丸的制備稱取處方量的880g聚乙二醇-6000在85。C95'C下熔融，緩慢加入實施例二制備得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物lg攪拌，依次加入15g硬脂酸、4.5g吐溫-80、0.5g亞硫酸鈉、充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，將混合?585'C恒溫條件下滴入液體石蠟冷卻液中冷凝成丸，再用毛邊紙吸去多余的石蠟即得。實施例十一蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物軟膠囊的制備稱取200g氫化棕櫚油，加入到1300g藥用豆油中，加熱混勻，制得軟膠囊基質(zhì)，將lg實施例二制備得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物加入到基質(zhì)中，攪拌均勻，膠體磨研磨，制得軟膠囊內(nèi)容物。按明膠甘油水(l:0.3:l)制膠，采用軟膠囊機(jī)壓丸，制得1000粒軟膠囊。實施例十二蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物片劑的制備稱取實施例二制備得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物lg，100g淀粉，40g預(yù)膠化淀粉、9g羧甲基淀粉鈉，充分混合均勻，過80目篩，加入95%乙醇適量制成軟材，12目制粒，6(TC干燥3小時，12目篩整粒，加入顆?？傊?.3%的硬脂酸鎂，調(diào)整片重約150mg，壓片，共制得1000片。實施例十三蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物膠囊的制備稱取實施例三制備得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物lg，淀粉50g，糊精49g，充分混合均勻，過80目篩，用95%乙醇制粒，過12目篩，填充于l號膠囊中，共制得1000粒。試驗例l.蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物I-V對SMMC-7721和ECV304的細(xì)胞毒活性材料SMMC-7721、ECV304均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理室實施例四八制備得到的化合物I-V華蟾素注射液安徽金蟾生化股份有限公司Cinobufotalitoxin:按文獻(xiàn)方法[StudiesonCardiotonicSteroidsfromtheSkinofJapaneseToads.Shimada，K.，F(xiàn)ujii，Y.，Yamashita，E.，etal.Chemical&PharmaceuticalBulletin,1977.25(4)，714-730制備。本實驗選用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，采用噻唑藍(lán)還原法(MTT)，對化合物I-V單體的細(xì)胞毒活性進(jìn)行了研究，實驗方法及結(jié)果如下取對數(shù)生長的細(xì)胞2-2.5X105/mL，放入96孔板，每孔0.2mL，設(shè)鹽水對照組，溶劑對照組和不同濃度的實驗組，以華蟾素注射液及Cinobufotalitoxin作為陽性對照組，每組設(shè)3~5個平行孔。實驗組分別加入不同濃度的藥物2uL，對照組和溶劑對照組分別加入等量的生理鹽水和DMSO，而陽性對照組分別加入華蟾素注射液、Cinobufotalitoxin2uL。37。C溫箱孵育45h后，各孔加入10uL的MTT液(IOmg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，吸去上清后加入DMSO100iiL，待結(jié)晶溶解后，即用酶標(biāo)儀在570nm波長測量各孔的OD值，計算細(xì)胞生長抑制率和IQo值，結(jié)果見表l。表1化合物I-V對SMMC-7721和ECV304細(xì)胞的增殖抑制作用IC50(X士SD，n=3)名稱SMMC-7721(lig/ml)ECV304(lig/ml)化合物I0.350.29化合物n0.580.46化合物in2.612.34化合物IV0.620.41化合物v2.052.15Cinobufotalitoxin1.952.58華蟾素注射液115.6132.5從表1數(shù)據(jù)可知，對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制作用，新化合物I、新化合物II和新化合物IV分別約為對照品Cinobufotalitoxin的6倍、3倍、3倍左右，新化合物III、新化合物V與對照品Cinobufotalitoxin的抑制作用相似；新化合物I-V明顯強于華蟾素注射液。對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的增殖抑制作用，新化合物I、新化合物II和新化合物IV分別約為對照品Cinobufotalitoxin的9倍、6倍、6倍左右，新化合物III、新化合物V與對照品Cinobufotalitoxin的抑制作用相似；新化合物I-V明顯強于華蟾素注射液。試驗例2.蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物對腫瘤的抑制作用材料NIH小鼠，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實驗動物中心提供實施例三制備得到的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物華蟾素注射液安徽金蟾生化股份有限公司本實驗選用NIH小鼠，采用經(jīng)典的抗腫瘤藥物初篩模型，對蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物對小鼠移植肉瘤S180生長的抑制作用及其對荷瘤小鼠壽命的影響進(jìn)行了研究。NIH性成熟雄性小鼠120只，分別按常規(guī)方法接種S180肉瘤細(xì)胞徐叔云，等。藥理實驗方法學(xué)(第二版)北京人民衛(wèi)生出版社，1991，1423。瘤齡10d的瘤源小鼠拉斷脊椎處死，無菌剖取瘤塊，取粉紅色瘤組織部位，用滅菌生理鹽水滅菌制成勻漿，調(diào)成lXl(^個/mL濃度的瘤細(xì)胞懸液，拌種于實驗小鼠右前肢腋下皮下，0.2mL/只。NIH小鼠分別按體重隨機(jī)分組。按劑量給藥。第1批小鼠于實驗結(jié)束時拉斷脊椎處死，完整剝離瘤體，觀察瘤體形態(tài)及出血壞死情況，稱量瘤重，計算各組平均瘤重及平均抑瘤率。第2批小鼠接種后按同樣方法給藥，標(biāo)準(zhǔn)條件喂養(yǎng)，任其生長，記錄每只小鼠的死亡時間，計算存活時間和壽命延長率。結(jié)果見表2，表3，利用學(xué)生t測驗進(jìn)行組間比較。結(jié)果表明，150mg/kg蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物灌胃給藥，對小鼠移植肉瘤S180有顯著抑制作用，能夠延長S180荷瘤小鼠的壽命，且有一定的量效關(guān)系，其作用強度比華蟾素注射液強。表2.蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物對小鼠移植肉瘤S180的抑制作用(f土s，n=10).組別劑量(mg/kg)瘤重(g)抑瘤率(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>與模型組比較*，P〈0.05;**，P<0.01。權(quán)利要求1、一種新的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其結(jié)構(gòu)式如下id="icf0001"file="S2007101681240C00011.gif"wi="43"he="44"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中，R1選自id="icf0002"file="S2007101681240C00012.gif"wi="51"he="11"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>id="icf0003"file="S2007101681240C00013.gif"wi="91"he="38"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>id="icf0004"file="S2007101681240C00014.gif"wi="87"he="14"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>或id="icf0005"file="S2007101681240C00015.gif"wi="83"he="18"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>R2為CHO或CH3；R3為OH或H；R4為OH，R5為H；或者R4和R5為-O-R6為H或OAc。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物，其選自:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3、含有權(quán)利要求1或2的一種或多種化合物或其鹽的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，其特征在于其中蟾蜍總二烯內(nèi)酯的重量百分含量為30-100%。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，其特征在于其中蟾蜍總二烯內(nèi)酯的重量百分含量為50-100%。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，其特征在于其中蟾蜍總二烯內(nèi)酯的重量百分含量為90-100%。7、根據(jù)權(quán)利要求3-6所述蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備方法為干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的乙醇洗脫，再用高濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，干燥或精制即得。8、根據(jù)權(quán)利要求3-6所述蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備方法為干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的乙醇洗脫，再用高濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，先以乙酸乙酯萃取，再以正丁醇萃取，收集正丁醇萃取部分，減壓回收溶劑，干燥即得。9、根據(jù)權(quán)利要求3-6所述蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備方法為干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后濃縮液上大孔樹脂柱，先用水及低濃度的乙醇洗脫，再用高濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，上硅膠色譜柱，以氯仿-甲醇梯度洗脫，收集相應(yīng)留份，回收溶劑，干燥即得。10、根據(jù)權(quán)利要求7-9所述蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備方法，其特征在于其中所說的低濃度乙醇是指10-50%的乙醇，高濃度乙醇是指60-100%的乙醇。11、根據(jù)權(quán)利要求7-9所述蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物的制備方法，其特征在于其中所說的低濃度乙醇是指30-40%的乙醇，高濃度乙醇是指70-100%的乙醇。12、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述化合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟取所述蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，上硅膠色譜柱，用氯仿-甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，然后經(jīng)HPLC精制，即得。13、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述化合物的制備方法為，其特征在于包括如下步驟取蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，上硅膠色譜柱，用氯仿-甲醇-水(CHClrMeOH5:1—CHCl3-MeOH-H2010:3:1—7:3:1—6:4:1—MeOH)進(jìn)行梯度洗脫，分為16個部分(Franctionl-16);Franction2回收溶劑，所得固體為化合物I粗品，粗品上HPLC(RpC-18色譜柱)精制收集其中主要的色譜峰，回收溶劑，得到化合物I;Franction12上0DS柱，以水-甲醇梯度洗脫，得到17個流份(SubFrl-17);上述SubFrl4經(jīng)HPLC(RpC-18色譜柱)分離，得到化合物II及化合物III;上述SubFrl2經(jīng)HPLC(RpC-18色譜柱)分離，得到化合物IV;Franction14上0DS柱，以水-甲醇梯度洗脫，得到15個流份(SubFrl-15);上述SubFrl4經(jīng)HPLC(RpC-18色譜柱)分離，得到化合物V。14、根據(jù)權(quán)利要求l-3所述的化合物或蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，以及在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。15、根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的化合物或蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物，其特征在于可以以片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、乳劑、注射液或凍干粉針劑的形式存在。全文摘要本發(fā)明提供了一種具有通式(I)的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及包含該化合物的蟾蜍二烯內(nèi)酯提取物或者藥物組合物。所說的化合物和提取物具有抑制腫瘤細(xì)胞活性的作用以及在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了該化合物和提取物適于工業(yè)化生產(chǎn)的制備方法。文檔編號C07J17/00GK101177445SQ20071016812公開日2008年5月14日申請日期2007年11月7日優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日發(fā)明者杰何,姜永濤,振李,邱鷹昆,陳繼永申請人:山東綠葉制藥有限公司