專利名稱：：一種多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多氧霉素屬于肽基核苷類抗生素，這類抗生素除了多氧霉素外，還包括新多氧霉素、白霉素、氨基嘌呤霉素、三原霉素和尼可霉素。多氧霉素在日本已經(jīng)實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，并在農(nóng)業(yè)上作為抗真菌農(nóng)藥廣泛使用。多氧霉素是可可鏈霉菌阿索變種(5"trepfo/n7cescacaw'var.awe/w's)產(chǎn)生的，是第一個發(fā)現(xiàn)抑制真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)生物合成的核苷類抗生素，主要用于防治植物病源真菌感染。多氧霉素的吡啶堿基核苷主要有尿苷、胸腺嘧啶、HMU(5-羥甲尿嘧啶)和5-羧酸尿嘧啶四種。結(jié)構(gòu)上，多氧霉素是UDP-GlcNAc的結(jié)構(gòu)類似物，競爭性抑制幾丁質(zhì)合成酶的活性(Endo，A.,Kakiki，K.,andMisato,T.1970.MechanismofactionoftheantifugalagentpolyoxinD./5acterio丄104:189-196;HoriM，EguchiJ，KakikiK,MisatoT.1974.Studiesonthemodeofactionofpolyoxins.VI.EffectofpolyoxinBonchitinsynthesisinpolyoxin-sensitiveandresistantstrainsofAlternariakikuchiana.(Tokyo).27(4):260-266)。多氧霉素作為農(nóng)用抗真菌抗生素使用的優(yōu)勢在于1)毒性低，應(yīng)用廣泛，已在日本等國作為理想的生物農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)達(dá)30多年之久，不存在對環(huán)境的污染問題，是各國生產(chǎn)各種綠色食品的專家推薦首選用藥。2)多氧霉素雖然已經(jīng)應(yīng)用數(shù)十年，但迄今未發(fā)現(xiàn)病原菌產(chǎn)生大規(guī)模的抗性。3)多氧霉素對作物非常安全，即使過量用藥也不易產(chǎn)生藥害。4)多氧霉素的使用濃度為50200ppm，有效作用劑量低，具有高效性。多氧霉素作用機制獨特，它選擇性地抑制真菌細(xì)胞壁的組成成份幾丁質(zhì)的合成。不同真菌細(xì)胞壁合成途徑的相似性決定了這一產(chǎn)品的廣譜性，多氧霉素對鞭毛菌、子囊菌、半知菌類二十五種真菌均有較強的抑制作用。多氧霉素除了作為農(nóng)用抗真菌抗生素外，多氧霉素D對醫(yī)學(xué)上重要的真菌有抑制作用。1991年Gottliebetal報道多氧霉素D處理白色念珠菌(Ca7&'c朋s)可以使其對上皮細(xì)胞的黏附率降低。這暗示多氧霉素某些組分可能在真菌引起疾病治療上有應(yīng)用前景。低濃度的多氧霉素D處理宮部旋孢腔菌(。C力Woi^7^肌'/aZ^3/2M)，形成滲透壓敏感的原生質(zhì)體樣結(jié)構(gòu)；高濃度下，能引起白色念珠菌成鏈化，末端的球狀細(xì)胞對滲透壓敏感，這些末端球狀細(xì)胞經(jīng)多氧霉素處理后放入水中會破裂，而在1.5MKC1溶液中發(fā)生質(zhì)壁分離。由于多氧霉素對幾丁質(zhì)合成酶的抑制作用，白色念珠菌細(xì)胞可腫脹至原始大小的2到3倍(Endo，A.，Kakiki，K.,andMisato,T.1970.MechanismofactionoftheantifugalagentpolyoxinD./5a"e".o丄104:189-196;BeckerJM，CovertNL,ShenbagamurthiP，SteinfeldAS,NaiderF.1983.PolyoxinDinhibitsgrowthofzoopathogenicfungi^W肌'cro力^"e/"C力e鵬t力ar.23(6):926-929)。此外，多氧霉素還影響白色念珠菌萌發(fā)管的形成。從1965年多氧霉素首次從可可鏈霉菌中分離以來，以Isono為首的研究組通過底物添加，同位素示蹤的方法推測出多氧霉素的合成途徑，但至今還沒有多氧霉素合成的基因被克隆的報道，對多氧霉素的生物合成的分子機制乃至對它的調(diào)控機制的研究至今仍屬空白。研究表明，抗生素的生物合成涉及一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，與此相關(guān)的基因成簇排列，它們的表達(dá)受到多水平多層次的調(diào)控。通?？股厣锖铣傻恼{(diào)控主要在三個水平進(jìn)行(1)途徑特異性調(diào)控；(2)與抗生素和形態(tài)分化都相關(guān)的多效調(diào)控；(3)全局性調(diào)控。途徑特異性調(diào)控基因(Pathway-SpecificRegulatoryGenes)只特異性地調(diào)控某種抗生素的生物合成。這些調(diào)控基因一般與抗生素生物合成基因成簇連鎖在一起，調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)抗生素生物合成基因簇都包含途徑特異性調(diào)控基因，有的是一個，有的是兩個或更多。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供種多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的多氧霉素合成調(diào)控蛋白，名稱為polR，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有多氧霉素合成調(diào)控功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列1由1112個氨基酸殘基組成。為了使(a)中的polR分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端連接上信號肽序列，為了(a)中的polR便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l.<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的polR可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的polR的編碼基因可通過將序列表中SEQIDN2:2的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端連上信號肽的編碼序列，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述多氧霉素合成調(diào)控蛋白的編碼基因(pWy)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述多氧霉素合成調(diào)控蛋白的編碼基因(po_/y)的編碼序列為自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列。上述多氧霉素合成調(diào)控蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一:1)序列表中序列2的DNA序列；2)編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列1是由3809個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列為編碼序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有上述多氧霉素合成調(diào)控蛋白的編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的多氧霉素合成調(diào)控蛋白(1112aa)要比一般的抗生素生物合成調(diào)控蛋白(200-400aa)大很多，是一種新的抗生素調(diào)控蛋白。通過基因功能研究表明，當(dāng)本發(fā)明的多氧霉素合成調(diào)控蛋白的編碼基因po^的來源菌株可可鏈霉菌阿索變種中的po^被破壞，該菌株即失去了多氧霉素的產(chǎn)生能力，在/^7W被破壞的突變株中重新引入一個拷貝的/x^P基因可以使多氧霉素重新產(chǎn)生，表明該基因是一個多氧霉素合成正調(diào)控基因。實驗證明，在可可鏈霉菌阿索變種中導(dǎo)入單個拷貝的po7y基因，可以使該菌株的多氧霉素產(chǎn)量提高2-3倍，說明本發(fā)明的多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因?qū)Χ嘌趺顾氐纳a(chǎn)應(yīng)用具有極其重要的意義，在提高多氧霉素產(chǎn)量(Polyoxin)方面具有極大的價值。圖1為polR基因破壞突變株發(fā)酵液中多氧霉素的HPLC分析圖譜圖2為pSET152::po77質(zhì)粒圖譜圖3為高產(chǎn)工程菌株中多氧霉素的活性檢測圖4為高產(chǎn)工程菌株產(chǎn)生多氧霉素產(chǎn)量的曲線圖5為高產(chǎn)工程菌株中多氧霉素的HPLC分析具體實施例方式實施例i、多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因(po/y)的獲得本發(fā)明以圈巻產(chǎn)色鏈霉菌中尼可霉素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因s朋J作為探針篩選可可鏈霉菌cosmid文庫，將篩選到的陽性克隆cosmid9A進(jìn)行了亞克隆測序，并對其進(jìn)行了序列測定及分析，共找到34個開放閱讀框，其中p^7基因位于polyoxin生物合成基因蔟的側(cè)翼。本發(fā)明的多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因(po7力的獲得具體方法如下所述。1、探針的制備根據(jù)圈巻產(chǎn)色鏈霉菌^/7J基因的序列信息設(shè)計兼并引物(dxf:5'-GTGACCCTSATCCCSGACCTSATCGAG-3';dxr:5，-GACCGCGGCGGCGCGCAGRTCSGTSGC-3，)，以可可鏈霉菌阿索變種(6"trepto,ce51cacaojfvar.asoe"57'sstrain;購自CGMCC;AS4.1602)總基因組作為模板進(jìn)行PCR擴增出466bp的DNA片段(序列表中序列3)，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列與SanX同源性為70%，將該DNA片段用非放射性地高辛標(biāo)記后作為基因克隆的探針。2、構(gòu)建基因組cosmid文庫提取可可鏈霄菌阿索變禾中(5Yreptcwycescscsoivar.ssoe/57's1strain;CGMCC(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCentre);AS4.1602)總DNA，脈沖場電泳確保總DNA大小在200kb以上。選取限制性內(nèi)切酶5"3iAX4對基因組進(jìn)行酶切，控制酶切時間，保證酶切片段大小為30-50kb，將DNA片段用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)進(jìn)行去磷酸化處理。將質(zhì)粒supercosl(購自stratagene)用J力o/進(jìn)行酶切回收，用CIAP進(jìn)行去磷酸化處理，用fe/sHI進(jìn)行酶切，得到分別兩條6.9kb和lkbDNA片段作為載體臂。將酶切后的30-50kb的DNA片段與6.9kb和1kbDNA片段載體臂進(jìn)行混合連接，連接產(chǎn)物用噬菌體包裝蛋白進(jìn)行包裝轉(zhuǎn)染￡coh'XblueMR菌株(購自stratagene)，涂布amp抗性LB平板，平均每1200個克隆即組成一個完整的可可鏈霉菌cosmid基因組文庫。3、多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因(pWy)的獲得將步驟1獲得的466bp5朋I同源腦A片段作為探針，通過菌落雜交對步驟2獲得的可可鏈霉菌的cosmid基因文庫進(jìn)行了篩選，將篩選得到的一個陽性克隆cosmid9A送與Invitrogen測序公司進(jìn)行測序，將cosmid9A的測序結(jié)果(約40kb)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列側(cè)翼顯示了一個完整的開放閱讀框(ORF)，將其命名為；o^。，^大小為3339bp，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列，編碼一個由1112個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(PolR)，即序列表中序列1所示的氨基酸殘基序列。在NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了同源性比較，發(fā)現(xiàn)PolR與鏈霉菌的抗生素生物合成調(diào)控蛋白(SARPs)(Liu,G.，Tian,Y.,Yang,H.，andTan,H.(2005)Apathway-specifictranscriptionalregulatorygenefornikkomycinbiosynthesisin5Yre/^o,ce51朋5Y5cArcwoge/e61thatalsoinfluencescolonydevelopment.#o/Mcro6io755:1855-1866)有較高的同源性，但它所編碼的蛋白(1112aa)要比一般的抗生素生物合成調(diào)控蛋白(200-400aa)大很多，是一類新型的抗生素調(diào)控蛋白。結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基端存在一個大腸桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OmpR類型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(自序列表中序列1的氨基端的第30位到第110位氨基酸)。以可可鏈毒菌阿索變禾中(5Yr印to歷yce51var.asoe/Li51strain;AS4.1602)總DNA作為模板，以P3:5，GCCGGTGGACGATGTTCG3，，P4:5，GAACGCTCCTGGTCGCTCATC3'為引物，進(jìn)行PCR擴增，PCR體系為H2027ul，DMSO2.5ul，10XKODbuffer5ul，dNTP5ul，MgCl22ul(2mmol/L)，P3/P4濃度5pmol/ul各3ul，總DNA模板1.5ul(總DNA約50ng)，KODplus(TOYOBOCO.，LTD.Japan)lul，總體積50ul混勻，進(jìn)行PCR，PCR程序為先95。C2min;然后94。C30s，55°C30s，68°C3.5min，共30循環(huán)；最后68°C延伸lOmin，結(jié)果得到3S09bp的片段，將該片段回收后進(jìn)行測序，結(jié)果表明該片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，即；o^基因片段，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸為編碼序列，編碼序列表中序列1的氨基酸殘基序列。實施例2、po^基因的功能驗證1、構(gòu)建/^^阻斷突變株并驗證該突變對多氧霉素合成的影響1)p^y基因的破壞載體(pDR101)的構(gòu)建在po^內(nèi)部設(shè)計兩個引物(Pl和P2);Pl:5'-GAACGCTCCTGGTCGCTCATC-3';P2:5'-ACGCCACCCTCCAGACCTACA-3'。以可可鏈霉菌阿索變種(5Yre/^，ycescscsdvssoe/75751strain;AS4.1602)總DNA作為模板，以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴增，得到長1885bp的DNA片段，經(jīng)測序表明，該片段具有序列表中序列2的5'端第643—2527位核苷酸序列，將該片段命名位po^-7。將上述擴增得到的片段用平端插入到質(zhì)粒pKC1139(BiermanM，LoganR，0BrienK,SenoET，RaoRN,SchonerBE(1992)PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStr印tomycesspp.Gene116:43-49)的fcoRV位點，獲得重組載體，并對該重組載體進(jìn)行酶切和測序驗證，將經(jīng)酶切和測序表明含有上述擴增得到的po7/-7片段的重組質(zhì)粒命名位pKC1139::po^-7。將含有卡那霉素抗性基因DNA片段0eo」的質(zhì)粒Supercosl(購自stratagene)，經(jīng)和6kal雙酶切后，回收1kb的DNA片段并用綠豆核酸酶進(jìn)行平端化，插入到pKC1139::/^;-/質(zhì)粒上的po77基因內(nèi)部5)zal位點處，挑選卡那霉素片段插入方向與po^轉(zhuǎn)錄方向相同的重組質(zhì)粒(pKC1139::poM-7::"eo)作為；a^基因的破壞載體，命名為pDR101。2)/70^基因破壞獲得/70/y缺失突變株首先將pDR101轉(zhuǎn)入Ecoh'ET12567(MacNeil，D.J.，Gewain，K.M.，Ruby，C.L.，Dezeny，G.，Gibbons,P.H.，andMacNeil,T.(1992)AnalysisofStreptoraycesavermitilisgenesrequiredforavermectinbiosynthesisutilizinganovelintegrationvector.Gene111:61-68.)，￡coZiET12567為dam—dcm—hsdS—菌株，將pDR101去除可能的限制與修飾，提取獲得的Aco/iET12567轉(zhuǎn)化子中的pDRlOl質(zhì)粒，通過鏈霉菌PEGIOOO介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將pDRlOl轉(zhuǎn)入可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)之中，以安普霉素為篩選標(biāo)記陽性轉(zhuǎn)化子。具體方法如下所述a.離心收集在YEME培養(yǎng)基(DifcoYeastExtract3g，DifcoTryptone5g，OxoidMaltExtract3g，Sucrose200g，加蒸餾水至lOOOral使用前加入下列滅過菌的溶液2ml2.5M的MgCl2.6H20溶液20ml質(zhì)量百分含量為50%的Glucose溶液，50ml質(zhì)量百分含量為10%的Glycine溶液)中培養(yǎng)約40小時的可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)菌體，用質(zhì)量百分含量為10.3%的蔗糖溶液洗菌體2次；b.用2-4mg/ml的溶菌酶溶液(用原生質(zhì)體緩沖液配置)懸浮步驟a得到的菌體，在3(TC酶解，至鏡檢形成原生質(zhì)體；作用期間搖動試管幾次，防止菌體沉到底部；c.在步驟b處理后的菌體中補加原生質(zhì)體緩沖液(蔗糖103g，K2S040.25g，MgCl2*6H20,2.02g，微量元素液(ZnCl240mg，F(xiàn)eCl:i.6H20200mg，CuCl2.2H2010mg，MnCl2.4H20lOmg，Na2B407,10H2010mg，(NH4)爿07024.4H2010mg，加蒸餾水至1000ml)2ml，加蒸餾水至800ml，滅菌，用前每40ml加入滅過菌的下列溶液0.5ml質(zhì)量百分含量為0.5。/。的KH2P04溶液，5ml質(zhì)量百分含量為3.68%的CaCl22H20溶液，5ml質(zhì)量百分含量為5.73%，pH7.2的TES溶液)過濾，獲得原生質(zhì)體懸液；d.將步驟c得到的原生質(zhì)體懸液3000rpm離心10分鐘，棄上清，用殘余的原生質(zhì)體緩沖液懸浮沉淀；加原生質(zhì)體緩沖液洗1-2次，離心，棄上清，用殘余的原生質(zhì)體緩沖液懸浮沉淀；e.加入要轉(zhuǎn)化的DNA(pDR101)，混勻，立即加入PEGIOOO溶液(用原生質(zhì)體緩沖液配置)至終濃度25%(g/ml)，混勻，3分鐘之內(nèi)加入原生質(zhì)體緩沖液，3000rpm離心7分鐘，棄上清，用殘余的原生質(zhì)體緩沖液懸浮沉淀；f.加原生質(zhì)體緩沖液，混勻，配成原生質(zhì)體濃度約為108個/ml的原生質(zhì)體懸浮液，每個R2YE平板(瓊脂20g，蔗糖103g，MgCI26H2010.12g，K2S040.25g,微量元素液(ZnCl240mg，F(xiàn)eCl3.6H20200mg，CuCl2.2H20lOmg，MnCl2.4H2010mg，Na2B407.10H20lOmg，(NH4)gMoA^4H2010rag，加蒸餾水至1000ral)2ml，Difco酪蛋白氨基酸0.lg，DifcoYeastExtract5g，TES緩沖液(5.73%,pH7.2)lOOml，加蒸餾水至1000ml使用前加入滅過菌的下列溶液10ral質(zhì)量百分濃度為0.5%的KH2P04溶液，4ml5mol/LCaCl22H20溶液，7mllmol/LNaOH溶液，20ml質(zhì)量百分濃度為50%的Glucose溶液，15ml質(zhì)量百分濃度為20%的L-proline溶液)用0.lml原生質(zhì)體懸浮液涂布，28"C培養(yǎng)；16-24小時后每板加lul的安普霉素溶液(100mg/ml)。上述轉(zhuǎn)化后的得到的抗安普霉素的轉(zhuǎn)化子，隨機挑選其中4個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有10ug/ml安普霉素(Apramycin)的YEME中富集菌體，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切驗證，證明所得轉(zhuǎn)化子都是轉(zhuǎn)入pDRlOl質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子。將上述篩選的其中一個轉(zhuǎn)入pDRlOl質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有5ug/ml安普霉素的麗平板(瓊脂10g，L一天冬酰氨0.5g，K2HP040.5g，MgS04.7H200.2g，F(xiàn)eS04.7H200.Olg，加蒸餾水至1000ml使用前加入滅菌的50ml10%甘露醇)上，2『C培養(yǎng)7天后，制備孢子懸液。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以每個平皿104個孢子的濃度涂布在含有5ug/ml卡那霉素的MM平板上，于39°C咼溫培養(yǎng)。pKC1139質(zhì)粒具有溫度敏感型復(fù)制子，在高于34X:條件下不能正常復(fù)制。因此，pDR101在39"C時不能自主復(fù)制，只有當(dāng)pojy基因及其側(cè)翼序列與可可鏈霉菌染色體發(fā)生了同源重組時——單交換或雙交換的菌株才能在含有卡那霉素的基本培養(yǎng)基上生長。若發(fā)生了雙交換，則卡那霉素抗性基因(/7)替換po77基因，此時菌落表現(xiàn)為KmrAms(對卡那霉素有抗性，而對安普霉素沒有抗性)；若發(fā)生了單交換，則整個pDR101插入到染色體上，此時菌落表現(xiàn)為Ki^Anr(對卡那霉素和安普霉素均有抗性)。具體篩選方法如下所述挑取上述在含有卡那霉素的平板上39'C高溫培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)pDR101轉(zhuǎn)化子，分別轉(zhuǎn)移至含5ug/ml安普霉素的麗平板和含5ug/ml卡那霉素的羅平板上。篩選可以在卡納霉素平板上生長，而不能在安普霉素平板上生長的轉(zhuǎn)化子，即得到pDR101質(zhì)粒中的卡那霉素抗性基因片段兩邊的po^基因同時與可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)基因組中的同源序列發(fā)生了雙交換(同源重組)的轉(zhuǎn)化子，即為po7W缺失突變株。將篩選得到的其中3株發(fā)生雙交換的/^^缺失突變株接種在沒有任何選擇壓力的麗培養(yǎng)基上，在28'C下培養(yǎng)，傳5代后重新轉(zhuǎn)接至分別含有5ug/ml卡那霉素的應(yīng)培養(yǎng)基和含有5ug/ml安普霉素的醒培養(yǎng)基上，結(jié)果仍然是KmrAmS(對卡那霉素有抗性，而對安普霉素沒有抗性)，說明通過雙交換得到的這些;^^缺失突變株在遺傳上是穩(wěn)定的。3)po27缺失突變株的Southernblotting雜交驗證將步驟2)得到的上述3株遺傳上穩(wěn)定的KnfAmS型po^缺失突變株接種于YEME培養(yǎng)基中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)30小時后分別提取總DNA，用U和M/e/雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后以地高辛標(biāo)記的步驟l)擴增獲得的1885bp的DNA片段為探針進(jìn)行Southernblot雜交，以可可鏈霉菌阿索變種為對照；可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)的雜交信號從理論上推測應(yīng)在2.4kb范圍內(nèi)，而雙交換破壞株雜交信號應(yīng)該在3.4kb范圍內(nèi)。雜交結(jié)果證明，步驟2)獲得的KnfAirf型po7y缺失突變株出現(xiàn)的雜交信號帶與理論上計算的分子量大小一致(3.4kb)，說明所得到的突變株都是正確的，即得到了將卡那霉素抗性基因DNA片段Oeo;插入可可鏈霉菌阿索變種基因組的po^基因中，從而使polR基因破壞，不能表達(dá)的突變株。2、p^y缺失突變株多氧霉素產(chǎn)量生物檢測將Southernblotting雜交驗證正確的polR基因破壞突變株或可可鏈霉菌阿索變禾中(5Yrepto/zycescaca。j'var.asoe/jsisstrain;AS4.1602)分別接種在YEME培養(yǎng)基中，在3(TC培養(yǎng)36h后，分別以1%的接種量在SP培養(yǎng)基(每L含有30g甘露醇，10g可溶性淀粉，5g中性大豆蛋白胨(neutralizedsoyap印tone)，8gDifcoYeastExtract)中進(jìn)行二次發(fā)酵，120小時后用定量濾紙過濾下濕菌體烘箱烘至恒重檢測菌體干重和發(fā)酵液濾液的抗真菌活性，并進(jìn)行HPLC分析檢測發(fā)酵液濾液的多氧霉素的量。發(fā)酵液濾液的抗真菌活性，是以長柄鏈格孢菌為指示菌檢測多樣霉素的活性1,從斜面轉(zhuǎn)接長柄鏈格孢菌(購自CGMCCAlternarialongipesAS3.2875)到100ml的土豆汁培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)4天，勻漿處理5分鐘，待用；2.在直徑20cm的培養(yǎng)皿中，加入100ml含體積百分含量為20%步驟1培養(yǎng)得到的長柄鏈格孢菌菌液的PDA固體培養(yǎng)基；3.用打孔器在檢測平板上打出小孔，分別在不同的孔內(nèi)加入polR基因破壞突變株或可可鏈霉菌阿索變種發(fā)酵液50ul，28°C培養(yǎng)18-24小時，檢測抑菌圈大小。結(jié)果表明，po7W缺失突變株發(fā)酵液無抗真菌活性(不產(chǎn)生抑菌圈)，表明不再產(chǎn)生多氧霉素，而所測菌體濕重與可可鏈霉菌阿索變種幾乎沒有差異。將polR基因破壞突變株或可可鏈霉菌阿索變種的上述培養(yǎng)發(fā)酵液上清液經(jīng)過直徑0.25陶的微孔濾膜過濾后，進(jìn)行了HPLC分析，在突變株中沒有檢測到像可可鏈霉菌阿索變種那樣出現(xiàn)的多氧霉素的吸收峰(HPLC分析圖如圖1所示，圖1中A為可可鏈霉菌阿索變種的HPLC分析圖譜，圖l中B為polR基因破壞突變株的HPLC分析圖譜，箭頭所示的為多氧霉素的吸收峰)，結(jié)果表明/^^基因是多氧霉素生物合成所必需的。3、pa/Z缺失突變株的互補分析為了排除/^7^缺失突變株的表型是由于染色體上其它基因位點突變所造成的可能性，進(jìn)行了突變株的遺傳互補實驗。即將本發(fā)明的po^基因轉(zhuǎn)化步驟1獲得的po^缺失突變株，用完整的po"基因?qū)o^缺失突變株破壞的po^基因置換，若po^缺失突變株恢復(fù)了多氧霉素的產(chǎn)生能力，則進(jìn)一步證明了po^基因是多氧霉素合成調(diào)控基因；具體方法如下所述1)互補轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建以可可鏈霄菌阿索變禾中(5Y_repf(9/B/cescacaoivar.asoe7757'sstrain;AS4.1602)總DNA作為模板，設(shè)計引物P3和P4;以P3:5，GCCGGTGGACGATGTTCG3'P4:5，GAACGCTCCTGGTCGCTCATC3'為引物，進(jìn)行PCR擴增，PCR體系為H2027ul，DMS02.5ul，10XK0Dbuffer5ul，dNTP5ul，MgCl22ul(2mmol/L)，P3/P4濃度5praol/ul各3ul，總DNA模板1.5ul(含總DNA約50ng)，K0Dplus(T0Y0B0CO.，LTD.Japan)lul，總體積50ul混勻，進(jìn)行PCR，PCR程序為先95。C2min;然后94。C30s，55°C30s，68°C3.5min，共30循環(huán)；最后68°C延伸10min，結(jié)果得到3809bp的片段，將該片段回收后進(jìn)行測序，結(jié)果表明該片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，即po7i基因片段，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸為編碼序列，自序列表中序列2的5'端第304-381位核苷酸為啟動子序列。將上述擴增得到的DNA片段，平端插入到pSET152(Bie雇nM'LoganR，OBrienK，SenoET，RaoRN,SchonerBE(1992)PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStr印tomycesspp.Gene116:43-49)的fcoRV位點上，得到重組載體，將重組載體進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定，將酶切和測序鑒定表明正確的含有完整po^基因及其上游啟動子的重組質(zhì)粒命名為pSET152::po^(結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示)。2)po^缺失突變株的互補轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)化子多氧霉素產(chǎn)生能力檢測pSET152為鏈霉菌基因組整合型質(zhì)粒，構(gòu)建好的pSET152::/w^質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入鏈霉菌后會整合到鏈霉菌基因組上，由于質(zhì)粒本身攜帶了一個完整拷貝的polR基因，將其導(dǎo)入polR基因功能缺失的突變株中后，可以替代被破壞polR基因的功能，從而使缺失突變株多氧霉素產(chǎn)生能力恢復(fù)。將pSET152::po7y轉(zhuǎn)入Aco7iET12567以去除可能的限制與修飾，然后通過PEG1000介導(dǎo)鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法(原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法同步驟1中的步驟2)所述的方法)，將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體接種到含5ug/ml安普霉素的麗培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，PSET152載體自身帶有安普霉素抗性基因，再保證培養(yǎng)基含有安普霉素抗性壓力下，轉(zhuǎn)化polR功能缺失突變株得到的轉(zhuǎn)化子具有安普抗性，從而保證了pSET152::po^正確整合到了基因組上。篩選得到的轉(zhuǎn)化子即為轉(zhuǎn)入pSET152::;x^陽性轉(zhuǎn)化子。隨機選取上述篩選得到的6株轉(zhuǎn)化子在SP培養(yǎng)基中發(fā)酵，然后按照步驟2的方法進(jìn)行多氧霉素生物活性檢測，發(fā)現(xiàn)po7/基因互補后得到的轉(zhuǎn)入pSET152::po7i的po7y缺失突變體恢復(fù)了多氧霉素的產(chǎn)生能力。實施例3、本發(fā)明的多氧霉素合成調(diào)控基因pW7在提高多氧霉素產(chǎn)量中的應(yīng)用1、轉(zhuǎn)入/o7;基因的工程菌株(轉(zhuǎn)pSET152::po77工程菌株)的獲得互補質(zhì)粒pSET152::po^即可用于在可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)基因組上增加pWv—個拷貝，，由于pSET152::po77可以整合在可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)基因組上，隨同染色體一起復(fù)制，所以用此質(zhì)粒構(gòu)建成的多氧霉素高產(chǎn)工程菌株(轉(zhuǎn)pSET152::po^工程菌株)具有遺傳穩(wěn)定性。具體方法如下所述將pSET152::po7/轉(zhuǎn)入￡co/iET12567以去除限制修飾，通過以PEG1000介導(dǎo)鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法(原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法同實施例2的步驟1中的步驟2)所述的方法)，將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體接種到含5ug/ml安普霉素的MM培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，篩選得到的抗安普霉素轉(zhuǎn)化子即為轉(zhuǎn)入pSET152::po^陽性轉(zhuǎn)化子，即得到轉(zhuǎn)pSET152::poJ7工程菌株。2、轉(zhuǎn)入pSET152::pW/質(zhì)粒的工程菌株的多氧霉素產(chǎn)量檢測按照步驟1所述的方法，將pSET152轉(zhuǎn)入￡co7/ET12567以去除限制修飾，通過以PEG1000介導(dǎo)鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法以安普霉素為篩選標(biāo)記，將pSET152轉(zhuǎn)入可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)中得到轉(zhuǎn)pSET152工程菌株。將步驟1篩選得到的3株轉(zhuǎn)pSET152::po^工程菌株在SP培養(yǎng)基中發(fā)酵120小時，按照實施例2的步驟2所述的方法進(jìn)行多氧霉素生物活性檢測。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)3株工程菌的發(fā)酵液對指示菌株一赤星灰霉的抑菌圈都大于轉(zhuǎn)pSET152的菌株和可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)的發(fā)酵液；圖3中A為可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602);B為轉(zhuǎn)pSET152的對照菌株；C、D、E分別為3株轉(zhuǎn)pSET152::;o^工程菌株工程菌株。選取其中一個高產(chǎn)菌株在不同時間點測定多氧霉素產(chǎn)量，均高于可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)及含有空載體的對照菌株。為了排除轉(zhuǎn)入單拷貝pSET152質(zhì)?？煽涉溍咕⑺髯兎N(AS4.1602)多氧霉素產(chǎn)量影響，構(gòu)建了轉(zhuǎn)pSET152工程菌株。將可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)、轉(zhuǎn)pSET152的對照菌株、轉(zhuǎn)pSET152::;o7/工程菌株分別用SP培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，不同時間點取出發(fā)酵液進(jìn)行生物活性檢測，以10%多氧霉素干粉(購自北京綠色農(nóng)華植保科技有限責(zé)任公司)不同濃度稀釋作為測試標(biāo)準(zhǔn)品，以長柄鏈格孢菌為指示菌用管碟法(白秀峰.鐘大放1998《生物藥物分析》93-114)測定不同時間點不同菌株發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌圈大小，并換算成多氧霉素濃度，以時間為橫坐標(biāo)，每毫升抗生素濃度為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明轉(zhuǎn)pSET152::po^工程菌株在各個時間點多氧霉素產(chǎn)量都高于可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)、轉(zhuǎn)pSET152的對照菌株，說明是由于;o^基因拷貝數(shù)的增加造成了多氧霉素產(chǎn)量的增加。其中，圖4中A為可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602);參為轉(zhuǎn)pSET152的對照菌株；B為轉(zhuǎn)pSET152::po^工程菌株。用HPLC分析轉(zhuǎn)pSET152::poy工程菌株多氧霉素的產(chǎn)量，并以CGMCC(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCentre);AS4.1602)為對照，將發(fā)酵液上清液經(jīng)過直徑0.25陶的微孔濾膜過濾后，進(jìn)行了HPLC分析，固定相為安捷倫公司20cmSB-C18反相柱，流動相為95%A.水相l(xiāng)Ommol四正丁基氫氧化氨(sigama)用冰醋酸調(diào)節(jié)ra至4.55%B.100%乙腈；流速lml/min，保留時間為10min為多氧霉素對應(yīng)吸收峰(圖5中箭頭所示)，10minHPLC吸收峰提高顯示多氧霉素產(chǎn)量顯著增加。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)pSET152::^0//工程菌株的多氧霉素產(chǎn)量是可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602)產(chǎn)量150Pg/mL的2倍多，即達(dá)到34(^g/inL，HPLC的分析結(jié)果與生物活性檢測結(jié)果一致。圖5中A為可可鏈霉菌阿索變種(AS4.1602);B為轉(zhuǎn)pSET152::/WW工程菌株。序列表<160〉3<210>1<211〉1112〈212>PRT<213〉可可鏈毒菌阿索變禾中(5"tre/^o/z7/cesvar.a5"oe/57'5"strain)<400〉1MetMetTyrAlaThrGluValHisGinProArgThrLeuThrAlaAsp151015LeuSerLeuGluAlaPheGlyValMetThrAlaArgArgGlySerGlu202530ProValHisLeuGlyProProArgHisArgAlaValLeuGlyLeuLeu354045MetLeuArgLeuGlyGinValValArgValAspGinLeuValAspGlu505560LeuTrpGlyAspLysProProArgArgProHisAlaThrLeuGinThr65707580TyrMetSerHisLeuArgArgAlaLeuThrSerGlyHisGlyLysAsp859095AlaGlyValAlaProLeuHisTyrArgAlaProGlyTyrValLeuAla100105110LeuAspProGinAlalieAspValCysArgPheAspGluMetValSer115120125ArgGlyGinGinHisAlaAlaGluGlyArgPheGlyGluAlaArgGlu130135140AlaLeuAspSerAlaLeuHisLeuTrpArgAlaAspProPheLeuAsp145150155160LeuThrSerTyrGluProLeuAlaGluGluSerAlaArgLeuGinHis165170175LeuArgThrAlaAlaValThrlieArgAlaGluAlaLeuLeuAlaLeu180GlyAspAlaArgThr195PheProSerAspGlu210ArgLeuGlyGinGin225ThrGinLeuSerGlu245ArgValHisLeuAla260AlaGlyGinArgAla275SerGluGluSerArg290AspProAlaThrThr305ProValAspAspAla325ProLeuProLeuPhe340ArgSerlieThrAla355ValGlyGinAlaGly370AlaHisAlaAlaGly385CysArgThrAlaGlu405LeuArgMetLeuGly420ArgLeuCysProAspThrValArgThr230GluVal185GluSerLeu200ValAlaAlalie215GluAlaLeuArgLeuGlylieLeuArgGluValProGly310AlaGluArg280AlaValHis265AlaAspAla250GluArgAlaPro295ThrGlyProGlyGlySerGlyGlyArgLeuLeu235ProLeuProValGly315ThrArgMet220TyrGlyGlyAspHis300HisArgGlu345GlySerAlaLeuGlu360LysThrGluGly375ValAlaTrp390GlyMetProGlyAlaThrCys410LeuGlyLeuArg395TrpProGlyProAspAla425ProThrValThrThrLeuGlu205ThrGluAspGlyArg285GlyArg330HisAlaLeuAlaHisLeu380ValValGlySerValTrpAspAsp190ValGlyArgAspAla270GluArgThrGlyProAlaHislieArgLeuTyrThrArg240LeuArg255AlaProProArgAlaAlaAlaArg320AlaSer335LeuArgSer350ThrAlaValLeu365AlaGinAlaThrArgGinValSer400GinAla415AlaProAsn430SerProGlu435AspAlaAspArgGlyAla450HisAspAlaLeuSer465LeuLeuLeuVslArg455Thr440GluGinThrGinGlu470GluAsnValHisAspValValValAspGly530HisLeu545GinGlyArgSerGlyGlyLeuAla500SerLeu485LeuLeuSerAsplieLeuArgHis475AlaVallie515ProLeuGinArgGluGluSer520LeuGly505GlyAlaAspGlyGlyAspProGly580LeuGly565AsnLeu535GluGluGinSer550ProAlaThrProLeu490ThrValAspValGinGlySerGin460AlaAspGlyAla445ArgPheLeuAlaAspArgArgGly525ThrAspProAla510AlaAspArg540GinThrLeuLeu555ValArgGlyLeuProTyrSerLeuHisAla595lieProThrGlyThrGlu610GlyLeuAlaProGlu625GlyThrGluThrProGlyAlaVal630LeuVal615LeuThrLeuAla600SerLeu585AlaSerVal570GlyGinLeuLeuAlaPro480ThrLeu495ValSerGluProValValAlaAla560TyrGlu575HisAlaArgAlaAlaMetAsp645ArgAlaValGluArgValLeuLeuLeuArgArgValArgAsp675AspVal660HisAspHisAlaArg680GluGlu665ThrThr650AlaLeuArg635ThrArg620GlyArg605ArgCysAla590GinValLeuArgLeuAlaAlaValLeuArgLeuValPheValLeuLeuAlaGluMetSerAspGinValLeu640LeuGlyAspThr655LeuLeuThrArg685GluGly670TyrArgGlyLeuSerAsp<table>complextableseeoriginalpage19</column></row><table>945950955960TyrSerHisAlaLeuValAlaAlaLeuAlaGluAspAlaAspAlaThr965970975AlaSerSerAlaAlaGluGlyLeuArglieAlaAspAlaHisGlyLeu980985990LeuHisTrpAlaAlaLeuLeuLysValCysArgGlyTrpAlaGinHis99510001005ArgLeuGlyThrProGlyAlaLeuAspAlaLeuLysAlaAlaValThr101010151020AspLeuSerValArgHisLeuArglieArgLeuProLeuHisLeuGly1025103010351040LeuLeuAlaHisAlaGinTyrAspAlaGlyAlaValGluAlaAlaArg104510501055AlaThrLeuArgArgAlaAlaArgGlulieArgAlaAlaGlyGluAsp106010651070AlaTyrLeuSerProAspLeuProPheAsnArgLeuProArgLeuGin107510801085ProProLeuProProArgGlyCysSerAspProThrGluHisLeuAla109010951100GlyLeuProArgArgSerGlyHis11051110〈210〉2<211〉3809〈212〉DNA<213〉可可鏈霄菌阿索變禾中(Streptcwycescacaoivar.asoe/57'sstrain)〈400〉2gccggtggacgatgttcgccgcgctgctgggcgccccggcgggccacagggcgtccacga60tcctggacaggctcacgggctgtccggcctcgagcaggagcagggccagcaccgcccgct120gcttgggcggccccgggggcagttccgcaccgtcccgccagatcctgatgggtcccagga180ccccgaaggcgatgtgtcgatccatgtcttcccacaagcccggccctgcggccgacgaaa240ctgaaatgcgctgatcagagtgtatgtggcaggctctccggcaggccgtggccgccaagt300ggagggagacgttccttggcttgttctcaccgtcagtgcaacgtcactctttccgcacag360gggcatgtgtagcctgctcgccgcacgtactgagcgagtggaaggcatatgcaccaggca420tgatgtatgcaacggaagtacaccagccccggactctgacggcggacctctcactcgaag480catttggcgtgatgacggcacggcggggcagcgagccggtgcacctcggacctccgaggc540accgggcggtcctcgggctgctgatgctgcgcctcggacaggtggtccgcgtcgaccagc600tcgtcgacgagttatggggcgacaaaccgccgcgccggccccacgccaccctccagacct660acatgtctcatcttcgacgggccctgacgtcgggtcacggcaaggacgccggggtggctc720ccctgcactaccgggcgcccggatacgtcctcgcgctggatccgcaggccatcgacgtgt780gccggttcgacgagatggtctcccgcggacaacagcacgccgccgagggccggttcggtg840aggcgcgcgaggcgctcgactccgcgctgcacctgtggcgggccgaccccttcctggatc900tcacgtcctacgagccgctggccgaggagagcgcacgcctccagcacctgcgcacggcgg%0ccgtgacgatccgcgccgaggccctgctcgccctcggcgacgcgcggaccacggtggagt1020ccctgcggcgcgaggtgatccgcttcccctcggacgaacgcatcgtggccgccctgatga1080ccggcctgtaccggctcggccagcagaccgaggcgctccgcctgtacgaacgtacgcgca1140cgcagctgtcggaggagctgggcgtggcaccgggcgacgacctgcggcgcgtccatctgg1200ccatcctgcggcacgsiactgggcggcgccgcaccggccgggcagcgggccgaggtgcggg1260cccggccggaccgcgagccccggagcgaggagagccgtxcgccggccgacgccgtccacg1320gccgcgccgccgaccccgcgacgaccggcaccggacccggcgggcacaccggcgcgcggc1380ctgtggacgacgccgccgggtccggcaggaccccggcccacgcgtcgccgcttccgctct1440tcgaagggcgcgaacacgccctggcctcgctgcgccgctccatcacggccgccctggagg1500gcagcggacatctcaccgcggtcgtgggtcaggccggggtgggca卿ccgaactgctgg1560cccaggccacggcgcacgccgccggatgggtcgccggaacccgggtggtccgggtgagct1620gccggaccgcggagggcatgccggcctgctgggtgtggcagcaggcgctgcggatgctcg1680gcggccccgacgcgctgccgggcgacaatgcgccccggctctgtccggaccctacggtga1740caacgctgtcagactcaccggagggagcggacgccgaccgccgggagcagacccagcagc1800gcttcctggcccacgacgccctgagtgaaacgattctgcgccacgcggacgacgctcccc1860tcctgctcgtcctcgagaacgtgcacctggcggaccgccccacgctcgacgtcctcgcac1920tgctcagcgacggcacacagggccgcgcggtgagcgtggtgatcagcgtccgggagtccg1980gtgtgggagccggagccg肌cccgacggcccgctccaggagttgctggccgactcccgca2040cggacgtcgtccacctcgacgacctgtccgaggaacaggtccagaccctcctcgcggccc2100agggcgggcccggcccggccacgcccgtggtgcgcggactctacgaacgcagcggcggga2160acccctacctgctcggccagctactggcacacgcgggtggtgcccgctccctgcacgccg2220cgcgcgcggcacgccaggtcctcaccgagatccccaccggcgtgtccagcatgctgcgcc2280gccgtctggccggactggccccggaggtcctgcgcgtgctcaggggatgcgcggtactcg2340ggaccgaggccgacctgaccctgctgaccaccgtgctcggcgacaccacccccggcgtcc2400gcgccgtggaggaggcgctgcgcaccggtctgctgcgccgcgaccacgatcacgcccgca2460ccctggtgttccgctacggcctggtacgcgacgtactgctcgccgagatgagcgaccagg2520agcgttccgacctgcacgcctgggcggtggacgtgctcggccgccaggccgacggccacc2580ccgcggcggcctcgcgcctggcgcaccacgcctggcaggcctcgctgaccctgcccccgg2640accaggtgctgccgtacctcgtgcgggccggcgagcaggccgccctggagagccggtacg2700accgcgcgcagacctggttccggcgcgcccacgcgctgctcacctccggcccctcggcga2760gcggtgcggccgcgcaggcgctgcaactgcgcaagcgcatcctccagatcgccaccgtca2820cccgcggatacggcgaccgggaggtcgtggccgagtcccagcgggtgctgagcatgtcac2880ccgccgcggtccaggagccggcactggtgttctcccagtgcatcgcccaactggtcaccg2940gacaccgggaggagagcgcccgccgcgcccatcagctgcgcgtcatggcgcagaacggcg3000acgcgcccgaagcccgcctgcacgaacggctcgcccacggcatcctgcacctgcccgacc3060gcaccgccgaggcgctggccgccctgacggaggccgagcagacggccgggaacctctccg3120ccgcccggctccggcagctcgcgcaccacacccagcacgacccccgattcctggccatga3180accaccggaccctcgctctgtcgctgctcggcgcccaggacgacgcgctcgccctggccc3240aggaactcctggcgctcaccggctgcgagggcacaccggtcgaccgggccagcgcccact3300actcccacgcgctggtcgccgccctcgccgaggacgccgacgccaccgcctcctccgccg3360ccgagggcctgcgcatcgccgacgcgcacggcctgctgcactgggcggccctgctcaagg3420tctgccgcggctgggcgcagcaccggctcgggacacctggcgcactcgacgccctcaaag3480cggccgtgaccgacctgagcgtccgccacctgcggatccgcctcccgctgcacctggggc3540tgctggcacacgcccagtacgacgcgggcgccgtcgaggccgcccgggcgaccctgcggc3600gggcggcccgggagatcagggccgcgggcgaggacgcctacctcagccccgacctgccct犯GOtcaaccggctgccgcgcctccagccgccgctgccgccccgcgggtgcagcgatccgacgg3720agcatctggccggcctgcccaggcgttccggccactgaccggtccaggccgctgacgagt3780cccggctcgcgacaagccccgtcctccca3809<210>3〈211〉466〈212〉DNA〈213〉可可鏈毒菌P可索變禾中(5YrepfOiT7/cescacao/var.asoewsisstrain)〈400〉3gcaccgcggctgacgccgtcgacccgggaccggcccaccccggcgaggaccctcgtggtcccaccgcccgccgcgcagatcgcccgcaggtcggtcgccgtgaggtcctggcccgtccgggaccctcagcgcgtagtcgtcctggacggcgtccatgccggtagccgtagcggtgctcccacacggcctcgctgatgagcggccatcagcgcgaagaagggctggctgtcgctgaacacgctcgacgggagccaggggccgttcggccgggtgggccgtgggtcaccacgcccatccggcgcagcacgtcgaactcgggtgtccatgccggggcccgtgatgtgcaccggcccgtxgcccccaggtgacgacctcgatcaggtccggcggcagggttgcggggtccagggcggtcagtcgccccctccccgggaggaccgagtccggccagcgccgacggtcacgg6012018024030036042046權(quán)利要求1、一種多氧霉素合成調(diào)控蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有多氧霉素合成功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述多氧霉素合成調(diào)控蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述多氧霉素合成調(diào)控蛋白的編碼基因，具有自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述多氧霉素合成調(diào)控蛋白的編碼基因的核苷酸序列為下述序列之一1)序列表中序列2的DNA序列；2)編碼序列表中序列l(wèi)蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5、含有權(quán)利要求2-4中任意一項所述編碼基因的重組表達(dá)載體。6、含有權(quán)利要求2-4中任意一項所述編碼基因的工程菌。7、含有權(quán)利要求2-4中任意一項所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。8、權(quán)利要求1所述的多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因在多氧霉素生產(chǎn)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有多氧霉素合成功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多氧霉素合成調(diào)控蛋白及其編碼基因?qū)Χ嘌趺顾氐纳a(chǎn)應(yīng)用具有極其重要的意義，在提高多氧霉素產(chǎn)量(Polyoxin)方面具有極大的價值。文檔編號C07K14/36GK101195655SQ20071017892公開日2008年6月11日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者鋼劉,睿李,謝周杰,譚華榮申請人:中國科學(xué)院微生物研究所