專利名稱：：多氧霉素b的定量分析檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種藥物
技術領域：
的檢測方法，具體地，涉及一種多氧霉素B的定量分析檢測方法。
背景技術：
：多氧霉素(polyoxin)是由日本理化研究所為首的科研機構開發(fā)、并于1967年獲登記的農用抗生素。從可可鏈霉菌阿蘇變種(Str印tomycescacaoivar.asoensis)發(fā)酵產生的多氧霉素主要為兩種成分多氧霉素A和多氧霉素B，但多氧霉素A幾乎沒有活性；而其B成分即多氧霉素B(polyoxinB)是一類廣譜的抗真菌農用抗生素，由于它是一種高效、低毒、無環(huán)境污染的安全農藥，所以被廣泛應用于糧食作物、特用作物、水果和蔬菜等重要病害的防治。在抗生素發(fā)酵過程中產物檢測方法的建立是至關重要的環(huán)節(jié)。目前己報道的多氧霉素B的檢測方法主要為HPLC法(孫忠松，劉剛，牛增元，馬昕，用液相色譜二極管陣列檢測器測定多氧霉素B，化學分析計量，1999年，第8巻，第3期)。這種方法結果準確，但傳統(tǒng)HPLC方法價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多，而且前期處理步驟多、過程復雜、分析時間長，在發(fā)酵生產中不便于對高產菌株進行大量初篩以及對發(fā)酵過程中的產物進行動態(tài)監(jiān)控?？股氐纳镨b定是以抗生素對微生物的抗菌效力作為效價的衡量標準，具有與應用原理相一致、用量少和靈敏度高等優(yōu)點。牛津杯法是瓊脂擴散法中的一種，其原理為①利用抗生素在攤布的含有特定試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內進行球型立體擴散；②形成一定濃度的含有抗生素的肉眼可觀察到透明抑制圈，抑制了試驗菌的繁殖；③抗生素的濃度不同，抑菌圈的大小也不同，比較供試品與樣品的抑菌圈直徑，可得供試品含量。然而在多氧霉素B發(fā)酵過程的動態(tài)監(jiān)控中，至今還未見有關生物檢測方面的報道。由于在整個生物檢測過程中影響實驗結果的因素很多，如檢測平板的厚度、培養(yǎng)的溫度、牛津杯的加液量以及菌懸液的濃度等，其中一個環(huán)節(jié)操作不當或因素被忽略，就有可能導致該檢測方法的失敗。因此如何建立起一套直觀、準確、快速、測試簡單并且費用低廉的定量分析檢測方法成為目前亟待解決的問題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種多氧霉素B的定量分析檢測方法。本發(fā)明對于多氧霉素B的檢測方法可以應用于多氧霉素B工業(yè)發(fā)酵生產中，包括在高產菌株的初篩階段以及對發(fā)酵產物進行動態(tài)監(jiān)控。與
背景技術：
中使用HPLC方法對多氧霉素B進行檢測的方法相比，具有靈敏、快捷、操作簡單、原料價廉且相關性好的特點。本發(fā)明是通過以下技術方案實現的(1)確立牛津杯法測定多氧霉素B的生物檢測條件平板厚度為底層培養(yǎng)基20tnL，上層培養(yǎng)基5mL;培養(yǎng)溫度為30-32°C;牛津杯的加液量為200uL;加菌層培養(yǎng)基的菌懸液濃度為5X106cfu/ml;(2)標準曲線的建立在步驟(l)的生物檢測條件下，取多氧霉素B的標品和樣品溶于緩沖液中，用牛津杯法測定在不同濃度時抑菌圈的直徑大小，并用抑菌圈直徑為橫坐標，多氧霉素B濃度的對數值為縱坐標，繪制標準曲線；(3)產多氧霉素B菌株的搖瓶發(fā)酵及發(fā)酵液的后處理將產多氧霉素B的菌株的孢子在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至孢子成熟，然后將成熟孢子接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)后再將活化的種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)并取樣，最后將發(fā)酵液離心并用氯仿抽提；(4)牛津杯法測定發(fā)酵液中多氧霉素B的含量，步驟包括在平板上加20mL底層培養(yǎng)基和5mL加菌層培養(yǎng)基，在加有底層和加菌層培養(yǎng)基的平板上放置牛津杯，然后將歩驟(3)中所述經氯仿抽提處理后的發(fā)酵液滴加到牛津杯中，其中牛津杯的加樣量為200yL，隨后將滴加抗生素的平板放入培養(yǎng)箱中在30-32。C下進行培養(yǎng)，最后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，根據標準曲線測得多氧霉素B在發(fā)酵液中的含量。本發(fā)明通過確定用牛津杯法檢測多氧霉素B方法的最佳生物檢測條件，并用多氧霉素B的標準溶液在此最佳生物檢測條件下繪制一條線性回歸曲線，然后利用牛津杯鑒定各階段的發(fā)酵液所產生的抑菌圈大小，利用線性回歸曲線測得多氧霉素B在發(fā)酵液中的含量。本發(fā)明使用牛津杯方法對多氧霉素B進行檢測，解決了當前在工業(yè)發(fā)酵生產多氧霉素B中存在的檢測不方便、HPLC的操作繁瑣、條件苛刻、勞動強度大、分析時間長、費用較貴等缺點。同時通過與HPLC檢測作比較，本發(fā)明中的方法提供了一種直觀、測試簡單、費用低廉的多氧霉素B的快速定量分析檢測方法，有利于提高篩選成功率，滿足高通量篩選的需要，可用于工業(yè)化發(fā)酵生產中對多氧霉素B的快速定量檢測。同時，本發(fā)明的檢測方法可用于抗生素的定量分析，便于進行抗生素合成和分離純化過程中的活性檢測以及產品質量標準的建立。本發(fā)明所涉及的菌株可可鏈霉菌阿蘇變種NRC-19已在參考文獻(E1-ShahedKamalY.I.等EgyptianJournalofMicrobiology1994,29(3):315-328)中公開。圖1牛津杯法和HPLC法在發(fā)酵過程中對各階段發(fā)酵液中多氧霉素B的檢測結果的對比圖具體實施例方式以下結合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1:步驟l、牛津杯法多氧霉素B的測定條件的確立測定條件取多氧霉素B的標準品于磷酸鹽緩沖液中，調pH值為4.0，再分別依次稀釋到終濃度為lyg/mL，5ug/mL，10iig/mL，25ixg/mL，50ug/mL，100ug/mL，250ug/mL，500ug/mL，750ug/mL，1000yg/mL，用牛津杯法測定在不同濃度時抑菌圈的直徑大小，并用抑菌圈直徑為橫坐標，多氧霉素B濃度的對數值為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線的斜率表示測量的偏差(估計值與真實值的接近程度)，其值越小，則表示多氧霉素B效價的增加幅度一定時，抑菌圈直徑的差異越大，意味著檢測時準確度較高。標準曲線的x軸截距則反映出在最低多氧霉素B效價下，各種情況的抑菌圈直徑的大小，即測定的靈敏度。多氧霉素B濃度在10500yg/mL時，其對數值與抑菌圈直徑有較好的線性關系，因此標準曲線范圍可選為10500ug/mL。在此范圍內，確立了如下所示的牛津杯法測定多氧霉素B的條件①平板厚度的確立通過變換不同的底層和上層培養(yǎng)基的配比，依次制成底層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)體積分別為20mL和5mL;15mL和5mL;15mL和10mL;10mL和lOmL(前后兩個數字分別代表底層和上層培養(yǎng)基的體積)的平板各一套，3(TC培養(yǎng)24小時后繪標準曲線，各曲線斜率比較接近，即對檢測的準確度影響不大，但對同一底層而言，較小的上層培養(yǎng)基加量其靈敏度較高，這可能是由于提高了指示菌的敏感性的緣故。因此采用底層培養(yǎng)基為20mL，上層培養(yǎng)基為5mL時得到較好的結果。②培養(yǎng)溫度的確立采用5種不同的培養(yǎng)溫度25°C，28°C，30°C，32'C和37t:培養(yǎng)，24h后，在3(TC，32'C和37"C培養(yǎng)的平板均出現較清晰的抑菌圈；而在25。C，28'C培養(yǎng)的平板培養(yǎng)至24h時，抑菌圈邊緣仍比較模糊，在3(TC，32'C和37。C三個溫度中，3(TC和32'C培養(yǎng)的斜率較小，z軸截距較大，所以選擇30-32°C作為檢測培養(yǎng)溫度。③牛津杯加液量的確立對于一般的抗生素測定來說,大多數情況下都需要把牛津杯加滿，但在實際測定中發(fā)現若加滿牛津杯，培養(yǎng)24h后牛津杯內仍有將近一半的殘留溶液。鑒于此，分別測試牛津杯加液量(分別為200，100，50!xL)的影響，結果顯示牛津杯加液量越大，所形成的抑菌圈直徑就越大。因此，牛津杯加液量和抑菌圈大小成正比。但從斜率來看，100uL和200nL都比50yL小，也就是準確度都比50yL要高，而加液量為200iiL靈敏度較高。因此，牛津杯加液量為200uL比較合適。④加菌層菌懸液濃度的確立牛津杯法測定多氧霉素B效價時，控制加菌平板中菌懸液的濃度非常重要過濃則抑菌作用不明顯；過低則菌體生長稀疏，抑菌圈不明顯或者不規(guī)則，難以準確測量。取皮狀絲孢酵母斜面一支，用適量無菌生理鹽水洗下全部菌苔，充分振蕩后作為原液，并依次十倍稀釋，到10—'，10"，10—4直至10—8倍，然后利用平板菌落計數法計數(結果為原液5X10"cfu/ml)，原液(5X10"cfu/ml)及各種濃度的稀釋液以4y。的接種量作為菌懸液加入到加菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后發(fā)現10—7，10—8倍稀釋液，平板上抑菌圈非常模糊，邊緣不清晰，呈鋸齒形,難以測量.原液及10—1,10—2'10—3，10—4倍稀釋液平板上菌體密度太大，抑菌圈不明顯，10—5，10—6倍稀釋液其產生的抑菌圈非常清晰，最容易觀察和測量.準確度比較接近，但10—5靈敏度性大于It)—6,即菌懸液濃度為5X106cfu/ml。步驟2、標準曲線的建立①線性實驗準確稱取多氧霉素B標準品，依次稀釋到終濃度為10yg/mL，25ug/mL，50tig/mL，100tig/mL，250ng/mL，500ug/mL六個濃度，多氧霉素B的反應液在10-500iig/mL范圍內，濃度與抑菌圈直徑具有良好的線性關系，符合比爾定律。經SAS統(tǒng)計軟件求得回歸方程y=5.7651x+6.7887，相關系數R2為0.9985。②精確度實驗做區(qū)間實驗和區(qū)內實驗，計算相對標準偏差。配制多氧霉素B的濃度為100"g/mL的6個樣品(保麗安)溶液，分二天(每天三個樣品)用牛津杯法檢測，測得區(qū)間相對標準偏差RSD為1.70，區(qū)內相對標準偏差RSD為0.63。③回收率實驗通過添加已知量的多氧霉素B標準品到樣品中，然后檢測其回收率?；厥章蕦嶒炦x定低、中、高三個濃度，分別是50ug/mL(40yg/mL樣品+10ug/mL標準品)，150iig/mL(120ug/mL樣品+30yg/mL標準品)，450(360ug/mL樣品)+90yg/mL標準品)，設計添加的標準品濃度為總濃度的1/5。經檢測，低濃度回收率為103.50%，中濃度回收率為96.22%,高濃度回收率為99.29%，平均回收率為99.67%。歩驟3、產多氧霉素B菌株——可可鏈霉菌阿蘇變種NRC-19的搖瓶發(fā)酵及發(fā)酵液的后處理搖瓶發(fā)酵的歩驟如下①將可可鏈霉菌阿蘇變種NRC-19菌株涂布于YMS固體培養(yǎng)基上(YMS固體培養(yǎng)基的組成部分的質量百分比為酵母膏0.39%，可溶性淀粉0.39%，麥芽糖O.96%，CoCL.6H200.0005%，瓊脂1.92%,蒸餾水96.34%，pH7.2)，28'C培養(yǎng)7天，待孢子完全成熟后，用無菌生理鹽水刮下孢子，然后充分震蕩以打散孢子，過濾離心收集，向成熟的孢子平板中滴加lmL無菌生理鹽水，并用無菌棉球輕輕刮拭孢子，然后接種于種子培養(yǎng)基中(種子培養(yǎng)基溶液組成部分的質量百分比為黃豆餅粉0.97%，玉米粉0.97%,葡萄糖0.97%，KH2P040.01%，NaClO.01%，CaC030.03%，蒸餾水97.04%，pH值為6.5)，28°C，搖瓶培養(yǎng)2天；調整孢子濃度在lX108-l(f個/niL，備用。②配制亞硝基胍處理孢子懸液稱取亞硝基胍20mg，放置于lOOmL無菌三角瓶中，加丙酮2mL使其溶解，再加入18mLTris緩沖液(pH6.0，0.5mol/L)混勻，備用。③取上述亞硝基胍處理液10mL，加入菌懸液10mL，30。C保溫振蕩一小時，每隔10分鐘取樣一次，取樣后首先稀釋1000倍終止反應，然后再適度稀釋，涂布平板，28'C培養(yǎng)7天，待孢子成熟后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基溶液組成部分的質量百分比為黃豆餅粉1.89%，玉米粉1.42%，葡萄糖1.89%，KH2P040.09%，NaCl0.09%，CaC030.27%，蒸餾水94.35%，pH值為6.5)的搖瓶中發(fā)酵72小時，取發(fā)酵液3000rpm離心5分鐘，取上清液，用氯仿抽取處理。發(fā)酵液的后處理的步驟如下①發(fā)酵液的離心取發(fā)酵液于EP管中，離心(3000rpm，3min)，除去菌體；②氯仿處理取約體積比為1:1的氯仿加入到EP管中，搖晃振蕩30分鐘，然后離心(3000rpra，3min)，取上清。步驟4、發(fā)酵過程中多氧霉素B的動態(tài)檢測將可可鏈霉菌阿蘇變種NRC-19菌株孢子涂布于YMS平板上，28-3(TC，培養(yǎng)7天，直至孢子成熟；然后將成熟的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，28-30°C，搖瓶培養(yǎng)2天；然后將活化后的種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-3(TC，搖瓶培養(yǎng)120小時，每隔24小時取樣一次，共取樣7次；將每次取的發(fā)酵液放入EP管中，離心(3000rpm，3min)，除去菌體，然后取約體積比為1:1的氯仿加入到EP管中，搖晃振蕩30分鐘后離心(3000rpm，3min)取上清，最后放入4。C冰箱保存，備用；取完所有7個樣品后，同時用牛津杯法和HPLC法對各樣品中多氧霉素B的含量進行檢測，并用統(tǒng)計學方法分析檢測結果。牛津杯法測定發(fā)酵液中多氧霉素B的含量步驟如下①實驗器材的準備和清洗選擇底面平整的玻璃雙蝶，避免底面的凹凸影響瓊脂層的厚度。牛津杯選擇加工精細的同一批產品，保證管壁厚薄與重量均勻一致?？股貙嶒炛?，平板，小鋼管往往連續(xù)使用，為避免因上次使用殘留的抗生素影響到下一次的測量準確，要反復用水沖洗干凈并干熱滅菌。②樣品與標準品溶液的配制標準品與樣品的稱取最好一次稱取，多氧霉素的標準品和樣品從冰箱取出后，放于干燥箱內30min，然后在1/100,000克的分析天平上準確稱取，稱量結束后，放入超聲波處理后的磷酸緩沖液，定容至刻度，調pH為4.0，過濾并稀釋到10ug/mL，25ug/mL，50yg/mL，100ug/mL，250ug/mL，500yg/mL六個濃度。③底層培養(yǎng)基的配制要注意保持無菌室工作臺面水平，在平板中倒入20mL6080。CPDA瓊脂培養(yǎng)基(土豆100g，葡萄糖10g，瓊脂10g，蒸餾水500mL，pH自然)平放于工作臺面上，待其完全部冷卻。④加菌層培養(yǎng)基的配制制備PDA瓊脂菌層培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基溫度過高或者受熱時間過長都會導致試驗菌死亡。因此，培養(yǎng)基應放在5(TC水浴中保溫。在實驗中，將事先配制好的培養(yǎng)基分裝在具塞試管中，每管5mL，濕熱滅菌后放在5(TC水浴中保溫，然后分別按4%的接種量加入濃度為5X106cfu/ml皮狀絲孢酵母菌液體。震蕩混勻后繼續(xù)保溫5min使培養(yǎng)基溫度回升，然后直接倒入底層培養(yǎng)基上，轉動平板使培養(yǎng)基均勻鋪開。⑤放置牛津杯每個平板放置6個牛津杯，放置時，小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨意移動，靜置5min，使之在瓊脂內稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。⑥滴加抗生素溶液用移液槍每杯滴加200uL抗生素溶液，在滴加之前，槍頭至少要用滴加液沖洗三次。滴加時不要離開牛津杯口距離太高。滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去。滴加完后，平板忌震動，要輕拿輕放，平板在30'C培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)過程中，如果溫度不均勻(過于接近熱源)，會造成同一平板上細菌生長速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把平板放入培養(yǎng)箱時，要與箱壁保持一定的距離。⑦用游標卡尺測量抑菌圈直徑在平板底部墊一張黑紙，在燈光下測量，并記錄測量結果。HPLC的條件如下色譜條件進樣量為20nL;色譜柱為大連伊利特；填料為Hypersi10DS25"ra;規(guī)格250X10.0mm;檢測器UV260nm;流動相梯度沖洗，初始階段三氟乙酸(0.3%)溶液與乙腈的體積比為90:10，在40min內，乙腈的體積從10%-40%;三氟乙酸溶液的體積從90%-60%。檢測結果為如表1所示。表1HPLC法和牛津杯法測量結果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表中HPLC法每個樣品檢測9次；牛津杯法每個樣品使用8個平板，二劑量法檢測實驗結果證明在實驗條件下，使用牛津杯方法在可可鏈霉菌阿蘇變種NRC-19菌株的培養(yǎng)過程中對多氧霉素B進行檢測與使用HPLC方法進行準確檢測的結果較為接近。權利要求1、一種多氧霉素B的定量分析檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)確立牛津杯法測定多氧霉素B的生物檢測條件平板厚度為底層培養(yǎng)基20mL，上層培養(yǎng)基5mL；培養(yǎng)溫度為30-32℃；牛津杯的加液量為200μL；加菌層培養(yǎng)基的菌懸液濃度為5×106cfu/ml；(2)標準曲線的建立在步驟(1)的生物檢測條件下，取多氧霉素B的標品和樣品溶于緩沖液中，用牛津杯法測定在不同濃度時抑菌圈的直徑大小，并用抑菌圈直徑為橫坐標，多氧霉素B濃度的對數值為縱坐標，繪制標準曲線；(3)產多氧霉素B菌株的搖瓶發(fā)酵及發(fā)酵液的后處理將產多氧霉素B的菌株的孢子在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至孢子成熟，然后將成熟孢子接種于種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)后再將活化的種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)并取樣，最后將發(fā)酵液離心并用氯仿抽提；(4)牛津杯法測定發(fā)酵液中多氧霉素B的含量，步驟包括在平板上加20mL底層培養(yǎng)基和5mL加菌層培養(yǎng)基，在加有底層和加菌層培養(yǎng)基的平板上放置牛津杯，然后將步驟(3)中所述經氯仿抽提處理后的發(fā)酵液滴加到牛津杯中，其中牛津杯的加樣量為200μL，隨后將滴加抗生素的平板放入培養(yǎng)箱中在30-32℃下進行培養(yǎng)，最后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，根據標準曲線測得多氧霉素B在發(fā)酵液中的含量。2、根據權利要求1所述的多氧霉素B的定量分析檢測方法，其特征是，步驟(3)中所述的固體培養(yǎng)基為YMS固體培養(yǎng)基，其組成部分的質量百分比為酵母膏0.39%，可溶性淀粉0.39%，麥芽糖0.96%，CoCL.6H200.0005%，瓊脂1.92%，蒸餾水96.34%。3、根據權利要求1所述的多氧霉素B的定量分析檢測方法，其特征是，步驟(3)中所述的種子培養(yǎng)基溶液組成部分的質量百分比為黃豆餅粉0.97%，玉米粉0.97%，葡萄糖0.97%，KH2P040.01%，NaCl0.01%，CaC030.03%，蒸餾水97.04%。4、根據權利要求1所述的多氧霉素B的定量分析檢測方法，其特征是，步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基溶液組成部分的質量百分比為黃豆餅粉1.89%,玉米粉1.42%，葡萄糖1.89%，KH2P040.09%，NaCl0.09%，CaC030.27%，蒸餾水94.35%。全文摘要本發(fā)明公開了一種多氧霉素B快速定量分析的檢測方法，該檢測方法包括建立牛津杯法測定多氧霉素B的條件，并用多氧霉素B的標準溶液在生物檢測條件下繪制一條線性回歸曲線，然后利用牛津杯鑒定各階段的發(fā)酵液所產生的抑菌圈大小，從而測得多氧霉素B在發(fā)酵液中的含量。本發(fā)明解決了目前在工業(yè)發(fā)酵生產多氧霉素B中存在的檢測不方便、HPLC方法操作繁瑣、勞動強度大、分析時間長、費用較貴等缺點，本方法可用于工業(yè)化發(fā)酵生產的多氧霉素B的檢測中。文檔編號C12Q1/18GK101302558SQ20081003956公開日2008年11月12日申請日期2008年6月26日優(yōu)先權日2008年6月26日發(fā)明者力孫,鐘建江申請人:上海交通大學