專利名稱：全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種全蠶粉，尤其是涉及一種采用反相高效液相色譜測(cè)定全蠶粉中 1-脫氧野尻霉素含量的方法。
背景技術(shù)：
全蠶粉中1-脫氧野尻霉素是其降血糖的主要活性成分。1-脫氧野尻霉素及其衍生物具有高效廣泛的藥理作用，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥、肥胖癥、病毒感染(HIV)等方面有著較顯著的治療效果。如何有效檢測(cè)1-脫氧野尻霉素產(chǎn)品的質(zhì)量，創(chuàng)建一種簡(jiǎn)便、快速、高效的檢測(cè)1-脫氧野尻霉素含量的方法逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。測(cè)定1-脫氧野尻霉素含量的方法主要有以下四種第一種是離子色譜測(cè)定法，陳智毅等利用該方法分別對(duì)黃血蠶、蠶沙中1-脫氧野尻霉素進(jìn)行了定量分析。第二種是反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，歐陽臻等、Jin等分別對(duì)這種方法進(jìn)行了研究，并測(cè)定了桑葉和全蠶粉中ι-脫氧野尻霉素的含量。結(jié)果顯示，離子色譜測(cè)定法具有樣品處理簡(jiǎn)單、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但分離效果和可靠性不夠理想；反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，具有靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)，但要求的檢測(cè)器價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室中很少配置，在應(yīng)用普及方面受到較大限制。第三種是反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)法，此法雖然所用檢測(cè)器普及于大多實(shí)驗(yàn)室，但是其樣品需要柱前衍生化，衍生過程復(fù)雜，條件較難把握。第四種，用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器來測(cè)定家蠶體內(nèi)1-脫氧野尻霉素，此種檢測(cè)器沒有紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器靈敏。因此，探索一種在普通實(shí)驗(yàn)室就能進(jìn)行測(cè)定復(fù)雜混合物中1-脫氧野尻霉素的含量，并且樣品處理較簡(jiǎn)單的方法是頗有現(xiàn)實(shí)意義的工作，既可提供在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行1-脫氧野尻霉素的分析，也便于企業(yè)進(jìn)行家蠶藥用產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的 1-脫氧野尻霉素質(zhì)量檢測(cè)。為此，探索穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測(cè)蠶樣品中的1-脫氧野尻霉素含量的方法，研究RP-HPLC-UV方法的具體技術(shù)參數(shù)，獲得穩(wěn)定準(zhǔn)確測(cè)定結(jié)果，具有重要的現(xiàn)實(shí)
眉、ο采用紫外末端吸收法檢測(cè)全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量，目前在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。中國(guó)專利CN1883513公開一種全蠶粉中降血糖活性物質(zhì)的分離方法。其分離步驟為首先將全蠶粉與浸提緩沖液按1 1的比例混勻，置4 8°C環(huán)境下浸提、過濾、分離，進(jìn)行全蠶粉降血糖有效成分的提取；然后將全蠶粉浸提液上離子交換柱層析，進(jìn)行陽離子交換柱層析，并調(diào)整PH值；再洗脫、樣品收集、濃縮與干燥。該發(fā)明保持了家蠶體內(nèi)的原有活性物質(zhì)，降血糖活性成分單一；產(chǎn)出量高，獲得率為2. 7%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種不僅具有精密度較高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好、加樣回收率符合要求、方法簡(jiǎn)便實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，而且可以普及于一般實(shí)驗(yàn)室等，并可用于全蠶粉制品中ι-脫氧野尻霉素的質(zhì)量控制的全蠶粉中ι-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法。本發(fā)明包括以下步驟1)稱定1-脫氧野尻霉素對(duì)照品各兩份，作為對(duì)照品液1和對(duì)照品液2 ；2)吸取對(duì)照品液1和對(duì)照品液2，進(jìn)樣；3)稱取待測(cè)全蠶粉，加入石油醚，在水浴中加熱回流提取，過濾，棄去濾液，揮干石油醚，得產(chǎn)物A ；4)在產(chǎn)物A中加入甲醇，超聲提取，過濾，將濾液濃縮，再置于中性氧化鋁柱，洗脫，收集洗脫溶液，蒸干，再用甲醇溶解并定容，作為供試品溶液；5)對(duì)步驟4)所得的供試品溶液進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)峰面積值，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算步驟幻所用待測(cè)全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量。在步驟1)中，所述對(duì)照品液1的濃度可為0. 82mg/mL,對(duì)照品液2的濃度可為 0. 74mg/mL。在步驟2)中，所述吸取對(duì)照品液1和對(duì)照品液2的可為各10 μ 1。在步驟幻中，所述待測(cè)全蠶粉每份可為0.5 2g，加入石油醚的量可為15 60mL ；所述在水浴中加熱回流提取的時(shí)間可為0. 5 池。在步驟4)中，在產(chǎn)物A中加入甲醇的量可為15 60mL ；所述超聲提取的時(shí)間可為0. 5 濁；所述將濾液濃縮，可濃縮至1 IOmL ；所述洗脫可采用0. 02mol/L HCl洗脫并調(diào)節(jié)流速至20 60滴/min。在步驟幻中，所述HPLC分析可采用包含有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)可為190 400nm，所用高效液相色譜的固定相為反相色譜柱，柱溫可為20 50°C;所述流動(dòng)相可為水與乙腈的混合液，其中有機(jī)相的比例可為20% 90%，以流動(dòng)相質(zhì)量為100 %計(jì)，水在流動(dòng)相中所占的質(zhì)量百分比可為10 % 80 %，優(yōu)選20 % 70 %，最好為 30% 60%。本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)在于，在上述流動(dòng)相和波長(zhǎng)條件下可以很準(zhǔn)確地測(cè)定將全蠶粉及其制劑中1-脫氧野尻霉素的含量。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果主要體現(xiàn)在以下幾方面1)所建立的高效液相色譜法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)；2)目前，1-脫氧野尻霉素通用測(cè)定方法均需柱前衍生化或者直接用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，而本發(fā)明所用的檢測(cè)方法無需柱前衍生化操作，具有高效、快速、低污染的優(yōu)占.
^ \\\ 3)本發(fā)明采用紫外末端吸收法檢測(cè)全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量，目前，在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，方法簡(jiǎn)便、實(shí)用，可以普及于一般實(shí)驗(yàn)室，測(cè)定結(jié)果可靠穩(wěn)定，可用于全蠶粉制品中ι-脫氧野尻霉素的質(zhì)量控制。


圖1為1-脫氧野尻霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖1中，橫坐標(biāo)為1-脫氧野尻霉素濃度 (μ g)，縱坐標(biāo)為峰面積。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定方法如下稱定兩份質(zhì)量為8. 20mg和7. 40mg的1_脫氧野尻霉素對(duì)照品，分別配制成濃度為 0. 82mg/mL、0. 7%ig/mL，作為對(duì)照品液1和對(duì)照品液2。吸取對(duì)照品液1和對(duì)照品液2各10 μ 1，各進(jìn)樣一次。分別稱取批號(hào)為200801、200802和200803三個(gè)批次全蠶粉，各3份，每份lg，分別加入石油醚30mL，在水浴中加熱回流提取lh，過濾，棄去濾液，揮干溶劑。加入甲醇30mL，超聲提取lh，過濾，將濾液濃縮至3mL，將其置于中性氧化鋁柱，用0. 02mol/L HCl洗脫，調(diào)節(jié)流速至40滴/min，收集洗脫溶液IOOmL,蒸干，甲醇溶解并定容至10mL，作為供試品溶液。進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)峰面積值，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算樣品中1-脫氧野尻霉素含量。 經(jīng)計(jì)算，全蠶粉樣品中1-脫氧野尻霉素含量為0. 5957%，不同批次全蠶粉1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定結(jié)果如表1所示。表1不同批次全蠶粉1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定
權(quán)利要求
1.全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟1)稱定1-脫氧野尻霉素對(duì)照品各兩份，作為對(duì)照品液1和對(duì)照品液2；2)吸取對(duì)照品液1和對(duì)照品液2，進(jìn)樣；3)稱取待測(cè)全蠶粉，加入石油醚，在水浴中加熱回流提取，過濾，棄去濾液，揮干石油醚，得產(chǎn)物A ；4)在產(chǎn)物A中加入甲醇，超聲提取，過濾，將濾液濃縮，再置于中性氧化鋁柱，洗脫，收集洗脫溶液，蒸干，再用甲醇溶解并定容，作為供試品溶液；5)對(duì)步驟4)所得的供試品溶液進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)峰面積值，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算步驟 3)所用待測(cè)全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量。
2.如權(quán)利要求1所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于在步驟1)中，所述對(duì)照品液1的濃度為0.82mg/mL，對(duì)照品液2的濃度為0. 7%ig/mL。
3.如權(quán)利要求1所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于在步驟2)中，所述吸取對(duì)照品液1為10μ1，所述對(duì)照品液2為10μ 1。
4.如權(quán)利要求1所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于在步驟3)中，所述待測(cè)全蠶粉每份為0.5 2g，加入石油醚的量為15 60mL。
5.如權(quán)利要求1所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于在步驟3)中，所述在水浴中加熱回流提取的時(shí)間為0.5 池。
6.如權(quán)利要求1所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于在步驟4)中，在產(chǎn)物A中加入甲醇的量為15 60mL。
7.如權(quán)利要求1所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于在步驟 4)中，所述超聲提取的時(shí)間為0. 5 池；所述將濾液濃縮，是濃縮至1 IOmL ；所述洗脫采用0. 02mol/L HCl洗脫并調(diào)節(jié)流速至20 60滴/min。
8.如權(quán)利要求1所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于在步驟5)中，所述HPLC分析是采用包含有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為 190 400nm，所用高效液相色譜的固定相為反相色譜柱，柱溫為20 50°C ；所述流動(dòng)相為水與乙腈的混合液，其中有機(jī)相的比例為20% 90%，以流動(dòng)相質(zhì)量為100%計(jì)，水在流動(dòng)相中所占的質(zhì)量百分比為10% 80%。
9.如權(quán)利要求8所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于所述水在流動(dòng)相中所占的質(zhì)量百分比為20% 70%。
10.如權(quán)利要求9所述的全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，其特征在于所述水在流動(dòng)相中所占的質(zhì)量百分比為30 % 60 %。
全文摘要
全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量的測(cè)定方法，涉及一種全蠶粉。稱定1-脫氧野尻霉素對(duì)照品各兩份，作為對(duì)照品液1和2；吸取對(duì)照品液1和2，進(jìn)樣；稱取待測(cè)全蠶粉，加入石油醚，在水浴中加熱回流提取，過濾，棄去濾液，揮干石油醚，得產(chǎn)物A；在A中加入甲醇，超聲提取，過濾，將濾液濃縮，再置于中性氧化鋁柱，洗脫，收集洗脫溶液，蒸干，再用甲醇溶解并定容，作為供試品溶液；對(duì)所得的供試品溶液進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)峰面積值，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算所用待測(cè)全蠶粉中1-脫氧野尻霉素含量。具有精密度較高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好、加樣回收率符合要求、方法簡(jiǎn)便實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，可普及于一般實(shí)驗(yàn)室等，并可用于全蠶粉制品中1-脫氧野尻霉素的質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)G01N30/89GK102507831SQ20111030907
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者楊輝, 許光輝, 趙艷麗, 黃亦琦 申請(qǐng)人:廈門市醫(yī)藥研究所