專利名稱：：蛋白、核酸和藥物的制作方法蛋白、核酸和藥物本發(fā)明涉及衍生自TGF-(33的蛋白、這種蛋白的生物活性片段和編碼所述蛋白的核酸。本發(fā)明也提供了所述蛋白或生物活性片段的衍生物。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的蛋白、片段、衍生物或核酸的藥物，以及利用本發(fā)明的蛋白、片段、衍生物或核酸的治療方法。轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-p)是參與調(diào)節(jié)很多細胞過程的生長因子的超家族的部分，所述細胞過程包括增殖、遷移、細胞凋亡、粘連、分化、炎癥、免疫抑制和胞外蛋白的表達。TGF-(3有3種哺乳動物同工型，稱為TGF-|31、TGF-卩2和TGF+3。TGF-P是由廣泛類型的細胞產(chǎn)生的，所述廣泛類型的細胞包括上皮細胞、內(nèi)皮細胞、造血細胞、神經(jīng)元細胞和結(jié)締組織細胞。TGF-(3在多種不同的治療環(huán)境有功效，并且TGF-(33同工型尤其有許多有利的治療用途。由于TGF-P3的治療潛力，其藥學應用受到很多關(guān)注。全長的野生型TGF-卩3的氨基酸序列以序列ID號1提出，編碼該TGF-卩3的cDNA以序列ID號2^是出。已知TGF-卩3在調(diào)節(jié)傷口愈合反應中起關(guān)鍵作用。TGF-(33的活性可能影響傷口愈合的速度和愈合引起的瘢痕形成程度。TGF-P3還可用于治療纖維化癥狀，肺纖維化、肝硬化、硬皮?。谎苌刹“Y，再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨誘導、體外受精、口腔粘膜炎、腎病、預防、減少或抑制瘢痕形成、促進外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元重連接、預防、減少或抑制眼外科手術(shù)(例如LASIK或PRK手術(shù))并發(fā)癥或眼后部瘢痕形成(例如增殖性玻璃體纟見網(wǎng)膜病變)。TGF-P3自身具備的治療用途已經(jīng)建立了對生物活性TGF-(33蛋白來源的公認需求，已經(jīng)^f故出^[艮多嘗試來通過重組方法產(chǎn)生這種有價值的蛋白。然而，現(xiàn)有的產(chǎn)生TGF-(33的方法被嚴重限制了，這是由于為了獲得生物活性分子而必須再折疊這種復雜的蛋白質(zhì)。TGF-卩以包含兩個112個氨基酸的亞基的同型二聚體蛋白形式天然存在。這些TGF-(33亞基的每一個在活性肽片段的第58個和第67個殘基間都含有a螺旋形成結(jié)構(gòu)域。除了殘基58和67之間的a螺旋外，每一個TGF-P3亞基還含有許多亞基內(nèi)部鍵，所述鍵包含鹽橋和二硫鍵。TGF-(33是以100-kDa的潛在的無活性前體分子(LTGF-(33)形式分泌的。所述LTGF-(33分子由以下成分組成i)C末端MkDa二聚體信號肽(活性片段)；以及ii)潛在相關(guān)肽(LAP)。LTGF-P是通過LAP從活性片段解離而被激活的。LTGF-P的裂解可通過酶如內(nèi)肽酶(弗林蛋白酶、纖溶酶和凝血酶)的作用來介導，或通過酸化細胞外周空間來介導?；钚訲GF-P二聚體片段通過疏水和離子相互作用來穩(wěn)定，所述相互作用通過亞基間的二硫鍵進一步加強。每個單體包括通過4個內(nèi)部二硫^;中的3個連鎖的幾個延伸的|3鏈，并形成已知為"半胱氨酸結(jié)"的緊密結(jié)構(gòu)。由于生物活性TGF-(33分子(如上文已顯示的，其是含有8個鏈內(nèi)二硫鍵和1個鏈間二硫鍵的同型二聚體蛋白)的復雜性，它們最初是在真核生物中表達。然而，使用真核生物表達系統(tǒng)可能實現(xiàn)的相對低的表達水平以及這種方法的高成本，意味著為了提高TGF-(33生產(chǎn)的商業(yè)效率要對使用微生物宿主進行考察。用微生物宿主如大腸桿菌(￡.//)表達重組分子(如包含多個二硫鍵的TGF-P3)的不利因素在于，產(chǎn)生的蛋白通常沒有正確折疊并且經(jīng)常形成不可溶的包涵體。這些包涵體需要增溶，然后復性以使蛋白再折疊成其天然的生物活性構(gòu)象。為有效復性TGF-P3同型二聚體，需要再產(chǎn)生正確取向的共價二硫鍵。假設(shè)有9個二硫鍵，允許34,459,245種可能的二硫鍵組合，則通過隨機的二硫4建形成方法來形成正確的TGF-(33同型二聚體的可能性很低。因此就不驚訝于重組產(chǎn)生的TGF-P3的再折疊嚴重影響了它的生產(chǎn)，因為這種折疊可能需要達144小時，并且通常僅獲得20%左右的再折疊效率。本發(fā)明的目的之一是排除或減少現(xiàn)有技術(shù)存在的一些問題。本發(fā)明某些方面的目的之一是提供TGF-P3(或其片段或衍生物)，所述TGF-(33(或其片段或衍生物)與野生型TGF-(33相比具有提高的再折疊效率。本發(fā)明某些方面的另一個目的是提供具有TGF-P3活性的不同于野生型TGF-P3的藥劑。所述藥劑提供了對于天然產(chǎn)生的TGF-P3的有價值的供選方案。在本發(fā)明的第一個方面，提供了TGF-p3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-P3的氨基酸殘基58和67之間的a螺旋形成區(qū)包括至少一個穩(wěn)固a螺旋的置換。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明也提供了編碼TGF-(33或其片段或衍生物的核酸。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的第一個方面公開的新的TGF-|33與天然形成的TGF-P3有相同的生物活性，并且與野生型TGF-|33相比有顯著改善的蛋白再折疊的效率。這種增加的蛋白再折疊的效率構(gòu)成顯著重要的優(yōu)勢，因為其簡化了用于生產(chǎn)生物活性TGF-(33的再折疊的條件，又極大的增加了所述蛋白(或所述蛋白的片段或衍生物)的產(chǎn)率，所述蛋白可通過使用原核蛋白表達系統(tǒng)來生產(chǎn)。不希望受到任何布支設(shè)的限制，本發(fā)明的發(fā)明人相信，將穩(wěn)固a螺旋的置換引入a螺旋形成區(qū)可有益降低此區(qū)域形成的a螺旋的靈活性。該降低的靈活性有助于^R高本發(fā)明第一個方面的TGF-P3的正確再折疊，以生產(chǎn)生物活性蛋白質(zhì)(或其片段或衍生物)。a螺旋的穩(wěn)固(通過穩(wěn)固a螺旋的置換)賦予的降低的靈活性足以增加正確再折疊的TGF-P3的產(chǎn)率(尤其是再折疊的TGF-(33二聚體)，然而令人驚奇的是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述置換不會改變本發(fā)明第一個方面的TGF-P3的生物活性，并且所述TGF-(33的生物和治療效力也不會降低。除了上下文另有要求夕卜，本說明書中氨基酸殘基的編號是基于TGF-卩3活性肽部分的氨基酸序列。例如，對"全長的野生型TGF-P3"的提及，通常用來指顯示在序列ID號1中活性肽的氨基酸序列，而對在氨基酸殘基58和67之間的a螺旋形成區(qū)也是作相應的解釋。一個穩(wěn)固a螺旋的置換可優(yōu)選包括在全長的野生型TGF-卩3的63位置上的甘氨酸殘基的置換。然而，合適的置換可另外的或做為選擇的包括例如，全長的野生型TGF-J33的60或67位置上的一個或兩個蘇氨酸的置換，或者全長的野生型TGF-P3在66位置上的天冬酰胺的置換。優(yōu)選的是，本發(fā)明使用的穩(wěn)固a螺旋的置換不包括纈氨酸61的置換。本發(fā)明的"穩(wěn)固a螺旋的置換"應理解為如下置換其中存在于野生型TGF-|33中一個指定的氨基酸殘基被更傾向于形成a螺旋的殘基替換。因此引入穩(wěn)固a螺旋的置換的替換氨基酸殘基不必需是其本身容易穩(wěn)定整合到a螺旋上的氨基酸殘基，而只需比被置換的氨基酸殘基有更多的穩(wěn)定整合傾向性。然而，通常優(yōu)選的是，作為穩(wěn)固a螺旋的置換的部分而引入的替換氨基酸殘基是確實有利于整合入a螺旋的氨基酸殘基。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以引入本發(fā)明第一個方面的穩(wěn)固a螺旋的置換中的優(yōu)選替代氨基酸殘基可以是選自下述組的任一個氨基酸或氨基酸的組合丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，曱硫氨酸和苯丙氨酸組成。這些優(yōu)選的替換氨基酸殘基都被認為是適用于全長的野生型TGF-(33的63位置上甘氨酸殘基的穩(wěn)固a螺旋的置換。也就是說，選自所述組的替換氨基酸殘基可在58和67氨基酸殘基間a螺旋形成區(qū)中的任意位置置換，在所述位置所述替換氨基酸殘基可提供穩(wěn)固a螺旋的置換。盡管上述列舉的氨基酸殘基代表了用于穩(wěn)固a螺旋的置換的優(yōu)選殘基，也應該可以理解有一些可選^^的定性和定量系統(tǒng)可以測定促成a螺旋形成的氨基酸殘基的傾向性(和用于穩(wěn)固a螺旋的置換的殘基的適合性)，合適的用于穩(wěn)固a螺旋的置換的氨基酸殘基可參考任何這些系統(tǒng)并結(jié)合TGF-J33序列的知識進行選沖奪。作為例子，Chou和Fasman說明的定性系統(tǒng)鑒定了基于它們形成a螺旋的傾向性的5種不同分類的氨基酸殘基。它們依次是強螺旋形成型；弱螺旋形成型；中性形式；弱螺旋破壞型；以及強螺旋破壞型。針對本發(fā)明說明書，氨基酸殘基谷氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、丙氨酸、曱硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸可被認為是螺旋形成型，其中谷氨酰胺、曱硫氨酸、丙氨酸和亮氨酸構(gòu)成強螺旋形成型。相反，天冬酰胺、甘氨酸和脯氨酸可被認為構(gòu)成螺旋破壞型，其中甘氨酸和脯氨酸是強螺旋破壞型。因此，如果是參考該定性等級評價a螺旋形成的傾向性，那應該認可的是，盡管穩(wěn)固a螺旋的置換可優(yōu)選氨基酸殘基被螺旋形成型替換的置換，但適合的穩(wěn)固a螺旋的置換可選擇地利用中性形成型或甚至螺旋破壞型，這取決于待替換的氨基酸殘基的性質(zhì)。例如，在中性形式的氨基酸殘基是穩(wěn)固a螺旋的置換的對象的情況下，適合的替換氨基酸殘基可以是強螺旋形成型或弱螺旋形成型。在強螺旋破壞型是穩(wěn)固a螺旋的置換的對象的情況下，替換氨基酸殘基可以是強螺旋形成型、弱螺旋形成型、中性形式氨基酸或弱螺旋破壞型。相應的，本發(fā)明的穩(wěn)固a螺旋的置換可包括強螺旋破壞型被弱螺旋破壞型、或中性形式、或弱螺旋形成型或強螺旋形成型置換?？蛇x擇的或另外的，適合的穩(wěn)固a螺旋的置換可包括弱螺旋破壞型被中性形式、弱螺旋形成型或強螺旋形成型置換?？蛇x擇的或另外的，適合的穩(wěn)固a螺旋的置換可包括中性形式氨基酸被弱螺旋形成型或強螺旋形成型置換。可選擇的或另外的，適合的穩(wěn)固a螺旋的置換可包括弱螺旋形成型被強螺旋形成型置換。氨基酸殘基形成a螺旋的傾向性、以及因此其用作穩(wěn)固a螺旋的置換部分的適合性的一種可選擇的評價是基于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何定量等級數(shù)。這種用于確定氨基酸殘基用于穩(wěn)固a螺旋的置換的適合性的定量等級的例子示于表1。該表提供了以kcal/mol標度的值，反映了氨基酸促成a螺旋的傾向性。表l中的高值伴隨形成a螺旋的低的傾向性。如此，依照本發(fā)明第一個方面的要求，當使用定量等級(如表1所顯示的)評價氨基酸殘基用于穩(wěn)固a螺旋的置換的適合性時，適合的穩(wěn)固a螺旋的置換是其中氨基酸殘基被比被替換殘基有更大的螺旋形成傾向性(表1中顯示的更低的kcal/mol值)的氨基酸殘基替換。依照本發(fā)明可被利用的適合的置換包括引入人工的替換氨基酸的那些置換?？捎幸嬗糜诜€(wěn)固a螺旋的人工氨基酸的適合的例子包括具有烷基和鞋基側(cè)鏈的氨基酸殘基。丙氨酸代表了特別優(yōu)選的適合用于穩(wěn)固a螺旋的置換的替換氨基酸殘基。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的第一個方面的TGF-(33或其片段或衍生物包括在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸被丙氨酸替換。優(yōu)選的本發(fā)明第一個方面的TGF-卩3的氨基酸序列以序列ID號3顯示(Gly-63Ala)，編碼該TGF-卩3的DNA以序歹'jID號4顯示。含有在全長的野生型TGF-P3的63位置上的丙氨酸的置換的序列ID號3的TGF+3的片段或衍生物，代表了優(yōu)選的本發(fā)明第一個方面的TGF-(33的片段或衍生物。適合的置換可以是其中全長的野生型TGF-(33中58和67之間的一個或多個氨基酸殘基被一個或多個天然的或人工的氨基酸殘基替換的置換。作為進一步說明，適合的置換可包括單個的氨基酸殘基被一個或多個替換殘基置換，或者多于一個的氨基酸殘基被一個或多個替換殘基置換。優(yōu)選的置換可以是其中氨基酸殘基數(shù)是保守的置換，即其中被置換的氨基酸殘基數(shù)與引入的替換氨基酸殘基數(shù)是相同的置換。還應該理解的是，優(yōu)選的待替換的氨基酸殘基(或多個殘基)可參考如上討論的定性或定量等級來選擇。因此，適合作為穩(wěn)固ot螺旋的置換的對象的氨基酸可以是分類為螺旋破壞型、或優(yōu)選強螺旋破壞型，參考如上討論的定性等級。參考表l顯示的定量等級，適合作為穩(wěn)固a螺旋的置換的對象的氨基酸可以優(yōu)選螺旋傾向性值大于或等于0.50、更優(yōu)選螺旋傾向性值大于或等于0.60和最優(yōu)選螺旋傾向性值是1.00的氨基酸。本發(fā)明的發(fā)明人相信，本發(fā)明的第一個方面的TGF-(33、或其生物活性片段或其衍生物可用于其中希望利用野生型TGF-(33的生物活性的所有環(huán)境中。這些環(huán)境具體包括但不限于治療用途。與所述治療用途一致，本發(fā)明也提供了依據(jù)本發(fā)明的第一個方面的TGF-(33、或其片段或衍生物作為藥物的用途。應該可以理解，盡管可能優(yōu)選的是本發(fā)明第一個方面的TGF-(33的片段或衍生物包括含有穩(wěn)固a螺旋的置換的全長的a螺旋形成區(qū)，但這種需要不是必須的情況。適合的片段或衍生物可包括截短的a螺旋形成區(qū)，只要所述截短的a螺旋形成區(qū)包含至少一個穩(wěn)固a螺旋的置換即可。在本發(fā)明的第二方面提供了其中在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸殘基被脯氨酸替換的TGF-P3或其片段或衍生物。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的第二方面的TGF-(33或其片段或衍生物的核酸。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的第二方面的蛋白(或其片段或衍生物)具有與野生型TGF-P3相當?shù)纳锘钚?。這個發(fā)現(xiàn)是意想不到的，因為認為脯氨酸在通常與a螺旋形成有關(guān)的TGF-P3區(qū)域中的出現(xiàn)將干擾此種蛋白的二級結(jié)構(gòu)，從而削弱其生物功能。盡管本發(fā)明的第二方面的TGF-P3的再折疊效率低于野生型TGF-f33，但預期的功能削弱驚奇地沒有發(fā)生。因此本發(fā)明的第二方面的蛋白(或其片段或衍生物)給本領(lǐng)域提供了有價值的貢獻，因為它們擴展了對于技術(shù)人員有用的能夠發(fā)揮TGF-(33活性的化合物的所有組成成分。所述化合物可以例如用于其中需要治療性地使用TGF-P3活性的環(huán)境。優(yōu)選的本發(fā)明的第二方面的優(yōu)選TGF-P3的氨基酸序列以序列ID號5顯示(Gly-63Pro),編碼所述TGF-(33的DNA以序列ID號6顯示。含有在全長的野生型TGF-p3中63位置上脯氨酸的置換的序列ID號5的TGF-(33的片段或其衍生物，代表了優(yōu)選的本發(fā)明的第二方面的TGF-P3的片段或其衍生物。若本發(fā)明的第二方面TGF-P3或其片段或衍生物可被應用于其中需要治療性地利用野生型TGF-(33生物活性的環(huán)境，則應該可以理解也提供了本發(fā)明的第二方面的TGF-P3或其片段或衍生物作為藥物的用途。本發(fā)明的發(fā)明人相信所述藥物可用于其中已知利用TGF-(33的生物活性的全部臨床環(huán)境。在本發(fā)明的第三方面，提供了包括全長的野生型TGF-P3中12位置上谷氨酸殘基的置換和/或全長的野生型TGF-P3中52位置上精氨酸殘基的置換的TGF-(33或其片段或衍生物。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的第三方面的編碼TGF-(33或其片段或衍生物的核酸。應該可以理解，本發(fā)明第三方面因此包括其中全長的野生型TGF-卩3中12位置上的谷氨酸被置換但是保留了全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸的TGF-P3。本發(fā)明第三方面也包括其中保留了全長的野生型TGF-P3中12位置上的谷氨酸但是全長的野生型TGF-(33中52位置的精氨酸被置換的TGF-P3。然而，優(yōu)選的是，本發(fā)明第三方面的TGF-(33包括全長的野生型TGF-卩3中12位置上的谷氨酸殘基的置換和全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸殘基的置換。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明第三方面的蛋白也具有與野生型TGF-P3的生物活性相當?shù)纳锘钚?。這個發(fā)現(xiàn)是預料不到的，因為置換一個或兩個全長的野生型TGF-P3中12位置上的谷氨酸殘基和/或全長的野生型TGF-卩3中52位置的精氨酸殘基，破壞了通常在野生型TGF-P3中存在的亞基內(nèi)部的鹽橋的形成。不能完成正確的鹽橋形成的這種失敗，可以預期降低本發(fā)明的第三方面的TGF-(33的生物活性，因為蛋白質(zhì)如TGF-卩3的生物活性通常被認為是依賴于它們的構(gòu)象。此外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明第二方面的TGF-P3顯示了成功再折疊的效率，所述效率與野生型TGF-P3所觀察到的一樣高。這個發(fā)現(xiàn)非常令人驚訝，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員認為的是，本發(fā)明第二方面的TGF-卩3中必然發(fā)生的亞基內(nèi)部鹽橋形成的缺失會有害地影響再折疊發(fā)生率，因而會降低生物活性TGF-(33的產(chǎn)率。因此本發(fā)明的第三方面的蛋白服務于擴展了對于技術(shù)人員有用的能夠發(fā)揮TGF-P3活性的化合物的所有組成成分。如上文記錄的，所述化合物的可用性在其中需要治療性地利用TGF-(33活性的環(huán)境中是重要的。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，全長的野生型TGF-(33中12位置上的谷氨酸或全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸中不管哪一個都可被選自下述組的任一個氨基酸殘基(或氨基酸殘基的任何組合)置換絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸。優(yōu)選的是，絲氨酸作為替換氨基酸殘基用于本發(fā)明的第三方面的TGF-(33或其片段或衍生物。絲氨酸可被用來替換全長的野生型TGF-(33中12位置上的谷氨酸或全長的野生型TGF-P3中52位置的精氨酸。最優(yōu)選地，絲氨酸既用于替換全長的野生型TGF-(33中12位置上的谷氨酸，又用于替換全長的野生型TGF-(33中52位置的精氨酸。優(yōu)選的本發(fā)明第三方面的TGF-P3的第一個例子以序列ID號7顯示。本發(fā)明包含序列ID號7的生物活性片段或衍生物，所述序列ID號7包括Glul2-Ser置換。編碼所述優(yōu)選TGF-卩3的cDNA在序列ID號8中顯示。優(yōu)選的本發(fā)明第三方面的TGF-(33的第二個例子以序列ID號9顯示。的本發(fā)明的片段或衍生物。編碼所述優(yōu)選TGF-|33的cDNA以序列ID號IO顯示。優(yōu)選的本發(fā)明第三方面的TGF-|33的第三個例子以序列ID號11顯示。包括Glul2-Ser置換和Arg52-Ser置換的序列ID號11的生物活性片段或衍生物也構(gòu)成了優(yōu)選的本發(fā)明的片段或衍生物。編碼所述優(yōu)選TGF-P3的cDNA以序列ID號12顯示。本發(fā)明的發(fā)明人相信，本發(fā)明第三方面的TGF-P3或其生物活性片段或其衍生物可用于其中可能希望利用野生型TGF-P3生物活性的全部環(huán)境。這些環(huán)境包括但不限于TGF-P3的治療用途。相應的，本發(fā)明也提供了本發(fā)明第三方面的TGF-(33或其片段或衍生物作為藥物的用途。本發(fā)明的TGF-P3或其生物活性片段或其衍生物可用于治療傷口(包含慢性傷口例如潰瘍)。它們尤其可用于通過預防、減少或抑制瘢痕形成來促進加速傷口愈合，和/或促進傷口的上皮再生。本發(fā)明的TGF-(33還可用于實現(xiàn)預防或治療纖維化疾病，所述疾病可獨立的選自包括肺纖維化、肝硬化、硬皮病和腎小球腎炎、肺纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、肌肉纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和子宮纖維化的組。本發(fā)明的TGF-P3可用于治療硬皮病、血管生成病癥、再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導、體外受精、口腔粘膜炎和腎病。作為例子，野生型二聚體TGF-P3在動物模型和臨床中的局部應用已經(jīng)顯示能夠加速慢性、非愈合的壓迫性潰瘍的愈合速度；降低了口腔粘膜炎的發(fā)病率、嚴重度和持續(xù)時間；并降低了放射性胃腸道綜合征的不良副作用，所述綜合征是由癌癥治療中的放療和化療導致干細胞損傷而形成的。本發(fā)明的發(fā)明人相信本發(fā)明的TGF-P3或其片段或衍生物可有益地用于全部的這些適應癥。本發(fā)明的TGF-(33可與天然存在的TGF-P3相同的方式用于例如治療可以例如獨立選自下述的狀態(tài)纖維化疾病、硬皮病、血管生成病癥、再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導、體外受精、口腔粘膜炎、腎病，預防、減少或抑制瘢痕形成，促進外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元重連"l妄和預防、減少或抑制眼外科手術(shù)(如LASIK或PRK手術(shù))并發(fā)癥。本發(fā)明的TGF-P3可用于治療唇和腭裂(例如與這種狀態(tài)的手術(shù)修補相結(jié)合)，和減少或抑制瘢痕形成和促進腱的愈合。本發(fā)明公開的TGF-卩3的突變型能夠以與天然存在的TGF-(33相同的方式促進加速的傷口愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。它們也可以促進上皮細胞的損傷部位的上皮再生。"本發(fā)明的TGF-P3"包括本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任何方面的任何的突變型TGF-(33。應該可以理解本發(fā)明的TGF-(33不包含TGF-pi或因此，可基于能夠減少施用了TGF-f33的傷口處的瘢痕形成來將TGF-f33與TGF-卩1或TGF-|32區(qū)分。本發(fā)明的TGF-(33可優(yōu)選是非天然TGF-(33。本發(fā)明任何方面的TGF-P3都可用于制備用于治療其中可能希望利用TGF-(33的任何狀態(tài)的藥物。這種用途包括但不限于，治療任何本說明書中考慮到的任何狀態(tài)?？梢詢?yōu)選的是，本發(fā)明的TGF-P3用于制備用于促進加速傷口愈合，和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥劑。所述瘢痕形成可能與傷口和/或纖維化疾病有關(guān)。用本發(fā)明TGF-P3生產(chǎn)的藥物可優(yōu)選用于皮膚，或眼(例如加速皮膚或眼的愈合，或預防、減少或抑制皮膚或眼的瘢痕形成)。本發(fā)明的TGF-P3可以是潛在的TGF-(33或有活性的TGF-p3(例如有或沒有潛在相關(guān)肽)。除上下文另有要求外，所有對本發(fā)明的TGF-(33的提及都應認為包括所述TGF-P3的片段或其衍生物，其中所述片段或衍生物的特征是它們包括使它們與野生型TGF-P3的片段或其衍生物(其氨基酸序列在本發(fā)明意圖中用序列ID號l代表)相區(qū)別的置換(適當?shù)嘏c本發(fā)明的第一、第二或第三方面一致)。本發(fā)明的第一、第二或第三方面的適合的TGF-|33的片段或其衍生物可包括至少IO個氨基酸殘基，優(yōu)選至少40個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少70個氨基酸殘基，最優(yōu)選至少100個氨基酸殘基。除了上下文另有要求，本發(fā)明說明書中對TGF-P3和TGF-(33的片段的提及也包括這種蛋白或片段的衍生物。不受限制的，適合形式的衍生物的適合的例子可選自本發(fā)明TGF-(33(或其片段)的治療有效肽衍生物、包括或基于本發(fā)明TGF-P3(或其片段)藥效基團的治療有效片段或衍生物、本發(fā)明TGF-(33(或其片段)的治療有效類肽衍生物、本發(fā)明TGF-(33(或其片段)的治療有效D-氨基酸衍生物、基于本發(fā)明TGF-(33(或其片段)的治療有效肽模擬物、本發(fā)明TGF-P3(或其片段)的治療有效肽類似物、基于本發(fā)明TGF-P3(或其片段)的治療有效假肽、基于本發(fā)明TGF-(33(或其片段)的治療有效逆反式肽、基于本發(fā)明TGF-(33(或其片段)的治療有效縮酚酸肽衍生物、基于本發(fā)明TGF-(33(或其片段)的治療有效p-肽衍生物和基于本發(fā)明TGF-P3(或其片段)的治療有效逆類肽書t生物。應該可以理解，為本發(fā)明目的，"TGF-P3"可以包括單體和二聚體形式的TGF-P3。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的TGF-P3以單體和二聚體形式都能發(fā)揮其生物效應。這驚奇地與現(xiàn)有技術(shù)之前報道的不同，現(xiàn)有技術(shù)通常認為TGF-P例如TGF-(33只可在二聚體形式下才能發(fā)揮生物活性。本發(fā)明人有關(guān)本發(fā)明的TGF-p3可以單體形式使用的發(fā)現(xiàn)提供了巨大的優(yōu)點，因為所述單體形式可通過相對簡單的折疊技術(shù)(如后面進一步討論的例子)就能生產(chǎn)，因此提高了生物活性分子生產(chǎn)的速度，同時也降低了與所述分子生產(chǎn)相關(guān)的費用。優(yōu)選的是，本發(fā)明的單體TGF-(33是以序列ID號3、5、7、9或11顯示的TGF-(33，或其片段或衍生物。"本發(fā)明的藥物"包括本發(fā)明TGF-P3的任何藥物。本發(fā)明的藥物可另外或可選擇的是包括編碼本發(fā)明TGF-P3的核酸的藥物。所述藥物既包含藥物本身(即，不考慮藥物的用途)，又包括用于具體治療應用(例如治療或改善本發(fā)明說明書中考慮到的狀態(tài))的藥物。本發(fā)明的藥物預期應被理解為包括包含適合的本發(fā)明TGF-(33的片段或其衍生物，或編碼所述片段或衍生物的核酸的藥物。"本發(fā)明的治療方法"(或"本發(fā)明的方法")被認為包括任何治療方法，所述治療方法利用了治療有效量的本發(fā)明的TGF-(33，或編碼所述TGF-(33的核酸。本發(fā)明治療方法還預期應被理解為包括利用了適合的本發(fā)明的TGF-(33的片段或其衍生物，或編碼所述片段或衍生物的核酸的治療方法。包括本發(fā)明TGF-(33或其生物活性片段或衍生物的藥物可用于治療傷口(包含慢性傷口如潰瘍)。它們尤其可用于通過預防、減少或抑制瘢痕形成來促進加速傷口愈合，和/或促進傷口處上皮再形成。本發(fā)明TGF-P3可用于實現(xiàn)纖維化疾病的預防或治療，所述纖維化疾病例如肺纖維化、肝硬化和纖維化、硬皮病、腎小球腎炎、皮膚纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化、增殖性玻璃體^L網(wǎng)膜病變或子宮纖維化。本發(fā)明TGF-P3可用于治療獨立選自下述的狀態(tài)硬皮病、血管生成病癥、再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、骨和軟骨的誘導、體外受精、口腔粘膜炎、腎病、肺纖維化、肝硬化和纖維化、腎小球腎炎、皮膚纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化和子宮纖維化。作為例子，野生型、二聚體TGF-P3在動物模型和臨床中的局部應用已經(jīng)顯示能夠加速慢性、非愈合的壓迫性潰瘍的愈合速度；降低口腔粘膜炎的發(fā)病率、嚴重度和持續(xù)時間；降低放射性胃腸道綜合征的不良副作用，所述綜合征是由癌癥治療中的放療和化療導致的干細胞損傷而形成的。本發(fā)明的發(fā)明人相信本發(fā)明的TGF-(33或其片段或衍生物可有益的用于全部的這些適應癥。瘢痕形成活性，所述抗瘢痕形成活性可優(yōu)選體內(nèi)研究的。本發(fā)明的治療有效量的TGF-(33或其片段或衍生物是足以引起下述需要的量i)加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成；或ii)促進上皮再生；或iii)預防和/或治療纖維化疾病。加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成的程度或者可能需要的上皮再生對于例如負責照料患者的臨床醫(yī)生是顯然的，或?qū)嶋H可容易地由其決定。力口速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成或促進上皮再生的程度的適合的評定可由臨床醫(yī)生決定，可參考這里描述測量的建議方法。適合的本發(fā)明的TGF-(33以及這種TGF-卩3的優(yōu)選片段或衍生物，可參考本文描述的任何或全部考慮進行選擇。參考治療的傷口顯示的特性，本發(fā)明TGF-P3加速傷口愈合的能力易于理解和/或測量。出于當前目的，"治療的傷口"可認為是暴露于治療有效量的本發(fā)明藥物的傷口或已依據(jù)本發(fā)明方法接受治療的傷口。治療的傷口愈合的加速可由與對照傷口相比上皮形成增加的速率表示。這樣，本發(fā)明的方法和藥物與其他方式相比，促進傷口面積上方的功能性上皮層更快地重建?？蛇x擇地或另外，治療的傷口愈合的加速可由與對照傷口相比對應時間點上減小的寬度表示。應理解的是，這種傷口寬度的減小確保了傷口閉合的相對較快的速率(由于待閉合的傷口寬度更小)，預示這些藥物加速愈合反應的能力。較窄的傷口可導致美學上優(yōu)于較寬瘢痕的較窄瘢痕。因此，本發(fā)明上下文中的加速的傷口愈合應被采用來包括，與對照治療或未治療傷口中發(fā)生的愈合速率相比，任何治療的傷口愈合速率的提高。優(yōu)選地，傷口愈合的加速可從治療和對照傷口中得到的上皮再形成速率比較方面，或治療和對照傷口在對應時間點上相對寬度的比較方面進行評定。更優(yōu)選地，加速的傷口愈合可定義為包含與對照傷口相比上皮再形成提高的速率和傷口寬度在對應時間點的減小。優(yōu)選地，促進傷口愈合加速可產(chǎn)生的傷口愈合速率比對照或未治療傷口中發(fā)生的愈合速率高至少5%、10%、20%或30%。更優(yōu)選地，促進傷口愈合加速可產(chǎn)生的愈合速率比對照傷口的愈合高至少40%、50%或60%。甚至更加優(yōu)選地，促進傷口愈合加速可產(chǎn)生的愈合速率比對照傷口中發(fā)生的高至少70%、80%或90%，最優(yōu)選地，促進傷口愈合加速可產(chǎn)生的愈合速率比對照傷口中發(fā)生的速率高至少100%。存在范圍廣泛的傷口愈合疾病，其特征為或至少部分特征為正常傷口愈合反應的不當?shù)氖?、延遲或障礙。因此，本發(fā)明某些方法和藥物促進加速傷口愈合的能力在預防或治療這些疾病中是有用的。由于本發(fā)明的某些方法和藥物能通過促進上皮再形成反應的激活(因此提高了傷口閉合的速率)而引起傷口愈合的加速，因此可理解地，本發(fā)明的這些方法和藥物尤其有利于有上皮再形成缺陷、延遲或其他方式損傷傾向的患者傷口的治療。例如，眾所周知老年人的皮膚傷口表現(xiàn)出比年輕個體的皮膚傷口更弱的上皮再形成反應。也有很多其它的狀態(tài)或疾病，在這些狀態(tài)或疾病中，傷口愈合與延遲或其他方式損傷的上皮再形成相關(guān)。例如，患糖尿病的患者、復方用藥的患者(例如由于老齡)、絕經(jīng)期后的婦女、易于壓迫受傷的患者(例如截癱患者)、靜脈疾病患者、臨床肥胖患者、接受化療的患者、接受放療的患者、接受類固醇治療的患者或免疫功能低下的患者可能都會經(jīng)受損傷上皮再形成的傷口愈合。在很多這樣的情況下，缺乏適當?shù)纳掀ぴ傩纬煞磻俪闪藗诓课桓腥镜陌l(fā)生，這可能又促成慢性傷口例如潰瘍的形成。因此，可理解的是，這些患者尤其可能從本發(fā)明適合的方法或藥物中受益。慢性傷口可能是與延遲傷口愈合反應相關(guān)的疾病的最重要的實例。如果受到適當(常規(guī))治療處理時，傷口在形成八周內(nèi)沒有表現(xiàn)出任何愈合傾向，就被定義為慢性。慢性傷口眾所周知的實例包括靜脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍和褥瘡，但是慢性傷口可在任意時間由另外的正常急性損傷引發(fā)。通常，慢性傷口可由傷口部位的感染、不當?shù)膫谥委熞l(fā)，或作為靜脈、動脈或代謝血管疾病、壓迫、放射損傷或腫瘤造成的進展性組織衰竭的結(jié)果?？衫斫獾氖?，能加速傷口愈合的本發(fā)明的方法和藥物可應用于現(xiàn)有慢性傷口的治療，旨在促進它們的愈合。這些方法和藥物可促進慢性傷口的上皮再形成，從而使得疾病治愈和終止。本發(fā)明優(yōu)選的方法和藥物(例如那些利用包含序列ID號3、5、7、9或11的TGF-P3的方法和藥物)還可抑制與傷口愈合相關(guān)的瘢痕形成。由于慢性傷口可典型地在患者身體相對大的部分延伸，這些情況中瘢痕形成的預防尤其有利?？蛇x擇地或除了在現(xiàn)有慢性傷口治療中的應用之外，本發(fā)明適合的方法和藥物可用于預防患者的急性傷口，所述患者具有受損的傷口愈合發(fā)展成慢性傷口的傾向。由于本發(fā)明適合的方法和藥物能促進上皮對損傷部位的覆蓋，因此它們能減小治療的傷口發(fā)生感染的可能性。同樣地，對上皮再形成的這種促進可能有利于由其它狀態(tài)例如糖尿病或靜脈疾病引發(fā)的慢性傷口的治療。可以從本發(fā)明方法和藥物中得到特別益處的另一組患者是那些免疫系統(tǒng)低下的患者(例如經(jīng)受化療或放療或患有HIV感染的患者)。廣為承認的是免疫低下患者可能不能在傷口產(chǎn)生后發(fā)生正常的炎癥反應，其傷口傾向于與較差的愈合結(jié)果相關(guān)。這些患者可從本發(fā)明適合的方法和藥物治療中受益。本發(fā)明的TGF-P3(諸如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)促進加速的傷口愈合，同時預防、減少或抑制瘢痕形成的能力在更多普遍的臨床背景中也有用處。這些更多益處的實例可參考下面描述的初級、二級或三級愈合的傷口愈合進行判斷。立邊緣的閉合(例如縫合、粘合帶或釘)。初級愈合治療典型地用于手術(shù)切口或其它清潔傷口的治療，且與最低水平的組織缺失相關(guān)。技術(shù)人員認識到由于本發(fā)明的TGF-(33(例如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)能減小傷口寬度，因此它們也有利于傷口對立邊緣的接合，這樣可能有益于為初級愈合的傷口愈合。而且，這些方法或藥物(正如下面進一步描述的)導致預防、減少或抑制這種愈合可能另外發(fā)生的瘢痕形成。本發(fā)明人認為這種方式的治療可對治療的傷口形成瘢痕的肉眼和顯微鏡下的外觀產(chǎn)生影響；肉眼下瘢痕可能更不引人注意并與周圍的皮膚融合，顯微鏡下瘢痕可表現(xiàn)出更多正常的皮膚結(jié)構(gòu)的再生。出于本發(fā)明的目的，二級愈合治療可認為包括傷口愈合過程中，非直接手術(shù)干預的傷口閉合。有待二級愈合治療的傷口可經(jīng)過持續(xù)地護理(例如傷口的包扎和再包扎以及施用適合的藥物)，但是它是肉芽組織形成和上皮再形成的、產(chǎn)生傷口閉合的天然過程?？衫斫獾氖怯捎诒景l(fā)明的TGF-(33(例如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)與對照傷口中所發(fā)生的相比，能提高上皮再形成的速率，因此它們在促進二級愈合的傷口愈合中有用處。三級愈合治療可認為包含先前開著的傷口的手術(shù)閉合，允許至少部分肉芽組織形成和上皮再形成。使之適合初級或二級愈合治療應用的本發(fā)明優(yōu)選方法和藥物的特性也有益于促進三級愈合治療傷口方面。本發(fā)明TGF-(33(例如序列ID號3、5、7、9或ll)促進上皮再形成(作為它們促進傷口愈合加速的一部分)同時抑制瘢痕形成的應用也在與移植過程相關(guān)的傷口治療中尤其有效。用本發(fā)明這些方法和藥物的治療有益于移植供體部位(在此部位其能輔助功能性上皮層的重建同時預防、減少或抑制瘢痕形成)和移才直受體部位(在此部位治療的抗瘢痕形成作用抑制了瘢痕形成，同時加速的愈合促進了移植組織的整合)。本發(fā)明人認為本發(fā)明的方法和藥物在用皮膚、人造皮膚或皮膚取代物移植的方面中提供了優(yōu)勢。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用TGF-(33(包含序列ID號3、5、7、9或ll)的本發(fā)明的方法和藥物，在傷口產(chǎn)生前或者傷口已經(jīng)形成時施用，能促進加速的傷口愈合且抑制瘢痕形成。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用TGF-P3(例如包含序列ID號3、5、7、9或11的那些)的本發(fā)明的方法或藥物能促進上皮再生。在本發(fā)明上下文中的促進上皮再生可理解為，包括與對照治療或未治療的上皮發(fā)生的再生相比，任何上皮再生速率的提高?？扇菀椎貙⑹褂帽景l(fā)明的適合的方法或藥物得到的上皮再生速率與對照治療或未治療的上皮獲得的速率相比，這可用本領(lǐng)域已知的任何適宜的上皮再生模型進行。例如，具有已知面積的實驗上皮損傷部位的再生速率可用公知的小鼠、大鼠、兔子或豬體內(nèi)模型進行比較，例如在Tomlinson&Ferguson(2003)、Davidson等(1991)和Paddock等(2003)中描述的那些。本發(fā)明人不希望被任何假說限制，認為通過本發(fā)明的TGF-(33實現(xiàn)的上皮再生的促進由上皮細胞遷移的促進作用介導。上皮細胞(其遷移已被促進)因此能夠比未治療的上皮更快速地重建和再生損傷的上皮?？衫斫獾兀帽景l(fā)明的TGF-(33促進上皮再生可用于誘導有效的上皮再形成，其處于上皮再形成反應被損傷、抑制、延遲或具有其他缺陷的情況中。上皮再生的促進也可有效地加快經(jīng)受上皮損傷患者的具有缺陷的或正常上皮再生反應的速率。在很多情況中，機體上皮再形成反應可能是具有缺陷的。例如，皮膚上皮再形成的缺陷可能與狀態(tài)相關(guān)，所述病狀態(tài)如天皰皰、Hailey-Hailey病(家族性良性天皰瘡)、中毒性表皮壞死松解癥(TEN)/Lyell's綜合癥、大皰性表皮松解癥、皮膚利什曼病和光化性角化病。肺上皮再形成的缺陷可能與原發(fā)性肺纖維化(IPF)或肺間質(zhì)性疾病相關(guān)。眼上皮再形成的缺陷可能與狀態(tài)相關(guān)，所述狀態(tài)例如部分角膜緣干細胞缺失或角膜糜爛。胃腸道或結(jié)腸的上皮再形成的缺陷可能與狀態(tài)相關(guān)，所述狀態(tài)例如慢性肛裂(肛(門)裂)、潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病(Crohn，sdisease)和其他炎癥性腸病。正如上文所陳述的，本發(fā)明的TGF-P3可用于預防、減少或以其他方式抑制瘢痕形成。瘢痕形成的這種抑制能在任意機體部位和任意組織或器官，包括皮膚、眼睛、神經(jīng)、肌腱、韌帶、肌肉和口腔(包括嘴唇和上腭)，以及內(nèi)部器官(例如肝臟、心臟、大腦、腹腔、骨盆腔、胸腔、腸和生殖組織)實現(xiàn)。皮膚中，治療可改善瘢痕肉眼下和顯微鏡下的外觀；肉眼下瘢痕可能更不明顯并且與周圍的皮膚融合，顯微鏡下瘢痕里的膠原纖維可具有與周圍皮膚的形態(tài)和組織更相似的形態(tài)和組織。本發(fā)明上下文中的預防、減少或抑制瘢痕形成應被理解為與對照治療或未治療傷口(如說明書其他地方定義)產(chǎn)生的瘢痕形成的水平相比，包括任何程度的預防、減少或抑制瘢痕形成。除了上下文另外需要參考的地方，瘢痕形成的"預防"、"減少"或"抑制"可被作為抗瘢痕活性中全部被證實的等效機制。使用本發(fā)明的方法和藥物實現(xiàn)的皮膚瘢痕形成的預防、減少或抑制，可根據(jù)治療的瘢痕的顯^t鏡下或優(yōu)選肉眼下的外觀與未治療瘢痕的外觀比較來進行評定和/或測量。更優(yōu)選地，瘢痕形成的預防、減少或抑制可根據(jù)治療的瘢痕的顯微鏡下和肉眼下的外觀進行評定。出于本發(fā)明的目的，"治療的瘢痕"可被定義為在治療的傷口愈合時形成的瘢痕，而"未治療的瘢痕"可被定義為未治療的傷口、或用安慰劑治療或標準護理治療的傷口愈合時形成的瘢痕。適合的瘢痕比較可優(yōu)選地才艮據(jù)瘢痕年齡、部位、尺寸和患者，與治療的瘢痕進行匹配。在考慮治療傷口產(chǎn)生的瘢痕肉眼下外觀時，瘢痕的程度和由此的任何瘢痕形成預防、減少或抑制的量級可根據(jù)以下很多參數(shù)中的任一項進行評定。肉眼下瘢痕評定的適合參數(shù)可包括i)瘢痕的顏色。正如上文提到的，瘢痕典型地可相對于周圍皮膚而色素沉著減少或色素沉著過度。當治療的瘢痕的色素沉著比未治療瘢痕的色素沉著更接近無瘢痕皮膚時，表明瘢痕的抑制或減少。同樣地，瘢痕可能比周圍皮膚更紅。在這種情況下，當治療的瘢痕的紅色與未治療瘢痕比較，更早褪色、褪色更完全或更類似周圍皮膚的外觀時，表明瘢痕形成的抑制或減少。ii)瘢痕的高度。瘢痕與周圍皮膚比較可典型地升高或降低。當治療的瘢痕的高度比未治療瘢痕的高度更接近無瘢痕皮膚(即無升高和降低)時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iii)瘢痕的表面肌理。瘢痕比周圍皮膚可能具有相對更光滑的表面(瘢痕產(chǎn)生"有光澤的，，外觀)或比周圍皮膚更粗糙。當治療的瘢痕的表面肌理比未治療瘢痕的表面肌理更接近無瘢痕皮膚時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iv)瘢痕的硬度。瘢痕異常的成分和結(jié)構(gòu)意味著它們通常比瘢痕周圍未損傷的皮膚更硬。在這種情況下，當治療的瘢痕的硬度比未治療瘢痕的硬度更接近無瘢痕皮膚時，表明瘢痕形成的抑制或減少。優(yōu)選地，當根據(jù)上文所述肉眼下評定的至少一項參數(shù)進行評定時，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。更優(yōu)選地，根據(jù)這些參數(shù)中至少兩項參數(shù)，甚至更加優(yōu)選地至少三項參數(shù)和最優(yōu)選地全部四項參數(shù)，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。瘢痕形成的全面評定可利用，例如視覺模擬評分(VisualAnalogueScale)或數(shù)字評定等級來進行。顯微鏡下瘢痕評定的適合參數(shù)可包括i)胞外基質(zhì)(ECM)纖維的厚度。瘢痕典型地比周圍皮膚包含較細的ECM纖維。這個特性在瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的情況下甚至更明顯。當治療的瘢痕的ECM纖維厚度比未治療瘢痕的ECM纖維厚度更接近無瘢痕皮膚的ECM纖維厚度時，表明瘢痕形成的抑制或減少。ii)ECM纖維的定向。瘢痕中發(fā)現(xiàn)的ECM纖維比無瘢痕皮膚發(fā)現(xiàn)的那些(經(jīng)常具有隨機的定向，稱為"籃網(wǎng)狀")傾向于表現(xiàn)出互相之間更高程度的排列。病理性瘢痕，例如瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的ECM可表現(xiàn)出更加不規(guī)則的定向，經(jīng)常形成ECM分子的大的"渦旋"或"嚢"。因此，當治療的瘢痕的ECM纖維定向比未治療瘢痕中的ECM纖維定向更接近無瘢痕皮膚中發(fā)現(xiàn)的ECM纖維定向時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iii)瘢痕的ECM成分。瘢痕中存在ECM分子的成分表現(xiàn)出與其在正常皮膚中發(fā)現(xiàn)的成分的差異，瘢痕的ECM存在的彈性蛋白數(shù)量有所減少。因此，當治療的瘢痕真皮的ECM纖維成分比未治療瘢痕中發(fā)現(xiàn)的成分更接近無瘢痕皮膚中發(fā)現(xiàn)的這種纖維成分時，表明瘢痕形成的抑制或減少。iv)瘢痕的細胞結(jié)構(gòu)。瘢痕傾向于比無瘢痕皮膚包含相對少的細胞。因此可理解當治療的瘢痕的細胞結(jié)構(gòu)比未治療瘢痕的細胞結(jié)構(gòu)更接近無瘢痕皮膚的細胞結(jié)構(gòu)時，表明瘢痕形成的抑制或減少。優(yōu)選地，當根據(jù)上文所述的顯微鏡下評定的至少一項參數(shù)進行評定時，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。更優(yōu)選地，根據(jù)這些參數(shù)中的至少兩項參數(shù)，甚至更加優(yōu)選地至少三項參數(shù)，最優(yōu)選地全部四項參數(shù)進行評定，治療的瘢痕將表明瘢痕形成的預防、抑制或減少。治療的傷口的瘢痕形成預防、抑制或減少可進一步根據(jù)以下使用的適合參數(shù)進行評定i)瘢痕肉眼下的臨床評定，尤其是對個體瘢痕的評定；ii)瘢痕照片圖像的評定；iii)有機硅模具或由瘢痕的有機硅模具制作的陽性石膏模型進行評定；和iv)瘢痕的顯微鏡下評定，例如瘢痕顯微結(jié)構(gòu)的組織學分析。可理解地，治療傷口的瘢痕形成的預防、抑制或減少可通過改善這些適合參數(shù)的一項或多項來顯示，在根據(jù)大量參數(shù)評定預防、抑制或減少的情況下，可根據(jù)不同的評定方案將這些參數(shù)結(jié)合(例如肉眼評定中使用的至少一項參數(shù)和顯微鏡下評定中使用的至少一項參數(shù)的減少、抑制或改善)?？赏ㄟ^一項或多項參^:的改善表明瘢痕形成的預防、減少或抑制，這顯示根據(jù)所選的參數(shù)，治療的瘢痕比未治療或?qū)φ振：鄹咏鼰o瘢痕皮膚。瘢痕臨床測量和評定的適合參數(shù)可基于多種測量或評定進行選擇，包括由Beausang等(1998)和vanZuijlen等(2002)描述的那些。典型地，適合的參數(shù)可包括2.橫禁視#模擬#為\^4》威疾#炎時#定。當與對照瘢痕比較時，由治療的瘢痕的VAS分數(shù)的減少，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。在瘢痕評定中使用的適合的VAS可基于Beausang等人(1998)所述方法進行。2.疾疾W/^,、疾癥對Jt^、嫂疾WA長、嫂疾時面^4疾疾時謬歡。瘢痕的高度和寬度可直接從個體測量，例如通過利用手工測量裝置例如卡鉗。瘢痕的寬度、周長和面積可直接從個體測量或從瘢痕的照片圖像分析進行測量。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道其他非損傷的方法和裝置，所述方法和裝置可用于研究適合的參數(shù)，包括有機硅制模、超聲波、光學三維剖析圖和高分辨率核磁共振圖像。通過與未治療瘢痕比較，治療的瘢痕的高度、寬度、面積或體積以及其任意組合的減少，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。與屌風無凌疾發(fā)歡^較疾疾^^A應和/減盧^。治療的瘢痕的外觀或顏色可與周圍無瘢痕皮膚的外觀或顏色進行比較，將其差異(如果有)與未治療瘢痕的外觀和顏色和無瘢痕皮膚的外觀和顏色之間的差異進行比較。這種比較可在各自的瘢痕和無瘢痕皮膚的視覺評定的基礎(chǔ)上進行。瘢痕的外觀可根據(jù)瘢痕是否比無瘢痕皮膚更亮或更暗，來與無瘢痕皮膚比較。瘢痕和皮膚各自的顏色可完美地互相匹配、輕微錯配、明顯錯配或顯著錯配。對于視覺評定可選擇地或另外地，有大量非損傷比色裝置，其能夠提供關(guān)于瘢痕和無瘢痕皮膚的色素沉著以及皮膚的紅色(可作為瘢痕或皮膚中存在的血管分布程度的指示)的數(shù)據(jù)。這些裝置的實例包括MinoltaChronameterCR隱200/300;Labscan600;Dr.LangeMicroColour;皮月夫分光計(DermaSpectrometer)、激光-多普勒流速計(laser-Dopplerflowmeter)和皮內(nèi)分析分光光度法(SIA)。治療的瘢痕的外觀或顏色和無瘢痕皮膚之間差異的量級比未治療瘢痕和無瘢痕皮膚之間差異更小時，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。4.癥疾#^多;^*樹'#雜瘢痕的變形可通過瘢痕和無瘢痕皮膚的視覺比較進行評定。適合的比較可將所選的瘢痕分類為無變形、輕微變形、中等變形或嚴重變形。瘢痕的機械性能可利用大量基于吸力、壓力、扭轉(zhuǎn)力、張力和聲學的非損傷的方法和裝置進行評定。適合的實例包括能用于評定瘢痕機械性能的已知裝置，包括直讀壓痕硬度計、皮膚彈性4義、Reviscometer、粘彈性皮膚分析儀、Dermaflex、硬度計、皮膚扭力計和彈力計。當與未治療瘢痕造成的變形比較時，由治療的瘢痕造成的變形的減少，表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。還可理解地，由治療的瘢痕的機械性能比未治療瘢痕更類似于無瘢痕皮膚的機械性能，可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。5.疾癥W粉肩;^疾參理瘢痕的輪廓可通過視覺評定的方式進行研究。這種評定中考慮的適合參數(shù)包括瘢痕和周圍的皮膚是否為齊平、輕微隆起、輕微鋸齒狀、肥厚性瘢痕或瘢痕瘤。瘢痕的肌理可根據(jù)瘢痕的外觀進行評定，這也可通過當與無瘢痕皮膚比較時，瘢痕例如是否無光澤或有光澤發(fā)亮或具有粗糙或光滑外觀的視覺評定來進行。肌理)，與無瘢痕皮膚比較，是否可觸摸到、結(jié)實或堅硬來進行評定。瘢痕的肌理也可根據(jù)漢密爾頓量表(Hamiltonscale)(Crowe等描述,1998)進行評定。除了上文所述的技術(shù)外，有大量的使用光學或機械的方法評定瘢痕的輪廓和/或肌理的非損傷剖析圖裝置。這種評定可在個體的身體上進行，或例如在瘢痕的有機硅模具印模，或由這種印模做出的陽性石膏模型上進行。如果治療的瘢痕具有的i侖廓和肌理比未治療瘢痕更與無瘢痕皮膚相當，則表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。照片評定治療和未治療瘢痕的照片評定可由獨立外行的評定者小組用標準化和校準的瘢痕照片來進行。瘢痕可由獨立外行的小組進行評定以提供分類的評分數(shù)據(jù)(例如特定治療的瘢痕與未治療瘢痕比較是"較好"、"較差"或"無差異")和使用基于Beausang等(1998)描述方法的視覺模擬評分(VAS)獲得定量的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)的取得可利用在申請人共同待決的的專利申請中描述的適合軟件和/或電子系統(tǒng)。昔家,/、逸可選擇地或另外地，治療的和未治療瘢痕的照片評定可由專家評定者小組用待評定的瘢痕的被標準化和校準的照片來進行。優(yōu)選地，專家小組由適合的本領(lǐng)域技術(shù)人員，例如整形外科醫(yī)生和適合背景的科學家組成。這種評定可提供分類的數(shù)據(jù)，如上文所述的或根據(jù)所選治療和未治療瘢痕的一段時間過程的圖像比較。所進行的適合的評定可包括出于本發(fā)明的目的，最好的瘢痕的鑒別被認為是最類似于周圍皮膚的瘢痕。一旦鑒別出最好的瘢痕，瘢痕間差異的量級可認為是，例如瘢痕之間的輕微或明顯的差異。所考慮的進一步的參數(shù)包括瘢痕形成后檢測到瘢痕間差異的最早時間，形成后瘢痕間差異最明顯的時間(或可選擇地在最后評定時間點繼續(xù)發(fā)現(xiàn)差異)，以及考慮較好的瘢痕是否一貫地保持更好。也要考慮一個瘢痕是否會一貫地比另外一個的更紅和紅色是否會在所認定的時間點后—逸色(或在最后時間點后繼續(xù))以及如果是這樣，則在瘢痕形成后的什么時間出現(xiàn)。專家小組也可考慮在形成后的什么時間紅色的任何差異變得可覺察，以及形成后的什么時間紅色差異最明顯。專家小組也可考慮治療或未治療的一個瘢痕是否一貫地比另一個更白或比無瘢痕皮膚更白。如果白色的差異可覺察，則考慮瘢痕形成后差異可被檢測的時間，差異最明顯的時間和差異消失的時間。專家小組可評定的進一步參數(shù)是治療和未治療瘢痕的肌理。在治療和未治療瘢痕的比較中，專家小組可考慮哪個瘢痕具有最好的皮膚肌理，瘢痕形成后所存在的任何差異可被檢測的最早時間，形成后任何差異最明顯的時間和任何差異消失的時間。治療和未治療瘢痕的比較可進一步評定哪個瘢痕是最窄的和哪個瘢痕是最短的。也可考慮瘢痕的形狀和區(qū)別于周圍皮膚的瘢痕邊緣的比例。正如與前文所述，還可考慮視覺評定，和色素沉著過度的存在、程度和位置的顏色評定。如上所述，治療和未治療瘢痕性質(zhì)比較的一種方法是通過顯微鏡評定進行。瘢痕性質(zhì)的顯微鏡評定可典型地用瘢痕的組織學切片進行。顯微鏡評定和測量瘢痕的過程可考慮基于以下適合參數(shù)的分類數(shù)據(jù)1.表皮重建。特別關(guān)注網(wǎng)脊(reteridge)的恢復程度和恢復表皮的厚度。2.血管形成和炎癥?？煽紤]存在血管的數(shù)量、存在血管的尺寸和炎癥的跡象，包括評定存在的任何水平的炎癥。3.膠原組織。在評定膠原組織時，可參考瘢痕中存在的膠原纖維的定向、這些纖維的密度和乳突狀及網(wǎng)狀真皮中膠原纖維的厚度。4.乳突狀真皮和網(wǎng)狀真皮的膠原組織的^L覺才莫擬評分(VAS)評定也可提供有用的瘢痕性質(zhì)指標。5.評定瘢痕的顯^t鏡下性質(zhì)時可考慮其他特征，包括相對于周圍無瘢痕皮膚的瘢痕的升高或降低和正常真皮界面的瘢痕的突出或明顯度。6.可以看出，與對照、未治療或其他適合比較的瘢痕比較，上文描述的評定產(chǎn)生了能提供關(guān)于治療的瘢痕是否更好、更差或無差別的指示的瘢痕評分數(shù)據(jù)。除了分類數(shù)據(jù)外，可將圖像分析與適合的可視技術(shù)結(jié)合使用來產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)(優(yōu)選與上文參數(shù)有關(guān)的)?？捎糜谠u定瘢痕性質(zhì)的適合可視技術(shù)的實例是特異的組織學染色或免疫標記，其中呈現(xiàn)的染色或標記程度可通過圖像分析定量測定?？捎行Ш腿菀椎禺a(chǎn)生與下列參數(shù)有關(guān)的定量數(shù)據(jù)1.瘢痕的寬度、高度、升高、體積和面積。2.上皮的厚度和范圍(例如瘢痕中存在的表皮的面積或具有表皮覆蓋傷口的比例)。3.血管的數(shù)量、尺寸、面積(即橫截面)和位置。4.炎癥的程度、存在的發(fā)炎細胞的數(shù)量、位置和種群/類型。5.膠原的組織、膠原纖維的厚度和膠原纖維的密度。通過上文考慮的任何一項參數(shù)的變化，可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制，以至于治療的瘢痕比對照或未治療瘢痕(或其他適合的比較物)更類似于無瘢痕皮膚。所討論的評定和參數(shù)適合于在動物或人中比較肽與對照、安慰劑或標準護理治療的效果。為了研究結(jié)果的顯著性，適當?shù)慕y(tǒng)計學檢驗可用于分析產(chǎn)生自不同治療的邀:據(jù)組。優(yōu)選地，根據(jù)一項以上參數(shù)可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。更優(yōu)選地，根據(jù)臨床(即觀察個體)參數(shù)和照片參數(shù)可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。甚至更加優(yōu)選地，根據(jù)臨床參數(shù)、照片參數(shù)和顯微鏡下評定參數(shù)(例如組織學參數(shù))可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。最優(yōu)選地，根據(jù)臨床VAS分數(shù)、外行小組VAS分數(shù)以及網(wǎng)狀真皮的評分(來自照片圖像)和顯微鏡下的VAS分數(shù)可表明瘢痕形成的預防、減少或抑制。使用本發(fā)明適合方法和藥物能使接受如此治療的損傷區(qū)域的美觀表征快速改善。美觀考慮在大量臨床情況中，尤其是當傷口在身體顯著的部位例如臉、頸和手上形成時是重要的。因此，在這些期望改善所形成的瘢痕美觀表征的部位抑制瘢痕形成(優(yōu)選地與加速傷口愈合相結(jié)合)代表了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。除了它的美觀效果外，皮膚瘢痕形成導致了大量使經(jīng)受這種瘢痕形成的患者痛苦的不良后果。例如，皮膚瘢痕形成與身體和機械的功能減弱有關(guān)，尤其是在收縮性瘢痕(例如肥厚性瘢痕)的情況下和/或跨越關(guān)節(jié)形成瘢痕的情況時。在這些情況下，對照于無瘢痕皮膚，瘢痕形成皮膚改變的機械性質(zhì)和瘢痕收縮的效果使受到如此影響的關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié)連接)運動受到很大限制。因此，優(yōu)選的實施方案是使用本發(fā)明適合的藥物和方法來預防、減少或抑制覆蓋機體關(guān)節(jié)的傷口的瘢痕形成(優(yōu)選地也加速這些傷口的愈合)。另一個優(yōu)選的實施方案是，使用本發(fā)明適合的藥物和方法促進傷口的加速愈合，和/或預防、減少或抑制具有增加的形成收縮瘢痕危險的傷口瘢痕形成。瘢痕形成的程度，由此由瘢痕造成的美觀或其他損傷的程度也會受到很多因素，例如傷口形成部位的張力的影響。例如，已知相對高張力下的皮膚(例如遍布胸或與張力線有關(guān)的)傾向于比機體其他部位形成更嚴重的瘢痕。這樣在優(yōu)選的實施方案中，使用本發(fā)明適合的藥物和方法促進傷口的加速愈合和/或預防、減少或抑制位于高皮膚張力部位的傷口瘢痕形成。很多外科方法可用于瘢痕修復以使傷口和瘢痕重排，以至于減少它們經(jīng)受的張力。大概這些中最熟知的是"z字成形術(shù)"，其中調(diào)換兩個v形的皮膚薄片組織以使張力線旋轉(zhuǎn)。這樣在更優(yōu)選的實施方案中，使用本發(fā)明這樣的藥物和方法促進傷口的加速愈合和/或預防、減少或抑制外科修復毀容瘢痕過程中傷口的瘢痕形成。病理瘢痕形成比相對嚴重的正常瘢痕形成具有更顯著的不良后果。病理瘢痕普遍的實例包括肥厚性瘢痕和瘢痕瘤?？烧J識到某些類型的傷口或某些個體傾向于形成病理瘢痕。例如加勒比黑人、日本人或蒙古人種，或那些具有病理瘢痕家族史的個體可能被認為具有增加的形成肥厚性瘢痕或瘢痕瘤的風險。兒童的傷口，尤其是兒童燒傷也與增加的肥厚性瘢痕形成有關(guān)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是使用適合的藥物和方法來促進傷口的加速愈合和/或預防、減少或抑制具有增加的病理瘢痕形成風險的傷口的瘢痕形成。盡管已經(jīng)經(jīng)歷了病理瘢痕形成的個體會經(jīng)受另外過多的瘢痕形成的傾向，但是通常臨床上必須外科修復肥厚性瘢痕或瘢痕瘤，其伴隨有隨后形成病理瘢痕形成的風險。因而，本發(fā)明進一步的優(yōu)選實施方案是使用適合的藥物和方法來促進加速傷口的愈合和/或預防、減少或抑制由外科修復病理瘢痕產(chǎn)生的傷口瘢痕形成?？烧J識到，燒傷造成的傷口(出于本發(fā)明的目的，也可包括涉及熱的液體或氣體的燙傷)會在受到如此痛苦的個體上大面積擴展。因此，燒傷可產(chǎn)生覆蓋患者機體上大部分的瘢痕形成，從而增加了形成的瘢痕覆蓋具有高的美觀重要性的區(qū)域(例如臉、頸、臂或手)或機械重要性區(qū)域(尤其是覆蓋或圍繞關(guān)節(jié)的區(qū)域)的風險。兒童經(jīng)常遭受熱的液體造成的燒傷(例如打翻的鍋、壺或類似的)并且由于兒童相對小的身體尺寸，尤其可能造成覆蓋身體大部分的大面積損傷。本發(fā)明進一步的優(yōu)選實施方案是使用適合的藥物和方法來促進傷口的加速愈合和/或預防、減少或抑制燒傷產(chǎn)生的傷口瘢痕形成。如上所述，響應于燒傷的傷口愈合經(jīng)常與不利的瘢痕形成結(jié)果有關(guān)，例如形成肥厚性瘢痕。相對大尺寸的燒傷的進一步后果是它們尤其易發(fā)生并發(fā)癥，例如感染和由于缺乏功能性的上皮層造成的脫水。根據(jù)上文，可理解的是，本發(fā)明適合的藥物和方法可用于燒傷的治療，以減少由傷口產(chǎn)生的瘢痕形成的水平和/或加速功能性的上皮屏障的重建。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的TGF-(33的本發(fā)明的藥物和方法能促進上皮再形成。因此這些方法和藥物在涉及上皮層損傷的所有損傷的治療中尤其有效。這些損傷示例有，但不限于上皮受到損傷的皮膚損傷。但是可理解的是，本發(fā)明的這樣的方法和藥物也可用于其他類型的上皮受到損傷的傷口，例如涉及呼吸道上皮、消化道上皮或圍繞內(nèi)部組織或器官的上皮(例如腹膜上皮)的損傷。涉及腹膜(覆蓋內(nèi)部器官和/或體腔內(nèi)部的上皮)的傷口愈合經(jīng)常引發(fā)粘連。這種粘連是涉及婦科或腸組織手術(shù)的普通結(jié)果。本發(fā)明人相信，本發(fā)明方法和藥物(例如包含序列ID號3、5、7、9或11所列TGF-卩3的那些)加速腹膜再生而減少瘢痕形成的能力，可減少腹膜各部分互相之間不當連接的發(fā)生，因而減少了粘連的發(fā)生。因此，使用本發(fā)明這樣的方法和藥物預防腸或婦科粘連形成了代表本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。事實上，在涉及腹膜的任何傷口愈合中使用本發(fā)明這些方法和藥物是優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明的方法或藥物可用于預防，例如在無傷口存在但以其他方式會產(chǎn)生瘢痕的傷口或形成慢性傷口的部位。通過實施例，可將本發(fā)明的藥物施用到遭受選擇性操作(例如手術(shù))造成的傷口的部位，或被認為具有提高的創(chuàng)傷風險的部位。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物可在大約創(chuàng)傷時或在傷口形成前(例如創(chuàng)傷前直到6小時期間)立即施用到部位，或藥物可在創(chuàng)傷前更早的時間施用(例如傷口形成前直到48小時內(nèi))。技術(shù)人員理解的是，傷口形成前施用的最優(yōu)選時間將根據(jù)大量因素來決定，所述因素包括所選藥物的制劑和施用途徑、施用藥物的劑量、傷口形成的尺寸和性質(zhì)以及患者的生物學狀況(根據(jù)例如患者的年齡、健康和發(fā)生愈合并發(fā)癥或不利瘢痕形成傾向等來確定)。本發(fā)明的方法和藥物的預防性應用是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，在外科傷口的情況下，特別優(yōu)選用于促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。如果在傷口形成后施用本發(fā)明的方法和藥物，也能促進傷口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。優(yōu)選地，這種施用應在傷口形成后盡可能早地進行，但是本發(fā)明的藥劑能在直到愈合過程完成前的任何時間(即甚至如果傷口已經(jīng)部分愈合，本發(fā)明的方法和藥物也可用于剩下的未愈合部分的加速傷口愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成)促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成?？衫斫獾?，可使用本發(fā)明方法和藥物促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的"窗口"，取決于所討論的傷口的性質(zhì)(包括發(fā)生損傷的程度、損傷區(qū)域的尺寸)。因此在大的損傷的情況下，本發(fā)明的方法和藥物在愈合反應中的施用可相對晚一些，但是仍然能促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法和藥物可例如在傷口形成后的第一個24小時內(nèi)施用，但如果傷口發(fā)生后十天或更長時間內(nèi)施用，仍然可促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。為了促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成，本發(fā)明的方法和藥物根據(jù)需要可施用一或多次。例如治療有效量的藥物可根據(jù)需要經(jīng)常給傷口施用，直到完成愈合過程。通過實例，本發(fā)明的藥物可在傷口形成后至少前三天纟會傷口一天一次或一天兩次施用。最優(yōu)選地，本發(fā)明的方法和藥物可在傷口形成前后都施用。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明藥物在傷口形成前立即施用，接著在創(chuàng)傷后的時間內(nèi)每天施用這些藥劑，可特別有效的促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。出于本說明書的目的，"藥劑"或"本發(fā)明藥劑"是指具生物學或治療活性的本發(fā)明的TGF-(33;和/或具生物學或治療活性的本發(fā)明的TGF-卩3片段；和/或具生物學或治療活性的本發(fā)明的TGF-P3衍生物。本發(fā)明的藥劑還可包括編碼本發(fā)明TGF-(33(或其片段或衍生物)的核酸?？衫斫獾?，所有這些藥劑可根據(jù)本發(fā)明摻合到藥物里，可用于本發(fā)明的方法或應用?？衫斫獾?，本發(fā)明藥物應用于傷口的量依賴于大量因素，例如藥物中存在的藥劑的生物活性和生物利用率，在其他因素中還依賴于藥劑的性質(zhì)和藥物施用的模式。決定藥物的適合治療量的其他因素可包括A)藥劑在受治療個體體內(nèi)的半衰期。B)待治療的特定狀態(tài)(例如急性或慢性傷口)。C)個體的年齡。施用的頻率也受到上文提及的因素，尤其是在受治療個體體內(nèi)所選藥劑的半衰期的影響。一般地，當將本發(fā)明的藥物用于治療現(xiàn)存的傷口時，藥物應在傷口一發(fā)生(或在傷口未立刻顯現(xiàn)的情況下，例如在才幾體內(nèi)部部位的那樣，傷口一經(jīng)診斷出就施用)時就施用。用本發(fā)明的方法或藥物進行治療應持續(xù)到愈合過程已經(jīng)被加速和/或瘢痕形成已經(jīng)被預防、減少或抑制，直到臨床醫(yī)生滿意為止。施用頻率依賴于使用藥劑的生物半衰期。典型地，應將含有本發(fā)明藥劑的乳膏或軟膏施用到耙組織，以使藥劑在傷口上的濃度保持在適合產(chǎn)生治療效果的水平。這需要每天一次或甚至每天幾次施用。本發(fā)明的藥物可通過能達到期望的促進傷口愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成效果的任何途徑施用，但是優(yōu)選藥物在傷口部位局部施用。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成可通過在傷口部位注射施用本發(fā)明的藥劑實現(xiàn)。例如，在真皮傷口的情況下，本發(fā)明的藥劑可通過真皮內(nèi)注射的方式施用。因此本發(fā)明的優(yōu)選藥物包含本發(fā)明藥劑的可注射溶液(例如在上皮損傷部位或可能損傷部位邊緣的周圍注射)。本發(fā)明實施方案中使用的適合的制劑在下文考慮?？蛇x擇地或另外地，本發(fā)明的藥物也可通過局部的形式施用以促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。這樣施用可作為傷口區(qū)域的初期和/或后續(xù)護理后的一部分起作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過本發(fā)明藥劑對傷口的局部施用(或在對形成傷口的組織或部位預防性施用的情況下)尤其改善了促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成。含有本發(fā)明藥劑的組合物或藥物可采取很多不同的形式，尤其依賴于它們被使用的方式。因此，例如它們可以為液體、軟膏、乳劑、凝膠、水凝膠、粉末或氣溶膠的形式。所有這些組合物適合對傷口局部施用，是對需要治療的個體(人或動物)施用本發(fā)明藥劑的優(yōu)選方式。本發(fā)明的藥劑可以由無菌敷料或貼片的形式提供，其可用于覆蓋傷口或所治療上皮損傷的其他部位?？衫斫獾?，包含本發(fā)明藥劑的組合物的賦形劑應被患者很好地耐受，使得藥劑對傷口釋放。這種賦形劑優(yōu)選是生物可降解、生物可溶解、生物可吸收和/或非炎性的。包含本發(fā)明藥劑的藥物和組合物可以很多方式使用。因此，例如為了促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成，組合物可應用于傷口內(nèi)部和/或周圍。如果組合物應用于"現(xiàn)存的，，傷口，那么藥劑學可接受的賦形劑將是相對"溫和的"，即賦形劑是生物可相容的、生物可溶解和非炎性的。本發(fā)明的藥劑，或編碼這種藥劑的核酸(下文進一步考慮)，可摻入緩釋或延遲釋放的裝置。這些裝置可例如放在或插入皮下，藥劑或核酸可在數(shù)天、數(shù)周或甚至數(shù)月內(nèi)釋放。這種裝置對于需要長期促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的患者(例如經(jīng)受慢性傷口的那些)尤其有用。當用于通常要求頻繁施用(例如通過其他途徑至少每天施用)的藥劑或核酸施用時，該裝置尤其有利。本發(fā)明藥劑的每日劑量可以單次施用(例如局部制劑的每日應用或每曰注射)?？蛇x擇地，本發(fā)明的藥劑一天內(nèi)可能需要施用兩次或多次。進一步可選擇地，緩釋裝置可用于對不需要施用重復劑量的患者提供本發(fā)明藥劑的最佳劑量。在一個實施方案中，用于本發(fā)明藥劑施用的藥學賦形劑可為液體，適合的藥學組合物將采取溶液的形式。在另一個實施方案中，藥學可接受的賦形劑是固體，適合的組合物采取粉末或片劑的形式。在進一步的實施方案中，本發(fā)明藥劑可配制成為藥學可接受的經(jīng)皮貼片的一部分。固體賦形劑可包括可作為調(diào)味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮輔助劑、粘合劑或片劑崩解劑的一種或多種物質(zhì)；也可是包嚢材料。在粉末中，賦形劑是細碎的固體，所述固體與細碎的本發(fā)明的藥劑混合。在片劑中，本發(fā)明藥劑以適合比例與具有必要壓縮特性的賦形劑混合，以期望的形狀和尺寸壓制。優(yōu)選地，粉末和片劑含有達到99%的本發(fā)明藥劑。適合的固體賦形劑包括，例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點蠟和離子交換樹脂。液體賦形劑可用于制備溶液、懸浮液、乳劑、糖漿劑、酏劑和加壓的組合物。本發(fā)明的藥劑可在藥學可接受的液體賦形劑，例如水、有機溶劑、藥學可接受的油或脂肪或其混合物中溶解或懸浮。液體賦形劑可含有其他適合的藥學添加劑例如增溶劑、乳化劑、緩沖液、防腐劑、甜味劑、調(diào)味劑、懸浮劑、增稠劑、色素、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透調(diào)節(jié)劑?？诜湍c胃施用的液體賦形劑的適合實例包括水(部分包含上文的添加劑，例如纖維素衍生物、優(yōu)選羧曱基纖維素鈉溶液)、醇(包括單羥基醇和多羥基醇，例如乙二醇)和它們的衍生物以及油(例如分餾的椰子油和花生油)。對于腸胃外施用，賦形劑也可為油酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。無菌液體賦形劑在用于腸胃外使用的無菌液體形式組合物中是有利的。加壓組合物的液體賦形劑可為卣代烴或其它藥學可接受的推進劑。液體藥學組合物的無菌溶液或懸浮液可以例如以肌內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、基質(zhì)內(nèi)(角膜)或皮下注射的方式使用。無菌溶液也可靜脈施用。本發(fā)明藥劑可制備成無菌固體組合物，可在施用時用無菌水、鹽水或其它適合的無菌可注射介質(zhì)溶解或懸浮。賦形劑傾向于包括必要和惰性的粘合劑、懸浮劑、潤滑劑和防腐劑。在期望以口服攝取的方式施用本發(fā)明藥劑的情況下，可理解地，所選的藥劑將優(yōu)選為具有提高程度的抵抗降解的藥劑。例如，本發(fā)明藥劑可被保護(例如用上文所述的技術(shù))，以便降低其在消化道中的降解速率。本發(fā)明藥劑的組合物適合用于促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制角膜內(nèi)的瘢痕形成。角膜傷口可由意外傷害(如上文考慮的)或外科手術(shù)(例如角膜的激光手術(shù))造成的眼外傷引起。在這種情況下本發(fā)明優(yōu)選的藥物是滴眼劑的形式。本發(fā)明藥劑可應用于一系列"內(nèi)部的"傷口(即傷口發(fā)生在機體內(nèi)，而不是在外表面上)。因此，例如可配制本發(fā)明的藥物供吸入用于肺或其它呼吸道上皮產(chǎn)生的傷口。已知的，例如那些藥學領(lǐng)域常規(guī)使用的方法(例如在體內(nèi)實驗、臨床試驗等中)，可用于建立包括本發(fā)明藥劑的組合物的特殊制劑和這些組合物施用的精確治療方案(例如活性藥劑的每日劑量和施用的頻率)。本發(fā)明的藥劑能促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的適合的每日劑量，依賴于一系列因素包括(但不限于)傷口組織的性質(zhì)、治療傷口的面積和/或深度、傷口的嚴重性和形成病理性瘢痕或慢性傷口的誘病因素的存在或缺乏。通過例子，可以通過局部注射施用到傷口或上皮損傷部位的活性劑總量優(yōu)選為每厘米線性傷口或上皮損傷區(qū)域約50ng/100|iL。這種劑量可一天給予一次延續(xù)三天，因而提供的總劑量是150ng/厘米線性傷口或上皮損傷。在局部應用到急性傷口或上皮損傷部位的情況下，活性劑的適合量可優(yōu)選為約100ng/cm2。這種劑量可一天給予一次延續(xù)三天，因而提供的總劑量是300ng/cm2傷口或上皮損傷。通過進一步的實例，每日施用給傷口或上皮損傷部位的活性劑的優(yōu)選量可為約50ng/cm線性傷口或上皮損傷(如果注射施用)或約100ng/cn^傷口或上皮損傷(如果局部施用)。通過進一步的例子，在單次發(fā)病治療中可施用給傷口或上皮損傷部位的活性劑的量可優(yōu)選為約50-200ng/cm線性傷口或上皮損傷(如果注射施用)，或約100-300ng/cn^傷口或上皮損傷(如果局部施用)。治療傷口或其它上皮損傷部位需要的本發(fā)明的藥劑量典型地為每24小時每厘米線性傷口或上皮損傷施用1pg到1mg藥劑，盡管這個數(shù)字可根據(jù)上文概括的因素向上或向下修正。藥劑可優(yōu)選地以1pg/100|iL-lmg/100!iL的藥劑溶液的形式提供，24小時期間每厘米線性傷口或上皮損傷施用100fxL這種i容液。更優(yōu)選地，藥劑以10pg/100iiL-100(ig/100的溶液施用，24小時期間每厘米線性傷口或上皮損傷施用100|LiL這種溶液。最優(yōu)選地，藥劑以1ng/100[iL-1000ng/100|iL的溶液施用，24小時期間每厘米線性傷口或上皮損傷施用100jiL這種溶液。一般地，包括本發(fā)明藥劑的組合物應被配制使得當給傷口施用時藥劑濃度達到每厘米線性傷口或上皮損傷0.79pM至0.79mM。優(yōu)選地，藥劑以每厘米7.9pM至0.079mM的濃度提供。本發(fā)明藥劑的(例如序列ID號3至8的肽)施用濃度可為0.79pM至0.79mM。優(yōu)選地，本發(fā)明藥劑的施用濃度可為7.9pM至0.079mM。最優(yōu)選地，本發(fā)明藥劑的施用濃度可為0.79nM至0.79pM。純粹通過實例，當皮內(nèi)注射施用并以100|iL每厘米線性傷口邊緣給藥，含有濃度為10pg/100(iL至100嗎/100jiL的本發(fā)明藥劑(例如序列ID號3、5、7、9或11的TGF-P3)的可注射溶液適合于用來促進真皮傷口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。在序列ID號3的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優(yōu)選劑量為約1ng/100pL-1000ng/100每cm線性傷口邊緣施用約100|iL的這種溶液。在序列ID號5的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優(yōu)選劑量為約1ng/100pL-1000ng/100|_iL，每cm線性傷口邊緣施用約100jiL的這種溶液。在序列ID號7的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優(yōu)選劑量為約1ng/100(iL-1000ng/100nL,每cm線性傷口邊緣施用約100的這種溶液。在序列ID號9的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優(yōu)選劑量為約1ng/100(iL-1000ng/100jaL，每cm線性傷口邊緣施用約100jiL的這種溶液。在序列ID號11的TGF-P3的情況下，施用給傷口的優(yōu)選劑量為約1ng/100[iL-1000ng/100fiL，每cm線性傷口邊緣施用約100的這種溶液。本發(fā)明的藥劑可作為單一療法(例如通過單獨使用本發(fā)明的藥物)用于促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成?？蛇x擇地，本發(fā)明的藥物或方法可用于與其它促進傷口愈合或抑制瘢痕的化合物或治療結(jié)合。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的TGF-(33可在糖存在時有利地配制。這種糖可為還原或非還原糖和/或其磷酸酯或其磷酸酯衍生物。這些糖的實例可選自，但不限于選自由麥芽糖、甘露糖、海藻糖、阿拉伯醣、甘露醇、蔗糖、果糖、右旋糖和葡萄糖組成的組的那些。優(yōu)選的糖可選自由麥芽糖和海藻糖組成的組?？衫斫獾?，通過包括編碼這些分子的核酸序列的細胞表達技術(shù)，包含本發(fā)明TGF-P3的肽可代表有利的施用藥劑。這些細胞表達的方法尤其適合醫(yī)療應用，其中需要長期的肽的治療效果，例如在期望其長時間增強有缺陷的傷口愈合反應的情況下。尤其優(yōu)選的是，通過細胞表達施用的TGF-P3包括序列ID號3、5、7、9或11定義的那些肽或其片段或衍生物。編碼這些肽的核酸在序列ID號4、6、8、10或12中列出。給組織例如傷口施用本發(fā)明肽藥劑的很多已知方法具有如下缺點由于肽藥劑在體內(nèi)的半衰期短，即使幾天的過程也^[艮難達到本發(fā)明藥劑在治療部位上的持續(xù)水平。藥劑的半衰期短出于^[艮多原因，包括(i)被蛋白酶和類似物的降解。(ii)被結(jié)合蛋白的清除。(iii)被胞外基質(zhì)分子結(jié)合和抑制藥劑活性。而且，用于促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥劑需要在適合的賦形劑內(nèi)施用，并且經(jīng)常以包含藥劑和賦形劑的組合物的形式提供。正如所討論的，優(yōu)選地這些賦形劑是非炎性、生物可相容的、生物可吸收的并且必須不能使藥劑降解或失活(貯存或使用中)。然而，經(jīng)常難以提供令人滿意的賦形劑以將藥劑遞送到具有待治療傷口的組織。排除或減輕這些問題的便利方法是，通過基因治療的方式提供治療有效量的本發(fā)明藥劑到待治療的區(qū)域。本發(fā)明第四方面提供了用于基因治療技術(shù)的遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包括編碼選自下述組的肽的DNA分子序列ID號3、序列ID號5、序列ID號7、序列ID號9和序列ID號11,所述DNA分子可凈皮轉(zhuǎn)錄導致被選擇肽的表達。本發(fā)明第五方面提供了前段定義的遞送系統(tǒng)用于生產(chǎn)應用于促進加速傷口愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥物的用途。本發(fā)明第六方面提供了上述定義的遞送系統(tǒng)用于生產(chǎn)應用于促進上皮再生的藥物的用途。本發(fā)明第七方面提供了促進加速傷口愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括施用給需要這種治療的患者治療有效量的由本發(fā)明第九方面定義的遞送系統(tǒng)。本發(fā)明第八方面提供了促進上皮再生的方法，所述方法包括施用給需要這種治療的患者治療有效量的由本發(fā)明第九方面定義的遞送系統(tǒng)。由于遺傳密碼簡并性，顯然編碼適合本發(fā)明應用的藥劑的核酸序列是可不同的或可變的，并且基本上不會影響被編碼產(chǎn)物的序列，以提供其功能變體?？捎糜诰幋a由序列ID號3、5、7、9或11定義的肽的可能的核酸的序列對技術(shù)人員是明顯的，技術(shù)人員可參考由分別作為序列ID號4、6、8、10或12而提供的例子。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)非常適合于在比大多數(shù)傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)可能的時段更長的時段內(nèi)在傷口處獲得持久水平的本發(fā)明的藥劑。適合促進加速傷口愈合和/或抑制瘢痕形成的本發(fā)明藥劑可從傷口部位的細胞持續(xù)表達，所述細胞經(jīng)過由本發(fā)明第四方面公開的DNA分子轉(zhuǎn)化。因此，即使本發(fā)明的藥劑在體內(nèi)有非常短的半衰期，治療有效量的藥劑仍可從被治療組織持續(xù)表達。此外，本發(fā)明遞送系統(tǒng)可用于提供DNA分子(和由此的本發(fā)明的藥劑)而不需要使用傳統(tǒng)的藥物賦形劑，例如在接觸傷口的軟膏或乳劑中所需要的那些l武形劑。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)優(yōu)選使DNA分子能夠表達(當遞送系統(tǒng)施用患者時)產(chǎn)生由序列ID號3、5、7、9或11組成的組定義的肽或這些肽的片段或衍生物。DNA分子可被包含在適合載體內(nèi)以形成重組載體。載體可例如是質(zhì)粒、粘?；蚴删w。所述重組載體非常適合于用DNA分子轉(zhuǎn)化細胞的本發(fā)明的遞送系統(tǒng)。重組載體也可包括其它功能性元件。例如，重組載體可被設(shè)計以使載體在細胞核內(nèi)自主復制。在這種情況下，誘導DNA復制的元件在重組載體內(nèi)是必需的?？蛇x擇地，重組載體可這樣設(shè)計以將載體和重組DNA分子整合進細胞的基因組。在這種情況下，利于把向整合的(例如通過同源重組)DNA序列是期望的。重組載體也可含有編碼用作克隆過程中可選擇標記物的基因的DNA。重組載體也可進一步根據(jù)需要包含控制基因表達的啟動子或調(diào)節(jié)子。DNA分子可(^旦不必須)整合進受治療個體細胞的DNA內(nèi)。未分化細胞可被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，引起遺傳改變的子細胞的產(chǎn)生。在這種情況下，需要對受治療個體的表達進行調(diào)控，例如用特異的轉(zhuǎn)錄因子、基因激活子或更優(yōu)選地用可誘導的啟動子，其可轉(zhuǎn)錄響應于在傷口中發(fā)現(xiàn)的特異信號的基因?？蛇x擇地，遞送系統(tǒng)可設(shè)計為利于受治療個體未分化細胞的不穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化。在這種情況下，因為當轉(zhuǎn)化細胞死亡或停止表達蛋白時(理想地當實現(xiàn)促進傷口加速愈合并減少瘢痕形成時)DNA分子的表達將終止，所以表達調(diào)控的重要性變小。遞送系統(tǒng)可給個體纟是供沒有整合進載體的DNA分子。例如，DNA分子可整合進脂質(zhì)體或病毒顆粒?？蛇x擇地，"棵"DNA分子可通過適合的方式例如直接內(nèi)吞攝取插入個體的細胞。DNA分子可通過轉(zhuǎn)染、感染、微注射、細胞融合、原生質(zhì)體融合或基因槍轟擊的方式轉(zhuǎn)移到個體的細胞內(nèi)。例如，轉(zhuǎn)移可通過用包被的金顆粒、包含DNA分子的脂質(zhì)體、病毒載體(例如腺病毒)的基因槍轉(zhuǎn)染和通過直接應用質(zhì)粒DNA到局部傷口或注射來直接提供DNA攝取(例如內(nèi)吞)的方式進行。本發(fā)明藥劑的細胞表達可以是通過傷口周圍無損傷區(qū)域的邊緣的細胞，或可選擇地通過治療性引入傷口的細胞(例如培養(yǎng)的與傷口愈合反應有關(guān)的內(nèi)源或外源細胞)?？衫斫獾兀恢委熜哉T導促進傷口加速愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的細胞可體外操作，以使它們可表達增加水平的本發(fā)明藥劑，接著引入傷口區(qū)域。優(yōu)選地，這些細胞是體外培養(yǎng)用于制備或制造在促進傷口愈合中使用的人造皮膚或皮膚取代物的細胞。更優(yōu)選地，細胞是自體同源的細胞，盡管可理解地任何適合細胞都可用。因此，本發(fā)明第九方面中提供了包含被誘導表達本發(fā)明藥劑的細胞的藥物。本發(fā)明藥劑細胞表達的誘導可通過將核酸整合進細胞的方式實現(xiàn)，所述核酸可使本發(fā)明適合使用的藥劑表達?，F(xiàn)在，本發(fā)明將通過實施例進一步描述，參考以下實驗方案和研究以及附圖，其中表1顯示指示在a螺旋結(jié)構(gòu)中涉及的氨基酸殘基傾向性的值；表2顯示提及本發(fā)明突變體TGF-(33時所使用名稱的詳細內(nèi)容；表3顯示野生型TGF-P3和本發(fā)明TGF-(33再折疊效率；表4對比了野生型TGF-卩3和Gly63-Ala(—種本發(fā)明的TGF-(33蛋白)的生物活性，通過細胞生長抑制測定評價；表5顯示體內(nèi)傷口愈合研究中使用的反應物濃度；表6顯示體內(nèi)傷口愈合研究中使用的反應物濃度；圖1顯示TGF-p3'野生型，在苯基-瓊脂糖凝膠柱的層析圖；圖2顯示TGF-(33'野生型，單體和二聚體在UN0-S1柱中的層析圖；圖3顯示通過考馬斯藍染色的SDS-PAGE比較TGF-(33突變蛋白和'野生型，TGF-(33(請注意更換Gly63-Ala和Gly63-Pro突變體蛋白的緩沖液會導致一些樣品損失，因此加入凝膠中的實際濃度會比所陳述的3jig少一些)；圖4顯示用于切口創(chuàng)傷的模板；圖5顯示用野生型TGF-卩3或本發(fā)明TGF-p3治療切入性傷口(A和B)第3天的平均肉眼評定分數(shù)，其中"*"表明與未治療傷口相比顯著增強的愈合(p〈0.05);圖6是用'野生型，和突變型TGF-P3蛋白治療切口創(chuàng)傷(C和D)第3天的顯微鏡下平均傷口寬度；圖7顯示用于切入性創(chuàng)傷的模板；圖8說明了用'野生型，TGF-(33、Gly63-Ala和Gly63-Pro治療傷口的肉眼瘢痕評分(第70天)；圖9說明了用'野生型，TGF-(33、Gly63-Ala和Gly63-Pro治療傷口的肉眼瘢痕圖像(第70天)；圖10說明了用'野生型，TGF-(33、Glul2-Ser和雙絲氨酸突變體(Glul2陽Ser和Arg52-Ser)治療傷口的肉眼瘢痕評分(第70天)，其中"+"表明與安慰劑治療傷口相比顯著降低的瘢痕形成(p0.05)。圖11說明了用'野生型，TGF-P3、Glul2-Ser和雙絲氨酸突變體(Glul2-Ser和Arg52-Ser)治療傷口的肉眼瘢痕圖像(第70天)；圖12說明了用'野生型，TGF-(33、Gly63-Pro和Gly63-Ala突變蛋白治療傷口的代表性顯微鏡瘢痕圖像(創(chuàng)傷后70天)；以及圖13說明了用Glul2-Ser和雙絲氨酸突變體(Glul2-Ser和Arg52-Ser)在創(chuàng)傷后70天治療傷口的代表性顯微鏡瘢痕圖像。特別感興趣的序列的詳細內(nèi)容在"序列信息"部分提供。實驗方案和結(jié)果1.本發(fā)明第一和第二方面的TGF-P3的產(chǎn)生、生產(chǎn)、再折疊和純化。1.1cDNA的產(chǎn)生源于人切入性傷口的總RNA(創(chuàng)傷后第5天取樣)用DNA-Free(Ambion)處理以除去任何污染性DNA。用總RNA作為才莫板，TGF-(33的cDNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)產(chǎn)生。RT-PCR的反應混合物是由BrilliantQRT-PCRCoreReagentKit，一步法(Stratagene)制備的。將1微克RNA加入到50pL的溶液，所述溶液含有一步QRT-PCR緩沖液、0.2mMdNTP、3.5mMMgCl2、lpLStrataScript逆轉(zhuǎn)錄酶、2.5單位Taq聚合酶、0.4pM有義引物(5'GATATACCATGGCTTTGGACACCAATTACTACTGC3')和0.4pM有義引物(5'-CAGCCGGATCCGGTCGACTCAGCTACATTTACAAGAC3')。反應在熱循環(huán)器(HybaidPCRExpresses)中發(fā)生，并且按照下列條件進行45。C30分鐘，95。C10分鐘，然后是40個循環(huán)的95°C30秒、65°C1分鐘和72。C1分鐘。最后的步驟是72°C10分鐘。PCR樣品用2。/。(w/w)瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小，并用WizardPCRPrepKit(Promega)純化。1.2質(zhì)粒的構(gòu)建pET-3d載體來自pBR322載體，并且包含LacUV5控制的T7啟動子和氨芐西林抗性標志物基因。TGF-P3的cDNA片段(3.2部分中產(chǎn)生的)被亞克隆進pET-3d的NcoI和BamHI位點(分別是5'-3')。產(chǎn)生的連接接著被轉(zhuǎn)化進XLIOGold細胞(Stratagene)并進行菌落PCR分析來定位包含插入物的克隆。使最后的克隆生長并用Qiaprep⑧Spin小量制備試劑盒(Qiagen)將質(zhì)粒DNA提取進水中。質(zhì)粒用T7啟動子引物(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')和T7終止子引物(5'誦GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')測序和驗證。1.3定向誘變從1.2部分獲得的'野生型，TGF-(33構(gòu)建體經(jīng)過定向誘變產(chǎn)生兩種編碼TGF-f33突變蛋白的突變構(gòu)建體。構(gòu)建體/突變體的名稱和核酸序列變化總結(jié)于表2。經(jīng)過誘變的核苷酸位置在序列信息部分顯示。體外定向誘變方法是基于Stratagene'sQuickChange⑧定向誘變試劑盒。100ng質(zhì)粒(來自L2部分)力。入到溶液中，所述溶液含有2.5pL10xQuickChange多反應緩沖液、Quick溶液、1OOng的誘變引物、1mLdNTP混合液、PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene)，用雙蒸餾水補充到2.5mL終體積。反應在熱循環(huán)器(HybaidPCRExpresses)中發(fā)生，并且在下列條件下進行95°C1分鐘，30個循環(huán)的95°C1分鐘、55。C1分鐘，最后一步是65。C2分鐘。一旦熱循環(huán)結(jié)束，將反應物在冰上放置2分鐘以使溫度降到37。C以下。lpLDpnI限制性酶(lOU/(iL)加入到每個反應中徹底混勻。對反應混合物進行離心(用SorvallBiofbge,10,000rpm/min),然后在37。C溫育消化雙親的雙鏈DNA。每個誘變反應中1-5DpnI處理的DNA加入45|iL活化的XLI-Blue大腸桿菌(Stratagene)和2|iLp-ME混合液(Stratagene)。將所述混懸液混合并且在冰上溫育30分鐘。所述混懸液用42。C水浴加熱30秒。所述混合物在冰上再溫育2分鐘。0.5mL預加熱(42。C)的NZY+肉湯加入到每一個細胞懸液中。轉(zhuǎn)化肉湯在225-250rpm條件下振動孵育1小時。每個誘變反應的轉(zhuǎn)化肉湯中取出lpL、10(iL和lOO(iL涂布到LB瓊脂平板上，并在37。C溫育18小時，所述LB瓊脂平板含有100jig/mL的氨千西林(Sigma)、80jig/mL的5-澳-4-氯-3-吲哚-(3-D-他喃半乳糖苷(X-gal,Stratagene)和20mM的異丙基P-D-硫代吡喃半乳糖普(IPTG,Sigma)。藍色菌落含有突變的質(zhì)粒。從瓊脂挑出每種突變型的單菌落，然后接種到10mL含有100|ig/mL氨千西林的LB培養(yǎng)基上。用QIAprepSpin小量制備試劑盒(Qiagen)分離質(zhì)粒。使用pQEfor和pQERev引物測序質(zhì)粒并驗證正確的突變。1.4轉(zhuǎn)化和克隆10!iL(50ngVl)質(zhì)粒DNA(來自1.2和1.3部分)力口入到lmL冷的(4。C)感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)pLysSSingles細胞(Novagen)。20分鐘后將所述細胞在42。C水浴溫育30秒熱激。lOO^iL的Psi培養(yǎng)基加入到細胞/質(zhì)?；旌弦褐胁⒃?7。C振蕩90分鐘。50(xL和lOO^iL等分試樣涂布到含有100嗎/mL的氨千西林(Sigma)LB瓊脂平板上并在37。C溫育18小時。單菌落被培養(yǎng)，并產(chǎn)生細胞凍存物，在-80。C條件保存。分析細胞凍存物的質(zhì)粒DNA從，以驗證正確的轉(zhuǎn)化。1.5表達復蘇凍存的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞(來自1.4部分)的安瓿，接種到含有100mLLB培養(yǎng)基和100嗎/mL氨千西林的封口的Erle腿eyer燒瓶里。燒瓶振蕩溫育，37。C過夜。將5mL這種過夜的培養(yǎng)物加入到2升的Erlenmeyer燒瓶(500mLLB培養(yǎng)基/和100嗎/mL氨千西林)并在37°C振蕩溫育。每小時取2mL肉湯樣品，追蹤其生長和TGF-(33"野生型，，和突變型蛋白的表達(誘導后)。生長由分光光度計測量在波長600nm的吸收來確定。當測得的吸收是0.6Abs時，通過加入異丙基(3-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)至終濃度1mM來誘導細胞表達"野生型"和突變型TGF-(33蛋白。培養(yǎng)物再多溫育4小時。0.5mL肉湯樣品離心沉淀(SorvallBioftige10,000rpm離心10min)，棄去上清液。沉淀在50|iL十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)樣品緩沖液中重懸浮，并在95。C水浴中加熱10分鐘。將10樣品加到SDS-PAGE上。SDS-PAGE和考馬斯藍染色(如A.TAndrews(1986)描述的)用HoeferMightySmallSE245DualGelCaster(Amersham)進行。凝膠厚度是1mm,含有15%(v/v)聚丙烯酰胺凝膠。1.6細胞收集和包涵體的分離來自1.5部分的細胞通過在帶有4315轉(zhuǎn)頭的HettichRotina46R離心機中，以5000g離心10分鐘而沉淀。于4。C進行細胞破碎和不溶性(包涵體)TGF-卩3蛋白的回收。細胞在pH8.3的50mL100mMTris/HCl(Sigma)和10mMEDTA(Sigma)中懸浮，用SanjoSoniprep150超聲破碎。加入0.2%(w/w)TritonX-100(Sigma),將懸浮液攪拌l小時。懸浮液15，000g離心40分鐘。沉淀在以12,000g離心40分鐘之前，于pH8.3的50mL100mMTris/HCl和10mMEDTA中重懸浮。1.7包涵體的溶解來自1.6部分的沉淀在40mL8M尿素l%(w/w)DL-二硫蘇糖醇(DTT)中重懸浮，并在HeidolphDiax900勻漿機中破碎。懸浮液加蓋并攪拌1小時以溶解包涵體，將TGF-P3"野生型"和突變型蛋白還原成它們的單體形式。接著懸浮液以15,000g離心30分鐘。將上清液透析以-使緩沖液乂人8M尿素(ICNBiomedical)換成10%(v/v)醋酸。當緩沖液交換到10%(v/v)醋酸時，溶于8M尿素的E.coli蛋白從溶液沉淀出來。將1%(w/w)DTT(Sigma)加入懸浮液中，加蓋并攪拌30分鐘以便還原緩沖液交換過程中TGF-(33單體間形成的任何二硫鍵。以12,000g離心懸浮液40分鐘以便分離可溶和不溶的蛋白。尿素溶解和緩沖液交換步驟取出的樣品(醋酸可溶和不溶物質(zhì))，接著用SDS-PAGE分析。1.8超濾來自1.7部分的10%(v/v)醋酸可溶物質(zhì)用10kDa膜在Vivoflow50(Vivascience)中進行超濾。這樣做的目的是減少10%(v/v)醋酸懸浮液的體積到3mL，以及除去低分子量的蛋白(<10kDa)。1.9凝膠過濾來自1.7部分的樣品用Hiprep26/60SephacrylS-100高分辨柱(Amersham，320mL)在10。/。(v/v)醋酸1.5mL/min流速下層析分離。包含單體的變性的TGF-卩3部分(在100至140分鐘之間洗脫)被收集。1.10冷凍干燥包含變性單體TGF-P3的收集部分用IECLyoprep-3000冷凍干燥器冷凍干燥，以^v樣品中除去醋酸和水。1.11再折疊來自1.10部分的凍干的單體TGF-(33在含有10mMDTT的8M尿素中溶解，直到達到10mg/mL的TGF-p3終濃度。在攪拌的同時，將TGF-(33溶液逐滴加入再折疊溶液(1M3-(-吡啶并)-l-丙烷磺酸鹽(NDSB-201)、20%(v/v)二曱基亞砜(DMSO,Sigma)、2%(w/v)3-(3-膽酰胺丙基)二曱銨基-l-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、1MNaCl(Sigma)、1%(w/v)還原型谷胱甘肽(GSH,Sigma)和0.05MTrizmaBase(Sigma)pH9.3)直到0.2mg/mL的TGF畫卩3終濃度。重要的是用濃NaOH/HCl將pH保持在9.2-9.4的范圍內(nèi)。溶液用石蠟封口膜(Parafilm)封口，石蠟封口膜上打孔以允許單體TGF-p3氧化，并在8。C攪拌。144小時后將溶液15,000g離心40分鐘，去除形成的沉淀，pH用冰醋酸調(diào)整為pH3.5。上清液含有二硫化物連接的二聚體TGF-(33，其通過SDS-PAGE(非還原的)和Western印跡進行測定。SDS-PAGE如2.1部分中所描述的進行。至于Western印跡，樣品被加載到lmm厚、15%(v/v)的聚丙烯酰胺凝膠中。一旦電泳結(jié)束，使用TE22Western印跡裝置(Pharmacia)將凝膠內(nèi)的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜(Sigma)上，按其指導手冊說明的。硝化纖維膜上非特異結(jié)合位點被封閉緩沖液(5。/。(w/v)脫脂奶粉，l%(v/v)聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸S旨(Tween20,Sigma),于磷酸鹽緩沖鹽水(Invitrogen)中)封閉。然后所述硝酸纖維素膜用洗滌緩沖液(PBS,0.1%Tween20)洗滌。然后將所述硝化纖維膜用一抗(MAB643(R&D體系))溫育1小時，所述一抗是用含0.1%(v/v)Tween20的PBS以1:500稀釋。所述硝化纖維膜經(jīng)再次洗滌，然后與山羊抗鼠抗體(Abcam)的二抗溫育1小時，所述二抗是用含0.1。/。(v/v)Tween20的PBS以1:3000稀釋。將所述硝化纖維膜最后洗滌一遍，然后加入ECL試劑(Amersham)使抗原-抗體復合物顯影。在暗室中所述硝化纖維膜在浸于顯影劑、固定劑和終止液前用X射線膠片曝光。然后使所述硝化纖維膜干燥。再折疊的TGF-P3'野生型，和突變型單體蛋白顯示了不同水平的二聚體形成。從其他非正確再折疊或非二聚體TGF-(33蛋白回收正確折疊的二聚體的百分比在表3中顯示。有趣的是，TGF-P3蛋白的a螺旋內(nèi)的氨基酸置換對再折疊產(chǎn)率(二聚體形成)產(chǎn)生最大影響。用精氨酸置換甘氨酸穩(wěn)固a螺旋會使再折疊產(chǎn)率從20%增加到50%。相反，用脯氨酸置換甘氨酸a螺旋破壞，會導致低得多的二聚體形成百分比。這說明a螺旋在形成正確再折疊TGF-P3分子中起重要作用。置換參與'鹽橋，形成的氨基酸，不影響再折疊產(chǎn)率。1.12疏7jC相互作用色鐠1.11部分的復性溶液用在Vivoflow50(Vivascience)上10kDa(分子量截留)膜超濾濃縮到50mL。所述復性溶液用含有2M硫酸胺(Sigma)和10。/。(v/v)醋酸的溶液1:1稀釋。填充有苯基-瓊脂糖凝膠快流速(Amersham)的2mlBiorad柱用緩沖液A(1.0M硫酸胺和10。/。(v/v)醋酸)平衡。20mL稀釋的復性溶液以1mL/min的流速(整個過程都使用這個流速)加到所述柱中。然后用緩沖液A洗柱直到280nm的吸光度讀數(shù)達到基線水平(10mL)。然后加入100。/。緩沖液B(10。/。(v/v)醋酸30。/。(v/v)異丙醇)到柱中。收集第一個峰，所述峰含有TGF-(33蛋白的單體和二聚體形式(見圖1)。1.13陽離子交換色鐠陽離子交換色譜用來把二聚體TGF-(33蛋白從單體中分離出來。2mLUN0-S1柱(Biorad)用緩沖液A(含有10。/。(v/v)醋酸，30。/。(v/v)異丙醇)平衡。從3.12部分收集的部分以lmL/min的流速加到UN0-S1柱上。然后用緩沖液A洗柱直到280nm的吸光度讀數(shù)達到基線水平(5分鐘)。線性梯度運行5分鐘，以60%1￡沖液a和40%緩沖液B(10。/q(Wv)醋酸、30。/。(v/v)異丙醇和1MNaCl)的混合液結(jié)束。所述緩沖液混合液的加入要再維持15分鐘。單體TGF-P3在樣品注入10分鐘后/人柱中洗脫出來。再4吏用第二個線性梯度運行5分鐘，用100。/。緩沖液B維持IO分鐘結(jié)束。二聚體TGF-P3在樣品注入后30分鐘/人柱中洗脫出來(見圖2)。1.14超濾/'滲濾1.13部分中含有純化的單體和二聚體TGF-(33分子的部分經(jīng)過超濾/滲濾來把緩沖液更換為20mM醋酸、20。/。(v/v)異丙醇，然后濃縮樣品到約10mg/mL(TGF-p3濃度由紫外分光光度計測定)。帶有10kDa截留的Vivoflow50(Vivascience)用來更換緩沖液和濃縮樣品。2.本發(fā)明TGF-P3的體外特性2.1SDS-PAGE分才斤純化的本發(fā)明TGF畫卩3純化的TGF-P3突變蛋白(來自1.14部分)用SDS-PAGE評價確定純度和分子量。由于來自3.14部分TGF-(33突變樣品的低pH,緩沖液用蛋白質(zhì)脫鹽洗脫柱(Pierce)更換成SDS-PAGE樣品緩沖液。3嗎純化的TGF-(33突變蛋白(還原的或非還原的樣品)、3昭'野生型，TGF-P3陽性對照(還原的和非還原的)和10[iLInvitrogenMark12分子量標準品加到聚丙烯酰胺凝膠中(10。/。-20。/。(v/v)梯度的丙烯酰胺)。一旦電泳結(jié)束，凝膠就用考馬斯藍染色。如所預料的'野生型，TGF-(33和Gly63-Ala突變蛋白跑到了凝膠的相同位置(對于還原的樣品為約13kDa，對于非還原樣品為約25kDa)。有趣的是沒有Gly63-Pro突變蛋白條帶在非還原膠中檢測出來但是在還原膠中檢測出來。由于Gly63-Pro再折疊效率非常低(〈1。/。)，可能會產(chǎn)生低于考馬斯的檢測水平(>1昭)的多種再折疊種類。然而當這些種類被還原后，還原的Gly63-Pro單體濃度就高于l(ig的考馬斯染色檢測限，因此Gly63-Pro能在還原膠中看到。還原的Gly63-Pro蛋白條帶位置比'野生型，TGF-(33條帶位置稍高。這正是所預期的，因為63位置上甘氨酸用脯氨酸的置換使得Gly63-Pro突變蛋白的分子比'野生型，TGF-卩3大(見圖3)。2.2對比本發(fā)明的TGF-卩3和野生型TGF-P3的生物活性的細胞生長抑制測定細胞生長抑制測定(AMeager,1991)是一種TGF-p分子體外生物活性測驗。比色測定是基于TGF-P分子對水貂肺上皮細胞(MinkLungEpithelialcells)(MLEC)的生長抑制作用。將包含下述物質(zhì)的100jiL的細胞混懸液加入到96孔組織培養(yǎng)板中的每一孔1x104MLEC細胞/mL和完全培養(yǎng)基(DMEM(Invitrogen),0.01MHepesi爰沖液(Invitrogen),2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)、L-精氨酸(Invitrogen)、L-天冬酰胺(Invitrogen),100單位/mL青霉素(Invitrogen)，50昭/mL鏈霉素(Invitrogen)和5%胎牛血清(Invitrogen))。經(jīng)過37。C、5%C02過夜溫育后，100pL系列稀釋(10pg/mL到500pg/mL)的二聚體TGF-卩3突變樣品(來自3.14部分)力。入到所述板中。對照孔加入200|iL完全培養(yǎng)基和10%(v/v)0.25M麥芽糖。所述板再溫育120小時，50pL的2mg/mL3-[4,5-二曱基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鐵噻唑蘭(MTT，Sigma)加入到每孔中。所述板再溫育4小時然后除去培養(yǎng)基。lOO)iL的0.05MHC1(BDH)、無水異丙醇(BDH)力口入到每孔中，然后對得到的溶解的曱月替(formazan)用全自動定量繪圖酶標儀(Victor21420)在570nm定量測定。Gly63-Ala、本發(fā)明的TGF-卩3在濃度范圍0-500pg/mL時對MLEC細胞有抑制效果。從表4可以看出，Gly63-Ala突變蛋白的IC50為34pg/mL,對比于'野生型，TGF+3的ICso為26pg/mL。2.3絲醋列分析來自3.14部分50微升純化的'野生型，和突變型TGF-(33樣品被真空干燥然后用20nL含有50mMNH4HCO^p10%(v/v)乙腈的溶液重懸。20|ig測序級胰蛋白酶(Promega)用10|iL試劑盒提供的重懸緩沖液(Promega)重懸，使胰蛋白酶濃度是2嗎/VL。然后將所得物用50mMNH4HC03和10%(v/v)乙腈稀釋到胰蛋白酶終濃度是0.2嗎/pL。通過加入與野生型，和突變型TGF-(33蛋白比率是1:20(w/w)的胰蛋白酶來消化過夜。通過加入蟻酸(Fluka)到終濃度0.1。/。(v/v)來結(jié)束消化。然后將樣品稀釋到lpmole/|iL。肽通過nano-flowRPLC-MS方法分析(臨界系統(tǒng)，Dionex聯(lián)機到Q-ToF2,微量)。層析是在7SpmC18柱(LC填料)利用45分鐘梯度從5。/。(v/v)乙腈到55%(v/v)乙腈進行的。MS分析采用的是數(shù)據(jù)依賴型分析的形式，其中儀器測量了從LC中洗脫的肽離子的m/z并且選擇適合的離子用于MS-MS分析，其中采用碰撞引發(fā)的分解以使肽離子片段化，以提供序列信息。3本發(fā)明TGF-P3的體內(nèi)特性在成年雄鼠中考察了再折疊活性'野生型，和突變型TGF-P3蛋白對切入性傷口和切口創(chuàng)傷愈合(創(chuàng)傷后3天)和瘢痕形成(創(chuàng)傷后70天)的生物效應。3.1野生型TGF-P3和本發(fā)明TGF-p3的傷口愈合效果對比雄鼠(SpragueDawley)用氟烷麻醉并且削去背毛。傷口位置使用標準模板和皮膚標記墨水如圖4所示進行標記。樣品用含有0.25M麥芽糖(Sigma)、0.002%(v/v)醋酸和0.33%(v/v)異丙醇的無菌賦形劑緩沖液稀釋到表4說明的濃度。所有樣品都無菌過濾并且不含內(nèi)毒素。4只鼠用于每一個治療組。來自每個治療組的(表4)100jiL樣品皮內(nèi)注射到標記傷口的位置A和B(不接受治療的(未實驗的)鼠除外)。傷口位置A和B進行鉆取活組織檢查。所有動物都單獨籠養(yǎng)。24小時后所述動物接受二次劑量的樣品。3天后傷口一皮拍照并<吏用肉目艮#見覺才莫擬評分系統(tǒng)(VisualAnalogueScoringsystem)(修改自Beausang，E等1998)分析。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析用MannWhitneyU/StudentT檢驗進行。p<0.05的值被認為是顯著的。3.2使用肉目械覺模擬評分法評估用野生型TGF-P3或本發(fā)明TGF-P3治療的第3天切入性傷口的傷口愈合切入性傷口在3天后使用肉眼視覺模擬評分法(VAS)檢查。在這個10分制中，0分代表良好愈合的傷口，IO分代表很差愈合的傷口。數(shù)據(jù)顯示與未治療的相比(未實驗的對照)，用50ng膽iiL或100ng/100^L的野生型TGF-(33治療會降低VAS分數(shù)(即，改善了傷口的肉眼外觀)。與未治療的相比(未實驗的對照)，用100ng/100(iL的劑量治療明顯改善了(pO.05)傷口的外觀，即加速愈合。與未治療的相比(未實驗的對照)，用50ng/100jiL或100ng/100(iL的Gly63-Ala突變型治療會降低VAS分數(shù)，并且比得上用野生型TGF-(33治療的傷口，即沒有削弱愈合。與未治療的相比(未實-驗的對照)，用50ng/100jiL或100ng/100faL的Gly63-Pro突變型治療會降低VAS分數(shù)，并且與用野生型TGF-p3治療的傷口相當，即，沒有削弱愈合。3.3用野生型和突變型TGF-P3蛋白治療的切口創(chuàng)傷第3天的傷口寬度顯微鏡評估切口創(chuàng)傷寬度在3天后顯微鏡評估。所有用TGF-P3的野生型和突變型蛋白治療的傷口都顯示了與安慰劑和未治療(未實驗)對照相當?shù)膫趯挾龋C明TGF-P3突變蛋白在愈合方面沒有不良作用(圖6)。3.4'野生型，和突變型TGF-(33蛋白在傷口瘢痕形成方面的效果(創(chuàng)傷笫70天)雄鼠(SpragueDawley)用氟烷麻醉并且削去背毛。傷口位置用標準模板和皮膚標記墨水如圖7所示的進行標記。樣品用含有0.25M麥芽糖(Sigma)、0.002%(v/v)醋酸和0.33%(v/v)異丙醇的無菌載體緩沖液稀釋到表5說明的濃度。所有樣品都無菌的、無內(nèi)毒素的和無熱原的。4只鼠用于每一個治療組。來自每個治療組的(表6)100pL樣品皮內(nèi)注射到標記傷口的位置A和B(不接受治療的(未實驗的)鼠除外)。在傷口位置A和B用ll號手術(shù)刀片做出總深度lcm長的切口。所有動物都單獨籠養(yǎng)。24小時后所述動物接受二次劑量的樣品。70天后瘢痕形成被拍照并使用肉眼視覺模擬評分系統(tǒng)(修改自Beausang，E等1998)分析。傷口處被切除并在處理成蠟塊前放置在10%緩沖鹽水中。所述蠟塊被切成5pm連續(xù)切片并放置在載玻片上。所述載玻片用Masson三色法(MassonsTrichrome)染色和分析。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析用MannWhitneyU/StudentT檢驗進行。p<0.05的值被認為是顯著的。3.5使用肉眼VAS對第70天切入性傷口的評估切入性傷口在70天后使用肉眼VAS系統(tǒng)進行檢查。10分說明很壞的瘢痕，0分是正常皮膚(圖8)。第70天傷口的VAS分析顯示'野生型，TGF-P3(以50ng/100iiL和100ng/100(iL劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。與用安慰劑治療的傷口相比這兩種劑量瘢痕形成的減少是統(tǒng)計學上顯著的(p0.05)。Gly63-Ala突變型(以50ng/100|iL和100ng/100^L劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。與用安慰劑治療的傷口相比用50ng/100!iL劑量的瘢痕形成的減少是統(tǒng)計學上顯著的(pO.05)。Gly63-Pro突變型(以50ng/100|iL和100ng/100|iL劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。Glul2-Ser突變型(以50ng/100|iL和100ng/100^L劑量)與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，減少了瘢痕形成。與用安慰劑治療的傷口相比用50ng/100)aL劑量的瘢痕形成的減少是統(tǒng)計學上顯著的(p0.05)。雙絲氨酸突變型(Glul2-Ser和Arg52-Ser)以50ng/100(iL和100ng/100(iL劑量，與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比減少了瘢痕形成。3.6第70天切入性傷口的顯孩t鏡評估使用VAS評分系統(tǒng)記錄的肉眼效果用組織學分析來確認。組織切片代表性的例子在圖12和13中顯示。所述的組織顯微照片顯示本發(fā)明TGF-(33蛋白的加入引發(fā)了與"野生型"TGF-P3中所見到的相似的改善。本發(fā)明的蛋白誘導瘢痕中的膠原纖維具有與周圍正常皮膚相似的形態(tài)和組織。4.結(jié)論a螺旋(在氨基酸殘基58-67之間)的靈活性影響再折疊過程中有功能的、正確再折疊的二聚體TGF-(33的形成。通過用丙氨酸置換63位的甘氨酸來穩(wěn)固a螺旋極大改善再折疊效率，而用脯氨酸置換63位的甘氨酸來去穩(wěn)定a螺旋則有相反的效果。與'野生型，TGF-(33相比，用丙氨酸或脯氨酸置換63位的甘氨酸沒有改變傷口愈合。與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，Gly63-Ala和Gly63-Pro減少了瘢痕形成。'鹽橋，的形成(在Arg52和Glul2之間)沒有改變TGF-p3再折疊效率。與用安慰劑治療的和未治療的傷口相比，Glul2-Ser型和雙絲氨酸突變型減少了瘢痕形成。5.生產(chǎn)本發(fā)明單體或二聚體TGF-P3的優(yōu)選實驗方案產(chǎn)生本發(fā)明正確再折疊的單體TGF-(33的優(yōu)選條件如下0.7M2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)、2mM還原型谷胱甘肽、0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。30mM牛石黃脫氧膽酸鹽、0.7MCHES、2mMGSH、0.4mMGSSG、0.12mg/mLTGF-P3，pH9.5、2-8°C。1MNDSB-201、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF畫[33，pH9.5、2-8。C。0.7MCHES、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。30mM牛石黃脫氧膽酸鹽加上1MNDSB-221、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。30mM?；敲撗跄懰猁}加上0.7MCHES、2mM還原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2-8。C。30mM?；敲撗跄懰猁}、0.7MCHES、2mMGSH、2mMGSSG、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2-8。C?？傮w來講本發(fā)明的TGF-(33可通過一種方法折疊成二聚體生物活性形式，所述方法包括將溶解的、未折疊的單體TGF-(33加入到一種溶液中，所述溶液包含(i)2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)或其功能類似物；以及(ii)低分子量的巰基/二硫化物氧化還原系統(tǒng)；以及在所述溶液中孵育生長因子直到二聚體生物活性TGF-(33形成。產(chǎn)生本發(fā)明正確再折疊二聚體TGF-(33的優(yōu)選條件如下0.7M2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)、2mM還原型谷胱甘肽、(MmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2-8。C。30mM牛磺脫氧膽酸鹽、0.7MCHES、2mMGSH、0.4mMGSSG、0.12mg/mLTGF-卩3，pH9.5、2畫8。C。30mM牛石黃脫氧膽酸鹽、0.7MCHES、2mMGSH、2mMGSSG、0.12mg/mLTGF-(33，pH9.5、2-8。C。優(yōu)選的實驗M5.1載體克隆和宿主細胞轉(zhuǎn)化pET-24d載體來自pBR322載體，和包含一個LacUV5控制的T7啟動子和一個抗卡那霉素標記基因。編碼本發(fā)明TGF-P3的DNA可用0.75pL7Vcol(NewEnglandBiolabs)和0.75(iL5am//l(NewEnglandBiolabs)與1xBaw/fl纟爰沖液(NewEnglandBiolabs)在15pL反應液(NucleaseFreeWater,Novagen)中37。C消化4小時。1微升pET-24d質(zhì)粒(Novagen)用同樣的方法消化。消化的cDNA和大的質(zhì)粒片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并用SpinPrepGelDNA提取試劑盒(Novagen)回收。純化的cDNA和質(zhì)粒片段用T4連接酶試劑盒(Novagen)連接。連接的cDNA/質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進HMS174(DE3)(NovagenHMS174(DE3)轉(zhuǎn)化試劑盒)。轉(zhuǎn)化體通過在含有50嗎/mL卡那霉素(Invitrogen)的Luria肉湯(LB)瓊脂平板上涂布來選擇。選擇適合的克隆進行限制性消化和/或表達。5.2用于產(chǎn)物表達的克隆篩選將克隆在1/2濃度的"TerrificBroth"(6g/L植物蛋白胨(BectonDickinson)、12g/L酵母"t是耳又物(BectonDickinson)、2g/L的甘油(JTBaker)、1.16g/L磷酸二氫鉀(JTBaker)、6.25g/L磷酸氫二鉀(JTBaker),蒸餾水適量至1升)的搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)且在指數(shù)生長期OD,為0.65-0.85時用1mM的異丙基-P-D硫代吡喃半乳糖脊(IPTG)誘導。在加入IPTG3小時后取誘導后的樣品并用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析產(chǎn)物的誘導和表達。來自適合克隆的樣品在NuPAGENovex12%Bis-TrisGel,1.0mm(Invitrogen)中，于120毫安和200伏下跑膠約40-50分鐘，然后用考馬斯藍染色。由此，本發(fā)明的TGF-P3的表達在這些培養(yǎng)物中被誘導出來。5.3細胞凍存物將克隆在1/2濃度的TerrificBroth的搖瓶中生長到OD6oo約為1且通過加入甘油到20。/。(v/v)而以甘油儲存液的形式保存。1.2ml的肉湯等分至12x2ml的冷凍管(其含0.3mL的甘油)，然后在-70。C儲存。5.4TGF-卩3基因序列確認用于細胞凍存物的培養(yǎng)物樣品在加入甘油前獲得并被用于使用QiagenMiniPrepKit進行質(zhì)粒分離。對分離的質(zhì)粒進行測序，并用T7啟動子引物(5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，)和T7終止子引物(5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG畫3，)驗證。5.5種子培養(yǎng)物將選擇的合適克隆接種到2升封口的(baffled)Erlenmeyer燒瓶，該燒瓶含有500mLHySoy培養(yǎng)基(12g/L蛋白胨(QuestInternational)、24g/L酵母提取液(BectonDickinson)、10g/LNaCl(Sigma)和10g/L甘油(Sigma)及50嗎/mL卡那霉素。燒瓶37。C、200rpm振蕩溫育，周期性取樣測OD550。當培養(yǎng)物的OD達到3.21U/mL(7小時后)時，細胞肉湯用于接種150L發(fā)酵罐(100L工作體積)。5.6發(fā)酵900毫升的細胞肉湯(來自3.6部分)用于接種1S0L發(fā)酵罐(WHE),所述發(fā)酵罐含卯L分批培養(yǎng)基(0.6g/LK2HP04、0.4g/LKH2HP04、1.25g/LNH4S04、12g/L蛋白胨、24g/L酵母提取物和10g/L甘油)。發(fā)酵的運行參數(shù)控制如下溫度設(shè)定值37。C;pH設(shè)定值7.0(用4N的氫氧化銨和4N的磷酸維持)且溶解氧(DO)最初校準到100%。容器排出壓力為7psi，攪拌速度和空氣流速分別為200-400rpm和每分鐘每體積培養(yǎng)基1體積的空氣(vvm或slpm)。以下列優(yōu)先順序通過調(diào)節(jié)發(fā)酵設(shè)定的參數(shù)將DO保持于20%以上攪拌速度(最大400rpm)、通風量(最大1.5vvm)、吸氧量(最大33.3Ipm)和背壓(最大12psi)。用PluronicL-61(25%v/v)控制起泡沫。當培養(yǎng)物的OD到10U/mL時，以45mL/分鐘的起始流速補充甘油(50。/。v/v)。當OD值到40U/mL,加入IPTG至終濃度為0.2mM進行細胞誘導。5.7收集誘導后4小時，將發(fā)酵罐冷卻到10。C且氣流和攪拌速率分別降到0.3vvm和100rpm。結(jié)束對泡沫和pH的控制且背壓調(diào)整到3psi。通過用WestfaliaCSA8連續(xù)離心機在10°C連續(xù)離心收集培養(yǎng)物。離心機運行速度為15,000rpm,流速為每分鐘3升并收集細月包漿液。5.8細胞裂解和IB回收發(fā)酵細胞體(來自5.7部分)用裂解緩沖液(6.1g/LTrizmaBase(Tris)、3.7g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、58.44g/LNaCl和10g/LTritonX-100,pH8.0)以1:5比例稀釋，并用手提式勻漿器重懸。重懸的細胞體經(jīng)高壓勻漿器兩次(參數(shù)壓力10,000psig;流速450mL/分；溫度15°C)。然后將勻漿的細胞裂解液在5,000xg于4。C離心(桶式離心機，固定角轉(zhuǎn)頭)20分鐘。去掉上清液，留下不溶(包涵體)的TGF-P3。包涵體(IB)沉淀用手提式勻漿器在洗滌緩沖液(6.1g/LTris和3.72g/LEDTA,pH8.0)中重懸后離心(4。C,5,000xg20分鐘)。5.9包涵體溶解來自5.8部分的沉淀用溶解緩沖液(6.1g/LTris，15.4g/LDL-二硫蘇糖醇(DTT)和360.4g/L尿素，pH8.0)以l:10比例稀釋并用手提式勻漿器重懸。懸浮液加蓋并于室溫攪拌60-75分鐘以溶解包涵體并將TGF-P3還原為單體形式。在第二次溫育60-75分鐘時間之前，用NaOH/醋酸將重懸沉淀的pH調(diào)至pH9.4-9.6。5.10凈化/超濾和滲濾來自5.9部分的溶解的材料在切向流過濾(TFF)系統(tǒng)(Millipore)中被凈化、濃縮和滲濾。初期的凈化和濃縮用預處理的凈化TFF膜(MilliporePellicon1000kDa，再生纖維素，篩網(wǎng)V)完成。凈化的TGF-|33在透過液中收集。換到超濾/滲濾(UF/DF)膜(MilliporePellicon5kDa，再生纖維素，篩網(wǎng)C)，接著TGF-卩3在6置換體積(diavolume)溶解緩沖液(6.1g/LTris、15.4g/LDTT和360.4g/L尿素，pH9.5)中清洗。5.11超濾/疏7jC相互作用色鐠選擇的再折疊溶液用超濾(膜為平板微孔Pellicon5kDa,O.lm2，再生纖維素，篩網(wǎng))濃縮5倍。在稀釋緩沖液(2.72g/L醋酸鈉、264.28g/L硫酸銨、100g/L醋酸和210.7g/L鹽酸精氨酸，pH3.3)里1:1稀釋之前，濃縮的再折疊物質(zhì)的pH用冰醋酸調(diào)節(jié)到pH2.5-2.8。丁基瓊脂糖凝膠4快流速柱(Amersham,床高16cm)用四柱體積的緩沖液A(2.72g/L醋酸鈉、132.14g/L硫酸銨和100g/L醋酸，pH3.3)平衡。在以100cm/hr的流速(整個過程都用這個流速)加樣到丁基瓊脂糖凝膠柱之前，再折疊物質(zhì)經(jīng)0.22(iM膜(微孔Millipak過濾器)過濾。然后柱子用四柱體積的緩沖液A清洗。TGF-卩3蛋白用緩沖液B(2.72g/L醋酸鈉、100g/L醋酸和300g/L乙醇，pH3.3)洗脫離柱。在分離單體和二聚體蛋白之前，包含TGF-(33蛋白單體和二聚體形式的第一個峰被收集。序列信息TGF-卩3(序列ID號1)aldtnycfrnleenccvrplyidfrqdlgwkwvhepkgyyanfcsgpcpylrsadtthstvlgeynt!jNpeasaspccvpqd:lep:lt工;lyyvgrtpkveqijSnmwksckcs突變型TGF-卩3"Gly63-Ala"(序列ID號3)ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRGDLGWKWVHEPKGYYAISIFCSGPCPYLRSADTTHSTVL^LYNTLNPEASASPCCVPQDLEPI/riLYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCS突變型TGF-p3"Gly63-Pro"(序列ID號5)ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYIiRSADTTHSTVL^LYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLT工LYYVGRTPKVEQLSNMWKSCKCS突變型TGF-p3"Glul2-Ser"(序列ID號7)ALDT1S!YCFRNL呈E1SICCVRPLY工DFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGIjYISITLilSIPEASASPCCVPQDLEPIiTILYWGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS突變型TGF-卩3"Arg52-Ser"(序列ID號9)a:ldtnycfr肌eenccvrp]lyidfrqd]lgwkwvhepkgyyanfcsgpcpyl呈sadt突變型TGF-卩3"Glul2-Ser/Arg52-Ser"(序列ID號11)aldtnycfrnl旦enccvrp:lyidfrqdlgwkwvhepkgyymfcsgpcpy:l旦sadt序列ID號2-編碼野生型人類TGF-P3的DNAGCTTTGGACACCTACTGCTTCCGCTTGGAGGAGAACTGCTGTGTGCGCcccCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGC(XCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGAAGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號4-編碼Gly63-Ala突變型的DNAGCTTTGGACACCAATTACTGCTTCCGCAACTTGGAGGAGAACTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATIGACTTCCGACAGGMCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGSACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGCACTGTACAACACTCTGAACCCTGARGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號6-編碼Gly63-Pro突變型的DNAGCTTTGGACACCTGCTTCCGCAACTTGGAGGAGAACTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCMGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGCCACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCGCCTGACCATCCTGTAC窗GTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCTCTCCAACATGGTGGTGAAGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號8-編碼Glul2-Ser突變型的DNAGCTTTGGACACCAM1TACTGCTTCCGCAACTTGICGGAGAACTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號10-編碼Arg52-Ser突變型的DNAGCTTTGGACACCAATTACTGCTTCCGCAACTTGGAGGAGARCTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTARGGGCTACTM1GCCAACTTC一TCCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCAGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAAC'ACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGAAGTCTTGTAAATGTAGC序列ID號12-編碼Glul2-Ser/Arg52-Ser突變型的DNAGCTGACACCAATTACTGCTTCCGCAACTTGTCGGAGTGCTGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGGAAGTGGGTCCATGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCAGGCCCTTGCCCATACCTCAGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACGGTGCTGGGACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCGCCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTACTATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTGGTGTCTTGTAAATGTAGC表1基于蛋白和肽的實驗研究的a螺旋傾向性等級螺旋傾向性氨基酸(kcal/mol)Ala0.00Glu°0.16Leu0.21Met0.24Arg:0.21Lys+0.26Gin0.39Glu0.40He0.41Asp00.43Ser0.50Trp0.49Tyr0.53Phe0.54Val0.61Thr0.66His00.56His+0.66Cys0.68Asn0.65Asp-0.69Gly1.00Pro3.16表2<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表3野生型TGF-P3和本發(fā)明TGF-P3再折疊效率<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表4用細胞生長抑制測定評估野生型TGF-卩3和Gly63-Ala(一種本發(fā)明的TGF-P3蛋白)的生物活性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表5傷口部位治療<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表6傷口部位治療<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>權(quán)利要求1.TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-β3的氨基酸殘基58和67之間的α螺旋形成結(jié)構(gòu)域包括至少一個穩(wěn)固α螺旋的置換。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸殘基被穩(wěn)固a螺旋的氨基酸殘基替換。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的TGF-P3或其片段或衍生物，其中所述穩(wěn)固a螺旋的置換包括引入選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸和苯丙氨酸的殘基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-卩3的63位置上的甘氨酸殘基被丙氨酸替換。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TGF-p3，其包括序列ID號3或其片段或衍生物。6.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其不包括在全長的野生型TGF+3的61位置上纈氨酸殘基的置換。7.TGF-P3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-(33的63位置上的甘氨酸殘基被脯氨酸替換。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的TGF-(33,其包括序列ID號5或其片段或衍生物。9.TGF-J33或其片段或衍生物，其包括在全長的野生型TGF-P3的12位置上谷氨酸殘基的置換和/或在全長的野生型TGF-(33的52位置上精氨酸殘基的置換。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的TGF-P3或其片段或衍生物，其中所述的一個或多個置換是使用選自下述的氨基酸殘基絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸。11.根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的TGF-p3或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-|33的12位置上的谷氨酸殘基被絲氨酸置換。12.根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物，其中在全長的野生型TGF-P3的52位置上的精氨酸殘基被絲氨酸置換。13.TGF-卩3或其片段或衍生物，所述TGF-卩3選自序列ID號7、序列ID號9和序列ID號11。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的單體TGF-(33或其片段或衍生物。15.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的二聚體TGF-(33或其片段或書亍生物。16.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求所述的TGF-P3或TGF-(33的片段或TGF-[33的衍生物作為藥物的用途。17.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物在制備用于加速傷口愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的藥物中的用途。18.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物在制備用于促進上皮再生的藥物中的用途。19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的用途，其中所述藥物用于皮膚。20.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的用途，其中所述藥物用于眼。21.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物在制備用于預防和/或治療纖維化疾病的藥物中的用途。22.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中所述纖維化疾病選自肺纖維化、肝纖維化、硬皮病、皮膚纖維化、肌肉纖維化、放射性纖維化、腎臟纖維化、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和子宮纖維化。23.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物在制備用于治療血管生成病癥、再狹窄、粘連、子宮內(nèi)膜異位、缺血性疾病、口腔粘膜炎和腎病的藥物中的用途。24.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物在制備用于誘導骨和軟骨或體外受精的藥物中的用途。25.編碼權(quán)利要求1至15任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物的核酸。26.加速傷口愈合和/或預防、減少或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括向有相應需要的患者提供治療有效量的權(quán)利要求1至13任一項所述的TGF-(33或其片段或衍生物。27.預防和/或治療纖維化疾病的方法，所述方法包括向需要這種預防和/或治療的患者提供治療有效量的權(quán)利要求1至13任一項所述的TGF-P3或其片段或衍生物。28.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的TGF-(33或其片段或衍生物被提供至患者的皮膚。29.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的TGF-卩3或其片段或衍生物被提供至患者的眼。全文摘要本發(fā)明提供了TGF-β3或其片段或其衍生物，其中在全長野生型TGF-β3的氨基酸殘基(58)和(67)之間的α螺旋形成結(jié)構(gòu)域包括至少一個穩(wěn)固α螺旋的置換。本發(fā)明還提供了TGF-β3或其片段或其衍生物，其中在全長野生型TGF-β3的位置(63)上的甘氨酸殘基被脯氨酸替換。并且更進一步，本發(fā)明提供了TGF-β3或其片段或其衍生物，其包括在全長的野生型TGF-β3的位置(12)上谷氨酸殘基的置換和/或全長的野生型TGF-β3的位置(52)上精氨酸殘基的置換。本發(fā)明還提供了使用這種TGF-β3的藥物和治療方法。文檔編號C07K14/435GK101437846SQ200780016343公開日2009年5月20日申請日期2007年3月12日優(yōu)先權(quán)日2006年3月11日發(fā)明者修·杰勒德·萊弗蒂,尼克·奧克萊斯頓,沙倫·奧凱恩,愛瑪·阿特金森,菲利普·梅勒,馬克·威廉·詹姆斯·弗格森申請人:瑞諾弗有限責任公司