專利名稱：：腫瘤的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤類型的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及腫瘤的抑制物和診斷標(biāo)志物，以及它們用于癌癥和腫瘤生長(zhǎng)的診斷和治療的用途。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤(癌)是在美國(guó)位居心臟病之后的第二位致死原因(參見(jiàn)例如Boringda/.，C4Ca"ce/J43:7(1993))。癌的特征為衍生自正常組織的異?；蛸樕约?xì)胞的數(shù)目增加，所述細(xì)胞增殖形成腫瘤塊；這些贅生性肺瘤細(xì)胞侵入鄰近組織；及產(chǎn)生惡性細(xì)胞，所述惡性細(xì)胞最終經(jīng)血液或淋巴系統(tǒng)傳播至局部淋巴結(jié)并經(jīng)稱為轉(zhuǎn)移的過(guò)程傳播至遠(yuǎn)處。在癌性狀態(tài)，細(xì)胞在正常細(xì)胞不會(huì)生長(zhǎng)的條件下增殖。癌自身表現(xiàn)為極其多種形式，特征為不同程度的侵襲力和進(jìn)攻性。多種類型的療法已經(jīng)被用于治療癌癥。例如，使用手術(shù)方法來(lái)切除癌性的或死亡的組織。通過(guò)縮小實(shí)體瘤來(lái)起作用的放射療法和快速殺死正在分裂的細(xì)胞的化學(xué)療法被用作癌癥療法。此外，抗血管發(fā)生劑是一種有效的抗癌策略。這些療法也在增強(qiáng)，同時(shí)其它療法正在發(fā)展，例如免疫療法?，F(xiàn)在完全確立了血管發(fā)生(angiogenesis)牽涉多種病癥的發(fā)病機(jī)理。這些包括實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管疾病諸如增殖性視網(wǎng)膜病例如糖尿病性浮見(jiàn)網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Folkman"a/.，所o/.C/zem,267:10931-34(1992);Klagsb匿efa/.,j畫.iev.尸—'o/.53:217-39(1991);及GamerA.,"Vasculardiseases",于《PathobiologyofOcularDisease.ADynamicApproach》，GarnerA和KlintworthGK編，第2版，MarcelDekker,NY,1994，pp1625-1710。在腫瘤生長(zhǎng)的情況中，血管發(fā)生對(duì)于自增生至瘤形成的轉(zhuǎn)換，及為胂瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的。FolkmanefA^wre339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)讓腫瘤細(xì)胞獲得了與正常細(xì)胞相比的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和增殖自治。腫瘤通常開(kāi)始于單個(gè)異常細(xì)胞，由于與可利用毛細(xì)管床的距離，該細(xì)胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長(zhǎng)的一段時(shí)間里保持"休眠，，狀態(tài)而不進(jìn)一步生長(zhǎng)和傳播。有些腫瘤細(xì)胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細(xì)胞，所述內(nèi)皮細(xì)胞增殖并成熟成新的毛細(xì)血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，而且讓轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在胂瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性。Weidnerefa/.,iV.乂324:1-6(1991);Horak"a/.，丄a"ce"40:l120-24(1992);Macchiarini&a/.，丄a"c^340:145-46(1992)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的精確機(jī)制，但是認(rèn)為肺瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡。Folkman,淑她d1(1):27-31(1995)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為病理學(xué)狀況中血管發(fā)生的主要調(diào)節(jié)物的認(rèn)識(shí)已經(jīng)引起了許多嘗試來(lái)阻斷VEGF活性。VEGF是最好表征的和最強(qiáng)力的血管發(fā)生正調(diào)節(jié)物之一。參見(jiàn)例如Ferrara，N.&Kerbel,R.S.Andoge腦isasatherapeutictarget.A^fwre438:967-74(2005)。在作為血管發(fā)生和血管生成(vasculogenesis)中的血管發(fā)生因子之外，VEGF作為多效性生長(zhǎng)因子展現(xiàn)了在其它生理學(xué)過(guò)程中的多種生物學(xué)效應(yīng)，諸如內(nèi)皮細(xì)胞存活、血管通透性和血管舒張、單核細(xì)胞趨化性和釣流入。FerraraandDavis-Smyth，iev.18:4-25(1997)。此外，研究已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了VEGF對(duì)數(shù)種非內(nèi)皮細(xì)胞類型，諸如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、胰管細(xì)胞和施旺細(xì)胞的促有絲分裂效果。參見(jiàn)例如Guerrin&a/.，JCW/戶/^w'o/.164:385-394(1995);Oberg-Welsh"a/.,Mo/,CW/.五油cn."o/.126:125-132(1997);及Sondella/.,腸r固'.19:5731-5740(1999)。已經(jīng)有許多嘗試來(lái)阻斷VEGF活性。抑制性抗VEGF受體抗體、可溶性受體構(gòu)建物、反義策略、針對(duì)VEGF的RNA適體和低分子量VEGF受體酪氨酸激酶(RTK)抑制物都被提出用于干擾VEGF信號(hào)傳導(dǎo)。參見(jiàn)例如Siemeister"a/.,C朋cerMetoWa^iev.17:241-248(1998)?？筕EGF中和性抗體已經(jīng)顯示了在棵鼠中抑制多種人類腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)(Kim"a/.，TVafwre362:841-844(1993);Warren"a/.,JC//",/we"95:1789-1797(1995);Borgstr6m"a/.,C"艦rL56:4032-4039(1996);及Melnyk，C騰wM56:921-924(1996))，并且還在缺血性視網(wǎng)膜病癥的模型中抑制了眼內(nèi)血管發(fā)生。Adamisda/.,Ac/7.Qp/^/za/mo/.114:66-71(1996)。實(shí)際上，人源化抗VEGF抗體貝伐單4元(bevadzumab,AVASTIN,Genentech，SouthSanFrancisco,CA)已經(jīng)被USFDA批準(zhǔn)作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的第一線療法。參見(jiàn)例如Ferrara"a/.，脂,i>wgZXscove3:391-400(2004)。然而，治療性化合物干擾肺瘤生長(zhǎng)的長(zhǎng)期能力經(jīng)常受到藥物抗性的發(fā)生/發(fā)展的限制。已經(jīng)鑒定了和在功能上表征了針對(duì)多種細(xì)胞毒性化合物的抗性的數(shù)種機(jī)制，主要是在單細(xì)胞腫瘤模型中。參見(jiàn)例如Longley,D.B.&Johnston,RG.,Molecularmechanismsofdrugresistance.>//to/zo/205:275-92(2005)。此外，宿主基質(zhì)-腫瘤細(xì)胞相互作用可能牽涉藥物抗性表型?；|(zhì)細(xì)胞分泌多種促血管發(fā)生因子，而且不傾向于與腫瘤細(xì)胞相同的遺傳不穩(wěn)定性禾口在突變率方面的升高(Kerbel,R.S.，Inhibitionoftumorangiogenesisasastrategytocircumventacquiredresistanc6toanti-cancertherapeuticagents.S/oawa"13:31-6(1991)。纟宗述見(jiàn)Ferrara&Kerbel及Hazlehursta/.于Ferrara，N.&Kerbel，R.S.，Angiogenesisasatherapeutictarget.Atowre438:967-74(2005);及Hazlehurst,L.A.，Landowski,T.H,&Dalton，W.S.，Roleofthetumormicroenvironmentinmediatingdenovoresistancetodrugsandphysiologicalmediatorsofcelldeath.O"coge"e22:7396-402(2003)。在臨床前模型中，利用人源化單克隆抗體貝伐單抗(bevacizumab，AVASTIN,Genentech，SouthSanFrancisco,CA)或貝伐單抗的鼠前體(A4.6.1;產(chǎn)生A4.6.1的雜交瘤細(xì)胞系于91年3月29日保藏，ATCCHB-10709)阻斷VEGF信號(hào)傳導(dǎo)在所測(cè)試的大多數(shù)異種移植物模型中顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)并降低腫瘤血管發(fā)生(綜述見(jiàn)Gerber&Ferrara于Gerber，H.P.&Ferrara，N.，Pharmacologyandpharmacodynamicsofbevadzumabasmonotherapyorincombinationwithcytotoxictherapyinpreclinicalstudies.Ca"ceri^&s65:671-80(2005))。當(dāng)在腫瘤生長(zhǎng)早期階段開(kāi)始治療時(shí)，單一藥劑抗VEGF治療的藥理學(xué)效果是最顯著的。如果治療延遲到腫瘤很好地建立，那么抑制效果一般是短暫的，而且紳瘤最終發(fā)生/發(fā)展出抗性。參見(jiàn)例如Klement,G."/.，Differencesintherapeuticindexesofcombinationmetronomicchemotherapyandananti-VEGFR-2antibodyinmultidrug-resistanthumanbreastcancerxenografts.C//"C朋cwi^s8:221-32(2002)。作為針對(duì)抗VEGF治療的此類抗性的基礎(chǔ)的細(xì)胞和分子事件是復(fù)雜的。參見(jiàn)例如Casanovas,O.,Hicklin，D丄，Bergers,G.&Hanahan,D.,DrugresistancebyevasionofantiangiogenictargetingofVEGFsignalinginlate-stagepancreaticislettumors.CW/8:299-309(2005);及Kerbel,R.S.,Possiblemechanismsofacquiredresistancetoanti-angiogenicdrugs:implicationsfortheuseofcombinationtherapyapproaches.Ca"cerA/etoWaw》Tev20:79-86(2001)?？赡軤可娑喾N因子。例如，與輩巴向VEGF和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)信號(hào)傳導(dǎo)的化合物的組合治療在胰島癌發(fā)生的成因模型中改善了效力且延遲了晚期階段腫瘤中抗性的發(fā)作。參見(jiàn)Casanovas,O.,Hicklin，D丄，Bergers,G.&Hanahan,D.，DrugresistancebyevasionofantiangiogenictargetingofVEGFsignalinginlate-stagepancreaticislettumors.Ce//8:299-309(2005)。其他研究人員已經(jīng)鑒定了腫瘤浸潤(rùn)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞作為可選擇的促血管發(fā)生因子的有力來(lái)源。參見(jiàn)例如Dong,J.a/.，VEGF-nullcellsrequirePDGFRalphasignaling-mediatedstromalfibroblastrecruitmentfortumorigenesis.￡m6oJ23:2800-10(2004);及Orimo，A.,StromalfibroblastspresentininvasivehumanbreastcarcinomaspromotetumorgrowthandangiogenesisthroughelevatedSDF-1/CXCL12secretion.CW/121:335-48(2005)。炎性細(xì)胞可通過(guò)分泌炎性細(xì)胞因子參與血管發(fā)生，所述炎性細(xì)胞因子可影響內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移和存活(綜述見(jiàn)Albinia/.及Balkwi11"a/.于Albini,A.,Tosetti,F.，Benelli,R.&Noonan,D.M.,Tumorinflammatoryangiogenesisanditschemoprevention.Ga"cer65:10637-41(2005);及Balkwill,F.,Charles,K.A.&Mantovani,A.,Smolderingandpolarizedinflammationintheinitiationandpromotionofmalignantdisease.Ca"cerCe〃7:211-7(2005)。數(shù)種肺瘤浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞分泌促血管發(fā)生因子，包括單核細(xì)月包/巨p藍(lán)細(xì)月包(參見(jiàn)傘'H口DePalma,M.da/.,Tie2identifiesahematopoieticlineageofproangiogenicmonocytesrequiredfortumorvesselformationandamesenchymalpopulationofpericyteprogenitors.Ga"cerCe〃8:211-26(2005);及Yang,L.a/.，ExpansionofmyeloidimmunesuppressorGr+CDllb+cellsintumor-bearinghostdirectlypromotestumorangiogenesis.Co"cerCe〃6:409-21(2004))、T和B淋巴細(xì)胞(參見(jiàn)例如Freeman，M.R.effl/,,PeripheralbloodTlymphocytesandlymphocytesinfiltratinghumancancersexpressvascularendothelialgrowthfactor:apotentialroleforTcellsinangiogenesis.Qmcer55:4140-5(1995))、血管的白細(xì)胞(參見(jiàn)例如Conejo-Garcia,J.R."a/.,Vascularleukocytescontributetotumorvascularization,^/ood105:679-81(2005))、樹(shù)突纟田月包(參見(jiàn)例如Conejo-Garcia,J.R.a/.,Tumor-infiltratingdendriticcellprecursorsrecruitedbyabeta-defensincontributetovasculogenesisundertheinfluenceofVegf-A.10:950-8(2004))、嗜中性細(xì)胞(參見(jiàn)例如Coussens,L.M,Tinkle,C.L.,Hanahan,D.&Werb,Z.，MMP-9suppliedbybonemarrow-derivedcellscontributestoskincarcinogenesis.Ce〃103:481-90(2000))、及月巴大細(xì)月包(參見(jiàn)例3口Coussens,L.M.a/.,Inflammatorymastcellsup-regulateangiogenesisduringsquamousepithelialcarcinogenesis.C7e"esDev13:382-97(1999);及綜述見(jiàn)deVisserandCoussens于deVisser,K.E.,Eichten,A.&Coussens,L.M.,Paradoxicalrolesoftheimmunesystemduringcancerdevelopment.胸ievC朋cer6:24-37(2006))。有提出骨髓衍生的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)(參見(jiàn)i"列^口Lyden,D,e"/.，Impairedrecruitmentofbone-marrow-derivedendothelialandhematopoieticprecursorcellsblockstumorangiogenesisandgrowth.淑Afed7:1194-201(2001))和血管周的祖細(xì)胞(參見(jiàn)例如Song,S.,Ewald,A丄，Stallcup,W.,Werb,Z.&Bergers，G，PDGFRbeta+perivascularprogenitorcellsintumoursregulatepericytedifferentiationandvascularsurvival.AtoCe〃5/o/7:870-9(2005))在胂瘤生長(zhǎng)的有些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭写龠M(jìn)血管發(fā)生(綜述見(jiàn)Rafiida/.于Rafii,S.，Lyden,D.,Benezra,R.，Hattori,K.&Heissig,B.,Vascularandhaematopoieticstemcells:noveltargetsforanti-angiogenesistherapyAtoievCa"cer2:826-35(2002))。髓樣譜系造血細(xì)胞，包括腫瘤相關(guān)巨p藍(lán)細(xì)胞(TAM),顯示了直接地通過(guò)分泌血管發(fā)生因子或間接地通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白酶、繼而釋放被隔離的血管發(fā)生因子來(lái)刺激血管生成(綜述見(jiàn)Lewis,C.E.&Pollard，J.W.，Distinctroleofmacrophagesindifferenttumormicroenvironments.Ca"cer/esearc/z66:605-612(2006);及Naldini,A.&Carraro,F.，Roleofinflammatorymediatorsinangiogenesis.Cw/r￡)rwgTbrg她/"yfe"徹j〃w^4:3-8(2005))。在髓樣細(xì)胞譜系中，分離自攜瘤小鼠脾臟的CDllb+Grl+祖細(xì)胞在與肺瘤細(xì)胞共注射時(shí)促進(jìn)血管發(fā)生(參見(jiàn)例如Yang,L.g,,ExpansionofmyeloidimmunesuppressorGr+CDllb+cellsintumor-bearinghostdirectlypromotestumorangiogenesis.Ca"cerCW/6:409-21(2004)),而且腫瘤浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞數(shù)目與有些人類腫瘤中的不良預(yù)后有關(guān)(綜述見(jiàn)Balkwillda/.于Balkwill,R,Charles,K.A.&Mantovani,A.,Smolderingandpolarizedinflammationintheinitiationandpromotionofmalignantdisease.Ca"cerCe〃7:211-7(2005))。然而，在另一項(xiàng)研究中，巨喧細(xì)胞抑制了小鼠中實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的生長(zhǎng)，表明它們作為抗癌療法的潛力。參見(jiàn)例如Kohchi，C.a/.，Utilizationofmacrophagesinanticancertherapy:themacrophagenetworktheory.勘f/ca"cer24:3311-20(2004)。盡管髓樣細(xì)胞的相對(duì)豐度和它們產(chǎn)生前血管生成因子的潛力，它們?cè)卺槍?duì)抗VEGF治療的腫瘤抗性中的作用仍然是未知的。需要發(fā)現(xiàn)并了解髓樣細(xì)胞的生物學(xué)功能、抗性肺瘤、及它們產(chǎn)生的因子。本發(fā)明解決了這些和其它需要，在閱讀以下公開(kāi)內(nèi)容后將變得顯而易見(jiàn)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于診斷和治療抗性腫瘤的方法和組合物。進(jìn)一步的，提供了使用組合治療來(lái)治療抗性胂瘤的方法。例如，一種方法包括向具有抗性腫瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的第二藥劑，其中所述第二藥劑包含髓樣細(xì)胞減少劑。所述髓樣細(xì)胞減少劑能降低或完全消融髓樣細(xì)胞，例如CDllb+Grl+髓樣細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，髓樣細(xì)胞減少劑包括但不限于例如Grl拮抗劑、CDllb拮抗劑、CD18拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-1拮抗劑、MIP-la拮抗劑、氯膦酸鹽等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述拮抗劑是抗體。本發(fā)明還提供了用于診斷抗性腫瘤的方法和用于診斷抗性腫瘤的標(biāo)志物集。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，一種方法包括診斷受試者中的抗性肺瘤，所述方法包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的肺瘤或所述受試者的血液的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中CDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目或百分比；與參考細(xì)胞群體(例如，來(lái)自抗VEGF敏感性腫瘤的細(xì)胞群體)中CD11b+Gr1+細(xì)胞的數(shù)目或百分比比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD11b+Gr1+細(xì)胞的數(shù)目或百分比；并，檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比在所述測(cè)試細(xì)胞群體中CDllb+Grl+的數(shù)目或百分比的增加，其中CDllb+Grl+的數(shù)目或百分比增加表明所述腫瘤是抗性胂瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)量所述受試者的脾臟大小，并與參考脾臟大小(例如，當(dāng)所述受試者沒(méi)有腫瘤時(shí)或當(dāng)所述受試者對(duì)VEGF拮抗劑治療敏感時(shí)所述受試者的脾臟大小、或?qū)EGF拮抗劑治療敏感的其他人的脾臟大小的數(shù)據(jù)庫(kù))比較所述受試者的脾臟大小，其中脾臟大小增大表明所述腫瘤是抗性肺瘤。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)量所述受試者施用VEGF拮抗劑之后所述受試者中腫瘤的血管表面積(VSA)的數(shù)目或百分比，與參考血管表面積(例如，來(lái)自抗VEGF敏感性腫瘤的血管表面積)比較所述受試者中腫瘤的血管表面積的數(shù)目或百分比，其中腫瘤的血管表面積的數(shù)目或百分比增加表明所述腫瘤是抗性腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述拮抗劑是抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法包括診斷受試者中的抗性腫瘤，所述方法包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的腫瘤的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；與參考細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；并，檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比在所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比的降低，其中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性腫瘤。在又一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法包括診斷受試者中的抗性腫瘤，所述方法包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的骨髓的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD90T-淋巴樣纟田月包、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CD11c樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；與參考細(xì)胞群體中CD90T-淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD90T-、淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；并，檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比在所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD90T-淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比的降低，其中CD90T-淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性腫瘤。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法包括用組合治療來(lái)治療受試者中的抗性腫瘤，所述方法包括向具有抗性腫瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的髓樣細(xì)胞減少劑和有效量的第三藥劑，其中所述第三藥劑是化療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述拮抗劑是抗體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，髓樣細(xì)胞減少劑包括但不限于例如Grl拮抗劑、CDllb拮抗劑、CD18拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-1拮抗劑、MIP-la拮抗劑、氯膦酸鹽等。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述化療劑是5FU、吉西他濱或在本文中列出的化療劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的腫瘤的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中分子的表達(dá)、水平或活性；與參考細(xì)胞群體中所述分子的表達(dá)和/或活性比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中所述分子的表達(dá)、水平或活性；并，檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體(例如，來(lái)自抗VEGF治療敏感性腫瘤的細(xì)胞群體)相比在所述測(cè)試細(xì)胞群體中所述分子的表達(dá)和/或活性的改變，其中所述分子是編碼蛋白質(zhì)的核酸或由所述核酸編碼的蛋白質(zhì)，從而診斷或確定所述受試者中的抗性胂瘤。在某些實(shí)施方案中，具有改變的表達(dá)和/或活性的蛋白質(zhì)包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。在表達(dá)和/或活性方面的改變可以是一種或多種蛋白質(zhì)、兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、或所有的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述分子的表達(dá)^Ui調(diào)，所述蛋白質(zhì)包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、MSCA、MIP2、IL-8R和G-CSF。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述分子的表達(dá)被下調(diào)，所述蛋白質(zhì)包括但不限于例如THBS1、Crea7、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。如上所述，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，一種方法包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的腫瘤或所述受試者的血液的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中CDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目或百分比；與參考細(xì)胞群體(例如，來(lái)自抗VEGF敏感性肺瘤的細(xì)胞群體)中CDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目或百分比比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中CDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目或百分比；并，；險(xiǎn)測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比在所述測(cè)試細(xì)胞群體中CDllb+Grl+的數(shù)目或百分比的增加，其中CDllb+Grl+的數(shù)目或百分比增加表明所述肺瘤是抗性腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比在所述測(cè)試細(xì)胞群體中分子的表達(dá)或活性的改變，其中所述分子是編碼蛋白質(zhì)的核酸或所述蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBSl和Crea7。在某些實(shí)施方案中，一種或多種、兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、或所有的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性方面存在改變。本發(fā)明還提供了標(biāo)志物集合來(lái)鑒定抗性腫瘤。例如，標(biāo)志物集合可以包括兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、或整個(gè)種集合的分子。所述分子是編碼蛋白質(zhì)的核酸或是蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有改變的表達(dá)和/或活性的且選自IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子衍生自CDllb+Grl+細(xì)胞，且包括例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBSl和Crea7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子衍生自抗性腫瘤，且包括例如MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。附圖簡(jiǎn)述附圖1畫面a-f說(shuō)明了同基因的腫瘤細(xì)胞系針對(duì)抗VEGF治療的抗性與它們募集BMMNC的潛力有關(guān)。(a)異種移植的LLC、EL4和B16F1腫瘤在用抗VEGF抗體G6-23或?qū)φ湛贵w(抗豚草)治療的C57BL/6，GFP骨髓嵌合小鼠(n=5)中的生長(zhǎng)曲線。在第二天，通過(guò)IOmg/kg的對(duì)照抗體、G-23的腹膜內(nèi)(IP)施用來(lái)開(kāi)始治療，每周兩次。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。(b)EL4腫瘤在用對(duì)照(10和50mg/kg,IP,每周兩次)或G6-23(10和50mg/kg，IP，每周兩次)治療的米色凈果XID小鼠(n=10)中的生長(zhǎng)。治療在腫瘤細(xì)胞植入之后第l天開(kāi)始。統(tǒng)計(jì)分析使用ANOVA禾呈序來(lái)"^M古，*p《0.05，**p<0.005。(c)LCC月中瘤(n=10)在^口(b)所描述的米色棵XID小鼠中的生長(zhǎng)，分別每周兩次地IP施用G6-23(10和IOOmg/kg)和對(duì)照(100mg/kg)。(d)治療14天的B16F1、EL4和LLC月中瘤細(xì)胞懸浮液(11=4)的FACS分析。在抗VEGF治療的EL4和LLC腫瘤中鑒定出相對(duì)于B16F1腫瘤的提高的GFP+BMMNC數(shù)目。(e)在用對(duì)照或抗VEGF抗體治療14天的EL4、LLC和B16F1肺瘤切片中CD31+和GFP+細(xì)胞的免疫熒光染色。與EL4和LCC腫瘤相比，鑒定出在B16Fl腫瘤的基質(zhì)中GFP+細(xì)胞的降低的存在和CD31+血管的數(shù)量的顯著降低。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的每個(gè)組的一個(gè)代表性切片。(f)在治療14天的腫瘤異種移植物中血管表面積(VSA)的定量?？筕EGF治療的B16F1腫瘤與LLC或EL4肺瘤相比顯示了血管表面積的更顯著的降低。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)治療組中3到5個(gè)腫瘤的9到15個(gè)切片的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。附圖2畫面a-d說(shuō)明了肺瘤混合實(shí)驗(yàn)和與分離自GFP嵌合小鼠的骨髓和肺瘤的GFP+混合的B16F1肺瘤的生長(zhǎng)曲線。(a)當(dāng)與分離自帶有EL4、LLC或B16F1腫瘤的小鼠的1(^個(gè)BMMNC混合并用對(duì)照抗體處理時(shí)，2.5x106個(gè)B16F1腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。作為對(duì)照，顯示了來(lái)自用matrigel植入的小鼠或?qū)φ招∈蟮腂MMNC。(n=5)(b)與分離自帶有EL4、LLC或B16F1肺瘤的小鼠并用抗￥￡0抗體處理的0+BMMNC混合的B16F1腫瘤的肺瘤生長(zhǎng)曲線。EL4和LLC腫瘤衍生的GFP+骨髓細(xì)胞顯著地提高了抗VEGF敏感性B16F1腫瘤的生長(zhǎng)(n=4)。(a)和(b)中顯示的數(shù)據(jù)來(lái)自至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表。(c和d)當(dāng)與分離自用對(duì)照抗體(c)或抗VEGFG6-23(d)處理的14天齡、EL4、LLC或B16F1腫瘤的5x1()5個(gè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞混合時(shí)，2x106個(gè)B16F1腫瘤的生長(zhǎng)。附圖3畫面a-f說(shuō)明了在體外的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)的腫瘤和骨髓中CD1lb、Grl細(xì)胞的頻率分析和它們?cè)诮閷?dǎo)針對(duì)抗VEGF的抗性方面的功能作用。分離自帶有EL4和LLC腫瘤的小鼠的CDllb+Grl+細(xì)胞是介導(dǎo)針對(duì)抗VEGF治療的抗性的主要BM細(xì)胞群體。(a)在暴露于來(lái)自對(duì)照或抗VEGF治療的EL4、LLC或B16F1腫瘤的條件化培養(yǎng)基之后，來(lái)自新鮮分離的BMMNC的遷移CDllb+Grl+陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。兩種抗VEGF抗性腫瘤(EL4、LLC)都誘導(dǎo)了獨(dú)立于VEGF的遷移。(b)來(lái)自植入有EL4、LLC和B16F1月中瘤、并用對(duì)照或抗VEGF治療的小鼠的肺瘤分離物的多譜系分析。EL4和LLC，而不是B16F1腫瘤，顯示了CDllb+Grl+細(xì)胞的顯著增力。。顯示的數(shù)據(jù)來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表。(c)來(lái)自植入有EL4、LLC和B16F1腫瘤的小鼠的腫瘤和骨髓分離物的多語(yǔ)系分析。與腫瘤分離物相反(附圖3b),在攜瘤小鼠的骨髓中沒(méi)有CDllb+或Grl+細(xì)胞的一致提高。顯示的數(shù)據(jù)來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表。(d)與EL4和LLC致敏的、骨髓衍生的CDllb+Grl+細(xì)胞混合的、并用抗VEGF(G6-23,每組『5)處理的B16F1腫瘤的生長(zhǎng)曲線。CDllb+Grl+細(xì)胞是介導(dǎo)抗性所必需的且足夠的，因?yàn)橄麥p了CDllb+Grl+細(xì)胞的BMMNC顯示了介導(dǎo)抗性的降低的潛力。顯示的數(shù)據(jù)來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表。(e和f)與分離自帶有EL4(e)和LLC(f)腫瘤的小鼠的CDllb+GrH細(xì)胞相關(guān)的肺瘤混合的B16F1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。大約地，從帶有EL4或LLC腫瘤的小鼠分離了3x1()5個(gè)FACS分選的CDllb+Grl+細(xì)胞，與3x106個(gè)B16Fl細(xì)胞混合并植入C57BL/6小鼠(n=5)中。附圖4畫面a-d說(shuō)明了骨髓細(xì)胞和肺瘤分離物的基因表達(dá)分析。(a)分離自小鼠骨髓的CDllb+Grl+細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的無(wú)監(jiān)督聚類分析(unsupervisedclusteranalysis),所述小鼠植入有抗VEGF抗性的EL4(ER1-3)、LLC(LR1-3)或抗VEGF敏感性B16F1胂瘤(BR1-3),并用抗VEGF治療。對(duì)于分級(jí)聚類(hierarchicalclustering)方法，數(shù)據(jù)針對(duì)對(duì)照matrigel植入的'J、鼠來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。顯示了下調(diào)的、不變的和上調(diào)的基因。可以鑒定出抗VEGF抗性腫瘤誘導(dǎo)的改變的特征集合，其不同于抗VEGF敏感性腫瘤所誘導(dǎo)的。(b)可能牽涉血管發(fā)生或髓樣細(xì)胞分化和遷移的調(diào)節(jié)、在用抗VEGF處理17天的抗VEGF抗性和敏感性腫瘤之間，在骨髓CDllb+Grl+細(xì)胞中表達(dá)水平顯著改變的(p=0.05,>2倍)基因的展示。(c)從分離自G6-23處理17天后的EL4、LLC和B16F1腫瘤的RNA產(chǎn)生的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的無(wú)監(jiān)督聚類分析。(d)潛在牽涉血管發(fā)生和/或髓樣細(xì)胞分化和遷移的調(diào)節(jié)、在用G6-23處理17天之后，相對(duì)于B16F1肺瘤(BR1-3)在兩種抗VEGF抗性腫瘤(EL4-ER1-3，LLC=LRl-3)中表達(dá)水平顯著改變(p《0.05,倍數(shù)變化>2)的基因的展示。附圖5畫面a-f說(shuō)明了組合抗VEGF與靶向Grl+髓樣細(xì)胞的抗體(抗Grl)對(duì)EL4和LLC腫瘤生長(zhǎng)的影響。(a)單獨(dú)地或組合地(抗VEGF+抗Grl;組合)用抗VEGF(n=5)或抗Grl(n=4)處理的EL4腫瘤的生長(zhǎng)曲線。這些組中動(dòng)物的數(shù)目是3-4只。(b)如(a)中描述的治療17天的EL4腫瘤的通過(guò)IHC的血管表面積(VSA)、通過(guò)FACS的外周部和腫瘤中的Grl+細(xì)胞及CD31+內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的頻率、以及末期腫瘤重量的定量。與循環(huán)的Grl細(xì)胞中幾乎完全降低相反，在抗Grl治療的小鼠的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了2-3倍的降低。在使用單獨(dú)的和與抗GrlMAb組合的抗VEGF治療的EL4腫瘤之間，鑒定出末期腫瘤重量方面的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。數(shù)據(jù)是來(lái)自至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表的平均值土SEM。(c)用單獨(dú)的或組合(n=4)的抗VEGF(n=5)或抗Grl(n=4)處理的LLC肺瘤的生長(zhǎng)曲線。(d)所治療的動(dòng)物中通過(guò)IHC的血管表面積(VSA)、通過(guò)FACS的外周部中的Grl+細(xì)胞和腫瘤中的Grl+和CD31+內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的頻率、以及腫瘤重量的定量。在使用單獨(dú)的和與抗GRl組合的抗VEGF治療的LLC腫瘤(c)之間，肺瘤體積和VSA存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。數(shù)據(jù)是來(lái)自至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表的平均值士SEM。(e&f)與抗VEGF治療組合的彈性蛋白酶抑制劑延遲了EL4(e)和LLC(f)腫瘤的腫瘤抗性。與抗VEGF群組相比，組合治療中的腫瘤體積顯著更小。附圖5所示數(shù)據(jù)是來(lái)自至少兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)ANOVA評(píng)估統(tǒng)計(jì)分析，*表明卩《0.05。附圖6畫面a-b說(shuō)明了用于調(diào)查BMMNC在針對(duì)抗VEGF治療有抗性的腫瘤中的作用的實(shí)驗(yàn)策略以及從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤或骨髓分離GFP+細(xì)胞。畫面a示意性地說(shuō)明了調(diào)查BMMNC在針對(duì)抗VEGF治療有抗性的腫瘤中的作用的實(shí)驗(yàn)策略。為了監(jiān)測(cè)異種移植物研究中BMMNC募集的動(dòng)力學(xué)，將GFP+BMMNCIV注射入經(jīng)致死照射的C57Bl/6小鼠(al.)。接著，通過(guò)植入matrigel中的敏感性(B16F1)和抗性(EL4和LLC)腫瘤來(lái)使嵌合小鼠致敏(all.)。自嵌合小鼠的骨髓(aIII.)和腫瘤(aIV.)分離GFP+細(xì)胞，與B16F1細(xì)胞混合并注射(SC)入C57BL/6小鼠。將植入有腫瘤的動(dòng)物用抗VEGF或?qū)φ湛贵w(aV.)治療以確定BMMNC在介導(dǎo)腫瘤針對(duì)抗VEGF治療的抗性中的作用。畫面b說(shuō)明了從接受了植入的小鼠的腫瘤和骨髓中分離GFP+細(xì)月包。使用FACS分選，自接受了植入的小鼠的腫瘤和骨髓分離GFP+細(xì)胞(策略的步驟all.)(bl.)。使用分選后分析(bll.)來(lái)測(cè)定從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤或骨髓分離的GFP+細(xì)刀包的純度。附圖7說(shuō)明了從植入有EL4和LLC腫瘤的小鼠的骨髓中純化CD1lbGrl。從植入有EL4或LLC細(xì)胞的C57BL/6小鼠分離BMMNC。將BMMNC與抗CD11b偶聯(lián)的珠子一起溫育，并穿過(guò)大規(guī)模磁柱來(lái)分離CD11b+和CD11b-級(jí)分。將來(lái)自每個(gè)級(jí)分的細(xì)胞以及未分選細(xì)胞的等分試樣用CDllb和Grl熒光染料偶聯(lián)的抗體染色，來(lái)測(cè)定細(xì)胞的純度。附圖8說(shuō)明了針對(duì)抗VEGF治療有抗性的小鼠淋巴瘤腫瘤溶胞物的洗脫序型，所述溶胞物用抗VEGF抗體(G6-31)處理并加載到HiTrapHS柱上。所述柱用漸增的鹽濃度以分步方式洗脫。附圖9說(shuō)明了在尾靜脈中接受一劑以下各項(xiàng)之后72小時(shí)，小鼠中EL4腫瘤大小的改變1)PBS脂質(zhì)體/豚草，2)PBS脂質(zhì)體/G6-31;3)氯膦酸鹽脂質(zhì)體/G6-23,4)氯膦酸鹽脂質(zhì)體/G6-31，或5)氯膦酸鹽脂質(zhì)體/PBS。附圖IO說(shuō)明了當(dāng)氯膦酸鹽脂質(zhì)體與抗VEGF(G6-23)組合施用給小鼠時(shí)，在具有針對(duì)抗VEGF治療有抗性的腫瘤的小鼠中VEGFmRNA表達(dá)的降低。附圖ll說(shuō)明了在用氯膦酸鹽脂質(zhì)體和抗VEGF(G6-23)治療的、具有針對(duì)抗VEGF治療有抗性的肺瘤的小鼠中KC水平的降低。附圖12畫面A和B說(shuō)明了MIP-la(畫面A)和MCP-1(畫面B)二者在針對(duì)抗VEGF治療有抗性的肺瘤細(xì)胞系中表達(dá)，其中Dil(+)是內(nèi)皮細(xì)胞，CD3(+)代表淋巴樣細(xì)胞，F(xiàn)4/80(+)代表巨噬細(xì)胞。附圖13畫面A和B說(shuō)明了MIP-1a和MCP-1在血管發(fā)生性出芽和毛細(xì)管管腔形成測(cè)定法中具有血管發(fā)生活性。畫面A說(shuō)明了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)照，其中珠子用VEGF和D551處理10天。畫面B說(shuō)明了用D551(陰性對(duì)照)(左上)、VEGF(陰性對(duì)照)(右上)、1.25jag/mlMCP-1和D551(左下)、和1.25ng/mlMIP-la和D551(右下)處理的內(nèi)皮細(xì)胞。附圖14說(shuō)明了來(lái)自用對(duì)照或抗VEGF抗體G6-23治療第7天(pl)和第14天(p2)的攜瘤小鼠(B16F1(a)、EL4(b)和LL2(c))的BMNNC的i普系分析。插圖代表對(duì)CDllb門選的細(xì)胞?？筕EGF治療提高了CDllb+和Grl+細(xì)胞的水平，但是所分析的其它細(xì)胞類型沒(méi)有提高。在第7天和第14天之間提高的細(xì)胞類型是CXCR4+、CDllb+、CD31+和CDllb+、CD31+細(xì)胞。與之相反，發(fā)現(xiàn)在第7和14天之間LL2和EL4而不是B16F1腫瘤中CD19+(B淋巴細(xì)胞)和CD90十(T淋巴細(xì)胞)細(xì)胞降低了。附圖15說(shuō)明了攜帶抗性和敏感性腫瘤的小鼠中腫瘤和BM中GFP+細(xì)胞的多譜系分析。給C57B1/6小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC月中瘤，并用抗VEGF或?qū)φ湛贵w治療，如所描述的。從每個(gè)小鼠收獲BMMNC和胂瘤分離物，用針對(duì)CD19(B淋巴樣)、CD90(T淋巴樣)、CDllc(樹(shù)突細(xì)胞)以及VEGF受體(R1和R2)的抗體染色。圖表呈現(xiàn)了腫瘤U)和骨髓(b)隔室中每種子集的頻率。附圖16。脾臟是攜帶抗性腫瘤的小鼠中CD1lb+Gr1+細(xì)胞的可選歸巢位點(diǎn)。給C57Bl/6-GFP嵌合小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤，并用抗VEGF或?qū)φ湛贵w治療17天，如所描述的。U)攜瘤動(dòng)物的分析揭示了在攜帶抗性腫瘤的小鼠中脾臟大小有顯著(p<0.05)增大。(b)使用機(jī)械破碎從每個(gè)小鼠收獲脾細(xì)胞，用裂解緩沖液處理來(lái)除去紅細(xì)胞。然后將脾臟細(xì)胞用抗CDllb和抗Grl抗體染色，在FACS儀器中分析來(lái)調(diào)查CDllb+Grl+細(xì)胞的頻率。數(shù)據(jù)分析表明攜帶抗性胂瘤的小鼠的脾臟中CD1lb+Grl+細(xì)胞的頻率與敏感性腫瘤相比有顯著提高(p《0.05)。華表明用抗VEGF治療的攜帶EL4腫瘤的小鼠與相應(yīng)的B16F1和TIB6處理動(dòng)物相比的差異是顯著的(p《0.05)。+表明用抗VEGF治療的攜帶LLC腫瘤的小鼠與B16F1和TIB6處理動(dòng)物相比有顯著差異(p<0.05)。附圖17說(shuō)明了(a)只有從用抗性肺瘤致敏的小鼠分離的髓樣細(xì)胞能夠介導(dǎo)針對(duì)抗VEGF的抗性。圖表呈現(xiàn)了與用B16Fl或matrigd致敏的骨髓衍生的CDllb+Grl+細(xì)胞混合、并用抗VEGF治療的B16F1肺瘤的生長(zhǎng)曲線(每組n=5)。如所描述的測(cè)量腫瘤體積達(dá)21天。("血管發(fā)生的誘導(dǎo)是001化+01"1+細(xì)胞發(fā)生針對(duì)抗VEGF治療的抗性的一種機(jī)制。在帶有B16Fl和CDllb+Grl十或CDllb-Grl-細(xì)胞的混合物的小鼠中分析了VSA^表明在比較B16Fl與來(lái)自EL4或LLC致敏的小鼠的CD1lb+Grl+細(xì)胞的混合物和/人同樣致敏的動(dòng)物分離的CDllb-Grl-細(xì)胞的B16F1混合物時(shí)有顯著差異(p《0.05)。附圖18說(shuō)明了不同機(jī)制控制針對(duì)抗VEGF和化療劑的抗性。給C57BL/6小鼠(n=5)才直入EL4(a)、LLC(b)、TIB6(c)和B16F1(d)月中瘤，并用抗VEGF抗體、對(duì)照抗體、吉西他濱和5FU治療，如所描述的。每周兩次測(cè)量腫瘤體積，在第17天分析所有的小鼠。承表明在比較抗VEGF治療的小鼠與5FU或吉西他濱治療的動(dòng)物時(shí)有顯著差異。(e)從每個(gè)小鼠分離BM細(xì)胞，用CDllb和Grl熒光染料偶聯(lián)的抗體來(lái)染色。圖表呈現(xiàn)了每種處理中BMCDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目。(f)在17天后收獲來(lái)自每個(gè)小鼠的腫瘤分離物，用相同的抗體染色，來(lái)查看每個(gè)腫瘤中CDllb+Grl+細(xì)胞的頻率和數(shù)目。柱條代表平均值士SEM。承表明用抗VEGF治療的攜帶EL4肺瘤的小鼠與相應(yīng)的B16F1和TIB6處理動(dòng)物相比的差異是顯著的(p<0.05)。十表明用抗VEGF治療的攜帶LLC腫瘤的小鼠與相應(yīng)的B16Fl和TIB6處理動(dòng)物相比有顯著差異(p《0.05)。發(fā)明詳述定義在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于具體的組合物或生物學(xué)系統(tǒng)，其當(dāng)然可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是出于描述具體實(shí)施方案的目的，并非意圖限制。在用于本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)時(shí)，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述"包括復(fù)數(shù)稱謂，除非另有明確說(shuō)明。如此，例如，"一個(gè)/一種分子"任選包括兩個(gè)或多個(gè)/兩種或多種所述分子的組合，諸如此類。術(shù)語(yǔ)"VEGF，，和"VEGF-A"可互換使用，指165個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及相關(guān)的121個(gè)、145個(gè)、183個(gè)、189個(gè)和206個(gè)氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)月包生長(zhǎng)因子，如Leungefl/.5We"ce,246:1306(1989);Houckefa/.7kfo/.￡>(iocn!>z.，5:1806(1991);及Robinson&Stringer,Jow廠"a/Ce//5b/ewce,144(5):853-865(2001)所記載的，及其天然存在等位形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF畫E、VEGF-F和P1GF在內(nèi)的基因家族的一部分。VEGF-A主要結(jié)合兩種高親和力受體酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-l)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂信號(hào)的主要遞質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"VEGF，或"VEGF-A"還指來(lái)自非人物種(諸如小鼠、大鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的VEGF。有時(shí)，來(lái)自特定物種的VEGF表示如下，諸如hVEGF表示人VEGF,mVEGF表示鼠VEGF。術(shù)語(yǔ)"VEGF，還用于指包含165個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸第8-109位或第l-109位的多肽截短形式或片段。本申請(qǐng)中可能通過(guò)例如"VEGF(8-109)"、"VEGF(l-109)，，或"VEGF，65，，來(lái)鑒別任何此類形式VEGF。"截短的"天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的編號(hào)。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(曱硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(曱硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶?duì)KDR和Flt-1受體的結(jié)合親和力。"VEGF拮抗劑"指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性(包括其與一種或多種VEGF受體的結(jié)合)的分子(肽基或非肽基)。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結(jié)合的受體分子及衍生物(例如可溶性VEGF受體蛋白質(zhì)或其VEGF結(jié)合片段、或嵌合VEGF受體蛋白質(zhì))、抗VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑(諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑)、及融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF121-gelonin(Peregine))。VEGF拮抗劑還包括VEGF的拮抗性變體、針對(duì)VEGF的反義分子、RNA適體(aptamer)、和針對(duì)VEGF或VEGF受體的核酶(ribozyme)?？捎糜诒景l(fā)明方法的VEGF拮抗劑進(jìn)一步包括特異性結(jié)合VEGF的肽基或非肽基化合物，諸如抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合VEGF的多肽或其片段；至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補(bǔ)的反義核堿基(nucleobase)寡聚物；至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補(bǔ)的小RNA;靶向VEGF的核酶；針對(duì)VEGF的肽體(peptibody);及VEGF適體。在一個(gè)實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑將VEGF的表達(dá)水平或生物學(xué)活性降低或抑制至少10%、20%、30%、40°/。、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受到VEGF拮抗劑抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(l-109)或VEGF!6s。術(shù)語(yǔ)"抗VEGF抗體"或"結(jié)合VEGF的抗體，，指能夠以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體，該抗體在耙向VEGF中可用作診斷劑和/或治療劑。例如，本發(fā)明的抗VEGF抗體可在靶向和干預(yù)其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治療劑。參見(jiàn)例如美國(guó)專利6,582,959，6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;WO2005/044853;EP0666868B1;美國(guó)專利申請(qǐng)20030206899,20030190317,20030203409,20050112126,20050186208和20050112126;Popkovefa/.,Jbwrwa/7mmww/ogfca/A/eAocfe288:149-164(2004);及W02005012359。所選擇的抗體通常具有針對(duì)VEGF的足夠強(qiáng)的結(jié)合親和力，例如所述抗體可以以介于100nM-lpM之間的Kd值結(jié)合hVEGF?？贵w親和力可以通過(guò)例如基于表面等離振子共振的測(cè)定法(諸如BIAcore測(cè)定法，如PCT申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO2005/012359所記載的)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA);和竟?fàn)帨y(cè)定法(例如RIA)來(lái)測(cè)定。所述抗體可以進(jìn)行其它生物學(xué)活性測(cè)定法，例如為了評(píng)估其作為治療劑的效力。此類測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，而且依賴于所述抗體的靶抗原和預(yù)期用途。例子包括HUVEC抑制測(cè)定法；肝瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定法(如例如WO89/06692所記載的)；抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定法(美國(guó)專利5,500,362);及激動(dòng)性活性或造血測(cè)定法(參見(jiàn)WO95/27062)?？筕EGF抗體通常不會(huì)結(jié)合其它VEGF同源物，諸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E,也不會(huì)結(jié)合其它生長(zhǎng)因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗VEGF抗體包括與雜交瘤ATCCHB10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1結(jié)合相同表位的單克隆抗體；依照Presta"a/.(1997)CancerRes.57:4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱為貝伐單抗即"bevacizumab(BV)"、也稱為"rhuMAbVEGF，或"AVASTIN②"的抗體。貝伐單抗包含突變的人IgGl框架區(qū)和來(lái)自鼠抗hVEGF單克隆抗體A.4.6.1(其阻斷人VEGF結(jié)合其受體)的抗原結(jié)合互補(bǔ)決定區(qū)。貝伐單抗大約93%的氨基酸序列(包括大部分框架區(qū))衍生自人IgGl,而大約7%的序列衍生自鼠抗體A4.6丄貝伐單抗具有約149,000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐單抗和其它人源化抗VEGF抗體進(jìn)一步記載于2005年2月26日公告的美國(guó)專利No.6,884,879。別的優(yōu)選的抗體包括G6或B20系列抗體(例如G6-23、G6-31、B20-4.1),如PCT申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO2005/012359所記載的。別的優(yōu)選的抗體參見(jiàn)美國(guó)專利No.7,060,269，6,582,959,6,703,020;6,054,297;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006009360，20050186208,20030206899，20030190317，20030203409和20050112126;及Popkovefa/.,JournalofImmunologicalMethods288:149-164(2004)。依照本發(fā)明的"G6系列抗體"指衍生自依照PCT申請(qǐng)^^開(kāi)號(hào)WO2005/012359的圖7、24-26、和34-35任一的G6抗體或G6衍生抗體之序列的抗VEGF抗體"造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞"或"原始造血細(xì)胞，，指能夠分化形成更定型的或成熟的血細(xì)胞類型的細(xì)胞。"淋巴樣血細(xì)胞譜系"指能夠分化形成淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞或T細(xì)胞)的造血祖細(xì)胞。類似的，"淋巴細(xì)胞生成"指淋巴細(xì)胞的形成。"紅細(xì)胞樣血細(xì)胞譜系，，指能夠分化形成紅細(xì)胞(紅血球)的造血祖細(xì)胞，而"紅細(xì)胞生成"指紅細(xì)胞的形成。短語(yǔ)"髓(纟田月包)樣血細(xì)胞譜系"在用于本文時(shí)涵蓋上文所述淋巴樣和紅細(xì)胞樣血細(xì)胞譜系以外的所有造血祖細(xì)胞，而"髓細(xì)胞生成，，牽涉血細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞以外的)的形成。髓樣細(xì)胞群體可以在01~1+/001化+(或CDllb+Grl+)或Grl十/Mac-l+的髓樣免疫細(xì)胞中富集。這些細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞譜系的髓樣細(xì)胞的標(biāo)志物即CDllb,和粒細(xì)胞的標(biāo)志物即Grl。Grl+ZCDllb+可以通過(guò)免疫粘附淘選例如用針對(duì)Grl+的抗體來(lái)選4奪。"髓樣細(xì)胞減少劑"指能減少或消融髓樣細(xì)胞群體的藥劑。典型的是，髓樣細(xì)胞減少劑將會(huì)減少或消融髓樣細(xì)胞、CDllb+Grl+、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。髓樣細(xì)胞減少劑的例子包括但不限于Grl+拮抗劑、CDllb拮抗劑、CD18拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-1拮抗劑、MIP-la拮抗劑等。術(shù)語(yǔ)"Grl拮抗劑"在用于本文時(shí)指能結(jié)合Grl并抑制或?qū)嵸|(zhì)性降低Grl生物學(xué)活性的分子。Grl拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機(jī)分子、肽沖莫擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述Grl拮抗劑是抗體，尤其是能結(jié)合人Grl的抗Grl抗體。術(shù)語(yǔ)"CDllb拮抗劑"在用于本文時(shí)指能結(jié)合CDllb并抑制或?qū)嵸|(zhì)性降低CDllb生物學(xué)活性的分子。正常情況下，所述拮抗劑將會(huì)(部分或完全)阻斷細(xì)胞(例如未成熟髓樣細(xì)胞)在其細(xì)胞表面上表達(dá)CDllb亞基以結(jié)合內(nèi)皮的能力。CDllb拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機(jī)分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDllb拮抗劑是抗體，尤其是能結(jié)合人CDllb的抗CDllb抗體。例示性的CDllb抗體包括MY卯4(美國(guó)專利No.4,840,793);1B6c(參見(jiàn)Zhangefa/"BrainResearch698:79-85(1995));CB脂1/5和CBRM1/19(WO94/08620)。術(shù)語(yǔ)"CD18拮抗劑"在用于本文時(shí)指能結(jié)合CD18(優(yōu)選人CD18)并抑制或?qū)嵸|(zhì)性降低CD18生物學(xué)活性的分子。正常情況下，所述拮抗劑將會(huì)(部分或完全)阻斷細(xì)胞(例如嗜中性細(xì)胞)在其細(xì)胞表面上表達(dá)CD18亞基以結(jié)合內(nèi)皮的能力。CD18拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機(jī)分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述CD18拮抗劑是抗體。抗CD18抗體的例子包括MHM23(Hildreth"a/.，￡w//mww"o/.13:202-208(1983》；M18/2(IgG2a;Sanches-Madrid"a/.，￡x/.Mdl58:586-602(l983)》H52(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏物HB10160);Masl91c和10T18(VermotDesrochesd5b朋dJ/mmmo/.33:277-286(1991));及NA-8(WO94/12214)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是能結(jié)合MHM23或H52所結(jié)合的CD18表位的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體具有針對(duì)CD18多肽的高親和力。在某些實(shí)施方案中，所述抗體可以結(jié)合CD18胞外結(jié)構(gòu)域中與CDllb相結(jié)合的區(qū)域，而且所述抗體還可解離a和P鏈(例如所述抗體可解離CDllb和CD18復(fù)合物，正如MHM23抗體的情況)。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)指牽涉先天免疫和Th2效應(yīng)器應(yīng)答，及CD4十T細(xì)胞分化的化學(xué)因子。參見(jiàn)例如Paul,W.E.,Fw"dame"to//www"o/o",5"五必/o"，LippincottWilliams&Wilkins,(Philadelphia,2003)pp801-840。術(shù)語(yǔ)"MCP-1拮抗劑"在用于本文時(shí)指能結(jié)合MCP-1并抑制或?qū)嵸|(zhì)性降低MCP-1生物學(xué)活性的分子。MCP-1拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機(jī)分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述MCP-1拮抗劑是抗體，尤其是能結(jié)合人MCP-l的抗MCP-1抗體。巨噬細(xì)胞炎性蛋白o(hù)c和(3(MIP-la和(3)是已知的化學(xué)因子。MIP-la牽涉先天免疫和Thl效應(yīng)器應(yīng)答，及CD4十T細(xì)胞分化。參見(jiàn)例如Paul，W.E.，F(xiàn)w,7(i函e她//w應(yīng)wo/ogy,5rt五血》w,LippincottWilliams&Wilkins，(Philadelphia,2003)pp801-840。術(shù)語(yǔ)"MIP-la拮抗劑"在用于本文時(shí)指能結(jié)合MIP-la并抑制或?qū)嵸|(zhì)性降低MIP-la生物學(xué)活性的分子。MIP-lct拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機(jī)分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述MIP-la拮抗劑是抗體，尤其是能結(jié)合人MIP-la的抗MIP-la抗體。術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"在用于本文時(shí)指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性(包括其與一種或多種受體的結(jié)合(在配體的情況中)或與一種或多種配體的結(jié)合(在受體的情況中)的分子。拮抗劑包括抗體及其抗原結(jié)合片段、蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機(jī)分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列、諸如此類。拮抗劑還包括本發(fā)明蛋白質(zhì)的小分子抑制劑、和融合蛋白、能特異性結(jié)合蛋白質(zhì)由此使其隔絕與其靶物結(jié)合的受體分子及衍生物、蛋白質(zhì)的拮抗性變體、針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的反義分子、RNA適體、和針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酶。"阻斷性"抗體或"拮抗性"抗體指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物活性。"URCGP"指在來(lái)自抗VEGF抗性肺瘤的CDllb+Grl+細(xì)胞中上調(diào)的蛋白質(zhì)。URCGP包括但不限于嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、CD14、expi、I1-13R、LDLR、TLR-1、RLF、Endo-Lip、SOCS13、FGF13、IL-4R、IL-11R、IL-IRII、IFNTM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌載體膜(Secretorycarriermembrane)1、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、血管生成素樣-6、Eph-RA7、腦信號(hào)蛋白(Semaphorin)Vlb、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子5、密蛋白(Claudin)-18、MDC15、ECM和ADAMTS7B。在某些實(shí)施方案中，所述URCGP指IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13和/或IL-4R。"DRCGP"指在來(lái)自抗VEGF抗性肺瘤的CDllb+Grl+細(xì)胞中下調(diào)的蛋白質(zhì)。DRCGP包括但不限于THBS1、Crea7、水通道蛋白(Aquaporin)-1、溶質(zhì)載體家族蛋白(SCF38)、載脂蛋白E(APOE)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)、NCAM-140、ni型纖連蛋白、WIP、CD74、ICAM-2、Jaggedl、ltga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFbIEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-l、CD48、E-選擇蛋白、IL-15、細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制物4、Cytor4和CX3CRl。在某些實(shí)施方案中，所述DRCGP指THBSl和/或Crea7。"URRTP"指在抗VEGF抗性腫瘤中上調(diào)的蛋白質(zhì)。URRTP包括但不限于Notch2、DMD8、MCP-1、ITGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM-CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、A型清除受體、巨噬細(xì)胞C型凝集素、Pigr3、巨噬細(xì)胞SRT-1、G蛋白偶聯(lián)受體、ScyA7、IL-1R2、IL-1可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、IL-1卩和ILIXPrecuror。在某些實(shí)施方案中，所述URRTP指MSCA、MIP2、IL-8R和/或G-CSF。"DRRTP"指在抗VEGF抗性腫瘤中下調(diào)的蛋白質(zhì)。DRRTP包括但不限于IL10-R2、Erb-2.1、窖蛋白(Caveolin)3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecaml、Tlr3、TGF-B、FIZZ1、Wfsl、TP14A、EMAP、SULF—2、月包夕卜基質(zhì)2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-a、肝配蛋白(Ephrin)Bl、SPARC樣1、和腦信號(hào)蛋白A。在某些實(shí)施方案中，所述DRRTP指IL10-R2、THBSP-4和/或JAM-2。"天然序列"多肽包括與衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多酸序列。此類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可以通過(guò)重組或合成手段來(lái)生產(chǎn)。術(shù)語(yǔ)"天然序列"多肽明確涵蓋該多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)、及天然存在的等位變體。"多肽鏈"指其中其每個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽鍵(不同于非共價(jià)相互作用或二硫鍵)與其它結(jié)構(gòu)域相連的多肽。多肽"變體"指與相應(yīng)的天然序列多肽具有至少約80。/。氨基酸序列同一性的生物學(xué)活性多肽。此類變體包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)殘基的多肽。通常，變體將會(huì)與天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性，或至少約90。/。氨基酸序列同一性，或至少約95。/?；蚋喟被嵝蛄型恍?。變體還包括天然序列的多肽片段(例如亞序列、截短等)，通常是有生物學(xué)活性的。本文中的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與選定序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性目的的對(duì)比可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測(cè)量對(duì)比的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長(zhǎng)獲得最大對(duì)比所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2如下所述獲得的。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech公司編寫，而且已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國(guó)版權(quán)局(USCopyrightOffice,WashingtonD,C.,20559),并以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087注冊(cè)，7^眾可通過(guò)Genentech7^司(SouthSanFrancisco,California)獲取。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)(優(yōu)選數(shù)碼UNIXV4.0D)上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。為了本發(fā)明的目的，給定氨基酸序列A相對(duì)于(to)、與(with)、或針對(duì)(against)給定氨基Sl序列B的。/。氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對(duì)于、與、或針對(duì)給定氨基S臾序列B的某一。/。氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計(jì)算分?jǐn)?shù)X/Y乘100的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢灶I(lǐng)會(huì)，若氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等，貝'jA相對(duì)于B的。/。氨基酸序列同一性將不等于B相對(duì)于A的％氨基酉吏序列同一性。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)變體"在用于本文時(shí)指上文所述變體和/或在天然蛋白質(zhì)序列中包含一處或多處氨基酸突變的蛋白質(zhì)。任選的是，所述一處或多處氨基酸突變包括氨基酸替代。用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其變體可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的多種方法來(lái)制備。蛋白質(zhì)的氨基酉^f列變體可通過(guò)蛋白質(zhì)DNA中的突變來(lái)制備。此類變體包括例如蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除、插入或替代?？梢赃M(jìn)行刪除、插入和替代的任何組合以獲得具有期望活性的最終構(gòu)建物。將在編碼變體的DNA中進(jìn)行的突變絕不能將序列置于讀碼框之外，而且優(yōu)選不會(huì)產(chǎn)生能產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。EP75,444A。蛋白質(zhì)變體的制備任選通過(guò)編碼天然蛋白質(zhì)的DNA中的核苷酸定點(diǎn)誘變或噬菌體展示技術(shù)，由此產(chǎn)生編碼變體的DNA,然后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該DNA。盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，然而突變本身不必預(yù)先決定。例如，為了優(yōu)化給定位點(diǎn)處突變的后果，可以在目標(biāo)密碼子或區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變，并對(duì)所表達(dá)的蛋白質(zhì)變體篩選期望活性的最佳組合。用于在具有已知序列的DNA中預(yù)先決定的位點(diǎn)進(jìn)行替代突變的技術(shù)是眾所周知的，諸如例如位點(diǎn)特異性誘變。本文所述蛋白質(zhì)變體的制備可通過(guò)噬菌體展示技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，諸如那些如PCT出版物WO00/63380所記載的。在選出這樣的克隆后，可以取出突變后的蛋白質(zhì)區(qū)并置入適用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的載體，一般是可用于轉(zhuǎn)化適宜宿主的那種類型的表達(dá)載體。氨基酸序列刪除的范圍一般是約l-30個(gè)殘基，任選1-10個(gè)殘基，任選l-5個(gè)殘基或更少，而且通常是連續(xù)的。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，從一個(gè)殘基至長(zhǎng)度本質(zhì)上不受限制的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。序列內(nèi)插入(即天然蛋白質(zhì)序列內(nèi)的插入)的范圍一般可以是約1-10個(gè)殘基，任選l-5個(gè)，或任選l-3個(gè)。末端插入的例子包括在N-末端融合信號(hào)序列(無(wú)論對(duì)宿主細(xì)胞是異源的或同源的)以便于由重組宿主分泌。別的蛋白質(zhì)變體有那些其中天然蛋白質(zhì)的至少一個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)消除并在它的位置插入了不同殘基的。此類替代可依照表l所示進(jìn)行。蛋白質(zhì)變體還可包含本文所述的非天然氨基酸。氨基酸可以根據(jù)其側(cè)鏈特性的相似性如下分組(A丄.Lehninger,5/oc/^w/Wr_y，第2版,pp.73-75，WorthPublishers,NewYork,(1975)):(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Tip(W)、Met(M)(2)不帶電荷的、極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)石成性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，天然存在殘基可以基于共同的側(cè)鏈特性如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性的、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石成性的:His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。表l原始?xì)埢咎娲鷥?yōu)選替代Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Asp;Lys;ArgGinAsp(D)Glu;AsnGluCys(C)Ser;AlaSerGin(Q)Asn;GluAsnGlu(E)Asp;GinAspGly(G)AlaAlaHis(H)Asn;Gin;Lys;ArgArgHe(I)Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；lie;Val;Met;Ala;PhelieLys(K)Arg;Gin;AsnArg<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>"天然存在的氨基酸殘基"(即由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基)可以選自丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(lie);亮氨酸(Leu);賴氨酸(Lys);甲硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val)。"非天然存在的氨基酸殘基"指上文所列天然存在氨基酸殘基以外的，能夠在多肽鏈中與鄰近氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合的殘基。非天然存在氨基酸殘基的例子包括例如正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，諸如那些Elhnan"a/"Me仇￡"z，.202:301-336(1991)及美國(guó)專利申請(qǐng)出版物20030108885和20030082575中所記載的。簡(jiǎn)言之，這些規(guī)程牽涉用非天然存在氨基酸殘基活化阻抑型tRNA,接著在體外或在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯RNA。參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)出版物20030108885和20030082575;Norenefa/.,5W認(rèn)e244:182(1989);及Ellman"a/.，見(jiàn)上文。"分離的"多肽指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回收的多肽。多肽的天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，將多肽純化至(1)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，多肽重量超過(guò)95%或重內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE,達(dá)到同質(zhì)。既然多肽的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽。然而，分離的多肽通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。術(shù)語(yǔ)"抗體"以最廣義使用，明確涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)的或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段(見(jiàn)下文)，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。除非另有說(shuō)明，表述"多價(jià)抗體"貫穿本說(shuō)明書(shū)用于指包含三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。多價(jià)抗體通常改造成具有三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)，而且一^:不是天然序列IgM或IgA抗體。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留了與抗原結(jié)合的能力。此定義所涵蓋的抗體片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1結(jié)構(gòu)域；(ii)Fab'片段，其是在CH1結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1結(jié)構(gòu)域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1結(jié)構(gòu)域及CH1結(jié)構(gòu)域C-末端的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域；(vi)dAb片H(Wardda/.,A^Mre341:544-546(1989》，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab'》片段，即包含通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫橋相連的兩個(gè)Fab'片段的二價(jià)片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv;scFv)(Bird"a/.,Sc/e"ce242:423-426(1988)和Hustonefa/"尸M4S(T7&4」85:5879-5883(1988));(x)"雙抗體"，其具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)(參見(jiàn)例如EP404,097;WO93/11161;和Hollingerefa/"iVoc.淑/.4cad固90:6444-6448(1993));(xi)"線性抗體，，，其包含一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)，與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)(Zapatada/.,Prafe〖"五吸8(10):1057-1062(1995)和美國(guó)專利5,641，870)。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體，，在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的，除了可以以極小量存在的可能突變(例如天然存在突變)外。如此，修飾語(yǔ)"單克隆"表明抗體不是不同抗體混合物的特征。單克隆抗體是針對(duì)單一抗原高度特異性的。在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體典型的包括包含能結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。例如，選擇過(guò)程可以是從眾多克隆(諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合)中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的輩巴物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對(duì)靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性之外，單克隆抗體制備物的優(yōu)點(diǎn)在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)"單克隆"表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)多種^支術(shù)來(lái)生成，包^^例如雜交瘤法(例如KoherandMilstein，淑,256:495-97(1975);Hongo"a/.，//咖V/蘭a,14(3):253-260(1995);Harlowefa/.,J""6o(i/asvJ丄a60rato7Ma/wa/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988;Hammerlinga/"于Mowoc/o"a//^z^oAesT-Ce//舉",cfo應(yīng)、563-681,Elsevier,N.Y"1981)、重組DNA法(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4,816,567)、噬菌體展示技術(shù)(參見(jiàn)例如Clacksona/.,A^wre352:624-628(1991);Marks/她/.則.222:581-597(1991);Sidhu"a/.，/Mo/.腸/.338(2):299-310(2004);Leeda/.，/Mo/.脂.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,/Voc.A^.Jcad5W."514101(34):12467-12472(2004);及Leeefa/,,/mww,w/.284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見(jiàn)例如WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovitsa/"iVoc.編.爿cad5W,腦90:2551(1993);Jakobovitsa/.,TVa^re362:255-258(1993》Bruggemanna/.，/,簡(jiǎn)證7:33(1993);美國(guó)專利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5，633，425;5,661,016;Marks"a/"所0/rec/7"0/0gy10:779-783(1992);Lonberga/"iVam368:856-859(1994);Morrison,A^^w368:812-813(1994);Fishwilda/.，7Va/wre祝她c/zm/.14:845-851(1996);Neuberger，Atowe歷otec/zwo/.14:826(1996);及LonbergandHuszar,/她m.iev./mmw"o/.13:65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利No.4,816,567和Morrisonda/"AW/.園81:6851-6855(1984))。非人(例如鼠)抗體的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒(méi)有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones"a/.，A^wre321:522-525(1986);Riechmannea/"A^ww332:323-329(1988);及Presta，CWr^racA歷o/.2:593-596(1992)。還可參見(jiàn)例如VaswaniandHamilton,Jww.j〃ergy,j"/zma在7m附wwo/.1:105-115(1998);Harris,S〖0c/2em.5bc,rra似ac"ora23:1035-1038(1995);HurleandGross,Cw/r.B/ofec/z.5:428-433(1994);及美國(guó)專利No.6,982,321和7,087,409。還可參見(jiàn)vanDijkandvandeWinkel,Cwr.Qp/".P/zarmaco/.,5:368-74(2001)。人抗體可以如下制備，即將抗原施用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其經(jīng)修飾而應(yīng)答抗原挑戰(zhàn)生成此類抗體，但是其內(nèi)源基因座已經(jīng)失去能力，例如經(jīng)免疫的異種移植小鼠(xenomice)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.6,075,181和6,150,584，關(guān)于XENOMOUSETM技術(shù))。還可參見(jiàn)例如Li^尸rac.扁.JcW.,,103:3557-3562(2006)，關(guān)于經(jīng)人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體。"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)生成。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體是從噬菌體文庫(kù)選擇的，該p藍(lán)菌體文庫(kù)表達(dá)人抗體(Vaughanda/.,A^wre5/oto:/zo/ogy14:309-314(1996);Sheets"a/.,/WJS95:6157-6162(1998);HoogenboomandWinter,■/Mo/.腺.227:381(1991);MarksJ,Mo/.組222:581(1991》。人抗體還可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全滅活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)來(lái)生成。在受到攻擊時(shí)，觀察到人抗體生成，它在所有方面與在人體中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體全集。這種方法記載于例如美國(guó)專利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016，及以下科學(xué)出版物Marksda/"歷o/Tec/z"o/ogy10:779-783(1992);Lonberga/"A^ww368:856-859(1994);Morrison,7V<^wre368:812-13(1994);Fishwild"a/"7VafwreBz'ofec/wo/o^14:845-51(1996);Neuberger,淑眺腸欣/wo/，14:826(1996);LonbergandHuszar,/"ter".iev./mm朋o/,13:65-93(1995)?；蛘撸丝贵w可通過(guò)生成針對(duì)靶抗原的抗體的人B淋巴細(xì)胞的永生化來(lái)制備(此類B淋巴細(xì)胞可從個(gè)體回卄欠，或者可在體夕卜免疫)。參見(jiàn)如H口Cole"a/"A/b"oc/o"a/v4"fz'6oflfesC朋cw7T7era，AlanR.Liss，p.77(1985》Boernerefo/,，J.147(1):86-95(1991);及美國(guó)專利No.5,750,373。術(shù)語(yǔ)"可變的"指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR，它們大多采取(3-折疊片構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成(3-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合J立點(diǎn)的形成(參見(jiàn)KabatC，5"e《we"cei1yiVote/ra</;wmM"o/o^cfl/第5版,PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體在抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性中的參與。術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"、"HVR"或"HV"在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。例如，術(shù)語(yǔ)高變區(qū)指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)HVR:三個(gè)在VH中(Hl、H2、H3)，三個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個(gè)HVR的最大多樣性，而且認(rèn)為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發(fā)揮獨(dú)特作用。參見(jiàn)例如Xu"a/./w/7wmXy13:37-45(2000);JohnsonandWu于M^/zO(is"M/ecw/(3T萬(wàn)/o/og^248:1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2003)。事實(shí)上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時(shí)是有功能的且穩(wěn)定的。參見(jiàn)例如Hamers-Casterman7W^wre363:446-448(1993);Sheriffda/.Atowre&rw".歷o/.3:733-736(1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(KabatWa/.,尸rafe/rao/7mw朋o/，'co//她mst，5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(ChothiaandLeskj;Mo/.所o/.196:901-917(1987》。AbMHVR代表KabatHVR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件的使用。"接觸"HVR是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些HVR中每一個(gè)的殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>HVR可包括如下"延伸的HVR":VL中的24-36或24-34(Ll)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(Hl)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。對(duì)于這些定義中的每一個(gè)，可變域殘基是依照Kabat等，見(jiàn)上文編號(hào)的。"框架區(qū)"或"FR"殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基之外的那些殘基。術(shù)語(yǔ)"依照Kabat的可變域殘基編號(hào)方式"或"依照Kabat的氨基酸位置編號(hào)方式，，及其變化形式指Kabat"見(jiàn)上文中的用于抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號(hào)方式可通過(guò)將抗體序列與"標(biāo)準(zhǔn)"Kabat編號(hào)序列對(duì)比同源區(qū)來(lái)確定。貫穿本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，Kabat編號(hào)系統(tǒng)一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1-107和重鏈殘基1-113)時(shí)使用(例如Kabatefa/.,5^z/ewces1#7ww7wwo/og/ca//"ferns.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。"EU編號(hào)系統(tǒng)，，或"EU索引，，一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時(shí)使用(例如KabatWa/.,Se《wewce51_Pra/e/"5o//w附w"o/o^7'ca///Merest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中報(bào)道的EU索引，明確收入本文作為參考)。除非本文中另有說(shuō)明，提及抗體可變域中的殘基編號(hào)指根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的殘基編號(hào)方式。除非本文中另有說(shuō)明，提及抗體恒定域中的殘基編號(hào)指根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)的殘基編號(hào)方式(例如參見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/640,323,EU編號(hào)方式的圖)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基S臾序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgG,(包括非A和A同種異型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgA,和lgA2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作a、5、s、y和P。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般性記載于例^口Abbasa/.,Ce//w/arawe/Mo/,/mmimo/ogy，4thed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗體可以是抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而形成的更大融合分子的一部分。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊推動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈，，可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡巾白(K)和拉姆達(dá)(x)。術(shù)語(yǔ)"Fc區(qū)"用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)，其可以是通過(guò)木瓜蛋白酶消化完整抗體生成的。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變異Fc區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為Fc區(qū)自大約Cys226位置或大約Pro230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區(qū)段。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(殘基447，依照EU編號(hào)系統(tǒng))可以消除，例如在生產(chǎn)或純化抗體的過(guò)程中，或者通過(guò)對(duì)編碼抗體重鏈的核酸進(jìn)行重組工程改造。因而，完整抗體的組合物可包括所有K447殘基都被消除的抗體群、無(wú)一K447殘基被消除的抗體群、或者混合了有和無(wú)K447殘基的抗體的抗體群。免疫球蛋白的Fc區(qū)一般包含兩個(gè)恒定域，即CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，任選包含CH4結(jié)構(gòu)域。除非本文另有說(shuō)明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號(hào)方式是如Kabatda/.,見(jiàn)上文中的EU索引的編號(hào)方式。"如Kabat中的EU索引，，指人IgGlEU抗體的殘基編號(hào)方式。"Fc區(qū)鏈'，在本文中指Fc區(qū)兩條多肽鏈之一。人IgGFc區(qū)的"CH2結(jié)構(gòu)域"(也稱為"Cg2"結(jié)構(gòu)域)通常自約第231位氨基酸殘基延伸至約第340位氨基酸殘基。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特之處在于它沒(méi)有與另一結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。而是，有兩個(gè)N-連接的分支的碳水化合物鏈介于完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。推測(cè)碳水化合物可能提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對(duì)的替代且有助于穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton,Mo/ec./mmwm/.22:161-206(1985)。CH2結(jié)構(gòu)域在本文中可以是天然序列CH2結(jié)構(gòu)域或變異CH2結(jié)構(gòu)域。"CH3結(jié)構(gòu)域"包含F(xiàn)c區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域C端的一段殘基(即自IgG的約第34H立氨基酸殘基至約第447位氨基酸殘基)。CH3區(qū)在本文中可以是天然序列CH3結(jié)構(gòu)域或變異CH3結(jié)構(gòu)域(例如在其一條鏈中具有引入的"隆起"(protroberance)而在其另一條鏈中具有相應(yīng)引入的"空腔，，(cavity)的CH3結(jié)構(gòu)域；參見(jiàn)美國(guó)專利No.5，821，333，明確收入本文作為參考)。此類變異CH3結(jié)構(gòu)域可用于生成本文所述多特異性(例如雙特異性)抗體。"鉸鏈區(qū)"通常定義為自人IgGl的約Glu216或約Cys226至約Pro230的區(qū)段(Burton，Mo/ec./wmw"o/.22:161-206(1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)可以通過(guò)將第一個(gè)和最后一個(gè)形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置于相同位置而與IgGl序列對(duì)比。鉸鏈區(qū)在本文中可以是天然序列鉸鏈區(qū)或變異4交鏈區(qū)。變異鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈通常每條多肽鏈保留至少一個(gè)半胱氨酸殘基，使得變異鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈可在兩條鏈之間形成二硫鍵。本文中優(yōu)選的鉸鏈區(qū)是天然序列人鉸鏈區(qū)，例如天然序列人IgGl鉸鏈區(qū)。"功能性Fc區(qū)"擁有天然序列Fc區(qū)的至少一項(xiàng)"效應(yīng)器功能"。例示性的"效應(yīng)器功能"包括Clq結(jié)合、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、Fc受體結(jié)合、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)下調(diào)等。此類效應(yīng)器功能一般要求Fc區(qū)與結(jié)合域(例如抗體可變域)結(jié)合，而且可使用本領(lǐng)域已知的用于評(píng)估此類抗體效應(yīng)器功能的多種測(cè)定法來(lái)評(píng)估。"天然序列Fc區(qū)"包含與自然界中找到的Fc區(qū)的氨基S^列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc區(qū)包括天然序列人IgGlFc區(qū)(非A和A同種異型)、天然序列人IgG2Fc區(qū)、天然序列人IgG3Fc區(qū)、及天然序列人IgG4Fc區(qū)，及其天然存在變體。"變異Fc區(qū)"包含由于至少一處氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)有所不同的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，變異Fc區(qū)具有與天然序列Fc區(qū)或與親本多肽的Fc區(qū)相比至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區(qū)中或在親本多肽的Fc區(qū)中具有約1處至約1O處氨基酸替代，優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區(qū)中或在親本多肽的Fc區(qū)中具有約l處至約10處氨基酸替代，優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。典型的是，變異Fc區(qū)在本文中將與天然序列Fc區(qū)和/或親本多肽的Fc區(qū)擁有至少約80%序列同一性，或至少約卯％序列同一性，或至少約95。/?；蚋嘈蛄型恍?。抗體"效應(yīng)器功能"指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC);Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)胞活化。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"或"ADCC"指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞只表達(dá)Fc7Rin,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、Fc7RII和FcyRin。RavetchandKinet,J"鼎.Aev.9:457-92(1991)第464頁(yè)表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利No.5，500，362或5,821,337中所記載的?？捎糜诖祟悳y(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes"a/.,/WAS(X/5L4」95:652-656(1998)中所披露的。"人效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)胞至少表達(dá)Fc7Rin并行〗吏ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞，一般優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)月包可以從其天然來(lái)源(例如/人血液或PBMC)分離，如本文所述。"Fc受體"或"FcR"描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在有些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是天然人FcR。在有些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的FcR(Y受體)，包括屬于FcyRI、FcYRII和FcYRIII亞類的受體，包括那些受體的等位變體和可變剪接形式。FcryRn受體包括FcYRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。活化受體FcyRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見(jiàn)例如Dagron,爿"層.iev./mmw"o/,15:203-234(1997》。FcR的綜述參見(jiàn)例戈口RavetchandKinet,Jmw.iev./附附wwo/.9:457-492(1991);Capel&"/,:Immunomethods4:25-34(1994);及deHaasea/.,丄a6.Afed.126:330-41(1995)。術(shù)語(yǔ)"FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來(lái)將會(huì)鑒定的。術(shù)語(yǔ)"Fc受體"或"FcR"還包括新生兒受體，F(xiàn)cRji,它負(fù)責(zé)將母體IgG壽爭(zhēng)牙多纟合月臺(tái)JL(Guyer"a/.,J./附mzmo/.117:587(1976)禾口Kim"a/,,//mmwwo/.24:249(1994))并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。測(cè)量對(duì)FcRn的結(jié)合的方法是已知的(參見(jiàn)例如Ghetie1997，Hinton2004)。測(cè)量對(duì)FcRn的結(jié)合的方法是已知的(參見(jiàn)例如GhetieandWard,/附wz/"o/.7b^y18(12):592-598(1997);Ghetie"a/.,iVaZi^e5/ofec/zm/ogy,15(7):637-640(1997);Hintona/.,JC/zew.279(8):6213-6216(2004);WO2004/92219(Hinton可測(cè)定人FcRn高親和力結(jié)合多肽與人FcRn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染人細(xì)胞系中，或者在施用了具有變異Fc區(qū)的多肽的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中。WO00/42072(Presta)記載了對(duì)FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。還可參見(jiàn)例如Shields"/.，乂所o/.Cte附.9(2):6591-6604(2001)。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"指存在補(bǔ)體時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結(jié)合至其關(guān)聯(lián)抗原。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如Gazzano-Santoro&a/.,///www"o/.AfeAo<iy202:163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區(qū)氨基酸序列(具有變異Fc區(qū)的多肽)及提高或降低的C1q結(jié)合能力的多肽變體記載于例如美國(guó)專利No.6,194,551Bl和WO1999/51642。還可參見(jiàn)例如Idusogie自/.,J/畫畫/.164:4178-4184(2000)。"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一處或多處改變、導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒(méi)有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級(jí)的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知^L程來(lái)生成。Marksda/.,說(shuō)o/rec/wo/ogy10:779-783(1992)記載了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas"a/.,尸麼.淑固91:3809-3813(1994);Schier"a/.，Ge"e169:147-155(1995);Yelton"a/.,乂/wwmw/.155:1994-2004(1995);Jacksonda/.,J./mw頭o/.154(7):3310-9(1995);及Hawkins"a/"乂tWo/.說(shuō)b/,226:889-896(1992)。"柔性接頭"在本文中指包含兩個(gè)或更多通過(guò)肽鍵相連的氨基酸殘基且為由其連接的兩段多肽(諸如兩個(gè)Fd區(qū))提供更多旋轉(zhuǎn)自由的肽。所述旋轉(zhuǎn)自由容許由柔性接頭連接的兩個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)各自更高效的接近靶抗原。合適的柔性接頭肽序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、和gly-gly-gly-ser。"二聚化結(jié)構(gòu)域"是由至少兩個(gè)氨基酸殘基(一般是半胱氨酸殘基)或者至少兩個(gè)肽或多肽(其可以具有相同或不同的氨基酸序列)結(jié)合形成的。所述肽或多肽可以經(jīng)由共價(jià)和/或非共價(jià)結(jié)合而彼此相互作用。本文中的二聚化結(jié)構(gòu)域的例子包括Fc區(qū)；鉸鏈區(qū)；CH3結(jié)構(gòu)域；CH4結(jié)構(gòu)域；CH1-CL對(duì)；具有"結(jié)節(jié)，，(knob)和/或"突起"(protmberance)的"界面"，如美國(guó)專利No.5，821,333中所記載的，明確收入本文作為參考；亮氨酸拉鏈(例如jim/fos亮氨酸拉鏈，參見(jiàn)Kostelneyefa/"http://mm畫/"148:1547-1553(1992);或酵母GCN4亮氨酸拉鏈)；異亮氨酸拉鏈；受體二聚體對(duì)(例如白介素-8受體(IL-8R);和整聯(lián)蛋白異二聚體，諸如LFA-l和GPIIIb/IIIa)或其二聚化區(qū)；二聚體配體多肽(例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成員、和腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子(BDNF);參見(jiàn)Arakawa"a/.乂歷o/.269(45):27833-27839(1994)及Radziejewskie^/.所oc/zem.32(48):1350(1993))或其二聚化區(qū)；一對(duì)能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基；一對(duì)肽或多肽，各自包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基(例如約1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)到約10個(gè)半胱氨酸殘基)使得可以在所述肽或多肽之間形成二硫鍵(下文的"合成鉸鏈")；及抗體可變域。本文中最優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域是Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)?？贵w的"功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)"指能夠結(jié)合靶抗原的位點(diǎn)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力不必像衍生該抗原結(jié)合位點(diǎn)的親本抗體那樣強(qiáng)，但是結(jié)合抗原的能力必須是使用已知用于評(píng)估抗體對(duì)抗原結(jié)合的多種方法之任一可測(cè)量到的。此外，本文中多價(jià)抗體的每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力不必定量相同。對(duì)于本文中的多聚體抗體，功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目可以使用超速離心分析來(lái)評(píng)估。依照這種分析方法，將靶抗原與多聚體抗體以不同比例混合，并計(jì)算復(fù)合物的平均分子量，其中假設(shè)不同數(shù)目的功能性結(jié)合位點(diǎn)。將這些理論值與得到的實(shí)際實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較以評(píng)估功能性結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。具有指定抗體的"生物學(xué)特征"的抗體指擁有該指定抗體區(qū)別于其它結(jié)合相同抗原的抗體的一項(xiàng)或多項(xiàng)生物學(xué)特征的抗體。為了篩選能結(jié)合抗原上感興趣抗體所結(jié)合的表位的抗體，可以實(shí)施常規(guī)交叉阻斷觀寸定法，諸^口爿w"'6od/as，爿丄a6ora;to^y^fo"z^/,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所記載的。與一種或多種其它治療劑"組合"施用包括同時(shí)(共同)施用和/或任何次序的序貫施用。為了治療目的，"哺乳動(dòng)物"指歸入哺乳類的任何動(dòng)物，包括人，家畜和牲畜，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、馬、貓、牛、綿羊、豬等。典型的是，哺乳動(dòng)物指人。"病癥"指任何會(huì)受益于使用本發(fā)明分子的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動(dòng)物傾向于所討"i侖病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括任何形式的腫瘤，良性和惡性腫瘤；血管化胂瘤；肥大；白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和嚢胚腔病癥；及炎性、血管發(fā)生性和免疫學(xué)病癥，源自不當(dāng)、異常、過(guò)度和/或病理性血管形成和/或血管通透性的血管病癥。術(shù)語(yǔ)"有效量，，或"治療有效量"指在哺乳動(dòng)物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情況中，有效量的藥物可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，典型的是阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，典型的是阻止)肺瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制肺瘤生長(zhǎng)；容許治療抗性肺瘤；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關(guān)的癥狀。根據(jù)藥物可阻止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度，它可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥療法，體內(nèi)功效可以通過(guò)例如評(píng)估存活持續(xù)時(shí)間、距疾病進(jìn)展的時(shí)間(TTP)、響應(yīng)率(RR)、響應(yīng)持續(xù)時(shí)間、和/或生活質(zhì)量來(lái)測(cè)量。"處理"和"治療"(treatment)指治療性處理和預(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括那些早就患有病癥的以及要預(yù)防病癥的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，治療可以指抑制腫瘤血管發(fā)生和/或生長(zhǎng)，或者延遲抗VEGF抗性發(fā)作。術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)活性"和"有生物學(xué)活性的，，就本發(fā)明的多肽而言指分子特異性結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答(例如增殖、遷移等)的能力。細(xì)胞應(yīng)答還包括那些經(jīng)由受體介導(dǎo)的，包括但不限于遷移和/或增殖。在此語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"調(diào)控"包括促進(jìn)和抑制二者。術(shù)語(yǔ)"癌癥，，和"癌性，，指或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長(zhǎng)不受調(diào)節(jié)的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括腎癌(kidneyorrenalcancer)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌(包括小細(xì)月包肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃腸癌、胃腸基質(zhì)腫瘤(GIST))、胰腺癌、頭頸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、泡膜細(xì)胞瘤、男性細(xì)胞瘤、肝瘤(hepatoma)、血液學(xué)惡性腫瘤(包括非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、多發(fā)性骨髓瘤和急性血液學(xué)惡性腫瘤)、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、子宮內(nèi)膜異位癥、纖維肉瘤、絨毛膜癌、唾液腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、食管癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛門癌、陰莖癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、黑素瘤、皮膚癌、許旺氏細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲狀腺癌、維爾姆斯(Wilm)氏肺瘤、以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL、中級(jí)/濾泡性NHL、中級(jí)彌漫性NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞性NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞性NHL、高級(jí)小無(wú)核裂細(xì)胞性NHL、貯積病(bulkydisease)NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞性白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水肺(諸如與腦瘤有關(guān)的水腫)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。"腫瘤，，在用于本文時(shí)指所有贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，無(wú)論是惡性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的細(xì)力包和組織。術(shù)語(yǔ)"抗性腫瘤"指對(duì)至少包含VEGF拮抗劑的癌癥療法在癌癥治療療程上完全沒(méi)有響應(yīng)、或者喪失或顯示降低的響應(yīng)的癌、癌性細(xì)胞、或腫瘤?？剐苑瘟鲞€指在本文中"^斷為有抗性的胂瘤(在本文中也稱為"抗VEGF抗性腫瘤")。在某些實(shí)施方案中，與對(duì)至少包括VEGF拮抗劑的療法敏感的腫瘤相比，抗性腫瘤中CD1lb+Grl+細(xì)胞增加。術(shù)語(yǔ)"抗肺瘤組合物，，指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如"抗癌劑"。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限于例如化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、細(xì)胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、毒素、和其它用于治療癌癥的藥劑，例如抗VEGF中和性抗體、VEGF拮抗劑、抗HER-2、抗CD20、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑、erlotinib、COX-2抑制劑(例如塞來(lái)考昔(celecoxib))、干擾素、細(xì)胞因子、能與ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受體中的一種或多種結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和/或干細(xì)胞因子(SCF)的受體酪氨酸激酶的抑制劑(例如曱磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)(GleevecNovartis))、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機(jī)化學(xué)劑等。本發(fā)明還包括它們的組合。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒劑"在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射性同位素(例如川At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、，和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素(諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體)。"生長(zhǎng)抑制劑"在用于本文時(shí)指在體外和/或在體內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。如此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低處于S期的細(xì)胞百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春藥類(vincas)(長(zhǎng)春新石威(vincristine)和長(zhǎng)春石威(vinblastine))、TAXOL⑧、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑，諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來(lái)霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類，諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼斥公(prednisone)、達(dá)卡巴。秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順柏(cisplatin)、曱氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見(jiàn)777eAfo/ecw/"r5as7'so/Cawcer,MendelsohnandIsrael編,第1章,題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs",Murakami"fl/.，WBSaunders,Philadelphia(1995),尤其是第13頁(yè)。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents)，諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酉臾烷基酉旨類(alkylsulfonates),諸長(zhǎng)口白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)牙口p底泊舒凡(piposulfan);氮丙口定類(aziridines),》者3口苯佐替》泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替;泉(meturedepa)禾口烏瑞替;泉(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemdamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐疏代石粦酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番篇才支內(nèi)酉旨類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));5-9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);(3"立帕醌(lapachone);拉帕醇(kpachol);秋水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinicacid);喜杉于石成(camptothecin)(包4舌合成類似、物才乇泊4齊康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙酰喜樹(shù)堿、東荒菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹(shù);威)；苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來(lái)新(adozelesin)、卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊芬(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特另'J是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;'海纟帛才中素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards)，i者嘖口苯丁酉交氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮齊(novembichin)、苯芥月旦甾酉孚(phenesterine)、〉發(fā)尼莫司、汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧咬氮芥(uracilmustard);亞硝脲類(nitrosoureas),諸i口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chorozotocin)、4畐莫司、;丁(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如蜂二炔類抗生素(enediyne)(例如力。利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素丫ll和加利車霉素coll(參見(jiàn)例如Agnew,O^m./"/7.Ed33:183-186(1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunombicin)、地4乇比星(detombicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRJAMYCIN⑧、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑(DOXIL⑧)和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、^f尹達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、椒欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)才亥菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex')、凈司4也丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗^Ci射物類，i者如曱氨卩巣口令(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegaflir)(UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA⑧)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);噪"令類似物，諸如氟達(dá)4立濱(fludarabine)、6畫巰基噤呤(mercaptopurine)、碌b。米噪p令(thiamiprine)、石克鳥(niǎo)嘌p令(thioguanine);嘧口定類似物，i者如安西他濱(ancitabine)、阿4U包普(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿香(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿芬(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表疏雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲;各司坦(trilostane);葉酸#卜充劑，i者如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酉旨(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉臾(aminolevulinicacid);恩尿口密卩定(eniluracil);安吖。定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);;也石壽酰胺(defosfamide);3也美可辛(demecolcine);i也p丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋4妄(elliptiniumacetate);依4乇才各魯(etoglucid);硝酸4家；羥脲(hydroxyurea);香菇多4唐(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)矛口安絲菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇蒽酉昆(mitoxantrone);莫咪達(dá)醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);他柔比星(pirambicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴胼(procarbazine);PSK多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐口南(sizofiran);蟲(chóng)累^走4者(spirogermanium);纟田交《連孑包菌§同酉吏(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、祝孑包菌素(verrucarin)A、桿孑包菌素(roridin)A和蟲(chóng)它行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達(dá)卡巴漆(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);口底泊澳烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)、帕利他塞的清蛋白改造的納米顆粒劑型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE));苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-碌u鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine);巰基嘌口令(mercaptopurine);曱氨口萊p令(methotrexate);4白類4以4勿，i者長(zhǎng)口順4白(cisplatin)和卡4白(carboplatin);長(zhǎng)春;咸(vinblastine)(VELBAN);柏(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);長(zhǎng)春新石咸(vincristine)(ONCOVIN);奧沙利鉑(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶口令(aminopterin);j尹本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);類視黃酸類(retinoids),諸如視黃酸(retinoicacid);任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍組合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)組合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制可促進(jìn)癌生長(zhǎng)的激素效果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LYl17018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON);抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD);功能為抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)(LUPRON⑧和ELIGARJD⑧)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯峻(vorozole)(RIVISOR)、來(lái)曲唑(letrozole)(FEMARA⑧)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、依替膦酸鈉(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑來(lái)膦酸/唑來(lái)膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)(ZOMETA)、阿倫膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID⑧)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環(huán)核香胞嘧咬類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制牽涉異常(abherant)細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核芬酸，諸如例如PKC-ouRaf、H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE⑧疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；拓樸異構(gòu)酶l抑制劑(例如LURTOTECAN);rmRH(例如ABARELIX);lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);COX-2抑制劑，諸如塞來(lái)考昔(CELEBREX;4-(5-(4-曱基苯基)-3-(三氟曱基)-lH-吡唑-l-基)苯磺酰胺；及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"是由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長(zhǎng)激素，諸如人生長(zhǎng)激素、N-曱硫氨酰人生長(zhǎng)激素、和牛生長(zhǎng)激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促印泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-(3;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E);胎盤衍生生長(zhǎng)因子(P1GF);血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)(例如PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD);整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF-a;血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF),諸如TGF-a和TGF-(3;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactor);干擾素，諸如干擾素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF),諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF(G-CSF);白介素(IL),諸如IL-1、IL畫la、IL-lf3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL畫13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20-IL-30;分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宮珠蛋白；制瘤素M(OSM);腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-(3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。術(shù)語(yǔ)"前體藥物"在用于本申請(qǐng)時(shí)指與母藥(parentdrug)相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降那绑w或衍生物形式藥用活性物質(zhì)。參見(jiàn)例如Wilman，"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14,pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)和Stellaa/.,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",D/recfec/Z>wgDe//ver_y，Borchardtda/.，ed.，pp.247-267,HumanaPress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/S旨前體藥物、含石克代磷酸鹽/S旨前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含(3-內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚远鵁o(wú)細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物。可衍生為本發(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。"血管發(fā)生因子，，或"血管發(fā)生劑，，指刺激血管發(fā)育，例如促進(jìn)血管發(fā)生(angiogenesis)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、血管穩(wěn)定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長(zhǎng)因子。例如，血管發(fā)生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF家族、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGF)、T正配體(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等。它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、CTGF及其家族成員、及TGF-a和TGF-卩。參見(jiàn)例如幻agsbrunandD，Amore,iev.P/zj^/o/.53:217-39(1991);StreitandDetmar,O"cogewe22:3172-3179(2003);Ferrara&Alitalo，TVa^reMe&c/"e5(12):1359-1364(1999);Tonini"a/.，O"coge"e22:6549-6556(2003)(例如列舉血管發(fā)生因子的表l);和Sato,/"f.』a/w.Owco/.8:200-206(2003)。"抗血管發(fā)生劑，，或"血管發(fā)生抑制劑，，指或是直接或是間接抑制血管發(fā)生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、阻斷VEGF受體信號(hào)傳導(dǎo)的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinibmalate)、AMG706)?？寡馨l(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮4也丁(endostatin)等。參見(jiàn)侈'H口KlagsbmnandD，AmoreTev.尸/7"/0/.53:217-39(1991);StreitandDetmar22:3172-3179(2003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表3);Ferrara&AlitaloiVamre7We&.c&e5(12):1359-1364(1999);Tonini等(9"cogewe22:6549-6556(2003)(例如列舉抗血管發(fā)生因子的表2);及Sato,/"AC7/".8:200-206(2003)(例如列舉臨床試驗(yàn)中所使用的抗血管發(fā)生劑的表l)。術(shù)語(yǔ)"免疫抑制劑"在用于本文時(shí)指作用于抑制或掩蓋本文所治療哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。此類藥劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見(jiàn)美國(guó)專利No.4,665,077);非類固醇抗炎藥(NSAID);更昔洛韋(gandclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質(zhì)激素諸如皮質(zhì)醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎藥諸如環(huán)加氧酶抑制劑、5-脂加氧酶抑制劑、或白三烯受體拮抗劑；噤呤拮抗劑，諸如硫唑。票呤(azathioprine)或麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolatemofetil,MMF);烷化劑，諸如環(huán)磷酰胺；溴隱亭(bromocryptine);達(dá)4L峻(danazol);氨苯石風(fēng)(dapsone);戊二醛(其掩蓋MHC抗原，如美國(guó)專利No.4,120,649中所記載的)；針對(duì)MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A;類固醇，諸如皮質(zhì)類固醇或糖皮質(zhì)類固醇或糖皮質(zhì)激素類似物，例如潑尼^Kprednisone)、曱基潑尼4公龍(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone);二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如曱氨蝶呤(methotrexate)(口月良或皮下)；#5氯p奎(hydroxycloroquine);杉p氮石黃p比口定(sulfasalazine);來(lái)氟米特(leflunomide);細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體抗體，包括抗干擾素-a、-(3或-y抗體、抗肺瘤壞死因子-a抗體(infliximab或adalimumab)、抗TNFa免疫粘附素(依那西普(etanercept))、抗腫瘤壞死因子-P抗體、抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-l抗體，包括抗CDlla和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；泛T抗體(pan-Tantibody),優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(1990年7月26日公布的WO1990/08187);鏈激酶；TGF-卩；鏈道酶；來(lái)自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T細(xì)胞受體(Cohenefa/.,美國(guó)專利No.5,114,721);T細(xì)胞受體片段(Offner"a/"5We"ce251:430-432(1991);WO1990/11294;Ianeway，A^wre341:482(1989);及WO1991/01133);及T細(xì)胞受體抗體(EP340,109),諸如T10B9。47"非類固醇抗炎藥，，或"NSAID"的例子有乙酰水楊酸(acetylsalicylicacid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、p引咮美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin),包括其鹽和衍生物，等。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"在用于本文時(shí)指與多肽直接或間接偶聯(lián)的可檢測(cè)化合物或組合物。標(biāo)記物自身可以是可檢測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢測(cè)的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與多肽核酸的天然來(lái)源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開(kāi)的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該多肽的細(xì)胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)。抗性腫瘤本發(fā)明部分地基于導(dǎo)致腫瘤對(duì)至少包含VEGF拮抗劑的癌癥療法產(chǎn)生抗性的細(xì)胞和分子事件的發(fā)現(xiàn)。本文中顯示了在造血骨髓衍生細(xì)胞的募集和肺瘤針對(duì)抗VEGF治療的抗性的發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)。免疫系統(tǒng)包括造血細(xì)胞，其包括紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和髓樣譜系細(xì)胞。這些細(xì)胞類型都來(lái)自于相同的多能干細(xì)胞。在成人中，血細(xì)胞生成在骨髓中發(fā)生，在那里干細(xì)胞偶爾分裂以產(chǎn)生更多的干細(xì)胞(自我更新)和多種定型的節(jié)因子主要由周圍的基質(zhì)細(xì)胞和在其它組織中產(chǎn)生，包括例如集落刺激因子(CSF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、白介素3(IL3)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)、粒細(xì)胞CSF(G-CSF)、巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)和STEEL因子。已經(jīng)提出在癌癥患者中免疫系統(tǒng)的改變促進(jìn)了免疫系統(tǒng)發(fā)起對(duì)癌癥的成功攻擊的能力喪失或降低，因而容許腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)展。參見(jiàn)例如Gabrilovich"。/.，AntibodiestoVascularEndothelialGrowthFactorEnhancestheEfficacyofCancerImmunotherapybyImprovingEndogenousDendriticCellFunction.C//mWC匿erie廳rc/z5:2963-2970(1999)。腫瘤產(chǎn)生的因子可以導(dǎo)致異常的髓細(xì)胞生成，而且可導(dǎo)致對(duì)針對(duì)腫瘤的48免疫應(yīng)答的承卩制。參見(jiàn)例3口KusmartsevandGabrilovich，Immaturemyeloidcellsandcancer-associatedimmunesuppression.Cawer7www"o//w附w"o^ra.51:293-298(2002)。本發(fā)明提供了來(lái)自腫瘤抗性細(xì)胞和CDllb+Grl+細(xì)胞、可牽涉針對(duì)VEGF拮抗劑治療的腫瘤抗性的特定因子。例如，抗性腫瘤的鹽分級(jí)也產(chǎn)生了可以直接地或間接地提供抗性的因子。參見(jiàn)例如本文中的附圖8和實(shí)施例2。CD11b+Gr1+髓樣細(xì)胞的動(dòng)員(mobilization)和活化可代表針對(duì)抗VEGF治療的抗性發(fā)生中的兩個(gè)步驟。本發(fā)明還提供了組合治療方法和組合物，其與抗VEGF—起使用了靶向髓樣細(xì)胞的藥劑和化療劑，如本文所述。這些組合治療可以抑制腫瘤血管發(fā)生和生長(zhǎng)，和/或延遲抗VEGF抗性的發(fā)作。CDllb+Grl+細(xì)胞CD11/CD18家族在結(jié)構(gòu)和遺傳上與更大的、調(diào)控細(xì)胞粘附相互作用的、受體的整聯(lián)蛋白家族相關(guān)，所述細(xì)胞粘附相互作用包括胚胎發(fā)生、對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、和細(xì)胞分化(Hynes,R.O.,Ce〃48:549-554(1987);Kishimotoda/.,Jdv./mmwm/.46:149-182(1989)，Kishimotoefa/.，Ce〃48:681-690(1987);及Ruoslahti"a/.，6W露e238:491-497(1987))。整聯(lián)蛋白是一類跨膜異二聚體，其包含非共價(jià)相結(jié)合的cx亞基和(3亞基。P亞基一般能夠與超過(guò)一種a亞基結(jié)合，而且享有共同P亞基的異二聚體已經(jīng)被分類為整聯(lián)蛋白群體中的亞家族(LarsonandSpringer,Structureandflmctionofleukocyteintegrins，/麵畫/.Tev.114:181-217(1990))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CD11/CD18家族的整聯(lián)蛋白分子和它們的細(xì)胞配體介導(dǎo)多種細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，尤其是在炎癥中。這些蛋白質(zhì)已經(jīng)被證明對(duì)免疫系統(tǒng)中的粘附功能是關(guān)鍵的(KishimotoWa/,,Wv./mm畫/.46:149-182(1989))。針對(duì)LFA-l的單克隆抗體已經(jīng)顯示了阻斷白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附(Dustin"a/.,J.Ce〃.腺.107:321-331(1988);Smith"a/.，C""./騰W,83:2008-2017(1989))以及氺卩制T細(xì)月包活4匕(Kuypersda/.,/mmw"o/.,140:461(1989))、抗原特異性CTL殺傷所需的偶聯(lián)物(conjugate)形成(Kishimotoda/.,Jdv./附/;w"o/.46:149-182(1989))、T細(xì)胞增殖(Davignon^a/.,J./ww謂o/.127:590-595(1981))和NK細(xì)月包殺傷(Krenskya/.,//mmw"o/.131:611416U983);i。粘附受體分子的CD11/CD18家族包括四種高度相關(guān)的細(xì)胞表面糖蛋白LFA-1(CDlla/CD18)、Mac陽(yáng)l(CDllb/CD18)、p150,95(CDllc/CD18)和(CDlld/CD18)。這些異二聚體的每一種具有獨(dú)特的oc鏈(CDlla、b、c或d)和不變的(3鏈(CD18)。位于白細(xì)胞上的CD18整聯(lián)蛋白可以結(jié)合在血管內(nèi)皮和其它細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)，從而介導(dǎo)白細(xì)胞粘附和跨內(nèi)皮遷移(transendothelialmigration)。LFA-1存在于除了巨噬細(xì)胞的子集之外的所有成熟白細(xì)胞的表面，而且被認(rèn)為是主要的淋巴樣整聯(lián)蛋白。Mac-l、pl50.95和CDlld/CD18的表達(dá)主要限于髓樣譜系的細(xì)胞(其包括嗜中性細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞)。CDllb+Grl+是也見(jiàn)于髓樣細(xì)胞上的標(biāo)志物。已經(jīng)提出，在成熟的和不成熟的髓樣細(xì)胞之間的平衡是癌癥的指標(biāo)，而且在漸進(jìn)性腫瘤生長(zhǎng)中，平衡朝向不成熟的髓樣細(xì)胞移動(dòng)，伴有樹(shù)突細(xì)胞的目禾口功能的F務(wù)孑氐。參見(jiàn)例^口KusmartsevandGabrilovich,Immaturemyeloidcellsandcancer-associatedimmunesuppression.CV"er/wmw"o/7m附w"o/7erfl.51:293-298(2002)。例如，通過(guò)在攜瘤小鼠中使不成熟的髓樣細(xì)胞分化來(lái)移動(dòng)平孑軒，改善了癌癥疫苗的歲丈果。參見(jiàn)Kusmartseva/.，All々纖-RetinoicAcidEliminatesImmatureMyeloidCellsfromTumor-bearingMiceandImprovestheEffectofVaccination.Ca"cer7g化flrc/;63:4441-4449(2003)。還觀察到，在癌癥患者中，循環(huán)中的VEGF水平與不成熟髓樣細(xì)胞數(shù)目增加有關(guān)。參見(jiàn)Almandd,Clinicalsignificanceofdefectivedendriticcellsdifferentiationincancer.CV/w.Qwceri饑6:1755(2000)。本文顯示了，CDllb+Grl+髓樣細(xì)胞的動(dòng)員和活化可導(dǎo)致針對(duì)抗VEGF治療的抗性。還顯示了，從攜瘤小鼠分離的骨髓衍生CDllb+Grl+髓樣細(xì)胞可以賦予腫瘤以針對(duì)抗VEGF治療的抗性，而且來(lái)自抗VEGF抗性(而不是抗VEGF敏感性腫瘤)的條件化培養(yǎng)基刺激CDllb+Grl+細(xì)胞的遷移。本發(fā)明還提供了用于診斷對(duì)VEGF拮抗劑治療有抗性的腫瘤的方法和組合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法比較測(cè)試和參考細(xì)胞群體中一種或多種CDllb+Gtl+或胂瘤抗性核酸的表達(dá)水平。本文公開(kāi)的序列信息，與本領(lǐng)域已知的核酸檢測(cè)方法一起，容許檢測(cè)和比較各種已公開(kāi)的轉(zhuǎn)錄物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法比較具有抗性腫瘤的受試者的脾臟診斷大小和參考脾臟大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考脾臟大小是當(dāng)所述受試者沒(méi)有腫瘤時(shí)或當(dāng)所述受試者對(duì)VEGF拮抗劑治療敏感時(shí)所述受試者的脾臟大小。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考脾臟大小是沒(méi)有腫瘤的其他受試者的平均脾臟大小或具有敏感性腫瘤的其他受試者的平均脾臟大小。脾臟大小可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于非侵入性的成像技術(shù)，諸如超聲波、超聲波照相術(shù)、一維超聲波照相術(shù)(us)、放射性核素掃描、計(jì)算斷層照相術(shù)(CT)和/磁共纟展成^象。參見(jiàn)例如Yangefa/.，155(1):47-52(1991)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法比較具有抗性腫瘤的受試者中腫瘤的血管表面積和參考血管表面積。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括提供測(cè)試細(xì)胞群體，其包括至少一個(gè)能夠表達(dá)一種或多種如下分子的細(xì)胞，所述分子是編碼蛋白質(zhì)的核酸或是所述蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP和/或DRRTP。"能夠表達(dá)"意思是所述基因以完整的形式存在于所述細(xì)胞中并且可以^皮表達(dá)。如果存在，那么然后檢測(cè)一種、一些或所有序列的表達(dá)，并測(cè)量。使用已知序列的數(shù)據(jù)庫(kù)條目或芯片制造商提供的序列信息，可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)來(lái)檢測(cè)(如果表達(dá))和測(cè)量序列。例如，與編碼Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP的核酸對(duì)應(yīng)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)條目?jī)?nèi)的序列可以用于構(gòu)建探針，用于在例如Northem印跡雜交分析或特異性地且優(yōu)選定量地?cái)U(kuò)增特定核酸序列的方法中檢測(cè)相應(yīng)的RNA序列。又例如，所述序列可以用于構(gòu)建引物，用于在例如基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法諸如基于反轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中特異性地?cái)U(kuò)增編碼Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的核酸。當(dāng)基因表達(dá)方面的改變與基因擴(kuò)增或刪除有關(guān)時(shí)，測(cè)試和參考群體中的序列比較可以通過(guò)比較測(cè)試和參考細(xì)胞群體中所檢查的DNA序列的相對(duì)量來(lái)進(jìn)行。表達(dá)也可以在蛋白質(zhì)水平來(lái)測(cè)量，即通過(guò)測(cè)量本文所述基因產(chǎn)物所編碼的多肽的水平。此類方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如基于針對(duì)基因所編碼的蛋白質(zhì)的抗體的免疫測(cè)定法。然后，將測(cè)試細(xì)胞群體中Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的一種或多種的表達(dá)水平與來(lái)自參考細(xì)胞群體的一種或多種細(xì)胞中所述序列的表達(dá)水平相比較。測(cè)試和對(duì)照細(xì)胞群體中序列的表達(dá)可以使用任何本領(lǐng)域公認(rèn)的用于比較核酸序列表達(dá)的方法來(lái)進(jìn)行比較。例如，表達(dá)可以使用GENECALLINGRTM.方法來(lái)比較，記載于美國(guó)專利No.5,871,697和Shimketsefa/.，A^.所ofec/z"o/.17:798-803。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，測(cè)量編碼Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP和/或DRRTP的一種、兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、十五種或更多、20種或更多、25種或更多、或所有的序列的表達(dá)。參考細(xì)胞群體包括一個(gè)或多個(gè)能夠表達(dá)所測(cè)量的Gr1、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列、且其所比較的參數(shù)(例如對(duì)VEGF拮抗劑的敏感性)是已知的細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，如果其表達(dá)水平在參考細(xì)胞群體中的Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP轉(zhuǎn)錄物的水平的小于或等于2.0倍的因數(shù)之內(nèi)變動(dòng)，那么測(cè)試細(xì)胞群體中的Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列被認(rèn)為是在表達(dá)水平上與參考細(xì)胞群體中的Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的表達(dá)水平相當(dāng)。在多種實(shí)施方案中，如果其表達(dá)水平相對(duì)于參考細(xì)胞群體的變動(dòng)超過(guò)參考細(xì)胞群體中相應(yīng)Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的表達(dá)水平的2.0倍，那么測(cè)試細(xì)胞群體中的Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP任選地，比較測(cè)試細(xì)胞群體和參考細(xì)胞群體之間差異表達(dá)的序列可以針對(duì)對(duì)照核酸來(lái)進(jìn)行，所述對(duì)照核酸的表達(dá)獨(dú)立于所測(cè)量的參數(shù)或條件。測(cè)試平。適合的對(duì)照核酸可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。測(cè)試細(xì)胞群體可以是任何數(shù)目的細(xì)胞，即一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，而且可以是體外、體內(nèi)或離體提供的。在某些實(shí)施方案中，參考細(xì)胞群體中的細(xì)胞衍生自與測(cè)試細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)盡可能相似的組織類型。在某些實(shí)施方案中，對(duì)照細(xì)胞衍生自與測(cè)試細(xì)胞相同的受試者，例如衍生自測(cè)試細(xì)胞的來(lái)源區(qū)域鄰近的區(qū)域，或衍生自所述受試者對(duì)VEGF拮抗劑治療敏感時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，參考細(xì)胞群體衍生自多種細(xì)胞。例如，參考細(xì)胞群體可以是來(lái)自早先測(cè)試的細(xì)胞的表達(dá)樣式的數(shù)據(jù)庫(kù)，所述細(xì)胞的VEGF拮抗劑的腫瘤敏感性治療是已知的。評(píng)估腫瘤敏感性CDllb+GRl+髓樣細(xì)胞的募集、及本文所述URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的一些的表達(dá)與腫瘤對(duì)VEGF拮抗劑治療的抗性有關(guān)。因而，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了評(píng)估受試者中VEGF拮抗劑敏感性的方法，其中VEGF拮抗劑敏感性是指用抗VEGF治療腫瘤的能力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法包括提供來(lái)自所述受試者的一種或多種測(cè)試細(xì)胞群體，其包括能夠表達(dá)一種或多種與編碼URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP的核酸同源的核酸序列的細(xì)胞。將序列的表達(dá)與參考細(xì)胞群體相比較?？梢允褂萌魏螀⒖技?xì)胞群體，只要所述參考細(xì)胞群體中的細(xì)胞的VEGF拮抗劑敏感性狀態(tài)是已知的。比較可以對(duì)同時(shí)地或在時(shí)間上不同的時(shí)間測(cè)量的測(cè)試和參考樣品來(lái)進(jìn)行。后者的例子是使用匯編的表達(dá)信息，例如序列數(shù)據(jù)庫(kù)，其集合了關(guān)于敏感性狀態(tài)已知的細(xì)胞中已知序列的表達(dá)水平的信息。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，參考細(xì)胞群體是對(duì)CDllb+Grl+髓樣細(xì)胞富集的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，參考細(xì)胞群體是對(duì)腫瘤細(xì)胞富集的。診斷或標(biāo)志物集合本發(fā)明還提供了標(biāo)志物集合來(lái)鑒定抗性腫瘤。在某些實(shí)施方案中，這些標(biāo)志物集合在試劑盒中提供，用于評(píng)估腫瘤對(duì)VEGF拮抗劑治療的敏感性或抗性。例如，標(biāo)志物集合可以包括兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、十五或更多、二十種或更多、或整種集合的分子。所述分子是編碼蛋白質(zhì)的核酸或是蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有改變的表達(dá)和/或活性且選自以下Notch2、DMD8、MCP-1、ITGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM陽(yáng)CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IL10-R1、Erb-2.1、窖蛋白3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecaml、Tlr3、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、CD14、expi、I1-13R、LDLR、TLR-l、RLF、Endo-Lip、S0CS13、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、水通道蛋白-1、SCF38、APOE、FABP、IL-11R、IL-IRII、IFNTM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌載體膜l、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、血管生成素樣-6、Eph-RA7、腦信號(hào)蛋白Vlb、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子5、密蛋白-18、MDC15、ECM、ADAMTS7B、NCAM-140、纖連蛋白III型、WIP、CD74、ICAM-2、Jaggedl、ltga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFbIEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-1、CD48、E-選擇素、IL-15、細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制物4、Cytor4、CX3CR1、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、清除受體A型、巨噬細(xì)胞C-型凝集素、Pigr3、巨噬細(xì)胞SRT-1、G蛋白偶聯(lián)受體、ScyA7、IL-1R2、IL-1可誘導(dǎo)蛋白、IL-l卩、ILIX前體(ILIXPrecuror)、TGF-B、FIZZ1、Wfsl、TP14A、EMAP、SULF-2、細(xì)胞外基質(zhì)2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-a、肝配蛋白B1、SPARC樣l和腦信號(hào)蛋白A。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子衍生自CDllb+Grl+細(xì)胞，而且包括例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBSl和Crea7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子衍生自抗性腫瘤，而且包括例如MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。調(diào)控物及其用途VEGF、Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRTRP的調(diào)控物指調(diào)控這些蛋白質(zhì)的活性的分子，例如激動(dòng)劑和拮抗劑。術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑，，用于指本發(fā)明蛋白質(zhì)的肽和非肽類似物，以及特異性結(jié)合此類本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體，只要它們具有提供激動(dòng)劑信號(hào)的能力。術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑"是在蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用的環(huán)境中定義的。在某些實(shí)施方案中，激動(dòng)劑具有本發(fā)明的天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，例如對(duì)于VEGF。術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"用于指具有抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的能力的分子。拮抗劑可以通過(guò)例如對(duì)蛋白質(zhì)活性的抑制來(lái)評(píng)估。治療用途根據(jù)本發(fā)明期待的是，調(diào)控物的組合(包括VEGF拮抗劑、髓樣細(xì)胞減少劑和其它藥劑)可以用于治療多種贅生物或非贅生性疾患。在一個(gè)實(shí)施方54案中，調(diào)控物(例如VEGF拮抗劑、髓樣細(xì)胞減少劑、URCGP和URRTP的拮抗劑("本發(fā)明的拮抗劑"))用于抑制抗性腫瘤的癌細(xì)胞或腫瘤生長(zhǎng)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，調(diào)控物(例如DRCGP和DRRTP的激動(dòng)劑("本發(fā)明的激動(dòng)劑))用于抑制癌細(xì)胞或腫瘤生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明期待的是，本發(fā)明的拮抗劑也可以用于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在某些實(shí)施方案中，一種或多種抗癌劑可以與本發(fā)明的拮抗劑和/或本發(fā)明的激動(dòng)劑一起施用來(lái)抑制癌細(xì)胞或腫瘤生長(zhǎng)。還參見(jiàn)本文中標(biāo)題為組合療法的小節(jié)。下所記載的那些?？梢杂帽景l(fā)明的拮抗劑治療的非贅生性疾患包括但不限于例如不良或異常肥大、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、4艮屑病、銀屑病斑塊、結(jié)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、來(lái)自心肌梗死的水腫、糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病(包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生癥、新生血管性青光眼、年齡相關(guān)的黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成、角(angle)的新血管形成(虹膜)、眼的新血管病、血管的再狹窄、動(dòng)靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、曱狀腺增生(包括格雷夫斯氏病(Grave'sdisease))、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺部炎癥、急性肺損傷/ARDS、敗血病、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、惡性肺部積液(malignantpulmonaryeffusion)、腦水腫(例如，與急性中風(fēng)/閉合頭部損傷/夕卜傷相關(guān)的)、滑液的炎癥、RA中的血管翳形式、骨化性肌炎、肥厚性骨形成(hypertropicboneformation)、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、頑固性腹水、多嚢性卵巢病、子宮內(nèi)膜異位癥、第三體液分區(qū)疾病(3rdspacingoffluiddiseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮的類纖維瘤(uterinefibroid)、早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD(克羅恩氏病(Crohn'sdisease)和潰瘍性結(jié)腸炎)、腎臟同種移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不良或異常組織塊生長(zhǎng)(tissuemassgrowth)(非癌癥)、肥胖、脂肪組織塊生長(zhǎng)、血友病關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生長(zhǎng)的抑制、Osler-Weber綜合癥、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生癥、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎相關(guān)的)和合胸腔積液。組合療法如上所述，本發(fā)明提供了組合療法，其中VEGF拮抗劑與另一種療法組合施用。例如，VEGF拮抗劑與本發(fā)明的不同藥劑或拮抗劑(和/或本發(fā)明的激動(dòng)劑)組合施用來(lái)治療針對(duì)抗VEGF治療有抗性的腫瘤。在某些實(shí)施方案中，別的藥劑(例如髓樣細(xì)胞減少劑、抗癌癥劑或治療劑、抗血管發(fā)生劑、或抗新血管形成治療劑)也可以與抗VEGF和本發(fā)明的不同拮抗劑組合施用來(lái)治療多種贅生性或非贅生性疾患。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述贅生性或非贅生性疾患的特征在于與針對(duì)VEGF拮抗劑治療有抗性的異?；虿涣佳馨l(fā)生有關(guān)的病理性疾患。本發(fā)明的拮抗劑可以與對(duì)那些目的有效的另一種藥劑連續(xù)地或組合地施用，或是在同一組合物中或是作為分開(kāi)的組合物。或者/另外，可以施用本發(fā)明的多種拮抗劑、藥劑和/或激動(dòng)劑。本發(fā)明的拮抗劑和/或藥齊"例如髓樣細(xì)胞減少劑)的施用可以同時(shí)進(jìn)行，例如作為單一組合物或作為使用相同或不同施用路徑的兩種或多種不同組合物?；蛘?另外，施用可以連續(xù)地、按任何次序進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，范圍從數(shù)分鐘到數(shù)天、到數(shù)周、到數(shù)月的間隔可以存在于兩個(gè)或多個(gè)組合物的施用之間。例如，可以先施用VEGF拮抗劑，接著是本發(fā)明的不同的拮抗劑或藥劑(例如髓樣細(xì)胞減少劑)(除了VEGF拮抗劑之外)。然而，還涵蓋同時(shí)施用或先施用本發(fā)明的不同的拮抗劑或藥劑。與VEGF拮抗劑組合施用的治療劑的有效量將處于醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷之內(nèi)。進(jìn)行劑量施用和調(diào)整來(lái)實(shí)現(xiàn)待治療疾患的最大管理。劑量將另外取決于這些因素，諸如待使用的治療劑的類型和所治療的特定的患者。VEGF拮抗劑的合適劑量就是當(dāng)前使用的那些，而且由于VEGF拮抗劑和本發(fā)明的不同拮抗劑的組合作用(協(xié)同作用)可以降低。在某些實(shí)施方案中，抑制物的組合強(qiáng)化了單一抑制物的效力。術(shù)語(yǔ)"強(qiáng)化"是指在其常用的或批準(zhǔn)的劑量下治療劑的效力方面的改善。還參見(jiàn)本文中標(biāo)題為藥物組合物的小節(jié)。與癌癥相關(guān)的抗血管發(fā)生療法是一種癌癥治療策略，針對(duì)抑制腫瘤血管的發(fā)育，腫瘤血管是提供營(yíng)養(yǎng)物以支持腫瘤生長(zhǎng)所需的。由于血管發(fā)生牽涉原發(fā)性胂瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移二者，本發(fā)明所提供的抗血管發(fā)生治療能夠抑制腫瘤在原發(fā)位點(diǎn)的贅生性生長(zhǎng)以及預(yù)防腫瘤在繼發(fā)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，因而容許用其它治療劑攻擊肺瘤。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗癌劑或治療劑是抗血管發(fā)生劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗癌劑是化療劑。許多抗血管發(fā)生劑已經(jīng)被鑒定并且是本領(lǐng)域已知的，包括本文中列出的那些，例3口在定義中歹'J出的，以及由例j口CarmelietandJain,iVafww407:249-257(2000);Ferraraa/.,胸,iev/ei>wgD&cov"3:391-400(2004);及Sato,乂C7/".O歸Z.8:200-206(2003)所列出的。還參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)US20030055006。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑與抗VEGF中和性抗體(或片段)和/或另一種VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑組合使用，所述VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑包括但不限于例如可溶性VEGF受體(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經(jīng)氈蛋白(neuropillin)(例如NRP1、NRP2))片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制物、針對(duì)VEGF的反義策略、針對(duì)VEGF或VEGF受體的核酶、VEGF的拮抗性變體；以及它們的任何組合。或者/另外，在VEGF拮抗劑和其他本發(fā)明藥劑之外，兩種或更多血管發(fā)生抑制劑可以任選地共施用給患者。在某些實(shí)施方案中，一種或多種別的治療劑(例如抗癌劑)可以與本發(fā)明的藥劑、VEGF拮抗劑和/或抗血管發(fā)生劑組合施用。在本發(fā)明的某些方面，可用于使用本發(fā)明拮抗劑的組合腫瘤治療的其它治療劑包括其它癌癥療法(例如手術(shù)、放射治療(例如牽涉照射或施用放射性物質(zhì))、化學(xué)療法、使用本文所列的和本領(lǐng)域已知的抗癌劑的治療、或其組合)。或者/另外，結(jié)合本文公開(kāi)的相同的或兩種或更多不同的抗原的兩種或更多抗體可以共施用給患者。有時(shí)，可能有益的是還向患者施用一種或多種細(xì)胞因子?；焺┰谀承┓矫妫景l(fā)明提供了阻斷或降低抗性腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其通過(guò)向易患癌癥或診斷有癌癥的患者施用有效量的VEGF拮抗劑和本發(fā)明的拮抗劑以及一種或多種化療劑。多種化療劑可以在本發(fā)明的組合治療方法中使用。所涵蓋的化療劑的例示性的和非限制性的列表在本文"定義"中提供。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的是，適合劑量的化療劑一般將接近臨床療法中所早就采用的那些，在所述臨床療法中化療劑被單獨(dú)地或與其它化療劑組合地施用。劑量的變異將有可能存在，這取決于所治療的疾患。施行治療的醫(yī)師將能夠確定各個(gè)受試者的適合劑量。復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)本發(fā)明還提供了用于抑制或預(yù)防復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法和組合物。復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)用于描述這樣一種狀況，其中正在接受一種或多種當(dāng)前可用療法或者用一種或多種當(dāng)前可用療法(例如癌癥療法，諸如化療、放療、手術(shù)、激素療法和/或生物學(xué)療法/免疫療法、抗VEGF抗體療法，特別是針對(duì)特定癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案)治療過(guò)的患者在臨床上不足以治療該患者，或者該患者不再?gòu)闹委熤薪邮苋魏斡幸嫘Ч?，使得這些患者需要?jiǎng)e的有效療法。在用于本文時(shí)，該用語(yǔ)也可以指"非響應(yīng)性/不應(yīng)性"患者的狀況，例如這描述了對(duì)治療有響應(yīng)但遭遇副作用的患者、發(fā)生抗性的患者、對(duì)治療不響應(yīng)的患者、對(duì)治療的響應(yīng)不令人滿意的患者等。在各種實(shí)施方案中，當(dāng)癌細(xì)胞的數(shù)目沒(méi)有顯著減少或癌細(xì)胞的數(shù)目增加了，或者腫瘤的大小沒(méi)有顯著縮小或腫瘤的大小增大了，或者癌細(xì)胞的數(shù)目或大小未能進(jìn)一步減少或縮小時(shí)，則癌癥是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。癌細(xì)胞是否是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的確定可以通過(guò)用于分析治療對(duì)癌細(xì)胞的有效性的本領(lǐng)域已知的任何方法、在體內(nèi)或在體外進(jìn)行，在上下文中使用"復(fù)發(fā)性"或"不應(yīng)性"或"非響應(yīng)性，，的本領(lǐng)域接受的含義。針對(duì)抗VEGF治療有抗性的腫瘤是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)的例子。本發(fā)明提供了阻斷或降低受試者中復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其通過(guò)施用本發(fā)明的一種或多種拮抗劑來(lái)阻斷或降低所述受試者中的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，所述拮抗劑可以在癌癥治療劑之后施用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑與癌癥治療(例如化療)同時(shí)地施用?；蛘?另外，拮抗劑治療與另一種癌癥治療交替，其可以以任何次序進(jìn)行。本發(fā)明還涵蓋施用一種或多種抑制性抗體來(lái)抑制傾向于患上癌癥的患者中癌癥的發(fā)作或復(fù)發(fā)的方法。一般而言，所述受試者正在接受癌癥治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥治療是使用抗血管發(fā)生劑(例如VEGF拮抗劑)的治療?？寡馨l(fā)生劑包括本領(lǐng)域已知的那些和本文定義中所見(jiàn)的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗血管發(fā)生劑是抗VEGF中和性抗體或片段(例如人源化A4.6.1，AVASTIN(Genentech，SouthSanFrancisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利6,582,959、6,884,879、6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美國(guó)專利申請(qǐng)20030206899、20030190317、20030203409和20050112126;Popkov，Jow廠"a/o/7;www"o/og/cfl/Me/ZzO(is1288:149-164(2004);及WO2005012359。別的藥劑可以與VEGF拮抗劑和本發(fā)明拮抗劑組合施用，用于阻斷或降低復(fù)發(fā)性肺瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)，例如參見(jiàn)本文中標(biāo)題為組合療法的小節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑或降低Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、URCGP或URRTP的表達(dá)的其它治療劑被施用來(lái)反轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)某些生物學(xué)的(例如拮抗劑，其是抗VEGF抗體)、激素的、放射的或化學(xué)治療的藥劑的抗性或降低的敏感性，從而使所述癌細(xì)胞對(duì)一種或多種這些藥劑重新敏感，其然后可以被施用(或繼續(xù)施用)來(lái)治療或管理癌癥，包括預(yù)防轉(zhuǎn)移?？贵w本發(fā)明的抗體包括本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體和本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體的抗體片段。本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)包括但不限于VEGF、Grl、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP。在某些方面，本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)是針對(duì)例如VEGF、Grl、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP的抗體，見(jiàn)本文中才是供的一般性多肽或蛋白質(zhì)信息。本發(fā)明的抗體進(jìn)一步包括作為抗血管發(fā)生劑或血管發(fā)生抑制劑的抗體，作為髓樣細(xì)胞減少劑的抗體，VEGF、Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP的抗體，作為抗癌劑的抗體，或本文所述其它抗體。例示性的抗體包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗體片段、多特異性抗體、異源偶聯(lián)抗體、多價(jià)抗體、效應(yīng)器功能工程改造的抗體等。多克隆抗體本發(fā)明的抗體可以包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是熟練技術(shù)人員知道的。例如，本發(fā)明的多克隆抗體通過(guò)在動(dòng)物中一次或多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來(lái)生成。使用雙功能或衍生化藥劑(例如馬來(lái)酰亞胺苯曱?；腔牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R'NONR(其中R和R'是不同的烴基))將相關(guān)抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)(例如匙孑U戚血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)偶聯(lián)可能是有用的。通過(guò)將例如10(Vg或5iiig蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，將動(dòng)物針對(duì)本發(fā)明的分子、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，通過(guò)多個(gè)部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量l/5-l/10的肽或偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度達(dá)到平臺(tái)(plateau)。典型的是，將動(dòng)物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來(lái)制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑(諸如明礬)來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。單克隆抗體針對(duì)本文所述抗原的單克隆抗體可以^吏用最初由Kohlerda/.,A^&w256:495(1975)記載的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法(美國(guó)專利No.4,816,567)來(lái)制備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物(諸如倉(cāng)鼠或短尾猴(macaquemonkey))以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜叉瘤纟田月包(Goding,Afowoc/owfl/j"/7'6。(iz'es:/V/wc^/as戶racO'ce,pp.59-103,AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基典型的含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃噤呤鳥(niǎo)噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃噪呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。典型的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感的。在這些骨髓瘤細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心、(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)獲4尋的MOPC-21和MPC-11小鼠胂瘤及可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor，/mww"o/.133:3001(1984);Brodeur"a/.,Mo"oc/owa//Vo^cricw7fec/m—as4^//c加bra,pp.51-63,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)。對(duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)液測(cè)定針對(duì)例如VEGF、Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-1、MIP-la、CDllb、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP、DRRTP、或血管發(fā)生分子的單克隆抗體的生成?？赏ㄟ^(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法(諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA))測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。此類技術(shù)和測(cè)定法是本領(lǐng)域知道的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)例如MunsonandPollard,歷ocAew.107:220(1980)的Scatchard分析來(lái)測(cè)定。在鑒定到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過(guò)有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding,Mowoc/oa/爿w/7.6o(i/es.,尸〃>7">/&flw<i/Va"/ce,pp.59-103,AcademicPress,1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程(諸如例如蛋白A-Sepharose、雍磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開(kāi)。單克隆抗體還可以通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備，諸如美國(guó)專利No.4,816，567中所記載的。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序(例如通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞可充當(dāng)此類DNA的來(lái)源。一旦分離，可將DNA置入表達(dá)載體，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入原本不生成免疫^(guò)^蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞)以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成?？贵w的重組生產(chǎn)在下文中有更詳細(xì)的描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從使用McCaffertyefa/.，A^ww348:552-554(19卯)所記載的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)分離抗體或抗體片l殳。Clacksonefa/.,胸臟352:624-628(1991)和Marksda/"J.贏編.222:581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過(guò)鏈改組(Marks"歷o/rec/z"o/ogy10:779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse&a/.，^c/^sWay.21:2265-2266(1993)),生成高親和力(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。還可以修飾DNA,例如通過(guò)替代即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替換同源鼠序歹'J(美國(guó)專利No.4,816,567;Morrison"a/.,7Va"^cad5W.81:6851(1984))，或通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)連接。典型的是，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域，以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，其包含對(duì)一種抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。人源化抗體和人抗體本發(fā)明的抗體可以包括人源化抗體或人抗體。人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作"輸入，，殘基，它們典型的取自"輸入"可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事白勺方法進(jìn)4亍(Jonesefa/"7Vafwe321:522-525(1986);RiechmanndaZ"7Vafwre332:323-327(1988);Verhoeyen"a/"Sc〖e廳239:1534-1536(1988)),通過(guò)用嚙齒類CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因而，此類"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利No.4,816,567),其中基本上少于整個(gè)人可變域用來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體典型的是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來(lái)自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。用于構(gòu)建人源化抗體的人可變域(包括輕鏈和重鏈二者)的選擇對(duì)于降低抗原性非常重要。依照所謂的"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對(duì)已知的人可變域序列的整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然后接受與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(FR)(SimsW"/.,J//wtw"o/.151:2296(1993);Chothiaefa/.，/Afo/.所o/.196:901(1987))。另一種方法4吏用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter"a/.,尸rac.iVaf/.5W.OS^89:4285(1992);PrestaWa/.,//mmw"o/.151:2623(1993))。一種典型的方法，通過(guò)使用親本和人源源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而荻得期望抗體特征，諸如對(duì)耙抗原的親和力提高。一般而言，CDR殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響?；蛘撸F(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在4元原J丈擊后生成人4元體。參見(jiàn)例:VJakobovitsefa/.,尸roc.7Va;7.^c^/.Sc/.OS^卯:2551(1993);Jakobovitsda/"胸匿362:255-258(1993);Bmgge羅nn"y麼&/廳諷7:33(1993);及Duchosalefa/.胸廳355:258(1992)。人抗體也可以衍生自p盡菌體展示庫(kù)(Hoogenboom&a/.,Mo/.所o/.,227:381(1991);Marksefa/.,JAio/.傷o/.，222:581-597(1991);Vaughan"a/.A/^mm腸fec/z14:309(1996》。人抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，包括噬菌體展示庫(kù)(HoogenboomandWinter,J!Afo/.所o/.227:381(1991);Marksdo/.，Mo/,歷o/.222:581(1991))。依照這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀碼框的方式克隆入絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種格式進(jìn)行，綜述參見(jiàn)例如Johnson,KS.andChiswell,DJ.，C&所o/3:564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來(lái)源可用于噬菌體展示。例如，Clackson"a/.,A/afwre352:624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫(kù)分離得到大量不同的抗條唑酮抗體。例如通63過(guò)基本上遵循Marksda/.,乂Mo/.222:581-597(199l)或Griffith"a/.,12:725-734(1993)記載的技術(shù)，可以自未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,565,332和5，573，905。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Colefl/.，Afowoc/owa/<3m/G2wcerTTzera/;/,AlanR.Liss,p.77(1985)及Boerner"a/.,J/mmw"o/.147(l):86-95(1991》。還可以由體外激活的B細(xì)胞來(lái)生成人抗體(參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,567,610和5,229，275)。抗體片段本發(fā)明還包括抗體片段。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)衍生這些片段(參見(jiàn)例如Morimotodfl/.,/owr"a/o/S/oc/remfca/朋(i所op/z戸'ca/Md/zcxis24:107-117(1992);Brennana/.,SWwce229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫(kù)中分離抗體片段?；蛘撸芍苯訌拇竽c桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Cartera/.，歷o/Tec/2"ofogy10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)將是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見(jiàn)WO93/16185;美國(guó)專利No.5,571,894;及美國(guó)專利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)、缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們適于在體內(nèi)使用時(shí)降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建sFv融合蛋白以生成效應(yīng)器蛋白質(zhì)在sFv的氨基或羧基末端的禹蟲(chóng)合。參見(jiàn)爿"&7)oc(v五"g77een'"g,Borrebaeck編,見(jiàn)上文。4元體片段還可以是"線性抗體"，例如如美國(guó)專利No.5,641,870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。多特異性抗體(例如雙特異性的)本發(fā)明的抗體還包括例如多特異性抗體，其具有對(duì)至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性。盡管此類分子通常只會(huì)結(jié)合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb),但是此表述在用于本文時(shí)涵蓋具有額外特異性的抗體(諸如三特異性抗體)。BsAb的例子包括一個(gè)臂針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原而另一個(gè)臂針對(duì)細(xì)胞毒性觸發(fā)分子的BsAb,諸如抗FcyRI/抗CD15、抗pl85HER2/Fc丫RI11(CD16)、抗CD3/抗惡性B細(xì)胞(1D10)、抗CD3/抗pl85HE"、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細(xì)胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結(jié)腸癌)、抗CD3/抗黑色素細(xì)胞刺激激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗CD3;—個(gè)臂特異性結(jié)合腫瘤抗原而一個(gè)臂結(jié)合毒素的BsAb,諸如抗皂草素/抗Id-l、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A鏈、抗千擾素-a(IFN-a)/抗雜交瘤獨(dú)特型、抗CEA/抗長(zhǎng)春花生物堿類；用于轉(zhuǎn)變酶活化的前體藥物的BsAb,諸如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其催化磷酸絲裂霉素前體藥物轉(zhuǎn)變成絲裂霉素醇)；可用作溶纖劑的BsAb，諸如抗血纖維蛋白/抗組織型纖溶酶原激活物(tPA)、抗血纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA);用于將免疫復(fù)合物靶向細(xì)胞表面受體的BsAb，諸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcyRI、FcyRII或FcYRin);用于傳染病治療的BsAb,諸如抗CD3/抗單純皰滲病毒(HSV)、抗T細(xì)胞受體:CD3復(fù)合物/抗流感、抗FcyR/抗HIV;用于體外或體內(nèi)腫瘤檢測(cè)的BsAb，諸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85H1^/抗半抗原；作為疫苗佐劑的BsAb;及作為診斷工具的BsAb，諸如抗家兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生長(zhǎng)素抑制素/抗物質(zhì)P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗(3-半乳糖苦酶。三特異性抗體的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。雙特異性抗體可以制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab，)2雙特異性抗體)。用于生成雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein"a/.,Atowe305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的規(guī)程披露于WO93/08829及Traunecker"a/.，五MBOJ！10:3655-3659(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和需要時(shí)的免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開(kāi)的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比例沒(méi)有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將想要的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開(kāi)。該方法披露于wo94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見(jiàn)例如SureshMef/20^y五w^ymo/ogv121:210(1986)。依照WO96/27011中記載的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的至少部分CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過(guò)將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈大小相同或相似的補(bǔ)償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物(諸如同二聚體)提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來(lái)制備雙特異性抗體。Brennan"a/.,5We"ce229:81(1985)記載了通過(guò)蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉時(shí)還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸綍跛狨?TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過(guò)巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalabyefa/.,MeA175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開(kāi)分泌每種Fab'片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過(guò)表達(dá)VEGF受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny"a/.，《//mm柳o/.148(5):1547-1553(1992)。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger"a/.,尸rac.A^/.Jcad5W.t/5^90:6444-6448(1993)記載的"雙抗體"技術(shù)提供了生成雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VO，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因而，迫使一個(gè)片段上的VH和Vt結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv)二聚體生成雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(jiàn)Grubere/.,/152:5368(1994)。涵蓋具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt"fl/.,乂/wm腦o/.147:60(1991)。異源偶聯(lián)抗體雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體，它們是本發(fā)明的抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體已經(jīng)建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利No.4,676,980),及用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來(lái)生成異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起4皮露于美國(guó)專利No.4,676,980。多價(jià)抗體本發(fā)明的抗體包括多價(jià)抗體。多價(jià)抗體可以比二價(jià)抗體更快的受到表達(dá)該抗體所結(jié)合抗原的細(xì)胞的內(nèi)在化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易的通過(guò)重組表達(dá)編碼抗體多肽鏈的核酸而生成的、具有三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如四價(jià)抗體)的多價(jià)抗體(IgM類別以外的)。多價(jià)抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成)Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。在這種情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文中優(yōu)選的多價(jià)抗體包含(或由其組成)三個(gè)至約八個(gè)但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。多價(jià)抗體包含至少一條多肽鏈(優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個(gè)或更多可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CH1-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文中的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩條(優(yōu)選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價(jià)抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。效應(yīng)器功能工程改造可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，從而增強(qiáng)例如抗體在治療癌癥中的效力。例如，可向Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，乂人而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或拔_高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)CaronW"/,，乂Exp.7k/^/.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.，J/肌ww"o/.148:2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗肺瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolffda/.,Omcerie"arc/z53:2560-2565(1993)中記載的異雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備?；蛘?，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見(jiàn)Stevensonefa/.,J汕'-C朋cerZ)rMgZ)ew'g773:219-230(1989)。為了延長(zhǎng)抗體的血清半衰期，可如例如美國(guó)專利No.5,739,277中記載的將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"指IgG分子(例如IgG!、IgG2、IgG3或IgGj的Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涵蓋包含本文所述抗體且其偶聯(lián)至細(xì)胞毒劑的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括但不限于例如^Bi、131I、131In、9GY和^Re。可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑上文已有描述。例如，BCNU、鏈佐星(streptozoicin)、長(zhǎng)春新石威、5-氟尿嘧咬、統(tǒng)稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物的藥劑家族(美國(guó)專利5,053,394,5,770,710)、埃斯波霉素類(美國(guó)專利5,877,296)等(還可見(jiàn)本文中化療劑的定義)可以偶聯(lián)至本發(fā)明的抗體或其片段。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)的抗體或其片段。例子包括但不限于例如"'At、13'1、1251、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、川In、Lu的放射性同位素等。在將偶聯(lián)物用于診斷時(shí)，它可包含放射性原子以用于閃爍照相研究，例如""tc或1231,或自旋標(biāo)記物以用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像(MRI))，諸如喊-123、石典-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、4L、錳或鐵。可以以已知方式將放射性標(biāo)記物或其它標(biāo)記物摻入偶4關(guān)物。例如，肽可以生物合成，或者可以通過(guò)化學(xué)氨基酸合成法合成，其中使用牽涉例如以氟-19代替氫的合適氨基酸前體。可以經(jīng)肽中的半胱氨酸殘基來(lái)附著標(biāo)記物，諸如"、或1231、i"Re、^Re和1111！1。可以經(jīng)賴氨酸殘基來(lái)附著釔-90。IODOGEN法(Frakerea/"所oc/zem.說(shuō)c^/;^.Commw".80:49-57(1978))可用于才參入石典-123。參見(jiàn)例長(zhǎng)口Chatal,Mo"oc/o"a/j""6c^/&s/mmM"osc/""grap/2乂CRCPress,1989,其詳細(xì)記載了其它方法。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合性活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌(i^ewcfowo"ayaen^'mwa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油一同(j/ew"tesybraf/Z)毒蛋白、香石沖個(gè)毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(尸/^to/acaawen'c朋a)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP陽(yáng)S)、苦瓜Ofoworafccfc/7ara^/fl)才中制物、麻瘋初于毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹(shù)毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局卩艮曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、豸斤霉素(neomycin)、依i若霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見(jiàn)例如1993年10月28日公布的WO93/21232。可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二酪)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯曱?；?-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可以如Vitettada/.,5Wwce238:1098(1987)中所記載的制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見(jiàn)WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二曱基接頭或含二硫化物接頭(Charidfl/"Owcwie化arc/z52:127-131(1992);姜國(guó)專利No.5,208,020)?；蛘?，可通過(guò)例如重組技術(shù)或肽合成來(lái)生成包含抗VEGF和/或抗本發(fā)明蛋白質(zhì)抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。DNA的長(zhǎng)度可以包含各自編碼偶聯(lián)物兩部分的區(qū)域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區(qū)域分開(kāi)，所述接頭肽不破壞偶聯(lián)物的期望特性。在某些實(shí)施方案中，將抗體與"受體，，(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)以用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對(duì)患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯(lián)的"配體，，(例如親合素)。在某些實(shí)施方案中，在抗體與具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成免疫偶聯(lián)物。美登素和美登木素生物堿類本發(fā)明提供了偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)美登木素生物4^類分子的本發(fā)明抗體。美登木素生物堿類是通過(guò)抑制微管蛋白聚合來(lái)起作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Mqytem^"rrato)分離到(美國(guó)專利No.3,896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登醇S旨(美國(guó)專利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和類似物才皮露于例如美國(guó)專利No.4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4，308，268;4，308，269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。本發(fā)明的抗體可以偶聯(lián)至美登木素生物堿類分子且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿類分子的生物學(xué)活性。每個(gè)抗體分子偶聯(lián)平均3-4個(gè)美登木素生物堿類分子在增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性中顯示出功效，且對(duì)抗體的功能或溶解度沒(méi)有負(fù)面影響，盡管預(yù)計(jì)甚至一個(gè)分子的毒素/抗體也將較之棵抗體的使用增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登木素生物堿類在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可通過(guò)已知技術(shù)合成或從天然來(lái)源分離。例如美國(guó)專利No.5,208,020及上文提及的其它專利和非專利出版物中披露了合適的美登木素生物堿類。在一個(gè)實(shí)施方案中，美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過(guò)修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領(lǐng)域知道許多連接基團(tuán)可用于生成抗體-美登木素生物石威類偶聯(lián)物，包括例如美國(guó)專利No.5'208,020或歐洲專利0425235B1及Charie/。/.，Ca"cw六e化^r/z52:127-131(1992)中所披露的。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，正如上述專利中所披露的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團(tuán)?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體與美登木素生物堿類的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基—4-(N-馬來(lái)酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。典型的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡卩定基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson"a/.,所oc/^肌J173:723-737(1978))和N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡口定基硫代)戊酸酯(SPP),以提供二硫化物連接。根據(jù)連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿類分子的多個(gè)位置。例如，可使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過(guò)與羥基的反應(yīng)來(lái)形成酯連接。反應(yīng)可發(fā)生在具有輕基的C-3位置、用羥甲基修飾的C-14位置、用羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置。在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成連接。加利車霉素另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包含與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子偶聯(lián)的本發(fā)明抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。關(guān)于加利車霉素家族偶聯(lián)物的制備參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296(都屬于美國(guó)Cyanamid公司)?？墒褂玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于y,1、0^、01、n-乙?；?yi1、PSAG和e、(Hinman"a/.，C""cwi&yewr/253:3336-3342(1993);71Lode"a/.，Omceriesewc/z58:2925-2928(1998);及上述授予美國(guó)Cyanamid公司的美國(guó)專利)?？梢耘c抗體偶聯(lián)的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，且不易穿過(guò)質(zhì)膜。因此，這些藥劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細(xì)胞攝取大大增強(qiáng)了它們的細(xì)胞毒性效果。其它抗體修飾本文還涵蓋抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。還可將抗體包載入例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、膠狀藥物投遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米月交嚢)、或并且滴乳狀液。此類4支術(shù)4皮露于7e附Z"gto"k/TjamwcewWca/)SWe"ces,第16版，Osol,A.編,1980。脂質(zhì)體和納米顆粒本發(fā)明的多肽可以配制成脂質(zhì)體。例如，本發(fā)明的抗體可以配制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體通過(guò)本領(lǐng)域已知方法來(lái)制備，諸如Epstein"a/.,Prac.jVo//.Jcad82:3688(1985);Hwang"a/"A^f/.爿cad5W.77:4030(1980);及美國(guó)專利No.4,485,045和4，544,545中所記載的。循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)的脂質(zhì)體披露于美國(guó)專利No.5,013,556。一般而言，脂質(zhì)體的配制和使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。可以用包含磷脂酰膽石威、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過(guò)反相蒸發(fā)法生成特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠過(guò)具有限定孔徑的濾器，以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體?？梢匀鏜artin&a/.,J歷o/.C/7em.257:286-288(1982)中所述，將本發(fā)明抗體的Fab，片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑(諸如多柔比星)。參見(jiàn)Gabizon"a/.，/胸zo"a/Ca鮮r/組81(19):1484(1989)。其它用途本發(fā)明的抗體具有多種功用。例如，本發(fā)明的抗體可用于診斷測(cè)定法，例如用于檢測(cè)特定細(xì)胞、組織或血清中的蛋白質(zhì)表達(dá)，用于癌癥檢測(cè)(例如在檢測(cè)抗性腫瘤中)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體用于選擇用本文提供的方法治療的患者群，例如用于檢測(cè)具有改變的Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、MCP-l、MIP-la、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP表達(dá)的患者?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種診斷測(cè)定技術(shù)，諸如竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定法、直接或間接三明治測(cè)定法、和免疫沉淀測(cè)定法，以異相或同相進(jìn)4亍(Zola，Afowoc/ow"/顛'yMfl畫/0/Tec/zm々腦，CRCPress,Inc.,1987，pp.147-158)。診斷測(cè)定法中所使用的抗體可以用可檢測(cè)模塊(moiety)標(biāo)記?？蓹z測(cè)模塊應(yīng)當(dāng)能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。例如，可檢測(cè)模塊可以是放射性同位素，諸如3仏14C、32P、3、或1251;熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，諸如異硫氰酸焚光素、羅丹明或營(yíng)光素；或酶，諸如44性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域知道的用于將抗體與可檢測(cè)模塊偶聯(lián)的任何方法，包括Hunter"a/.,淑,144:945(1962);Davida/"腸c/z麵勿13:1014(1974);Paina/.,/m扁"o/.Me仇40:219(1981);及Nygren,歷加c/zem.爿mfCyoc/ze肌30:407(1982)中所記載的那些方法。本發(fā)明的抗體還可用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來(lái)源親和純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。在該過(guò)程中，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法將針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體固定化在合適的支持物上，諸如Sephadex樹(shù)脂或?yàn)V紙。然后使固定化抗體接觸含有待純化蛋白質(zhì)的樣品，此后用合適的溶劑清洗支持物，所述溶劑將會(huì)基本上清除樣品中除結(jié)合至固定化抗體的蛋白質(zhì)以外的所有物質(zhì)。最后，用另一種合適的溶劑清洗支持物，所述溶劑將會(huì)從抗體上釋放蛋白質(zhì)。對(duì)本發(fā)明多肽的共價(jià)修飾本發(fā)明多肽(例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)、本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體、多肽拮抗劑片段、融合分子(例如免疫融合分子)等)的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果適用，它們可通過(guò)化學(xué)合成或者通過(guò)酶促或化學(xué)切割所述多肽來(lái)生成。多肽的其它類型共價(jià)修飾如下引入分子，即通過(guò)將多肽的目標(biāo)氨基酸殘基與能夠與選定側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化試劑起反應(yīng)，或者通過(guò)將經(jīng)修飾的氨基酸或非天然的氨基酸摻入正在增長(zhǎng)的多肽鏈，例如Ellmana/.，她仇202:301-336(1991);Noren^a/"Scz.認(rèn)e244:182(1989);及美國(guó)專利申請(qǐng)出版物20030108885和20030082575。半胱氨酰殘基最常見(jiàn)的是與a-卣代乙酸(鹽/酯)(和相應(yīng)的胺)起反應(yīng)，諸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧曱基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰殘基還可以通過(guò)與溴代三氟丙酮、a-溴代-l3-(5-imidozoyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(鹽/酯)、N-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、曱基2-吡。定基二硫化物、對(duì)氯汞苯曱酸(鹽/酯)、2-氯汞基-4-硝基酚或(4-)氯-7-賄基苯并-2-氧-l,3-二唑起反應(yīng)而衍生化。組氨酰殘基通過(guò)與二乙基焦碳酸(鹽/酯)在pH5.5-7.0起反應(yīng)而衍生化，因?yàn)榇嗽噭┫鄬?duì)特異于組氨酰側(cè)鏈。對(duì)溴苯曱酰曱基溴也是有用的；此反應(yīng)通常在pH6.0的0.1M二曱胂酸鈉中進(jìn)行。賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸肝或其它羧酸酐起反應(yīng)。用這些試劑的衍生化具有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基電荷的效果。適于衍生化含a-氨基的殘基的其它試劑包括亞氨基酯，諸如皮考啉亞氨酸曱酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡口多醛酯、吡,醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、鄰曱基異脲、2,4-戊二酮、和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸(glyoxylate)的反應(yīng)。精氨酰殘基通過(guò)與一種或數(shù)種常規(guī)試劑起反應(yīng)來(lái)修飾，其中有苯曱酰曱醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化由于胍官能基的高pKa所以需要在堿性條件下進(jìn)行反應(yīng)。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團(tuán)以及精氨酸s-氨基起反應(yīng)。酪氨酰殘基可以進(jìn)行特異性修飾，對(duì)在酪氨酰殘基中引入光譜標(biāo)記物特別感興趣，其通過(guò)與芳香族重氮化合物或四硝基曱烷起反應(yīng)。最常見(jiàn)的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基曱烷分別形成鄰乙?；野滨７N類和3-硝基衍生物。用1251或1311碘化酪氨酰殘基以制備帶標(biāo)記物的蛋白質(zhì)以用于放射免疫測(cè)定法。羧基側(cè)基團(tuán)(天冬氨?；蚬劝滨?通過(guò)與碳二亞胺(R-NON-R，)起反應(yīng)而進(jìn)行選擇性修飾，碳二亞胺中的R和R，是不同的烴基，諸如l-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽(yáng)離子-4,4-二曱基戊基)碳二亞胺。此外，通過(guò)與銨離子起反應(yīng)將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)變成天冬酰胺酰和谷酰胺酰殘基。谷酰胺酰和天冬酰胺酰殘基常常脫酰胺，分別成為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基在中性或堿性條件下脫酰胺。這些殘基的脫酰胺形式落入本發(fā)明的范圍。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈a-氨基的曱基化(T.E.Creighton，Prato'ra.'iSYracweMo/ecw/ar/Vope"/es,W.H.Freeman&Co"SanFrancisco,pp.79-86(1983)),N-末端胺的乙?；?，及任何C-末端羧基的酰胺化。另一類共價(jià)修飾牽涉向本發(fā)明的多肽化學(xué)或酶促偶聯(lián)糖苷。這些規(guī)程的優(yōu)點(diǎn)在于它們不需要在具有N-或O-連接糖基化的糖基化能力的宿主細(xì)胞中生成多肽根據(jù)所使用的偶聯(lián)模式，可以將糖附著于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基，諸如半胱氨酸的游離巰基，(d)游離羥基，諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的游離羥基，(e)芳香族殘基，諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法記載于1987年9月11日公布的WO87/0533O和AplinandWriston，C7CCW,iev,所0c/2e肌pp.259-306(1981)。本發(fā)明多肽上存在的任何碳水化合物模塊的消除可通過(guò)化學(xué)或酶促方法實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)的脫糖基化作用需要將多肽暴露于化合物三氟曱磺酸或等效化合物。此處理導(dǎo)致除連接糖(linkingsugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化學(xué)的脫糖基化作用記載于Hakimuddina/.,J/r/i^/oc/zew.5/o//z>w.259:52(1987)牙口Edgeda/"所0c/2e肌118:131(1981)。碳水化合物模塊(例如抗體上的)的酶促切割可通過(guò)使用多種內(nèi)切和外切;瞎苷酶來(lái)實(shí)現(xiàn)，記載于Thotakura"a/.，Me仇￡"，0/.138:350(1987)。本發(fā)明多肽的另一類共價(jià)修飾包括將多肽連接至多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美國(guó)專利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4，791,192或4,179,337所列方式。載體、宿主細(xì)胞和重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的多肽可以使用易于獲得的技術(shù)和材料而重組生產(chǎn)。為了重組生產(chǎn)本發(fā)明的多肽，例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)，本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體，例如抗VEGF抗體，分離編碼它的核酸，并插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。編碼本發(fā)明多肽的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序。例如，對(duì)編碼單克隆抗體的DNA分離和測(cè)序，例如通過(guò)使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷S殳探針。可以獲得許多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。信號(hào)序列構(gòu)件本發(fā)明的多肽不僅可以直接重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽典型的是成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端處的信號(hào)序列或具有特異性切割位點(diǎn)的其它多肽。所選擇的異源信號(hào)序列典型的是受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即受到信號(hào)肽酶切割)的。對(duì)于不識(shí)別和加工天然多肽信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，所述信號(hào)序列用例如選自下組的原核信號(hào)序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。為了酵母分泌，天然信號(hào)序列可以用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導(dǎo)序列)、酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列、或WO90/13646中記載的信號(hào)替代。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，例如單純皰疹gD信號(hào)。將此類前體區(qū)(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼本發(fā)明多肽的DNA連接。復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件表達(dá)和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。眾所周知多種細(xì)菌、酵母和病毒的此類序列。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2|1質(zhì)粒起點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。一4殳而言，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件(SV40起點(diǎn)的使用通常可能只是因?yàn)樗缙趩?dòng)子)。選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的必需營(yíng)養(yǎng)物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個(gè)例子利用藥物來(lái)阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選4奪方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個(gè)例子是那些能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II(典型的是靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因)、腺普脫氨酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等。例如，首先通過(guò)將所有轉(zhuǎn)化子在含有曱氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一種竟?fàn)幮赞卓箘?的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型DHFR時(shí)，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卯巢(CHO)細(xì)胞系。或者，可以通過(guò)細(xì)胞在含有針對(duì)選擇標(biāo)志的選擇劑(諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)來(lái)選擇經(jīng)編碼本發(fā)明多肽、野生型DHFR蛋白質(zhì)和另一種選擇標(biāo)志(諸如氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參閱美國(guó)專利No.4,965,199。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒Yrp7中的fr;^基因(Stinchcomba/.，Atoww282:39(1979))。^7基因?yàn)槿狈υ谏彼嶂猩L(zhǎng)能力的酵母突變抹(例如ATCCNo.44076或PEP4-1)提供了選擇標(biāo)志。Jones,Ge""/w85:12(1977)。酵母宿主細(xì)胞基因組中存在^;7損傷隨之提供了用于通過(guò)在缺乏色氨酸時(shí)的生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似的，用攜帶丄^2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)足丄ew2缺陷型酵母菌一朱(ATCC20，622或38,626)。此外，衍生自1.6nm環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維氏酵母屬酵母。或者，報(bào)導(dǎo)了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。VandenBerg,歷a/rec/7"0/0w8:135(1990)。還披露了用于由克魯維氏酵母屬的工業(yè)用菌抹分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達(dá)載體。Fleer"a/"5/。/Tec/wo/柳9:968-975(1991)。啟動(dòng)子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體通常包含受到宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，而且它與編碼本發(fā)明多肽的核酸可揭:作連接。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括p/ia4啟動(dòng)子、(3-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子(諸如tac啟動(dòng)子)。然而，其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還將包含與編碼本發(fā)明多肽的DNA可操作連接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。已知真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游大約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添力。polyA尾的信號(hào)。所有這些序列合適的插入真核表達(dá)載體。適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。作為具有通過(guò)生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的其它酵母啟動(dòng)子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步記載于EP73,657。酵母增強(qiáng)子也可以有利的與酵母啟動(dòng)子一起使用。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄本發(fā)明多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40))基因組、異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子)、及熱4木克啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子的控制，倘若此類啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。美國(guó)專利No.4,419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利No.4,601,978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來(lái)自單純皰滲病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下表達(dá)人(3-干擾素cDNA還可參見(jiàn)Reyes"A^wre297:598-601(1982)?；蛘?，可以使用勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體來(lái)提高高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。典型的是，使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子、和胨^病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件還可參見(jiàn)Yaniv，7Va/we297:17-18(1982)?？梢詫⒃鰪?qiáng)子剪接入載體，位于多肽編碼序列的5'或3'位置，但是典型的位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼本發(fā)明多肽的mRNA的非翻i奪部分中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見(jiàn)WO94/11026及其中披露的表達(dá)載體。宿主細(xì)胞的選4奪和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的編碼本發(fā)明多肽的DNA的宿主細(xì)胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(&cfehc/n'a)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(Eco")、腸桿菌屬C&7fera6acfe。、歐文氏菌屬(五nv/w'a)、克雷伯氏菌屬(^:/e^/e〃a)、變形菌屬CPra&w》、沙門氏菌屬(;S"a/wcwe〃a)1"列^口鼠4方寒沙、門氏菌(6"a/mo"e〃a(y尸/n'wwn'"附)、沙、雷氏菌屬(5ferra/7'a)例^口粘質(zhì)沙雷氏菌(iSferra^2jW3rc^scam1)、志賀氏菌屬(i57w'ge〃(3)、以及芽孢桿菌屬(Sa"7/0諸如枯草芽孢桿菌(及^&///力和地衣芽孢桿菌(及//c/^w/or做'力(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(尸"^fomo"oy)諸如銅綠假單胞菌CPaerwg/"osa)、和鏈霉菌屬(S/re;to/^caO。典型的是，大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31，446)，盡管其它菌抹諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,S:3"和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是編碼本發(fā)明多肽的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒糖酵母(Sacc/zaramycescerev^ae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌抹且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母克魯纟隹酵母屬(A7wyverawyce"宿主，諸^口例3口乳酸克魯維酵母(K/acfc)、脆壁克魯維酵母(尺.#^//&)(^10:l2，424)、保加利亞克魯維酵母(K6w/gan'cw)(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(Kw/cferaw7)(ATCC24,178)、AT.wa/"7(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(Kdrawp/n7aram)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(KAermoto/erara)和馬克思克魯維酵母(K.mwx/am^);亞羅酵母屬(JamWa)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(尸Zc/n'a/xwton、)(EP183,070);假絲酵母屬(CW"W&);瑞氏木霉(7>/c/7c^ferma(EP244,234);斗24造月永孑包菌(A^w/w;oracra^a);i午旺酵母屬(6b/zHW7w'cw;)^力，諸如5"c/7vra朋/cwycay禾口絲狀真菌，諸^口仿B口月永孑包菌屬(vVeMros;ora)、青霉屬(尸em'cz'〃/ww)、彎頸霉屬(7b/j^oc/a(iz'i/m)、和曲霉屬(y^^rgz7/w)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(Am^w/am)和黑曲霉G4.m'取r)。適于表達(dá)糖基化本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無(wú)脊推動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒抹和變體及相應(yīng)的允許昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞，它們來(lái)自諸如草地夜蛾GS^^o//era/ri^i^m^)(毛蟲(chóng))、》矣及4尹蟲(chóng)丈"ec/es"egv/7")(蟲(chóng)文子)、白纟丈j尹蟲(chóng)丈"^/esa/6op/"w力(蟲(chóng)丈子)、,J復(fù)果蟲(chóng)龜(IV(W(9//n7ame/a"ogoster)(果蟲(chóng)U禾口家蠶(5om6jxwon〕等宿主。眾可獲得多種病毒抹用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖力Wogra;^aca^/brm'caNPV的L-l變體和家蠶5omxmoWNPV的Bm-5抹，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。然而，脊推動(dòng)物細(xì)胞得到最多關(guān)注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊推動(dòng)物細(xì)胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎系(293或?yàn)榱嗽趹腋∨囵B(yǎng)中生長(zhǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，GrahamGe"腸/.36:59(1977));幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK,ATCCCCL10);中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO,UrlaubWa/"尸rac.Ato/.^cad6W.L/iX477:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather,所o/.i甲rad23:243-251(1980》；猴腎細(xì)胞(CVl,ATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138,ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(HepG2,HB8065);小鼠乳瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Mather"a/.,^f""a^80WUcac/.5W,383:44-68(1982);MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝瘤系(HepG2)。用上文所述用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)更改的常類L營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM,Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham"a/.,TWeA.58:44(1979);Barnesda/"Jwa/.5z.oc/zem.102:255(1980);美國(guó)專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5，122,469;WO卯/03430;WO87/00195;或美國(guó)專利Re.30,985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件(諸如溫度、pH等)就是先前為表達(dá)而選擇用于宿主細(xì)胞的，這對(duì)于普通技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。多肽純化本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)可以從受試者中回收。在使用重組技術(shù)時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成本發(fā)明的多肽，或者直接分泌入培養(yǎng)基?？梢詮呐囵B(yǎng)物的培養(yǎng)液或者從宿主細(xì)胞溶胞液回收本發(fā)明的多肽。如果是膜結(jié)合的，那么可以用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或通過(guò)酶促切割從膜碎，諸如凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎或細(xì)胞裂解劑。以下規(guī)程是合適的蛋白質(zhì)純化規(guī)程的例子通過(guò)離子交換柱上的分級(jí)；乙醇沉淀；反相HPLC;硅土上的層析，肝素SEPHAROSETM上的層析，陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(諸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE;硫酸銨沉淀；利用例如S印hadexG-75的凝膠過(guò)濾；用蛋白ASepharose柱去除雜質(zhì)諸如IgG;及用金屬螯合柱結(jié)合帶表位標(biāo)簽形式的本發(fā)明多肽。可以采用多種蛋白質(zhì)純化方法，此類方法是本領(lǐng)域已知的，而且記載于1"列3口Deutscher，AfeAcxiy/"jE>2^ymo/ogy,182(1990);Scopes,/Vo&z'"尸Mri/C(3打'cw../V/"")/^尸A3c,/ce,Springer-Verlag，NewYbrk(1982)。戶斤選捧的純化步驟取決于例如所用純化方法的本質(zhì)和所生成的具體本發(fā)明多肽。例如，可以使用例如羥磷灰石層析、凝月交電泳、透4斤和親和層析來(lái)純4匕由細(xì)胞制備的抗體組合物，典型的純化技術(shù)是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純4b基于人yl、Y2或Y4重《連的4元體(Lindmark"a/.,J/mww"o/.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人y3(Guss"a/.，五7^S(9乂5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)(諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時(shí)間。若抗體包含Ch3結(jié)構(gòu)域，則可使用BakerbondABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如上文所述的。還可參見(jiàn)Carter"a/.,A'o/rec/ww/o^10:163-167(1992),其記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的規(guī)程。藥用配制劑通過(guò)將具有期望純度的分子(例如多肽)與任選的藥學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16片反，Osol,A.編，1980)混合來(lái)制備本文所述和依照本發(fā)明使用的本發(fā)明藥劑(VEGF拮抗劑、髓樣細(xì)胞減少劑、URCGP拮抗劑、URRTP拮抗劑、DRCGP激動(dòng)劑、DRRTP激動(dòng)劑、或抗癌劑)及其組合的治療用配制劑，以凍干劑型或水溶液的形式貯存。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，而且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯曱酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它82碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)?；钚猿煞诌€可包載入例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、膠狀藥物投遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米月交嚢)、或粗滴乳狀液。此類技術(shù)4皮露于例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.編，1980。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可容易的通過(guò)使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有本發(fā)明多肽的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-鞋基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠囊化抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？蒦^艮據(jù)相關(guān)機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S^t，那么可通過(guò)#"飾巰基、由酸性:容液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。還可參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.6,699,501,其記載了具有聚電解質(zhì)覆蓋物的膠嚢。還涵蓋可以通過(guò)基因療法將本發(fā)明的藥劑(例如VEGF拮抗劑、髓樣細(xì)胞減少劑、化療劑或抗癌劑)導(dǎo)入受試者?；虔煼ㄖ竿ㄟ^(guò)給受試者施用核酸進(jìn)行的療法。在基因療法的應(yīng)用中，為了實(shí)現(xiàn)治療上有效的基因產(chǎn)物的體內(nèi)合成，例如為了替換缺陷基因，將基因引入細(xì)胞。"基因療法"包括通過(guò)單次處理實(shí)現(xiàn)持久效果的傳統(tǒng)基因療法及牽涉一次或重復(fù)施用治療上有效的DNA或mRNA的基因治療劑施用二者。反義RNA和DNA可作為治療劑用于阻斷某些基因的體內(nèi)表達(dá)。早已顯示可以將短反義寡核苷酸輸入細(xì)胞，在那里它們起抑制劑的作用，盡管由于細(xì)胞膜對(duì)它們的攝取受限制因而它們的胞內(nèi)濃度低(Zamecnikefa/.，7Vaf/.Jcad"6^83:4143-4146(1986》?？梢孕揎椆押塑账嵋栽鰪?qiáng)它們的攝取，例如通過(guò)用不帶電荷的基團(tuán)取代它們帶負(fù)電荷的磷酸二酯基團(tuán)。關(guān)于基因療法的方法的一般性綜述參閱例如Goldspiela/.,C//"/ca/P/zarmacy12:488-505(1993);WuandWu,^/c^/zenapy3:87-95(1991);Tolstoshev,」朋.iev.尸/w/tw"co/.7fea.co/.32:573-596(1993);Mulligan,5Wewce260:926-932(1993);MorganandAnderson,Jw.A.oc/zem.62:191-217(1993);及May,7YB7EC^11:155-215(1993)。重組DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
普遍知道的、可以使用的方法記載于Ausubel等人編(1993)Cwwe"/1/Votoco/sz>Mo/ecw/arjBz'o/ogy,JohnWiley&Sons,NY牙口Kriegler(1990)7>朋*/-awe/Er/7/ms7'o"，^Z^orato/^M3"wfl7,StocktonPress,NY。有多種技術(shù)可用于將核酸引入活細(xì)胞。所述技術(shù)可才艮據(jù)核酸是在體外轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)的細(xì)胞還是在體內(nèi)轉(zhuǎn)移入預(yù)期宿主的細(xì)胞而變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯^鼓注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。當(dāng)前優(yōu)選的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒(典型的是逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染和病毒外殼蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau7>e"*z>腺ec/z"o/，11:205-210(1993》。例如，體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂類有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在基因療法中使用病毒載體的例子可參閱Clowese/a/.，JC7/"./"ve"93:644-651(1994》Kiemda/,，B/ood83:1467-1473(1994);SalmonsandGunzberg，//w廳"Ge"e777erap_y4:129-141(1993);GrossmanandWilson,Q/r.QpZ".z>Gew幼'cs朋(iZ)eve/.3:110-114(1993);Bout"a/.，//wmw7T7era;^5:3-10(1994);RosenfeldW5We"ce252:431-434(1991);Rosenfelda/.，Ce〃68:143-155(1992);Mastrangeli"a/,，乂/m^W.91:225-234(1993);及Walshda/.,尸roc.5bc.Exp.S/o/.Med204:289-300(1993)。在有些情況中希望與靶向靶細(xì)胞的藥劑(諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異性的抗體、針對(duì)靶細(xì)胞上受體的配體等)一起提供核酸來(lái)源。若采用脂質(zhì)體，則可以使用與胞吞作用有關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)靶向和/或促進(jìn)攝取，例如對(duì)特定細(xì)胞類型有向性的衣殼蛋白或其片段、針對(duì)在循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、靶向胞內(nèi)定位并延長(zhǎng)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的胞吞作用的技術(shù)記載于例如Wuda/.,J歷o/.Cfem.262:4429-4432(1987)和Wagnerda/.,尸rac.A^/.^cad5W."&487:3410-3414(1990)。關(guān)于基因標(biāo)記和基因療法方案的綜述參閱Andersond5Wewce256:808-813(1992)。劑量和施用依照已知方法將本發(fā)明的藥劑(VEGF拮抗劑、髓4羊細(xì)胞減少劑、化療劑或抗癌劑)施用于人類患者，諸如靜脈內(nèi)施用(像推注或持續(xù)一段時(shí)間的連續(xù)輸注)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入路徑，和/或皮下施用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療牽涉組合施用VEGF拮抗劑和一種或多種髓樣細(xì)胞減少劑或化療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在別的抗癌劑，例如一種或多種不同的抗血管發(fā)生劑、一種或多種化療劑等。本發(fā)明還涵蓋施用多種抑制劑，例如針對(duì)同一抗原的多種抗體或針對(duì)本發(fā)明不同蛋白質(zhì)的多種抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，與VEGF拮抗劑和/或一種或多種髓樣細(xì)胞減少劑一起施用不同化療劑的混合物。組合施用包括使用分開(kāi)的配制劑或單一藥物配制劑的共施用，和/或任一次序的順次施用。例如，VEGF拮抗劑可以在施用髓樣細(xì)胞減少劑或化療劑之前、之后、交替，或者可以同時(shí)給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，有一段時(shí)間所有(兩種或更多)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性。對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，本發(fā)明藥劑的適宜劑量取決于上文定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、施用抑制劑是用于預(yù)防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對(duì)抑制劑的響應(yīng)、及主治醫(yī)師的判斷。將抑制劑一次性或者在一系列治療中適當(dāng)?shù)氖┯糜诨颊?。在組合治療方案中，本發(fā)明的組合物以治療有效量或治療協(xié)同量施用。在用于本文時(shí)，治療有效量指導(dǎo)致所針對(duì)疾病或疾患得到減輕或抑制的本發(fā)明組合物的施用量和/或VEGF拮抗劑和一種或多種其它治療劑的共施用量。藥劑組合的施用效果可以是疊加的。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用的效果是協(xié)同效應(yīng)。治療協(xié)同量指協(xié)同的或顯著的減輕或消除與特定疾病有關(guān)的狀況或癥狀所必需的VEGF拮抗劑和一種或多種其它治療劑(例如髓樣細(xì)胞減少劑、化療劑或抗癌劑)的量。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，大約lpg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)VEGF拮抗劑或髓樣細(xì)胞減少劑、化療劑、或抗癌劑是施用于患者的初始候選劑量，無(wú)論是例如通過(guò)一次或多次分開(kāi)施用，或者是通過(guò)連續(xù)輸注。典型每曰劑量的范圍可以為大約l(ig/kg到大約100mg/kg或者更多，取決于上述因素。對(duì)于持續(xù)數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)給藥，根據(jù)疾患，治療維持到直至發(fā)生期望的疾病癥狀抑制。然而，其它劑量方案可能也是有用的。典型的是，臨床醫(yī)師將會(huì)施用本發(fā)明的分子，直至劑量達(dá)到提供所需生物學(xué)效應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法來(lái)容易的監(jiān)測(cè)本發(fā)明療法的進(jìn)展。例如，血管發(fā)生抑制劑(例如抗VEGF抗體，諸如AVASTIN⑧(Genentech))的制備和劑量給藥方案可以依照制造商的說(shuō)明書(shū)使用，或者由熟練從業(yè)人員憑經(jīng)驗(yàn)確定。在另一個(gè)例子中，此類化療劑的制備和劑量給藥方案可以依照制造商的說(shuō)明書(shū)使用，或者由熟練從業(yè)人員憑經(jīng)驗(yàn)確定。化療的準(zhǔn)備和劑量纟合藥方案還記載于C/2ewof/zera;^Serv/ceM.C.Perry,Williams&Wilkins,Baltimore,MD(1992)。治療功效本發(fā)明治療的功效可以通過(guò)評(píng)估贅生性或非贅生性病癥中常用的多種終點(diǎn)來(lái)測(cè)量。例如，癌癥治療可以通過(guò)例如但不限于腫瘤消退、腫瘤重量或大小收縮、距進(jìn)展的時(shí)間、存活持續(xù)時(shí)間、無(wú)進(jìn)展存活、整體響應(yīng)率、響應(yīng)持續(xù)時(shí)間、生活質(zhì)量、蛋白質(zhì)表達(dá)和/或活性來(lái)評(píng)估。因?yàn)楸疚乃隹寡馨l(fā)生劑靶向肺瘤血管結(jié)構(gòu)而不必是贅生性細(xì)胞本身，所以它們代表了一類獨(dú)特的抗癌藥，并因此可以要求獨(dú)特的對(duì)藥物的臨床應(yīng)答的測(cè)量和定義。例如，二維分析中大于50%的腫瘤收縮是宣告響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)截留。然而，本發(fā)明的抑制劑可以引起對(duì)轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散的抑制而沒(méi)有原發(fā)瘤的收縮，或者可以僅僅發(fā)揮抑制腫瘤效果。因而，可采用測(cè)定治療功效的方法，包括例如測(cè)量血管發(fā)生的血漿或尿液標(biāo)志物和通過(guò)放射學(xué)成像測(cè)量響應(yīng)。制品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含可用于治療或診斷上文所述病癥的物質(zhì)的制品。所述制品包括容器、標(biāo)簽和包裝插頁(yè)。合適的容器包括例如藥瓶、藥管、注射器等。所述容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑86料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述容器裝有有效治療所述疾患的組合物，可以具有無(wú)菌存取口(例如所述容器可以是帶有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或藥瓶)。所述組合物中的至少一種活性藥劑是VEGF調(diào)控劑，且至少一種第二活性劑是髓樣細(xì)胞減少劑和/或化療劑。容器上或與容器有關(guān)的標(biāo)簽指明該組合物用于治療所選擇的疾患。所述制品可進(jìn)一步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述容器裝有作為檢測(cè)抗性肺瘤的診斷劑的標(biāo)志物集合。所述組合物中的至少一種藥劑是用于檢測(cè)Grl、嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶、CD19、CD90、CDllc、URCGP、URRTP、DRCGP和/或DRRTP的標(biāo)志物。容器上或與容器有關(guān)的標(biāo)簽指明該組合物用于診斷對(duì)VEGF拮抗劑治療有抗性的腫瘤。本發(fā)明的制品可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場(chǎng)出發(fā)需要的其它物質(zhì)，包括別的活性劑、其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。實(shí)施例應(yīng)當(dāng)理解，在此描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于例示目的，根據(jù)這些將為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供各種修改或變化，它們包括在本申請(qǐng)的精神和范圍、以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實(shí)施例l:通過(guò)CDllb+Grl+髓樣細(xì)胞賦予的針對(duì)抗VEGF治療的胂瘤抗性調(diào)查了導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)性腫瘤針對(duì)抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)治療的抗性的細(xì)胞和分子事件。發(fā)現(xiàn)了在骨髓衍生細(xì)胞的募集和針對(duì)抗VEGF治療的腫瘤抗性的發(fā)生之間的相關(guān)性。肺瘤混合實(shí)驗(yàn)證明了從攜帶抗VEGF抗性(但不是抗VEGF敏感性)腫瘤的小鼠的骨髓或腫瘤分離的CD11b+Gr1+細(xì)胞足以賦予針對(duì)抗VEGF治療的抗性。在體外，來(lái)自抗VEGF抗性(但不是抗VEGF敏感性胂瘤)的條件化培養(yǎng)基刺激了CDllb+Grl+細(xì)胞的遷移。CDllb+Grl+細(xì)胞向原發(fā)性腫瘤的募集代表了介導(dǎo)針對(duì)抗VEGF治療的抗性的細(xì)胞機(jī)制。肺瘤致敏的CDllb+Grl+細(xì)胞的基因表達(dá)分析鑒定了由抗性腫瘤調(diào)節(jié)的獨(dú)特基因集合。CDllb+Grl+髓樣細(xì)胞的動(dòng)員和活化可能代表了針對(duì)抗VEGF治療的抗性的發(fā)生中的兩個(gè)步驟?？筕EGF和靶向髓樣細(xì)胞的化合物的組合治療進(jìn)一步抑制了腫瘤血管法生和生長(zhǎng)，并延遲了抗VEGF抗性的發(fā)作，證明組合把向髓樣細(xì)胞和VEGF的化合物有治療效益。方法勿^屑。EL4、LLC、B16F1和TIB6(J558)腫瘤細(xì)胞系得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC),并在補(bǔ)充有10%胎兒牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbecco氏改良的培養(yǎng)基(DMEM)中在組織培養(yǎng)中維持。術(shù)語(yǔ)"B16F1"和"B16"在此可互換使用，指相同的黑素瘤細(xì)胞系。^t體?？筕EGF(諸如G6-23)是結(jié)合并中和鼠型和人型VEGF的抗體。衍生自噬菌體展示技術(shù)，IgG部分包含鼠同種型IgG2a(參見(jiàn)例如Malik,A.K.ao/.RedundantrolesofVEGF-BandPIGFduringselectiveVEGF-Ablockadeinmice.腸od107:550-7(2006)),除非另有說(shuō)明，以10mg/kg的劑量每周兩次IP給藥。同種型匹配的對(duì)照抗體是抗人類豚草-IgG2a(Genentech，Inc.)?？笴Dllb+抗體(eBioSciences)、抗L畫選擇素(BDBiosciences)和抗CXCR4(TorreyPinesLab)被用于FACS實(shí)驗(yàn)中?？笹rlMAb(eBioSciences,CA或BDBiosciences,CA)以10mg/kg每周兩次IP施用。彈性蛋白酶抑制劑(lmg/小鼠；eBiosciences,SanDiego，CA)在植入5x1()6個(gè)EL4或LLC細(xì)胞之后一天開(kāi)始向C57Bl/6小鼠(n=5)每天IP施用。兩次/周進(jìn)行腫瘤測(cè)量，測(cè)量末期腫瘤重量，如上所述。GF/V方合V、武凝型。年齡6-8周的C57BL/6和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6-TgN;ACTbEGFP;lOsb;JAXstock#—003291)分別4尋自CharlesRiverLaboratories禾口JacksonLaboratories。EGFP由卩-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制，其在EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠中的所有細(xì)胞中是豐富的(參見(jiàn)4列^口Okabe，M.，Ikawa，M.,Kominami,K.，Nakanishi,T.&Nishimune,Y.'Greenmic6'asasourc6ofubiquitousgreencells.F朋S丄幼407:313-9(1997))。通過(guò)致死照射(11Gy,Cs-輻射體)C57BL/6小鼠以消融內(nèi)源骨髓、接著用分離自EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的5x1()6個(gè)BMMNC拯救，來(lái)產(chǎn)生C57BL/6GFP嵌合小鼠。如早先所述制備BMMNC(參見(jiàn)Gerber,H.P."a/.VEGFregulateshaematopoieticstemcellsurvivalbyaninternalautocrineloopmechanism.A^e417:954-8.(2002))。嵌合小鼠中的所有腫瘤異種移植物實(shí)驗(yàn)在造血重建之后至少4周進(jìn)行。對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，將5x1(^個(gè)鼠EL4或LLC腫瘤細(xì)胞皮下注射在背部區(qū)域。對(duì)于在XID小鼠中的實(shí)驗(yàn)，植入lx10"個(gè)LLC或EL4肺瘤細(xì)月包。5WF/;遂合豸-發(fā)。在米色棵XID(HarlanSpragueDawley)或C57BL/6小鼠(JacksonLab,BarHarbor)或者GFP骨髓嵌合小鼠中進(jìn)行腫瘤生長(zhǎng)研究。將5x106個(gè)或107個(gè)肺瘤細(xì)胞(如標(biāo)明的)重懸浮于200julMatriGel(生長(zhǎng)因子減低的；BDBiosciences,CA),并皮下注射在小鼠的背部側(cè)翼區(qū)域。對(duì)于骨髓混合實(shí)驗(yàn)，將106個(gè)分離自骨髓的BMMNC或CDllb+Grl+與2.5xio6個(gè)B16F1纟田月包在200|a1matrigel(BDBiosciences)中混合，并立即植入C57BL/6小鼠的側(cè)部。對(duì)于腫瘤0+/001化+01"1+混合實(shí)驗(yàn)，將2x106個(gè)B16F1細(xì)胞與3x1()5個(gè)GFP+細(xì)胞混合并如所述地植入。抗VEGF(G6-23)或?qū)φ?抗豚草)抗體治療在腫瘤細(xì)胞接種以后4天啟動(dòng)。在腫瘤達(dá)到可觸知的大小之后每周2-3次使用游標(biāo)卡尺評(píng)估腫瘤大小。使用公式Pi/6xLxWxW確定肝瘤體積，其中L是最長(zhǎng)的直徑，W是在垂直于L的位置的直徑。化夢(mèng)^f法。給C57B1/6小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC細(xì)胞系。在植入后的前4天小鼠不接受任何治療以容許腫瘤細(xì)胞的建立。包括5-氟尿嘧咬(5FU，AmericanPharmaceuticalPartner,IL;50mg/kg每周一次)和吉西他濱(EliLillyCo,IN,120mg/kg每周兩次)的化療劑IP施用。每周兩次測(cè)量腫瘤體積，如所描述的計(jì)算。名瘦邀織化夢(mèng)(7/7C義對(duì)于免疫熒光分析，收獲腫瘤，在最佳切割溫度(OCT)介質(zhì)中冷凍用于低溫切片?？偣?jam腫瘤^[氐溫切片在室溫千燥l小時(shí)，并在-2(TC在丙酮中固定10分鐘。在室溫風(fēng)干4分鐘之后，通過(guò)將它們?cè)谑覝卦?0%正常山羊血清(NGS，GIBCO#16210-064;在磷酸鹽緩沖鹽水("PBS")中配制)中溫育l小時(shí)來(lái)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。切片用在DAKO封閉液(DakoCytomation,CA)中稀釋的以下抗體連續(xù)染色，家兔抗GFPAlexaFluor488偶聯(lián)物(MolecularProbes)保持在20|ug/ml稀釋度在室溫l小時(shí)，山羊抗家兔AlexaFluor488偶聯(lián)物(MolecularProbes)保持l:500稀釋度在室溫l小時(shí)，大鼠抗小鼠PECAM-1(克隆MEC13.3;BDPharmingen)在1:100稀釋度在4。C保持過(guò)夜，以及山羊抗大鼠AlexaFluor594偶聯(lián)物(MolecularProbes)保持在1:500稀釋度在室溫1小時(shí)。洗滌載玻片并在DAKO熒光制片介質(zhì)中制片，在裝備有Plan-Neofluar20x物鏡的Nikon顯孩丈鏡上收集免疫熒光圖像，并數(shù)字合并。i管襲面承fKS^J^Wf。從CD31染色切片使用20x物鏡的數(shù)字圖象測(cè)定腫瘤血管表面積。一般地，通過(guò)使用ImageJ軟件，使用設(shè)置在50-70的預(yù)定閾值作為截留，選擇與染色的血管對(duì)應(yīng)的像素。消除污染的(非血管的)離群像素。除非另有說(shuō)明，每個(gè)組分析總共3-5個(gè)腫瘤。從每個(gè)腫瘤切片采集總共15個(gè)圖像，每個(gè)圖像覆蓋1502nn^的面積。除非另有說(shuō)明，每個(gè)組的背景染色通過(guò)使用帶標(biāo)記物的對(duì)照抗體來(lái)確定，并從總血管計(jì)數(shù)中減去。相對(duì)于總圖象面積和總分析面積的聚集血管像素面積報(bào)告為°/。血管/表面積。在一個(gè)實(shí)施方案中，血管表面積可以使用非侵入性定量方法來(lái)定量，包括但不限于^f茲共振成像、動(dòng)態(tài)對(duì)比強(qiáng)化的》茲共振成像、計(jì)算斷層照相術(shù)(CT)和電子發(fā)射斷層照相術(shù)(PET)。參見(jiàn)例如O，Connorea/.,Bn'fe/zJow"a/o/Ca"cw96:189-195(2007)。在某些實(shí)施方案中，4L造影藥劑及其f;f生物和復(fù)合物可以用于》茲共振成像。^4勿y^j。分離對(duì)照和抗VEGF治療的小鼠的腫瘤，通過(guò)切石牟肺瘤組織、接著用細(xì)胞勻漿器(VWR)處理來(lái)產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。BMMNC從植入動(dòng)物的股骨和脛骨沖洗下，使用ACK裂解緩沖液(Cambrex，MA)進(jìn)行RBC裂解。通過(guò)眼窩后采血收集外周血，取40ial外周血用ACK緩沖液預(yù)處理用于紅細(xì)胞裂解。來(lái)自BM、腫瘤或外周血的細(xì)胞用一系列單克隆抗體染色，包括CDllb、Grl、CD19、CD90、VEGFR2、CXCR4、L-選擇素2(全部來(lái)自BDBiosciences,CA)、VEGFR1(R&D，CA)、Tie2(eBioSciences，CA)以及合適的同種型對(duì)照，來(lái)研究每個(gè)隔室中的髓樣和淋巴樣級(jí)分。FACS數(shù)據(jù)在FACScalibur上獲得，通過(guò)CellQuestPro軟件(BDBiosciences)來(lái)分析。為了分離GFP+細(xì)胞和/或CDllb+Grl+,從植入小鼠的骨髓或腫瘤提供單細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞用偶聯(lián)有APC的抗CDllb和偶聯(lián)有PE的抗Grl來(lái)染色。GFP、GFP-、CDllb+Grl+和CDllb-Grl-細(xì)胞的群體在FACSVantage才幾器中分離，分選后分析確保每個(gè)隔室中感興趣群體的純度。微浮/{/。使用qiagenRneasy試劑盒(Qiagen)自骨髓衍生CDllb+Grl十細(xì)胞分離RNA。互補(bǔ)RNA(cRNA)的制備和陣列的雜交/掃描的方法由Affymetrix(Affymetrix,Inc.)提供。將5Mg總RNA使用cDNA合成試劑盒(SuperscriptChoice,GIBCO/BRL)和T7-(dT)24寡聚物引物(BiosearchTechnologies,Inc.,CustomSynthesis)轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA在親和樹(shù)脂(樣品清潔模塊試劑盒，Affymetrix,Inc.)上并通過(guò)乙醇沉淀來(lái)純化。在第二鏈合成之后，使用T7RNA聚合酶和生物素標(biāo)記的核苷酸在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(EnzoBiochem，Inc.)中從cDNA樣品產(chǎn)生帶標(biāo)記物的cRNA。帶標(biāo)記物的cRNA在親和樹(shù)脂(樣品清潔模塊試劑盒，Affymetrix)上純化。帶標(biāo)記物的cRNA的量通過(guò)測(cè)量260nm吸光度，并使用260nm處的1OD對(duì)應(yīng)于40jag/mlRNA的換算關(guān)系來(lái)測(cè)定。取20jiigcRNA通過(guò)在40mMtris-乙酸鹽(pH8.1)、100mM乙酸鉀和30mM乙酸鎂中在94。C溫育30分鐘來(lái)片段化。然后將樣品在設(shè)置在60rpm的電熱輪轉(zhuǎn)烘箱中在45'C與小鼠基因組4302.0陣列雜交19小時(shí)。將陣列在AffymetrixFluidics工作站和掃描器中洗滌，染色，掃描。使用AffymetrixGeneChip分析軟件或Spotfire軟件(Sportfire,MA)來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選擇信號(hào)強(qiáng)度比參考RNA高至少1.5倍的基因用于進(jìn)一步的分析。然后，選擇與相應(yīng)的B16F1組相比在EL4和LLC樣品中顯著(p<0.05)差異(在CDllb分析中超過(guò)1.5倍以及在腫瘤分析中超過(guò)2倍)表達(dá)的基因用于最終的分析。對(duì)所有腫瘤和CDllb數(shù)據(jù)使用Spotfire(Spotfire)軟件中的算法進(jìn)行分級(jí)基因聚類分析。勿/敏if移W/定法。如關(guān)于FACS分析所述分離腫瘤細(xì)胞，以lx106個(gè)細(xì)月包/ml在DMEM、10。/。FCS和4mM谷氨酰胺培養(yǎng)基中平鋪，在032組織培養(yǎng)溫箱中溫育4天。使用Amicon離心柱(Millipore)將培養(yǎng)基按與原始體積的比例來(lái)濃縮。取600nl—式三份樣品用于穿孔(transwell)細(xì)胞遷移平板(Corning)。將分離自C57BL/6小鼠的2.5x104個(gè)新鮮分離的BMMNC重懸浮在DMEM中，并置于穿孔平板的上室，隨后在37。C溫育9小時(shí)，通過(guò)對(duì)下室內(nèi)的細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)量BMMNC的遷移能力。鍵#。使用ANOVA來(lái)確定顯著差異。認(rèn)為《0.05的p值是顯著的。結(jié)果好;^抗K五GF治《的抗^不^由z義處佳給藥〃趟的，并j^f不依顛于淋為了建立允許評(píng)估抗VEGF治療的腫瘤中骨髓衍生細(xì)胞(BMC)的身份和相對(duì)豐度的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將綠色熒光蛋白標(biāo)記的(GFP+)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)過(guò)繼性地轉(zhuǎn)移給經(jīng)過(guò)致死照射的C57BL/6小鼠(參見(jiàn)例如Okabe，M.efa/.，'Greenmice'asasourceofubiquitousgreencells.i^E^S*丄e"407:313-9(1997))。將C57BL/6同基因腫瘤細(xì)胞系植入GFP+骨髓嵌合小鼠中，評(píng)估VEGF中和性抗體(G6-23)(參見(jiàn)例如Malik，A.K."a/.，RedundantrolesofVEGF-BandP1GFduringselectiveVEGF-Ablockadeinmice.廣2005))對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和血管發(fā)生的影響。這些細(xì)胞系包括黑素瘤細(xì)胞系(B16F1)、兩種T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系(EL4和TIB6)、和Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞系。術(shù)語(yǔ)"B16F1"和"B16"在本文中可互換4吏用，指相同的黑素瘤細(xì)胞系。B16F1胂瘤的生長(zhǎng)被抗VEGF(G6-23)阻斷了(附圖la)。在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，TIB6腫瘤的生長(zhǎng)也被抗VEGF顯著地阻斷了。然而，EL4和LLC腫瘤僅短暫地被抑制，而且在起初的生長(zhǎng)延遲之后，肺瘤開(kāi)始快速擴(kuò)展(附圖la)。類似地，植入免疫受損的米色棵X連鎖的免疫缺陷(XID)小鼠中的EL4(附圖lb)和LLC胂瘤(附圖lc)的G6-23治療在所有測(cè)試的劑量引起了僅僅短暫的腫瘤生長(zhǎng)延滯。這些發(fā)現(xiàn)表明，針對(duì)抗VEGF治療的抗性以不依賴T和B淋巴細(xì)胞的方式發(fā)生。在這個(gè)模型中，EL4和LLC腫瘤的抗性不是由次最佳劑量的抗VEGF抗體引起的(附圖lb和lc)。在我K5GF敏J^和在^浙vf的j&f^智溝#缺乏#鑊衍^的力犮i取腔扭/七'f服扁五尸CVEL4和LLC腫瘤分離物的熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)分析揭示了與抗VEGF敏感性腫瘤相比，在抗VEGF和對(duì)照二者治療的小鼠中GFP+骨髓細(xì)胞在抗性腫瘤中的頻率提高了(p《0.05),表明針對(duì)抗VEGF治療的抗性與BMMNC的募集有關(guān)(附圖ld)。為了闡明浸潤(rùn)性BMMNC是否直接促進(jìn)鐘瘤血管結(jié)構(gòu)，使用血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(CD31，PECAM)/GFP雙重染色來(lái)定量腫瘤切片中的微血管表面積和GFP+A:D31+(PECAM)EPC的數(shù)目。在治療的第14天，不論腫瘤類型，在抗VEGF或?qū)φ罩委煹哪[瘤中絕大多數(shù)的CD31+血管結(jié)構(gòu)缺乏GFP+表達(dá)(附圖le)。這些發(fā)現(xiàn)表明，BM-EPC向肺瘤血管結(jié)構(gòu)的募集不直接促進(jìn)抗VEGF抗性或敏感性腫瘤中的腫瘤血管結(jié)構(gòu)的形成?？筕EGF治療的EL4和LLC腫瘤顯示了與對(duì)照治療的腫瘤相比血管表面積方面2-3倍降低(附圖lf)，與腫瘤重量方面類似的降低相關(guān)。與抗VEGF抗性的EL4和LLC肺瘤中相比，在抗VEGF敏感性B16F1腫瘤中在抗VEGF治療之后CD31+血管的降低更大。此外，血管表面積(VS)的分析顯示了與抗性腫瘤相比，在敏感性腫瘤中抗VEGF治療之后在CD31+血管方面顯著的(p《0.05)降低(附圖lf)。5MMVC的j:襄和致敏對(duì)f我K五G尸我'/:^ff要的用抗VEGF敏感性B16F1腫瘤進(jìn)行腫瘤混合實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估0卩+BMMNC在針對(duì)抗VEGF治療的抗性的發(fā)生中的功能關(guān)聯(lián)性(relevance)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和細(xì)胞純度，參見(jiàn)附圖6a和b以及附圖7。為了進(jìn)行骨髓和腫瘤嵌合實(shí)驗(yàn)，從植入有抗性和敏感性腫瘤的小鼠的腫瘤或骨髓分離GFP+細(xì)胞。分選后分析確保了在每個(gè)隔室中GFP+細(xì)胞的純度。B16F1與抗性胂瘤致敏的BMMNC混合顯示了顯著的(p《0.05)生長(zhǎng)剌激效應(yīng)(附圖2a，b)。與之相反，當(dāng)與B16F1肺瘤或?qū)φ誱atrigel植入物致敏的BMMNC混合時(shí)，B16F1腫瘤的生長(zhǎng)速率沒(méi)有顯著改變(附圖2a，b)。與來(lái)自植入有matrigd或?qū)φ盏男∈蟮腂MMNC相比，從攜帶EL4和LLC月中瘤的小鼠的脛骨分離的BMMNC在與B16F1肺瘤混合后顯著提高了腫瘤生長(zhǎng)速率(附圖2a)。與對(duì)照抗體治療的組(附圖2a)相比，肺瘤生長(zhǎng)速率方面的差異在抗VEGF治療的組(附圖2b)中是更顯著的。與之相反，當(dāng)與用B16Fl腫瘤或?qū)φ誱atrigel致敏的BMMNC混合時(shí)，不論治療，B16F1腫瘤中的生長(zhǎng)速率沒(méi)有顯著提高(附圖2a,b)。類似地，當(dāng)與抗VEGF敏感性B16F1肺瘤混合時(shí)，在生長(zhǎng)14天之后分離自EL4和LLC腫瘤的GFP+細(xì)胞足以介導(dǎo)針對(duì)抗VEGF治療的抗性(附圖2c,d)。當(dāng)單獨(dú)地植入時(shí)，GFP+BMMNC或CDllb+Grl+細(xì)胞不產(chǎn)生胂瘤，證明了不存在污染性肺瘤細(xì)胞。BMMNC和抗VEGF敏感性腫瘤在物理上的接近本身不足以誘導(dǎo)抗性，而且用抗VEGF抗性腫瘤使骨髓細(xì)胞致敏是介導(dǎo)腫瘤抗性所需的。組合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)表明，BMMNC向腫瘤的募集和通過(guò)抗性腫瘤的致敏二者是？I起針對(duì)抗VEGF治療的抗性發(fā)生的事件級(jí)聯(lián)中的兩個(gè)步驟。^我^,yf放敏的CD77Z)+GW+細(xì)應(yīng)乂介^拔F五GF我^的i要f體舉沐BMMNC包含異質(zhì)性群體，其包括原始的、髓樣的和淋巴樣的譜系的細(xì)月包。Morrison,S丄"a/.,爿mwievCe〃Dev說(shuō)'o/，11:35-71(1995)。附圖3a-d中顯示的數(shù)據(jù)表明，代表髓樣群體的CD1lb+Grl+細(xì)胞是抗VEGF抗性的發(fā)生中主要的BMMNC子集。參見(jiàn)例如Onai,N."a/.，96:2074-2080(2000)。開(kāi)發(fā)了體外細(xì)胞遷移測(cè)定法來(lái)測(cè)試暴露于獲自抗性或敏感性腫瘤的可溶性提取物的BMMNC。將腫瘤在用抗VEGF或?qū)φ湛贵w治療的小鼠中培養(yǎng)14天。體外遷移測(cè)定法表明了BMCDllb+Grl+細(xì)胞朝向抗性肺瘤而不是敏感性腫瘤的可溶性提取物的遷移能力更大(p《0.05)(附圖3a)。因此，髓樣化學(xué)吸引因子存在于對(duì)照或抗VEGF治療的腫瘤的可溶性提取物中，而且當(dāng)抗VEGF(10|ig/ml)被添加到培養(yǎng)基中時(shí)，保持不受影響。這些發(fā)現(xiàn)表明，髓樣細(xì)胞募集是腫瘤固有的，不依賴于VEGF,而且不是由治療誘導(dǎo)的。這些發(fā)現(xiàn)與來(lái)自腫瘤生長(zhǎng)實(shí)^r的數(shù)據(jù)(附圖ld)—致，其中抗VEGF治療不能有效地阻斷BMMNC向抗性腫瘤的歸巢，進(jìn)一步支持了如下觀念，即髓樣細(xì)胞募集是腫瘤固有的而不是治療誘導(dǎo)的。考慮到CD1lb+Grl+細(xì)胞遷移方面響應(yīng)于來(lái)自抗VEGF抗性腫瘤的條件化培養(yǎng)基而表現(xiàn)出的提高(附圖3a),使用FACS分析來(lái)研究向小鼠中生長(zhǎng)的EL4和LLC肺瘤募集的造血的、淋巴樣的和髓樣的譜系。當(dāng)對(duì)于CDllb+子集門選時(shí)，與B16F1腫瘤相比，EL4和LLC腫瘤顯示了CDllb+Grl+細(xì)胞的富集(附圖3b)。在抗VEGF治療的腫瘤中，差異是最顯著的。在B16F1腫瘤中，CDllb+Grl+細(xì)胞群體在抗VEGF治療中顯著降低，而它們?cè)贓L4或LLC腫瘤中保持了不受影響(附圖3b)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用FACS儀器和針對(duì)CD1lb與Grl的單克隆抗體來(lái)分析攜帶TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤的小鼠中的髓樣隔室。EL4和LLC腫瘤分離物中浸潤(rùn)性BMMNC的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示了與TIB6和B16Fl胂瘤相比CDllb+Grl+細(xì)胞的顯著的(p<0.05)富集。這些結(jié)果與抗VEGF敏感性腫瘤中BMMNC水平降低一致(附圖ld),而且提供了在CDllb+Grl+細(xì)胞向胂瘤的募集和藥物抗性的發(fā)生之間相關(guān)性的進(jìn)一步支持。與來(lái)自腫瘤中分離的CDllb+Grl+的數(shù)據(jù)相反，在攜瘤小鼠的骨髓CDllb+子集中發(fā)現(xiàn)了較不顯著的改變(附圖3c)。這些數(shù)據(jù)表明，在攜帶抗性肺瘤的小鼠中的骨髓和腫瘤之間有獨(dú)特的串話(cross-talk),因?yàn)樗鼈兡技嗟腃Dllb+Grl+而且還指示骨髓產(chǎn)生更多的髓樣細(xì)胞。抗性和敏感性腫瘤中CDllb+Grl+細(xì)胞的進(jìn)一步分析揭示了，已知牽涉髓樣細(xì)胞的歸巢和穿內(nèi)皮遷移的分子(例如分別是CXCR4和L-選擇素)有更高的表達(dá)。攜瘤小鼠的BMMNC中CDllb+CD31+(EPC)和CDllb+CXCR4十細(xì)胞(嗜中性細(xì)胞)、CD19(B細(xì)胞)、CD卯(T細(xì)胞)、CDllc(樹(shù)突細(xì)胞)和VEGFR-2的相對(duì)數(shù)目在治療組和腫瘤類型之間是相似的，除了有些腫瘤中的CD19之外(附圖14)。在CDllb和Grl之外，調(diào)查了攜瘤小鼠中其它造血譜系(諸如B和T淋巴樣、CDllc、以及VEGFR1和VEGFR2)的表達(dá)(附圖15)?？剐阅[瘤中B淋巴樣細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的頻率方面的顯著降低(p《0.05)是值得注意的(附圖15a)。此外，數(shù)據(jù)表明了，在攜帶抗性腫瘤的小鼠的BM中與攜帶相應(yīng)敏感性腫瘤的小鼠的BM相比B和T淋巴細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞的頻率方面有顯著差異(附圖15b)。這些觀察結(jié)果表明，抗性腫瘤中髓樣細(xì)胞頻率的提高與其它造血譜系的降低有關(guān)。在BM和腫瘤之外，調(diào)查了攜瘤小鼠的脾臟，因?yàn)樵缦鹊难芯勘砻髌⑴K的CDllb+Grl+細(xì)胞促進(jìn)腫瘤擴(kuò)展。參見(jiàn)例如Kusmartsev,S.&Gabrilovich,D.I.,Ca"cer7mmM"o//mmw"o//2er,51:293-298(2002);Bronte,V.efa/.,腸od,96:3838-3846(2000)。作為對(duì)BM和肺瘤數(shù)據(jù)的支持，發(fā)現(xiàn)了與植入有敏感性腫瘤的小鼠相比，在植入有抗性腫瘤的小鼠中CD1lb+Grl+在脾臟中的頻率有提高(p《0.05)且脾臟大小有擴(kuò)大(p《0.05)(附圖16a和b)。結(jié)合在一起，這些觀察結(jié)果表明了CDllb+Grl+細(xì)胞作為介導(dǎo)針對(duì)抗VEGF治療的抗性中的主要細(xì)胞群體之一的功能性作用。為了調(diào)查髓樣細(xì)胞在抗VEGF抗性中的功能關(guān)聯(lián)性，從用EL4和LLC肺瘤致敏的小鼠的骨髓分離CDllb+Grl+和CDllb-Grl-亞群(附圖17),并將它們與B16F1肺瘤細(xì)胞混合。而，消減了CD1lb+Grl+細(xì)胞的BMMNC和腫瘤衍生GFP+細(xì)胞未能介導(dǎo)抗性。來(lái)自用抗VEGF抗性腫瘤致敏的小鼠的骨髓的CDllb+Grl+細(xì)胞可以介導(dǎo)針對(duì)抗VEGF治療的抗性。因而，附圖3樣明，由抗性腫瘤而不是敏感性胂瘤致敏的CDllb+Grl+細(xì)胞介導(dǎo)了針對(duì)抗VEGF治療的抗性。然而，與CDllb-Grl-群體相比，B16Fl與從B16Fl或matrigel致敏的小鼠分離的CDllb+Grl+細(xì)胞的混合物不能促進(jìn)針對(duì)抗VEGF治療的抗性(附圖17a)。這進(jìn)一步證明了如下假說(shuō)，即與敏感性腫瘤相比，抗性腫瘤具有與髓樣隔室的獨(dú)特串話。為了調(diào)查CDllb+Grl+細(xì)胞對(duì)肺瘤血管結(jié)構(gòu)的影響，分析了B16F1與CDllb+Grl+和CDllb-Grl-細(xì)胞的混合物中的血管表面積(VSA)(附圖17b)。這些發(fā)現(xiàn)表明，CDllb+Grl+混合物中的VSA顯著(p<0.05)大于單獨(dú)的B16Fl或與CDllb-Gr1-細(xì)胞的混合物，表明當(dāng)混合敏感性細(xì)胞系和CD11b+Gr1+細(xì)胞時(shí)，血管結(jié)構(gòu)的發(fā)育是針對(duì)抗VEGF的抗性的主要原因之一。當(dāng)測(cè)試自抗性腫瘤分離的胂瘤相關(guān)CDllb+Grl+細(xì)胞賦予敏感性腫瘤以抗性的能力時(shí)，獲得了相似的結(jié)果(附圖3e，f)。因而，當(dāng)在細(xì)胞獲取功能(cellular-gain-of-fonction)方法中測(cè)試時(shí),BM相關(guān)的和肺瘤相關(guān)的CD11b+Gr1十細(xì)胞都足以賦予針對(duì)抗VEGF的抗性。我)^(7尸在#,著^#體0)〃6+(^/+勿應(yīng)^謬尋7V一定付差^襄合為了檢測(cè)攜瘤小鼠的骨髓中CD1lb+Grl+細(xì)胞的活化狀態(tài)方面的潛在差異，使用DNA陣列進(jìn)行了基因表達(dá)分析。抗VEGF抗性EL4或LLC腫瘤致敏的CDllb+Grl+細(xì)胞的無(wú)監(jiān)督聚類分析鑒定了差異調(diào)節(jié)基因的特征性集合，其不同于抗VEGF敏感性B16F1肺瘤致敏的細(xì)胞(附圖4a)?；虮倔w分析揭示了抗VEGF抗性腫瘤對(duì)炎性細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞/髓樣細(xì)胞分化標(biāo)志物的的富集以及促血管發(fā)生和抗血管發(fā)生因子水平方面的改變。鑒定了由兩種抗VEGF抗性腫瘤普遍上調(diào)的基因集合，其中數(shù)種已知牽涉血管發(fā)生調(diào)節(jié)、松弛素樣因子(RLF)(參見(jiàn)例如Silvertown，J.D.,Summerlee，A丄&Klonisch,T.Relaxin-likep印tidesincancer.JOwcer107:513-9(2003))、牙口石舞月旨^L序酵(scramblase)(Endo-Lip)(參見(jiàn)例^口Favre,C丄e/"a/.Expressionofgenesinvolvedinvasculardevelopmentandangiogenesisinendothelialcellsofadultlu股.爿mJP/^w.o/ifeaWCz>c尸/zjWo/285:Hl917-38(2003))。與髓樣細(xì)胞的分化和/或活化相關(guān)的另一類基因在CDllb+Grl+細(xì)胞中被抗VEGF抗性腫瘤顯著上調(diào)，包括TLR-1(參見(jiàn)例如Edfeldt，K.,Swedenborg,J.,Hansson，G.K.&Yan，Z.Q.Expressionoftoll-likereceptorsinhumanatheroscleroticlesions:apossiblepathwayforplaqueactivation.C/簡(jiǎn)/a"。"105:1158-61(2002))、CD14(參見(jiàn)例如Scott,C.S."a/.FlowcytometricanalysisofmembraneCDllb，CDllcandCD14expressioninacutemyeloidleukaemia:relationshipswithmonocyticsubtypesandtheconceptofrelativeantigenexpression.五z^J/7aemflto/44:24-9(1990))、IL-13(參見(jiàn)4列^口Roy,B.a/.IL-13signaltransductioninhumanmonocytes:phosphorylationofreceptorcomponents,associationwithJaks,andphosphorylation/activationofStats.J丄eioc歷o/72:580-9(2002))和IL-4(參見(jiàn)例如Palmer-Crocker，R丄.，Hughes,C.C.&Pober，J.S,IL-4andIL-13activatetheJAK2tyrosinekinaseandStat6inculturedhumanvascularendothelialcellsthroughacommonpathwaythatdoesnotinvolvethegammacchain./C7/"/"vgW98:604-9(1996))的受體(附圖4)。反之，凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1),—種強(qiáng)力的血管發(fā)生抑制劑(參見(jiàn)例^口Good,D.a/,Atumorsuppressor-dependentinhibitorofangiogenesisisimmunologicallyandfunctionallyindistinguishablefromafragmentofthrombospondin.逾.Xcat/.<SW.園87:6624-6628(1990);及Imela-Arispe，M丄.，Bornstein,P.&Sage，H.Thrombospondinexertsanantiangiogeniceffectoncordformationbyendothelialcellsinvitro.PracjVa"爿cadSc/t/S」88:5026-30(1991))處在被兩種抗VEGF抗性腫瘤顯著下調(diào)的基因中。在又一個(gè)微陣列中顯示了，抗性肺瘤表現(xiàn)了不同的基因表達(dá)序型。對(duì)自才直入有EL4(El-3)、LLC(Ll-3)、B16F1(Bl畫3)和TIB6(Tl-3)腫瘤并用抗VEGF治療的小鼠的骨髓分離的CDllb+Grl+細(xì)胞進(jìn)行了基因樹(shù)分析。鑒定了下調(diào)的、不變的和上調(diào)的基因。鑒定了由抗VEGF抗性腫瘤誘導(dǎo)的改變的特征性集合，其不同于抗VEGF敏感性肺瘤所誘導(dǎo)的。對(duì)自攜帶TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤并用抗VEGF治療17天的小鼠的骨髓分離的CD11b+Gr1+細(xì)胞中差異表達(dá)的基因進(jìn)行了陣列分析。鑒定了潛在牽涉血管發(fā)生或髓樣細(xì)胞分化和遷移的調(diào)節(jié)、在抗性與敏感性腫瘤中的表達(dá)水平顯著改變(p《0.05,>1.5倍)的基因。已知牽涉血管發(fā)生的調(diào)節(jié)的上調(diào)基因包括白介素-U受體(IL-IIR)、白介素-l受體II(IL-IRII)、干擾素跨膜l(IFNTM1)、腫瘤壞死因子受體超家族成員18(TNFRSF18)、無(wú)翅整合5A(Winglessintegration5A:WNT5A)、分泌載體膜l、熱休克蛋白(HSP86)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、Eph受體B2(EphRB2)、G蛋白偶聯(lián)受體25(GPCR25)、肝瘤衍生的生長(zhǎng)因子(HGF)、血管生成素樣-6、肝配蛋白受體RA7(Eph-RA7)、腦信號(hào)蛋白Vlb、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白5、密蛋白-18、金屬蛋白酶-解聯(lián)蛋白MDC15(MDC15)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、以及具有凝血栓蛋白基序7B的解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶(ADAMTS7B)。下調(diào)的基因包括神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子(NCAM-140)、纖連蛋白III型、Wiskott-Aldrich綜合癥蛋白相互作用蛋白(WIP)、CD74、細(xì)胞間粘附分子2(ICAM-2)、Jaggedl、整聯(lián)蛋白a-4(Itga4)、整聯(lián)蛋白卩-7(ITGB7)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-PII型受體(TGF-BII-R)、TGFb可誘導(dǎo)的早期蛋白(TGFbIEP)、針對(duì)decapentaplegic的母親(MAD)和華麗線蟲(chóng)(C.e/egara)蛋白SMA-4(Smad4)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1A(BMPR1A)、CD83、Dectin-l、CD48、E-選擇素、白介素-15(IL-15)、細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制物4、細(xì)胞因子受體相關(guān)蛋白質(zhì)4(Cytor4)和趨化因子(C-X3-C)受體l(CX3CR1)。鑒定了由兩種抗性腫瘤普遍上調(diào)的基因集合，其中數(shù)種已知牽涉血管發(fā)生的調(diào)節(jié)，包括松弛素樣因子(RLF)(Ho，R丄."a/.Immunologicalresponsescriticaltothetherapeuticeffectsofadrianvycinplusinterleukin2inC57BL/6micebearingsyngeneicEL4lymphoma,(9"co/ie，5:363-372(1993))、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白5(Lazarovici，Ref，Nervegrowthfactor(NGF)promotesangiogenesisinthequailchorioallantoicmembrane,EWof/7e"簡(jiǎn)，13:51-59(2006))、石粦月旨^L序酵(Endo畫Lip)(Favre,C丄da/.，Expressionofgenesinvolvedinvasculardevelopmentandangiogenesisinendothelialcellsofadultlung,^wJ^/zj^WZ/eaWOcP/^/o/,285:H1917-1938(2003))、血管生成素樣-6、腦信號(hào)蛋白VIb、EphRA7、EphRB2和FGF13。此外，與髓樣細(xì)胞的分化和/或活化相關(guān)的GM-CSF(Rapoport,A.P.da/.，Granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)andgranulocytecolony-stimulatingfactor(G-CSF):receptorbiology,signaltransduction,andneutrophilactivation,祝oodiev，6:43-57(1992))也在自攜帶抗性腫瘤的小鼠分離的CD1lb+Grl+BM細(xì)胞中上調(diào)。已知牽涉樹(shù)突細(xì)胞的活化/產(chǎn)生的數(shù)種基因在分離自抗性肺瘤的BMCDllb+Grl+中完全下調(diào)。這包括CD83、CD48、Crea7和Dectin-l(參見(jiàn)例如Lechmann,Maa/.,CD83ondendriticcells:morethanjustamarkerformaturation,7>e"^s7www"o/23:273-275(2002))、IL-15(參見(jiàn)例如Feau，S.o/.，Dendriticcell-derivedIL-2productionisregulatedbyIL-15inhumansandinmice,說(shuō)"105:697-702(2005))和CX3CR1(參見(jiàn)例如Mess,J.H.""/.,CX3CR1-mediateddendriticcellaccesstotheintestinallumenandbacterialclearance,5We"cg307:254-258(2005))。分子數(shù)據(jù)符合BMMNC的多譜系分析(附圖15)，其中在攜帶抗性腫瘤的小鼠中的BM和腫瘤中CDllc+細(xì)胞的頻率方面存在顯著(p《0.05)降低。此外，TGF-卩超家族的數(shù)個(gè)成員(參見(jiàn)例如Derynck，R"a/.，TGF-betasignalingintumorsuppressionandcancerprogression,AtoGe"e29:117-129(2001))(包括Smad4和BMPRlA)處于下調(diào)的基因之中，表明在攜帶抗性腫瘤的小鼠中TGF-(3途徑在調(diào)節(jié)CD1lb+Gr1+細(xì)胞的活化/分化方面的作用。此外，進(jìn)行了來(lái)自LL2、EL4和B16F1腫瘤的基因表達(dá)分析，分析了在抗VEGF治療的抗性(EL4+LL2)而不是敏感性(B16F1)腫瘤中特異性上調(diào)或下調(diào)的基因。在所有腫瘤類型之間總體基因表達(dá)樣式是不同的。如附圖4d所示，在抗VEGF抗性和敏感性腫瘤之間其表達(dá)改變的許多基因?qū)儆谮吇蜃雍图?xì)胞因子的類別，表明炎性細(xì)胞在抗VEGF抗性腫瘤中的存在。此外，鑒定了多種促血管發(fā)生因子或抗血管發(fā)生因子。類似地，在抗VEGF治療的TIB6、B16F1、EL4和LLC腫瘤中的其它基因表達(dá)分析表明了在所有腫瘤類型之中基因表達(dá)的不同序型。上調(diào)的基因包括胰島素樣生長(zhǎng)因子2、結(jié)合蛋白3(IGF2BP3)、熱休克蛋白9A(HSP9A)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18(FGF18)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白WISP-1(ELM1)、晶狀體上皮衍生的生長(zhǎng)因子a(Ledgfa)、清除受體A型、巨噬細(xì)胞C型凝集素、聚合的免疫球蛋白受體3前體(Pigr3)、巨噬細(xì)胞清除受體I型(巨噬細(xì)胞SRT-1)、G蛋白偶聯(lián)受體、小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子A7(ScyA7)、白介素-l受體2(IL-1R2)、白介素-l可誘導(dǎo)蛋白(IL-1可誘導(dǎo)蛋白)、白介素-ip(IL-113)、LIX(LPS誘導(dǎo)的CXC趨化因子(Scyb5)基因l趨化因子(C-X-C基序)配體5)。下調(diào)的基因包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩(TGF-B)、Frizzled(FIZZ1)、Wolfram綜合征l同系物(Wfsl)、跨膜蛋白14A(TP14A)、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白(EMAP)、硫酸酯酶2(SULF-2)、細(xì)胞外基質(zhì)2、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTFG)、組織因子途徑抑制物(TFPI)、抵抗素樣分子amRNAI抹系C57BL/6XCP2蛋白(Xcp2)基因(XCP2)、受體活性修飾蛋白2(Ramp2)、RAR相關(guān)的;瓜兒受體a(ROR-a)、肝配蛋白B1、分泌的蛋白酸性和富含半胱氨酸樣l(SPARC-樣l)、腦信號(hào)蛋白A。在抗性與敏感性(TIB6+B16F1)腫瘤中差異表達(dá)的基因(超過(guò)2倍，p《0.05)的分析鑒定了數(shù)種已知牽涉BMMNC向外周血?jiǎng)訂T的細(xì)胞因子，包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(參見(jiàn)例如Rapoport，A.P,"a/.，Granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)andgranulocytecolony-stimulatingfactor(G-CSF):receptorbiology，signaltransduction,andneutrophilactivation,5/oodiev6:43-57(1992))禾口單才亥纟田月包化學(xué)吸引蛋白(MCP-1X參見(jiàn)例如Leonard,E丄"a/.,Secretionofmonocytechemoattractantprotein-1(MCP-1)byhumanmononuclearphagocytes,爿cfv五xpMed351:55-64(1993))。此外，牽涉炎癥的因子諸如巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-2)(參見(jiàn)例如Cook，D.N.,TheroleofMIP-1alphaininflammationandhematopoiesis,J丄eMbc5/o/，59:61-66(1996))和IL陽(yáng)1R(參見(jiàn)例如Dinarello,C.A.,BlockingIL-1insystemicinflammation,/Ex_pMed,201:1355-1359(2005)處在差異表達(dá)的基因之中。大多數(shù)上述細(xì)胞因子諸如G-CSF也已知牽涉造血祖細(xì)胞向髓樣細(xì)胞的分化(參見(jiàn)例如McNiece，I.K.Wa/.，RecombinanthumanstemcellfactorsynergiseswithGM-CSF，G-CSF，IL-3andepotostimulatehumanprogenitorcellsofthemyeloidanderythroidlineages,鄉(xiāng)//，她/，19:226-231(1991))和增殖(參見(jiàn)例如Lemoli,R.M."a/.,ProliferativeresponseofhumanacutemyeloidleukemiacellsandnormalmarrowenrichedprogenitorcellstohumanrecombinantgrowthfactorsIL-3，GM-CSFandG-CSFaloneandincombination,丄e"A:e附/a，5:386-391(1991))。因而，在致敏和促進(jìn)造血細(xì)胞向外周部動(dòng)員之外，攜帶抗性腫瘤的小鼠可能享有刺激髓樣細(xì)胞分化的能力。這些發(fā)現(xiàn)支持了來(lái)自CDllb+、Grl+細(xì)胞中的基因表達(dá)研究的結(jié)論，表因子和趨化因子的差異調(diào)節(jié)可能潛在促進(jìn)抗VEGF抗性腫瘤的抗性。遂合戎J^GF和于挽體存細(xì)應(yīng)功處的i^,^伊^/^9fA營(yíng)發(fā)蘭和蘭長(zhǎng)在EL4(附圖5a-b)和LL2紳瘤(附圖5c-d)的環(huán)境中單獨(dú)地或與抗VEGF組合地測(cè)試了降低外周循環(huán)中Grl+髓樣細(xì)胞的數(shù)目的抗Grl抗體。當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)，抗Grl治療在降低外周的和腫瘤的Grl+細(xì)胞的數(shù)目方面是有效的，然而，它不顯著地影響EL4腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)和血管形成(附圖5a-b)。然而，當(dāng)抗Gr1抗體與G6-23組合時(shí)，我們觀察到與抗VEGF-A治療單獨(dú)誘導(dǎo)的效果相比，組合治療組中存在EL4(附圖5b)或LL2(附圖5d)腫瘤朝向延長(zhǎng)的腫瘤生長(zhǎng)延遲和肺瘤抗性發(fā)作的傾向。LL2腫瘤的組織學(xué)分析揭示了通過(guò)FACS和血管表面積(VSA)測(cè)得的朝向Grl+髓樣細(xì)胞降低的傾向，其與組合治療組中腫瘤生長(zhǎng)速率降低(附圖5c和d)相關(guān)?；虮磉_(dá)分析揭示了抗VEGF抗性腫瘤細(xì)胞系對(duì)腫瘤和CD1lb、Grl+骨髓細(xì)胞中嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶表達(dá)的顯著增加(附圖4b)。嗜中性細(xì)胞產(chǎn)生的彈性蛋白酶據(jù)記載促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)性，并且刺激多種腫瘤類型的生長(zhǎng)。參見(jiàn)i"列^口Sun，Z.&Yang，RRoleofimbalancebetweenneutrophilelastaseandalpha1-antitrypsinincancerdevelopmentandprogression.Zawce/(9"co/5:182-90(2004)。此外，提出了嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶在調(diào)節(jié)嗜中性細(xì)胞動(dòng)員和血管發(fā)生中的作用。參見(jiàn)例如Shamamian,P,a/.ActivationofprogdatinaseA(MMP-2)byneutrophilelastase,cathepsinG,andproteinase-3:aroleforinflammatorycellsintumorinvasionandangiogenesis./CW/尸/戸W189:197-206(2001)。將抗VEGF治療與彈性蛋白酶抑制劑組合。組合治療引起了LLC和EL4肺瘤的肺瘤體積和末期肺瘤重量的顯著降低(附圖5e和f)。類似于抗Grl抗體治療(附圖5a-d),彈性蛋白酶抑制劑^"導(dǎo)了幾乎完全消融的循環(huán)髓樣細(xì)胞，然而，在腫瘤之內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與對(duì)照治療相比時(shí)2到3倍的降低。根據(jù)這一點(diǎn)，我們猜測(cè)缺乏CDllb或Grl表達(dá)的某些髓樣祖細(xì)胞可能不受治療的影響?；蛘撸婕?xì)胞可以潛在地浸潤(rùn)腫瘤和原位分化成髓樣細(xì)胞。在抗100VEGF治療的腫瘤內(nèi)誘導(dǎo)更深刻的髓樣細(xì)胞消融的策略可以進(jìn)一步提高組合治療的治療效果。組合起來(lái)，這些發(fā)現(xiàn)表明，抗VEGF與靶向髓樣細(xì)胞功能的化合物的組合改善了治療效力，并提供了第一證據(jù)，髓樣細(xì)胞的促血管發(fā)生功能可能促進(jìn)針對(duì)抗VEGF治療的抗性的發(fā)生。此外，這些發(fā)現(xiàn)支持了如下觀點(diǎn)，即數(shù)種途徑可能牽涉髓樣細(xì)胞向抗VEGF抗性腫瘤的募集和活化。我^^Vf*CD7"+GW+的衷至V一在根據(jù)抗性腫瘤中CDllb+Grl+細(xì)胞的獨(dú)特功能特征，調(diào)查了它們的細(xì)胞特性。檢查了已知牽涉造血細(xì)胞的動(dòng)員(CXCR4)(參見(jiàn)例如Orimo,A.，Stromalfibroblastspresentininvasivehumanbreastcarcinomaspromotetumorgrowthandang;iogenesisthroughelevatedSDF-1/CXCL12secretion,CW/，121:335-348(2005)))和穿內(nèi)皮遷移(L-選擇素)(參見(jiàn)例如Simon，S.I."a/.,L-selectin(CD62L)cross-linkingsignalsneutrophiladhesivefunctionsviatheMac-l(CDllb/CD18)beta2-integrin,J7m羅"o/，155:1502-1514(1995)))的分子的表達(dá)。此外，通過(guò)F480的表達(dá)認(rèn)識(shí)到的TAM已經(jīng)被描述為具有提高腫瘤生長(zhǎng)的潛力的髓樣細(xì)胞子集(參見(jiàn)例如Luo,Y."a/.，Targetingtumor-associatedmacrophagesasanovelstrategyagainstbreastcancer,/C7z'"/"veW,116:2132-2141(2006))。使用氯膦酸鹽的TAM消減在攜帶抗性腫瘤的小鼠中改善了抗VEGF治療的效力。并且，Tie2陽(yáng)性TAM被發(fā)現(xiàn)定位在胂瘤血管之內(nèi)以及介導(dǎo)血管發(fā)生(參見(jiàn)例如DePalma，M.da/.,Tie2identifiesahematopoieticlineageofproangiogenicmonocytesrequiredfortumorvesselformationandamesenchymalpopulationofpericyteprogenitors,Ca"cerCe〃，8:211-226(2005))。因而，調(diào)查了CXCR4、L-選才奪素、F4/80和Tie-2在抗VEGF治療的抗性和敏感性腫瘤中的髓樣級(jí)分中的表達(dá)。給C57BL/6小鼠(n二5)植入TIB6、B16F1、EL4和LLC月中瘤，并用抗VEGF或?qū)φ湛贵w治療，如所述的。在17天后收獲來(lái)自每只小鼠的腫瘤分離物，用針對(duì)CDllb、Grl、CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2的抗體染色。當(dāng)比較攜帶抗性腫瘤和相應(yīng)敏感性腫瘤的小鼠中腫瘤相關(guān)的CDllb+Grl+時(shí)，觀察到CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2子集的表達(dá)有顯著差異(p<0.05)。自攜瘤的小鼠分離BMMNC，用如上所述相同的標(biāo)志物染色。與腫瘤分^f一致，在抗性和相應(yīng)敏感性胂瘤群體中，CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2子集在GFP+CD1lb+Grl+細(xì)胞中的頻率有顯著差異(p《0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析揭示了，抗性腫瘤中腫瘤相關(guān)的CDllb+Grl+對(duì)于CXCR4、F480、L-選擇素和Tie2的表達(dá)是高度富集的(p《0.05)。當(dāng)分析自帶攜瘤小鼠分離的BMCDllb+Grl+細(xì)胞時(shí)，獲得了類似的圖片。這些觀察結(jié)果表明，抗性腫瘤中的CDllb+Grl+在動(dòng)員、穿內(nèi)皮遷移和歸巢至腫瘤方面是更有力的。^#^/^^,我^:(7尸和化;^^/的我#的不/^在射對(duì)針對(duì)抗VEGF的抗性的細(xì)胞機(jī)制的了解提出了如下問(wèn)題，即髓樣細(xì)胞是否也介導(dǎo)針對(duì)其它抗癌化合物的抗性。因而，我們調(diào)查了肺瘤針對(duì)兩種常用化療劑(包括5-氟尿嘧啶(5FU)和吉西他濱)的抗性(參見(jiàn)例如Pasetto,L.M.ea/.,Oldandnewdrugsinsystemictherapyofpancreaticcancer,CW///蘭to/，49:135-151(2004))?？筕EGF抗性和敏感性肺瘤顯示了對(duì)化療的不同響應(yīng)。如附圖18a和b所示，兩種抗VEGF抗性腫瘤(即EL4和LLC)顯示了對(duì)5FU的完全響應(yīng)和對(duì)吉西他濱的部分抗性，后者在稍晚的時(shí)間點(diǎn)且比針對(duì)抗VEGF治療的抗性輕微得多。在抗VEGF敏感性細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)TIB6肺瘤對(duì)兩種化合物完全敏感，與對(duì)抗VEGF治療的響應(yīng)相比沒(méi)有顯著差異(附圖18c)。然而，與抗VEGF治療相比，B16F1腫瘤顯示了針對(duì)5FU和吉西他濱兩者的抗性(附圖18d)。因此，數(shù)據(jù)清楚地表明了，針對(duì)抗VEGF的抗性的序型不對(duì)應(yīng)于抗性和敏感性腫瘤中的化療，表明抗血管發(fā)生方法與化療劑中抗性的發(fā)生牽涉不同的機(jī)制。BM細(xì)胞的分析顯示了在所有5FU治療的小鼠中CDllb+Grl+細(xì)胞的完全耗盡，在吉西他濱治療的動(dòng)物中達(dá)到較低的程度(附圖6e)。然而，在用吉西他濱或5FU治療的B16Fl腫瘤中CDllb+Grl+細(xì)胞的缺乏最小化了髓樣細(xì)胞在針對(duì)化療的抗性的發(fā)生中的牽涉(附圖6f)。CDllb+Grl+細(xì)胞向原發(fā)腫瘤的募集代表了在小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤子集之內(nèi)調(diào)節(jié)針對(duì)抗VEGF治療的抗性的細(xì)胞機(jī)制?；虮磉_(dá)序型分析允許鑒定與抗VEGF敏感性腫瘤相比，在攜帶抗VEGF抗性腫瘤的小鼠的骨髓中的CDllb+Grl+細(xì)胞中差異調(diào)節(jié)的基因集合。在它們之中，發(fā)現(xiàn)了在月中瘤致敏期間變得上調(diào)的數(shù)種促血管發(fā)生因子或抗血管發(fā)生因子和髓樣細(xì)胞活化的標(biāo)志物。髓樣細(xì)胞向肺瘤的募集牽涉藥物抗性的發(fā)生，并且代表了事件級(jí)聯(lián)中最早的步驟之一。靶向腫瘤衍生的因子、調(diào)節(jié)髓樣細(xì)胞的募集和/或活化的化合物可以與抗血管發(fā)生化合物組合。當(dāng)與全身性髓樣細(xì)胞消融策略相比時(shí)，腫瘤衍生的化學(xué)吸引物對(duì)髓樣細(xì)胞的選擇性阻斷可能是有益的，例如避免延長(zhǎng)部分先天免疫系統(tǒng)全身性抑制的潛在并發(fā)癥(參見(jiàn)例如Lewis，C.E.&Pollard,J.W.Distinctroleofmacrophagesindifferenttumormicroenvironments.iee化arch66:605-612(2006))。胂瘤浸潤(rùn)性髓樣細(xì)胞分泌的促血管發(fā)定功能的靶向因子可以間接地影響腫瘤血管發(fā)生并降低腫瘤對(duì)抗VEGF治療的抗性。參見(jiàn)附圖5?？筕EGF單克隆抗體貝伐單抗的臨床評(píng)估顯示了在多種人類癌癥(包括腎癌和卵巢癌)中的顯著單藥劑活性(參見(jiàn)例如Ferrara,N.,Hillan,K丄，Gerber,H.R&Novotny,W.Discoveryanddevelopmentofbevacizumab，ananti-VEGFantibodyfortreatingcancer.AtoievZ)rwgZ)&c。v3:391-400(2004);及Jain，R.K.，Duda，D.G.,Clark,J.W.&Loeffler，J.S.LessonsfromphaseIIIclinicaltrialsonanti-VEGFtherapyforcancer.tV"C7/"(9"co/3:24-40(2006))。在貝伐單抗在大多數(shù)人類腫瘤類型的廣泛臨床開(kāi)發(fā)期間，變得清楚的是，在許多腫瘤中，與化療劑組合時(shí)獲得了強(qiáng)烈的治療效果。正在檢驗(yàn)在與細(xì)胞毒性化合物的組合治療中引起提高的治療效益的基礎(chǔ)分子和細(xì)胞事件的本質(zhì)。已經(jīng)提出的是，作為血管正?；慕Y(jié)果而提高的肺瘤藥物攝取(纟宗述見(jiàn)Jainefa/.于Jain,R.K.Normalizingtumorvasculaturewithanti-angiogenictherapy:anewparadigmforcombinationtherapy.TVafMe"7:987-9(2001))和/或在腫瘤血管結(jié)構(gòu)的細(xì)胞毒性破壞之后干擾內(nèi)皮細(xì)胞再生(綜述見(jiàn)Ferraraea/.于Ferrara，N.，Hillan,K丄，Gerber,H.P.&Novotny,W.Discoveryanddevelopmentofbevacizumab,ananti-VEGFantibodyfortreatingcancer.iVafWevDr收iXycov3:391-400(2004))可以說(shuō)明提高的治療安文益(纟宗述見(jiàn)Ferrara&Kerbel于Ferrara，N.&Kerbel,R.S.,Angiogenesisasatherapeutictarget.Atowe438:967-74(2005))。不限于單一的理論，髓樣細(xì)胞在51起針對(duì)抗VEGF治療的抗性的機(jī)制方面的作用的鑒定提供了對(duì)如下觀點(diǎn)的進(jìn)一步支持，即與大多數(shù)細(xì)胞毒性化合物相關(guān)的骨髓抑制效果可能促進(jìn)提高的腫瘤生長(zhǎng)抑制。觀察到的是，在用化療治療的患者中的原發(fā)肺腫瘤內(nèi)髓樣細(xì)月包數(shù)目的降低與存活有關(guān)(參見(jiàn)例如DiMaio,M.Wa/.Chemotherapy-inducedneutropeniaandtreatmentefficacyinadvancednon-small-celllungcancer:apooledanalysisofthreerandomisedtrials.丄a"ceZ16>"co/6:669-77(2005))。103CDllb+Grl+細(xì)胞的DNA陣列分析鑒定出基因表達(dá)方面的改變，其在抗VEGF抗性和敏感性腫瘤之間是不同的，證明了在小鼠的側(cè)部生長(zhǎng)的腫瘤和在骨髓中的細(xì)胞子集之間有顯著的串話(附圖4a)。實(shí)施例2:來(lái)自針對(duì)抗VEGF治療有抗性的腫瘤模型的別的因子鑒定了來(lái)自腫瘤的、可能向腫瘤直接或間接地幫助或提供抗性的其它因子。將針對(duì)抗VEGF治療有抗性的小鼠淋巴瘤腫瘤溶胞物(例如EL4和L1210)用抗VEGF抗體(G6-31)以5mg/kg/周、兩次/周處理2周。在處理之后，將腫瘤合并，并在含有蛋白酶抑制劑的6mlRIPA緩沖液2X(Roche)中均化。將均化物在eppendorf離心機(jī)中在14，000rpm離心2x15分鐘。將上清液在20mMTris、pH7.5、50mMNaCl中l(wèi):l稀釋，施加至lmlHiTrapHS。將柱用起始緩沖液(20mMTris、pH7.5,50mMNaCl)洗滌，然后用約5倍柱體積的分步提高的NaCl濃度(0.25MNaCl、0.5MNaCl、1MNaCl，和3MNaCl)洗脫。收集每個(gè)步驟的峰級(jí)分。參見(jiàn)附圖8。在來(lái)自EL4和L1210的高鹽級(jí)分中發(fā)現(xiàn)了多種因子，其促進(jìn)趨化活性(例如通過(guò)單核細(xì)胞遷移測(cè)定法)或增殖測(cè)定法(例如HUVEC增殖測(cè)定法)。例如，bFGF發(fā)現(xiàn)于在高鹽級(jí)分中，在HUVEC增殖測(cè)定法中顯示了促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖，但是在單核細(xì)胞遷移測(cè)定法中顯示了沒(méi)有趨化活性。在高鹽級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的其它因子被發(fā)現(xiàn)具有朝向單核細(xì)胞的趨化活性。在針對(duì)抗VEGF治療有抗性的肺瘤(EL4)中使用減少/消減巨噬細(xì)胞的藥劑與抗VEGF治療(G6-23)的組合，發(fā)現(xiàn)了該組合延遲腫瘤生長(zhǎng)。將小鼠中的EL4腫瘤在尾靜脈中用以下各項(xiàng)治療1)PBS脂質(zhì)體/豚草；2)PBS月旨質(zhì)體/G6-31;3)氯膦酸鹽脂質(zhì)體/G6-23;4)氯膦酸鹽脂質(zhì)體/G6-31;或5)氯膦酸鹽脂質(zhì)體/PBS治療。附圖9顯示了在最后一次給藥之后72小時(shí)EL4腫瘤體積(通過(guò)卡尺測(cè)量)的改變。在用氯膦酸鹽脂質(zhì)體、巨噬細(xì)胞消減劑和抗VEGF(G6-23)治療的小鼠中存在著腫瘤體積的降低。在來(lái)自氯膦酸鹽-脂質(zhì)體/抗VEGF治療的動(dòng)物的血液中也檢測(cè)到了巨噬細(xì)胞的降低。參見(jiàn)附圖9的底部。根據(jù)定量實(shí)時(shí)PCR(Taqman)的測(cè)量，當(dāng)與抗VEGF(G6-23)組合施用給小鼠時(shí)，氯膦酸鹽脂質(zhì)體也降低了VEGF表達(dá)。參見(jiàn)附圖IO。根據(jù)ELISA(RDSystems)的測(cè)量，在如上所述用氯膦酸鹽脂質(zhì)體和抗VEGF(G6-23)治療的小鼠中，KC(CXCL1)蛋白表達(dá)也降低了。參見(jiàn)附圖ll。KC(CXCL1)是通過(guò)它在鼠單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)而鑒定出的蛋白質(zhì)。它的合成被TNFa誘導(dǎo)。KC牽涉嗜中性細(xì)胞趨化性/活化和翻滾中的(rolling)單核細(xì)胞在內(nèi)皮表面的捕獲(arrest)。血管內(nèi)皮細(xì)胞中KC的合成由凝血酶誘導(dǎo)。KC受體和IL-8B型受體是同系物。所述受體能夠結(jié)合KC和MP-2(巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2)二者。KC由對(duì)抗VEGF治療敏感的腫瘤細(xì)胞系和對(duì)抗VEGF治療有抗性的腫瘤細(xì)胞系二者分泌。在來(lái)自抗性胂瘤細(xì)胞系的高鹽級(jí)分中發(fā)現(xiàn)了其它促炎性細(xì)胞因子，例如MIP-la、MCP-1、IL-la、IL-1卩、IL-7、IL-9、IL-10和IL-13。MCP-1是單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白-1(CCL2或JE),它由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)^^和內(nèi)皮細(xì)月包分泌。它由M-CSF、IL-1、IFN"/和TGF卩誘導(dǎo)。MIP-la是巨噬細(xì)胞炎性蛋白-la(CCL3)，它由巨噬細(xì)胞在響應(yīng)局部炎癥時(shí)分泌，它活化嗜中性細(xì)胞而產(chǎn)生超氧化物。它還由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌。在肝細(xì)胞癌發(fā)生的小鼠模型中，MIP-la和MCP-l由新血管分泌，并且通過(guò)它們的關(guān)聯(lián)受體以自分泌方式刺激增殖。參見(jiàn)例如Ca"cer尺e.66(1):198-211(2006)。MCP陽(yáng)1和MIP-la二者都在對(duì)抗VEGF治療有抗性的肺瘤細(xì)胞系中表達(dá)。參見(jiàn)附圖12,畫面A和B,其中Dil(+)是內(nèi)皮細(xì)胞，CD3(+)代表淋巴樣細(xì)胞，F(xiàn)4/8(+)代表巨噬細(xì)胞。Dil代表Dil-Ac-LDL(用高氯酸l,l'-二十八烷基-3,3,3',3'-四曱基吲哚-羰花青(Dil)標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?(BiomedicalTechnologiesInc)。任何內(nèi)皮細(xì)月包具有攝取這種染料的能力。MIP-1a和MCP-1還被發(fā)現(xiàn)在血管發(fā)生性出芽和毛細(xì)管管腔形成測(cè)定法中具有血管發(fā)生活性。參見(jiàn)附圖13，畫面A和畫面B第10天。在該測(cè)定法中，將HUVEC細(xì)胞在之前一天在低傳代數(shù)(passagenumber)解凍，之后將細(xì)胞包被在珠子上。將細(xì)胞在大約80。/。匯合時(shí)脫離，在37。C以400個(gè)細(xì)胞/珠子包被cytodex微珠(交聯(lián)右旋糖苷基質(zhì))4小時(shí)。將珠子和游離的HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)移到燒瓶中并培養(yǎng)過(guò)夜。將珠子脫離，將它們與纖維蛋白原(牛血漿)(250)ag/ml)混合。然后通過(guò)添加凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性纖維蛋白凝膠。約有100個(gè)珠子/12孔板。將珠子與40，000個(gè)D551成纖維細(xì)胞和VEGF(作為陽(yáng)性對(duì)照)、D551或VEGF(作為陰性對(duì)照)、MCP-1和D551、或MIP-la和D551—起培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物用生物素化的抗人類CD31和Cy3鏈霉親合素染色過(guò)夜，廣泛洗滌。在60小時(shí)、6天和10天采集圖片。#一,*^^《移_^定法步驟l:自人類PBMC分離單核細(xì)胞。將血液用105PBS1:1(v/v)稀釋。將稀釋的血液慢慢添加到Ficoll的頂部，在室溫(RT)不間斷地在3000rpm離心15分鐘。除去血漿，收集白細(xì)胞(9-5ml中間相)。將細(xì)胞在含有具有0.5。/。BSA(低內(nèi)毒素)的PBS的遷移緩沖液中洗滌，在RT在1850rpm(9~800g)離心10分鐘，計(jì)數(shù)細(xì)胞。步驟2:細(xì)胞的f茲標(biāo)記。將細(xì)胞團(tuán)粒重懸浮在含有具有0.5%BSA(低內(nèi)毒素)和2mMEDTA的PBS的MACS緩沖液中，30jtU每10個(gè)細(xì)胞。添加FcR封閉劑和生物素-抗體混合物并混勻。然后將細(xì)胞在4。C溫育10分鐘，之后每10個(gè)細(xì)胞再添加30jalMACS緩沖液，添加抗生物素微珠?；靹颍?。C溫育10分鐘。通過(guò)再添加10-20倍的標(biāo)記體積，將細(xì)胞用MACS緩沖液洗滌，在300g(1250rpm)離心10分鐘。將細(xì)胞以多至l()S個(gè)細(xì)胞懸浮在2ml緩沖液中。步驟3:使用LS柱的^茲分離。將LS柱(MiltenyiBiotec)置于磁場(chǎng)支架中。將柱用MACS;爰沖液清洗。將細(xì)胞懸浮液施加到柱上。收集未標(biāo)記的流出液，其代表富集的單核細(xì)胞級(jí)分。將柱用緩沖液洗滌3次，收集流出液，合并。然后將合并液在300g(1250rpm)離心5分鐘。步驟4:用含有具有0.5。/。BSA(低內(nèi)毒素)加上2mML-谷氨酰胺和抗生素的RPMI的遷移培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。將106個(gè)細(xì)胞添加到具有5微米孔徑的24孔Transwell平板(Corning)中。向外室中添加各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子/趨化因子或其它測(cè)試樣品。在37。C溫育2.5小時(shí)之后，小心除去濾器，將細(xì)胞徹底混勻并轉(zhuǎn)移到10mlZPAK溶液中來(lái)計(jì)數(shù)。//L^EC增崖趙定法將低于8次傳代的HUVEC用于該研究中。第l天將3000個(gè)細(xì)胞/孔(96孔板)在具有1.5%FBS的測(cè)定培養(yǎng)基(DMEM:F1250:50)中平鋪在1%明膠包被的平板上。第2天更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞用各種生長(zhǎng)因子或條件化培養(yǎng)基處理。第3天以0.5MCi/孔添力^H-胸苷。第4天在早上添加250mMEDTA/孔來(lái)停止反應(yīng)。將細(xì)胞收獲到96孔濾板上，并用水洗滌3次。將31"1樣品用TOPCOUNT液體閃爍計(jì)數(shù)器來(lái)計(jì)數(shù)。舉/^治;^^t^查^^細(xì)^g諒減和^9f4這使用鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系EL4。治療在棵鼠中植入EL4月中瘤細(xì)胞(5x106，在matrigel中0.1ml體積)之后48小時(shí)開(kāi)始。治療如下組l，8只小鼠，每周兩次，PBS-脂質(zhì)體200|i1IV和豚草IgG2x5mg/kg/周100ulip.;組2,8只小鼠，每周兩次，PBS-脂質(zhì)體200)i1IV和G6-312x5mg/kg/周100ju1ip.;組3,8只小鼠，每周兩次，氯膦酸鹽-脂質(zhì)體200ialIV.豚草IgG2x5mg/kg/周100julip.;組4,8只小鼠,每周兩次，氯膦酸鹽-脂質(zhì)體200julIV.G6-312x5mg/kg/周100nlip.;組5，8只小鼠，每周兩次，氯膦酸鹽-脂質(zhì)體200nlIV.PBS每周兩次lOOplip.。每個(gè)組的3只小鼠預(yù)先放出50yl全血用于FACS巨噬細(xì)胞群體評(píng)估。每個(gè)組的3只小鼠在每次PBS-脂質(zhì)體或氯膦酸鹽-脂質(zhì)體注射之后l小時(shí)放血(眼)100pi全血用于FACS分析。繼續(xù)研究直到充分的腫瘤生長(zhǎng)(不超過(guò)5周)。如果肺瘤長(zhǎng)度大于20mm,那么肺瘤生長(zhǎng)被定義為充分的。每周測(cè)量腫瘤大小(lxwxh)。至少每周兩次地觀察動(dòng)物。在實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)處死小鼠，腫瘤測(cè)量最后一次，然后提取、稱重、然后固定。從所有動(dòng)物中采集血液、脾臟和肝臟用于進(jìn)一步的分析，例如FACS分析、RNA分析等。j&;^、,返和,返尹^噬細(xì)應(yīng)莽沐的趁^/，斧為^^勿應(yīng)諒減的措標(biāo)在氯膦酸鹽脂質(zhì)體的第一次i.v.注射之后92小時(shí)之后，施用C02來(lái)殺死小鼠(FV6轉(zhuǎn)基因小鼠vs米色棵XID小鼠)(2只來(lái)自氯膦酸鹽治療的FV6，2只來(lái)自氯膦酸鹽治療的米色棵XID小鼠，1只未治療的米色棵XID小鼠)，收集來(lái)自心室的150pl血液，并置入裝有肝素的試管中，在RT保存。如下加工血液1)采集150jal血液樣品并添加lmlACK紅細(xì)胞裂解緩沖液(BiosourceP304-100);2)在RT裂解5分鐘;3)在RT在5000rpm離心2分鐘;4)用FACS緩沖液(PBS+2%FCS)洗滌并再次離心；和5)在60)alFACS緩沖液中重懸浮，通過(guò)70jLxm篩過(guò)濾。如下加工脾臟1)在FACS緩沖液中使用蓋玻片(VWR微玻片48312-002,25x75mm)的磨砂表面制備單細(xì)胞懸浮液；2)在1200卬m離心5分鐘；3)用5mlACK(ACK緩沖液0.15MNH4C1，10.0mMKHC03，0.1mMNa2EDTA，pH7.2-7.4，通過(guò)0.22pm過(guò)濾除菌，保存在RT)懸浮團(tuán)粒并在RT溫育5分鐘或更久，任選偶爾搖動(dòng)；4)在溫育之后，添加FACS培養(yǎng)基到15ml;5)再次離心并在0.5-lmlFACS緩沖液中重懸浮細(xì)胞(對(duì)于FV6小鼠用lml，對(duì)于米色棵XID小鼠用0.5ml);和6)過(guò)濾。如下加工肝臟1)在FACS緩沖液中切碎肝臟(整塊的1/8)成小塊(在50ml錐形管中)并用45mlPBS洗滌小塊；2)將小塊在1200卬m離心5分鐘并將小塊小心移到磨砂表面來(lái)產(chǎn)生單細(xì)胞；3)用3mlFACS緩沖液洗滌并離心；和4)在0.5mlFACS緩沖液中重懸浮并過(guò)濾。將10jal血細(xì)胞稀釋到卯li1FACS緩沖液中用于總細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)于總細(xì)胞計(jì)數(shù)，采集脾臟樣品并1:10稀釋。來(lái)自血液、脾臟和肝臟的50iul樣品放入V形底、具有蓋子的96孔細(xì)胞培養(yǎng)簇(Costar3894)中，以lMl/樣品添加封閉用抗體(CD16/32)達(dá)15分鐘。將細(xì)胞與F4/80-PE抗體(10jal/樣品；Serotec,大鼠抗小鼠F4/80,MCA497PE,1101B)—起溫育來(lái)^^測(cè)巨噬細(xì)胞。用鋁箔覆蓋，將細(xì)胞與抗體在冰上溫育20分鐘，之后添加200julFACS緩沖液，將細(xì)胞在4。C、1500rpm離心5分鐘。除去緩沖液，使用200julFACS緩沖液重懸浮細(xì)胞，再次離心。最后將細(xì)胞重懸浮到130julFACS緩沖液中，轉(zhuǎn)移到小試管(202032202-12)并在BDFACS儀器上讀取?！產(chǎn)膚,品對(duì)備#勿/&#浮濕解剖腫瘤來(lái)除去脂肪組織和皮膚，將它放入含有PSGF的EL4培養(yǎng)基中，置于冰上；通過(guò)添加15mL/腫瘤用相同的培養(yǎng)基洗滌腫瘤，在180rpm離心10分鐘；除去上清液，再次洗滌組織；并且，將肺瘤切碎成小塊(<lmm),放入10cm組織培養(yǎng)皿中的2ml冷的EL4培養(yǎng)基中。通過(guò)添加8ml培養(yǎng)基并過(guò)濾通過(guò)40jnm尼龍濾網(wǎng)，將來(lái)自EL4月中瘤的單細(xì)胞收集到50mlFalcon試管中；將含有膠原酶IV、DNA酶和彈性蛋白酶的50ml細(xì)胞解離緩沖液/腫瘤添加到細(xì)胞，使用2個(gè)10cm皮氏培養(yǎng)皿在37。C溫育1.5小時(shí)。通過(guò)每15分鐘將組織上下吸移來(lái)破壞組織。任選地，在半小時(shí)后可以添加12.5ml含有LiberaseBlendymeI的細(xì)胞解離緩沖液，例如12.5ml中含200ial,以及在1小時(shí)后添加額外的膠原酶IV。將組織消化物連續(xù)地過(guò)濾通過(guò)不同大小的尼龍濾網(wǎng)(100、70和40iam);將樣品用EL4培養(yǎng)基洗滌兩次，在4。C在2000rpm離心5分鐘。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并收集。在一個(gè)實(shí)-驗(yàn)中，裂解細(xì)胞，分離總RNA(例如其可以通過(guò)Taqman來(lái)分析)。任選地，將細(xì)胞以多至IOOOOOO個(gè)細(xì)胞AOOju1使用EL4培養(yǎng)基(1.4ml)來(lái)重懸?。粚?duì)于1000000個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞用2iugFcI/II封閉30分鐘，在RT用F4/80、CD3抗體或CD31標(biāo)記的抗體來(lái)標(biāo)記l小時(shí)，以從樣品分離巨噬細(xì)胞、EL4淋巴細(xì)胞和其它造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；將細(xì)胞用EL4培養(yǎng)基洗滌兩次，以1OOOOOO個(gè)細(xì)胞/0.5ml重懸浮用于細(xì)胞分選。根據(jù)FSC/SSC和熒光強(qiáng)度來(lái)門選細(xì)胞。所分選的細(xì)胞也可以離心，放入適合的培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)并測(cè)量細(xì)胞生存力。通過(guò)使用EL4培養(yǎng)基將細(xì)胞平鋪在l。/。明膠包被的或Matrigel包被(30分鐘)的4孔細(xì)胞培養(yǎng)載玻片室中并培養(yǎng)過(guò)夜，可以制備細(xì)胞用于形態(tài)學(xué)/免疫熒光研究。可以將細(xì)胞疏松和裂解(<500000個(gè)細(xì)胞)來(lái)分離RNA。任選地，可以從分選儀器中分離另一種類型的細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞等)，計(jì)數(shù)，并測(cè)量細(xì)胞生存力，以及進(jìn)一步分析。任選地，可以裂解這些細(xì)胞和分離RNA?；蛎襘i^H舉W^/務(wù)和滋^7:將75-95mgL-a-磷脂酰膽堿添加至裝有1Oml曱醇和1Oml氯仿的500ml燒瓶(其早先已經(jīng)用曱醇和氯仿漂洗過(guò))。添加10-15mg膽固醇。將燒瓶在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(Rotovapor),即旋轉(zhuǎn)(130-150rpm)和低真空(從200mbar逐漸降低到150mbar)直到液體消失和薄膜形成，10分鐘。將薄膜溶于10ml氯仿，再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去氯仿，在燒瓶的內(nèi)壁周圍形成乳白色磷脂薄膜，~15分鐘。在有些情況中，即使液體蒸發(fā)掉了也不形成薄膜。將磷脂薄膜分散在10mlPBS或2.0g氯膦酸鹽/10mlPBS中，手動(dòng)旋轉(zhuǎn)和/或漩渦直到薄膜溶解，其中形成乳白色懸浮液。將乳白色懸浮液在N2氣體中在RT保持1.5-2小時(shí)。輕輕地?fù)u動(dòng)懸浮液，在水浴超聲發(fā)生器中超聲處理3分鐘。將懸浮液在N2氣體中在RT保持2小時(shí)，或在4。C保持過(guò)夜，用于脂質(zhì)體膨脹。通過(guò)10，000xg、15分鐘、16°C(11,600rpm70Ti轉(zhuǎn)子)的脂質(zhì)體離心，除去未封裝的氯膦酸鹽。脂質(zhì)體在懸浮液的頂部形成白色帶。使用移液器除去脂質(zhì)體之下的氯膦酸鹽溶液。將脂質(zhì)體用無(wú)菌PBS洗滌2-3次，手動(dòng)漩渦來(lái)破壞團(tuán)粒。將脂質(zhì)體離心25，000xg,30分鐘，16°C(18，400rpm,使用70Ti轉(zhuǎn)子)。將團(tuán)粒重懸浮在4ml無(wú)菌PBS中，在N2中保存，可長(zhǎng)達(dá)4周。在施用給動(dòng)物之前，輕輕地?fù)u動(dòng)脂質(zhì)體，將200^1脂質(zhì)體藥劑通過(guò)尾靜脈施用給每個(gè)動(dòng)物，每周兩次。認(rèn)為本說(shuō)明書(shū)足以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。才艮據(jù)以上說(shuō)明，本發(fā)明在本文所顯示的和描述的之外的各種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，并且落入所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。將本文中引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)收入本文作為參考以用于各種目的。權(quán)利要求1.一種使用組合治療來(lái)治療受試者中的抗性腫瘤的方法，所述方法包括向具有抗性腫瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的第二藥劑，其中所述第二藥劑包含髓樣細(xì)胞減少劑。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述髓樣細(xì)胞減少劑包含Grl拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-l拮抗劑或MIP-la拮抗劑。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述拮抗劑是抗體。4.一種診斷受試者中的抗性肺瘤的方法，所述方法包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的肺瘤的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中CDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目或百分比；與參考細(xì)胞群體中CD11b+Gr1+細(xì)胞的數(shù)目或百分比比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中CDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目或百分比；并檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD11b+Gr1+細(xì)胞的數(shù)目或百分比的增加，其中CDllb+Grl+細(xì)胞的數(shù)目或百分比增加表明所述腫瘤是抗性腫瘤。5.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量所述受試者的脾臟大小，并與參考脾臟大小比較所述受試者的脾臟大小，其中脾臟大小增大表明所述腫瘤是抗性腫瘤。6.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括在所述受試者已經(jīng)施用VEGF拮抗劑之后測(cè)量所述受試者中腫瘤的血管表面積(VSA)的數(shù)目或百分比，并與(參考血管表面積比較所述受試者中腫瘤的血管表面積的數(shù)目或百分比，其中肺瘤的血管表面積的數(shù)目或百分比增加表明所述肺瘤是抗性腫瘤。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述拮抗劑是抗體。8.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的腫瘤的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；與參考細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CD11c樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；并，檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比的降低，其中CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CD11c樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性胂瘤。9.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括從所述受試者提供來(lái)自所述受試者的骨髓的測(cè)試細(xì)胞群體；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD90T-淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；與參考細(xì)胞群體中CD90T-淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比比較所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD90T-淋巴樣細(xì)月包、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CD11c樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比；并，檢測(cè)與所述參考細(xì)胞群體相比所述測(cè)試細(xì)胞群體中CD90T-淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CD11c樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比的降低，其中CD90T-淋巴樣細(xì)胞、CD19B-淋巴樣細(xì)胞或CDllc樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)目或百分比降低表明所述腫瘤是抗性腫瘤。10.—種使用組合治療來(lái)治療受試者中的抗性腫瘤的方法，所述方法包括向具有抗性肺瘤的受試者施用有效量的VEGF拮抗劑以及有效量的髓樣細(xì)胞減少劑和有效量的第三藥劑，其中所述第三藥劑是化療劑。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述拮抗劑是抗體。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述髓樣細(xì)胞減少劑包含Grl拮抗劑、彈性蛋白酶抑制劑、MCP-l拮抗劑或MIP-la拮抗劑。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述化療劑是5FU或吉西他濱。全文摘要提供了使用包括抗VEGF抗體在內(nèi)的組合療法治療癌癥的方法。還提供了診斷抗性腫瘤的方法。文檔編號(hào)C07K16/18GK101448856SQ200780018441公開(kāi)日2009年6月3日申請(qǐng)日期2007年3月28日優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日發(fā)明者梅甘·鮑德溫,漢斯-彼得·格伯,法博德·肖杰伊,納波萊昂·費(fèi)拉拉,鐘翠玲申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司