專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)、診斷和治療血液惡性腫瘤的組合物和方法
相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)的相互參照本申請(qǐng)是2002年1月22日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/057,475的部分延續(xù)，后者是2001年11月6日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/040,862的部分延續(xù)，后者是2001年3月1日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)09/796,692的部分延續(xù)，它要求2000年3月1日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)60/186,126；2000年3月17日提交的序列號(hào)60/190,479；2000年4月27日提交的序列號(hào)60/200,545；2000年4月28日提交的序列號(hào)60/200,303；2000年4月28日提交的序列號(hào)60/200,779；2000年5月1日提交的序列號(hào)60/200,999；2000年5月4日提交的序列號(hào)60/202,084；2000年5月22日提交的序列號(hào)60/206,201；2000年7月14日提交的序列號(hào)60/208,950；2000年8月3日提交的序列號(hào)60/222,903；2000年8月4日提交的序列號(hào)60/223,406；和2000年8月7日提交的序列號(hào)60/223,378的優(yōu)先權(quán)；上述各專(zhuān)利申請(qǐng)的完整說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)、序列和附圖都納入本文作為參考，無(wú)需棄權(quán)且用于所有目的。
關(guān)于在聯(lián)邦政府資助下進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)獲得的發(fā)明權(quán)利的聲明不適用參考以光盤(pán)形式提交的“序列表”、表格或計(jì)算機(jī)程序表附孫無(wú)1發(fā)明背景1.1發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及癌癥診斷和治療領(lǐng)域。更具體說(shuō)，涉及令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了檢測(cè)和免疫治療血液惡性腫瘤，具體是B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的組合物和方法。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對(duì)分離自人血液惡性腫瘤的抗原性多肽及抗原性肽片段的免疫應(yīng)答和T細(xì)胞應(yīng)答的新的有效方法、組合物和試劑盒，以及利用這類(lèi)組合物診斷、檢測(cè)、治療、監(jiān)測(cè)和/或預(yù)防各種類(lèi)型人血液惡性腫瘤的方法。具體說(shuō)，本發(fā)明提供的多肽、肽、抗體、抗原結(jié)合片段、雜交瘤、宿主細(xì)胞、載體和多核苷酸化合物及組合物，可用于鑒定和區(qū)分不同類(lèi)型的血液惡性腫瘤，及檢測(cè)、診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)和治療患病動(dòng)物的這類(lèi)疾病。
1.2相關(guān)領(lǐng)域描述1. 2.1血液惡性腫瘤血液惡性腫瘤，如白血病和淋巴瘤是以造血細(xì)胞的異常生長(zhǎng)和成熟異常為特征的疾病。白血病通常是造血干細(xì)胞的惡性疾病，包括成人和兒童的急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和繼發(fā)性白血病。淋巴瘤有兩種不同類(lèi)型非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金氏病。NHL是B或T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)展，但何杰金氏病的分子病理學(xué)，包括譜系衍生和克隆能力仍不清楚。其它血液惡性腫瘤包括骨髓增生異常綜合征(MDS)、骨髓增生綜合癥(MPS)和多發(fā)性骨髓瘤。血液惡性腫瘤通常是嚴(yán)重疾病，可導(dǎo)致各種癥狀包括骨髓衰竭和器官衰竭。
NHL是美國(guó)癌癥死亡的第6位最常見(jiàn)原因。每年發(fā)病率中只有前列腺、乳腺、肺、結(jié)直腸和膀胱癌通常超過(guò)淋巴瘤。1995年新診斷為NHL超過(guò)45000人，21000多病人死亡。淋巴瘤病人的平均年齡較年輕(42歲)，因此病而死亡的人數(shù)使NHL成為影響美國(guó)經(jīng)濟(jì)的第四位癌癥。過(guò)去15年，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)報(bào)告NHL發(fā)病率增加了50％，是任何癌癥中增加最大的之一。大量增加主要?dú)w因于患AIDS的年輕人淋巴瘤的發(fā)生。淋巴瘤也是第三位最常見(jiàn)的童年期惡性腫瘤，占兒童癌癥的約10％。成活率(所有年齡)73％(低危)至26％(高危)不等。
1.3現(xiàn)有技術(shù)的不足對(duì)許多血液惡性腫瘤包括白血病和淋巴瘤的治療仍有困難，現(xiàn)有療法不是普遍有效。雖然包括特異性免疫療法的治療似乎有很大潛力，但這些治療只限于少數(shù)已知的惡性腫瘤相關(guān)抗原。況且早期檢測(cè)這類(lèi)血液惡性腫瘤可能相當(dāng)困難取決于具體疾病。此病缺乏足夠數(shù)量的特異性診斷和預(yù)后標(biāo)志和鑒定可能受影響的細(xì)胞和組織的方法，極大限制了腫瘤學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。
因此，該領(lǐng)域仍然需要改進(jìn)的方法用于檢測(cè)、篩查、診斷和治療血液惡性腫瘤疾病，如B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓病。本發(fā)明滿足了該領(lǐng)域中的這些和其它基本需求，在檢測(cè)一種或多種這類(lèi)血液惡性腫瘤中已證明為過(guò)度表達(dá)的一種或多種多肽的細(xì)胞和細(xì)胞類(lèi)型上提供了顯著的優(yōu)越性。
2發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)對(duì)一種或多種血液惡性腫瘤，具體是B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的鑒定、檢測(cè)、篩查、診斷、預(yù)后、預(yù)防治療和免疫調(diào)節(jié)，提供了一種新和有效的策略，滿足了該領(lǐng)域中上述的長(zhǎng)期需求和其它缺陷。
本發(fā)明部分根據(jù)令人驚奇和出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即在一種或多種類(lèi)型的血液惡性腫瘤中已鑒定到過(guò)度表達(dá)的，某些以前不知道或未鑒定的人類(lèi)多肽、肽和它們所產(chǎn)生的片段，現(xiàn)已鑒定了編碼這些肽的基因，并得到其分離形式，并已用一系列的分子生物學(xué)方法，包括扣除文庫(kù)分析，微陣列篩選、多核苷酸測(cè)序、肽和表位的鑒定，以及表達(dá)概況分析和體外全基因細(xì)胞引發(fā)，進(jìn)行了特征分析?，F(xiàn)已鑒定了這些多核苷酸及它們編碼的多肽、肽和抗原片段，并與血液惡性腫瘤疾病，具體如白血病和淋巴瘤的開(kāi)始，進(jìn)展和/或結(jié)果等復(fù)雜過(guò)程相牽連。
本發(fā)明還證明這些多核苷酸和它們編碼的多肽，及抗體、抗原呈遞細(xì)胞、T細(xì)胞和衍生自這種抗體的抗原結(jié)合片段，可用于開(kāi)發(fā)特別有利的組合物和方法，以檢測(cè)、診斷、預(yù)后、預(yù)防和/或治療一種或多種這些疾病，特別是那些(a)以一種或多種多核苷酸表達(dá)的增加、改變、升高或持續(xù)表達(dá)為特征的疾病，所述多核苷酸包含至少第一序列區(qū)，該區(qū)含SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一所示的核酸序列，或(b)以一種或多種多肽生物活性的增加、改變、升高或持續(xù)為特征的疾病，所述多肽含有至少第一序列區(qū)，該區(qū)含SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供一種或多種所述肽、多肽、抗體、抗原結(jié)合片段和本發(fā)明多核苷酸組合物在動(dòng)物中特別是在哺乳動(dòng)物如人中產(chǎn)生免疫應(yīng)答或產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答的方法和用途。本發(fā)明還提供這些組合物的一種或多種用于鑒定、檢測(cè)和定量測(cè)定臨床樣品、分離的細(xì)胞、整體組織和甚至受影響個(gè)體中血液惡性腫瘤組合物的方法和用途。本文所述組合物和方法也可用于制備一種或多種診斷試劑、測(cè)定、藥物或治療劑，進(jìn)行此類(lèi)疾病的診斷和治療。
在第一個(gè)重要實(shí)施例中，提供含有至少第一種分離的肽或多肽的組合物，此分離的肽或多肽所含的氨基酸序列與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列至少有約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或約99％相同。示范性優(yōu)選序列是含有至少第一編碼區(qū)的那些序列，該第一編碼區(qū)所含的氨基酸序列與SEQ IDNO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或約94％相同；包含與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％或約99％相同的至少第一編碼區(qū)的那些序列，是實(shí)施本發(fā)明特別優(yōu)選序列的例子。同樣，還提供含有基本上由SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列組成的肽和多肽化合物及組合物。
以類(lèi)似方式，本文實(shí)施例也提供檢測(cè)、診斷、預(yù)后、預(yù)防、治療B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的組合物和方法。涉及本發(fā)明此方面的示范性優(yōu)選肽和多肽化合物及組合物，包括但不限于含有至少第一種分離的肽或多肽的那些肽和多肽化合物或與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或約99％相同；和含有至少第一編碼區(qū)的那些序列，該第一編碼區(qū)所含的氨基酸序列與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或約94％相同；以及甚至含有至少第一編碼區(qū)的那些序列，該第一編碼區(qū)所含的氨基酸序列與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列至少約95％、96％、97％、98％或約99％相同。
本發(fā)明的示范性肽可以是任何合適的長(zhǎng)度，取決于其具體用途；這些肽可長(zhǎng)約9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或約100個(gè)左右氨基酸。當(dāng)然，本發(fā)明的肽也可包含上述范圍內(nèi)中等長(zhǎng)度或整數(shù)長(zhǎng)度的氨基酸。
本發(fā)明的示范性多肽和蛋白質(zhì)可以是任何合適的長(zhǎng)度，取決于其具體用途；這些多肽和蛋白質(zhì)可長(zhǎng)約100、150、200、250、300、35或約400個(gè)左右氨基酸。當(dāng)然，本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)也可包含上述范圍內(nèi)中等長(zhǎng)度或整數(shù)長(zhǎng)度的氨基酸。
本發(fā)明的肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體和抗原結(jié)合片段優(yōu)選含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者100個(gè)毗連的氨基酸序列。
而且，本發(fā)明的多肽、蛋白質(zhì)、抗體和抗原結(jié)合片段可更優(yōu)選至少含有第一分離的編碼區(qū)，該編碼區(qū)含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一所編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的至少約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或者200個(gè)毗連的氨基酸序列。
同樣，本發(fā)明的多肽、蛋白質(zhì)、抗體和抗原結(jié)合片段可含有第一分離的編碼區(qū)，該編碼區(qū)包含基本上較長(zhǎng)的序列，例如，含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的至少約200、220、240、260、280、或者300個(gè)毗連的氨基酸序列。
在說(shuō)明性實(shí)施例中，特別在涉及B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的方法和組合物的那些實(shí)施例中，本發(fā)明多肽所含氨基酸序列(a)含有，(b)基本上包括，或(c)包括SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)優(yōu)選含有至少第一核酸區(qū)段編碼的氨基酸序列，該第一核酸區(qū)段含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一種的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個(gè)毗連核苷酸序列。
本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)還優(yōu)選含有至少第一核酸區(qū)段編碼的氨基酸序列，該第一核酸區(qū)段含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一種的至少約31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個(gè)毗連核苷酸序列。本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)還優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，這些編碼區(qū)含有第一核酸區(qū)段編碼的氨基酸序列，該第一核酸區(qū)段含有SEQ IDNO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一種的至少約41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)毗連核苷酸序列。本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)還優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，這些編碼區(qū)含有第一核酸區(qū)段編碼的氨基酸序列，該第一核酸區(qū)段含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一種的至少約51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60個(gè)毗連核苷酸序列。本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)還優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，這些編碼區(qū)含有第一核酸區(qū)段編碼的氨基酸序列，該第一核酸區(qū)段含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一種的至少約70、80、90、100、110、120、130、140或150個(gè)毗連核苷酸序列。本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)還優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，這些編碼區(qū)含有第一核酸區(qū)段編碼的氨基酸序列，該第一核酸區(qū)段含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一種的至少約175、200、225、250、275、300、325、350、375、或4000個(gè)毗連核苷酸序列。本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)還優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，這些編碼區(qū)含有第一核酸區(qū)段編碼的氨基酸序列，該第一核酸區(qū)段含有SEQ IDNO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一種的至少約500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500個(gè)毗連核苷酸序列。
在第二個(gè)重要實(shí)施例中，提供含有至少第一種分離的多核苷酸的組合物，此第一種分離的多核苷酸所含的核酸序列至少與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一所示的核酸序列至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或約99％相同。示范性優(yōu)選序列是含有至少與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一所示的核酸序列至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或約94％相同；包含與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一所示的核酸序列至少約95％、96％、97％、98％或約99％相同的至少一種核酸序列的那些序列，是實(shí)施本發(fā)明特別優(yōu)選序列的例子。
在具體涉及檢測(cè)、診斷、預(yù)后、預(yù)防、治療B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的組合物和方法的實(shí)施例中，示范性優(yōu)選多核苷酸組合物包括至少含有第一種分離的核酸區(qū)段的那些組合物，此第一種分離的核酸區(qū)段含有的序列與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一所示的核酸序列至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或約99％相同。這類(lèi)多核苷酸優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)分離的編碼區(qū)，各區(qū)可(a)包括，(b)基本上包括，或(c)含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中所示的核酸序列。
本發(fā)明的示范性多核苷酸可有任何合適的長(zhǎng)度，取決于其具體用途；這些多核苷酸可(a)至少長(zhǎng)約，或(b)至少含有第一種分離的核酸區(qū)段，該區(qū)段至少長(zhǎng)約27、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、625、650、675、700、750、800、850、900、950或者1000個(gè)左右核苷酸；以及較長(zhǎng)的多核苷酸，該多核苷酸(a)至少長(zhǎng)，或(b)至少含有第一種分離的核酸區(qū)段，該區(qū)段至少長(zhǎng)約1000、1025、1050、1075、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000個(gè)左右核苷酸，以及大體上較大的多核苷酸。當(dāng)然，本發(fā)明的多核苷酸和核酸區(qū)段也可含有上述范圍內(nèi)的中等長(zhǎng)度或整數(shù)核苷酸。
本發(fā)明的組合物可含有單一多肽或多核苷酸，或者，可含有二種或多種血液惡性腫瘤化合物，例如二種或多種多肽，二種或多種多核苷酸，或甚至一種或多種肽或多肽與一種或多種多核苷酸的組合。當(dāng)具體應(yīng)用考慮二種或多種多肽時(shí)，第二和/或第三和/或第四等分離的肽或多肽優(yōu)選含有的氨基酸序列至少與SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一所編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的氨基酸序列至少約91％、93％、95％、97％或99％相同。或者，本發(fā)明的多核苷酸可含有一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，其編碼第一種融合蛋白或肽，例如在正確讀碼框中與一種或多種所述血液惡性腫瘤肽或多肽融合的佐劑編碼區(qū)?；蛘撸巳诤系鞍卓珊性谡_讀碼框中與一可檢測(cè)蛋白或肽，或與一免疫剌激蛋白或肽，或其它此類(lèi)構(gòu)建物融合的血液惡性腫瘤多肽或肽。融合蛋白如具體用于與本文所述一種或多種血液惡性腫瘤的診斷、檢測(cè)和治療有關(guān)實(shí)施例中的那些融合蛋白。
本發(fā)明也提供含有至少第一種雜交瘤細(xì)胞系的組合物，該雜交瘤細(xì)胞系可產(chǎn)生對(duì)本文所述一種或多種肽或多肽有免疫特異性的單克隆抗體，或至少第一種對(duì)所述肽或多肽有免疫特異性的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。該抗原結(jié)合片段可含一輕鏈可變區(qū)，一重鏈可變區(qū)，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab)2片段，F(xiàn)v片段、scEv片段或此類(lèi)抗體的抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明也提供含有至少第一種表達(dá)本文所述肽或多肽的分離的抗原呈遞細(xì)胞，或能與所述肽或多肽起特異性反應(yīng)的許多分離的T細(xì)胞的組合物?？赏ㄟ^(guò)使T細(xì)胞與本文所述一種或多種肽或多肽接觸來(lái)剌激或擴(kuò)展大多數(shù)分離的T細(xì)胞群。擴(kuò)展前可克隆T細(xì)胞且可獲得自健康哺乳動(dòng)物或至少患有第一種血液惡性腫瘤如白血病或淋巴瘤哺乳動(dòng)物的骨髓、骨髓組分、外周血或外周血組分。
如上所述，本發(fā)明的分離的多肽可長(zhǎng)約9-1000個(gè)氨基酸，或可長(zhǎng)約50-900個(gè)氨基酸，長(zhǎng)約75-800個(gè)氨基酸，長(zhǎng)約100-700個(gè)氨基酸，長(zhǎng)約125-600個(gè)氨基酸，或任何其它合適長(zhǎng)度。
編碼此分離多肽的分離的核酸區(qū)段可長(zhǎng)約27-10000個(gè)核苷酸，長(zhǎng)約150-800個(gè)核苷酸，長(zhǎng)約250-6000個(gè)核苷酸，長(zhǎng)約350-4000個(gè)核苷酸，長(zhǎng)約450-2000個(gè)核苷酸，或任何其它合適長(zhǎng)度。
該核酸區(qū)段可操作地置于至少一種異源重組啟動(dòng)子，如組織特異性、細(xì)胞特異性、可誘導(dǎo)性或調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制下。這類(lèi)啟動(dòng)子也可受到一種或多種附加的增強(qiáng)子或調(diào)控區(qū)的控制或調(diào)節(jié)，這取決于所需表達(dá)該多核苷酸的具體細(xì)胞類(lèi)型。也可將本發(fā)明的多核苷酸和核酸區(qū)段包含在一載體內(nèi)，如質(zhì)?；虿《据d體。也可將本發(fā)明的多核苷酸和核酸區(qū)段包含在宿主細(xì)胞內(nèi)，如重組宿主細(xì)胞、或人宿主細(xì)胞如血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸可含有至少第一種操作性框內(nèi)連接于至少第二種分離的核酸區(qū)段，這樣該多核苷酸可編碼一種融合蛋白，該融合蛋白中第一肽或多肽與第二肽或多肽連接。
本發(fā)明的多肽可含有任何合適長(zhǎng)度的毗連氨基酸，例如長(zhǎng)約2000、1900、1850、1800、1750、1700、1650、1600、1550、1500、1450、1400、1350、1300、1250、1200、1150、1100或約1000個(gè)左右氨基酸。同樣，本發(fā)明的多肽和肽可含有略短的毗連氨基酸編碼區(qū)，例如約950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或甚至約100個(gè)左右氨基酸長(zhǎng)度。
以同樣方式，本發(fā)明的多肽和肽可含有甚至更小的毗連氨基酸編碼區(qū)，例如長(zhǎng)約95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15或甚至約9個(gè)左右氨基酸。
在所有這類(lèi)實(shí)施例中，那些具有優(yōu)選范圍內(nèi)中等長(zhǎng)度包括所有整數(shù)長(zhǎng)度的肽和多肽(如含有長(zhǎng)度至少約94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、69、68、67、66個(gè)左右氨基酸的那些肽和多肽)均認(rèn)為屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例中，本發(fā)明的肽和多肽可含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的一種或多種肽的至少約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或約50個(gè)毗連氨基酸的序列。
其它實(shí)施例中，本發(fā)明的肽和多肽可含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的一種或多種肽的至少約51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個(gè)毗連氨基酸的序列。
還有其它實(shí)施例中，本發(fā)明的肽和多肽可含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的一種或多種肽的至少約100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或約400個(gè)毗連氨基酸的序列。
本發(fā)明的多肽通常含有上述多核苷酸任一編碼的或SEQ ID NOs10，471-10，474；SEQ ID NO10，481；SEQ ID NOs10，599-10，819；SEQ ID NOs10，820-10，842；SEQID NOs10，849-10，908；和SEQ ID NOs10，909-10，968任一所示的第一毗連氨基酸序列，但還可任選地含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的至少第二種，至少第三種，或甚至至少第四種或更多種毗連的氨基酸序列。單一肽可只含單一編碼區(qū)，或單一肽可含有多個(gè)相同或明顯不同的SEQ IDNO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的肽毗連氨基酸序列。事實(shí)上，所述多肽可含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的多個(gè)相同的毗連氨基酸序列，或它們可含有一個(gè)或多個(gè)不同的毗連氨基酸序列。例如，單一多肽可含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的一種或多種肽的單一毗連氨基酸序列，或者，可含有SEQ IDNO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的一種或多種肽的兩個(gè)或多個(gè)明顯不同的毗連氨基酸序列。事實(shí)上，所述多肽可含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的2、3、4或甚至5個(gè)不同的毗連氨基酸序列?；蛘?，單一多肽可含有2、3、4或甚至5個(gè)不同的編碼區(qū)。例如，多肽至少可含有第一編碼區(qū)，該第一編碼區(qū)含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的第一種毗連氨基酸序列，和至少一個(gè)第二編碼區(qū)，該第二編碼區(qū)含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的第二種毗連氨基酸序列。相反，多肽至少可含有第一編碼區(qū)，該第一編碼區(qū)含有SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的第一種毗連氨基酸序列，和至少第二編碼區(qū)，該第二編碼區(qū)含有明顯不同的第二種肽或多肽，例如佐劑或免疫剌激肽或多肽。
在這種情況下，同一多肽上的兩個(gè)編碼區(qū)可以分開(kāi)，或兩個(gè)編碼區(qū)可操作性相連，各處在正確的讀框中，這樣產(chǎn)生融合蛋白其中第一編碼區(qū)的第一氨基酸序列連接于第二編碼區(qū)的第二氨基酸序列。
本文公開(kāi)內(nèi)容中，短語(yǔ)“SEQ ID NO1-SEQ ID NO4所述序列”指包括這些序列標(biāo)志符任一所述的任何和所有毗連序列?！奔础癝EQ ID NO1-SEQ ID NO4任一所述序列”指“SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4任一所述任何序列。同樣，“SEQ ID NO25-37所述序列”指SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ IDNO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，或SEQ ID NO37任一所述任何序列。
同樣，短語(yǔ)“至少一種SEQ ID NO55-SEQ ID NO62任一的序列”指SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQID NO61，或SEQ ID NO62任一所述的第一種序列。
也應(yīng)理解本發(fā)明的試劑盒和組合物從整體和一般意義上說(shuō)，含有至少一種或多種具體的多核苷酸、多肽和肽，它們含有本文在SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中所示的一種或多種核酸序列的一個(gè)或多個(gè)毗連序列區(qū)，或由SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的一種或多種氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)毗連序列區(qū)，這些肽、多肽和多核苷酸組合物可用于一種或多種具體方法，和用于本文所述一種或多種血癌，具體說(shuō)是各種特殊類(lèi)型的淋巴瘤的診斷、檢測(cè)、預(yù)防和治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可理解，本說(shuō)明書(shū)所述益處是，所述肽和多肽組合物可用于動(dòng)物中產(chǎn)生T細(xì)胞或免疫應(yīng)答，也可將這類(lèi)組合物施動(dòng)物，然后從該動(dòng)物分離得到免疫特異性抗體和抗原結(jié)合片段或鑒定其與這類(lèi)肽或多肽的特異性結(jié)合。本發(fā)明所鑒定的多核苷酸可通過(guò)重組蛋白產(chǎn)生方法(在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi))，用于產(chǎn)生這類(lèi)肽、多肽、抗體和抗原結(jié)合片段，它們具有本文提供的特異性氨基酸和核酸序列。
同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，一種或多種所述組合物可用于一種或多種診斷或檢測(cè)方法以鑒定生物樣品、宿主細(xì)胞、或甚至動(dòng)物機(jī)體或組織內(nèi)的某些抗體、肽、多核苷酸或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，一種或多種所述核酸或氨基酸組合物可用于制備或制造一種或多種藥物，用于診斷、檢測(cè)、預(yù)后、預(yù)防或治療動(dòng)物的一種或多種血液惡性腫瘤，具體是本文和權(quán)利要求所述的惡性疾病。
本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白，本發(fā)明的方法、試劑盒及其用途優(yōu)選采用本文所述一種或多種化合物和/或組合物，它們含有本文所附序列表SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124所示的一種或多種毗連核苷酸序列。
同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難明白，本發(fā)明的方法、試劑盒及其用途也可采用本文所述一種或多種化合物和/或組合物，它們含有上述多核苷酸之一編碼的或本文所附序列表SEQ ID NO1-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124中任一編碼的或SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121中任一所示的任一肽的一種或多種毗連氨基酸序列。
3.附圖和序列的簡(jiǎn)要說(shuō)明可通過(guò)參見(jiàn)以下描述并結(jié)合附圖了解本發(fā)明，其中，同樣的參考數(shù)字鑒別同樣的成分，且其中

圖1為用于鑒定本發(fā)明cDNA靶標(biāo)的微陣列芯片技術(shù)方法的示意圖，見(jiàn)5.1節(jié)所述。
圖2為用于產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞系和鑒定感興趣克隆的體外全基因CD8+T細(xì)胞引發(fā)方法的總方案的示意圖。
圖3為用于產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞系和鑒定感興趣克隆的體外全基因CD4+T細(xì)胞引發(fā)方法的總方案的示意圖。
圖4為用于鑒定在淋巴瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的cDNA的一組探針。
圖5列出了與已知的治療劑CD20和CD52有類(lèi)似組織表達(dá)概況的抗原。
圖6說(shuō)明Ly1484長(zhǎng)的和Ly1484短的TMpred報(bào)告的結(jié)果。
圖7說(shuō)明Ly1484長(zhǎng)TSITES分析的結(jié)果。
圖8說(shuō)明Ly1484短的TSITES分析的結(jié)果。
SEQ ID NO1是Ly1728P的全長(zhǎng)cDNA。
SEQ ID NO2是Ly1728P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO3是Ly1732P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO4是Ly1732P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。
SEQ ID NO5是Ly1888P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO6是Ly1888P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO7是Ly1452_HIS-Tag-融合蛋白的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO8是Ly1452_His-tag-融合蛋白的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO9是Ly1452P，剪接變體1的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO10是Ly1452P，剪接變體1的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO11是Ly1452P，剪接變體2的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO12是Ly1452P，剪接變體2的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO13是Ly1462P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO14是Ly1462P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO15是Ly1462P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO16是Ly1484P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO17是Ly1484P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO18是Ly1484P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO19是Ly1486P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO20是Ly1486P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO21是Ly1486P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO22是Ly1677P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO23是Ly1682P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO24是Ly1693P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO25是Ly1693P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO26是Ly1693P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO27是Ly1697P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO28是Ly1715P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO29是Ly1715P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO30是Ly1727P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO31是Ly1727P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO32是Ly1727P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO33是Ly1885P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO34是Ly1885P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO35是Ly1885P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO36是Ly1905P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO37是Ly1905P的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO38是Ly1905P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO39是Ly1905P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO40是Ly1905P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO41是Ly663S的部分cDNA序列。
SEQ ID NO42是Ly663S的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO43是Ly663S的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO44是Ly664S的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO45是Ly664S的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO46是Ly667S的部分cDNA序列。
SEQ ID NO47是Ly667S的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO48是Ly667S的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO49是Ly677S的部分cDNA序列。
SEQ ID NO50是Ly677S的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO51是Ly677S的部分cDNA序列。
SEQ ID NO52是Ly677S的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO53是Ly677S的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO54是Ly677S的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO55是Ly1891P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO56是Ly1891P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO57是CD138的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO58是CD138的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO59是CD22的部分cDNA序列。
SEQ ID NO60是CD22的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO61是CD22的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO62是CD79β的部分cDNA序列。
SEQ ID NO63是CD79β的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO64是CD79β的部分cDNA序列。
SEQ ID NO65是CD79β的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO66是CD79β的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO67是Ly1450P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO68是Ly1450P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO69是Ly1451P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO70是Ly1451P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO71是Ly1451P的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO72 72＞Ly1454P，OLD-SEQ-ID_3577，部分cDNASEQ ID NO73是Ly1454P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO74是Ly1454P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO75是Ly1485P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO76是Ly1485P的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO77是Ly1485P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO78是Ly1500P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO79是Ly1500P，剪接變體1的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO80是Ly1500P，剪接變體1的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO81是Ly1500P，剪接變體2的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO82是Ly1500P，剪接變體2的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO83是Ly1500P，剪接變體3的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO84是Ly1500P，剪接變體3的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO85是Ly1516P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO86是Ly1516P，剪接變體1的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO87是Ly1516P，剪接變體1的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO88是Ly1516P，剪接變體2的部分cDNA序列。
SEQ ID NO89是Ly1516P，剪接變體3的部分cDNA序列。
SEQ ID NO90是Ly1678P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO91是Ly1678P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO92是Ly1678P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO93是Ly1678P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO94是Ly1680P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO95是Ly1686P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO96是Ly1687P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO97是Ly1706P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO98是Ly1712P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO99是Ly1729P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO100是Ly1729P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO101是Ly1729P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO102是Ly1848P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO103是Ly1859P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO104是Ly1859P的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO105是Ly1859P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO106是Ly1859P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO107是Ly1859P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO108是Ly1866P的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO109是Ly1866P的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO110是Ly1867P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO111是Ly1868P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO112是Ly1886P的部分cDNA序列。
SEQ ID NO113是Ly669S的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO114是Ly669S的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO115是Ly672S的部分cDNA序列。
SEQ ID NO116是Ly672S的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO117是Ly672S的全長(zhǎng)cDNA序列。
SEQ ID NO118是Ly675S的部分cDNA序列。
SEQ ID NO119是Ly675S的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO120是Ly1484P的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO121是Ly1484P的部分蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO122是His-Ly1452P的PCR引物序列。
SEQ ID NO123是His-Ly1452P的PCR引物序列。
SEQ ID NO124是Ly1451P的開(kāi)放閱讀框序列。
4.說(shuō)明性實(shí)施例的描述為了更全面了解本文所述的本發(fā)明，以下列出各種說(shuō)明性實(shí)施例的描述。
本發(fā)明一般涉及免疫治療和診斷血液惡性腫瘤如B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的組合物和方法。
4.1核酸遞送和DNA轉(zhuǎn)染的方法某些實(shí)施例中，采用本文所述的一種或多種RNA或DNA和/或替代的多核苷酸組合物來(lái)轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知將RNA和DNA及包含它們的載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞的技術(shù)。具體說(shuō)，當(dāng)通過(guò)編碼一種或多種感興趣的治療性化合物的一種或多種多核苷酸構(gòu)建物的表達(dá)而獲得治療性施用一種或多種活性肽、化合物或疫苗時(shí)，這種多核苷酸可用于遺傳轉(zhuǎn)化一種或多種宿主細(xì)胞。
將多核苷酸和/或多肽導(dǎo)入合適的靶細(xì)胞的各種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，當(dāng)要將多核苷酸遞送一細(xì)胞時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用其使用的幾種非病毒方法，將表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)運(yùn)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些方法包括例如磷酸鈣沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；DEAE-葡聚糖沉淀(Copal，1985；電泳(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；Tur-Kaspa等，1966；Potter等，1984；suzuti等1998；Vanbever等，1998)、直接微注射(Capecchi，1980；Harland和Wontraub，1985))；裝載DNA的脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Takakura，1998)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-DNA復(fù)合物；細(xì)胞超聲處理(Fechherimer等，1987)；采用高速微粒的基因轟擊技術(shù)(Yang等，1992；Klein等，1992)和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Curiel等，1991；Wagner等，1992；Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。這些技術(shù)中的一些可成功采納用于體內(nèi)或活體外。
用一種或多種所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞是本發(fā)明的重要方面。常需要將這種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞用于表達(dá)本文所述各種DNA基因構(gòu)建物。本發(fā)明某些方面常需要調(diào)制調(diào)節(jié)或控制所述基因節(jié)段的表達(dá)，這種方法對(duì)分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員是常規(guī)技術(shù)。通常當(dāng)需要提高或過(guò)度表達(dá)一個(gè)具體基因時(shí)，可采用各種操作提高其信使RNA的表達(dá)，具體是采用活性啟動(dòng)子，如本文所述的組織特異性啟動(dòng)子，以及采用能提高該信使RNA在具體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性的序列。
通常起始和翻譯終止區(qū)含有終止密碼子，和任選的一種聚腺苷酸化信號(hào)。在轉(zhuǎn)錄方向即編碼序列或有義序列的5’→3’方向，該構(gòu)建物將包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和啟動(dòng)子，其中的調(diào)控區(qū)可以是5’或3’啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，起始密碼子，具有開(kāi)放讀框和起始密碼子的結(jié)構(gòu)基因，終止密碼子，聚腺苷酸化信號(hào)序列和終止子區(qū)域(如需要)。作為雙鏈，該序列本身可用于轉(zhuǎn)化微生物或真核宿主，但在DNA導(dǎo)入宿主期間將第二DNA序列連接于表達(dá)構(gòu)建物時(shí)，通常在DNA序列中包含一標(biāo)記。
當(dāng)不存在功能性復(fù)制系統(tǒng)時(shí)，該構(gòu)建物還優(yōu)選包括與宿主中序列同源的至少約30、40或50個(gè)堿基對(duì)的序列，優(yōu)選至少約60、70、80或90-100bp，通常不超過(guò)約500-1000bp的序列。以這種方式，可能增強(qiáng)合理的重組，從而該基因?qū)⒄先胨拗鲀?nèi)并被宿主穩(wěn)定地保留。理想的是，該表達(dá)構(gòu)建物的調(diào)控區(qū)緊靠(也可操作性相對(duì)定位于)所選的治療性基因，以提供互補(bǔ)及競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的基因。因此，當(dāng)喪失該治療基因時(shí)，所產(chǎn)生的生物也可能喪失提供此競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的基因，從而不能在具有保留完整構(gòu)建物的基因環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)。
可將所選治療基因?qū)朕D(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)之間，使之處于該起始區(qū)的調(diào)控下?？蓪⒋藰?gòu)建物包含在一質(zhì)粒中，該質(zhì)粒包括至少一復(fù)制系統(tǒng)，其中一復(fù)制系統(tǒng)用于克隆在開(kāi)發(fā)質(zhì)粒，并且在最終宿主(此例為哺乳動(dòng)物宿主)中的功能需要第二個(gè)復(fù)制系統(tǒng)時(shí)，也可含一個(gè)以上系統(tǒng)。此外，可存在上述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記。需要整合時(shí)該質(zhì)粒需包括具有宿主基因組的同源序列。
可采用該領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)將上述基因或其它核酸區(qū)段插入宿主細(xì)胞。已描述了以下五種通用方法來(lái)傳遞核酸區(qū)段到細(xì)胞中(1)化學(xué)方法(Graham和Van Der Eb，1973)；(2)物理方法，如微注射(Capecchi，1980)、電穿孔(美國(guó)專(zhuān)利5,472,869；Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985)、微粒轟擊(美國(guó)專(zhuān)利5,874,265，其內(nèi)容納入本文作參考)、“基因槍”(Yang等，1990)；(3)病毒載體(Eglitis和Anderson1988)；(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curiel等，1991；Wagner等，1992)；(5)細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
4.2血液惡性腫瘤相關(guān)的特異性抗體及其抗原結(jié)合片段本發(fā)明還提供能特異地結(jié)合(或有免疫特異性)上述至少第一種肽或肽變體的抗體及其抗原結(jié)合片段。本文中的抗體或其抗原結(jié)合片段，指能“特異地結(jié)合”肽，并與該肽發(fā)生可檢測(cè)(如ELISA)水平的反應(yīng)，但與無(wú)關(guān)的肽或蛋白質(zhì)在相似條件下不發(fā)生可檢測(cè)反應(yīng)?！敖Y(jié)合”是指形成“復(fù)合物”的兩種不同分子之間的非共價(jià)連接。結(jié)合能力可通過(guò)例如測(cè)定該復(fù)合物形成的結(jié)合常數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。結(jié)合常數(shù)是復(fù)合物濃度除以組分產(chǎn)物的濃度所得值。本發(fā)明內(nèi)容中，當(dāng)形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)超過(guò)約103L/mol時(shí)，一般認(rèn)為這兩種化合物“結(jié)合”?？捎帽绢I(lǐng)域熟知方法測(cè)定結(jié)合常數(shù)。
能滿足上述要求的任何試劑可能是一種結(jié)合劑。在說(shuō)明性實(shí)施例中，該結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何各種技術(shù)制備這種抗體(Harlow和Lanl，1988)。通?？捎眉?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)抗體，包括產(chǎn)生上述單克隆抗體，或通過(guò)將抗體基因轉(zhuǎn)染入合適的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主以產(chǎn)生重組抗體。在一項(xiàng)技術(shù)中，將含有肽的免疫原先注射入任何各種哺乳動(dòng)物(如小鼠、大鼠、家兔、山羊或綿羊)。此步驟中，本發(fā)明的肽不經(jīng)修飾即可作為免疫原。另外，特別對(duì)于較短的肽，若將肽連接于一載體蛋白如牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白可引發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答。將免疫原注射動(dòng)物宿主，優(yōu)選按照預(yù)定的時(shí)間表進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)免疫接種，并定期采集動(dòng)物的血?？赏ㄟ^(guò)例如親和層析(采用偶聯(lián)于合適的固相支持物的肽)從抗血清中純化對(duì)肽特異的多克隆抗體。
“抗體”指由特異性結(jié)合或識(shí)別抗原的免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽。識(shí)別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分成為κ或λ。重鏈被分成為γ、μ、α、δ或ε，這依次決定了免疫球蛋白的類(lèi)型分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示范性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包括一個(gè)四聚體。每個(gè)四聚體由相同的兩對(duì)多肽鏈構(gòu)成，每對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N-末端限定約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，它主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別，即抗原識(shí)別區(qū)域?！翱乖R(shí)別區(qū)域”是指識(shí)別靶或其部分的本發(fā)明的抗體、重組分子、融合蛋白或免疫結(jié)合物的一部分?？乖R(shí)別區(qū)域通常包括抗體的可變區(qū)或其部分，例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或多個(gè)超變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。術(shù)語(yǔ)“VL”或“VL”是指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。
例如，作為完整免疫球蛋白或一些良好鑒定的片段存在的抗體通過(guò)用各種肽酶消化產(chǎn)生。因此，例如，胃蛋白酶在絞鏈區(qū)的二硫鍵以下消化抗體產(chǎn)生F(ab)’2，這是Fab的二聚體，它本身是通過(guò)二硫鍵與VH-CH1連接的輕鏈。F(ab)’2可在溫和條件下還原以斷裂絞鏈區(qū)中的二硫鍵，從而將F(ab)’2二聚體轉(zhuǎn)變成Fab’單體。Fab’單體實(shí)質(zhì)上是具有部分絞鏈區(qū)的Fab(參見(jiàn)Fundamental Immunology(Paul編，第三版，1993)。因此，術(shù)語(yǔ)抗體在這里還包括通過(guò)修飾完整抗體產(chǎn)生的抗體片段。
“片段”在這里指免疫球蛋白分子的至少部分可變區(qū)，它結(jié)合其靶，即抗原識(shí)別區(qū)域或抗原結(jié)合區(qū)。還可包括免疫球蛋白的一些恒定區(qū)?？贵w功能片段的例子包括但不限于完整的抗體分子、人源化抗體、抗體片段、如Fv、單鏈Fv(scFv)、超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、VL(輕鏈可變區(qū))、VH(重鏈可變區(qū))、Fab、F(ab)2’以及這些成分的任何組合或能夠結(jié)合靶抗原的免疫球蛋白肽的任何其它部分(參見(jiàn)，例如Fundamental Immunology(Paul編，第四版，1999)。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，可用多種方法獲得各種抗體片段，例如，用酶如胃蛋白酶消化完整抗體；或從頭合成。通常用化學(xué)方法或采用重組DNA法從頭合成抗體片段。因此，術(shù)語(yǔ)抗體在這里包括通過(guò)修飾完整抗體產(chǎn)生的抗體片段，或用重組DNA法從頭合成的抗體片段(如單鏈Fv)或用噬菌體展示文庫(kù)鑒定的抗體片段(例如參見(jiàn)McCafferty等，(1990)，Nature348552)。術(shù)語(yǔ)抗體還包括二價(jià)或雙特異性分子、雙抗體、三抗體和四抗體。例如，二價(jià)和雙特異性分子描述在Kostelny等，J.Immunol.1481547(1992)，Pack和Pluckthun，Biochemistry 311579(1992)，Zhu等，Protein Sci.6781(1997)，Hu等，Cancer Res.563055(1996)，Adams等，Cancer Res.534026(1993)和McCartney等，Protein Eng.8301(1995)。
“人源化抗體”是指其中VH和VL區(qū)域所含的抗原結(jié)合環(huán)，即互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，被移植到人構(gòu)架序列內(nèi)的抗體。通常，人源化抗體與本文所述的非人源化抗體有著相同的結(jié)合特異性。使抗體人源化的技術(shù)是此領(lǐng)域熟知的并描述在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567；5,530,101；5,859,205；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,777,085；6,180,370；6,210,671和6,329,511；WO 87/02671；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0173494；Jones等，Nature 321522(1986)和Verhoyen等，Science 2391534(1988)。人源化抗體還描述在例如Winter和Milstein，Nature 349293(1991)。
為制備單克隆或多克隆抗體，可采用此領(lǐng)域已知的任何技術(shù)(參見(jiàn)例如Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，《單克隆抗體和癌癥治療》(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY)，77-96頁(yè)，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
生產(chǎn)多克隆抗體的方法是精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。在一個(gè)示范性方法中，采用標(biāo)準(zhǔn)佐劑(如弗氏佐劑)和標(biāo)準(zhǔn)免疫方法，用螯合物或封閉結(jié)構(gòu)的類(lèi)似物免疫近交品系的小鼠(如BALB/C小鼠)或兔?；蛘?，除了使用佐劑外，將螯合物與自身呈免疫原性的載體(如匙孔血藍(lán)蛋白(“KLH”)偶合。通過(guò)取試驗(yàn)血并測(cè)定其與β亞基的反應(yīng)性效價(jià)來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物對(duì)免疫原制劑的免疫應(yīng)答。當(dāng)?shù)玫娇贵w對(duì)免疫原適當(dāng)?shù)母咝r(jià)時(shí)，從動(dòng)物采集血液并制備抗血清。如果需要，還可以富集抗血清的其它組分以使抗體與蛋白質(zhì)反應(yīng)。
單克隆抗體可用此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)獲得。簡(jiǎn)言之，來(lái)自用所需抗原免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞無(wú)限增殖，這通常是通過(guò)與骨髓瘤細(xì)胞融合(例如參見(jiàn)Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519(1976))。其它無(wú)限增殖化的方法包括用EB病毒、癌基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化，或用此領(lǐng)域熟知的其它方法。篩選產(chǎn)生自單個(gè)無(wú)限增殖細(xì)胞克隆以生產(chǎn)對(duì)抗原有所需特異性和親和性的抗體，且可通過(guò)各種技術(shù)提高用這種細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體的產(chǎn)率，包括注射到脊椎動(dòng)物宿主的腹膜腔中。或者，根據(jù)Huse等，Science 2461275-1281(1989)中概述的一般方法，通過(guò)篩選人B細(xì)胞的DNA文庫(kù)分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。
收集單克隆抗體和多克隆血清并用免疫測(cè)定法確定其對(duì)免疫原的效價(jià)，例如用固定在固體支持物上的免疫原進(jìn)行固相免疫測(cè)定。通常，選擇效價(jià)為104或更高的多克隆抗血清，并用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫測(cè)定法測(cè)試其對(duì)不同螯合物的交叉反應(yīng)性。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體的結(jié)合Kd一般至少約為0.1mM、更一般至少約為1μM，優(yōu)選至少約為0.1μM或更好，最優(yōu)選為0.01μM或更好。
可采用生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4,946,778)來(lái)生產(chǎn)與螯合物和其它診斷劑、分析劑或治療劑反應(yīng)的抗體。同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物如其它哺乳動(dòng)物可用來(lái)表達(dá)人源化抗體?；蛘?，可用噬菌體展示技術(shù)來(lái)生產(chǎn)和鑒別特異性結(jié)合所選抗原的抗體和異聚的Fab片段(參見(jiàn)例如McCafferty等，Nature 348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10779-783(1992))。
在一個(gè)示范性實(shí)施方案中，動(dòng)物，如兔或小鼠用螯合物或免疫原性構(gòu)建物免疫。優(yōu)選用標(biāo)準(zhǔn)方法分離通過(guò)免疫方法產(chǎn)生的抗體。
再在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述抗體是人源化抗體?！叭嗽椿笔侵敢呀?jīng)被修飾以使在人體內(nèi)的免疫反應(yīng)性最小化的非人多肽序列，這通常是通過(guò)改變氨基酸序列以模擬現(xiàn)在的人序列，而無(wú)需改變多肽序列的功能(參見(jiàn)例如Jones等，Nature321522-525(1986)，和發(fā)表的英國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?707252)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種抗體，如上所述，該抗體上還附著選自可檢測(cè)標(biāo)記、生物活性劑及其組合的部分。
當(dāng)抗體與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，所述標(biāo)記優(yōu)選選自放射性同位素、熒光劑、熒光劑前體、生色團(tuán)、酶或其組合。將各種基團(tuán)結(jié)合到抗體的方法是此領(lǐng)域熟知的。例如，經(jīng)常結(jié)合到抗體的可檢測(cè)標(biāo)記是酶，如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。
生產(chǎn)用小分子如熒光劑標(biāo)記的抗體的方法是此領(lǐng)域熟知的。熒光標(biāo)記的抗體可用于免疫組織化學(xué)染色(Osborn等，Methods Cell Biol.2497-132(1990)；用于流式細(xì)胞術(shù)或細(xì)胞分選技術(shù)(Ormerod，M.G.(編)，《流式細(xì)胞術(shù)實(shí)用方法》(FLOWCYTOMETRY.A PRACTICAL APPROACH)，IRL Press，New York，1990)；用于追蹤和定位抗原，以及各種雙染色方法(小Kawamura，A.，《熒光抗體技術(shù)及其應(yīng)用》(FLUORESCENT ANTIBODY TECHNIQUES AND THEIR APPLICATION)，Univ.Tokyo Press，Baltimore，1977)。
許多反應(yīng)性熒光標(biāo)記可通過(guò)商業(yè)獲得(如Molecular Probes，Eugene，OR)或者可用此領(lǐng)域已知的技術(shù)合成。在一個(gè)示范性實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體在溫和堿性條件下被胺反應(yīng)性熒光劑，如異硫氰酸熒光素標(biāo)記。欲了解抗體標(biāo)記技術(shù)的其它例子可參見(jiàn)Goding，J.Immunol.Methods 13215-226(1976)和《單克隆抗體“原理和實(shí)踐》(MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE)，6-58頁(yè)，Academic Press，Orlando(1988)。
可采用例如Kohler和Milstein(1976)的技術(shù)及其改進(jìn)，來(lái)制備對(duì)感興趣抗原肽特異的單克隆抗體。簡(jiǎn)言之，這些方法包括制備能產(chǎn)生具有所需特異性(如與感興趣肽反應(yīng))抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞系。可從獲自上述免疫接種動(dòng)物的脾細(xì)胞產(chǎn)生這種細(xì)胞系。例如通過(guò)與骨髓瘤細(xì)胞融合伙伴(優(yōu)選與該免疫動(dòng)物同系)融合，使脾細(xì)胞無(wú)限增殖。可采用各種融合技術(shù)。例如，可用非離子洗滌劑使脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合幾分鐘，然后以低密度鋪在能支持雜交細(xì)胞生長(zhǎng)但不支持骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇培養(yǎng)基上。優(yōu)選的選擇技術(shù)采用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)。足夠時(shí)間后，一般約1-2周，可見(jiàn)雜交體的集落。選出單個(gè)克隆，測(cè)試其培養(yǎng)物上清液對(duì)肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
可從生長(zhǎng)的雜交瘤集落的上清液中分離單克隆抗體。此外，可采用各種技術(shù)來(lái)提高產(chǎn)量，例如將雜交瘤細(xì)胞系注射到合適的脊椎動(dòng)物宿主，如小鼠的腹腔內(nèi)。然后從腹水或血液中收集單克隆抗體。用常規(guī)方法如層析、凝膠過(guò)濾、沉淀和抽提法去除抗體中的污染物。本發(fā)明的肽可用于此純化過(guò)程，例如親和層析步驟中。
某些實(shí)施例中，優(yōu)選采用抗體的抗原結(jié)合片段。這些片段包括用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的Fab片段。簡(jiǎn)言之，可用A蛋白珠柱進(jìn)行親和層析(Harlow和Lanl，1988)純化兔血清中的免疫球蛋白，再用木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生Fab和Fc段。用A蛋白珠柱親和層析分離Fab和Fc片段。
可將單克隆抗體及其片段偶聯(lián)于一種或多種治療藥物。在這方面，合適的試劑包括放射性追蹤劑和化療劑，它們可用于例如體外凈化自身骨髓。代表性的治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)劑、藥物、毒素及其衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲喋呤和嘧啶及嘌呤類(lèi)似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)劑包括佛波醇酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括篦麻毒蛋白，想思豆毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素、白樹(shù)毒蛋白、假單胞菌外毒素、志賀菌毒素和商陸抗病毒蛋白。為診斷目的，與放射活性藥物偶聯(lián)可用于促進(jìn)轉(zhuǎn)移的追蹤或確定血液惡相關(guān)陽(yáng)性腫瘤的位置。
可將治療劑與合適單克隆抗體直接或間接(通過(guò)一接頭基因)偶聯(lián)(如共價(jià)健合)。當(dāng)藥劑和抗體各自具有能相互反應(yīng)的取代基時(shí)，二者之間可能直接反應(yīng)。例如，一個(gè)分子上的親核基團(tuán)如氨基或巰基，能與另一分子上含羰基的基團(tuán)如酸酐或酸鹵化物反應(yīng)，或與含有良好離去基團(tuán)(如鹵化物)的烷基反應(yīng)。
或者，可能需要將治療劑和抗體通過(guò)一接頭基團(tuán)偶聯(lián)。接頭基團(tuán)的功能是作為間隔使抗體與藥劑隔開(kāi)，以避免干優(yōu)結(jié)合能力。接頭基團(tuán)也可用于增加藥劑或抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)性，從而提高偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的增加還促進(jìn)藥劑原本不可能的用途或其上功能基團(tuán)的用途。
該領(lǐng)域技術(shù)人員已證明各種雙功能或多功能試劑，同質(zhì)和異質(zhì)功能試劑(見(jiàn)Pierci Chemical Co(Rockford IL)的產(chǎn)品目錄上所述)，可用作接頭基團(tuán)。例如通過(guò)氨基、羧基、巰基或氧化的糖殘基可影響偶聯(lián)。有許多參考文獻(xiàn)描述了這種方法，如美國(guó)專(zhuān)利4,671,958。
當(dāng)治療劑從本發(fā)明免疫偶聯(lián)物的抗體部分游離出來(lái)時(shí)其作用更強(qiáng)，因此可能需要采用細(xì)胞內(nèi)化期間或內(nèi)化時(shí)能被切割的接頭基團(tuán)。已描述了許多不同的可切割的接頭基團(tuán)。從這些接頭基團(tuán)細(xì)胞內(nèi)釋放藥劑的機(jī)制包括通過(guò)還原二硫鍵切割(美國(guó)專(zhuān)利4,489,710)；通過(guò)對(duì)光不穩(wěn)定的鍵(美國(guó)專(zhuān)利4,625,014)；通過(guò)水解衍生的氨基酸側(cè)鏈(美國(guó)專(zhuān)利4,638,045)；通過(guò)血清補(bǔ)體介導(dǎo)的水解(美國(guó)專(zhuān)利4,671,958)和酸催化的水解(美國(guó)專(zhuān)利4,569,789)來(lái)切割。
可能需要將一個(gè)以上的藥劑偶聯(lián)于抗體。一實(shí)施例中，將藥劑的多個(gè)分子偶聯(lián)于一個(gè)抗體分子。另一實(shí)施例中，可將一種以上的藥劑偶聯(lián)于一種抗體。不論具體的實(shí)施例，含一種以上藥劑的免疫偶聯(lián)物可用各種方法制備，例如，可將一種以上的藥劑物直接偶聯(lián)于一抗體分子或可用接頭提供多個(gè)附著位點(diǎn)。或者可采用載體。載體也可以不同方法攜載藥劑，包括直接，或通過(guò)接頭基團(tuán)共價(jià)鍵合。合適的載體包括蛋白質(zhì)如白蛋白(美國(guó)專(zhuān)利4,507,234)，肽和多糖如氨基葡聚糖(美國(guó)專(zhuān)利4,699,784)。載體也可通過(guò)非共價(jià)鍵合或包囊化如包裹在脂質(zhì)體載體內(nèi)(美國(guó)專(zhuān)利4,429,008和4,873,088)而攜帶藥劑。對(duì)放射性核素試劑特異的載體包括放射性鹵化的小分子和螯合性化合物。例如美國(guó)專(zhuān)利4,735,792披露代表性放射性鹵化的小分子和它們的合成方法。可從含有氮和硫原子作為結(jié)合金屬或金屬氧化物、放射性核素的供體原子的螯合性化合物中產(chǎn)生放射性核素螯合物。例如美國(guó)專(zhuān)利4,673,562披露的代表性螯合化合物及其合成方法。
可采用各種途徑施予抗體和免疫偶聯(lián)物。通常給藥途徑是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或腫瘤切除的床中。顯然抗體/免疫偶聯(lián)物的精確劑量隨所用抗體，腫瘤上的抗原密度和抗體清除率而不同。
本文還提供模擬血液惡性腫瘤相關(guān)免疫原性部分的抗獨(dú)特性抗體?？捎帽娝苤募夹g(shù)產(chǎn)生針對(duì)能特異地結(jié)合血液惡性腫瘤相關(guān)免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段的這種抗體?？躬?dú)特性抗體能模擬血液惡性腫瘤相關(guān)免疫原性部分，這類(lèi)抗體能結(jié)合上述能特異地結(jié)合血液惡性腫瘤相關(guān)免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段。
不考慮最初的血液惡性腫瘤相關(guān)肽特異性抗體的來(lái)源，本發(fā)明可采用完整的抗體、抗體多聚體或該抗體的各種功能性、抗原結(jié)合區(qū)的任一種。示范性的血液惡性腫瘤相關(guān)肽特異性抗體的功能區(qū)包括seFv、Fv、Fab’和F(ab’)2片段。制備這些構(gòu)建物的技術(shù)是該領(lǐng)域熟知的，本文將進(jìn)一步舉例說(shuō)明。
各種因素可能影響抗體構(gòu)建物的選擇。例如由于腎臟內(nèi)完整抗體的主動(dòng)重吸收、免疫球蛋白Fc段的性能所致的半壽期延長(zhǎng)。因此預(yù)計(jì)基于IgG的抗體表現(xiàn)出較其Fab’對(duì)應(yīng)物具有較慢的血液清除率。然而，基于Fab’片段的組合物通常表現(xiàn)出更好的組織滲透能力。
可用非特異性巰基蛋白酶-木瓜蛋白酶蛋白水解整個(gè)免疫球蛋白獲得抗體片段。木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段稱(chēng)為“Fab片段”，各具有一抗原結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)殘余的“Fc片段”。
木瓜蛋白酶應(yīng)先用半胱氨酸、2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇還原活性位點(diǎn)上的巰基而活化。通過(guò)用EDTA(2mM)螯合去除酶貯存液中的重金屬以確保酶活性最高。通常以1∶100重量比將此酶與底物混合在一起。溫育后用碘乙酰胺不可逆地烷化巰基，或簡(jiǎn)單地透析中止反應(yīng)。應(yīng)通過(guò)SDS-PAGE監(jiān)測(cè)消化的完全性，且用蛋白A-瓊脂糖或離子交換層析分離各組分。
常規(guī)制備兔和人IgG的F(ab’)2片段的方法限于用胃蛋白酶水解。提出抗體在重鏈內(nèi)二硫鍵的C端側(cè)要害的條件，是37℃用PH4.5的乙酸緩沖液處理，抗體過(guò)量100倍(重量比)。小鼠IgG的消化速度隨亞類(lèi)而不同，可能難以獲得高產(chǎn)量的活性F(ab’)2片段沒(méi)有未消化或完全降解的IgG。具體講，IgG2a對(duì)完全降解高度敏感。而其它亞類(lèi)要求不同的溫育條件才能產(chǎn)生最佳結(jié)果，這是該領(lǐng)域已知的。
胃蛋白酶處理完整抗體產(chǎn)生的F(ab’)2片段具有二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，仍能交聯(lián)抗原。胃蛋白酶消化大鼠IgG的條件包括用0.1M醋酸緩沖液PH4.5透析，然后與1％(重量比)胃蛋白酶一起溫育4小時(shí)，若4℃先用PH2.8，0.1M甲酸液透析16小時(shí)，再用醋酸緩沖液透析可改進(jìn)消化。IgG2b與鏈球菌V8蛋白酶(3％重量比)在PH78，0.1M磷酸鈉緩沖液中，37℃溫育4小時(shí)所得結(jié)果更一致。
Fab片段也含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段與Fab片段不同處在于其重鏈CH1區(qū)的羧基端添加了幾個(gè)殘基，包括了抗體絞鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。F(ab’)2抗體片段原來(lái)作為Fab’片段配對(duì)產(chǎn)生，二者之間有絞鏈半胱氨酸。也知道其它化學(xué)偶聯(lián)的抗體片段。
術(shù)語(yǔ)“可變區(qū)”本文用于指抗體可變區(qū)的某些部分在序列中存在廣泛差異，可變區(qū)用于結(jié)合和各特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，變異性不是平均分布在抗體可變區(qū)中。而是集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中的三個(gè)區(qū)段，稱(chēng)為“超變區(qū)”。
可變區(qū)中更高度保守部分稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含4個(gè)FR(分別為FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采取β-片層構(gòu)型，通過(guò)形成環(huán)連接的三個(gè)超變區(qū)相連接，在某些情況下形成β-片層結(jié)構(gòu)的一部分。
每條鏈中的超變區(qū)通過(guò)FR與另一條鏈超變區(qū)緊靠在一起，有助于形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(Kabat等，1991，納入本文作參考)。恒定區(qū)不直接參與抗體和抗原的結(jié)合，但顯示各種效應(yīng)功能，如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒性。
術(shù)語(yǔ)“超變區(qū)”本文用于指抗體中負(fù)責(zé)抗體結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包括來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基，(即輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)中的殘基31-35(H1)、50-56(H2)和95-102(H3)(Kabat等，1991，納入本文作參考)，和/或來(lái)自來(lái)自“超變環(huán)”(即輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3))的那些殘基?！皹?gòu)架”或“FR”殘基是除上述超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“FV”片段是含有完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)域由一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)以緊密、共價(jià)連接的二聚體組成。其構(gòu)型中各可變區(qū)的三個(gè)超變區(qū)相互作用限定了VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)超變區(qū)共同賦予此抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單一可變區(qū)(或FV的一半只含有對(duì)抗原特異的三個(gè)超變區(qū))就能識(shí)別和結(jié)合抗原，雖然其親和力較全部結(jié)合位點(diǎn)低。
“單鏈FV”或“sFV”抗體片段含有抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)存在于單一多肽鏈。通常，F(xiàn)V多肽在VH和VL區(qū)之間還含有一個(gè)多肽接頭，使sFV能形抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。
“雙抗體”是具有二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中含有重鏈可變區(qū)(VH)連接于輕鏈可變區(qū)(VL)。所用接頭太短不允許在同一鏈?zhǔn)堑亩€(gè)區(qū)之間配對(duì)，而迫使二區(qū)與另一鏈的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP404,097和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO93/11161，各納入本文作參考?！熬€性抗體”可以是雙特異性或單特異性抗體，含有一對(duì)串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)，如Zapata等(1995)所述，納入本文作參考。
其它類(lèi)型的變體是生物學(xué)性較之產(chǎn)自其親代抗體有所改進(jìn)的抗體。這類(lèi)變體或第二代化合物通常是置換性變體，包括親代抗體的一個(gè)或多個(gè)置換的超變區(qū)殘基。產(chǎn)生這類(lèi)置換變體的方便途徑是采用噬菌體展示的親和力成熟。
采用噬菌體展示的親和力成熟中突變了幾個(gè)超變區(qū)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))，在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。由此產(chǎn)生的抗體變體融合于絲狀噬菌體每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的基因III產(chǎn)物M13，以單價(jià)形式從噬菌體顆粒表面展示。然后如本文所述篩選噬菌體展示變體的生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選超變區(qū)位點(diǎn)，可對(duì)鑒別為非常有助于抗原結(jié)合的超變區(qū)域基進(jìn)行丙氨酸掃描誘變。
另一方面或此外，可描述和分析抗原一抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體與靶之間的接觸點(diǎn)。這些接觸殘基或鄰近殘基是置換的候選殘基。一旦產(chǎn)生了變體，可對(duì)一組變體進(jìn)行篩選，在一種或多種相關(guān)測(cè)定中選出具有類(lèi)似但不同或甚至優(yōu)良特征的抗體作進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。
采用抗體的Fab’或抗原結(jié)合片段具有對(duì)組織穿透的好處，修飾此片段可產(chǎn)生的另一優(yōu)點(diǎn)是增加了半衰期?？刹捎酶鞣N技術(shù)如操作或修飾抗體分子本身，也可將其結(jié)合于隋性載體。任何結(jié)合的唯一目的是增加半衰期而不是為了將藥劑輸送給靶，在所選的Fab’和其它穿透組織的片段中需小心地進(jìn)行這種結(jié)合。然而，可考慮結(jié)合于非蛋白性聚合物如PEG等。
因此修飾而非結(jié)合的依據(jù)是，修飾抗體片段的結(jié)構(gòu)可使其更穩(wěn)定，和/或降低體內(nèi)的分解代謝的速度。這類(lèi)修飾方法的機(jī)制是用D-氨基酸取代L-氨基酸。該領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，引入這類(lèi)修飾后需要精確地測(cè)試所產(chǎn)生的分子，以確保它仍保留所需的生物學(xué)性能。其它穩(wěn)定化修飾包括在N-末端或C-端或二端加入穩(wěn)定化組成成分通常用延長(zhǎng)生物分子的半衰期。僅作為例子，可考慮通過(guò)?；虬被揎棿宋炊?。
本發(fā)明所用的中等結(jié)合類(lèi)型修飾包括在抗體片段中摻入一補(bǔ)救受體結(jié)合表位。實(shí)施的技術(shù)包括突變抗體片段的適當(dāng)區(qū)域或摻入的該表位(作為肽標(biāo)記)使之隨著于抗體片段。見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO96/32478，本文納入其內(nèi)容的目的是進(jìn)一步闡明此技術(shù)。補(bǔ)救受體結(jié)合表位通常是來(lái)自Fc結(jié)構(gòu)域的1個(gè)或2個(gè)環(huán)的3個(gè)或3個(gè)以上的氨基酸區(qū)域，將其轉(zhuǎn)移到抗體片段上的類(lèi)似位置。補(bǔ)救受體結(jié)合表位見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/45331，納入本文作為本發(fā)明的參考。
4.3地血液惡性腫瘤相關(guān)肽特異的T細(xì)胞組合物免疫治療性組合物也可或另外包含對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽特異的T細(xì)胞。這類(lèi)T細(xì)胞一般用標(biāo)準(zhǔn)方法在體外或活體外制備。例如，可分離哺乳動(dòng)物如病人骨髓，外周血或骨髓組分或外周血中存在的T細(xì)胞，采用商品化的細(xì)胞分離系統(tǒng)如IsolexTM系統(tǒng)，購(gòu)自Nexell Therapeutics Inc.(Irvine.CA.見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,240,856、5,215,926，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO89/06280、WO91/16116和WO92/07243)?；蛘呖蓮南嚓P(guān)或無(wú)關(guān)的人、非人哺乳動(dòng)物、細(xì)胞系或培養(yǎng)物中產(chǎn)生T細(xì)胞。
可用血液惡性腫瘤相關(guān)肽、編碼該肽的多核苷酸和/或表達(dá)該肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)刺激T細(xì)胞。在以充足時(shí)間允許產(chǎn)生對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽特異的T細(xì)胞條件下，進(jìn)行這種刺激。優(yōu)選地血液惡性腫瘤相關(guān)肽或多核苷酸存在于輸送載體如微球內(nèi)，以促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生。簡(jiǎn)言之，用常規(guī)技術(shù)(如Ficoll/Hypaque密度梯度離心外周血淋巴細(xì)胞)從病人、或有關(guān)或無(wú)關(guān)供血者中分離T細(xì)胞，與血液惡性腫瘤相關(guān)肽一起培育。例如，將T細(xì)胞體外37℃與血液惡性腫瘤相關(guān)肽(如5-25μg/ml)或合成相當(dāng)量此肽的細(xì)胞一起培養(yǎng)2-9天(一般4天)?？赡苄枰谌狈ρ簮盒阅[瘤相關(guān)肽時(shí)培養(yǎng)另一等份的T細(xì)胞樣品作為對(duì)照。
如果T細(xì)胞殺傷包被血液惡性腫瘤相關(guān)肽或表達(dá)編碼該肽的基因的靶細(xì)胞，就認(rèn)為T(mén)細(xì)胞對(duì)該肽有特異性。T細(xì)胞特異性也可用任何一種標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)評(píng)價(jià)。例如鉻釋放測(cè)定或增殖測(cè)定中，與陰性對(duì)照相比較，裂解和/或增殖的刺激指數(shù)增加二倍以上時(shí)，表明T細(xì)胞特異性?？砂碈hen等(1994)所述進(jìn)行此類(lèi)測(cè)定。另外，可用各種已知技術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞增殖。例如測(cè)定增加的DNA合成的速率(如用氚化胸苷脈沖標(biāo)記培養(yǎng)T細(xì)胞和測(cè)定摻入DNA中的氚化胸苷量)可檢測(cè)T細(xì)胞增殖。檢測(cè)T細(xì)胞增殖的其它方法包括測(cè)定的介素-2(IL-2)產(chǎn)生、Ca2+流動(dòng)或染料攝入，如3-(4，5二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑的攝入。另外，可測(cè)定淋巴因子(如γ干擾素)或定量測(cè)定能對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽起反應(yīng)的T細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。與血液惡性腫瘤相關(guān)肽(200ng/ml-100μg/ml，優(yōu)選100ng/ml-25μg/ml)接觸3-7天應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞增殖提高至少二倍，和/或如上述接觸2-3小時(shí)應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞激活，后者可用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞因子試驗(yàn)測(cè)定，該試驗(yàn)中細(xì)胞因子(如TNF或IFN-γ)釋放水平增加二倍表明T細(xì)胞激活(Coligan等，1998)。可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)展血液惡性腫瘤相關(guān)特異性T細(xì)胞。優(yōu)選實(shí)施例中，刺激和擴(kuò)增后將來(lái)源于病人或有關(guān)或無(wú)關(guān)供血者的T細(xì)胞施予病人。
在對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽、其多核苷酸或?qū)Ρ磉_(dá)該肽的APC應(yīng)答中被激活的T細(xì)胞可以是CD4+和/或CD8+?？梢愿鞣N方法檢測(cè)特異性激活的CD4+或CD8+T細(xì)胞。檢測(cè)特異性T細(xì)胞激活的方法包括檢測(cè)T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子(如淋巴因子)的產(chǎn)生或溶細(xì)胞活性的產(chǎn)生(即對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞的產(chǎn)生)。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，檢測(cè)特異性T細(xì)胞激活的優(yōu)選方法是檢測(cè)T細(xì)胞增殖。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，檢測(cè)特異性T細(xì)胞激活的優(yōu)選方法是檢測(cè)溶細(xì)胞活性的產(chǎn)生。
為治療目的，可體內(nèi)或體外擴(kuò)增對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽、多核苷酸或APC反應(yīng)而增殖的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。體外T細(xì)胞的增殖可采用各種方法進(jìn)行。例如，使該T細(xì)胞再接觸血液惡性腫瘤相關(guān)肽，加或不加T細(xì)胞生長(zhǎng)因子如IL-2，和/或合成血液惡性腫瘤相關(guān)肽的刺激性細(xì)胞。當(dāng)產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞應(yīng)答時(shí)優(yōu)選加入刺激性細(xì)胞。在對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽間歇性再刺激的應(yīng)答中，保持特異性的T細(xì)胞可在體外大量生長(zhǎng)。簡(jiǎn)言之，對(duì)于初次體外刺激(1VS)，可將大量淋巴細(xì)胞(如4×107以上)置于含人血清培養(yǎng)基的燒瓶中。可直接加入血液惡性腫瘤相關(guān)肽(如10μg/ml肽)與破傷風(fēng)類(lèi)毒素(如5μg/ml)。然后培養(yǎng)該燒瓶(如37℃、7天)。對(duì)于第二次1VS，收獲T細(xì)胞，置于具有2-3×107個(gè)照射的外周血單核細(xì)胞的新燒瓶中。直接加入血液惡性腫瘤相關(guān)肽(如10μg/ml)。37℃培養(yǎng)該燒瓶7天，第二次IVS后的第2天和4天，可加入2-5單位的IL-2。對(duì)于第三次IVS，可將T細(xì)胞置于孔中并用個(gè)體自身的EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞(包太的)刺激。每輪的第2和第4天加入IL-2。一旦證明細(xì)胞為特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞，就可在第2、4和6天用較高IL-2(20單位)進(jìn)行10天剌激周期擴(kuò)增這些T細(xì)胞。
或者用克隆方法在數(shù)量上擴(kuò)增存在血液惡性腫瘤相關(guān)肽時(shí)增殖的一種或多種T細(xì)胞?？寺〖?xì)胞的方法是該領(lǐng)域熟知的，包括有限稀釋法?？捎妹芏忍荻入x心和羊紅細(xì)胞玫瑰花結(jié)法純化致敏病人外周血中的反應(yīng)性T細(xì)胞，在存在照射過(guò)的自身浸潤(rùn)細(xì)胞時(shí)，采用命名的抗原刺激培養(yǎng)細(xì)胞建立細(xì)胞克隆。為了產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞系，可采用血液惡性腫瘤相關(guān)肽作為抗原刺激，并用EB病毒感染無(wú)限增殖的自身外周血淋巴細(xì)胞(PBL)或成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCL)作為抗原呈遞細(xì)胞。為了產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞系，用能產(chǎn)生血液惡性腫瘤相關(guān)肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染自身抗原呈遞細(xì)胞，用作刺激細(xì)胞?？稍诳乖碳ず?-4天克隆建立的T細(xì)胞系，方法是在含有1×106個(gè)照射過(guò)的PBL或LCL細(xì)胞和重組IL-2(50U/ml)的96孔平底板中，接種剌激的T細(xì)胞，頻率為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。在首次平板接種和存在自身抗原呈遞細(xì)胞時(shí)用適當(dāng)抗體再刺激后約2-3周，可鑒定具有建立的克隆生長(zhǎng)的孔。抗原刺激后加入低劑量rIL-2(10U/ml)2-3天擴(kuò)增克隆細(xì)胞。約每隔二周通過(guò)定期抗原和IL-2再刺激可在24孔板中維持T細(xì)胞克隆。如所述可將克隆的和/或擴(kuò)增的T細(xì)胞輸回給病人，見(jiàn)Chang等(1996)。
某些實(shí)施例中，可在體內(nèi)和/或體外致每同種異型T細(xì)胞(即對(duì)相關(guān)血液惡性腫瘤敏感)。用T細(xì)胞接觸血液惡性腫瘤相關(guān)肽、編碼該肽的多核苷酸或產(chǎn)生該肽的細(xì)胞在足以致敏T細(xì)胞的條件和時(shí)間下獲得這種致敏。總之，例如通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)的增殖、鉻釋放和/或細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)測(cè)定，如果與血液惡性腫瘤相關(guān)肽接觸導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和/或活化，則認(rèn)為該T細(xì)胞是致敏的。與陰性對(duì)照相比，增殖或裂解的刺激指數(shù)增加二倍以上，細(xì)胞因子水平增加三倍以上，表明T細(xì)胞的特異性?？稍诠撬枰浦仓谢蜃鳛楣w淋巴細(xì)胞灌注，采用體外致敏的細(xì)胞。
血液惡性腫瘤相關(guān)特異性T細(xì)胞可殺傷表達(dá)血液惡性腫瘤相關(guān)蛋白的細(xì)胞。在T細(xì)胞受體(TCR)鏈中導(dǎo)入編碼相關(guān)血液惡性腫瘤相關(guān)的基因用作一種方法在質(zhì)和量上改進(jìn)對(duì)攜帶血液惡性腫瘤相關(guān)肽的白血病和癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。接種能增加與血液惡性腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)的T細(xì)胞數(shù)量的疫苗，是靶向攜帶血液惡性腫瘤相關(guān)細(xì)胞的一種方法。采用血液惡性腫瘤相關(guān)特異性T細(xì)胞治療是另一種方法。另一方法是將地相關(guān)血液惡性腫瘤特異的TCR鏈導(dǎo)入T細(xì)胞或是有裂解潛力的其它細(xì)胞。一合適的實(shí)施例中，從相關(guān)血液惡性腫瘤特異性T細(xì)胞系中克隆獲得TCRα和β鏈，且用于過(guò)繼性T細(xì)胞治療，如WO96/30516所述，納入本文作參考。
4.4藥物組合物和疫苗制劑本發(fā)明某些方面中，可將所述肽、多核苷酸、抗體和/或T細(xì)胞摻入藥物組合物或免疫原性組合物(如疫苗)?；蛘?，所述藥物組合物可含有轉(zhuǎn)染血液惡性腫瘤相關(guān)多核苷酸的抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞)，這樣該抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)血液惡性腫瘤相關(guān)肽。該藥物組合物含有一種或多種這類(lèi)化合物或細(xì)胞和生理上可接受的載體或賦形劑。疫苗可含有一種或多種這類(lèi)化合物或細(xì)胞和免疫刺激劑如佐劑或脂質(zhì)體(化合物摻入其中)。免疫刺激劑可以是能提高或增強(qiáng)對(duì)外原抗原的免疫應(yīng)答(抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo))的物質(zhì)。免疫刺激劑的例子包括佐劑、生物可降解微球體(如聚乳酸半乳交酯)和脂質(zhì)體(化合物摻入其中)(美國(guó)專(zhuān)利4,235,877)。疫苗制品一般描述于Powell和Newman(1995)。本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物和疫苗也可含有生物活性或無(wú)活性的其它化合物。例如可加入其它腫瘤抗原的一種或多種免疫原性部分或摻入融合肽中，或作為組合物或疫苗內(nèi)單獨(dú)的化合物。
某些實(shí)施例中，設(shè)計(jì)藥物組合物和疫苗在患者如人中誘發(fā)對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽特異的T細(xì)胞應(yīng)答。一般通過(guò)采用較短的肽(如天然血液惡性腫瘤相關(guān)肽的23個(gè)以下連續(xù)氨基酸殘基，優(yōu)選4-16個(gè)連續(xù)殘基，更優(yōu)選8-16個(gè)連續(xù)殘基，最優(yōu)選8-10個(gè)連續(xù)殘基)有利于T細(xì)胞應(yīng)答。另一方面或此外，所述疫苗可含有優(yōu)先增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫刺激劑。換言之，該免疫刺激劑可提高T細(xì)胞對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽的應(yīng)答水平，按比例數(shù)量＞增強(qiáng)抗體應(yīng)答的數(shù)量。例如，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)的油性佐劑如CFA相比時(shí)，優(yōu)先增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫刺激劑可提高的增殖性T細(xì)胞應(yīng)答，比相關(guān)的血液惡性腫瘤陰性對(duì)照細(xì)胞系至少高二倍，提高裂解反應(yīng)至少10％和/或提高T細(xì)胞活化至少二倍，雖然沒(méi)有檢測(cè)到抗體應(yīng)答增強(qiáng)。一般可采用該領(lǐng)域已知的任何代表性技術(shù)如本文提供的技術(shù)，來(lái)測(cè)定增強(qiáng)的對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)肽的T細(xì)胞的數(shù)量或抗體應(yīng)答。
藥物組合物或疫苗可含有編碼上述一種或多種肽的DNA，這樣就原位產(chǎn)生了肽。如上所述，可將DNA置于該領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何各種傳遞系統(tǒng)中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。許多基因傳遞技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(Roll and，1998，和本文引用的參考文獻(xiàn))。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)含有在病人中表達(dá)所需的DNA、cDNA或RNA(如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))。細(xì)菌傳遞系統(tǒng)包括給予能在其細(xì)胞表面表達(dá)肽的免疫原性部分或分泌表位的細(xì)菌(如BCG)。一優(yōu)選實(shí)施例中，采用病毒表達(dá)系統(tǒng)(如牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)導(dǎo)入該DNA，此系統(tǒng)涉及采用非致病性(缺陷性)復(fù)制病毒(Fisher-Hoch等，1989；Flexner等，1989，F(xiàn)lexner等，1990；美國(guó)專(zhuān)利4,603,112、4,769,330；5,017,487；國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 89/01973；美國(guó)專(zhuān)利4,777,127；英國(guó)專(zhuān)利GB 2,200,651；歐洲專(zhuān)利EP0,345,242；國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 91/02805；BerKner，1988；Rosenfeld等，1991；Kolls等，1994；Kass-Ersler等，1993；Guzman等，1993a；和Guzman等，1993)。將DNA摻入這類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)是該領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。DNA也可是“裸的”，例如見(jiàn)Ulmer等(1993)所述和Cohen(1993)的綜述?？赏ㄟ^(guò)將該DNA包被在可生物降解的小珠上有效地轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，來(lái)增加裸DNA的攝入。顯然一種疫苗可含有多核苷酸和肽組分。這種疫苗可提供增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
如上所述，藥物組合物或疫苗可含有能表達(dá)血液惡性腫瘤相關(guān)肽的抗原呈遞細(xì)胞。為上述治療目的，該抗原呈遞細(xì)胞優(yōu)選是自身樹(shù)突細(xì)胞?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Reeves等，1996；Tuting等，1998；和Nair等，1998)制備和轉(zhuǎn)染此種細(xì)胞?？捎蒙鲜鲶w外刺激和標(biāo)準(zhǔn)的增殖以及鉻釋放測(cè)定驗(yàn)證抗原呈遞細(xì)胞的表面上血液惡性腫瘤相關(guān)肽的表達(dá)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員懂得本文所述的好處是，疫苗可含有上述多核苷酸和肽的藥學(xué)上可接受的鹽?？蓮乃帉W(xué)上接受的非毒性堿，包括有機(jī)堿(如伯、仲、叔胺和堿性氨基酸的鹽)和無(wú)機(jī)堿(如鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽)制備此種鹽。短語(yǔ)“藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的”指當(dāng)給予合適的動(dòng)物或人時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生副作用、過(guò)敏或其它明顯不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何或所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。用于藥物活性物質(zhì)的這類(lèi)介質(zhì)和制劑是本領(lǐng)域熟知的。應(yīng)考慮用于治療組合物時(shí)，除迄今已知的與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或制劑。對(duì)于人給藥，制品應(yīng)符合食品和藥物管理局的生物制品標(biāo)準(zhǔn)所要求的無(wú)菌、無(wú)熱源、總體安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。組合物中也可摻入補(bǔ)充的活性成分。
雖然本發(fā)明藥物組合物中可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適的載體，但載體的類(lèi)型根據(jù)給藥方式而不同?？蓪⒈景l(fā)明組合物配制成任何合適的給藥方式例如局部、口服、鼻、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)給藥的劑型，對(duì)于胃腸道外給藥如皮下注射，載體最好含有水、鹽水、酒精、脂肪、蠟或緩沖劑。對(duì)于口服給藥，可采用任一上述載體，或固體載體如甘露糖醇，乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可采用生物可降解微球體(如聚乳酸聚羥乙酸鹽)作為本發(fā)明藥物組合物的載體。合適的生物可降解微球體見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252中所述。對(duì)于某些局部應(yīng)用，優(yōu)選用熟知的組分配制成霜?jiǎng)┗蛳磩?br> 這類(lèi)組合物也可含有緩沖劑(如中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽水)、碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)，甘露糖醇、蛋白質(zhì)、肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑，螯合劑如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(如氫氧化鋁)、能賦予該制劑與受者血液等滲、低滲或微高滲的溶質(zhì)、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑?；蛘撸蓪⒈景l(fā)明組合物配制成凍干劑，或用熟知的技術(shù)配制成一種或多種脂質(zhì)體、微球體、納米顆粒或微?；瘋鬟f系統(tǒng)。
在制備本發(fā)明疫苗組合物時(shí)，可采用任何各種免疫刺激劑如佐劑。大多數(shù)佐劑含有保護(hù)抗原免被快速分解的物質(zhì)如氫氧化鋁或礦物油、免疫應(yīng)答刺激劑如脂質(zhì)A、來(lái)源于百日咳鮑特氏菌或結(jié)核分枝桿菌的蛋白質(zhì)。合適的佐劑可從市場(chǎng)上購(gòu)得，如鋁基佐劑(如Alhydrogel、Rehydragel、磷酸鋁；Algammulin，氫氧化鋁)；油基佐劑(弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA 50或Seppic MONTANIDE ISA 720)、基于非離子嵌段共聚物的佐劑、細(xì)胞因子(如GM-CSF或Flat3-配體)；Merck佐劑65(Merck and CompanyInc.Rahway，NJ)；AS-2(Smithkline Beecham，Philadelphia.PA)；鈣、鐵或鋅的鹽；?；野彼岬牟蝗苄詰腋∫海货；牵魂?yáng)離子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解微球體；單磷酰脂質(zhì)A和Quil A。細(xì)胞因子如GM-CSF或IL-2、IL-7或IL-12也可用作佐劑。
血藍(lán)蛋白和血紅細(xì)胞素也可用于本發(fā)明。特別優(yōu)選采用匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，雖然可采用其它軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的血藍(lán)蛋白和血紅細(xì)胞素。也可采用各種多糖佐劑。特別優(yōu)選多糖的聚胺變體如殼多糖和脫乙酰殼多糖。
另一組優(yōu)選佐劑是細(xì)菌肽聚糖的胞壁酰二肽(MDP，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺)。也考慮胞壁酰二肽的衍生物，如氨基酸衍生物蘇氨酰-MDP和脂肪酸衍生物MTPPE。
美國(guó)專(zhuān)利4,950,645描述了胞壁酰二肽的親脂性二糖-三肽衍生物，提議可用于磷脂酰膽堿和磷脂酰甘油形成的人工脂質(zhì)體。據(jù)說(shuō)其能有效激活人單核細(xì)胞和破壞腫瘤細(xì)胞，但通常高劑量時(shí)無(wú)毒性。也提出美國(guó)專(zhuān)利4,950,645和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO91/16347的化合物可用于本發(fā)明的具體方面。
也可采用BCG和BCG細(xì)胞壁骨架(CWS)作為本發(fā)明的佐劑，加或不加海藻糖二霉菌酸?？刹捎煤Ｔ逄嵌咕岜旧?。Azuma等(1988)證明海藻糖二霉菌酸給藥與小鼠對(duì)流感病毒感染的抗性增強(qiáng)相關(guān)?？砂疵绹?guó)專(zhuān)利4,579,945所述制備海藻糖二霉菌酸。
兩親性和表面活性劑如皂苷及衍生物如QS21(Cambridge Biotech)形成了用于本發(fā)明疫苗免疫原的另一類(lèi)優(yōu)選佐劑。也可使用非離子嵌段共聚物表面活性劑(Rabinovich等，1994；Hunter等，1991)。如Yamamoto等(1988)描述的寡核苷酸是另一類(lèi)有用的佐劑。Quil A和香菇多糖也是優(yōu)選佐劑。
還考慮采用超抗原作為本發(fā)明佐劑?！俺乖币话闶羌?xì)菌產(chǎn)物，能刺激比肽抗原更大比例的T淋巴細(xì)胞而無(wú)需抗原加工(Mooney等，1994)。超抗原包括葡萄球菌外蛋白如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的α、β、γ和δ腸毒素和大腸桿菌的α、β、γ和δ外毒素。常見(jiàn)的葡萄球菌腸毒素稱(chēng)為葡萄球菌腸毒素A(SEA)和B(SEB)到腸毒素E(SEE)(Rott等，1992)。釀膿葡萄球菌B(SEB)、產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(Bowness等，1992)、釀膿葡萄球菌的胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白(CAP)(Sato等，1994)和金黃色葡萄球菌的毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)(Schwab等，1993)也是有用的超抗原。
一類(lèi)特別優(yōu)選用于本發(fā)明的佐劑是精制的去毒內(nèi)毒素，如美國(guó)專(zhuān)利4,866,034中所述。這些精制去毒內(nèi)毒素能在哺乳動(dòng)物中有效產(chǎn)生佐劑反應(yīng)。去毒內(nèi)毒素可與其它佐劑聯(lián)用?？紤]去毒內(nèi)毒素與海藻糖二霉菌酸聯(lián)用，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,435,386所述。還參考去毒內(nèi)毒素與海藻糖二霉菌酸及內(nèi)毒素糖脂聯(lián)用(美國(guó)專(zhuān)利4,505,899)，去毒內(nèi)毒素與細(xì)胞壁骨架(CWS)聯(lián)用，或CWS與海藻糖二霉菌酸聯(lián)用，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,436,727；4,436,728和4,505,900。預(yù)計(jì)只聯(lián)用CWS和海藻糖二霉菌酸而無(wú)去毒內(nèi)毒素也有用，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,520,019。
MPL是目前的一種優(yōu)選免疫增強(qiáng)劑，可用于本發(fā)明。關(guān)于MPL用途的參考文獻(xiàn)包括Tomai等(1987)，Chen等(1991)和Garg和Subbarao(1992)，各關(guān)于MPL在老齡小鼠反應(yīng)中的某些作用；Ellioff等(1991)報(bào)道了D-半乳糖胺負(fù)載小鼠及其對(duì)脂多糖和MPL敏感性的增強(qiáng)；Chase等(1986)報(bào)道了與細(xì)菌感染的關(guān)系，Masihi等(1988)報(bào)道了MPL和內(nèi)毒素對(duì)小鼠的抗鼠弓體的作用。Fitzgerald(1991)也報(bào)道用MPL上調(diào)梅毒疫苗的免疫原性且賦予家兔明顯的抗攻擊性感染的保護(hù)作用。
如以上模型系統(tǒng)所證明，已知MPL使用安全。I期臨床試驗(yàn)也顯示MPL使用安全(Vosika等，1984)。的確，已知人用時(shí)100μg/m2是安全的，即使門(mén)診使用(Vosika等，1984)。
MPL一般誘導(dǎo)多克隆B細(xì)胞活化(Baker等，1994)，已證明能在許多系統(tǒng)如免疫不成熟小鼠(Baker等，1988)；老齡小鼠(Tomai和Johnson，1989)和裸鼠及Xid小鼠(Madonna和Vogel，1986；Myers等，1955)中增強(qiáng)抗體產(chǎn)生。顯示能產(chǎn)生針對(duì)紅細(xì)胞(Hraba等，1993)、T細(xì)胞依賴和不依賴抗原、Pnu-免疫疫苗(Garg和Subbarao，1992)、分離的腫瘤相關(guān)抗原(美國(guó)專(zhuān)利4,877,611)、同系腫瘤細(xì)胞(Livingston等，1985；Ravindranath等，1994a；b)、腫瘤相關(guān)神經(jīng)節(jié)苷脂(Ravindranath等，1994a；b)的抗體。
MPL的另一用途是增強(qiáng)IgM應(yīng)答，Baker等(1988a)報(bào)道MPL能提高幼齡小鼠的抗體應(yīng)答。本發(fā)明某些實(shí)施例中顯示了此佐劑的特別有用的特點(diǎn)。Myers等(1995)最近報(bào)道通過(guò)不依賴T細(xì)胞抗體產(chǎn)生MPL誘導(dǎo)IgM抗體的能力。Myers等(1995)的研究中，將MPL與半抗原TNP偶聯(lián)。MPL可用作其它半抗原如肽的載體。MPL也可激活和募集巨噬細(xì)胞(Verma等，1992)。Tomai和Johnson(1989)證明MPL-刺激的T細(xì)胞增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞分泌IL-1。還知道MPL能激活超氧化物的產(chǎn)生、溶菌酶活性、吞噬、和殺傷鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的念珠菌(Chen等，1991)。
MPL對(duì)T細(xì)胞的作用包括在BCG-致敏小鼠的血清中產(chǎn)生內(nèi)源性細(xì)胞毒因子如TNF(Bennett等，1988)。Kovach等(1990)和Elliot等(1991)也證明MPL誘導(dǎo)TNF活性。已知MPL與TNF-α作用以誘導(dǎo)NK細(xì)胞釋放IFN-γ。Tomai和Johnson(1989)及Odean等(1990)也證明在T細(xì)胞對(duì)MPL反應(yīng)中產(chǎn)生IFN-γ。
也已知MPL是強(qiáng)的T細(xì)胞佐劑。例如，MPL刺激黑色素瘤-抗原特異性CTL的增殖(Mitchell等，1988，1993)。另外，Baker等(1988b)證明無(wú)毒MPL滅活了抑制型T細(xì)胞的活性。當(dāng)然，已認(rèn)識(shí)到在生理環(huán)境中，滅活T抑制型細(xì)胞能增加對(duì)動(dòng)物的好處，如提高抗體產(chǎn)量。Jonson和Tomai(1988)報(bào)道了MPL的佐劑作用的可能的細(xì)胞和分子介體。
也知道MPL能誘導(dǎo)血小板凝聚和磷酸化血小板蛋白，繼而誘導(dǎo)5-羥色胺分泌(Grabarek等，1990)。此研究表明MPL參與了蛋白激酶C的活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
許多文章關(guān)于MPL的結(jié)構(gòu)和功能。這些文章包括Johnson等(1990)描述獲自明尼蘇達(dá)沙門(mén)菌Re595脂多糖的MPL同系物的結(jié)構(gòu)特征。Johnson等(1990)與Grabarek等(1990)共同證明，MPL的脂肪酸部分可不同，即使是商品化種類(lèi)。用薄層層析可將MPL分成8個(gè)組分，Johnson等(1990)用人血小板反應(yīng)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)三個(gè)特別有活性。Johnson等(1990)征了各種MPL的化學(xué)組分。
Baker等(1992)還分析了影響脂質(zhì)A及其類(lèi)似物消除抑制型T細(xì)胞活性表達(dá)能力的結(jié)構(gòu)特征。他們報(bào)道說(shuō)，將脂質(zhì)A的磷酸基因從二個(gè)減少到一個(gè)(即產(chǎn)生單磷酸脂質(zhì)A，MPL)以及主要去除3位殘基減少脂肪?；浚瑢?dǎo)致毒性逐漸降低，然而這些結(jié)構(gòu)修飾不影響其消除TS功能表達(dá)的能力(Baker等，1992)。這些類(lèi)型的MPL用于本發(fā)明是理想的。
Baker等(1992)還證明將脂肪?；繌?減至4(脂質(zhì)A前體IVA或Ia)消除了影響TS功能的能力，但不誘導(dǎo)B細(xì)胞的多克隆活化。這些研究表明為了能消除TS功能的表達(dá)，脂質(zhì)A必須是葡糖胺二糖，可具有一或二個(gè)磷酸基團(tuán)，且必須具有至少5個(gè)脂肪酰基。另外，非羥基化脂肪酸的鏈長(zhǎng)和酰氧?；?2’和3’位)的位置可能起重要作用(Baker等，1992)。
研究脂肪?；逆滈L(zhǎng)和位置間關(guān)系對(duì)消除脂質(zhì)a表達(dá)抑制型T細(xì)胞(Ts)活性的能力后，Baker等(1994)發(fā)現(xiàn)，鏈長(zhǎng)C12-C14的脂肪?；坪跎锘钚宰罴?。因此，雖然它們?nèi)钥墒褂?，但本發(fā)明不太優(yōu)選采用脂肪基鏈長(zhǎng)較短(銅綠假單胞菌和紫色色桿菌的C10-C12)；或主要是長(zhǎng)鏈(幽門(mén)螺桿菌的C18)的脂質(zhì)A制品。
Baker等(1994)還證明一些細(xì)菌多糖的脂質(zhì)A近側(cè)內(nèi)核心區(qū)寡糖能提高TS活性的表達(dá)，主要由于革蘭陰性菌結(jié)構(gòu)中相對(duì)保守的這類(lèi)寡糖能擴(kuò)大或擴(kuò)增對(duì)無(wú)關(guān)微生物抗原的正?？贵w應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的CD8+Ts細(xì)胞群。據(jù)報(bào)道，增加所見(jiàn)免疫抑制表達(dá)所需的最小結(jié)構(gòu)是一個(gè)六糖，其含有2-酮基-3-脫氧辛酸殘基、二個(gè)葡萄糖殘基和三個(gè)庚糖殘基(其上附著有二個(gè)焦磷酸乙醇胺基團(tuán)Baker等(1994)。這些信息可考慮在本發(fā)明中利用或設(shè)計(jì)另外的佐劑。
相關(guān)研究中，Tanamoto等(1994a；b；1995)描述化學(xué)合成的脂質(zhì)A前體，在乙?；蜱牾；髢?nèi)毒素活性的解離。因此，本發(fā)明也考慮采用“乙酰406”和“琥珀酰516”等化合物(Tanamoto等，1994a；b；1995)。
合成的MPL形成一種特別優(yōu)選的抗原。例如，Brade等(1993)描述一種含脂質(zhì)A的雙磷?；咸前范枪羌艿娜斯ぬ蔷Y合物能結(jié)合抗脂質(zhì)a單抗。這是用于本發(fā)明某些方面的一個(gè)候選物。
具體考慮本發(fā)明采用美國(guó)專(zhuān)利4,987,237所述的MPL衍生物。該專(zhuān)利描述MPL衍生物通過(guò)脂基團(tuán)連接于單磷酰脂質(zhì)A核的伯羥基的側(cè)鏈上含有一個(gè)或多個(gè)游離基團(tuán)如銨基。衍生物提供了偶聯(lián)脂質(zhì)A的方便方法，即通過(guò)偶聯(lián)劑將脂質(zhì)A與各種生物活性材料偶聯(lián)，并保持脂質(zhì)A的免疫刺激劑性能。美國(guó)專(zhuān)利4,987,237中的所有MPL衍生物都考慮用作本發(fā)明的MPL佐劑摻入的細(xì)胞。
各種佐劑，甚至于通常不用于人類(lèi)的那些，仍可用于動(dòng)物，例如，人們希望產(chǎn)生抗體或隨后獲得活化的T細(xì)胞。例如當(dāng)采用未照射的腫瘤細(xì)胞時(shí)可能發(fā)生，從佐劑或細(xì)胞中產(chǎn)生的毒性或其它副作用在這種情況下是沒(méi)關(guān)系的。
本文所述疫苗中，佐劑組合物最好設(shè)計(jì)成能誘導(dǎo)Th1型占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。高水平的Th1型細(xì)胞因子(如IFN-r、TNF-α、IL-2和IL-12)傾向于誘導(dǎo)對(duì)給與抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。相反，高水平的Th2型細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。應(yīng)用本文所述疫苗后，病人將維持包括Th1和Th2型的免疫應(yīng)答。優(yōu)選實(shí)施例中，其中免疫應(yīng)答以Th1型占優(yōu)勢(shì)，Th1型細(xì)胞因子水平的增加高于Th2型細(xì)胞因子的水平。采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)不難評(píng)估這些細(xì)胞因子的水平。細(xì)胞因子家族的綜述可參見(jiàn)Mosmann和Coffman(1989)。
用于誘導(dǎo)Th1型占優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的優(yōu)選佐劑包括，例如單磷酰脂質(zhì)A(優(yōu)選3-脫氧?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)a(3D-MPL)與鋁鹽合用。MPL佐劑可從Corixa Corporation(Seattle WA；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094，其各自納入本文作參考)購(gòu)買(mǎi)到。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是非甲基化的)也誘導(dǎo)Th1型占優(yōu)勢(shì)的應(yīng)答，這類(lèi)寡核苷酸是熟知的，例如可參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO96/02555和WO99/33488中所述。Sato等(1996)也描述了免疫刺激DNA序列。另一種優(yōu)選的佐劑是皂苷，優(yōu)選是QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)，可單獨(dú)或與其它佐劑聯(lián)用。例如，一種強(qiáng)化系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合，如QS21和3D-MPL的組合(見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO94/00153)或一種反應(yīng)原性較低的組合物，其中QS21用膽固醇猝滅(見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO96/33739)。其它優(yōu)選制劑包括水包油乳劑和生育酚。特別強(qiáng)的佐劑包括QS21、3D-MPL和上述水包油乳劑中的生育酚(見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO95/17210)。
其它優(yōu)選佐劑包括Montanide ISA720(Seppic)、SAF(Chiron)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBA系列佐劑(如SBAS-2或SBAS-4、購(gòu)自SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)、Detox(Corixa公司)、RC-529(Corixa公司)和氨烷基氨基葡糖苷-4-磷酸鹽(AGPs)。
本發(fā)明的任何疫苗可用熟知的方法制備，即將一種或多種抗原，一種或多種免疫刺激劑或佐劑，以及一種或多種合適的載體，賦形劑或藥學(xué)上可接受的緩沖劑組合在一起。本文所述組合物可作為緩釋劑型給藥(即以多糖組成的膠囊、海綿或凝膠劑型、能在給藥后緩慢釋放其中的化合物)?？刹捎檬熘夹g(shù)(Coombes等，1996)制備此種制劑，并通過(guò)口服、直腸或皮下植入在所需的靶位或植入)給藥。緩釋制劑可含有分散在載體基質(zhì)和/或包含在儲(chǔ)存器(被速率控制膜包圍)中的肽、多核苷酸或抗體。
這類(lèi)制劑中所用的載體優(yōu)選生物相容性，也可以是生物可降解的，優(yōu)選提供較恒定水平的活性成分釋放的制劑。這類(lèi)載體包括聚(丙交酯-共乙交酯)的微顆粒以及聚丙烯酸、乳膠、淀粉、纖維素和葡聚糖。其它緩釋載體包括超分子生物載體，其含有非液態(tài)親水核心(如交聯(lián)的多糖或寡糖)和任選的含兩親性化合物如磷脂的外層(美國(guó)專(zhuān)利5,151,254、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO94/20078；WO94/23701和WO96/06638)。緩釋制劑中活性化合物的量取決于植入部位、釋放的速度和預(yù)計(jì)持續(xù)時(shí)間，及待防治疾病的性質(zhì)。
所述藥物組合物和疫苗中可采用任何各種傳遞載體，以促進(jìn)產(chǎn)生靶向腫瘤細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答。傳遞載體包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和可被基因改造成有效的APC的其它細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可以但不需要基因修飾以提高其提呈抗原的能力，改進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答的活化和/或維持本身具有的抗腫瘤作用，和/或在免疫學(xué)上與接受者相容(即配對(duì)的HLA單倍型)。一般可從各種生物液體和器官，包括腫瘤和腫瘤外周組織中分離得到APC，且可以是自體的、同種異體的，同種或異種細(xì)胞。
本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施例采用樹(shù)突細(xì)胞或其后代細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞是很強(qiáng)的APC(Banchereau和Steinman，1998)，已證明其有效作為誘導(dǎo)預(yù)防或治療抗腫瘤免疫性的生理性輔劑(Timmerman和Levy，1999)。通?？筛鶕?jù)其典型形態(tài)(原位星狀，顯著的胞質(zhì)突(樹(shù)突)體外可見(jiàn))，攝取、加工和高效呈遞抗原的能力及激活原初T細(xì)胞應(yīng)答的能力，來(lái)鑒定樹(shù)突細(xì)胞。當(dāng)然可基因改造樹(shù)突細(xì)胞以表達(dá)通常在體內(nèi)或活體內(nèi)樹(shù)突細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性細(xì)胞表面受體或配體，這類(lèi)修飾的樹(shù)突細(xì)胞也是本發(fā)明考慮的。另一種樹(shù)突細(xì)胞，分泌性載體、抗原負(fù)載的樹(shù)突細(xì)胞(稱(chēng)為外染色體)也可用于疫苗中(Zitvogel等，1998)。
樹(shù)突細(xì)胞可獲自外周血、骨髓、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞、腫瘤外周組織浸潤(rùn)細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟、皮膚、臍帶血或任何其它合適的組織或液體。例如，可通過(guò)在獲自外周血單核細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入組合細(xì)胞因子如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα活體外分化樹(shù)突細(xì)胞。或者，在培養(yǎng)基中加入能誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞分化、成熟和增殖的GM-CSF、IL-3、TNF-α、CD40配體、LPS、fit3配體和/或其它化合物，使獲自外周血、臍帶血或骨髓的CD34陽(yáng)性細(xì)胞分化為樹(shù)突細(xì)胞。
可方便地將樹(shù)突細(xì)胞分成“不成熟”和“成熟”細(xì)胞，這是在兩種鑒定良好的表型之間區(qū)別的簡(jiǎn)單方法。然而這種命名法不應(yīng)認(rèn)為排除了所有可能的分化中間期。不成熟樹(shù)突細(xì)胞被稱(chēng)為PAC，其抗原攝取和加工能力高，這與FCr受體和甘露糖受體的高表達(dá)相關(guān)。成熟表型的典型特征是這些標(biāo)志的表達(dá)較低，但負(fù)責(zé)T細(xì)胞活化的細(xì)胞表面分子，如I類(lèi)和II類(lèi)MHC分子、粘附分子(如CD54和CD11)和共刺激分子(如CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表達(dá)。
一般用編碼血液惡性腫瘤相關(guān)肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染APC，在細(xì)胞表面上表達(dá)肽或其抗原性部分?？苫铙w外進(jìn)行這種轉(zhuǎn)染，含這種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物或疫苗可用于上述治療目的?；蛘?，可將靶向樹(shù)突細(xì)胞或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因傳遞載體給予病人，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染。可用該領(lǐng)域已知的任何方法如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO97/24947中所述的方法或Mahvi等(1997)所述基因槍方法進(jìn)行樹(shù)突狀細(xì)胞的體內(nèi)或活體內(nèi)轉(zhuǎn)染。可將樹(shù)突細(xì)胞或祖細(xì)胞與血液惡性腫瘤相關(guān)肽、DNA(裸或在質(zhì)粒載體中)或RNA一起培育，或與表達(dá)抗原的重組細(xì)菌或病毒(如牛痘、禽痘、腺病毒或慢病毒載體)一起培育，獲得樹(shù)突細(xì)胞的抗原負(fù)載。負(fù)載前可將此肽共價(jià)偶聯(lián)于提供T細(xì)胞輔助的免疫伙伴(如載體分子)?；蛘?，可單獨(dú)或存在此肽時(shí)用非偶聯(lián)的免疫伙伴脈沖剌激樹(shù)突細(xì)胞。
也考慮聯(lián)合治療，可采用同一類(lèi)型的所述藥物組合物作單一和聯(lián)合藥物。所述疫苗和藥物組合物可裝在單位劑量或多劑量容器，如安瓿或小瓶中。這些容器最好密封保持制劑的無(wú)菌，直到使用。一般將這類(lèi)制劑作為懸浮液、溶液或乳液貯存在油性和水性載體中。或者，可將所述疫苗或藥物組合物凍干貯存，使用前只需加入無(wú)菌液態(tài)載體即可。
4.5血液惡性腫瘤疾病的診斷和預(yù)后方法本發(fā)明還提供檢測(cè)與上述一種或多種多肽或多核苷酸組合物相關(guān)的惡性腫瘤疾病的方法，以及監(jiān)測(cè)免疫接種或治療此類(lèi)疾病效果的方法。為了確定是否存在與上述一種或多種多肽或多核苷酸組合物相關(guān)的惡性腫瘤疾病，可測(cè)試病人的對(duì)一種或多種組合物特異的T細(xì)胞的水平。某些方法中，從病人中分離含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的生物樣品，與上述一種或多種多肽或多核苷酸組合物一起培育，和/或檢測(cè)表達(dá)一種或多種所述肽或多肽的APC，以及是否存在T細(xì)胞的特異性激活。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細(xì)胞。例如，可用常規(guī)方法(如Ficoll/Hypaque密度梯度離心外周血淋巴細(xì)胞)從病人中分離T細(xì)胞。37℃體外將T細(xì)胞與上述一種或多種肽、多肽或多核苷酸組合物(如5-25μg/ml)一起培育2-9天(一般4天)。需要在缺乏所述組合物時(shí)培養(yǎng)另一等分的T細(xì)胞樣品作為對(duì)照。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，最好通過(guò)評(píng)價(jià)T細(xì)胞增殖來(lái)檢測(cè)活化。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，最好通過(guò)評(píng)價(jià)溶細(xì)胞活性來(lái)檢測(cè)活化。增殖水平至少比無(wú)病者高兩倍或溶細(xì)胞活性水平至少比無(wú)病者高20％，表明存在與上述一種或多種多肽或多核苷酸組合物的表達(dá)相關(guān)的惡性腫瘤疾病。再采用該領(lǐng)域熟知的方法，進(jìn)行增殖水平和/或溶細(xì)胞活性與對(duì)治療預(yù)計(jì)反應(yīng)之間的相關(guān)分析。具體說(shuō)，可預(yù)計(jì)顯示了較高抗體、增殖和/或裂解反應(yīng)的病人對(duì)治療顯示較大的反應(yīng)。
其它方法中，測(cè)定病人的生物樣品中對(duì)上述一種或多種血液惡性腫瘤相關(guān)肽或多肽特異的抗體水平。將該生物樣品與血液惡性腫瘤相關(guān)肽或多肽，或編碼肽或多肽的多核苷酸，和/或表達(dá)肽或多肽的APC在適當(dāng)條件下一起培育足夠時(shí)間，以形成免疫復(fù)合物。然后，檢測(cè)所選肽或多肽與生物樣品中特異性結(jié)合所述肽或多肽的抗體之間形成的免疫復(fù)合物。此方法中所用的生物樣品可以是獲自預(yù)計(jì)含有抗體的病人的任何樣品。合適的生物樣品包括血液、腹水、骨髓、胸腔積液和腦脊液。
將反應(yīng)混合物中的生物樣品與所選肽或多肽在適當(dāng)條件下培育足夠時(shí)間，以使所選肽或多肽與對(duì)肽或多肽有免疫特異性的抗體之間形成免疫復(fù)合物。例如，將生物樣品與所選肽或多肽于4℃培育24-48小時(shí)。
培育后檢測(cè)反應(yīng)混合物中存在的免疫復(fù)合物。檢測(cè)所選肽或多肽與生物樣品中存在的抗體之間形成的免疫復(fù)合物，可采用各種已知技術(shù)如放射免疫測(cè)定(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行。合適的測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的，并可參見(jiàn)科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)的詳述(Harlow和Lane，1988)?？捎玫臏y(cè)定包括但不限于雙單抗夾心免疫測(cè)定技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4,376,110)，單克隆-多克隆抗體夾心測(cè)定(Wide等，1970)；“Western印跡”法(美國(guó)專(zhuān)利4,452,901)；標(biāo)記配體的免疫沉淀(Brown等，1980)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Raines和Ross，1982)；包括利用熒光色素的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(Brooks等，1980)和活性的中和作用(Bowen Pope等，1984)。其它免疫測(cè)定包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074和4,098,876中所述的測(cè)定。
為了檢測(cè)目的，所選肽或多肽可標(biāo)記或不標(biāo)記。不標(biāo)記的多肽和肽可用于凝集測(cè)定或與標(biāo)記的檢測(cè)試劑聯(lián)用，該標(biāo)記的試劑能結(jié)合所述免疫復(fù)合物(如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素，和能結(jié)合第一抗體(此抗體能特異性結(jié)合所選血液惡性腫瘤相關(guān)肽或多肽)的第二抗體和/其抗原結(jié)合片段。如果標(biāo)記所選肽或多肽，報(bào)道基團(tuán)可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的報(bào)道基團(tuán)，包括放射性同位素、熒光基團(tuán)、發(fā)光基團(tuán)、酶、生物素和染料顆粒。
某些測(cè)定中，將不標(biāo)記的肽或多肽固定在固相支持物上。固相支持物可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的、可附著肽的任何材料。例如，固相支持物可以是微量滴定板中的測(cè)試孔，或硝酸纖維素或其它合適的膜?；蛘?，該支持物可以是小珠或園片，如玻璃、玻璃纖維、膠乳或塑料如聚苯乙烯或聚氯乙烯。該支持物也可以是磁性顆粒或光纖傳感器，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,359,681所述?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的，專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)中詳述的各種技術(shù)，將所述肽固定在固相支持物上。本文中，“固定”指非共價(jià)結(jié)合如吸附和共價(jià)結(jié)合(可以是抗原和支持物上的功能基團(tuán)之間的直接連接，或可以通過(guò)交聯(lián)劑連接)。優(yōu)選通過(guò)吸附固定于微量滴定板的孔中或膜上。在這種情況下，可使所選肽或多肽在合適的緩沖液中與固支持物接觸適當(dāng)時(shí)間來(lái)獲得吸收。接觸時(shí)間因溫度而不同，但通常在約1小時(shí)至約1天之間。一般接觸塑料(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)微量滴定板的孔所用肽量的范圍為約10ng至約10μg，優(yōu)選約100ng至約1μg，以充分固定足夠量的肽。
固定后，通常要封閉支持物上的殘留蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道可使用任何合適的封閉劑，如牛血清白蛋白、TweenTM20(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)熱滅活的正常山羊血清(NGS)或BLOTTO(無(wú)脂干奶粉的緩沖液，也含有防腐劑、鹽和消泡劑)。然后將此支持物與懷疑含有特異性抗體的生物樣品一起培育。樣品可不稀釋或更常用含少量(0.1-0.5％重量)蛋白如BSA，NGS或BLOTTO的緩沖液稀釋后加入。通常適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間(即培育時(shí)間)是足以檢測(cè)到樣品中存在的抗體或其抗原結(jié)合片段的時(shí)間，所述抗體對(duì)所選肽或多肽有免疫特異性。優(yōu)選接觸時(shí)間是足以結(jié)合和未結(jié)合抗體或抗體片段之間達(dá)到平衡時(shí)的至少約95％的結(jié)合水平。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，達(dá)到平衡所需時(shí)間不難通過(guò)測(cè)定該期間段發(fā)生的結(jié)合水平來(lái)確定。室溫培育時(shí)間約30分鐘通常足夠。
可用適當(dāng)?shù)木彌_液如含0.1％TweenTM20的PBS洗滌固相支持物，去除未結(jié)合樣品。然后加入能結(jié)合免疫復(fù)合物(其至少含有第一種可檢測(cè)標(biāo)記或“報(bào)道”分子)的檢測(cè)試劑。將該檢測(cè)試劑與免疫復(fù)合物一起培育足夠時(shí)間以檢測(cè)結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。一般通過(guò)測(cè)定該時(shí)間段發(fā)生的結(jié)合水平確定適合的時(shí)間量。然后除去未結(jié)合標(biāo)記或檢測(cè)試劑，用合適的試驗(yàn)或分析儀器檢測(cè)結(jié)合的標(biāo)記或檢測(cè)試劑。檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)所用方法取決于報(bào)道基團(tuán)的性質(zhì)。對(duì)于放射性標(biāo)記物，一般適用閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影方法。分光光度法可用于檢測(cè)染料、發(fā)光或化學(xué)發(fā)光部分及各種色原、熒光標(biāo)記物等。偶聯(lián)于不同報(bào)道基團(tuán)(常為放射性或熒光基團(tuán)或酶)的生物素可用親和素檢測(cè)。酶報(bào)道基團(tuán)(如辣根過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶)一般可通過(guò)加入底物(通常一個(gè)特定時(shí)間段)，然后用分光光度計(jì)或其它分析反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)。不論所用的具體方法，結(jié)合的檢測(cè)試劑水平比本底(即獲自無(wú)病者的生物樣品中所觀察到的水平)至少高二倍時(shí)，表明存在與表達(dá)所選肽或多肽相關(guān)的惡性疾病。
通常，監(jiān)測(cè)免疫接種或治療效果的方法，包括監(jiān)測(cè)樣品中或動(dòng)物如病人中對(duì)所選肽或多肽特異的抗體或T細(xì)胞水平中的變化。監(jiān)測(cè)抗體水平的方法包括以下步驟(a)將獲自治療或免疫接種前病人的第一種生物樣品與所選肽或多肽一起培育，其中培育的條件和時(shí)間足以形成免疫復(fù)合物；(b)檢測(cè)所選肽或多肽與生物樣品中能特異性結(jié)合所選肽或多肽的抗體或抗原結(jié)合片段之間形成的免疫復(fù)合物；(c)用以后時(shí)間例如治療或免疫接種后采自該病人的第二種生物樣品重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)比較第一和第二種生物樣品中檢測(cè)到的免疫復(fù)合物的量?；蛘?，可用編碼所選肽或多肽的多核苷酸，或表達(dá)所選肽或多肽的APC代替所選肽或多肽本身。這些方法是檢測(cè)多核苷酸編碼的或APC所表達(dá)的所選肽或多肽和生物樣品中的抗體和或抗原結(jié)合片段之間的免疫復(fù)合物。
監(jiān)測(cè)T細(xì)胞活化和/或血液惡性肽特異性前體的方法，可包括以下步驟(a)將獲自治療或免疫接種前病人的含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的第一種生物樣品(如骨髓、外周血或其組分)與血液惡性肽或多肽一起培育，其中培育的條件和時(shí)間足以使T細(xì)胞特異性活化、增殖和/或裂解；(b)檢測(cè)T細(xì)胞活化、增殖和/或裂解的量；(c)用治療或免疫接種后采自同一病人的含有CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的第二種生物樣品重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)比較第一和第二種生物樣品中的T細(xì)胞活化、增殖和/或裂解的量?；蛘呖捎镁幋a血液惡性腫瘤相關(guān)肽的多核苷酸或表達(dá)此肽的APC代替血液惡性腫瘤肽本身。
以上方法中所用生物樣品可以是獲自病人的、預(yù)計(jì)含有抗體、CD4+T細(xì)胞和/或CD8+T細(xì)胞的任何樣品。合適的生物樣品包括血液、血清、腹水、骨髓、胸腔積液和腦脊液。第一種生物樣品可獲自治療或免疫接種開(kāi)始之前，或部分完成治療或免疫接種方案時(shí)。第二種生物樣品應(yīng)以類(lèi)似方法獲得，但時(shí)間在治療或免疫接種之后。第二種生物樣品可獲自治療或免疫接種完成時(shí)或部分完成時(shí)，只要第一和第二種生物樣品分離至少已進(jìn)行了部分治療或免疫接種。
二種樣品的培育和檢測(cè)步驟一般按上述進(jìn)行。第二種樣品中的免疫復(fù)合物的量比第一種樣品有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加，反映治療或免疫接種成功。
4.6藥物組合物和制劑的給藥某些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用藥學(xué)上可接受的溶液配制上述一種或多種多核苷酸、多肽、肽、抗體或抗原結(jié)合片段組合物，單獨(dú)或與抗癌癥治療的一種或多種其它方式組合，或與一種或多種診斷或治療劑組合給予細(xì)胞或動(dòng)物。
也可理解，若需要，可將上述核酸片段、RNA或DNA組合物與其它制劑如蛋白質(zhì)或肽或各種藥物活性劑組合給藥。只要該組合物至少含有一種上述基因表達(dá)構(gòu)建物，事實(shí)上不限制也可包含其它組分，只要加入的制劑與靶細(xì)胞或宿主組織接觸時(shí)不產(chǎn)生顯著副作用。如需要時(shí)，RNA或DNA衍生物組合物可與其它各種制劑一起傳遞。這類(lèi)RNA或DNA組合物可從宿主細(xì)胞或其它生物來(lái)源純化得到，或者可如上述化學(xué)合成。同樣，這類(lèi)組合物可含有取代或衍生的RNA或DNA組合物。這類(lèi)組合物可包括一種或多種治療性基因構(gòu)建物，單用或與一種或多種修飾的肽或核酸取代衍生物和/或其它抗癌治療劑組合。
隨著合適給藥和治療方案的發(fā)展，藥學(xué)上可接受的賦形劑和載體溶液的配制是精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，以將本文所述的特定組合物用于各種治療方案，包括例如口服、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、前列腺內(nèi)、腫瘤內(nèi)和/或肌肉內(nèi)施用和制劑。
4.6.1注射輸藥本文所述藥物組合物例如可通過(guò)胃腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或甚至腹膜內(nèi)給藥，如美國(guó)專(zhuān)利5,543,159；5,641,515和5,399,363所述(各自納入本文作為參考)?？蓪⑺c表面活性劑如羥丙基纖維素適當(dāng)混合，制備活性化合物的游離堿或藥學(xué)上可接受鹽的溶液。也可用甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物和油制備分散劑。在普通的貯藏和使用條件下，這些制品應(yīng)含有防腐劑以預(yù)防微生物生長(zhǎng)。
適合于注射的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散液，和無(wú)菌粉劑臨用時(shí)配成無(wú)菌注射液或分散液(美國(guó)專(zhuān)利5,466,468，納入本文參考)。所有情況下制劑必須無(wú)菌，必須是易用針筒裝的液體。在生產(chǎn)和貯藏條件下必須穩(wěn)定，必須防止微生物如細(xì)菌和真菌污染。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)，其合適的混合物和/或植物油?？删S持合適的流動(dòng)性，例如通過(guò)采用包衣如卵磷脂，可通過(guò)使用表面活性劑保持分散劑中所需的顆粒大小。可加入各種抗細(xì)菌和抗真菌劑如對(duì)羥基苯甲酸脂、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等產(chǎn)生防止微生物的作用。許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑如糖和氯化鈉。可通過(guò)在組合物中采用延緩吸收劑，如單硬脂酸鋁和明膠延長(zhǎng)可注射的組合物的吸收。
若需要，胃腸道外給藥的水溶液應(yīng)適當(dāng)?shù)鼐彌_，可用足量的鹽和糖使液體稀釋液等滲。這些特定的水溶液尤其適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本文所述將知道可用的無(wú)菌含水介質(zhì)。例如，可將一個(gè)劑量溶于1ml等滲NaCl液中，加入到100ml的皮下輸液中或在提出的輸注部位注射(見(jiàn)例如Hoover，1970)。一些劑量變化是需要的，取決于待治療者的狀況。在任何情況下，負(fù)責(zé)給藥的人將決定個(gè)體對(duì)象的適合劑量。此外，對(duì)于人施用，制品應(yīng)符合FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌、致熱原性、總體安全和純度標(biāo)準(zhǔn)?？蓪⑺枇康幕蛑委煒?gòu)建物和幾種其它上述成分摻入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，如需要然后過(guò)濾除菌制備無(wú)菌注射液。通常將多種滅菌活性組分摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的上述其它組分的無(wú)菌載體中制成分散液。制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉未時(shí)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥或凍干技術(shù)，從其預(yù)先除菌過(guò)濾液制備活性組分和其它所需成分的粉末。
上述組合物可配制為中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括用無(wú)機(jī)酸如鹽酸或磷酸或有機(jī)酸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成鹽。與游離羧基形成的鹽可衍生自無(wú)機(jī)堿如鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵和有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等。配制時(shí)將此溶液以與劑型相配方式和治療有效量給藥。該制劑可以各種劑型如注射溶液、藥物釋放膠囊等易于給藥。
本文所用的“載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、載體、包衣、稀釋液、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。藥物活性物質(zhì)所用的這類(lèi)介質(zhì)和制劑是本領(lǐng)域熟知的。除了迄今已知與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或制劑外，均可考慮用于本發(fā)明的治療組合物。也可將輔助的活性成分摻入組合物中。
4.6.2鼻內(nèi)輸藥可采用鼻液或噴霧、氣霧甚至吸入劑來(lái)治療與上述一種或多種肽和多核苷酸相關(guān)的血液惡性腫瘤。鼻液是通常用于滴或噴霧給予鼻通道而設(shè)計(jì)的水溶液。制備的鼻液應(yīng)在許多方面類(lèi)似于鼻分泌液以維持正常的纖毛活動(dòng)。鼻水溶液一般是等滲和略有緩沖性以維持PH約5.5-6.5。此外，若需要，可在該制劑中加入類(lèi)似于眼科制劑中所用的抗微生物防腐劑和適當(dāng)?shù)乃幬锓€(wěn)定劑。各種商品化鼻制劑是已知的。
吸入劑或吸入物是設(shè)計(jì)用于傳送藥物或化合物至病人呼吸樹(shù)的藥物制劑。給予蒸氣或濕氣且到達(dá)患病區(qū)域常可緩解支氣管和鼻阻塞癥狀。然而，也可借此途徑將藥物輸送至全身循環(huán)?？赏ㄟ^(guò)鼻或口呼吸給予吸入劑。如果液滴大小足夠細(xì)和均勻，這樣濕氣到達(dá)細(xì)支氣管，施用吸入液才有效。
另一類(lèi)產(chǎn)品也稱(chēng)為吸入劑，有時(shí)稱(chēng)為吹入劑由細(xì)粉化的或液態(tài)藥物組成，可用特殊的給藥系統(tǒng)，如將藥液或藥物懸液保持為液化氣體推進(jìn)劑的藥物氣霧劑將其帶入呼吸道。當(dāng)通過(guò)一合適的閥門(mén)和口腔適配器釋放時(shí)，可將定量的吸入劑推入病人的呼吸道。
此類(lèi)制劑給藥時(shí)顆粒大小是重要的。據(jù)報(bào)道，能透入肺腔的最佳粒子大小為約0.5-7μm。加壓氣霧劑可產(chǎn)生細(xì)小濕氣，因此可考慮優(yōu)先采用。
4.6.3脂質(zhì)體、納米膠囊和微粒介導(dǎo)的輸藥在某些實(shí)施例中，本發(fā)明人考慮采用脂質(zhì)體、納米膠囊、微球體、微粒、脂質(zhì)顆粒載體等，將本發(fā)明多核苷酸組合物導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞。具體說(shuō)，可將本發(fā)明多核苷酸組合物配制包裹在脂性粒子、脂質(zhì)體、載體、毫微球或納米顆粒等中來(lái)輸送。
為加入上述核酸的藥學(xué)上可接受制劑，這類(lèi)制劑是優(yōu)選的。脂質(zhì)體的形成和用途通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見(jiàn)例如Couyreur等，1997；Couvreur，1988；Lasic，1998；他們報(bào)道了脂質(zhì)體和納米膠囊在抗生素靶向治療胞內(nèi)細(xì)菌感染和疾病中的應(yīng)用)。最近開(kāi)發(fā)的脂質(zhì)體具有改進(jìn)的血清穩(wěn)定性和循環(huán)半壽期(Gabizon和Papahadjopoulos，1988；Allen和Choun，1987；美國(guó)專(zhuān)利5,741,516，納入本文作為參考)。另外，已綜述了脂質(zhì)體和脂質(zhì)體樣制劑用作潛在藥物載體的各種方法(見(jiàn)Takakura，1998；Chandran等，1997；Margalit，1995；美國(guó)專(zhuān)利5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587，各自納入本文作為參考)。
脂質(zhì)體已成功地用于其它方法通常不能轉(zhuǎn)染的一些細(xì)胞類(lèi)型，包括T細(xì)胞懸液、原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物和PC12細(xì)胞(Renneisen等，1990；Muller等，1990)。此外，脂質(zhì)體對(duì)DNA長(zhǎng)度沒(méi)有通?；诓《据斔拖到y(tǒng)的限制。脂質(zhì)體已有效用于在各種培養(yǎng)的細(xì)胞系和動(dòng)物中導(dǎo)入基因、藥物(Heath和Martin，1986；Heath等，1986；Balazsovits等，1989；Fresta和Puglisi，1996)、放射性治療劑(Pikul等，1987)、酶(Imaizumi等，1990a；Imaizumi等，1990b)、病毒(Faller和Baltimore，1984)、轉(zhuǎn)錄因子和別構(gòu)劑(Nicolau和Gersonde，1978)。此外，已完成了檢測(cè)脂質(zhì)體介導(dǎo)藥物輸送效果的幾項(xiàng)成功臨床試驗(yàn)(Lope Berestein等，1985a；1985b；Coune，1988；Sculier等，1988)。此外，幾項(xiàng)研究提示，采用脂質(zhì)體全身給藥后不會(huì)伴有自身免疫反應(yīng)、毒性或性腺定位(Mori和Fukatsu，1992)。
將磷脂分散在水介質(zhì)中形成脂質(zhì)體且自發(fā)形成多層同心雙層載體(也稱(chēng)為多層載體MLV)。MLV一般直徑25nm-4μm。超聲處理MLV導(dǎo)致形成直徑200-500的小單層載體(SUV)，核心中含水溶液。
脂質(zhì)體類(lèi)似細(xì)胞膜，可考慮用于本發(fā)明作為所述肽組合物的載體。它們廣泛適用于作為水溶性和脂溶性物質(zhì)分別包載在水空間和雙層本身內(nèi)。載有藥物的脂質(zhì)體通過(guò)選擇性修飾脂質(zhì)體制劑可位點(diǎn)專(zhuān)一輸送活性藥物。
除Couvreur等(1977，1988)所述外，以下信息可用于產(chǎn)生脂質(zhì)體制劑。當(dāng)磷脂分散在水中時(shí)形成脂質(zhì)體以外的各種結(jié)構(gòu)，這取決于脂質(zhì)與水的摩爾比。比例低時(shí)，脂質(zhì)體是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體的物理特征性依賴于PH、離子強(qiáng)度和雙價(jià)陽(yáng)離子的存在。脂質(zhì)體可顯示對(duì)離子和極性物質(zhì)的低通透性，但溫度升高時(shí)經(jīng)歷相轉(zhuǎn)變可顯著改變其通透性。相轉(zhuǎn)變包括從包裝緊密的有序結(jié)構(gòu)(稱(chēng)為凝膠態(tài))改變?yōu)榘b松散不太有序的結(jié)構(gòu)(稱(chēng)為流動(dòng)態(tài))。這發(fā)生在特征性的相轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，且導(dǎo)致對(duì)離子、糖和藥物的通透性增加。
或者，本發(fā)明提供多核苷酸組合物的藥學(xué)上可接受的納米膠囊制劑。納米膠囊一般可以穩(wěn)定和可重復(fù)方式包載化合物(Henry-Michelland等，1987；Quintanar-Guerrero等，1988；Douglas等，1987)。為了避免因胞內(nèi)聚合物過(guò)載產(chǎn)生的副作用，應(yīng)采用能在體內(nèi)降解的聚合物設(shè)計(jì)這類(lèi)超細(xì)顆粒(大小約0.1μm)。生物可降解的聚烷基氰基丙烯酸納米顆粒符合這些要求，可考慮用于本發(fā)明，這類(lèi)顆粒不難制備，見(jiàn)(Couvreur等，1980；1988；Zur Muhlen等，1998；Zambaux等，1998；Pinto-Alphandry等，1995和美國(guó)專(zhuān)利5,145,684，各自納入本文參考)所述。具體說(shuō)，也特別考慮用納米顆粒和毫微球?qū)⒍嗪塑账彷斔徒o靶細(xì)胞的方法用于制備所述組合物，給予動(dòng)物，尤其給與人。
4.7治療制劑和試劑盒本發(fā)明還提供含有一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、稀釋劑、佐劑和/或其它組分配制的一種或多種血液惡性腫瘤相關(guān)組合物，用于制備藥物或診斷試劑以及各種試劑盒，所述試劑盒含有一種或多種這類(lèi)組合物、藥物或制劑，以及給予需要的動(dòng)物或用于一種或多種診斷試驗(yàn)來(lái)鑒定對(duì)上述一種或多種血液惡性腫瘤相關(guān)化合物特異的多核苷酸、多肽和/或抗體。除上述表位外，在配制上述具體組合物和制劑時(shí)，可采用所述抗體和抗原結(jié)合片段、編碼抗體或抗原結(jié)合片段的多核苷酸或其它抗癌藥物、多核苷酸、肽、抗原或其它治療化合物，特別是在制備抗癌藥物或給予患病哺乳動(dòng)物的抗血液惡性腫瘤治療。
因此，優(yōu)選給予上述藥物組合物的動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，特別是人。其它優(yōu)選動(dòng)物包括靈長(zhǎng)動(dòng)物、綿羊、山羊、牛、馬、豬、狼、犬和貓以及任何其它通常認(rèn)為是哺乳動(dòng)物種類(lèi)的寵物、家畜或商業(yè)化相關(guān)動(dòng)物種類(lèi)。本發(fā)明的組合物和制劑可包括部分或明顯純化的多肽、多核苷酸或抗體或抗原結(jié)合片段組合物，單用或與一種或多種其它活性成分、抗癌藥物、疫苗、佐劑或其它治療劑組合使用，這些治療劑可獲自天然或重組來(lái)源，或可是天然獲得的或化學(xué)合成的，或由表達(dá)一種或多種核酸區(qū)段的重組宿主細(xì)胞體外產(chǎn)生的，這些核酸區(qū)段編碼一種或多種其它活性成分、載體、佐劑、輔因子或其它治療性化合物。
4.8診斷試劑和試劑盒本發(fā)明還提供診斷試劑和試劑盒，它們包含用于各種診斷試驗(yàn)包括免疫測(cè)定如ELISA和“夾心”型免疫測(cè)定的一種或多種試劑。此試劑盒優(yōu)選包括本發(fā)明的至少第一種肽或第一種抗體或抗原結(jié)合片段、其功能性片段或它們的混合物和產(chǎn)生信號(hào)的物質(zhì)。可將此試劑盒組分預(yù)先附著于固相支持物上或在使用時(shí)施加在固相支持物表面。信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)可預(yù)先與本發(fā)明抗體結(jié)合或使用前需要與一種或多種組分如緩沖液、抗體-酶偶聯(lián)物、酶底物等組合。該試劑盒也可包括其它試劑如封閉試劑用以降低與固相表面的非特異性結(jié)合、洗滌試劑、酶底物等。該固相表面可以以微量滴定板、微球體形式或其它適合固定蛋白質(zhì)、肽或多肽的物質(zhì)。能催化形成化學(xué)發(fā)光或生色產(chǎn)物或能減少化學(xué)發(fā)光或生色底物的酶是一種優(yōu)選的產(chǎn)生信號(hào)的組分。這類(lèi)酶是本領(lǐng)域熟知的。
這類(lèi)試劑盒用于檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和診斷過(guò)度表達(dá)或不適當(dāng)表達(dá)血液惡性腫瘤相關(guān)肽、多肽、抗體和/或多核苷酸及雜交瘤、宿主細(xì)胞和含有上述一種或多種組合物的載體為特征的疾病。
制備的本發(fā)明治療性和診斷性試劑盒也可包含至少一種上述抗體、肽、抗原結(jié)合片段，雜交瘤、載體、疫苗、多核苷酸或細(xì)胞組合物，及使用該組合物作為診斷試劑或治療劑的說(shuō)明書(shū)。此試劑盒中的容器通常包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、針筒和其它合適的容器，容器中裝有一種或多種所述診斷和/或治療組合物，最好適當(dāng)?shù)胤殖傻确帧．?dāng)提供第二種治療劑時(shí)，該試劑盒還包含第二個(gè)不同容器，此容器中裝有第二種診斷和/或治療組合物?；蛘撸梢砸环N藥物組合物制備多個(gè)化合物，將其包裝在一個(gè)容器中如小瓶、燒瓶、針筒、瓶或其它合適的單一容器中。本發(fā)明的試劑盒通常還包括密封裝有小藥瓶供商品銷(xiāo)售的裝置，如注塑或吹塑容器中裝有所需的小。該試劑盒內(nèi)還裝有放射標(biāo)記的生色素、熒光素或其它類(lèi)型的可檢測(cè)標(biāo)記和檢測(cè)工具，可在同一容器中提供標(biāo)記劑如同診斷或治療組合物本身，或者置于裝有第二種組合物并適當(dāng)?shù)胤殖傻确值牡诙€(gè)不同容器中?；蛘?，可將檢測(cè)試劑和標(biāo)記裝在單一容器中，且在大多數(shù)情況下，該試劑盒一般還包括有密封小瓶的裝置供商品銷(xiāo)售和/或方便包裝和運(yùn)輸。
4.9多核苷酸組合物術(shù)語(yǔ)“DNA區(qū)段”和“多核苷酸”指特定物種中去除總基因組DNA分離得到的一種DNA分子。因此，編碼多肽的DNA區(qū)段指含有一個(gè)或多個(gè)編碼序列的DNA區(qū)段基本上分離或純化去除了物種(獲得DNA區(qū)段的物種)總基因組DNA。術(shù)語(yǔ)“DNA區(qū)段”和“多核苷酸”包括DNA區(qū)段和該區(qū)段的較小片段和重組載體如質(zhì)粒、粘粒、噬粒、噬菌體、病毒等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的DNA區(qū)段可包括基因組序列、額外的基因組和質(zhì)粒編碼的序列和較小的經(jīng)工程改造的基因區(qū)段，它們能表達(dá)或適合表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽等。這種節(jié)段可天然分離或經(jīng)人工合成修飾。
“分離的”本文用于指基本上沒(méi)有其它編碼序列的多核苷酸和不含有大部分無(wú)關(guān)編碼DNA如染色體大片段或其它功能性基因或多肽編碼區(qū)的DNA區(qū)段。當(dāng)然，所指的DNA區(qū)段是最初分離的且不排除后來(lái)在該區(qū)段中人為加入的基因或編碼區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈，可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其含有內(nèi)含子并以一對(duì)一方式對(duì)應(yīng)于一個(gè)DNA分子)和mRNA分子(其不含內(nèi)含子)。本發(fā)明的多核苷酸中可能有其它編碼或非編碼序列但不需要，多核苷酸可能(但不需要)連接于其它分子和/或支持物。
所述多核苷酸可含有天然序列(即編碼血液惡性相關(guān)腫瘤蛋白或其部分的內(nèi)源性序列)，或可含有該序列的變體或生物學(xué)或抗原性功能等同物。多核苷酸變體含有下述一個(gè)或多個(gè)取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選編碼的多肽與天然腫瘤蛋白相比不會(huì)免疫原性。一般可如本文所述評(píng)估對(duì)編碼多肽的免疫原性的影響。術(shù)語(yǔ)“變體”還包含異種來(lái)源的同源基因。
當(dāng)比較多核苷酸或多肽序列時(shí)，如果兩序列當(dāng)排列對(duì)比其最大一致性時(shí)，核苷酸或氨基酸的序列相同則認(rèn)為兩個(gè)序列“相同”。兩序列之間進(jìn)行比較通常比較序列窗口上的序列以鑒別和比較局部區(qū)域的序列相似性?！氨容^窗口”本文用于指至少約20個(gè)毗連位置，通常約30-75個(gè)、40-50個(gè)毗連位置的區(qū)段，其中在兩序列最佳排到后一個(gè)序列可與相同序號(hào)毗連位置的參比序列相比較。
比較序列的最佳排列可用Lasergen生物信息軟件包(DNASTAR Inc.Madison WI)中的Megalign程序進(jìn)行，采用默認(rèn)參數(shù)。該程序包括幾種排列方案，見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)中所述Dayhoff MO(1978)一種蛋白質(zhì)進(jìn)化改變的模型-檢測(cè)遠(yuǎn)親關(guān)系的模型。Dayhoff，MO編《蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集》，National Biomedical Research Foundation，Washington DC，第5卷，增刊3，345-358頁(yè)；Hein J(1990)《排列和種系發(fā)生的統(tǒng)一方法》，626-645頁(yè)，《酶學(xué)方法》，第183卷，Academic Press，Inc.，San DiegoCA；Higgings，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5151-153；Myers，E.W.和MullerW.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor 11105；Santou，N.Nes，M(1987)Mol.Biol.Evol.4406-25；Sneath P.H.A和Sokal，R.R.(1973)《數(shù)值分類(lèi)學(xué)一數(shù)值分類(lèi)學(xué)的原理和實(shí)踐》，F(xiàn)reeman Press，San Frncisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，DJ(1983)Proc.Natl.Acad，Sci.USA 80726-730)。
或者，比較的最佳序列排列可用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2482的局部民一性算法，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同一性排列算法，Pearson和Lipuman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的類(lèi)似方法搜索，計(jì)算機(jī)實(shí)施的這些算法(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，威斯康新遺傳學(xué)軟件包，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)或察看來(lái)進(jìn)行。
適合測(cè)定序列同一性或序列相似性的優(yōu)選算法的例子是BLAST和BLAST2.0算法，分別見(jiàn)Altschul等，(1977)Nucl.Acids Res.253389-3402和Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215403-410。例如，可用BLAST和BLAST2.0與上述參數(shù)來(lái)測(cè)定本發(fā)明多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。進(jìn)行BLAST分析的軟件可從固定生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)獲得。一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施例中，可采用參數(shù)M(-對(duì)匹配殘基獎(jiǎng)分；總是＞0)和N(不匹配殘基的罰分，總是＜0)計(jì)算核苷酸序列的累積評(píng)分。對(duì)氨基酸序列，可用評(píng)分矩陣計(jì)算累計(jì)分。當(dāng)累計(jì)排列評(píng)分從其達(dá)到的最大值下降數(shù)量X時(shí)；當(dāng)累計(jì)評(píng)分由于累積一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基排列而下降到零或以下時(shí)；當(dāng)達(dá)到二序列之一的未端時(shí)；停止各方向命中詞的延伸。BLAST算法參數(shù)W，T和X確定了該算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)用作默認(rèn)值詞長(zhǎng)(W)為11，期望值(E)為10，BLOSUM 62評(píng)分矩陣(見(jiàn)Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)排列，B為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，并比較兩條鏈。
對(duì)于兩序列的最佳排列，“序列同一至少20個(gè)位置的比較窗口上性百分比”的測(cè)定最好通過(guò)比較的兩個(gè)最佳對(duì)比序列。其中比較窗口中的多核苷酸或多肽序列部分與參比序列(不含有添加或缺失)相比，可含有20％或不到、通常5-15％或10-12％的添加或缺失(即空隙)。計(jì)算此百分比可通過(guò)測(cè)定兩個(gè)序列中出現(xiàn)的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)，產(chǎn)生相匹配的位置數(shù)，將該匹配的位置數(shù)除以參比序列中的位置總數(shù)(即窗口大小)，再乘以100，得出序列同一性的百分比。
因此，本發(fā)明包括與本文所述序列基本相同的多核苷酸和多肽序列，例如用本文所述方法(如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析，如以下所述)。比較了本發(fā)明多核苷酸或多肽序列的同一性，至少有50％序列同一性，優(yōu)選至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀框定位等，適當(dāng)調(diào)整這些值來(lái)確定二個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。
其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸和多肽含有與本文所述一種或多種序列相同或互補(bǔ)的不同長(zhǎng)度的毗連序列。例如，本發(fā)明提供的多核苷酸含有本文所述的一種或多種序列的至少約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多的毗連核苷酸以及所有中間長(zhǎng)度的核苷酸。不難理解本文中的“中間長(zhǎng)度”指上述數(shù)值之間的任何長(zhǎng)度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等，包括200-500、500-1000之間的所有整數(shù)等。
本發(fā)明的多核苷酸或其片段，不論編碼序列本身的長(zhǎng)度，均可與其它DNA序列如啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、附加的限制性酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其它編碼區(qū)段等組合，這樣其總長(zhǎng)度可相當(dāng)不同。因此考慮可采用幾乎任何長(zhǎng)度的核酸片段，總長(zhǎng)度最好受到制備容易和所用重組DNA方案的限制。例如，考慮在本發(fā)明許多實(shí)施例中所用的說(shuō)明性DNA區(qū)段具有約10000、5000、3000、2000、1000、500、200、100、50個(gè)堿基對(duì)的總長(zhǎng)度等(包括所有中間長(zhǎng)度)。
其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文所述多核苷酸序列或其片段或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的。為了說(shuō)明起見(jiàn)，測(cè)試本發(fā)明多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適中等嚴(yán)謹(jǐn)條件包括以5×SSC、0.5％SDS、10mM EDTA(PH8.0)溶液預(yù)洗滌，于50-65℃，5×SS中雜交過(guò)夜，然后于65℃以含0.1％SDS的2×，0.5×和0.2×SSC洗二次，各20分鐘。
然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員懂得，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，編碼上述多肽的核苷酸序列有許多。其中，一些多核苷酸與任何天然基因的核苷酸序列的同源性最小。因而，本發(fā)明要具體考慮由于密碼子使用的差異造成的多核苷酸不同。此外，含有本文所述多核苷酸序列的等位基因也在本發(fā)明范圍內(nèi)。等位基因是由于核苷酸的一個(gè)或多個(gè)突變?nèi)缛笔А⑻砑雍?或取代而發(fā)生改變的內(nèi)源性基因。產(chǎn)生的mRNA和蛋白質(zhì)可能(但不需要)有改變的結(jié)構(gòu)或功能?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如雜交擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較)鑒定等位基因。
4.10探針和引物本發(fā)明其它實(shí)施例中，可有利地將本文所述多核苷酸序列用作核酸雜交的探針或引物。為此，考慮到核酸區(qū)段含有的序列區(qū)域至少長(zhǎng)約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95個(gè)毗連核苷酸序列，與其相同或互補(bǔ)的序列至少長(zhǎng)約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95個(gè)毗連核苷酸序列，將發(fā)現(xiàn)多核苷酸在各種雜交實(shí)施例中特別有用。較長(zhǎng)的相同或互補(bǔ)的毗連序列如約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950甚至1000個(gè)核苷酸(包括所有中間長(zhǎng)度)和所有全長(zhǎng)序列如上述多核苷酸也可在某些實(shí)施例中用作探針、引物或擴(kuò)增目標(biāo)等。
這類(lèi)核酸探針能與感興趣的序列特異性雜交，使它們用于檢測(cè)給定樣品中存在的互補(bǔ)序列。然而也考慮其它用途，如利用序列信息制備突變種引物或引物，用于制備其它基因構(gòu)建物和鑒定及表征全長(zhǎng)多核苷酸和全長(zhǎng)或基本上全長(zhǎng)的cDAN，mRNA等。
特別考慮具有與本文所述一種或多種多核苷酸序列相同或互補(bǔ)的毗連核苷酸序列區(qū)的多核苷酸分子，作為雜交探針用于如Southern雜交分析和Nothern印跡因此需要分析各種細(xì)胞類(lèi)型和各種細(xì)菌細(xì)胞中的基因產(chǎn)物或其片段。片段的總體大小和互補(bǔ)序列的大小最終取決于所用的具體核酸區(qū)段。較小片段一般用于雜交實(shí)施例，其中毗連互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度可不同，根據(jù)雜交分析的所需目的和希望檢測(cè)的互補(bǔ)序列的具體長(zhǎng)度，例如在約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60左右之間，包括較大的毗連互補(bǔ)序列，包括長(zhǎng)約70、80、90、100、120、140、160、180或200左右的核苷酸序列也可使用。
采用長(zhǎng)約20-500個(gè)核苷酸的雜交探針能形成穩(wěn)定和選擇性的雙鏈體分子。通常優(yōu)選具有長(zhǎng)20個(gè)左右堿基以上的毗連互補(bǔ)序列的分子以提高雜交體的穩(wěn)定性和選擇性，從而改進(jìn)所得特異性雜交分子的量和程度。一般最好設(shè)計(jì)核酸分子具有長(zhǎng)約25-300左右之間的連續(xù)核苷酸的基因互補(bǔ)序列，需要時(shí)甚至可更長(zhǎng)。
可從本文所述序列之一的任何部分選擇雜交探針。為此需要回顧所述序列或其長(zhǎng)約15-30個(gè)核苷酸序列的毗連部分，包括希望用全長(zhǎng)序列作為探針或引物。探針或引物序列的選擇受制于多種因素。例如可能希望采用從總序列末端開(kāi)始的引物。
小的多核苷酸區(qū)段或片段與通過(guò)化學(xué)方法直接合成片段制備，如通?？衫米詣?dòng)化寡核苷酸合成儀進(jìn)行。也可應(yīng)用核酸再生技術(shù)，如美國(guó)專(zhuān)利4,683,262的PCRTM技術(shù)(納入本文作參考)，通過(guò)在重組載體中導(dǎo)入所選序列，重組產(chǎn)生這些片段，或采用分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它重組DNA技術(shù)。
可利用本發(fā)明的核苷酸序列與感興趣的全基因或基因片段的互補(bǔ)序列選擇性形成雙鏈體分子的能力。取決于所考慮的用途，通常需要采用不同的雜交條件來(lái)實(shí)現(xiàn)探針對(duì)于靶序列的不同程度的選擇性。對(duì)于需要高選擇性的應(yīng)用，通常需要用較嚴(yán)謹(jǐn)條件以形成雜交變體，可選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫條件如鹽濃度約0.02M-0.15M，溫度約50-70℃。這類(lèi)選擇性條件(如果有)寬容性小，探針和模板或靶鏈之間錯(cuò)配，此種條件特別適合分離相關(guān)序列。
當(dāng)然，對(duì)于某些應(yīng)用，例如需要用突變引物鏈與其下模板雜交制備突變體時(shí)，一般需要嚴(yán)謹(jǐn)性較低的雜交條件以便形成異源雙鏈體。在這些情況下，可能需要采用約0.15M-0.9M的鹽，約50-55℃的溫度。因而不難鑒定到交叉雜交種作為相對(duì)于對(duì)照雜交的陽(yáng)性雜交信號(hào)。總之，一般認(rèn)為增加加入的甲酰胺(其作用是隨著溫度升高使雜交雙鏈體不穩(wěn)定)量可賦予更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件。因此，不難操縱雜交條件，且選擇方法一般取決于需要的結(jié)果。
4.11多核苷酸的鑒定和表征可用各種良好建立的技術(shù)鑒定、制備和/或操作多核苷酸。例如，可按以下更詳細(xì)描述鑒定多核苷酸，即篩選cDNA的微陣列用于腫瘤相關(guān)的表達(dá)(即用本文提供的代表性測(cè)定檢測(cè)腫瘤中的表達(dá)比正常組織至少高2倍)?？捎肧ynteni微陣列(PaloAlto CA)按廠商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行此種篩選(基本上如Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9310614-10619，1996和Heller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942150-2155，1997所述)。或者，可從表達(dá)本文所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞，如血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤細(xì)胞制備的cDNA中擴(kuò)增多核苷酸。可通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增此種多核苷酸。可根據(jù)本文提供的序列，設(shè)計(jì)序列特異性引物且可購(gòu)買(mǎi)或合成來(lái)實(shí)施此方法。
可用熟知的技術(shù)將本發(fā)明多核苷酸的擴(kuò)增部分用于分離合適文庫(kù)(如血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤cDNA文庫(kù))中的全長(zhǎng)基因。這些技術(shù)中，采用適合擴(kuò)增的一種或多種多核苷酸探針或引物篩選文庫(kù)(cDNA或基因組)。文庫(kù)的大小優(yōu)選包括較大分子。對(duì)于鑒定基因的5’端和上游區(qū)域也優(yōu)選隨機(jī)引導(dǎo)文庫(kù)。優(yōu)選獲得內(nèi)含子和延伸5’序列的基因組文庫(kù)。
對(duì)于雜交技術(shù)，可用熟知的技術(shù)(如缺口翻譯或32P末端標(biāo)記)標(biāo)記部分序列。然后使含有變性細(xì)菌菌落(或含噬菌斑的菌苔)的雜交濾膜與標(biāo)記探針雜交，篩選細(xì)菌或噬菌體文庫(kù)(見(jiàn)Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Cold Spring HaborLaboratoris，Cold Spring Habor，NY，1989)。選擇和擴(kuò)增雜交的菌落或噬斑并分離DNA作進(jìn)一步分析。用來(lái)自部分序列的引物和載體的引物進(jìn)行PCR，分析DNA克隆以確定加成序列的量?？僧a(chǎn)生限制性酶切圖譜以鑒定一個(gè)或多個(gè)重疊克隆?？刹捎每赡軙?huì)產(chǎn)生一系列缺失克隆的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定該完整序列。然后將得到的重疊序列裝配成單一連續(xù)序列。用熟知的技術(shù)連接合適的片段來(lái)產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA分子。
或者，有許多擴(kuò)增技術(shù)可從部分cDNA序列獲得全長(zhǎng)編碼序列。這些技術(shù)中，通常用PCR進(jìn)行擴(kuò)增?？捎酶鞣N商品化試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增步驟。例如，可用本領(lǐng)域熟知的軟件或算法或公式來(lái)設(shè)計(jì)引物。
一種擴(kuò)增技術(shù)是反向PCR(見(jiàn)Triglia等，Nucl Acids Res；168186，1988)，此法利用限制性酶在基因的已知區(qū)域中產(chǎn)生一片段。通過(guò)分子內(nèi)連接環(huán)化此片段，且用作PCR的模板，所用趨異引物衍生自已知區(qū)域。另一種方法中，用接頭序列的引物和對(duì)已知區(qū)域特異的引物擴(kuò)增，可挽回鄰近部分序列的序列。通常用相同的接頭引物和對(duì)已知區(qū)域特異的第二引物對(duì)擴(kuò)增的序列作第二輪擴(kuò)增。此法的變動(dòng)是采用二種引物，以已知序列的相反方向引導(dǎo)延伸，見(jiàn)WO 96/38591所述。另一種技術(shù)稱(chēng)為“cDNA未端快速擴(kuò)增法”或RACE。此技術(shù)包括采用內(nèi)引物和外引物與Poly A區(qū)或載體序列雜交，以鑒定已知序列的5’和3’端序列。其它技術(shù)包括捕捉PCR(Lagerstrom等，PCR Methods Applic.1111-19，1991)和步行PCR(Parker等，Nucl.Acids Res.193055-60，1991)。也可采用其它擴(kuò)增方法以獲得全長(zhǎng)cDNA序列。
某些情況下，可通過(guò)分析表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank提供的序列來(lái)獲得全長(zhǎng)cDNA?？捎檬熘某绦?如NCBIBLAST檢索)進(jìn)行重疊EST的檢索，該EST可用于產(chǎn)生一條連續(xù)的全長(zhǎng)序列。也可通過(guò)分析基因組片段獲得全長(zhǎng)DNA序列。
4.12多核苷酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)本發(fā)明的其它實(shí)施例中，編碼本發(fā)明多肽或其融合蛋白或其功能等同物的多核苷酸序列或其片段，可用于重組DNA分子以指導(dǎo)多肽在適當(dāng)宿主細(xì)胞中的表達(dá)。由于遺傳密碼子的固有簡(jiǎn)并性，可產(chǎn)生編碼基本上相同或功能上相等的氨基酸序列的其它DNA序列，這些序列可用于克隆和表達(dá)某多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，在某些情況下產(chǎn)生擁有非天然產(chǎn)生的密碼子的多肽編碼核苷酸序列可能有利。例如，可優(yōu)選選擇特定的原核或真核宿主的密碼子以提高蛋白質(zhì)表達(dá)率或產(chǎn)生具有所需性能的重組RNA轉(zhuǎn)錄物，如半壽期比天然發(fā)生序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的半更期更長(zhǎng)。
另外，可用本領(lǐng)域已知的方法工程改造本發(fā)明的多核苷酸以改變多肽編碼序列，有多種理由，包括但不限于修飾該基因產(chǎn)物的克隆、加工和/或表達(dá)的改變。例如，通過(guò)基因片段的隨機(jī)片段化和PCR重裝配和合成寡核苷酸改組的DNA，可用于工程改造該核苷酸序列。此外，定點(diǎn)誘變可用來(lái)插入新的限制性位點(diǎn)、改變糖基化模式、改變密碼子偏愛(ài)、產(chǎn)生剪接變體或?qū)胪蛔兊取?br> 本發(fā)明另一實(shí)施例中，可將天然的、修飾的或重組的核酸序列連接于一異源序以而編碼融合蛋白。例如，為篩選適合多肽活性抑制劑的肽文庫(kù)，它可用于編碼能為商品化抗體所認(rèn)別的嵌合蛋白。也可工程改造融合蛋白使其在多肽編碼序列和異源蛋白序列之間含有一切割位點(diǎn)，這樣就可切下此多肽并從異源部分中純化出來(lái)?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的化學(xué)方法，全部或部分合成編碼所需多肽的序列(見(jiàn)CaruthersMH等，(1980)Nucl.Acids Res Symp Ser 215-223；Horn T.等，(1980)Nucl AcidsRes Symp Ser 225-232)。或者，該蛋白本身可用化學(xué)方法產(chǎn)生，以合成多肽的氨基酸序列或其部分。例如肽合成可用各種固相技術(shù)(Roberge，JY等，(1995)Science269202-204)和自動(dòng)化合成進(jìn)行，例如采用ABI431A肽合成儀(Perkin Elmer，PaloAlto CA)。
可用制備型高效液相層析或本領(lǐng)域其它類(lèi)似技術(shù)基本純化新合成的肽(如Creighton T.(1983)，《蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)和分子原理》，WH Freaman and Co.，New York，NY)。合成肽的組成可通過(guò)氨基酸分析或測(cè)序(如Edman降解法)證實(shí)。另外，多肽或其任何部分的氨基酸序列在直接合成時(shí)可改變，和/或用化學(xué)方法與其它蛋白質(zhì)或其任何部分組合，產(chǎn)生變體多肽。
為了表達(dá)所需的多肽，可將編碼該多肽或功能等同物的核苷酸序列插入適合的表達(dá)載體，即含有轉(zhuǎn)錄和翻譯該插入編碼序列所必需元件的載體中?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有編碼感興趣多肽的序列和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。這些技術(shù)見(jiàn)Sambrook，J等，(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.，和Ausubel，F(xiàn).M等，(1989)，《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，JohnWiley & Sons New York N.Y.
可利用各種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)來(lái)包含和表達(dá)多核苷酸序列。這些包括但不限于微生物，如用重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母、用病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒CaMV，煙草花葉病毒TMV)或用細(xì)菌表達(dá)載體(如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。
表達(dá)載體中存在的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)-增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、與宿主細(xì)胞蛋白相互作用進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的5’和3’非翻譯區(qū)。這些元件在強(qiáng)度和特異性上可以不同。取決于所用的載體系統(tǒng)和宿主，可采用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如當(dāng)在細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可采用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagen La Jolla，Calif.)或PSPORTI質(zhì)粒(Gibco BRL Gaithersburg，MD)等的雜交lacZ啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，一般優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物基因或哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。如需要產(chǎn)生含多拷貝編碼多肽序列的細(xì)胞系，采用具有適當(dāng)可選擇標(biāo)記的SV40或EBV載體是有利的。
細(xì)菌系統(tǒng)中，可根據(jù)表達(dá)的多肽選擇一些表達(dá)載體。例如需要大量誘導(dǎo)抗體時(shí)，可采用能指導(dǎo)高水平表達(dá)易于純化的融合蛋白的載體。這類(lèi)載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中編碼感興趣多肽的序列框內(nèi)連接入氨基末端Met的序列和β-半乳糖苷酶的7位殘基，從而產(chǎn)生一雜交蛋白；以及PIN載體(Van Heeke G.和SM.Schuster(1989)，J.Biol Chem 2645503-5509)等。也可用pGEX載體(Promega，Madison，Wis)來(lái)表達(dá)外源多肽如與谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常這類(lèi)融合蛋白可溶解，通過(guò)吸附于谷胱苷肽瓊脂糖珠，然后在游離谷胱苷肽存在時(shí)洗脫容易從裂解細(xì)胞中純化。在此類(lèi)系統(tǒng)中生產(chǎn)蛋白質(zhì)可設(shè)計(jì)包含肝素、凝血酶、因子X(jué)A蛋白酶切割位點(diǎn)，使克隆的感興趣多肽可任意地從GST部分中釋放。
可采用釀酒酵母菌中的一些含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如α因子、醇氧化酶和PGH的載體。綜述見(jiàn)Ausabel等(同上)和Grant等，Method Enzymol.153516-544。
當(dāng)采用植物表達(dá)載體時(shí)，可通過(guò)一些啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼多肽的序列的表達(dá)。例如，可單獨(dú)采用病毒啟動(dòng)子如CaMV的35S和19S啟動(dòng)子或與TMV的奧米伽前導(dǎo)序列組合(Takamatsu N.EMBO J 6307-311，1987)?；蛘撸刹捎弥参飭?dòng)子如RUBISCO的小亞單位或熱休克啟動(dòng)子(Coruzzi，G.等，EMBO J.31671-1680，1984；Broglie，R等，Science 224838-843，1984和Winter，J.等，Results Probl Cell Differ1783-105，1991)?？赏ㄟ^(guò)DNA直接轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染將這些構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞。有許多可獲得的綜述描述了這類(lèi)技術(shù)(見(jiàn)Hobbs Sor.或Murry L.E.在《McGrawHill科學(xué)技術(shù)年鑒》，(1992)中的文章，McGraw Hill，New York，NY，第191-196頁(yè))。
也可用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)感興趣多肽。例如，在一系統(tǒng)中，用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)作為載體，在草地夜蛾細(xì)胞或夜蛾幼蟲(chóng)中表達(dá)外源基因?？蓪⒕幋a所述多肽的序列克隆入病毒的非必需區(qū)域中如多角體蛋白基因中，且置于多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下。成功插入的多肽編碼序列將滅活多角體蛋白基因，產(chǎn)生缺少外被蛋白的重組病毒。然后用此重組病毒感染草地夜蛾細(xì)胞或幼蟲(chóng)，可在其中表達(dá)感興趣多肽(Engellard，E.K等，Proc.Natl.Acad.Sci 913224-3227，1994)。
一般可得到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的一些基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。例如，利用腺病毒作為表達(dá)載體，將編碼感興趣多肽的序列連接入由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合體中?？衫迷诓《净蚪M的非必需區(qū)域E1或E3區(qū)域中插入，獲得能在感染宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.81 3655-3659，1984)。此外，可利用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，如羅斯肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子來(lái)提高哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
也可利用特異性起始信號(hào)來(lái)有更效翻譯編碼感興趣多肽的序列。這類(lèi)信號(hào)包括ATG起始密碼子和毗鄰序列。當(dāng)將編碼多肽的序列其起始密碼子和上游序列插入適當(dāng)表達(dá)載體時(shí)，不需要其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，當(dāng)只插入編碼序列或其一部分時(shí)，應(yīng)提供含有ATG起始密碼子的外源翻譯控制信號(hào)。因此，起始密碼子應(yīng)處于正確的讀以確保整個(gè)插入物的翻譯。外源性翻譯元件和起始密碼子可以是各種來(lái)源天然或合成的。包含適合于具體細(xì)胞體系的增強(qiáng)子可提高表達(dá)效率，見(jiàn)文獻(xiàn)描述(Scharf，D.等，Results Probl.Cell.Differ.20125-162，1994)。
此外，可選用能調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或能以所需方式加工表達(dá)的蛋白的宿主細(xì)胞株。所述多肽的修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和酰化。可利用切割“前原”形式蛋白的翻譯后加工來(lái)促進(jìn)正確插入、折疊和/或功能?？衫镁哂刑禺愋约?xì)胞機(jī)制和翻譯后活動(dòng)特征性機(jī)制的不同宿主細(xì)胞，如CHO、Hela、MDCK、HEK293和WI38來(lái)保證外源蛋白的正確修飾和加工。
為了長(zhǎng)期高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，一般優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)，例如能穩(wěn)定表達(dá)感興趣多核苷酸的細(xì)胞系，可用在相同或不同載體上含有病毒復(fù)制起點(diǎn)和/或內(nèi)源性表達(dá)元件和選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。導(dǎo)入載體后，在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中?？蛇x擇標(biāo)記的目的是賦予對(duì)選擇的抗性，此抗性的存在使成功表達(dá)導(dǎo)入序列的細(xì)胞得以生長(zhǎng)和回收。采用適合于細(xì)胞類(lèi)型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性克隆。
一些選擇系統(tǒng)可用于回收轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等，Cell 11223-32，1977)和嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy，I.等，Cell22817-23，1990)基因，它們可分別用于tk.Sup.-或aprt.sup.-細(xì)胞。另外，也可利用抗代謝物、抗生素和除草劑抗性作為選擇的基礎(chǔ)；例如，dhfr賦予對(duì)氨甲喋呤的抗性(Wigler，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70，1980)；npt賦予對(duì)氨基葡糖苷、新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F(xiàn).等，J.Mol.Biol.1501-14，1981)；als或pat分別賦予對(duì)氯磺隆和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的抗性(Murry，同上)。其它已描述的可選擇基因如trpB使細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸；或hisD使細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸(Hartman，SC和R.C.Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci855247-5251，1988)。最近，采用花色素苷、β-葡糖醛酸酶及其底物GUS和熒光素酶及其底物熒光素等可見(jiàn)標(biāo)記已獲得普及，不僅廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化體，還用于基于特定載體系統(tǒng)的瞬時(shí)或穩(wěn)定蛋白質(zhì)表達(dá)的定量(Rhodes，CA.等，Methods Mol.Biol.55121-131，1995)。
雖然存在/缺乏標(biāo)記基因表達(dá)提示了感興趣基因也存在，但仍需要證實(shí)感興趣基因的存在與表達(dá)。例如，如果將編碼多肽的序列插入標(biāo)記基因序列內(nèi)，通過(guò)缺乏標(biāo)記基因功能可鑒定重組細(xì)胞含有這些序列?；蛘撸蓪?biāo)記基因與多肽編碼基因串聯(lián)置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制下。隨誘導(dǎo)或選擇而表達(dá)的標(biāo)記基因，通常表明串聯(lián)基因也表達(dá)。
或者，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法鑒定含有并表達(dá)所需多核苷酸序列的宿主細(xì)胞，這些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物測(cè)定或免疫測(cè)定，包括檢測(cè)和/或定量核酸或蛋白質(zhì)的膜、溶液或基于芯片的技術(shù)。
用對(duì)產(chǎn)物特異的多克隆或單克隆抗體測(cè)試和測(cè)定多核苷酸編碼產(chǎn)物的表達(dá)的各種方法是本領(lǐng)域已知的。例子包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。一些應(yīng)用優(yōu)選采用對(duì)某給定多肽上兩個(gè)非干擾表位反應(yīng)的單抗作雙位點(diǎn)單抗免疫測(cè)定，但也可采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。這些和其它測(cè)定已有描述(見(jiàn)Hampton，R.等(1990)《血清學(xué)方法-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，APS Press，St Paul.Minn.)和Maddox，DE.等，J.Exp.Med.1581211-1216，1983)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道各種各樣標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)，且可用于各種核酸和氨基酸測(cè)定。產(chǎn)生檢測(cè)與多核苷酸相關(guān)序列的標(biāo)記雜交或PCR探針的方法，包括寡聚體標(biāo)記、缺口翻譯、末端標(biāo)記或采用標(biāo)記核苷酸的PCR擴(kuò)增?；蛘撸蓪⑿蛄谢蚱淙魏尾糠挚寺〉捷d體中產(chǎn)生mRNA探針。這些載體是本領(lǐng)域已知的，可商品購(gòu)買(mǎi)到并可用于體外合成RNA探針，方法是加入合適的RNA聚合酶如T7、T3或SP6和標(biāo)記核苷酸。可采用各種商品化試劑盒進(jìn)行這些程序?？刹捎玫暮线m報(bào)道分子或標(biāo)記物包括放射性核素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或生色劑及其底物、輔因子、抑制劑，磁粒等。
用感興趣多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可在適合從細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)和回收蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)。重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可分泌或包含在細(xì)胞內(nèi)，取決于所用的序列和/或載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可設(shè)計(jì)含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體含有信號(hào)序列，該信號(hào)序列可指導(dǎo)編碼的多肽穿過(guò)原核或真核細(xì)胞膜分泌出來(lái)?？刹捎闷渌亟M構(gòu)建將編碼感興趣多肽的序列與編碼促進(jìn)可溶性蛋白純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列連接起來(lái)。這種純化促進(jìn)結(jié)構(gòu)域包括但不限于金屬螯合肽，如允許在固定的金屬上純化的組氨酸-色氨酸組件，允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，和用于FLAGS延伸段/親和純化系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)域(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)。在純化結(jié)構(gòu)域和編碼肽之間包含可切割接頭序列，如對(duì)因子X(jué)A或腸激酶特異的切割接頭序列(Invitrogen San Diego Calif)可有利于純化。一種這樣的表達(dá)載體提供了一種融合蛋白的表達(dá)，該融合蛋白含有感興趣的肽和編碼6個(gè)組氨酸殘基的核酸，前面的硫氧還蛋白或腸激酶切割位點(diǎn)。組氨酸殘基有利于在IMIAC(固定的金屬離子親和層析)上純化。見(jiàn)Porath，J.等(Prot.Exp.Purif.3263-81，1992)所述，而腸激酶切割位點(diǎn)提供了從融合蛋白純化所需肽的工具。含融合蛋白的載體的討論見(jiàn)Kroll，D.J.等(DNA Cell Biol.12441-453，1993)。
除了重組生產(chǎn)方法外，可用固相法直接合成肽生產(chǎn)本發(fā)明的多肽和其片段(Merrifild J.，J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963)?？捎檬止し椒ɑ蜃詣?dòng)化進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。自動(dòng)化合成例如可采用Applied Biosystems 431A肽合成儀(PerkinElmer)進(jìn)行?；蛘呖煞謩e化學(xué)合成各種片段，再用化學(xué)方法組合產(chǎn)生全長(zhǎng)分子。
4.13定點(diǎn)誘變定點(diǎn)誘變是一種通過(guò)特異性誘變編碼肽的多核苷酸制備各種肽或生物功能等價(jià)多肽的有用技術(shù)。該技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，還能用于制備和測(cè)定序列變體，如結(jié)合一個(gè)或多個(gè)上述條件，在DNA中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列變化。定點(diǎn)誘變可通過(guò)利用特定寡核苷酸序列產(chǎn)生突變體，該突變體編碼具有所需突變的DNA序列，以及足夠數(shù)目的鄰近核苷酸可提供足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，形成橫跨缺失連接的兩側(cè)的穩(wěn)定雙鏈體。突變可用于選擇的多核苷酸序列以改進(jìn)、改變、降低、修飾或改變?cè)摱嗪塑账岜旧淼男阅?，?或改變編碼肽的性能、活性、組成、穩(wěn)定性或一級(jí)序列。
本發(fā)明某些實(shí)施例中，考慮對(duì)上述多核苷酸序列進(jìn)行誘變以改變編碼多肽的一種或多種性能，如多肽疫苗的抗原性。定點(diǎn)誘變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并廣泛用于產(chǎn)生多肽和多核苷酸的變體。例如通常用定點(diǎn)誘變來(lái)改變DNA分子的特定部分。這類(lèi)實(shí)施例中，通常采用長(zhǎng)約14-25個(gè)核苷酸的引物，序列連接的兩側(cè)約5-10個(gè)殘基被改變。
本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，定點(diǎn)誘變技術(shù)常采用單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體。用于定點(diǎn)誘變的典型載體包括例如M13噬菌體。這些噬菌體不難從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到，其用途一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。定點(diǎn)誘變也常規(guī)采用雙鏈質(zhì)粒來(lái)取消將感興趣基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到噬菌體的步驟。
通常，進(jìn)行上述定點(diǎn)誘變的第一步是獲得單鏈載體或使雙鏈載體的兩條鏈解離分開(kāi)(在載體的序列內(nèi)含有編碼所需肽的DNA序列)。通常用合成法制備攜帶有所需突變復(fù)序列的寡核苷酸引物。然后使該引物與單鏈載體退火，經(jīng)DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段處理，以便完成帶突變鏈的合成。形成的異源雙鏈體中一條鏈編碼原來(lái)的非突變序列，第二條鏈帶有所需的突變。然后用此異源雙鏈體載體轉(zhuǎn)化適合的細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇含有攜帶突變序列排列的重組載體的克隆。
用定點(diǎn)誘變法制備所選肽編碼DNA區(qū)段的序列變體，提供了一種可能產(chǎn)生有用物種的方法，且不意味著限于用其它方法來(lái)獲得肽的序列變體及其編碼DNA序列。例如可用誘變劑如羥胺處理編碼所需肽序列的重組載體以獲得序列變體。關(guān)于這些方法和方案的具體細(xì)節(jié)見(jiàn)Maloy等，1994；Segal，1976；Prokop和Bajpai，1994；Kuby，1994；和Maniatis等，1982，各自納入本文作為參考。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸指導(dǎo)的誘變方法”本文指模板依賴方法和載體介導(dǎo)的增殖，導(dǎo)致特異性核酸分子的濃度比其初始濃度升高，或可檢測(cè)信號(hào)如擴(kuò)增的濃度升高。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸指導(dǎo)的誘變方法”本文指模板依賴的引物分子的延伸。術(shù)語(yǔ)“模板依賴方法”指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列由熟知的互補(bǔ)性堿基配對(duì)規(guī)律所決定(見(jiàn)例如Watson，1987)。通常，載體介導(dǎo)的方法涉及將核酸片段導(dǎo)入DNA或RNA載體中，載體的克隆擴(kuò)增，回收擴(kuò)增的核酸片段。這些方法的例子見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,237,224，納入本文作為參考。
4.14多核苷酸擴(kuò)增技術(shù)可利用一些模板依賴方法擴(kuò)增樣品中的感興趣靶序列。一種最著名的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCRTM)，其詳細(xì)描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,683,195；4,683,202和4,800,159，各自納入本文作為參考。簡(jiǎn)言之，在PCRTM中制備與靶序列的相反互補(bǔ)鏈區(qū)域互補(bǔ)的兩條引物序列。在反應(yīng)混合物中加入過(guò)量的脫氧核苷三磷酸和DNA聚合酶(如Taq聚合酶)。如果樣品中存在靶序列，引物將結(jié)合該靶，聚合酶將使引物通過(guò)加入的核苷酸沿著靶序列延伸。提高和降低反應(yīng)混合物溫度，延伸的引物將從靶上解離形成反應(yīng)產(chǎn)物，剩余引物將結(jié)合靶和反應(yīng)產(chǎn)物，且重復(fù)此過(guò)程。優(yōu)選進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCRTM擴(kuò)增程序以定量擴(kuò)增的mRNA量。聚合酶鏈反應(yīng)是本領(lǐng)域熟知的。
另一擴(kuò)增方法是連接酶鏈反應(yīng)(稱(chēng)為L(zhǎng)CR)，見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)320、308(特別納入本文參考)。在LCR中制備兩對(duì)互補(bǔ)探針，存在靶序列時(shí)，每對(duì)探針將結(jié)合靶的互相毗鄰的相反互補(bǔ)鏈。存在連接酶時(shí)，兩對(duì)探針將連接形成一個(gè)單元。經(jīng)過(guò)溫度循環(huán)(如PCRTM中的循環(huán))，結(jié)合的連接單元從靶上解離，然后作為過(guò)量探針對(duì)連接的“靶序列”。其內(nèi)容納入本文作參考的美國(guó)專(zhuān)利4,883,750描述了另一擴(kuò)增方法，類(lèi)似于探針結(jié)合靶序列的LCR。
PCT國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US87/00880(納入本文參考)中所述的Qbeta復(fù)制酶也可用于本發(fā)明另一擴(kuò)增方法中。在此方法中，將具有與靶互補(bǔ)區(qū)域的RNA的復(fù)制性序列加入存在RNA聚合酶的樣品中。聚合酶將拷貝復(fù)制性序列，然后可被檢測(cè)到。
一種等溫性擴(kuò)增方法中，用限制性內(nèi)切酶和連接酶擴(kuò)增靶分子，該靶分子的限制性位點(diǎn)的一條鏈中含有核苷酸5’-[α-硫代]三磷酸(Walker等，1992，納入本文參考)]，也可在本發(fā)明中用于擴(kuò)增核酸。
鏈置換擴(kuò)增(SDA)是實(shí)施核酸等溫?cái)U(kuò)增的另一方法，此法包括多輪鏈置換和合成，即缺口翻譯。一種類(lèi)似方法稱(chēng)為修復(fù)鏈反應(yīng)(PCR)是另一種可用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法，所述方法包括退火整個(gè)擴(kuò)增靶區(qū)域的幾個(gè)探針，然后進(jìn)行四種堿基只存在2種的修復(fù)反應(yīng)?？蓪⑵渌鼉煞N堿基作為生物素化衍生物加入而易于檢測(cè)。SDA中采用了類(lèi)似的方法。
也可用循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(CPR)檢測(cè)序列。在CPR中，使具有非靶DNA的3’和5’序列和靶蛋白特異性RNA的內(nèi)部或“中間”序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交時(shí)用RNA酶H處理反應(yīng)物，通過(guò)消化后釋放產(chǎn)生的信號(hào)可將該探針產(chǎn)物鑒定為特殊產(chǎn)物。最初的模板與另一循環(huán)探針退火并重復(fù)此反應(yīng)。因此，CPR包括擴(kuò)增探針與靶基因特異性表達(dá)的核酸雜交產(chǎn)生的信號(hào)。
可用于本發(fā)明的其它擴(kuò)增方法，見(jiàn)英國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2,202,328和PCT國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US89/01025，各自納入本文作參考。前一申請(qǐng)中，PCR采用“修飾的”引物進(jìn)行模板和酶依賴的合成?？捎貌蹲匠煞?如生物素)和/或檢測(cè)成分(如酶)標(biāo)記來(lái)修飾引物。后一申請(qǐng)中，樣品中加入過(guò)量的標(biāo)記探針。存在靶序列時(shí)，該探針結(jié)合并被催化切割。切割后，靶序列被完整釋放，并被過(guò)量探針結(jié)合切割的標(biāo)記探針表明存在靶序列。
包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)(Kwoh等，1989；PTC國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO88/10315，納入本文作參考)的其它核酸擴(kuò)增方法，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SR。NASBA中，可制備用于擴(kuò)增的核酸，采用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚/氯仿抽提法，熱變性樣品，用裂解液處理，微旋轉(zhuǎn)柱分離DNA和RNA或氯化胍提取RNA。這些擴(kuò)增技術(shù)涉及退火具有對(duì)靶序的特性序列的的引物。聚合后，用RNA酶H消化DNA/RNA雜交體，同時(shí)再熱變性雙鏈DNA分子。兩種情況下，通過(guò)加入第二種靶特異性引物，然后聚合，將單鏈DNA制備成全雙鏈。然后用聚合酶如T7或SP6多重轉(zhuǎn)錄該雙鏈DNA分子。在等溫循環(huán)反應(yīng)中，RNA被逆轉(zhuǎn)錄為DNA，并用聚合酶如T7或SP6再轉(zhuǎn)錄一次。所得產(chǎn)物不論是截短的或完全的均顯示了靶特異性序列。
納入本文作參考的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)329,822描述了一種核酸擴(kuò)增方法，包括可用于本發(fā)明的循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)，ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)。ssRNA是用逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴的DNA聚合酶)延伸的第一引物瓜豁寡核苷酸的第一模板。然后經(jīng)核糖核酸酶H(RNA酶H，一種具有DNA或RNA的雙鏈體中對(duì)RNA特異的RNA酶)作用從產(chǎn)生的DNA:RNA雙鏈體中去除RNA。產(chǎn)生的ssDNA是第二引物的第二模板，該第二引物中還包含RNA聚合酶啟動(dòng)子(由T7RNA聚合酶)為例5’至與其模板同源的序列。然后用DNA聚合酶(由大腸桿菌DNA聚合酶1的大“Klenow”片段為例)延伸該引物得到雙鏈DNA(“dsDNA”)分子，該分子的序列與引物之間的最初RNA相同，并在另一端有一啟動(dòng)子序列。此啟動(dòng)子序列可經(jīng)適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶作用產(chǎn)生DNA的許多RNA拷貝。然后這些拷貝可再進(jìn)入循環(huán)導(dǎo)致非?？斓臄U(kuò)增。選用合適的酶，可在等溫下進(jìn)行此擴(kuò)增而不需每輪都加酶。由于該過(guò)程的循環(huán)性質(zhì)，所選的起始序列可以是DNA或RNA形式。
納入本文參考的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO89/06700描述了一種核酸序列擴(kuò)增流程，根據(jù)啟動(dòng)子/引物序列與靶單鏈DNA(“ssDNA”)的雜交，接著轉(zhuǎn)錄許多RNA拷貝的序列。此流程不是循環(huán)性，即從產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物中不產(chǎn)生新的模板。其它擴(kuò)增方法包括“RACE”(Frohman，1990)和“單面PCR”(Ohara，1989)這是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在擴(kuò)增本發(fā)明DNA序列時(shí)，也可采用以下方法，即在具有所產(chǎn)生的“雙-寡核苷酸”的序列的核酸存在時(shí)，連接二個(gè)(或多個(gè))寡核苷酸，從而擴(kuò)增該雙-寡核苷酸的方法(Wu和Dean，1996，納入本文作參考)。
4.15體內(nèi)多核苷酸送遞技術(shù)其它實(shí)施例中，將含有本發(fā)明一種或多種多核苷酸的基因構(gòu)建物體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞。這可用多種熟知的方法進(jìn)行，這些方法中的幾種將在下文中闡述。
4.15.1腺病毒體內(nèi)送遞一種或多種核酸序列的優(yōu)選方法之一是采用腺病毒表達(dá)載體?！跋俨《颈磉_(dá)載體”包括能充分(a)支持構(gòu)建物包裝和(b)以有義或反義取向表達(dá)其中已克隆的多核苷酸的腺病毒序列的那些構(gòu)建物。當(dāng)然，反義構(gòu)建物的表達(dá)不需要合成基因產(chǎn)物。
表達(dá)載體含有基因工程改造的腺病毒形式。已知腺病毒的基因結(jié)構(gòu)是36kb、線性、雙鏈DNA病毒，使腺病毒DNA的大部分可用多達(dá)7kb的外源序列取代(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，腺病毒感染宿主細(xì)胞不導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA可以附加型方式復(fù)制而沒(méi)有潛在的基因毒性。還有，腺病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定經(jīng)大量擴(kuò)增后未檢測(cè)到基因組重排。事實(shí)上腺病毒可感染所有的上皮細(xì)胞而不論其細(xì)胞周期。迄今，腺病毒感染似乎只與輕微疾病如人急性呼吸道疾病有關(guān)。
腺病毒特別適合用作基因轉(zhuǎn)移載體，因其基因組大小適中、易操作、高滴度、靶細(xì)胞范圍廣和高感染性。病毒基因組兩端含100-200個(gè)堿基對(duì)反向重復(fù)序列(ITR)。它是病毒DNA復(fù)制和包裝必需的順式元件。基因組的早期(E)和晚期(L)區(qū)域含有不同的轉(zhuǎn)錄單元，其通過(guò)病毒DNA復(fù)制的開(kāi)始而分裂。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組和少許細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)引起病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)的合成。這些蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制、后期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉(Renan，1990)。后期基因的產(chǎn)物包括大部分的病毒衣殼蛋白，只在主要晚期啟動(dòng)子(MLP)產(chǎn)生的一種原代轉(zhuǎn)錄物的加工后才表達(dá)。MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期特別有效，此啟動(dòng)子產(chǎn)生的所有mRNA擁有5’-三聯(lián)前導(dǎo)(TPL)序列，使它們成為翻譯的優(yōu)選mRNA。
一最新系統(tǒng)中，用穿梭載體和原病毒載體之間的同源重組產(chǎn)生的重組腺病毒由于兩種原病毒載體之間可能重組，此過(guò)程可產(chǎn)生野生型腺病毒。因此，關(guān)鍵是從單個(gè)噬斑中分離病毒的單一克隆并檢驗(yàn)其基因組結(jié)構(gòu)。
復(fù)制缺陷性的最新腺病毒載體的產(chǎn)生和增殖依賴于一種獨(dú)特的輔助細(xì)胞系，命名為293，是用Ad5DNA片段轉(zhuǎn)化人胚腎細(xì)胞而得，組成性地表達(dá)E1蛋白(Graham等，1977)。因?yàn)镋3區(qū)與腺病毒基因組分開(kāi)(Jones和Shenk，1978)，最新的腺病毒載體在293細(xì)胞輔助下，可在E1、D3或兩個(gè)區(qū)域中攜帶外源DNA(Graham和Prevec，1991)。實(shí)質(zhì)上，腺病毒可包裝約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)，提供了約2個(gè)額外KBDNA的容量。與約5.5kbDNA組合，可在E1和E3區(qū)中更換，此最新腺病毒載體的最大容量低于7.5kb，或占約載體總長(zhǎng)的15％。留在載體骨架中80％以上的腺病毒基因組是載體攜帶的細(xì)胞毒性的來(lái)源。還有，E1缺失病毒的復(fù)制缺損是不完全的。例如，在高感染復(fù)數(shù)(MOI)時(shí)，用最新獲得的載體觀察到病毒基因表達(dá)的滲漏(Mulligan，1993)。
輔助細(xì)胞系可衍生自人細(xì)胞，如人胚腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或其它人胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。另外，輔助細(xì)胞可衍生自人腺病毒允許的其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括如Vero細(xì)胞或其它猴胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。如上所述，目前優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。
目前，Racher等(1995)披露了培養(yǎng)293細(xì)胞和增殖腺病毒的改良方法。一種方式中，通過(guò)接種細(xì)胞到1升硅烷化旋轉(zhuǎn)瓶(Techne，Cambridge，UK)內(nèi)含100-200ml培養(yǎng)液，以培養(yǎng)天然的細(xì)胞聚集物。以40rpm攪拌后，用臺(tái)盼蘭估計(jì)細(xì)胞活力。另一方式中，如下采用Fibra-Cel微載體(Bibby Sterlin Stone UK)5克/升。將重懸于5ml培養(yǎng)液中的細(xì)胞接種物加入含50ml載體的250ml錐形瓶中，靜置(偶爾搖動(dòng))1-4小時(shí)。培養(yǎng)基用50ml新鮮培養(yǎng)基更換并搖動(dòng)。為了產(chǎn)生病毒，使細(xì)胞生長(zhǎng)到約80％匯合，此時(shí)更換培養(yǎng)基(至最終體積的25％)，以0.05約MOI的腺病毒。培養(yǎng)物靜置過(guò)夜，增加然后容量到100％，并開(kāi)始振搖72小時(shí)。
除了要求腺病毒載體是復(fù)制缺損型或至少是條件缺損型外，據(jù)信對(duì)于成功實(shí)施本發(fā)明腺病毒的性質(zhì)不是關(guān)鍵。該腺病毒可以是已知的42種不同血清型或亞組A-F中的任何一種。為獲得用于本發(fā)明的條件性復(fù)制缺損型腺病毒載體，起始材料優(yōu)選腺病毒5型C亞組，因?yàn)橄俨《?型是人腺病毒，其大量的生化和遺傳學(xué)信息已知道，且歷史上大多數(shù)構(gòu)建采用腺病毒作為載體。
如上所述，本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺損型，不具有腺病毒E1區(qū)。因此，最方便的是將編碼感興趣基因的多核苷酸導(dǎo)入去除了E1編碼序列的位置上。然而，構(gòu)建物插入腺病毒序列內(nèi)的位置對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵性的。也可將編碼感興趣基因的多核苷酸插入E3取代載體中，以代替缺失的E3區(qū)，見(jiàn)Karlsson等，(1986)所述；或插入E4區(qū)在那里輔助細(xì)胞系或輔助病毒補(bǔ)充E4缺陷。
腺病毒容易生長(zhǎng)和增殖，體內(nèi)和體外宿主范圍寬。此組病毒可獲得高滴度，如每毫升109-1011噬斑形成單位，它們有高度感染性。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主細(xì)胞基因組。由腺病毒載體輸送的外源基因是附加型，因而對(duì)宿主細(xì)胞的基因毒性低。用野生型腺病毒接種疫苗的研究中已報(bào)道無(wú)副作用(Couch等，1963，Top等，1971)，證明其作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體的安全性和治療潛力。
腺病毒已用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991，Gomez-Foix等，1992)和疫苗開(kāi)發(fā)(Grunhaus和Horwitz，1992，Graham和Prevec，1992)。最近，動(dòng)物研究提示，重組腺病毒可用于基因治療(Stratford Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford Perric andet等，1990；Rich等，1993)。不同組織給予重組腺病毒的研究包括氣管滴注法(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)，肌肉注射(Ragot等，1993)，外周靜脈注射(Herz和Gerard，1993)和腦內(nèi)立體定向接種(Le Gal Salle等，1993)4.15.2逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，特征為能在感染細(xì)胞中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程將其RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA(Coffin，1990)。產(chǎn)生的DNA然后穩(wěn)定整合入細(xì)胞染色體內(nèi)作為原病毒并指導(dǎo)病毒蛋白的合成。整合導(dǎo)致病毒基因序列保留在受體細(xì)胞及其子代中。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組分別含有編碼衣殼蛋白的三種基因gag、pol和env，聚合酶和包膜組分。gag基因上游的序列含有將基因組包裝入病毒粒子的信號(hào)。病毒基因組的5’和3’端有二條長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列。這些含強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列也是在宿主細(xì)胞基因組中融合所需的(Coffin，1990)。
為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可將編碼一種或多種感興趣的寡核苷酸或多核苷酸的核酸插入病毒基因組中替代某些病毒序列，以產(chǎn)生復(fù)制缺損型病毒。為了產(chǎn)生病毒粒子，構(gòu)建含gag、pol和env基因但無(wú)LTR的包裝細(xì)胞系和包裝組分(Mann等，1983)。當(dāng)重組質(zhì)粒含cDNA時(shí)，將其與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起導(dǎo)入該細(xì)胞系(例如用磷酸鈣沉淀)，此包裝序列能使重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物被包裝入病毒粒子中，然后分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988，Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選地濃縮，用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染各種各樣類(lèi)型的細(xì)胞。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)要求宿主細(xì)胞的分裂(Paskind等，1975)。
最近，開(kāi)發(fā)了一種使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特異性靶向的新方法，所述方法通過(guò)在病毒包膜中用化學(xué)方法加入乳糖殘基而化學(xué)修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒。這種修飾通過(guò)唾液糖蛋白受體允許特異性感染肝細(xì)胞。
設(shè)計(jì)了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向的不同方法，其中采用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和抗特異性細(xì)胞受體的生物素化抗體。采用鏈霉親和素這些抗體通過(guò)生物素偶聯(lián)(Rous等，1989)。采用抗主要組織相容性復(fù)合物I類(lèi)和II類(lèi)抗原的抗體，他們證明體外用親嗜性病毒可感染載有這些表面抗原的各種人細(xì)胞(Roux等，1989)。
4.15.3腺相關(guān)病毒AVV(Ridgeway，1988；Hermonat和Muzycska，1984)是作為一種污染腺病毒貯液而發(fā)現(xiàn)的細(xì)小病毒(parovirus)。它是一種遍在性病毒(85％美國(guó)人群中存在抗體)，與任何疾病無(wú)關(guān)。也分類(lèi)為依賴病毒，因?yàn)槠鋸?fù)制依賴于輔助病毒如腺病毒的存在。已分離到5種血清型，其中AAV-2是最了解的。AAV有一單鏈線性DNA包裹在衣殼蛋白VP1、VP2和VP3中，形成直徑20-24nm的二十面體病毒粒子(Muzyczka和Mclaughlin，1988)。
AAV DNA約長(zhǎng)4.7kb，它含兩個(gè)開(kāi)放讀框，側(cè)面接二個(gè)ITR。AAV基因組中有兩個(gè)主要基因rep和cap。rep基因編碼的蛋白負(fù)責(zé)病毒復(fù)制，而cap編碼衣殼蛋白VP1-3。各ITR形成T形發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。這些末端重復(fù)序列是AAV染色體整合唯一必需的順式組分。因此AAV可用作一種載體，此載體中所有的病毒編碼序列被去除并用輸送基因盒代替。已鑒定到三個(gè)病毒啟動(dòng)子按它們的圖譜位置命名為p5、p19和p40。P5和p19的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致產(chǎn)生rep蛋白，p40的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生衣殼蛋白(Hermonat和Muzyczka，1984)。
有幾種因素促進(jìn)了研究人員研究利用rAAV作為表達(dá)載體的可能性。一種是很少需要將基因輸送整合到宿主染色體中。這需要有145-bpITR，僅為AAV基因組的6％。這在載體中留下了可裝配4.5kbDNA插入物的空間。雖然此攜帶容量可不使AAV輸送大基因，但十分適合輸送本發(fā)明的反義構(gòu)建物。
AAV由于其安全性也是輸送載體的一個(gè)良好選擇。需要相對(duì)復(fù)雜的拯救機(jī)制，不僅是野生型腺病毒，而且需要AAV基因來(lái)調(diào)動(dòng)rAAV。同樣；AAV無(wú)致病性且與任何疾病無(wú)關(guān)。去除病毒的編碼序列可最大程度減少對(duì)病毒基因表達(dá)的免疫反應(yīng)，因此，rAAV不會(huì)激發(fā)炎癥反應(yīng)。
4.15.4其它病毒載體作為表達(dá)構(gòu)建物可采用其它病毒載體作為本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物，將寡核苷酸或多核苷酸序列輸運(yùn)給宿主細(xì)胞?？刹捎貌《救缗６徊《?Ridgeway，1988；Coupar等，1988)、慢病毒、脊灰病毒和皰疹病毒衍生的載體。它們對(duì)各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞有幾種吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。由于最近識(shí)別的缺損性乙肝病毒，獲得了對(duì)不同病毒序列的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的新了解。體外研究表明，病毒盡管缺失了其多達(dá)80％的基因組，仍能保持輔助依賴性包裝能力和逆轉(zhuǎn)錄能力(Horwich等，1990)。這提示大部分基因組可用外源基因物質(zhì)替代。嗜肝性和持久性(整合)是肝定向基因轉(zhuǎn)運(yùn)特別吸引的性能。Chang等(1991)將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)滕喴腋尾《净蚪M中，取代聚合酶、表面和前表面編碼序列。與野生型病毒共轉(zhuǎn)染入禽肝癌細(xì)胞系。培養(yǎng)基中含高滴度重組病毒，用于感染原代鴨肝細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后檢測(cè)到穩(wěn)定的CAT基因表達(dá)至少24天(Chang等，1991)。
4.15.5非病毒載體為了有效表達(dá)本發(fā)明寡核苷酸或多核苷酸序列，必須將表達(dá)構(gòu)建物輸送到細(xì)胞內(nèi)。體外進(jìn)行此輸送可用于實(shí)驗(yàn)室方法中轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，或體內(nèi)或活體內(nèi)輸送用于治療某些疾病。如上所述，一種優(yōu)選的輸送機(jī)制是通過(guò)病毒感染，將表面構(gòu)建物包裹在感染性病毒顆粒中。一旦表達(dá)構(gòu)建物被輸送入細(xì)胞內(nèi)，編碼所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸可定位于不同部位并表達(dá)。某些實(shí)施例中，編碼該構(gòu)建物的核酸可穩(wěn)定整合入細(xì)胞的基因組中。此整合可通過(guò)同源重組(基因取代)，以特異性定位和取向整合或可以是隨機(jī)、非特異性定位整合(基因增大)。其它實(shí)施例中，該核酸可穩(wěn)定保持在細(xì)胞中作為DNA的分離的附加型節(jié)段。這類(lèi)核酸節(jié)段或“附加體”編碼序列，能充分不受宿主細(xì)胞周期的制約，或與其同步維持和復(fù)制。該表達(dá)構(gòu)建物如何輸送入細(xì)胞，及該核酸保持在細(xì)胞中何處，取決于所用表達(dá)構(gòu)建物的類(lèi)型。
本發(fā)明某些實(shí)施例中，含有一種或多種寡核苷酸或多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建物可僅由裸重組DNA或裸質(zhì)粒組成?？捎蒙鲜鑫锢砘蚧瘜W(xué)通透細(xì)胞膜的方法之一轉(zhuǎn)移該構(gòu)建物。這具體可用于體外轉(zhuǎn)移，但也可應(yīng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)移。Dubensky等(1984)成功地將磷酸鈣沉淀形式的多瘤病毒DNA注射入成年鼠和新生小鼠的肝和脾中，證明了活性病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Reshef(1986)也證明直接腹膜內(nèi)注射磷酸鈣沉淀質(zhì)粒結(jié)果表達(dá)了轉(zhuǎn)染的基因?？紤]編碼感興趣基因的DNA也可以用類(lèi)似方式體內(nèi)轉(zhuǎn)移并表達(dá)基因產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)移裸DNA表達(dá)構(gòu)建物到細(xì)胞中的本發(fā)明另一實(shí)施例涉及顆粒轟擊技術(shù)。此方法根據(jù)加速DNA包被的微粒至高速的能力，使它們穿破細(xì)胞膜且進(jìn)入細(xì)胞而不殺死細(xì)胞(Klein等，1987)。已開(kāi)發(fā)了加速小粒子的幾種裝置。一種裝置依靠施加高壓產(chǎn)生電流，進(jìn)而提供動(dòng)力(Yang等，1990)。所用微粒由生物惰性物質(zhì)如鎢或金珠組成。
所選器官包括大鼠和小鼠的肝、皮膚及肌肉組織，已作過(guò)體內(nèi)轟擊(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。這可能需要手術(shù)暴露組織或細(xì)胞以消除槍和靶器官之間的任何干擾組織，即活體內(nèi)治療。另外，可通過(guò)此法輸送編碼特定基因的DNA，仍納入本發(fā)明中。
4.16反義寡核苷酸基因信息流動(dòng)的最后結(jié)果是合成蛋白質(zhì)。DNA被聚合酶轉(zhuǎn)錄為信使RNA并在核糖體上翻譯產(chǎn)生折疊的功能性蛋白質(zhì)。沿著蛋白質(zhì)合成途徑的幾個(gè)步驟可受到抑制。象所有哺乳動(dòng)物DNA鏈那樣，編碼本文所述多肽的天然DNA區(qū)段也有兩條鏈，一條有義鏈和一條反義鏈，由氫鍵連在一起。編碼多肽的信使RNA具有與有義DNA鏈相同的核苷酸序列，除了DNA胸腺嘧啶由尿嘧啶代替外。因此，合成的反義核苷酸序列將結(jié)合mRNA，并抑制該mRNA編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)。
因此，反義寡核苷酸靶向mRNA是關(guān)閉蛋白質(zhì)合成的一種機(jī)制，故代表了一種有效和靶向治療方法。例如，多聚半乳糖醛酸酶和毒蕈堿2型乙酰膽堿受體的合成可受到針對(duì)它們各自mRNA序列的反義寡核苷酸的抑制(美國(guó)專(zhuān)利5,739,119和5,759,829，各自納入本文參考)。另外，反義抑制的例子已用核蛋白細(xì)胞周期蛋白、多重抗藥性基因(MDGI)、ICAM-1、E-選擇素、STK-1、橫紋肌GABAA受體和人EGF得到證明(Jaskulski等，1988；Vasanthaku mar和Ahmed，1989；Peris等，1998；美國(guó)專(zhuān)利5,801,154；5,789,573；5,718,709；5,610,288，各自納入本文參考)。也已描述反義構(gòu)建物抑制并可用于治療各種異常細(xì)胞增殖如癌癥(美國(guó)專(zhuān)利5,474,470；5,591,317和5,783,683，各自納入本文參考)。
因此，示范性實(shí)施例中，本發(fā)明提供的寡核苷酸序列含有能特異性結(jié)合本文所述寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所有任何序列或一部分序列。一實(shí)施例中，反義寡核苷酸含DNA或其衍生物.。另一實(shí)施例中，寡核苷酸含RNA或其衍生物.。第三個(gè)實(shí)施例中，寡核苷酸是修飾的DNA，含硫代磷酸酯修飾的骨架。第四個(gè)實(shí)施例中，寡核苷酸序列含肽核酸或其衍生物.。各自情況下，優(yōu)選的組合物含有與本文所述多核苷酸的一部分或多個(gè)部分互補(bǔ)，更優(yōu)選基本互補(bǔ)，甚至更優(yōu)選完全互補(bǔ)的序列區(qū)域。
對(duì)某給定基因序列特異的反義組合物的選擇，根據(jù)對(duì)所選靶序列(即這些說(shuō)明性例子中的大鼠和人的序列)的分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)、Tm、結(jié)合能、相對(duì)穩(wěn)定性的測(cè)定；反義組合物的選擇根據(jù)其相對(duì)不能形成二聚體、發(fā)夾環(huán)或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而可減少或抑制與宿主細(xì)胞中靶mRNA的特異性結(jié)合。
最優(yōu)選的MRNA的靶區(qū)域是AUG翻譯起始密碼子處或附近的那些區(qū)域，和與mRNA的5’區(qū)基本互補(bǔ)的那些序列。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析和靶位點(diǎn)選擇可用OLIGO引物分析軟件第4版(Rychlik，1997)和BLASTN 2.0.5算法軟件(Altschul，等，1997)進(jìn)行。
也考慮采用稱(chēng)為MPG(27個(gè)殘基)的短肽載體的反義輸送方法。MPG肽含有衍生自HIV gp41的融合序列的疏水性結(jié)構(gòu)域和SV40 T-抗原的核定位序列的親水性結(jié)構(gòu)域(Morris，等，1997)。已證明幾個(gè)MPG肽的分子包被反義寡核苷酸，可在不到1小時(shí)內(nèi)被輸送入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，效率相對(duì)高(90％)。另外，與MPG相互作用大大提高了寡核苷酸對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性和穿過(guò)質(zhì)膜的能力(Morris等，1997)。
4.17核酶雖然傳統(tǒng)上蛋白質(zhì)用來(lái)催化分解核酸，但已出現(xiàn)的另一類(lèi)大分子可用于此目的。核酶是能以定點(diǎn)方式切割核酸的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。核酶且有特異性催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有內(nèi)切核酸酶活性(Kim和Cech，1987；Gerlach等，1987；Forster和Symons，1987)。例如，大量核酶能以高度特異性加速磷脂轉(zhuǎn)移反應(yīng)，常只切割寡核苷酸底物中幾個(gè)磷酸脂之一(Cech等，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。此特異性歸因于化學(xué)反應(yīng)前底物結(jié)合于核酶的內(nèi)部指導(dǎo)序列(“IGS”)需要通過(guò)特異性的堿基配對(duì)相互作用。
最初觀察一核酶催化是核酸序列特異性切割/連接反應(yīng)的一部分(Joyce，1989；Cech等，1981)。例如，美國(guó)專(zhuān)利5,354,855(納入本文作參考)報(bào)道某些核酶可起內(nèi)切核酸酶作用，其序列特異性比已知的核糖核酸酶還高，接近DNA限制性酶的特異性。因此，序列特異性核酶介導(dǎo)的抑制基因表達(dá)可能特別適合治療應(yīng)用(Scanlon等，1991；Sarver等，1990)。最近報(bào)道核酶引起了它們所應(yīng)用的一些細(xì)胞系中的遺傳變化；改變的基因包括癌基因H-ras、c-fos和HIV基因。此研究的大部分涉及基于特異性核酶切割的特定突變密碼子的修飾靶mRNA。
目前知道有天然產(chǎn)生的酶RNA的六種基本變體。在生理?xiàng)l件下各自能反式催化RNA磷酸二酯鍵的水解(因此能切割其它RNA分子)?？傊?，酶核酸通過(guò)先與靶RNA結(jié)合起作用。發(fā)生這種結(jié)合是通過(guò)酶核酸的靶結(jié)合部分，其保持非常接近于該分子的酶部分而發(fā)揮切割靶RNA的作用。因此酶核酸通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)，先識(shí)別酶核酸然后結(jié)合靶RNA，一但結(jié)合于正確部位就酶促切割該靶RNA。這種靶RNA的關(guān)鍵性切割將破壞其指導(dǎo)編碼蛋白合成的能力。酶核酸結(jié)合和切割其RNA靶后，從RNA釋放以搜尋另一個(gè)靶并可重復(fù)地結(jié)合和切割新的靶。
核酶的酶特性優(yōu)于許多技術(shù)如反義技術(shù)(核酸分子只結(jié)合核酸靶以阻止其翻譯)，因?yàn)榘l(fā)揮治療作用所需的核酶濃度比反義寡核苷酸濃度低。此優(yōu)點(diǎn)反映了核酶發(fā)揮酶促的能力。因此，一個(gè)核酶分子能切割許多靶RNA分子。此外，核酶是一種高度特異性抑制劑，此抑制特異性不僅依賴于與靶RNA結(jié)合的堿基配對(duì)機(jī)制，而且依賴于靶RNA切割的機(jī)制?？拷懈钗稽c(diǎn)的單個(gè)錯(cuò)配或堿基置換可完全去除核酶的催化活性。而反義分子中的類(lèi)似錯(cuò)配不阻止其作用(Woolf等，1992)。因此，核酶作用的特異性大于反義寡核苷酸結(jié)合相同RNA位點(diǎn)的特異性。
可在錘頭、發(fā)夾、δ肝炎病毒、I組內(nèi)含子或RNaseP RNA(與RNA指導(dǎo)序列相連)或鏈孢霉VS RNA基序中形成酶核酸分子。錘頭基序的例子見(jiàn)Rossi等(1992)所述。發(fā)夾基序的例子見(jiàn)Hample等，(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)專(zhuān)利EP0360257)、Hample和Tritz(1989)、Hample等，(1990)和美國(guó)專(zhuān)利5631359(納入本文作參考)中所述。δ肝炎病毒基序的例子見(jiàn)Perrotta和Been(1992)所述；RNaseP基序的例子見(jiàn)Guerrier-Takada等(1983)所述；鏈孢霉VS RNA核酶基序見(jiàn)Collins(Saville和Collins，1990；Saville和Collins，1991；Collins和Olive，1993)所述；I組內(nèi)含子的例子見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4987071(納入本文作參考)中所述。本發(fā)明酶核酸分子中重要的是其與一種或多種靶基因RNA區(qū)互補(bǔ)的特異性底物結(jié)合位點(diǎn)，和此底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)或周?chē)x予該分子的RNA切割活性的核苷酸序列。因此核酶構(gòu)建物不需要限于上述特異性基序。
某些實(shí)施例中，重要的是產(chǎn)生對(duì)所需靶RNA(如上述序列之一)有高度特異性的酶促切割劑。優(yōu)選酶核酸分子靶向靶RNA的高度保守序列區(qū)。若需要，這類(lèi)酶核酸分子可外源輸送給特定細(xì)胞?；蛘?，可從輸送給特定細(xì)胞中的DNA或RNA表達(dá)此核酶。
小的酶核酸基序(如錘頭或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的基序)也可用于外源輸送。這些分子的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)提高了酶核酸侵入mRNA結(jié)構(gòu)的靶區(qū)域的能力?；蛘?，催化性RNA分子可在含真核啟動(dòng)子的細(xì)胞中表達(dá)(如Scanlon等，1991；Kashani-Sabet等，1992；Dropulic等，1992；Weerasinghe等，1991；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Sarver等，1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，任何核酶都可在真核細(xì)胞中由合適的DNA載體表達(dá)。這類(lèi)核酶的活性可通過(guò)第二核酶釋放其初級(jí)轉(zhuǎn)錄物而增強(qiáng)(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO93/23569和WO 94/02595，二者納入作參考；Ohkawa等，1992；Taira等，1991；和Ventura等，1993)。
可直接加入核酶，或?qū)⒑嗣概c陽(yáng)離子脂質(zhì)、脂質(zhì)復(fù)合物絡(luò)合，包裝在脂質(zhì)體內(nèi)或另外輸送給靶細(xì)胞?？蓪NA或RNA復(fù)合物局部給予活體內(nèi)的有關(guān)組織，或通過(guò)注射、氣霧劑吸入、灌注泵或支撐管(它們摻入或不摻入在生物聚合物中)體內(nèi)給予。
可按國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/23569和WO 94/02595(各自納入本文作參考)所述設(shè)計(jì)核酶并合成，如上所述在體內(nèi)或體外進(jìn)行測(cè)試。也可優(yōu)選輸送這類(lèi)核酶。當(dāng)提供具體例子時(shí)，本領(lǐng)域人員知道需要時(shí)可采用其它形式的等價(jià)RNA靶。
可通過(guò)計(jì)算機(jī)折疊(Jaeger等，1989)個(gè)別分析錘頭或發(fā)夾核酶，以評(píng)估此核酶序列是否折疊成適當(dāng)?shù)亩?jí)結(jié)構(gòu)。不考慮結(jié)合臂與催化核心之間具有不利的分子間相互作用的那些核酶。可選擇不同的結(jié)合臂長(zhǎng)度以優(yōu)化活性。通常每個(gè)臂至少5個(gè)以上堿基才能結(jié)合或與靶RNA反應(yīng)?？稍O(shè)計(jì)能與mRNA信使中各種位點(diǎn)退火的錘頭或發(fā)夾基序的核酶，并化學(xué)合成。所用合成方法按照正常RNA合成程序，見(jiàn)Usman等(1987)和Scaringe等，(1990)所述，并采用共同的核酸保護(hù)和偶聯(lián)基團(tuán)，如5’端的二甲氧三苯甲基和3’端的亞磷酰胺。分步偶聯(lián)平均得率通常＞98％。發(fā)夾核酶可二部分合成，并退火重建活性核酶(Chowrira和Burke，1992)。可廣泛修飾核核酶提高其穩(wěn)定性，修飾用的基團(tuán)為核酸酶抗性基團(tuán)，例如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟基、2 ’-O-甲基、2’-H(綜述見(jiàn)Usman和Cedergren，1992)。可用一般方法凝膠電泳或高效液相層析純化核酶并重懸于水。
可改變核酶結(jié)合臂的長(zhǎng)度或化學(xué)合成具有防止其被血清核糖酶降解的修飾的核酶，來(lái)優(yōu)化核酶的活性(見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 92/07065；Perrault等，1990；Pieken等，1991；國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 91/03162；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)92110298.4；美國(guó)專(zhuān)利5,334,711；和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/13688，它們描述了對(duì)酶RNA分子的糖部分可進(jìn)行的各種化學(xué)修飾)，這些修飾能增強(qiáng)核酶在細(xì)胞中的效果，和除去主干II堿基以縮短RNA合成時(shí)間及減少化學(xué)需求。
Sullivan等(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/02595)描述了輸送酶RNA分子的通用方法。可用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的各種方法將核酶給予細(xì)胞，包括但不限于脂質(zhì)體包裹、離子電滲、摻入其它載體如水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解納米膠囊和生物粘附性微球體中。對(duì)一些應(yīng)用，可活體內(nèi)將核酶物直接輸送給細(xì)胞或組織，用或不用上述載體?；蛘?，可通過(guò)直接吸入、直接注射或?qū)Ч?、灌注泵或支撐管局部輸送RNA/載體組合。其它輸送途徑包括但不限于血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或關(guān)節(jié)注射、氣霧劑吸入、口服(片劑或藥丸)、局部、全身、眼、腹膜內(nèi)和/或鞘內(nèi)輸送。核酶輸送和給藥的更詳細(xì)說(shuō)明見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/02592和WO 93/23569中所述，各自納入本文作參考。
細(xì)胞內(nèi)積累高濃度核酶的另一種方法是將編碼核酶的序列摻入DNA表達(dá)載體中。核酶序列的轉(zhuǎn)錄受真核RNA聚合酶(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。Pol II或pol III啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄物將在所有細(xì)胞中高水平表達(dá)；pol II啟動(dòng)子在給定細(xì)胞類(lèi)型中的水平將取決于附近存在的基因調(diào)節(jié)序列(增強(qiáng)子、沉默子等)的性質(zhì)。也可采用原核RNA聚合酶啟動(dòng)子，只要該原核RNA聚合酶能在適當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)(Elroy-Stein和Moss，1990；Gao和Huang，1993；Lieber等，1993；Zhou等，1990)。這些啟動(dòng)子表達(dá)的核酶可在哺乳動(dòng)物中起作用(Kashani-Saber等，1992；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Ye等，1993；L’Huillier等，1992；Lisziewicz等，1993)。為導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可將這類(lèi)轉(zhuǎn)錄單位摻入各種載體中，包括但不限于質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(如腺病毒、腺相關(guān)病毒載體)或病毒RNA載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、生里基森林病毒、新培斯病毒載體)。
核酶可用作診斷工具以檢測(cè)患病細(xì)胞內(nèi)的基因漂變和突變。它們也可用來(lái)評(píng)估靶RNA分子的水平。核酶活性與靶RNA結(jié)構(gòu)之間的密切關(guān)系得以檢測(cè)分子的任何區(qū)域中改變靶RNA的堿基配對(duì)和三維結(jié)構(gòu)的突變。利用多種核酶可繪制對(duì)RNA結(jié)構(gòu)和體外及細(xì)胞和組織中發(fā)揮功能十分重要的核苷酸變化圖譜?？捎煤嗣盖懈畎蠷NA來(lái)抑制基因表達(dá)和明確特定基因產(chǎn)物在疾病進(jìn)程中的作用。以此方式可明確作為疾病重要介體的其它基因靶標(biāo)。這些研究將通過(guò)可能的組合性治療(如多種核酶靶向不同基因，核酶與已知小分子抑制劑偶聯(lián)，或用核酶和/或其它化學(xué)或生物分子組合間歇性治療)導(dǎo)致更好治療疾病進(jìn)展。核酶的其它體外用途是本領(lǐng)域熟知的，包括檢測(cè)與IL-5相關(guān)疾病有關(guān)的mRNA的存在。用核酶處理后，通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定切割產(chǎn)物的存在，可檢測(cè)這類(lèi)RNA。
4.18肽核酸某些實(shí)施例中，本發(fā)明人考慮利用肽核酸(PNA)來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。PNA是一種DNA模擬物，其中的核堿基附著于假肽骨架(Good和Nielsen，1997)。許多傳統(tǒng)上采用RNA或DNA的方法可采用PNA。這些技術(shù)中，PNA序列常常比相應(yīng)的RNA或DNA序列做得更佳，其用途不是RNA或DNA所固有的。PNA的綜述包括制備方法、特征和和使用方法見(jiàn)Corey(1997)，本文納入作參考。因此在某些實(shí)施例中，可制備與ACEmRNA序列的一部分或多部分互補(bǔ)的PNA序列，這類(lèi)PNA組合物可用于調(diào)節(jié)、改變、減少或降低ACE-特異性mRNA的翻譯，從而改變已給予PNA組合物的宿主細(xì)胞中的ACE活性水平。
PNA具有2-氨基乙基-甘氨酸鍵替代DNA的正常磷酸二酯主鏈(Nielsen等，1991；Hanvey等，1992；Hyrup和Nielsen，1996；Neilsen，1996)。這種化學(xué)性質(zhì)具有三個(gè)重要的結(jié)果第一，與DNA或硫代磷酸寡核苷酸相反，PNA是中性分子；第二，PNA無(wú)手性，不需要開(kāi)發(fā)立體選擇性合成；第三，PNA合成可用固相肽合成的標(biāo)準(zhǔn)的Boc(Dueholm等，1994)或Fmoc(Thomson等，1995)方案，雖然其它方法包括改進(jìn)的Merrified方法也可使用(Christensen等，1995)。
PNA單體或易制備的寡聚物可從PerSeptive Biosystems(Framinghan，MA)商業(yè)購(gòu)得。Boc或Fmoc方案合成PNA可直接用手工或自動(dòng)化方案進(jìn)行(Norton等，1995)。手工方案本身提供產(chǎn)生化學(xué)修飾的PNA或同時(shí)合成密切相關(guān)的PNA家族。
關(guān)于肽合成，具體PNA合成的成功取決于所選序列的性質(zhì)。例如，雖然理論上PNA可摻入任何核苷酸堿基的組合，但相鄰嘌呤的存在可能導(dǎo)致產(chǎn)物中缺失一個(gè)或多個(gè)殘基。預(yù)計(jì)到這種困難，建議在生產(chǎn)具有相鄰嘌呤的PNA時(shí)。應(yīng)反復(fù)偶聯(lián)可能無(wú)效加入的殘基。然后通過(guò)反相高壓液相層析純化PNA(Norton等，1995)，產(chǎn)物的得率和純度與肽合成時(shí)所見(jiàn)相似。
為某種應(yīng)用而修飾PNA可通過(guò)在固相合成中偶聯(lián)氨基酸，或結(jié)合含有羧酸基團(tuán)的化合物而暴露N端胺基來(lái)完成?；蛘?，可在合成后通過(guò)偶聯(lián)導(dǎo)入的賴氨酸或半胱氨酸來(lái)修飾PNA。PNA容易被修飾有利于優(yōu)化更佳的溶解性或特殊功能要求。一旦合成，可用質(zhì)譜驗(yàn)證PNA及其衍生物的同一性。進(jìn)行的幾項(xiàng)研究采用了PNA的修飾(Norton等，1995；Haaima等，1996；Stetsenko等，1996；Petersen等，1995；Ulmann等，1996；Koch等，1995；Orum等，1995；Footer等，1996；Griffith等，1995；Kremsky等，1996；Pardridge等，1995；Boffa等，1995；L and sdorp等，1996；Gambacorti-Passerini等，1996；Armitage等，1997；Seeger等，1997；Ruskowski等，1997)。美國(guó)專(zhuān)利5,700,922討論了PNA-DNA-PNA嵌合分子和它們?cè)谠\斷學(xué)、調(diào)生物體中的蛋白質(zhì)和對(duì)治療劑敏感的疾病中的用途。
與含有負(fù)電荷鍵的DNA或RNA相反，PNA主鏈?zhǔn)侵行缘?。盡管這種顯著改變，PNA能通過(guò)Watson-Crick配對(duì)識(shí)別互補(bǔ)性DNA和RNA(Egholm等，1993)，證實(shí)了Nielsen等(1991)提出的最初模型。PNA缺乏3’-5’極性，且能以平行或反平行方式與優(yōu)選的反平行模式結(jié)合(Egholm等，1993)。
DNA寡核苷酸與DNA和RNA的雜交因互補(bǔ)鏈的帶負(fù)電的磷酸骨架之間的靜電排斥而失去穩(wěn)定性。相反，PNA-DNA或PNA-RNA雙鏈體中沒(méi)有電荷排斥，提高了融化溫度(Tm)并降低了Tm對(duì)單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子濃度的依賴性(Nielsen等，1991)。雜交的速率和親和力明顯提高因?yàn)樗鼈兪筆NA能在松開(kāi)的雙鏈DNA內(nèi)進(jìn)行互補(bǔ)序列的鏈入侵。此外，反向重復(fù)的有效雜交提示PNA能有效識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。識(shí)別增強(qiáng)也隨PNA固定在表面上而出現(xiàn)，Wang等證明載體連接的PNA可用于檢測(cè)雜交事件(Wang等，1996)。
人們可能希望PNA與互補(bǔ)序列的緊密結(jié)合也會(huì)增加與類(lèi)似(但不相同)序列的結(jié)合，因而降低了PNA識(shí)別的序列特異性。然而，如同DNA雜交一樣，可通過(guò)平衡寡聚物長(zhǎng)度與培育時(shí)間實(shí)現(xiàn)選擇性識(shí)別。而且通過(guò)PNA-DNA雜交增強(qiáng)的PNA選擇性雜交比DNA-DNA雜交更不耐受堿基錯(cuò)配。例如，16bp PNA-DNA雙鏈體內(nèi)的一個(gè)錯(cuò)配可降低Tm多達(dá)15℃(Egholm等，1993)。這種高水平的辨別力得以開(kāi)發(fā)幾種以PNA為基礎(chǔ)的策略來(lái)分析點(diǎn)突變(Wang等，1996；Carlsson等，1996；Thiede等，1996；Webb和Hurskainen，1996；Perry-O’Keefe等，1996)。
高親和力結(jié)合為分子識(shí)別和開(kāi)發(fā)PNA的新用途提供了明顯的優(yōu)點(diǎn)。例如，11-13個(gè)核苷酸PNA能抑制端粒酶(一種利用基本的RNA模板延伸端粒端酶末端的核糖核蛋白)的活性，而類(lèi)似的DNA寡聚物則不能(Norton等，1996)。
中性PNA比類(lèi)似的DNA寡聚物更疏水，這可能導(dǎo)致它們難于在中性pH時(shí)溶解，特別是如果PNA有高的嘌呤含量或如果它們可能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)在電荷連接于PNA末端提高其溶解性(Nielsen等，1991)。
Allfrey及其同事的發(fā)現(xiàn)提示，鏈入侵會(huì)自發(fā)地逐一發(fā)生于染色體DNA內(nèi)(Boffa等，1995；Boffa等，1996)。這些研究將PNA靶向的核苷酸CAG的三聯(lián)體序列，并利用此識(shí)別來(lái)純化轉(zhuǎn)錄與活性DNA(Boffa等，1995)并抑制轉(zhuǎn)錄(Boffa等，1996)。此結(jié)果提示如果PNA能在細(xì)胞內(nèi)輸送，它們可能是通用的基因表達(dá)的序列特異性調(diào)節(jié)劑。關(guān)于PNA用作反義和反基因制劑的研究和綜述可參見(jiàn)Nielsen等(1993b)，Hanvey等(1992)，Good和Nielsen(1997)。Koppelhus等(1997)利用PNA來(lái)抑制HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄，表明PNA可用于抗病毒治療。
表征PNA的反義結(jié)合性能的方法見(jiàn)Rose(1993)和Jensen等(1997)所述。Rose用毛細(xì)管凝膠電泳測(cè)定PNA與其互補(bǔ)寡核苷酸的結(jié)合，測(cè)定相對(duì)結(jié)合動(dòng)力學(xué)和化學(xué)計(jì)量。Jensen等用BIAcoreTM技術(shù)進(jìn)行了相似類(lèi)型的測(cè)定。
PNA的其它用途包括用于DNA鏈入侵(Nielsen等，1991)，反義抑制(Hanvey等，1992)，突變性分析(Orum等，1993)，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(Mollegaard等，1995)，核酸純化(Orum等，1995)，轉(zhuǎn)錄活性基因的分離(Boffa等，1995)，阻斷轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(Vickers等，1995)，基因組切割(Veselkov等，1996)，生物傳感器(Wang等，1996)，原位雜交(Thisted等，1996)，和替代Sounthern印跡(Perry-O’Keefe，1996)。
4.19多肽、肽和肽變體在其它方面本發(fā)明提供了多肽組合物。一般說(shuō)，本發(fā)明的多肽是衍生自哺乳動(dòng)物的分離的多肽(或其表位、變體或活性片段)。優(yōu)選該多肽由本文所述多核苷酸序列編碼，或由在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文所述多核苷酸序列雜交的序列編碼。或者，該多肽可定義為含有本文所述氨基酸序列的毗連氨基酸序列的多肽，或該多肽含有本文所述的全部氨基酸序列。
本發(fā)明中，多肽組合物還含有與本發(fā)明多肽產(chǎn)生的抗體起免疫反應(yīng)的一種或多種多肽，具體是具有所述多核苷酸編碼的氨基酸序列的多肽，或其活性片段、變體或生物功能等價(jià)物。
同樣，應(yīng)理解本發(fā)明的多肽組合物含有能誘導(dǎo)抗體的一種或多種多肽(所述抗體能與本申請(qǐng)書(shū)中所述一種或多種毗連核酸序列編碼的一種或多種多肽起免疫反應(yīng))，或其活性片段，或其變體，或能在中等到高度嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與這些序列的一種或多種雜交的一種或多種核酸序列。
如本文所用，多肽的活性片段包括用常規(guī)技術(shù)如誘變、或添加、缺失或置換修飾的多肽的全部或一部分，但活性片段顯示與本文所述多肽基本相同的結(jié)構(gòu)功能、抗原性等。
某些說(shuō)明性實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽至少含有上述血液惡性相關(guān)腫瘤蛋白或其變體的免疫原性部分。如上所述，“血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白”是由血液惡性疾病相關(guān)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)。在采用血液惡性腫瘤患者的抗血清作免疫測(cè)定(如ELISA)時(shí)也可檢測(cè)到與血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白反應(yīng)的蛋白質(zhì)。上述多肽可以是任何長(zhǎng)度?？赡艽嬖谘苌滋烊坏鞍椎钠渌蛄泻?或異源序列，這些序列也可(但不需要)具有免疫原性和抗原性。
“免疫原性部分”本文指某蛋白質(zhì)中被B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表面抗原受體識(shí)別(即特異性結(jié)合)的部分。這些免疫原性部分通常含有血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白或其變體的至少5個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少10個(gè)，最優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸殘基。某些優(yōu)選的免疫原性部分包括缺失了N-末端前導(dǎo)序列和/或跨膜結(jié)構(gòu)域的肽。其它優(yōu)選免疫原性部分與成熟蛋白質(zhì)相比較，可含有小的N-末端和/或C-端缺失(如1-30個(gè)氨基酸，優(yōu)選5-15個(gè)氨基酸)。
免疫原性部分通?？捎檬熘募夹g(shù)鑒定，如Paul，《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)，第三版，243-247(Raven Press，1993)中總結(jié)和本文參考文獻(xiàn)引用的那些技術(shù)。這些技術(shù)包括篩選能與抗原特異性抗體、抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆反應(yīng)的多肽。如本文所用，抗血清和抗體是“抗原特異性的”，如果它們能與抗原特異性結(jié)合(即在ELISA或其它免疫測(cè)定中，它們能與蛋白反應(yīng)，但與無(wú)關(guān)蛋白不發(fā)生可檢測(cè)反應(yīng))?？扇缟纤鲇檬熘募夹g(shù)制備這些抗血清和抗體。天然血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白的免疫原性部分是與上述抗血清和/或T細(xì)胞反應(yīng)的部分，其反應(yīng)水平基本上不低于全長(zhǎng)多肽的反應(yīng)性(如在ELISA和/或T細(xì)胞反應(yīng)性測(cè)定中)。這些免疫原性部分能在這類(lèi)測(cè)定中反應(yīng)，反應(yīng)水平類(lèi)似于或高于全長(zhǎng)多肽的反應(yīng)性?？捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行這種篩選，見(jiàn)Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。例如，可將此多肽固定在固相載體上，并與病人血清接觸，使血清中的抗體與固定的多肽結(jié)合。然后洗去未結(jié)合的血清，用例如125I-標(biāo)記蛋白A檢測(cè)結(jié)合的抗體。
如上所述，組合物可含有天然血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白的變體。多肽“變體”本文指與天然血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白不同，有一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、添加和/或插入的多肽，這樣該多肽的免疫原性基本上沒(méi)有減弱。換句話說(shuō)，變體與抗原特異性抗血清的反應(yīng)能力與天然蛋白相比可能增強(qiáng)或無(wú)變化，或與天然蛋白相比減少不到50％，優(yōu)選不到20％。這類(lèi)變體可通過(guò)修飾上述多肽序列之一和評(píng)價(jià)修飾的演多肽與上述抗原特異性抗體或抗血清的反應(yīng)性來(lái)鑒定。優(yōu)選的變體包括一部分或多部分，如N未端前導(dǎo)序列或跨膜結(jié)構(gòu)域已去除的那些變體。其它優(yōu)選項(xiàng)變體包括從成熟蛋白的N未端和/或c未端中去除的一小部分(如1-30個(gè)氨基酸，優(yōu)選5-15個(gè)氨基酸)已變體。
本發(fā)明的多肽變體包括顯示與本文所述多肽至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的那些多肽變體。
優(yōu)選變體含有保守性取代。“保守性取代”是其中一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有類(lèi)似性能的氨基酸所取代，這樣肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員預(yù)計(jì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性基本上不改變。通?？梢獡?jù)極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性的相似性和/或殘基的兩親性進(jìn)行氨基酸取代。例如，負(fù)電荷氨基酸包括門(mén)冬氨酸和谷氨酸；正電荷氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有無(wú)電荷極性頭部基、相似疏水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守性改變的其它氨基酸組包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，mel，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。變體也可含有非保守性改變。一優(yōu)選項(xiàng)實(shí)施例中，變體多肽有5個(gè)氨基酸或更少個(gè)取代、缺失或添加而與不同于天然序列。也可例如通過(guò)缺失或添加對(duì)多肽的免疫原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性影響最小的氨基酸來(lái)修飾(或改變)變體。
如上所述多肽可在蛋白質(zhì)的N末端含有一信號(hào)(或前導(dǎo))序列，該序列共翻譯或翻譯后指導(dǎo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移?？蓪⒍嚯呐悸?lián)于一接頭或其它序列，而易于多肽(如聚組氨酸)的合成、純化和鑒定，或增強(qiáng)多肽與固相載體的結(jié)合。例如，可將多肽偶聯(lián)于免疫球蛋白Fc區(qū)。
可用各種熟知的技術(shù)制備多肽。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種表達(dá)載體，不難從DNA序列制備上述DNA序列編碼的重組多肽。可在用含有編碼重組多肽的DNA分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的合適宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母和高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。優(yōu)選采用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物系如COS或CHO?？捎蒙虡I(yè)購(gòu)得的濾器先濃縮合適宿主/載體系統(tǒng)的培養(yǎng)基上清液(其中有分泌的重組蛋白或多肽)。濃縮后，將濃縮液加到合適的純化基質(zhì)如親和基質(zhì)或離子交換樹(shù)脂上。最后，可用一種可多種反相HPLC進(jìn)一步純化重組多肽。
也可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，以合成方法產(chǎn)生不到約100個(gè)氨基酸，通常不到約50個(gè)氨基酸的部分和其它變體。例如，可用市場(chǎng)上購(gòu)得的固相技術(shù)，如Merrifield固相合成方法合成多肽，合成中氨基酸被依次加到正在生長(zhǎng)的氨基酸鏈中。見(jiàn)Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852146-2149，1963。自動(dòng)化合成多肽的儀器可從供貨商如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City，CA)購(gòu)得，并可按廠商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
某些具體實(shí)施例中，所述多肽可以是含有上述多個(gè)多肽，或含有上述至少一個(gè)多肽和一無(wú)關(guān)序列如已知的腫瘤蛋白質(zhì)的一種融合蛋白。此融合伙伴可以，例如幫助提供T輔助表位(一種免疫融合伙伴)，優(yōu)選人可識(shí)別的T輔助表位，或幫助表達(dá)該蛋白(表達(dá)增強(qiáng)子)，產(chǎn)量比天然重組蛋白高。某些優(yōu)選的融合伙伴是免疫和表達(dá)增強(qiáng)融合伙伴。可選擇其它融合伙伴來(lái)提高蛋白的溶解性或使該蛋白靶向所需的胞內(nèi)區(qū)室。其它融合伙伴包括有利于蛋白純化的親和標(biāo)記物。
通?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括化學(xué)偶聯(lián)制備融合蛋白。優(yōu)選融合蛋在表達(dá)系統(tǒng)中作為重組蛋白表達(dá)，與非重組蛋白相比產(chǎn)量水平提高了。簡(jiǎn)言之，可分別裝配編碼多肽組分的DNA序列，并連接入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。將編碼一多肽組分的DNA序列的3’末端用或不用肽接頭，與編碼第二個(gè)多肽組分的DNA序列的5’末端連接，使該序列的讀框處于相中。這允許翻譯成保留二組分多肽的生物活性的一個(gè)融合蛋白。
用一肽接頭序列分開(kāi)第一和第二多肽組分，分開(kāi)的距離足以保證各多肽折疊成其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法將這種肽接頭序列摻入融合蛋白中。合適的肽接頭序列可根據(jù)以下因素選擇(1)其采取可屈曲延伸構(gòu)型的能力，(2)其不能采取能與第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)，(3)缺少能與多肽功能性表位反應(yīng)的疏水性或帶電殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly，Asn和Ser殘基。其它接近中性的氨基酸如Thr和Ala也可用于接頭序列?？捎米鹘宇^的氨基酸序列包括Maratea等，Gene 4039-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci838258-62，1986；美國(guó)專(zhuān)利4,935,233和4,751,180中所述。接頭序列一般長(zhǎng)1-約50個(gè)氨基酸。當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯暮锌捎糜诜珠_(kāi)功能性結(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需N-末端氨基酸區(qū)域時(shí)，不需要接頭序列。
將該連接的DNA序列操作性連接于合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件。負(fù)責(zé)表達(dá)DNA的調(diào)控元件只能位于編碼第一個(gè)多肽的DNA序列的5’端。類(lèi)似地，終止翻譯和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所需的終止密碼子只能位于編碼第二多肽的DNA序列的3’端。
也提供融合蛋白。此種蛋白含上述多肽與無(wú)關(guān)的免疫原性蛋白。優(yōu)選免疫原性蛋白能誘導(dǎo)回憶應(yīng)答。此種蛋白的例子包括破傷風(fēng)、結(jié)核和肝炎蛋白(見(jiàn)例如Stoute等，New Engl.J.Med.，33686-91，1997)。
優(yōu)選實(shí)施例中，一種免疫融合伴侶衍生自蛋白質(zhì)D，一種革蘭陰性菌流感嗜血桿菌B(WO 91/18926)的表面蛋白。蛋白D衍生物優(yōu)選含蛋白質(zhì)的約1/3(如前N-末端100-110個(gè)氨基酸)，并可脂化的蛋白D衍生物。某些優(yōu)選實(shí)施例中，將脂蛋白D融合伴侶的前109個(gè)殘基包含在N-末端上以提供具有附加外源性T-細(xì)胞表位的多肽及提高在大腸桿菌中的表達(dá)水平(因此起表達(dá)增強(qiáng)子的作用)。脂尾可確保將抗原最適呈遞給抗原呈遞細(xì)胞。其它融合伴侶包括流感病毒的非結(jié)構(gòu)性蛋白、NS1(凝血素)。通常利用N-末端81個(gè)氨基酸，雖然可采用包括T-輔助表位的不同的片段。
另一實(shí)施例中，免疫合伴侶是稱(chēng)為L(zhǎng)YTA的蛋白質(zhì)，或其一部分(優(yōu)選C-末端部分)。LYTA衍生自肺炎鏈球菌，該細(xì)菌合成一種稱(chēng)為酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；Gene 43265-292，1986)。LYTA是一種能特異性降解肽聚糖骨架中某些鍵的自溶素。LYTA的C-末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對(duì)膽堿或?qū)δ承┠憠A類(lèi)似物(如DEAE)的親和力。已利用這種性能開(kāi)發(fā)用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。已描述氨基末端含C-LYTA片段的雜交蛋白的純化(見(jiàn)Biotechnology10795-798，1992)。一優(yōu)選實(shí)施例中，可將LYTA的重復(fù)部分摻入一融合蛋白中。在開(kāi)始于殘基178的C-末端區(qū)中找到重復(fù)部分。特別優(yōu)選的重復(fù)部分摻入了殘基188-305。
通常，需分離本文所述多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸。“分離的”多肽或多核苷酸指從其原來(lái)環(huán)境中除去的。例如，分離天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，如果它與天然系統(tǒng)中共存的一些或全部物質(zhì)分開(kāi)的話。優(yōu)選這些多肽至少約90％純，更優(yōu)選至少約95％純，最優(yōu)選至少約99％純。如果將一多核苷酸克隆到不是天然環(huán)境一部分的載體中，就認(rèn)為該多核苷酸是分離的。
4.20結(jié)合劑本發(fā)明還采用能特異性結(jié)合血液惡性相關(guān)抗原的制劑如抗體及其抗原結(jié)合片段。如果抗體及其抗原結(jié)合片段以可檢測(cè)水平(如在ELISA中)與血液惡性相關(guān)抗原反應(yīng)，但在類(lèi)似條件下與無(wú)關(guān)蛋白檢測(cè)不到反應(yīng)，就認(rèn)為其與血液惡性相關(guān)抗原“特異性結(jié)合”?！敖Y(jié)合”本文指兩個(gè)不同分子間的非共價(jià)結(jié)合，從而形成一種復(fù)合物。結(jié)合能力可通過(guò)測(cè)定形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。復(fù)合物濃度除以組分的濃度可獲得結(jié)合常數(shù)。通常本文中形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)超過(guò)約103L/mol時(shí)，就認(rèn)為兩化合物“結(jié)合”了。結(jié)合常數(shù)可用本領(lǐng)域熟知方法測(cè)定。
結(jié)合劑能區(qū)分患或不患血液惡性腫瘤的病人。這類(lèi)結(jié)合劑產(chǎn)生的信號(hào)表明此病患者至少約20％存在血液惡性腫瘤；且產(chǎn)生陰性信號(hào)表明在至少約90％的無(wú)此病個(gè)體中不存在此病。為確定結(jié)合劑是否能滿足此要求，可測(cè)試患或不患有血液惡性腫瘤(用標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)測(cè)定)病人的生物樣品(如血、血清、尿、和/腫瘤活檢)是否存在與結(jié)合劑結(jié)合的多肽。顯然應(yīng)測(cè)試有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的患或不患有疾病的樣品。各結(jié)合劑應(yīng)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，然而，該領(lǐng)域普通技術(shù)人員懂得可聯(lián)合應(yīng)用結(jié)合劑以提高靈敏度。
能滿足上述要求的任何制劑可以是一種結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是有或沒(méi)有肽組分、RNA分子或多肽的核糖體。一優(yōu)選實(shí)施例中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的各種技術(shù)制備抗體。見(jiàn)例如，Harlow和Lane《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。通常，可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生抗體，包括產(chǎn)生上述單克隆抗體，或通過(guò)將抗體基因轉(zhuǎn)染入合適的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞以產(chǎn)生重組抗體。一種技術(shù)是將含多肽的免疫原先注射入各種各樣的動(dòng)物(如小鼠、大鼠、家兔、綿羊或山羊)中。在步驟中，本發(fā)明的多肽可作為免疫原而無(wú)需修飾?；蛘撸貏e對(duì)于較短的肽，如果將多肽連接于一載體蛋白如牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白，可誘導(dǎo)高免疫應(yīng)答。優(yōu)選按預(yù)定的時(shí)間表給動(dòng)物宿主注射免疫原，加一次或多次加強(qiáng)免疫，動(dòng)物定期采血?？蓪⒍嚯呐悸?lián)于合適的固相載體，如采用親和層從血清中純化對(duì)多肽特異的多克隆抗體。
可用Kohler和Milstein，Eur J Immunol.6511-19，1976的技術(shù)及其改進(jìn)制備感興趣抗原肽特異的單克隆抗體。簡(jiǎn)言之，這些方法包括制備能產(chǎn)生具有所需特異性(如與感興趣多肽反應(yīng))的無(wú)限增殖的細(xì)胞系。例如，可從上述免疫動(dòng)物獲得的脾細(xì)胞產(chǎn)生這種細(xì)胞系。然后將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶(優(yōu)選與免疫動(dòng)物同系)融合而無(wú)限增值?？刹捎酶鞣N融合技術(shù)。例如，將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞與非離子去污劑混合幾分鐘，然后以低密度接種在支持雜交細(xì)胞生長(zhǎng)而不支持骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基上中。優(yōu)選的選擇技術(shù)采用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)選擇。充分時(shí)間后，通常約1-2周可見(jiàn)雜交的克隆。選擇單個(gè)克隆并檢測(cè)其培養(yǎng)上清液對(duì)多肽的結(jié)合能力。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
可從生長(zhǎng)的雜交瘤克隆的上清液中分離得到單克隆抗體。此外，可用各種技術(shù)來(lái)提高產(chǎn)量，如將雜交瘤細(xì)胞系注射入合適脊椎動(dòng)物宿主如小鼠的腹膜腔。然后從腹水或血液中收獲單抗?？捎贸Ｒ?guī)技術(shù)如層析、凝膠過(guò)濾、沉淀和抽提去除抗體中的污染物。本發(fā)明的多肽可用于此純化工藝如親和層析步驟。
某些實(shí)施例中，優(yōu)選采用抗體的抗原結(jié)合片段。這種片段包括Fab片段可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備。簡(jiǎn)言之，可用蛋白A珠柱親和層析(Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)從兔血清中純化免疫球蛋白，并用木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生Fab和Fc片段。用蛋白A珠層析柱親和層析分離Fab和Fc片段。
可將本發(fā)明的單抗及其片段偶聯(lián)于一種或多種治療劑，如放射性核素、分化誘導(dǎo)劑、藥物、毒素和它們的衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲喋呤、嘧啶和嘌呤類(lèi)似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)劑包括佛波醇酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括篦麻毒蛋白，想思豆毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素、白樹(shù)毒蛋白、假單胞菌外毒素、志賀菌毒素和商陸抗病毒蛋白。對(duì)于某些體內(nèi)或活體內(nèi)治療，優(yōu)選將抗體或其片段偶聯(lián)于細(xì)胞毒劑如放射性或化療組成成分。
可將治療劑與合適的單克隆抗體直接或間接(通過(guò)一接頭基團(tuán))偶聯(lián)(如共價(jià)連接)。當(dāng)藥劑和抗體各自具有能相互反應(yīng)的取代基時(shí)，二者之間可能發(fā)生直接反應(yīng)。例如，一個(gè)分子上的親核基團(tuán)如氨基或巰基，能與另一分子上含羰基的基團(tuán)如酸酐或鹵酸反應(yīng)，或與含有良好離去基團(tuán)(如鹵化物)的烷基反應(yīng)。
或者，可能需要將治療劑和抗體通過(guò)一接頭基團(tuán)偶聯(lián)。接頭基團(tuán)的功能是作為分隔抗體與藥劑的間隔臂，以避免干擾結(jié)合能力。接頭基團(tuán)也可增加藥劑或抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)性，從而提高偶聯(lián)效果?；瘜W(xué)反應(yīng)性的增加還便于使用藥劑或其它藥劑上的功能基團(tuán)，否則中不可能的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已證明各種雙功能或多功能試劑，同功能和異功能試劑(見(jiàn)Pierce Chemical Co，Rockford，IL的產(chǎn)品目錄上所述)，可用作接頭基團(tuán)?？赏ㄟ^(guò)氨基、羧基、巰基或氧化的糖殘基進(jìn)行偶聯(lián)。有許多參考文獻(xiàn)描述了這類(lèi)方法，如美國(guó)專(zhuān)利4,671,958。
當(dāng)治療劑從本發(fā)明免疫偶聯(lián)物的抗體部分游離出來(lái)時(shí)其作用更強(qiáng)，因此可能需要采用細(xì)胞內(nèi)化期間能切割的接頭基團(tuán)。已描述了許多不同的可切割的接頭基團(tuán)。從這些接頭基團(tuán)細(xì)胞內(nèi)釋放藥劑的機(jī)制包括通過(guò)還原二硫鍵(美國(guó)專(zhuān)利4,489,710)；照射對(duì)光不穩(wěn)定鍵(美國(guó)專(zhuān)利4,625,014)；水解衍生的氨基酸側(cè)鏈(美國(guó)專(zhuān)利4,638,045)；血清補(bǔ)體介導(dǎo)的水解(美國(guó)專(zhuān)利4,671,958)和酸催化水解(美國(guó)專(zhuān)利4,569,789)來(lái)切割。
可能需要將一個(gè)以上的藥劑偶聯(lián)于抗體。一實(shí)施例中，將多個(gè)藥劑的分子偶聯(lián)于一個(gè)抗體分子。另一實(shí)施例中，可將一種以上的藥劑偶聯(lián)于一個(gè)抗體。不論具體的實(shí)施例，含一種以上藥劑的免疫偶聯(lián)物可用各種方法制備。例如，可將一種以上的藥劑直接偶聯(lián)于一抗體分子，或可用接頭提供多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)?；蛘撸刹捎幂d體。
載體也可以不同方法攜帶藥劑，包括直接，或通過(guò)接頭基團(tuán)共價(jià)接合。合適的載體包括蛋白質(zhì)如白蛋白(美國(guó)專(zhuān)利4,507,234)、肽和多糖如氨基葡聚糖(美國(guó)專(zhuān)利4,699,784)。載體也可通過(guò)非共價(jià)結(jié)合或包囊化如包裹在脂質(zhì)體載體中(美國(guó)專(zhuān)利4,429,008和4,873,088)而攜帶藥物。對(duì)放射性核素劑特異的載體包括放射性鹵化的小分子和螯合性化合物。例如，美國(guó)專(zhuān)利4,735,792披露的代表性放射性鹵化的小分子及其的合成方法。可從含有氮和硫原子作為結(jié)合金屬或金屬氧化物、放射性核素的供體原子的螯合性化合物中產(chǎn)生放射性核素螯合物。例如，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,673,562披露的代表性螯合化合物及其合成方法。
可采用各種途徑給予抗體和免疫偶聯(lián)物。給藥途徑通常是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或腫瘤切除床部位。顯然抗體/免疫偶聯(lián)物的精確劑量視所用抗體、腫瘤上的抗原密度和抗體清除率而不同。
4.21疫苗本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施例中提供了疫苗。這些疫苗通常含有上述一種或多種藥物組合物與免疫剌激劑組合。免疫剌激劑是任何能提高或增強(qiáng)對(duì)異源抗原的免疫應(yīng)答(抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答)的物質(zhì)。免疫剌激劑的例子包括佐劑、生物可降解微球體(如聚乳酸聚半乳交酯)和脂質(zhì)體(將化合物摻入其中，見(jiàn)Fullerton，美國(guó)專(zhuān)利4,235,877)。疫苗制品的一般描述見(jiàn)M.F.Powell和M.J.Newman編，《疫苗設(shè)計(jì)(亞基和佐劑方法)》(“Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach))，”P(pán)lenumPress(NY，1995)。本發(fā)明范圍中的藥物組合物和疫苗也可含有其它可能有或沒(méi)有生物活性的化合物。例如，組合物或疫苗中，存在其它腫瘤抗原的一種或多種免疫原性部分，或摻入融合多肽中，或作為分開(kāi)的化合物。
說(shuō)明性疫苗可含有編碼上述一種或多種多肽的DNA，從而可在原位產(chǎn)生該多肽。如上所述，DNA可在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的各種輸送系統(tǒng)內(nèi)存在，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。許多基因輸送技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，如見(jiàn)RollandCrit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems.15143-198，1998，及其引用的參考文獻(xiàn)。適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)系統(tǒng)含有在患者中表達(dá)所需的DNA序列(如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))。細(xì)菌輸送系統(tǒng)包括給予能在其細(xì)胞表面表達(dá)多肽的免疫原性部分，或分泌此種表位的細(xì)菌(如卡介苗)。一優(yōu)選實(shí)施例中，可用病毒表達(dá)系統(tǒng)(如牛痘苗或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)。合適系統(tǒng)的描述見(jiàn)Fisher-Hoch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86317-321，1989；Flexner等，Ann.N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等，Vaccine 817-21，1990；美國(guó)專(zhuān)利4,603,112；4,769,3305,017,487；WO 89/01973；美國(guó)專(zhuān)利4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO91/02805；Berkner，Biotechniques 6616-27，1988；Rosenfeld等，Science252431-4，1991；Kolls等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-19，1994；Kass-Eisler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011498-502，1993；Guzman等，Circulation882838-48，1993；和Guzman等，Cir.Res.731202-07，1993。將DNA摻入這類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。DNA也可是“裸的”，例如見(jiàn)Ulmer等，Science 2591745-1749(1993)所述和Cohen(1993)的綜述?？赏ㄟ^(guò)將DNA包被在可生物降解的小珠上而有效地轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞中，來(lái)提高裸DNA的攝入。顯然所述疫苗可含有多核苷酸和多肽組分。提供這種疫苗用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
顯然所述疫苗可含有上述多核苷酸和多肽的藥學(xué)上可接受的鹽。可從藥學(xué)上接受的非毒性堿，包括有機(jī)堿(如伯、仲、叔胺和堿性氨基酸的鹽)和無(wú)機(jī)堿(如鈉、鉀、鋰、鈣和鎂鹽)制備此種鹽。
雖然本發(fā)明疫苗組合物中可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適載體，但載體的類(lèi)型將根據(jù)給藥方式而不同?？膳渲票景l(fā)明組合物用于任何合適的給藥方式，包括例如局部、口、鼻、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)給藥。對(duì)于胃腸道外給藥如皮下注射，載體最好含有水、鹽水、酒精、脂肪、蠟或緩沖劑。對(duì)于口服給藥，可采用上述任一載體，或固體載體如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可采用生物可降解微球體(如聚乳酸聚甘醇酸酯)作為本發(fā)明藥物組合物的載體。合適的生物可降解微球體見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252中所述。也可采用美國(guó)專(zhuān)利5,928,647中所述包含宿主中能誘導(dǎo)I類(lèi)限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的顆粒一蛋白復(fù)合物的載體。
這類(lèi)組合物可也含有緩沖劑(如中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽水)、碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)，甘露糖醇、蛋白質(zhì)、肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑，螯合劑如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(如氫氧化鋁)、能賦予制劑與受者血液等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑?；蛘?，可將本發(fā)明組合物配制成凍干劑，。也可用熟知的將化合物包囊在脂質(zhì)體內(nèi)。
在制備本發(fā)明疫苗時(shí)可采用各種免疫刺激劑如佐劑。大多數(shù)佐劑含有保護(hù)抗原免被快速分解的物質(zhì)如氫氧化鋁或礦物油、免疫應(yīng)答刺激劑如脂質(zhì)A、百日咳鮑特氏菌或結(jié)核分枝桿菌衍生的蛋白。合適的佐劑可從市場(chǎng)上購(gòu)得，如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐劑65(Merck and Company Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(Smithkline Beecham，Philadelphia，PA)；鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁、鈣、鐵或鋅的鹽；?；野彼岬牟蝗苄詰腋∫海货；?；陽(yáng)離子或陰離子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球體；單磷酰脂質(zhì)A和Quil A。細(xì)胞因子如GM-CSF或IL-2、IL-7或IL-12也可用作佐劑。
本文所述疫苗中，佐劑組合物優(yōu)選設(shè)計(jì)成能誘導(dǎo)Th1型占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。高水平的Th1型細(xì)胞因子(如IFN-r、TNF-α、IL-2和IL-12)有利于誘導(dǎo)對(duì)施用抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。相反，高水平的Th2型細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)有利于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。應(yīng)用本文所述疫苗后，病人將產(chǎn)生包括Th1和Th2型的免疫應(yīng)答。優(yōu)選實(shí)施例中，免疫應(yīng)答是占優(yōu)勢(shì)的Th1型，Th1型細(xì)胞因子水平的增加大于Th2型細(xì)胞因子的水平。采用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定不難評(píng)估這些細(xì)胞因子的水平。細(xì)胞因子家族的綜述可參見(jiàn)Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
用于誘導(dǎo)占優(yōu)勢(shì)的Th1型應(yīng)答的優(yōu)選佐劑包括，例如單磷酰脂質(zhì)A(優(yōu)選3-脫氧酰化單磷酰脂質(zhì)a(3D-MPL)與鋁鹽合用。MPL佐劑可從Corixa Corporation(SeattleWA；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)購(gòu)買(mǎi)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是非甲基化的)也誘導(dǎo)占優(yōu)勢(shì)的Th1型應(yīng)答。這類(lèi)寡核苷酸是熟知的，例如可參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO96/02555和WO99/33488及美國(guó)專(zhuān)利6,008,200；5,856,462中所述。Sato等，Science 273352，1996也描述了免疫刺激DNA序列。另一種優(yōu)選的佐劑是皂苷，優(yōu)選QS21(Aquila Biophamaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)，可單獨(dú)或與其它佐劑聯(lián)用。例如，一種增強(qiáng)系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合，如QS21和3D-MPL的組合(見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO94/00153)，或一種反應(yīng)原性較低的組合物(其中采用膽固醇猝滅QS21，見(jiàn)WO96/33739所述)。其它優(yōu)選制劑包括水包油乳劑和生育酚。特別強(qiáng)的佐劑包括QS21、3D-MPL和上述水包油乳劑中的生育酚，見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO95/17210。
其它優(yōu)選佐劑包括Montanide ISA 720(Seppic)、SAF(Chiron)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐劑(如SBAS-2或SBAS-4，獲得自SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)、Detox(Corixa公司)、RC-529(Corixa公司)和氨烷基氨基葡糖苷-4-磷酸鹽(AGPs)，這些可見(jiàn)待批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/853,826和09/074,720，其內(nèi)容納入本文作參考。
本文所述任何疫苗可用熟知的方法制備而得到抗原、免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑和合適的載體或賦形劑的組合。本文所述組合物可作為緩釋劑型的一部分給藥(即以多糖組成的膠囊、海綿或明膠劑型、能在給藥后緩慢釋放起作用的化合物)?？刹捎檬熘夹g(shù)(Coombes等，Vaccine 141429-38，1996)制備此種制劑，并通過(guò)口、直腸或皮下植入(植入在所需的靶位置)給藥。緩釋制劑可含有分散在載體基質(zhì)，和/或包含在貯器(被一控速膜包圍)中的肽、多核苷酸或抗體。
這類(lèi)制劑中所用的載體優(yōu)選生物相容的，也可以是生物可降解的，該制劑優(yōu)選提供較恒定水平的活性成分釋放。這類(lèi)載體包括聚(丙交酯-共乙交酯)的微球體聚丙烯酸、乳膠、淀粉、纖維素和葡聚糖等。其它緩釋載體包括超分子生物載體，其含有非液態(tài)親水核心(如交聯(lián)的多糖或寡糖)和任選地含兩親性化合物如磷脂的外層(美國(guó)專(zhuān)利5,151,254、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO94/20078；WO94/23701和WO96/06638)。緩釋制劑內(nèi)活性化合物含量取決于植入的部位、釋放的速度和持續(xù)時(shí)間，及待防治疾病的性質(zhì)。
所述藥物組合物和疫苗中可采用各種輸送載體，以促進(jìn)靶向腫瘤細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。輸送載體包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和可被基因改造成有效的APC的其它細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可以但不需要基因修飾以提高其呈遞抗原的能力，促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答的活化和/或維持本身具有的抗腫瘤作用，和/或在免疫學(xué)上與接受者相容(即HLA單倍體型相配)。一般可從各種生理性液體和器官，包括腫瘤和腫瘤外周組織中分離得到APC，可以是自身的、同種異體的，同系或異種細(xì)胞。
本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施例采用樹(shù)突細(xì)胞或其祖細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞是很強(qiáng)的APC(Banchereau和Steinman，Nature 392245-251，1998)，已證明其有效作為誘導(dǎo)預(yù)防或治療性抗腫瘤免疫的生理性佐劑(Timmerman和Levy，Ann Rev Med50507-529，1999)。通?？筛鶕?jù)其典型形狀(原位放射狀，顯著的胞質(zhì)突起(樹(shù)突)體外可見(jiàn))，攝取、加工和高效呈遞抗原的能力及激活原初T細(xì)胞應(yīng)答的能力，來(lái)鑒定樹(shù)突細(xì)胞。當(dāng)然，可基因改造樹(shù)突細(xì)胞使其表達(dá)通常在體內(nèi)或活體內(nèi)樹(shù)突細(xì)胞上沒(méi)有的特異性細(xì)胞表面受體或配體，這類(lèi)修飾的樹(shù)突細(xì)胞也是本發(fā)明考慮的。另一種樹(shù)突細(xì)胞，分泌的載體、載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞(稱(chēng)為外體)也可用于疫苗中(Zitvogel等，Nature Med 4594-600，1998)。
樹(shù)突細(xì)胞可獲得自外周血、骨髓、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞、腫瘤外周組織浸潤(rùn)細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟、皮膚、臍帶血或任何其它合適的組織或液體。例如，可通過(guò)在獲自外周血的單核細(xì)胞培養(yǎng)物中加入細(xì)胞因子的組合物如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα來(lái)話體外分化樹(shù)突細(xì)胞。或者，在培養(yǎng)基中加入能誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞分化、成熟和增殖的GM-CSF、IL-3、TNF-α、CD40配體、LPS、fit3配體和/或其它化合物的組合物，使獲自外周血、臍帶血或骨髓的CD34陽(yáng)性細(xì)胞分化為樹(shù)突細(xì)胞。
可方便地將樹(shù)突細(xì)胞分成“不成熟”和“成熟”細(xì)胞，這是在兩種鑒定良好的表型之間的簡(jiǎn)單方法。然而，這種命名法不應(yīng)認(rèn)為排除了所有可能的分化中間期細(xì)胞。作為APC，不成熟樹(shù)突狀細(xì)胞特征是抗原攝取和加工能力高，這與其FCr受體和甘露糖受體的高表達(dá)相關(guān)。成熟表型的典型特征是這些標(biāo)記的表達(dá)較低，但負(fù)責(zé)T細(xì)胞活化的細(xì)胞表面分子，如I類(lèi)和II類(lèi)MHC分子、粘附分子(如CD54和CD11)和共刺激分子(如CD40、CD80、CD86和4-IBB)高表達(dá)。
一般用編碼血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白(其部分或其它變體)的多核苷酸轉(zhuǎn)染APC，在細(xì)胞表面表達(dá)該血液惡性疾病相關(guān)腫瘤多肽或其免疫原性部分?？苫铙w外進(jìn)行這種轉(zhuǎn)染，包含這種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物或疫苗可用于上述治療目的?；蛘?，可將靶向樹(shù)突細(xì)胞或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因輸送載體給予病人，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法如WO97/24947中所述的方法或Mahvi等，Immunology andCell Biology 75456-460，1997所述基因槍方法進(jìn)行樹(shù)突細(xì)胞的體內(nèi)或活體內(nèi)轉(zhuǎn)染。可將樹(shù)突細(xì)胞或祖細(xì)胞與血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤多肽、DNA(裸的或在質(zhì)粒載體內(nèi))或RNA一起培育，或與表達(dá)抗原的重組細(xì)菌或病毒(如牛痘、禽痘、腺病毒或慢病毒載體)一起培育，實(shí)現(xiàn)樹(shù)突細(xì)胞的抗原負(fù)載。負(fù)載前，可將此多肽共價(jià)偶聯(lián)于提供T細(xì)胞輔助的免疫伙伴(如載體分子)?；蛘?，可分別或存在此多肽時(shí)用非偶聯(lián)的免疫伙伴脈沖剌激樹(shù)突細(xì)胞。
所述疫苗和藥物組合物可裝在單位劑量或多劑量容器中，如密封的安瓿或小瓶。這些容器最好密封以保持制劑的無(wú)菌，直到使用。一般將制劑作為懸浮液、溶液或乳液貯存在油性和水性載體中?；蛘?，可將所述疫苗或藥物組合物凍干貯存，使用前只需加入無(wú)菌液體載體即可。
4.22癌癥治療本發(fā)明的其它方面，可用本文所述組合物免疫治療癌癥如血液惡性腫瘤，這類(lèi)方法中，通常給予患者藥物組合物和疫苗?！盎颊摺北疚闹笢匮?jiǎng)游?，?yōu)選人?；颊呖梢曰加谢驔](méi)患有癌癥。因此可用上述藥物組合物和疫苗來(lái)預(yù)防癌癥的發(fā)展或治療患有癌癥的患者。癌癥可用該領(lǐng)域一般所接受的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，包括惡性腫瘤的存在?？稍谑中g(shù)切除原發(fā)腫瘤和/或給予放療或常規(guī)化療藥物等治療之前或之后，給予藥物組合物和疫苗。可用任何合適的方法，包括靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、肛門(mén)、陰道、局部和口服途徑給藥。
某些實(shí)施例中，免疫治療可以是主動(dòng)性免疫治療，這種治療依靠給予免疫應(yīng)答修飾劑(如本文所述多肽和多核苷酸)體內(nèi)刺激內(nèi)源性宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)。
其它實(shí)施例中，免疫治療可以是被動(dòng)性免疫治療，這種治療包括給予已建立的抗腫瘤免疫反應(yīng)性制劑(如效應(yīng)細(xì)胞或抗體)的輸送直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤作用，而不需要依賴宿主的完整免疫系統(tǒng)。效應(yīng)細(xì)胞的例子包括上述表達(dá)本文所述多肽的T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(如CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和CD4+T輔助腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)、殺傷細(xì)胞(如自然殺傷淋巴和因子激活的殺傷細(xì)胞)、B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。
可將對(duì)上述多肽特異的T細(xì)胞受體和抗體受體克隆、表達(dá)和轉(zhuǎn)移到用于過(guò)繼免疫治療的其它載體或效應(yīng)細(xì)胞中。也可用上述多肽產(chǎn)生用于被動(dòng)性免疫治療的抗體或抗獨(dú)特型抗體(見(jiàn)上述和美國(guó)專(zhuān)利4,918,164)。
用于過(guò)繼免疫治療的效應(yīng)細(xì)胞一般可如上所述通過(guò)體外生長(zhǎng)而充分獲得。本領(lǐng)域熟知將一個(gè)抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增至數(shù)十億數(shù)量并保留抗原識(shí)別能力的培養(yǎng)條件。體外培養(yǎng)條件通常在存在細(xì)胞因子(如IL-2)和非分裂飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下采用抗原間歇刺激。如上所述，本文所述免疫反應(yīng)性多肽可用于快速擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物，以產(chǎn)生充分?jǐn)?shù)量的細(xì)胞用于免疫治療。特別是，可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以免疫反應(yīng)性多肽脈沖刺激或用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和/或B細(xì)胞。例如，可用具有適合于提高重組病毒或其它表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的啟動(dòng)子的多核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞。培養(yǎng)的治療用效應(yīng)細(xì)胞必須能在體內(nèi)生長(zhǎng)并廣泛分布和長(zhǎng)期存活。研究顯示，用補(bǔ)充了IL-2的抗原反復(fù)制刺激可誘導(dǎo)培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)大量生長(zhǎng)和長(zhǎng)期存活(見(jiàn)例如Cheever等，Immnnol Rev 157177，1997)。
或者，可將表達(dá)上述多肽的載體導(dǎo)入病人的抗原呈遞細(xì)胞且在活體外克隆增殖供移植回同一病人中?？刹捎迷擃I(lǐng)域已知的方法將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再導(dǎo)入病人體內(nèi)，優(yōu)選以無(wú)菌形式通過(guò)靜脈內(nèi)，腔內(nèi)，腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給藥。
給予本文所述治療組合物的途徑和次數(shù)以及劑量，個(gè)體之間不同，易用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。一般可通過(guò)注射(如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)，鼻內(nèi)(如吸入)或口服給予藥物組合物和疫苗。最好在52周期間給藥1-10個(gè)劑量。優(yōu)選間隔1個(gè)月一次給予6個(gè)劑量，然后可定期給予加強(qiáng)免疫接種。其它方案也適合各個(gè)病人。合適的劑量是如上給予時(shí)能促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答并超過(guò)基礎(chǔ)水平(即未治療)至少10-50％的量。免疫應(yīng)答可通過(guò)測(cè)定病人的抗腫瘤抗體，或依賴疫苗產(chǎn)生的能體外殺傷病人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞來(lái)監(jiān)測(cè)。此種疫苗也應(yīng)能引起免疫應(yīng)答導(dǎo)致接種疫苗病人比未接種疫苗病人的臨床結(jié)果改善(如更常見(jiàn)緩解、完全或部分緩解或較長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)病存活)。總之，藥物組合物和疫苗含有一種或多種多肽，一個(gè)劑量中各多肽的量為每公斤宿主約25μg-5mg范圍。合適的劑量范圍因病人的體重而不同，但通常為約0.1mL-5mL范圍。
一般適合的劑量和治療方案可提供充足量的活性化合物以獲得治療和/或預(yù)防效果。治療病人與未治療病人相比，可通過(guò)確定改善的臨床結(jié)果(如更常見(jiàn)緩解、完全或部分緩解或較長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)病存活)來(lái)監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。先前存在的對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白的免疫應(yīng)答得到提高，通常與改善的臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)。一般可用獲自治療前后病人的樣品，以標(biāo)準(zhǔn)增殖、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子測(cè)定，來(lái)評(píng)價(jià)此種免疫應(yīng)答。
4.23癌癥的檢測(cè)和診斷通常病人的癌癥檢測(cè)可根據(jù)獲自該病人的生物樣品(如血、血清、痰、尿和/或腫瘤活檢)中存在的一種或多種血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白和/或編碼此類(lèi)蛋白的多核苷酸而定。換句話說(shuō)，這類(lèi)蛋白可用作表明是否存在血液惡性腫瘤的標(biāo)志。此外，這類(lèi)蛋白可用于檢測(cè)其它癌癥。本發(fā)明提供的結(jié)合劑通常能檢測(cè)生物樣品中結(jié)合藥劑的抗原水平?？衫枚嗪塑账嵋锖吞结榿?lái)檢測(cè)編碼腫瘤蛋白的mRNA水平。通常腫瘤組織中存在的血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤的序列水平應(yīng)比正常組織中至少高3倍。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知有多種測(cè)定采用結(jié)合劑來(lái)檢測(cè)樣品中的多肽標(biāo)記。見(jiàn)例如Harlow和Lane《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。通常病人中是否存在癌癥可通過(guò)(a)使病人的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)檢測(cè)樣品中結(jié)合該結(jié)合劑的多肽水平；和(c)將多肽水平與預(yù)定的截?cái)嘀当容^來(lái)測(cè)定。
一優(yōu)選實(shí)施例中，測(cè)定涉及利用固定在固相載體上的結(jié)合劑來(lái)結(jié)合樣品中的多肽和去除其余成分。然后用含有報(bào)導(dǎo)基團(tuán)能特異性結(jié)合該結(jié)合劑/多肽復(fù)合物的檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)合的多肽。這類(lèi)檢測(cè)試劑可包括能特異性結(jié)合該多肽或抗體的結(jié)合劑，或能特異性結(jié)合該結(jié)合劑的其它試劑，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。或者，可用競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，此測(cè)定中用一報(bào)導(dǎo)基團(tuán)標(biāo)記多肽，培育結(jié)合劑和樣品后，使標(biāo)記的多肽與固定的結(jié)合劑結(jié)合。樣品中的成分抑制該標(biāo)記多肽與結(jié)合劑結(jié)合的程度，反映了樣品與固定的結(jié)合劑的反應(yīng)性，適合這類(lèi)測(cè)定用的多肽包括上述能與結(jié)合劑結(jié)合的全長(zhǎng)血液惡性腫瘤相關(guān)蛋白及其部分。
腫瘤蛋白可附著的固相支持體是本領(lǐng)域普通技術(shù)已知的任何材料。例如，固相支持體可以是微量滴定板中的測(cè)試孔、或硝酸纖維素或其它合適的膜?；蛘撸С煮w可以是珠或圓片，如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料如聚丙乙烯或聚氯乙烯。支持體也可以是上述磁性顆?；蚬饫w傳感器，例如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,359,681。結(jié)合劑可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)上所詳細(xì)描述的各種技術(shù)固定在固相支持體上。本發(fā)明內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“固定”指非共價(jià)締合(如吸附)和共價(jià)結(jié)合(可以是試劑和支持體上的功能基團(tuán)之間直接連接或借助交聯(lián)劑連接)。優(yōu)選通過(guò)吸附于微量滴定板中的孔或膜上的固定。此類(lèi)情況下，可使用合適緩沖液配的結(jié)合劑與固相支持接觸適當(dāng)時(shí)間而獲得吸附。接觸時(shí)間隨溫度而異，但通常約1小時(shí)和約1天。一般與塑料微量滴定板的孔接觸的結(jié)合劑量約10ng-10μg，優(yōu)選100ng-1μg，能充分固定足夠量的結(jié)合劑。
結(jié)合劑與固相支持體共價(jià)結(jié)合的實(shí)現(xiàn)，一般可先使該支持體與雙功能試劑反應(yīng)，該雙功能試劑可與支持體和結(jié)合劑上的功能基因如羥基或氨基反應(yīng)。例如，所述結(jié)合劑可共價(jià)結(jié)合于具有用苯醌包被的適當(dāng)聚合物的支持體上，或通過(guò)支持體上的醛基與結(jié)合伙伴上的胺基和活化氫縮合(見(jiàn)Pierce《免疫技術(shù)樣本和手冊(cè)》，1991，A12-13)。
某些實(shí)施例中，測(cè)定是雙抗體夾心測(cè)定。進(jìn)行該測(cè)定可先使固定在固相支持體(通常是微量滴定板的孔)上的抗體與樣品接觸，使樣品中的多肽結(jié)合于固定的抗體。然后從固定的多肽-抗體復(fù)合物中洗去未結(jié)合樣品，加入含報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的檢測(cè)試劑(優(yōu)選能結(jié)合多肽上不同位點(diǎn)的第二抗體)。然后用適合于特異性報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的方法，測(cè)定仍結(jié)合于固相支持體的檢測(cè)試劑的量。
更具體地說(shuō)，一理抗體被固定于上述支持體上，通過(guò)封閉該支持體上的其余蛋白結(jié)合位點(diǎn)。合適的封閉劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，如牛血清白蛋白或Tween20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后，一起培育固定化抗體和樣品，使多肽結(jié)合于該抗體。培育前可用合適的稀釋液如磷酸緩沖液(PBS)稀釋樣品。一般，適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間(即培育時(shí)間)是足以檢測(cè)到獲自血液惡性腫瘤患者樣品中多肽存在的時(shí)間。優(yōu)選的接觸時(shí)間是獲得的結(jié)合水平足以達(dá)到結(jié)合和非結(jié)合多肽之間平衡時(shí)至少約95％。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，不難通過(guò)測(cè)定該時(shí)間段出現(xiàn)的結(jié)合水平來(lái)確定實(shí)現(xiàn)平衡所需的時(shí)間。通常室溫下培育時(shí)間約30分鐘是足夠的。
可用適當(dāng)?shù)木彌_液如含0.1％Tween20TM的PBS洗去固相支持體上未結(jié)合的樣品。然后將含報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的第二抗體加到固相支持體上。優(yōu)選的報(bào)導(dǎo)基團(tuán)包括上述基團(tuán)。
然后，將檢測(cè)試劑與固定的抗體-多肽復(fù)合物培育足夠時(shí)間以檢測(cè)結(jié)合的多肽。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間通?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定該時(shí)間段出現(xiàn)的結(jié)合水平來(lái)確定。然后洗去未結(jié)合的檢測(cè)試，并用報(bào)導(dǎo)基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑。用于檢測(cè)報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的方法取決于該報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的性質(zhì)。對(duì)于放射性基團(tuán)，通常適合用閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影方法?？捎梅止夤舛确z測(cè)染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。偶聯(lián)于不同報(bào)導(dǎo)基團(tuán)(通常為放射性或熒光基團(tuán)或酶)的生物素可用親和素檢測(cè)。一般可加入底物(通常用于特定時(shí)間段)然后用分光度或反應(yīng)產(chǎn)物的其它分析，來(lái)檢測(cè)酶報(bào)導(dǎo)基團(tuán)。
為確定是否存在癌癥如血液惡性腫瘤，通常將檢測(cè)到的仍結(jié)合于固相支持體的報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的信號(hào)，與相應(yīng)于預(yù)定的截?cái)嘀敌盘?hào)作比較。一優(yōu)選實(shí)施例中，測(cè)定癌癥的截?cái)嘀凳枪潭ɑ贵w與非癌癥患者樣品培育時(shí)獲得的信號(hào)平均值。一般，樣品產(chǎn)生的信號(hào)高于預(yù)定截?cái)嘀等齻€(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差即認(rèn)為癌癥陽(yáng)性。另一優(yōu)選實(shí)施例中，按Sackett等，《臨床流行病學(xué)臨床醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)科學(xué)》，Little Brow and Co.，1985，106-7頁(yè)的方法，用接受手術(shù)者曲線(Receiver Operator Curve)測(cè)定此截?cái)嘀?。?jiǎn)言之，此實(shí)施例中，可從真陽(yáng)性率(即靈敏度)和假陽(yáng)性率(100％特異性)配對(duì)的曲線來(lái)確定此截留值，其對(duì)應(yīng)于診斷試驗(yàn)結(jié)果的每種可能截?cái)嘀?。該曲線上最靠近左手上角處的截?cái)嘀?即圍住最大區(qū)域的值)是最精確的截?cái)嘀担墚a(chǎn)生高于此法所測(cè)定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品被認(rèn)為是陽(yáng)性。或者，可將截?cái)嘀笛厍€向左移動(dòng)以最低程度地減少假陽(yáng)性率，或向右移動(dòng)以最低程度地減少假陰性率。通常，能產(chǎn)生高于此法所測(cè)定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品被認(rèn)為是癌癥陽(yáng)性。
一相關(guān)實(shí)施例中，以流通或測(cè)試條方式進(jìn)行測(cè)定，其中結(jié)合劑被固定在一種膜如硝酸纖維素。流通試驗(yàn)中，樣品中的多肽隨樣品流過(guò)膜時(shí)結(jié)合于已固定的結(jié)合劑。然后標(biāo)記的第二結(jié)合劑在含第二結(jié)合劑的溶液流過(guò)該膜時(shí)，結(jié)合于結(jié)合劑-多肽復(fù)合物。然后如上所述檢測(cè)結(jié)合的第二結(jié)合劑。測(cè)試條方式中，將結(jié)合劑所結(jié)合的膜的一端浸在含樣品的溶液中。樣品沿著膜移動(dòng)，通過(guò)含第二結(jié)合劑的區(qū)域，進(jìn)入固定結(jié)合劑的區(qū)域。固定抗體區(qū)域中聚集的第二結(jié)合劑表明有癌癥存在。通常該部位聚集的第二結(jié)合劑產(chǎn)生一種模式，如可用肉眼看的線條。缺乏此模式表示陰性結(jié)果。一般在上述形式的雙抗體夾心測(cè)定中，當(dāng)生物樣品含有的多肽水平足以產(chǎn)生陽(yáng)生信號(hào)時(shí)，選擇固定于膜上的結(jié)合劑的量以產(chǎn)生肉眼可辨別的模式。這類(lèi)測(cè)定中所用的結(jié)合劑優(yōu)選抗體和其抗原結(jié)合片段。固定在膜上的抗體量?jī)?yōu)選約25ng-1μg，更優(yōu)選約50ng-500ng。這類(lèi)試驗(yàn)一般用很少量的生物樣品進(jìn)行。
當(dāng)然，現(xiàn)有的許多其它測(cè)定方案也適合采用本發(fā)明的腫瘤蛋白或結(jié)合劑。以上所述僅是示范性的。例如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員懂得，易對(duì)上述方案進(jìn)行改進(jìn)而采用血液惡性腫瘤相關(guān)多肽來(lái)檢測(cè)與生物樣品中此類(lèi)多肽結(jié)合的抗體。檢測(cè)這類(lèi)血液惡性疾病相關(guān)腫瘤蛋白特異性抗體可能與癌癥的存在相關(guān)。
或者，也可根據(jù)存在能與生物樣品中血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白特異性反應(yīng)的T細(xì)胞測(cè)定癌癥。某些方法中，將分離自病人的含CD4+T或/或CD8+T細(xì)胞的生物樣品與血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤多肽一起培育，檢測(cè)編碼多肽的多核苷酸、和/或表達(dá)至少一種多肽的免疫原性部分的APC，及特異性激活的T細(xì)胞存在與否。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細(xì)胞。例如可用常規(guī)技術(shù)(如Ficoll-Hypaque密度梯度離心外周血淋巴細(xì)胞)分離病人的T細(xì)胞?？审w外37℃培養(yǎng)T細(xì)胞與多肽(如5-25μg/ml)2-9天(一般4天)?？赡苄枰谌鄙傺簮盒阅[瘤相關(guān)腫瘤多肽時(shí)培養(yǎng)另一等分T細(xì)胞樣品作為對(duì)照。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的增殖來(lái)測(cè)定其激活。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒活性來(lái)測(cè)定其激活。與無(wú)此病患者相比，增殖水平至少高兩倍，和/或細(xì)胞毒活性至少高20％表明該病人患有癌癥。
如上所述也可根據(jù)生物樣品中編碼血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白的mRNA水平來(lái)檢測(cè)癌癥。例如可在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定中采用至少二種寡核苷酸引物來(lái)擴(kuò)增衍生自生物樣品的血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤cDNA的一部分，其中至少一種寡核苷酸引物對(duì)編碼血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白的多核苷酸有特異性(即與之雜交)。然后用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(如凝膠電泳)分離和檢測(cè)擴(kuò)增的cDNA。類(lèi)似地，可在雜交測(cè)定中采用能特異性雜交編碼血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白的多核苷酸的寡核苷酸探針，檢測(cè)生物樣品中存在的編碼腫瘤蛋白的多核苷酸。
為了能在測(cè)定條件下雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)含有的寡核苷酸序列應(yīng)與至少長(zhǎng)10個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少長(zhǎng)20個(gè)核苷酸的編碼血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白的多核苷酸一部分的同一性至少的60％，優(yōu)選至少約75％，更優(yōu)選至少約90％。優(yōu)選在上述中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，寡核苷酸引物和/或探針與編碼所述多肽的多核苷酸雜交?？捎糜谒鲈\斷方法的寡核苷酸引物和/或探針長(zhǎng)度最好至少10-40個(gè)核苷酸。一優(yōu)選實(shí)施例中，寡核苷酸引物含本申請(qǐng)書(shū)所述序列的DNA分子的至少10個(gè)毗連核苷酸，更優(yōu)選至少15個(gè)毗連核苷酸。PCR測(cè)定和雜交測(cè)定技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)例如Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51；263，1987；Erlich編《PCR技術(shù)》Stockton Press，NY，1989)。一優(yōu)選測(cè)定采用RT-PCR，其中PCR與逆轉(zhuǎn)錄相結(jié)合。RNA一般提取自生物樣品如活檢組織并逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子。用至少一個(gè)特異性引物作PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的cDNA分子可分離并用凝膠電泳觀察。對(duì)取自待測(cè)病人和取自非患癌癥的個(gè)體的生物樣品進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)可在橫跨二個(gè)數(shù)量級(jí)的幾種cDNA稀釋液中進(jìn)行。待測(cè)病人樣品幾種稀釋液中的表達(dá)比非癌性樣品的相同稀釋度大2倍或以上通常視為陽(yáng)性。
另一實(shí)施例中，上述組合物可用作癌癥進(jìn)展的標(biāo)志。此實(shí)施例中，可隨時(shí)進(jìn)行癌癥診斷的上述測(cè)定，且評(píng)價(jià)反應(yīng)性多肽或多核苷酸水平的變化。例如，可在6個(gè)月至1年中每隔24-72小時(shí)進(jìn)行一次測(cè)定。然后按需要進(jìn)行。通常這些病人中癌癥發(fā)展時(shí)，檢測(cè)到的多肽或多核苷酸水平隨時(shí)間而增加。相反，當(dāng)反應(yīng)性多肽或多核苷酸水平保持恒定或隨時(shí)間而降低時(shí)，則癌癥沒(méi)有進(jìn)展。
某些體內(nèi)診斷測(cè)定可直接在腫瘤上進(jìn)行。這類(lèi)試驗(yàn)包括使腫瘤細(xì)胞與結(jié)合劑接觸。然后結(jié)合的結(jié)合劑可直接檢測(cè)或通過(guò)報(bào)道基因間接檢測(cè)。這類(lèi)結(jié)合劑也可用于組織學(xué)?；蛘?，這類(lèi)應(yīng)用中可采用多核苷酸探針。
如上所述，為了提高靈敏度，可測(cè)定給定樣品中的多種血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白標(biāo)記。顯然在一個(gè)試驗(yàn)中可聯(lián)用本文提供的對(duì)不同蛋白質(zhì)特異的結(jié)合劑。另外，可同時(shí)采用多個(gè)引物和探針?？筛鶕?jù)常規(guī)試驗(yàn)選擇腫瘤蛋白標(biāo)記來(lái)確定能導(dǎo)致最佳靈敏度的組合。此外，或者本文提供的腫瘤蛋白的測(cè)定可與其它已知腫瘤抗原的測(cè)定聯(lián)合應(yīng)用。
4.24制備DNA序列通過(guò)基于PCRTM的扣除分離了編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原部分的cDNA分子的某些核酸序列。此技術(shù)用來(lái)規(guī)范差異性表達(dá)的cDNA，有利于回收罕見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄物，還具有用小量Poly A RNA材料富集的cDNA和沒(méi)有多輪雜交的優(yōu)點(diǎn)。為獲得在非霍奇金淋巴瘤中抗原的過(guò)度表達(dá)，用三個(gè)T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤mRNA的集合體制備的實(shí)驗(yàn)對(duì)象文庫(kù)進(jìn)行了兩次扣除。此兩個(gè)獨(dú)自扣除的文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)cDNA的不同集合體。驅(qū)動(dòng)#1含有從特定的正常組織(淋巴結(jié)、骨髓、T細(xì)胞、心臟和腦)制備的cDNA，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)TCS-D1(T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#1)。驅(qū)動(dòng)#2含非特定的正常組織(結(jié)腸、大腸、肺、胰、脊髓、骨骼肌、肝、腎、皮膚和腦)，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)TCS-D2(T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#2)。用三個(gè)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤mRNA的集合體制備的實(shí)驗(yàn)對(duì)象文庫(kù)進(jìn)行另二次扣除。此兩個(gè)獨(dú)自扣除的文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)cDNA的不同集合體。驅(qū)動(dòng)#1含有從特定的正常組織(淋巴結(jié)、骨髓、B細(xì)胞、心臟和腦)，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)BCNHL/D1(B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#1)。驅(qū)動(dòng)#2含非特定的正常組織(腦，肺，胰，脊髓，骨骼肌，結(jié)腸，脾，大腸和PBMC)，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)BCNHL/D2(B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#2)。從扣除文庫(kù)產(chǎn)生PCRTM擴(kuò)增的庫(kù)，并測(cè)序克隆。用各種熟知技術(shù)之進(jìn)一步表征了血液惡性腫瘤相關(guān)抗原序列。例如，可將PCRTM擴(kuò)增的克隆在玻璃載玻片上排成陣列作微陣列分析。為確定組織分布，陣列的克隆可用作靶，與不同的第一鏈cDNA探針包括淋巴瘤探針、白血病探針和不同正常組織的探針雜交?？蓮慕Y(jié)果差的(常規(guī)化療后不能完全緩解或復(fù)發(fā)的病人)或結(jié)果良好(獲得長(zhǎng)期緩解的病人)的NHL、何杰金氏病、AML、CML、CLL、ALL、MDS和骨髓瘤病人診斷時(shí)獲得的凍存樣品產(chǎn)生白血病和淋巴瘤探針。為了分析造血細(xì)胞分化期間的基因表達(dá)，可從衍生自健康個(gè)體的CD34+、CD2+、CD14+、CD15+和CD19+的95％以上純化組分中產(chǎn)生探針。
多核苷酸變體一般可用該領(lǐng)域已知的任何方法制備，包括化學(xué)合成如固相亞磷酰胺化學(xué)合成。也可用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)如多核苷酸指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變，在多核苷酸序列中導(dǎo)入修飾(見(jiàn)Adelman等，DNA 2183，1983)?；蛘?，可通過(guò)DNA序列的體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子，只要將DNA摻入具有合適的RNA聚合酶啟動(dòng)子(如T7或SP6)的載體中。某些部分可用于制備上述的編碼多肽。此外，或者可將一部分給予病人，這樣在體內(nèi)產(chǎn)生編碼多肽(如通過(guò)用編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的cDNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞，并給予該病人此轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。
與編碼序列互補(bǔ)的序列的一部分(即反義多核苷酸)可用作探針，或調(diào)節(jié)血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)。也可將轉(zhuǎn)錄入反義RNA中的cDNA構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞或組織中，以促進(jìn)反義RNA的產(chǎn)生?？捎蒙鲜龇戳x多核苷酸來(lái)抑制血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)。反義技術(shù)可通過(guò)三股螺旋形成以折衷雙螺旋充分打開(kāi)的能力，用于聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子的結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)(見(jiàn)Gee等，Huber and Carr，《分子和免疫方法》，F(xiàn)utura Pulishing Co.(Mt.Kisco，NY；1994)?；蛘呖稍O(shè)計(jì)能與基因的控制區(qū)(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))雜交的反義分子，并阻斷基因的轉(zhuǎn)錄，或通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄物與核糖體的結(jié)合來(lái)阻斷翻譯。也可設(shè)計(jì)編碼序列的一部分或互補(bǔ)序列的一部分作為探針或引物來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)。可用各種報(bào)導(dǎo)基團(tuán)如放射性核素和酶來(lái)標(biāo)記探針，探針優(yōu)選至少長(zhǎng)10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少長(zhǎng)20個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少長(zhǎng)30個(gè)核苷酸。如上所述引物優(yōu)選長(zhǎng)22-30個(gè)核苷酸。還可修飾任何多核苷酸提高其體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǖ幌抻谠?’和/或3’末端加入側(cè)翼序列；主鏈中采用硫代磷酸或2’-O-甲基而不是磷酸二酯酶鍵；和/或加入非傳統(tǒng)堿基如肌苷，queosine和Wybutosine以及腺嘌呤、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙?；?、甲基、硫代和其他修飾形式。
可用已建立的重組DNA技術(shù)將血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的多核苷酸連接于各種其他核苷酸序列。例如，可將多核苷酸克隆入各種克隆載體中，包括質(zhì)粒、噬菌粒，λ噬菌體衍生物和粘粒。特別感興趣的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測(cè)序載體。一般說(shuō)，載體含有能在至少一種生物中有功能的復(fù)制起點(diǎn)、方便的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記。其它元件取決于所需用途，這是該領(lǐng)域普遍技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。
某些實(shí)施例中，可制備多核苷酸使其能進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并在其中表達(dá)。如下所述，這類(lèi)制劑對(duì)于治療特別有用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道有許多方法可實(shí)現(xiàn)多核苷酸在靶細(xì)胞中的表達(dá)，并可采用任何合適的方法。例如，可將多核苷酸摻入病毒載體(但不限于腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒或其他痘病毒如禽痘病毒)。將DNA摻入這類(lèi)載體的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒還可轉(zhuǎn)移或摻入可選擇標(biāo)記的基因(有助于鑒定或選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞)，和/或靶向組成成分，如編碼特異性靶細(xì)胞上受體的配體的基因賦予該載體靶向特異性。也可用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知方法利用抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向。
其它治療制劑包括膠體分散系統(tǒng)如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油乳液、膠團(tuán)、混合膠團(tuán)和脂質(zhì)體。用于體內(nèi)和體外輸送載體的優(yōu)選膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即人工膜載體)。這些系統(tǒng)的制備和使用是本領(lǐng)域熟知的。
4.25治療方法本發(fā)明其他方面，上述組合物可用于免疫治療血液惡性腫瘤，包括成人和兒童AML、CML、ALL、CLL、骨髓增生異常綜合癥(MDS)、骨髓增生綜合征(MPS)、繼發(fā)性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。此外，所述組合物可用于治療與對(duì)造血前體細(xì)胞自身免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病如嚴(yán)重再生障礙性貧血。
免疫治療可采各種技術(shù)進(jìn)行，其中提供的化合物或細(xì)胞可發(fā)揮功能去除病人中的血液惡性腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)細(xì)胞。發(fā)生這種去除的結(jié)果是增強(qiáng)或誘導(dǎo)了對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異的病人中的免疫應(yīng)答，或表達(dá)血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞?；蚩稍诨铙w內(nèi)去除血液惡性腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)細(xì)胞(如通過(guò)對(duì)自身骨髓、外周血、或骨髓或外周血組分的處理)?？捎帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得骨髓或外周血組分。
這些方法中，通常可給予患者藥物組合物和疫苗。“患者”本文用于指任何溫血?jiǎng)游?，?yōu)選人?；颊呖梢曰加谢虿换加醒簮盒阅[瘤。因此，上述藥物組合物和疫苗可用于預(yù)防惡性腫瘤的發(fā)生或治療惡性腫瘤患者?？捎帽绢I(lǐng)域普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)診斷血液惡性腫瘤?？稍谑中g(shù)切除原發(fā)性腫瘤和/或給予放療或常規(guī)化療藥物或骨髓移植(自身、同種異體或同系)之前或之后給予藥物組合物和疫苗。
某些實(shí)施例中，免疫治療可以是主動(dòng)免疫治療，這種治療依賴給予免疫應(yīng)答修飾劑(如本文所述多肽或多核苷酸)體內(nèi)刺激宿主內(nèi)源性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)。
其它實(shí)施例中，免疫治療可以是被動(dòng)免疫治療，這種治療包括輸送已建立抗腫瘤免疫反應(yīng)性的制劑(如效應(yīng)細(xì)胞或抗體)可直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤作用，而不需要依賴完整的宿主免疫系統(tǒng)。效應(yīng)細(xì)胞的例子包括上述表達(dá)本文所述多肽的T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(如CD8+T細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和CD4+T輔助腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)、殺傷細(xì)胞(如天然殺傷細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)、B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。可將地上述多肽特異的T細(xì)胞受體和抗體受體克隆表達(dá)，轉(zhuǎn)移入用于過(guò)繼免疫治療的其它載體或效應(yīng)細(xì)胞中。也可用上述多肽來(lái)產(chǎn)生用于被動(dòng)免疫治療的抗體或抗獨(dú)特型抗體(見(jiàn)上述和美國(guó)專(zhuān)利4,918,164)。
用于過(guò)繼免疫治療的效應(yīng)細(xì)胞可如上所述通過(guò)體外生長(zhǎng)以足夠數(shù)量獲得。本領(lǐng)域熟知將一個(gè)抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增至幾十億數(shù)量并保留抗原識(shí)別的培養(yǎng)條件。體外培養(yǎng)條件通常在細(xì)胞因子(如IL-2)和非分裂飼養(yǎng)細(xì)胞存在的條件下采用抗原間歇刺激。如上所述，本文所述免疫反應(yīng)性多肽可用于快速擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物，以產(chǎn)生充分?jǐn)?shù)量的細(xì)胞用于免疫治療。特別是，可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以免疫反應(yīng)性多肽脈沖刺激或用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞。例如，可用具有適合于提高重組病毒或其它表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的啟動(dòng)子的多核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞。培養(yǎng)的治療用效應(yīng)細(xì)胞必須能在體內(nèi)生長(zhǎng)并廣泛分布和長(zhǎng)期存活。研究表明，用補(bǔ)充了IL-2的抗原反復(fù)制刺激可誘導(dǎo)培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)大量生長(zhǎng)和長(zhǎng)期存活(見(jiàn)例如Cheever等，Immnnol.Rev.157177，1997)。
或者，可將表達(dá)上述多肽的載體導(dǎo)入病人的抗原呈遞細(xì)胞在活體外克隆增殖后用于移植回同一病人?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再導(dǎo)入病人中，優(yōu)選以無(wú)菌形式通過(guò)靜脈內(nèi)，腔內(nèi)，腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)給藥。
本文提供的組合物可單獨(dú)使用或與常規(guī)治療方案如手術(shù)、照射、化療或骨髓移植(自身、同系、同種異體或無(wú)關(guān)的)聯(lián)合。如以下更詳細(xì)說(shuō)明，本文提供的結(jié)合劑和T細(xì)胞可用于凈化自身干細(xì)胞。這種凈化(purging)在骨髓移植、輸血或血液組分前可能有益處。本文所述的結(jié)合制劑-T細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞(APC)和組合物還可用于體外和/或體內(nèi)擴(kuò)增和刺激(或致敏)自身、同種異體、同系或無(wú)關(guān)的血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞。這些血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞可用于供者淋巴細(xì)胞輸注。
給予本文所述治療組合物的途徑和次數(shù)以及劑量隨個(gè)體之間而異，易于用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定。一般可通過(guò)注射(如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)，鼻內(nèi)(如吸入)或口服給予。優(yōu)選藥物組合物和疫苗在52周期間給藥1-10個(gè)劑量。優(yōu)選間隔1個(gè)月給予6個(gè)劑量，然后可定期給予加強(qiáng)免疫接種。其它方案也適合各個(gè)病人。合適的劑量是如上給予后能促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答并超過(guò)基礎(chǔ)水平(即未治療)至少10-50％的量。免疫應(yīng)答可通過(guò)測(cè)定病人中的抗腫瘤抗體，或依賴疫苗產(chǎn)生的能體外殺傷病人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞來(lái)監(jiān)測(cè)。此種疫苗也應(yīng)能引起免疫應(yīng)答導(dǎo)致接種疫苗病人比未接種疫苗病人的臨床結(jié)果改善(如更常見(jiàn)緩解、完全或部分緩解或較長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)病存活)?？傊?，藥物組合物和疫苗含有一種或多種多肽，一個(gè)劑量中各多肽的量為每公斤宿主約100μg-5mg范圍。合適的劑量范圍因病人的體重而不同，但通常為約0.1ml-5ml范圍。
一般適合的劑量和治療方案可提供充足量的活性化合物以獲得治療和/或預(yù)防效果。治療病人與未治療病人相比，可通過(guò)確定改善臨床結(jié)果(如更常見(jiàn)緩解、完全或部分緩解或較長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)病存活)來(lái)監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。先前存在的對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤抗原的免疫應(yīng)答得到提高，通常與改善的臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)。一般可用獲自治療前后病人的樣品，以標(biāo)準(zhǔn)增殖、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子測(cè)定，來(lái)評(píng)價(jià)此種免疫應(yīng)答。其它方面，抑制與血液惡性腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)有關(guān)的惡性疾病發(fā)生的方法，包括給予自身T細(xì)胞，此種T細(xì)胞在對(duì)上述血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多肽或血液惡性腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的APC的反應(yīng)中已被激活。這種T細(xì)胞可以是CD4+和/或CD8+，可如上所述增殖。將這種T細(xì)胞給予患者的量應(yīng)能有效抑制惡性疾病的發(fā)生。通常為約1×109-1×1011個(gè)T細(xì)胞/平方米，靜脈內(nèi)、腔內(nèi)或腫瘤切除床內(nèi)給藥。該領(lǐng)域技術(shù)人員懂得給予的細(xì)胞數(shù)和次數(shù)取決于病人的反應(yīng)。
某些實(shí)施例中，可在自身骨髓移植前刺激T細(xì)胞?？稍隗w內(nèi)或體外進(jìn)行此種刺激。對(duì)于體外刺激，可在足以剌激T細(xì)胞的上述條件和時(shí)間下使病人的骨髓和/或外周血(或骨髓或外周血組分)與血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多肽、編碼該抗原多肽的多核苷酸和/或表達(dá)該抗原多肽的APC接觸。然后可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)給予病人骨髓、外周血干細(xì)胞和/或血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞。
在有關(guān)實(shí)施例中，可在同系或同種異體(相關(guān)或無(wú)關(guān))骨髓移植前刺激相關(guān)或無(wú)關(guān)供者的T細(xì)胞?？稍隗w內(nèi)或體外進(jìn)行這種刺激。對(duì)于體外剌激，可在足以剌激上述T細(xì)胞的條件和時(shí)間下，使獲自相關(guān)或無(wú)關(guān)供者的骨髓和/或外周血(或骨髓或外周血的組分)與血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多肽、血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多核苷酸和/或表達(dá)該抗原多肽的APC接觸。然后可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)給予病人骨髓、外周血干細(xì)胞和/或血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞。
在其它實(shí)施例中，上述血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞、抗體或及抗原結(jié)合片段可用于從生物樣品中去除表達(dá)血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞，如自身骨髓外周血(PB)，或骨髓或外周血的組分(如在給予病人前富集CD34+細(xì)胞的外周血)?？稍谧阋越档脱簮盒阅[瘤相關(guān)抗原表達(dá)細(xì)胞至骨髓或外周中骨髓或淋巴細(xì)胞總數(shù)10％以下，優(yōu)選5％以下，更優(yōu)選1％以下的條件和時(shí)間下，使生物樣品與這類(lèi)T細(xì)胞、抗體或抗體片段接觸?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)使抗體結(jié)合于層析柱來(lái)實(shí)現(xiàn)這種接觸?？乖磉_(dá)細(xì)胞保留在柱上。除去這類(lèi)細(xì)胞的程度易用標(biāo)準(zhǔn)方法，如定性和定量PCR分析、形態(tài)學(xué)、免疫組化和FACS分析進(jìn)行測(cè)定。然后可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)給予病人骨髓或PB(或其組分)。
4.26診斷方法通?？筛鶕?jù)獲自病人的生物樣品(如血、血清、痰、尿和/或腫瘤活檢)中存在的血液惡性腫瘤相關(guān)抗原和/或多核苷酸檢測(cè)病人中的血液惡性腫瘤。換句話說(shuō)，血液惡性腫瘤相關(guān)抗原可用作表明是否存在此惡性腫瘤的標(biāo)志。本發(fā)明提供的結(jié)合劑通常能檢測(cè)生物樣品中結(jié)合該試劑的抗原水平?？衫枚嗪塑账嵋锖吞结榿?lái)檢測(cè)編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的mRNA水平，這也是血液惡性腫瘤存在與否的標(biāo)志。通常獲自患血液惡性腫瘤病人的樣品中血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的水平，應(yīng)比獲自未患此病個(gè)體樣品中水平至少高3倍。
本該領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知有多種測(cè)定采用結(jié)合劑來(lái)檢測(cè)樣品中的多肽標(biāo)記。見(jiàn)例如Harlow和Lane《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。通常病人中是否存在血液惡性腫瘤可通過(guò)(a)使病人的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)檢測(cè)樣品中結(jié)合該結(jié)合劑的多肽水平；和(c)將多肽水平與預(yù)定的截取值比較來(lái)測(cè)定。
一優(yōu)選實(shí)施例中，測(cè)定涉及利用固定在一固相支持體上的結(jié)合劑來(lái)結(jié)合樣品中的多肽和去除其余成分。然后用含有報(bào)導(dǎo)基團(tuán)和特異性結(jié)合該結(jié)合劑/多肽復(fù)合物的檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)合的多肽。這類(lèi)檢測(cè)試劑可包括特異性結(jié)合多肽或抗體的結(jié)合劑，或其它特異性結(jié)合該結(jié)合劑的試劑，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素?；蛘呖捎酶?jìng)爭(zhēng)測(cè)定，此測(cè)定中用一報(bào)導(dǎo)基團(tuán)標(biāo)記多肽，培育結(jié)合劑和樣品后，使標(biāo)記報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的多肽與固定的結(jié)合劑結(jié)合。樣品中的成分抑制該標(biāo)記多肽與結(jié)合劑的結(jié)合程度，反映了樣品與固定的結(jié)合劑的反應(yīng)性。在這類(lèi)測(cè)定中使用的合適的多肽包括上述與結(jié)合劑結(jié)合的全長(zhǎng)血液惡性腫瘤相關(guān)肽抗原及其部分。
血液惡性相關(guān)抗原多肽可附著的固相支持體是本領(lǐng)域普通技術(shù)已知的任何材料。例如，固相支持體可以是微量滴定板中的測(cè)試孔、或硝酸纖維素或其它合適的膜。或者，支持體可以是珠或圓片，如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料如聚丙乙烯或聚氯乙烯。支持體也可以是上述磁性顆?；蚬饫w傳感器，例如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,359,681。結(jié)合劑可用該領(lǐng)域技術(shù)人員已知專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)上詳細(xì)描述的各種技術(shù)固定在固相支持體上。本發(fā)明內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“固定”指非共價(jià)締合(如吸附)和共價(jià)結(jié)合(可以是試劑和支持體上的功能基團(tuán)之間直接連接或借助交聯(lián)劑連接)。優(yōu)選通過(guò)吸附于微量滴定板的孔或膜上的固定。此類(lèi)情況下，可使用合適緩沖液配的結(jié)合劑與固相支持體接觸適當(dāng)時(shí)間獲得吸附。接觸時(shí)間隨溫度而異，但通常約1小時(shí)和約1天。一般與塑料微量滴定板的孔接觸的結(jié)合劑量約10ng-10μg，優(yōu)選100ng-1μg，能充分固定足夠量的結(jié)合劑。
結(jié)合劑與固相支持體共價(jià)結(jié)合的實(shí)現(xiàn)，一般可先使該支持體與雙功能試劑反應(yīng)，該雙功能試劑可與支持體和結(jié)合劑上的功能基因如羥基或氨基反應(yīng)。例如，所述結(jié)合劑可共價(jià)結(jié)合于具有用苯醌包被的適當(dāng)聚合物的支持體上，或通過(guò)支持體上的醛基與結(jié)合伙伴上的胺基和活化氫縮合(見(jiàn)Pierce《免疫技術(shù)樣本和手冊(cè)》，1991，A12-13)。
某些實(shí)施例中，測(cè)定是雙抗體夾心測(cè)定。進(jìn)行該測(cè)定可先使固定在固相支持體(通常是微量滴定板的孔)上的抗體與樣品接觸，使樣品中的多肽結(jié)合于固定的抗體。然后從固定的多肽-抗體復(fù)合物中洗去未結(jié)合樣品，加入含報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的檢測(cè)試劑(優(yōu)選能結(jié)合多肽上不同位點(diǎn)的第二抗體)。然后用適合于特異性報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的方法，測(cè)定仍結(jié)合于固相支持體的檢測(cè)試劑的量。
更具體地說(shuō)，一旦抗體被固定于上述支持體上，通常封閉該支持體上的剩余蛋白結(jié)合位點(diǎn)。合適的封閉劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，如牛血清白蛋白或Tween20TM(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)。然后，一起培育固定化抗體和樣品，使多肽結(jié)合于該抗體。培育前可用合適的稀釋液如磷酸緩沖液(PBS)稀釋樣品。一般，適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間(即培育時(shí)間)是足以檢測(cè)到獲自血液惡性腫瘤患者樣品中多肽存在的時(shí)間。優(yōu)選的接觸時(shí)間是獲得的結(jié)合水平足以達(dá)到結(jié)合和非結(jié)合多肽之間平衡時(shí)至少約95％。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，不難通過(guò)測(cè)定該時(shí)間段出現(xiàn)的結(jié)合水平來(lái)確定實(shí)現(xiàn)平衡所需的時(shí)間。通常室溫下培育時(shí)間約30分鐘是足夠的。
可用適當(dāng)?shù)木彌_液如含0.1％Tween20TM的PBS洗去固相支持體上未結(jié)合的樣品。然后將含報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的第二抗體加到固相支持體上。優(yōu)選的報(bào)導(dǎo)基團(tuán)包括上述基團(tuán)。
然后，將檢測(cè)試劑與固定的抗體-多肽復(fù)合物培育足夠時(shí)間以檢測(cè)結(jié)合的多肽。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間通?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定該時(shí)間段出現(xiàn)的結(jié)合水平來(lái)確定。然后洗去未結(jié)合的檢測(cè)試劑，并利用報(bào)導(dǎo)基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑。用于檢測(cè)報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的方法取決于該報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的性質(zhì)對(duì)于放射性基團(tuán)，通常適合用閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影方法?？捎梅止夤舛确z測(cè)染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。偶聯(lián)于不同報(bào)導(dǎo)基團(tuán)(通常為放射性或熒光基團(tuán)或酶)的生物素可用親和素檢測(cè)。一般可加入底物(通常用于特定時(shí)間段)然后用分光光度或反應(yīng)產(chǎn)物的其它分析，來(lái)檢測(cè)酶報(bào)導(dǎo)基團(tuán)。
為確定是否存在血液惡性腫瘤，通常將檢測(cè)到的仍結(jié)合于固相支持體的報(bào)導(dǎo)基團(tuán)的信號(hào)，與相應(yīng)于預(yù)定的截?cái)嘀敌盘?hào)作比較。一優(yōu)選實(shí)施例中，測(cè)定血液惡性腫瘤的截?cái)嘀凳枪潭ɑ贵w與非惡性腫瘤患者樣品培育時(shí)獲得的信號(hào)平均值。一般，樣品產(chǎn)生的信號(hào)高于預(yù)定截?cái)嘀等齻€(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差即認(rèn)為惡性腫瘤陽(yáng)性。另一優(yōu)選實(shí)施例中，按Sackett等，《臨床流行病學(xué)臨床醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)科學(xué)》，Little Brow and Co.，1985，106-7頁(yè)的方法，用接受手術(shù)者曲線測(cè)定此截?cái)嘀怠：?jiǎn)言之，此實(shí)施例中，可從真陽(yáng)性率(即靈敏度)和假陽(yáng)性率(100％特異性)配對(duì)的曲線來(lái)確定此截留值，其對(duì)應(yīng)于診斷試驗(yàn)結(jié)果的每種可能截?cái)嘀?。該曲線上最靠近左手上角處的截?cái)嘀?即圍住最大區(qū)域的值)是最精確的截?cái)嘀?，能產(chǎn)生高于此法所測(cè)定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品被認(rèn)為是陽(yáng)性?；蛘?，可將截?cái)嘀笛厍€向左移動(dòng)以最低程度地減少假陽(yáng)性率，或向右移動(dòng)以最低限度地減少假陰性率。通常，能產(chǎn)生高于此法所測(cè)定的截?cái)嘀档男盘?hào)的樣品被認(rèn)為是惡性腫瘤陽(yáng)性。
一相關(guān)實(shí)施例中，以流通或測(cè)試條方式進(jìn)行測(cè)定，其中結(jié)合劑被固定在一種膜如硝酸纖維素。流通方式試驗(yàn)中，樣品中的多肽隨樣品流過(guò)膜時(shí)結(jié)合于已固定的結(jié)合劑。然后標(biāo)記的第二結(jié)合劑在含第二結(jié)合劑的溶液流過(guò)該膜時(shí)，結(jié)合于結(jié)合劑-多肽復(fù)合物。然后如上所述檢測(cè)結(jié)合的第二結(jié)合劑。測(cè)試條方式中，將結(jié)合劑所結(jié)合的膜的一端浸在含樣品的溶液中。樣品沿著膜移動(dòng)，通過(guò)含第二結(jié)合劑的區(qū)域，進(jìn)入固定結(jié)合劑的區(qū)域，固定抗體區(qū)域中聚集的第二結(jié)合劑表明有癌癥存在。通常，該部位聚集的第二結(jié)合劑產(chǎn)生一種模式，如可用肉眼觀察看的線條。缺乏此模式表示陰性結(jié)果。一般在上述形式的雙抗體夾心測(cè)定中，當(dāng)生物樣品含有的多肽水平足以產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，選擇固定于膜上的結(jié)合劑的量以產(chǎn)生肉眼可辨別的模式。這類(lèi)測(cè)定所用的結(jié)合劑優(yōu)選抗體和其抗原結(jié)合片段。固定在膜上的抗體量?jī)?yōu)選約25ng-1μg，更優(yōu)選約50ng-500ng。這類(lèi)試驗(yàn)一般用很少量的生物樣品進(jìn)行。
當(dāng)然，現(xiàn)有的許多其它測(cè)定方案也適合采用本發(fā)明的血液惡性腫瘤相關(guān)抗原序列或結(jié)合劑。以上所述僅是示范性的。例如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員懂得，易對(duì)上述方案進(jìn)行改進(jìn)而采用血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多肽來(lái)檢測(cè)與生物樣品中此類(lèi)多肽結(jié)合的抗體。血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗體的檢測(cè)可能存在癌癥相關(guān)。
或者，惡性腫瘤也可根據(jù)存在與生物樣品中血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異性反應(yīng)的T細(xì)胞來(lái)測(cè)定。某些方法中，將分離自病人的含CD4+T或/或CD8+T細(xì)胞的生物樣品與血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多肽一起培育，檢測(cè)編碼這類(lèi)多肽的多核苷酸、和/或表達(dá)這類(lèi)多肽的APC，及特異性激活的T細(xì)胞的存在與否。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細(xì)胞。例如，可用常規(guī)技術(shù)(如Ficoll-Hypaque密度梯度離心外周血淋巴細(xì)胞)從病人中分離T細(xì)胞?？审w外37℃培養(yǎng)T細(xì)胞與Mtb-81或Mtb-67.2多肽(如5-25μg/ml)2-9天(一般4天)?？赡苄枰谌鄙傺簮盒阅[瘤相關(guān)抗原多肽時(shí)培養(yǎng)另一等分的T細(xì)胞樣品作為對(duì)照。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的增殖來(lái)測(cè)定其激活。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒活性來(lái)測(cè)定其激活。與無(wú)此病患者相比，增殖水平至少高兩倍，和/或細(xì)胞毒活性至少高20％，表明該病人患血液惡性腫瘤。
如上所述，血液惡性腫瘤也可根據(jù)生物樣品中編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的mRNA水平來(lái)檢測(cè)。例如，可在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定中采用至少二種寡核苷酸引物來(lái)擴(kuò)增生物樣品中血液惡性疾病相關(guān)抗原cDNA的一部分，其中至少一種寡核苷酸引物對(duì)編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原蛋白的多核苷酸有特異性(即與之雜交)。然后用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(如凝膠電泳)分離和檢測(cè)擴(kuò)增的cDNA。相似地，可在雜交測(cè)定中采用特異性雜交編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的多核苷酸的寡核苷酸探針，檢測(cè)生物樣品中存在的編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的多核苷酸。
為了能在測(cè)定條件下雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)包含的寡核苷酸序列與至少長(zhǎng)10個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少長(zhǎng)20個(gè)核苷酸的編碼血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的多核苷酸一部分有至少60％，優(yōu)選至少約75％，更優(yōu)選至少約90％同一性。優(yōu)選在上述中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，寡核苷酸引物和/或探針與編碼所述多肽的多核苷酸雜交?？捎糜谏鲜鲈\斷方法的寡核苷酸引物和/或探針優(yōu)選至少10-40個(gè)核苷酸。PCR測(cè)定和雜交測(cè)定技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)例如Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51263，1987；Erlich編，《PCR技術(shù)》，Stockton Press，NY.1989)。
一優(yōu)選測(cè)定采用RT-PCR，其中PCR應(yīng)用與逆轉(zhuǎn)錄相結(jié)合。一般從生物樣品如活檢中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子。用至少一個(gè)特異性引物作PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的cDNA分子可分離并用凝膠電泳觀察。對(duì)取自待測(cè)病人和取自未患血液惡性腫瘤個(gè)體的生物樣品進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)可在橫跨二個(gè)數(shù)量級(jí)的幾種cDNA稀釋液中進(jìn)行。待檢病人樣品的幾種稀釋液中的表達(dá)比正常個(gè)體樣品的相同稀釋度大2倍或以上通常視為陽(yáng)性。
優(yōu)選實(shí)施例中，采用富含能表達(dá)感興趣血液惡性腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞的樣品進(jìn)行此類(lèi)測(cè)定。這種富集可用例如本文提供的結(jié)合劑從生物樣品的剩余部分去除細(xì)胞。然后測(cè)定去除的細(xì)胞。
其它實(shí)施例中，血液惡性腫瘤相關(guān)抗原可用作監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展或?qū)ρ簮盒阅[瘤治療反應(yīng)的標(biāo)志。此實(shí)施例中，可隨時(shí)進(jìn)行上述測(cè)定來(lái)診斷血液惡性腫瘤，評(píng)價(jià)反應(yīng)性多肽水平的變化。例如，可每隔24-72小時(shí)進(jìn)行一次測(cè)定，持續(xù)6個(gè)月至1年，然后按需要進(jìn)行。通常此種病人中惡性腫瘤發(fā)展時(shí)，結(jié)合劑檢測(cè)到的多肽水平隨時(shí)間而增加。相反，當(dāng)反應(yīng)性多肽水平保持恒定或隨時(shí)間而降低時(shí)，惡性腫瘤沒(méi)有進(jìn)展。
某些體內(nèi)診斷測(cè)定可直接在腫瘤上進(jìn)行。一種此類(lèi)試驗(yàn)涉及使腫瘤細(xì)胞與結(jié)合劑接觸。然后可直接或通過(guò)報(bào)告基團(tuán)間接測(cè)定結(jié)合的結(jié)合劑。此類(lèi)結(jié)合劑也可用于組織學(xué)。另外，此類(lèi)應(yīng)用中可采用多核苷酸探針。
如上所述，為了提高靈敏度，可測(cè)定給定樣品中的多種標(biāo)志。顯然在一試驗(yàn)中可聯(lián)用對(duì)本文提供的對(duì)不同蛋白質(zhì)特異的結(jié)合劑。此外，可同時(shí)采用多個(gè)引物或探針。標(biāo)志物的選擇可根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定能導(dǎo)致最佳靈敏度的組合。
其它診斷應(yīng)用包括檢測(cè)髓外疾病(如白血病中胚細(xì)胞的腦內(nèi)浸潤(rùn))。此類(lèi)方法中，可將結(jié)合劑與一示蹤物質(zhì)偶聯(lián)，并用熟知的技術(shù)在體內(nèi)進(jìn)行診斷?？扇缟纤鼋o予偶聯(lián)的結(jié)合劑，并根據(jù)測(cè)定示蹤物質(zhì)的存在檢測(cè)髓外疾病。或者，示蹤物質(zhì)可與對(duì)血液惡性腫瘤相關(guān)抗原特異的T細(xì)胞結(jié)合，根據(jù)測(cè)定該示蹤物質(zhì)的定位檢測(cè)髓外疾病。
4.27示范性定義本發(fā)明中，核酸序列包括但不限于DNA(包括但不限于基因組或基因組外DNA)、基因、肽核酸(PNA)、RNA(包括但不限于rRNA，mRNA和tRNA)、核苷和合適的核酸片斷不論獲自天然來(lái)源、化學(xué)合成、修飾的還是全部或部分用人工制備的。
除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同理解的相同。雖然也可采用與上述相似或相等的方法和組合物來(lái)實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明。但本文所述的是優(yōu)選的方法和組合物。為說(shuō)明本發(fā)明以下術(shù)語(yǔ)定義如下一個(gè)、一種按照長(zhǎng)期存在的專(zhuān)利法慣例，單詞“一個(gè)”和“一種”本申請(qǐng)書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中用于指“一個(gè)或多個(gè)”、“一種或多種”。
表達(dá)多核苷酸如結(jié)構(gòu)基因經(jīng)歷胞內(nèi)加工過(guò)程的組合，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯以合成編碼的肽或多肽。
啟動(dòng)子一般用于描述調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的核酸區(qū)域或序列的術(shù)語(yǔ)。
調(diào)控元件一般用于描述調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的核酸區(qū)域或序列的術(shù)語(yǔ)。
結(jié)構(gòu)基因一種表達(dá)以產(chǎn)生編碼的肽或多肽的基因或序列區(qū)域。
轉(zhuǎn)化將外源多核苷酸序列(如載體、重組DNA或RNA分子)導(dǎo)入宿主細(xì)胞或原生質(zhì)中，其中外源核酸片斷摻入至少一個(gè)第一染色體中，或在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)能自身復(fù)制。轉(zhuǎn)染、電穿孔和裸核酸攝取都是用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的技術(shù)的代表性例子。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于細(xì)胞中導(dǎo)入了一種或多種外源性多核苷酸因而其核酸補(bǔ)體，已改變的宿主細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因細(xì)胞任何細(xì)胞衍生或再生自轉(zhuǎn)化細(xì)胞，或衍生自轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或來(lái)自轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生的子代或后代。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物衍生自轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物或其產(chǎn)生的子代或后代，其中動(dòng)物的DNA含有同種的天然、野生型、非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中原先不存在的導(dǎo)入的外源核酸分子。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”和“轉(zhuǎn)化動(dòng)物”本領(lǐng)域有時(shí)作為同義詞使用，指其基因組成經(jīng)修飾而含有一種或多種外源性核酸片段的動(dòng)物。
載體一種核酸分子。通常含有能在宿主細(xì)胞中復(fù)制的和/或與另一核酸區(qū)段操作性連接以致附著區(qū)段引起復(fù)制的DNA。質(zhì)粒、粘?；虿《臼鞘痉缎缘妮d體。
本文所用術(shù)語(yǔ)“基本上相應(yīng)于”、“基本上同源”或“基本上同一”指核酸或氨基酸序列的特征，其中所選核酸或氨基酸序列與所選參比核酸或氨基酸序列相比，至少有約70％或約75％序列同一性。更具體說(shuō)，所選序列和參比序列至少有約76，77，78，79，80，81，82，83，84或甚至85％的序列同一性，和更優(yōu)選至少有約86，87，88，89，90，91，92，93，94或95％的序列同一性。更優(yōu)選高度同源序列在所選序列和參比序列之間的序列同一性大于至少約96，97，98或99％。序列同一性百分比可根據(jù)比較序列的全長(zhǎng)計(jì)算，或可排除總數(shù)不到所選參比序列的約25％的小量缺失或添加。參比序列可以是一亞組較大的序列，如基因的一部分或側(cè)翼序列或染色體的重復(fù)部分。然而，就兩種或多種多核苷酸序列的序列同源性而言，參比序列通常含有至少約18-25個(gè)核苷酸，更通常含約26-35個(gè)核苷酸，甚至更通常含至少約40、50、60、70、80、90或甚至100個(gè)以上核苷酸。理想地需要高度同源片斷，二序列之間同一性百分率應(yīng)至少約80％，優(yōu)選至少約85％，更優(yōu)選至少約90％或95％或更高。這不難用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一種或多種序列比較算法測(cè)定，如Pearson和Lipman(1988)所述的FASTA程序分析。
術(shù)語(yǔ)“天然產(chǎn)生的”本文用于指某物質(zhì)可在自然中找到。例如，生物體(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列可從天然來(lái)源中分離得到而不是在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)人工有意修飾產(chǎn)生的，這就是天然產(chǎn)生的。如本文所用的實(shí)驗(yàn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物品系是按經(jīng)典遺傳學(xué)選擇性飼養(yǎng)的，可認(rèn)為是天然產(chǎn)生的動(dòng)物。
本文所用的“異源性”是與預(yù)定的參比基因序列有關(guān)而定義的。例如就結(jié)構(gòu)基因序列而言，異源性啟動(dòng)子定義為，靠近參比的結(jié)構(gòu)基因不天然產(chǎn)生但經(jīng)實(shí)驗(yàn)實(shí)操作而定位的啟動(dòng)子。同樣，異源性基因或核酸區(qū)段定義為，靠近參比的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子元件不天然產(chǎn)生的基因或區(qū)段。
“轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件”指單獨(dú)或與一個(gè)或多個(gè)其他核酸序列聯(lián)合能激活轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如可包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)元件、一個(gè)或多個(gè)負(fù)調(diào)控元件和/或一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子。
“轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)”和“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)”本文用于指一種多核苷酸序列或序列基序，其鑒定為一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的序列特異性相互作用的位點(diǎn)，通常采取直接的蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合形式。通?？赏ㄟ^(guò)DNA足跡法、凝膠遷移率變動(dòng)分析等鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，或可根據(jù)已知的共有序列基序或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法預(yù)測(cè)。
術(shù)語(yǔ)“操作性連接”本文用于指兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸或兩個(gè)或多個(gè)核酸序列以功能關(guān)系連接。當(dāng)將核酸置于與另一核酸序列功能相關(guān)的位置上時(shí)，即為該核酸“操作性連接”。例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子操作性連接于編碼序列，它就影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄。操作性連接意味著DNA序列通常是毗連連接的，需要將兩種蛋白編碼區(qū)毗連連接和在讀框內(nèi)連接。然而，因?yàn)榕c啟動(dòng)子分隔數(shù)千個(gè)堿基時(shí)增強(qiáng)子也能發(fā)揮功能，所以內(nèi)含子序列可有不同長(zhǎng)度，一些多核苷酸元件可操作性連接而非毗連。
“轉(zhuǎn)錄單元”指一種多核苷酸序列，其含有至少第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因(該結(jié)構(gòu)基因操作性連接于至少第一個(gè)順式作用啟動(dòng)子序列，并任選地操作性連接于該結(jié)構(gòu)基因序列的有效轉(zhuǎn)錄所必需的一個(gè)或多個(gè)其它順式作用核酸序列)，和至少一個(gè)該結(jié)構(gòu)基因序列的適當(dāng)?shù)慕M織特異性和發(fā)育性轉(zhuǎn)錄所需的第一個(gè)遠(yuǎn)端調(diào)控元件，此結(jié)構(gòu)基因序列操作性位于該啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子元件以及有效轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的其它順式序列(如聚腺苷酸化位點(diǎn)，mRNA穩(wěn)定性控制序列等)的控制下。
如上所述，本發(fā)明一般涉及治療和診斷癌癥如血液惡性腫瘤的組合物和使用該組合物的方法。本文所述的某些說(shuō)明性組合物包括血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤多肽、編碼這類(lèi)多肽的多核苷酸、結(jié)合劑如抗體、抗原呈遞細(xì)胞(APC)和/或免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如T細(xì)胞)?！把簮盒阅[瘤相關(guān)腫瘤蛋白”本文用于指在血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平用本文提供的代表性試驗(yàn)測(cè)定，比正常組織中的表達(dá)水平至少高2倍，優(yōu)選至少高5倍。某些血液惡性腫瘤相關(guān)腫瘤蛋白是能與血液惡性腫瘤患者的抗血清起可檢測(cè)反應(yīng)(如ELISA或Western印跡等免疫測(cè)定)的腫瘤蛋白。
4.28生物功能等價(jià)物可在本發(fā)明的多核苷酸和肽的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾和改變，仍可獲得編碼具有所需特征的功能性分子，或仍能獲得具有所需表達(dá)特異性和/或性能的遺傳構(gòu)建物。因?yàn)橥ǔＰ枰谔囟ǘ嗪塑账嵝蛄兄袑?dǎo)入一個(gè)或多個(gè)突變。在多核苷酸或肽序列中導(dǎo)入突變的各種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可用于制備異源性序列并將該異源性序列導(dǎo)入所選的細(xì)胞或動(dòng)物中。某些情況下，此種突變改變了所得的編碼的肽序列，或其它情況下，編碼的多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)突變不會(huì)改變肽的序列。其它情況下，在多核苷酸構(gòu)建物的啟動(dòng)子區(qū)和/或增強(qiáng)子區(qū)中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)變化，以改變表達(dá)元件的活性或特異性，從而改變操作性位于元件控制下的異源性治療核酸區(qū)段的表達(dá)。
當(dāng)需要改變由表達(dá)構(gòu)建物編碼的一個(gè)或多個(gè)異源性肽的氨基酸序列以產(chǎn)生等價(jià)物，或甚至產(chǎn)生改進(jìn)的第二代分子時(shí)，可按表1所列，通過(guò)改變?cè)摼幋aDNA序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子實(shí)現(xiàn)氨基酸改變。
例如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些氨基酸可被其它氨基酸取代而不會(huì)明顯失去與抗體的抗原結(jié)合區(qū)，或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)相互結(jié)合的能力。因?yàn)檎堑鞍踪|(zhì)的這種相互作用能力和性質(zhì)確定了該蛋白質(zhì)的生物功能活性?？稍诘鞍踪|(zhì)序列中進(jìn)行某些氨基酸序列的替代，當(dāng)然其基礎(chǔ)是DNA編碼序列，從而獲得性能相似的蛋白質(zhì)。本發(fā)明人設(shè)想可在上述組合物的肽序列中或編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列中，進(jìn)行各種改變而不會(huì)明顯失去其生物學(xué)用途或活性。
表1氨基酸 密碼子丙氨酸AlaA GCA GCC GCG GCU半胱氨酸 CysC UGC UGU天冬氨酸 AspD GAC GAU谷氨酸GluE GAA GAG苯丙氨酸 PheF UUC UUU甘氨酸GlyG GGA GGC GGG GGU組氨酸HisH CAC CAU異亮氨酸 IleI AUA AUC AUU賴氨酸LysK AAA AAG亮氨酸LeuL UUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 MetM AUG天冬酰胺 AsnN AAC AAU脯氨酸ProP CCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 GlnQ CAA CAG精氨酸ArgR AGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸SerS AGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸ThrT ACA ACC ACG ACU纈氨酸ValV GUA GUC GUG GUU色氨酸TrpW UGG酪氨酸TyrY UAC UAU進(jìn)行這些改變可考慮氨基酸的親水性指數(shù)。氨基酸親水性指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用的生物功能中的重要性是本領(lǐng)域通常了解的(Kyte和Doolitte，1982，納入本文作參考獻(xiàn))。眾所接受的是氨基酸的相對(duì)親水性有助于所得蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而確定了蛋白質(zhì)與其它分子如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。根據(jù)氨基酸的疏水性和電荷特征排定各氨基酸的親水性指數(shù)是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域知道某些氨基酸可被具有類(lèi)似親水性指數(shù)或評(píng)分的其它氨基酸替代，仍導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有相似的生物活性，即仍獲得生物功能相等的蛋白質(zhì)。進(jìn)行這種變化中，替代的氨基酸的親水性指數(shù)優(yōu)選在±2內(nèi)，特別優(yōu)選在±1內(nèi)，更加特別優(yōu)選在±0.5內(nèi)。本領(lǐng)域還知道可根據(jù)親水性進(jìn)行同類(lèi)氨基酸的替代。美國(guó)專(zhuān)利4,554,101(納入本文作參考)闡述了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性受其毗連氨基酸的親水性的控制，與該蛋白質(zhì)的生物性能相關(guān)。
如美國(guó)專(zhuān)利4,554,101所詳述，氨基酸的親水性值排列如下精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。已知道氨基酸可被具有相似親水性值的另一氨基酸替代且仍可獲得生物等價(jià)物，具體是免疫等價(jià)蛋白質(zhì)。這些變化中，替代的氨基酸的親水性值優(yōu)選在±2內(nèi)，特別優(yōu)選在±1，更加特別優(yōu)選在±0.5內(nèi)。
如上所述，氨基酸取替通常是根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性例如其疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮到上述幾種特征的示范性取替是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括精氨酸和賴氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
5.實(shí)施例以下實(shí)施例顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，根據(jù)本文公開(kāi)內(nèi)容，可對(duì)這些公開(kāi)的具體實(shí)施例進(jìn)行許多改變?nèi)钥色@得相似和類(lèi)似結(jié)果而不背離附加權(quán)利要求書(shū)中所述的本發(fā)明的精神和范圍。
5.1實(shí)施例1—血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多核苷酸的鑒定此實(shí)施例說(shuō)明非霍奇金淋巴瘤的血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多核苷酸的鑒定。
通過(guò)PCR扣除法分離得到血液惡性腫瘤相關(guān)抗原多核苷酸。從T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤和和正常組織制備多聚A mRNA。構(gòu)建了6個(gè)cDNA文庫(kù)，進(jìn)行PCR扣除和分析。用3個(gè)T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤mRNA的集合體構(gòu)建了二個(gè)文(本文稱(chēng)為T(mén)CS文庫(kù))。用3個(gè)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤mRNA的集合體構(gòu)建了其它二個(gè)文庫(kù)(本文稱(chēng)為BCNHL文庫(kù))。用2個(gè)T細(xì)胞霍奇金淋巴瘤mRNA的集合體構(gòu)建了其它二個(gè)文庫(kù)(本文稱(chēng)為HLS文庫(kù))。按Clontech的用戶手冊(cè)(PCR-Select cDNA扣除)進(jìn)行了cDNA合成、雜交和PCR擴(kuò)增，改變?nèi)缦?)用包括Mscl，Pvull，Stul，和Dral的酶混合物代替單一酶RsaI限制性消化cDNA；2)雜交步驟中提高驅(qū)動(dòng)和測(cè)試cDNA的比率(至76∶1)以產(chǎn)生更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目鄢?br> 用驅(qū)動(dòng)cDNA的不同集合體單獨(dú)扣除二個(gè)TCS文庫(kù)。驅(qū)動(dòng)#1含從特定正常組織(淋巴節(jié)、骨髓、T細(xì)胞、心臟和腦)制備的cDNA，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)TCS-D1(T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#1)。驅(qū)動(dòng)#2含非特定的正常組織(結(jié)腸、大腸、肺、胰、脊髓、骨骼肌、肝、腎、皮膚和腦)，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)TCS-D2(T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#2)。
類(lèi)似地，用驅(qū)動(dòng)cDNA的不同集合體單獨(dú)扣除二個(gè)BCNHL文庫(kù)。驅(qū)動(dòng)#1含從特定的正常組織(淋巴節(jié)、骨髓、T細(xì)胞、心臟和腦)制備的cDNA，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)BCNHL/D1(B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#1)。驅(qū)動(dòng)#2含非特定的正常組織(腦、肺、胰、脊髓、骨骼肌、結(jié)腸、脾、大腸和PBMC)，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)BCNHL/D2(B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#2)。
用驅(qū)動(dòng)cDNA的不同集合體單獨(dú)扣除二個(gè)HLS文庫(kù)。驅(qū)動(dòng)#1含從特定的正常組織(淋巴節(jié)、骨髓、B細(xì)胞和肺)制備的cDNA，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)HLS-D1(霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#1)。驅(qū)動(dòng)#2含非特定的正常組織(結(jié)腸、大腸、肺、胰、脊髓、骨骼肌、肝、腎、皮膚和腦)，此扣除產(chǎn)生文庫(kù)HLS-D2(霍奇金淋巴瘤扣除文庫(kù)具有驅(qū)動(dòng)#2)。
為了分析此扣除的效果，PCR擴(kuò)增扣除及不扣除PCR樣品稀釋液中的肌動(dòng)蛋白(管家基因)。此外，通過(guò)測(cè)定各PCR扣除文庫(kù)(TCS-D1、TCS-D2、BCNHL/D1、BCNHL/D2、HLS-D1、HLS-D2)的96個(gè)克隆的序列，表征了各文庫(kù)的復(fù)雜性和豐余性。這些分析表明文庫(kù)富含白血病組織中，特別是T細(xì)胞和B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤樣品中過(guò)度表達(dá)的基因。
PCR擴(kuò)增后，將cDNA克隆入pCR2.1-TOPO質(zhì)粒載體(Invitrogen)中。
從這些分析中獲得的序列用BLAST2.0釋放法檢索公共可利用的數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列。BLAST默認(rèn)參數(shù)如下間隙參數(shù)開(kāi)放間隙＝0，延伸間隙＝0；輸出參數(shù)期望值＝10.0，閾值＝0，排列數(shù)＝250。BLASTN的檢索參數(shù)如下錯(cuò)配＝-3，正向＝1，詞大?。?。配對(duì)排列窗口同一性百分率＝22。檢索了所有可得到的蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，包括PIR，SwissPROT，GenBank，小鼠EST，人EST，其它EST，人重復(fù)和高通量序列，及公開(kāi)的專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)數(shù)據(jù)庫(kù)。
從這些檢索中鑒定到許多獨(dú)特序列，它們代表GenBank和其它數(shù)據(jù)庫(kù)中以前未描述的新的多核苷酸序列。鑒定到許多其它序列似乎含有與數(shù)據(jù)庫(kù)中以前鑒定的一個(gè)或多個(gè)序列有顯著同源性，雖然只描述它們?yōu)榛蚪M或cDNA克隆但不知其功能。其余序列與已知基因相對(duì)應(yīng)。從此分析獲得的克隆概述于待批專(zhuān)利申請(qǐng)USSN09/796,692的表2-6中。
5.2實(shí)施例2—用微陣列分析扣除的cDNA序列用微陣列分析扣除的cDNA序列以評(píng)價(jià)它們?cè)谘簮盒阅[瘤和正常組織中的表達(dá)。用此方法PCR擴(kuò)增了cDNA序列，并用基本上如上述(Shena等，1995)cDNA微陣列技術(shù)檢驗(yàn)了血液惡性腫瘤和和正常組織中的mRNA表達(dá)模式。
簡(jiǎn)言之，將扣除cDNA文庫(kù)分析鑒定的克隆固定并在載玻片上列陣成為微陣列載玻片上的多個(gè)復(fù)制物，使載玻片與二組不同的探針雜交，各組探針?lè)謩e位于微陣列載玻片上相應(yīng)于一獨(dú)特cDNA克隆的位置(一張載玻片或芯片上可排列多達(dá)5500個(gè)克隆)。每張芯片與分別熒光標(biāo)記了Cy3和Cy5的一對(duì)cDNA探針雜交。衍生自血液惡性腫瘤的一組探針用Cy3標(biāo)記，而另一組衍生自正常組織集合體的探針用Cy5標(biāo)記。通常用1微克poly A+RNA來(lái)產(chǎn)生各cDNA探針。雜交后，掃描芯片并記錄Cy3和Cy5通路的熒光強(qiáng)度。與二組探針雜交后的強(qiáng)度差異(即Cy3/Cy5比率)提供了固定在腫瘤和正常組織載玻片上各cDNA序列的相對(duì)表達(dá)水平的信息。這是多重內(nèi)部質(zhì)量控制步驟。首先用一組遍在表達(dá)基因監(jiān)測(cè)探針質(zhì)量。其次對(duì)照板也可包括酵母DNA片段，其互補(bǔ)RNA可摻入探針合成中以測(cè)定探針的質(zhì)量和分析的靈敏度。此方法提供的靈敏度為100000拷貝的mRNA中可測(cè)出1個(gè)，通過(guò)在不同位置包含重復(fù)的對(duì)照cDNA元件可確保此技術(shù)的重現(xiàn)性。
通過(guò)在各種微陣列芯片上的微陣列分析血液惡性腫瘤扣除克隆，鑒定到待批專(zhuān)利申請(qǐng)USSN 09/796,692的所有SEQ ID NO668中的SEQ ID NO1所述序列，在血液惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)至少是正常組織中的二倍。
5.3實(shí)施例3—多核苷酸和多肽組合物簡(jiǎn)要描述通過(guò)扣除雜交和微陣列分析鑒定cDNA克隆和開(kāi)放讀框待批專(zhuān)利申請(qǐng)USSN 09/796,692的表7列出了本發(fā)明分析中獲得的多核苷酸序列。顯示了668個(gè)多核苷酸序列和它們的克隆名字標(biāo)志以及在先臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)中第一次鑒定克隆的序列號(hào)和申請(qǐng)日期。
待批專(zhuān)利申請(qǐng)USSN 09/796,692的表8鑒定了該待批專(zhuān)利申請(qǐng)中SEQ ID NO1-SEQID NO668的cDNA序列分析獲得的推測(cè)開(kāi)放讀框。顯示了用于產(chǎn)生該開(kāi)放讀框的多核苷酸序列相應(yīng)DNA序列中的序列標(biāo)志、克隆名稱(chēng)、翻譯框、起始和終止核苷酸。
待批專(zhuān)利申請(qǐng)USSN 09/796,692的表9鑒定了用上述扣除文庫(kù)和微陣列方法獲得的其它具體血液惡性腫瘤相關(guān)的cDNA序列組。這些序列在該待批專(zhuān)利申請(qǐng)中命名為SEQ ID NO2533-SEQ ID NO9597，表中還顯示了最初的克隆名稱(chēng)，和在先臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)中第一次描述克隆的序列號(hào)和申請(qǐng)日期。
5.4實(shí)施例4-通過(guò)扣除雜交和微陣列分析鑒定cDNA克隆和Orf的其它分析此實(shí)施例描述了白血病腫瘤特異cDNA和組織特異cDNA的微陣列分析。
微陣列分析識(shí)別很多在特異組織/腫瘤中過(guò)度表達(dá)的潛在基因。然而，這些基因通常是已知基因或隨后用實(shí)時(shí)PCR分析發(fā)現(xiàn)具有較寬表達(dá)模式(expression profile)的基因。本公開(kāi)描述了將微陣列分析(CorixArray)和比較公共數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合以確定和按重點(diǎn)排列實(shí)時(shí)分析的候選序列，從而可以更加有效的方式鑒定具有較好表達(dá)模式的序列。
用Corixa白血病/淋巴瘤芯片#3(Lyc3)測(cè)得與正常組織相比，克隆在淋巴瘤樣品中過(guò)度表達(dá)。被分析的克隆最初隨機(jī)挑取自淋巴瘤PCR扣除文庫(kù)B-細(xì)胞非非霍奇金淋巴瘤文庫(kù)(BCNHL/D1和BCNHL/D2；CID000153)；T-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤文庫(kù)(TCS-D1和TCS-D2；CID000166)；霍奇金淋巴瘤文庫(kù)(HLS-D1和HLS-D2；CID000204和CID000275)和Clontech產(chǎn)生的T8白血病PCR扣除文庫(kù)。排列了總共5184個(gè)克隆2304個(gè)來(lái)自BCNHL文庫(kù)，288個(gè)來(lái)自TCS文庫(kù)，1344個(gè)來(lái)自HLS文庫(kù)，960個(gè)來(lái)自Clontech-T8文庫(kù)。此外，從上述文庫(kù)中選擇已經(jīng)用白血病/淋巴瘤芯片鑒定的288個(gè)克隆在LyC3上再分析。
用載體特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增排列用的cDNA插入物。用43個(gè)探針對(duì)探測(cè)這些陣列。用CorixArray計(jì)算分析進(jìn)行分析。該分析包括用兩組探針確定特定元件(cDNA)平均或中位值雜交信號(hào)的比例。該比例反應(yīng)了元件(cDNA)在探針群體內(nèi)過(guò)度表達(dá)或表達(dá)不足。建立探針組以鑒定在探針組#1中高度差異表達(dá)的元件(cDNA)。探針組#1通常包括20個(gè)腫瘤RNAs，每個(gè)探針代表一個(gè)淋巴瘤亞組(如B-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤、T-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)。組#2中的探針包括16T必需和非必需的正常組織(參見(jiàn)圖4)。閾值(在探針組#1中的過(guò)表達(dá)倍數(shù))設(shè)在3.0。設(shè)定這一閾值是為了鑒別基于芯片質(zhì)量可能被重復(fù)檢測(cè)的過(guò)度表達(dá)的元件。序列最初根據(jù)其CorixArray分析分選，尤其是基于它們的平均信號(hào)2值。
平均信號(hào)2＜0.1的序列可被認(rèn)為是在正常組織中低表達(dá)/不表達(dá)的序列。平均信號(hào)2在0.1和0.2之間的序列可被認(rèn)為是在正常組織中可能有一些表達(dá)的克隆。平均信號(hào)2＞0.2的序列可被認(rèn)為是在一些正常組織中可能表達(dá)的克隆。
5.5實(shí)施例5-鑒定具有與CD20和CD52有相同組織表達(dá)模式的候選基因此實(shí)施例鑒定了與CD20和CD52有類(lèi)似組織表達(dá)模式的白血病腫瘤和組織特異性基因(圖3)?？惯@兩種標(biāo)記的抗體被用來(lái)治療血液惡性疾病和其它與這些標(biāo)記的表達(dá)有關(guān)的疾病，即FDA批準(zhǔn)的Rituximab(抗CD20 Ab)和Campath(抗-CD52 Ab)。我們的候選基因和CD20和CD52之間基因表達(dá)的類(lèi)似性提示，所述基因作為診斷和治療血液惡性疾病和其它與所述一種或多種抗原的表達(dá)有關(guān)的癌性和非癌性疾病的化合物也是有用的。
實(shí)時(shí)PCR被用來(lái)比較候選基因的表達(dá)模式和CD20和CD52的表達(dá)模式。圖8說(shuō)明了候選基因在造血亞組和血液惡性腫瘤中的表達(dá)。這張圖中總結(jié)的數(shù)據(jù)顯示，聯(lián)合使用PCR扣除的cDNA文庫(kù)、微陣列分析和實(shí)時(shí)PCR可以鑒定在正常B-細(xì)胞、淋巴瘤、骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓性白血病中差異表達(dá)的基因。
5.6實(shí)施例6-一種與CD20和CD52有類(lèi)似表達(dá)模式的基因Ly1484(SEQ IDNOS16-18和120-121)的分析此實(shí)施例說(shuō)明了用來(lái)鑒定用作治療劑、診斷劑等的抗原的典型程序，以及用于開(kāi)發(fā)白血病/淋巴瘤疾病的治療劑和診斷劑的優(yōu)選方法。首先，用PCR扣除文庫(kù)克隆鑒定白血病/淋巴瘤細(xì)胞中高度富集的候選基因。然后，通過(guò)微陣列分析法分析扣除的cDNA序列以評(píng)估它們?cè)谘簮盒阅[瘤和正常組織中的表達(dá)。由于微陣列分析通常識(shí)別的基因是已知基因或隨后用實(shí)時(shí)PCR分析發(fā)現(xiàn)具有較寬表達(dá)模式的基因，微陣列分析和比較公共數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合以確定用按重點(diǎn)排列用于分析的候選序列。然后，用實(shí)時(shí)PCR來(lái)分析各種血液亞組中的表達(dá)模式。一些情況下，進(jìn)一步的分析集中在與已知治療劑有類(lèi)似表達(dá)模式的抗原上。對(duì)于這些基因，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)程序被用來(lái)鑒定跨膜結(jié)構(gòu)域，用人體外致敏產(chǎn)生了抗原特異性CTL，并產(chǎn)生了人源化的單克隆和多克隆抗體，這些抗體作為試劑被用于診斷和治療惡性疾病和與抗原表達(dá)有關(guān)的自身免疫疾病。
Ly1484P PCR扣除文庫(kù)克隆序列與Genbank克隆KIAA1607(登錄號(hào)XM033378、XM033379和AB046827)和FJL00111(登錄號(hào)AK024502)相匹配。用微陣列分析和實(shí)時(shí)PCR證實(shí)了Ly1484的過(guò)表達(dá)。Ly1484P在B細(xì)胞瘤中過(guò)度表達(dá)，而在正常組織中的表達(dá)限于正常B-細(xì)胞。
用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了候選Ly1484P的全長(zhǎng)序列。Ly1484P被繪制在人染色體10上。Ly1484P具有長(zhǎng)型和短型(長(zhǎng)型-SEQ ID NO120；短型-SEQ ID NO121)。Ly1484P的TMpred分析表明此蛋白質(zhì)含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。采用TSITES程序還鑒定了T-輔助細(xì)胞表位(圖7和8)。產(chǎn)生了多肽，這些多肽被用來(lái)產(chǎn)生對(duì)Ly1484P特異的抗體。這些人源化的單克隆抗體可用來(lái)(共軛或非共軛的)診斷和治療惡性疾病和與Ly1484的表達(dá)有關(guān)的自身免疫疾病。
5.7實(shí)施例7-跨膜結(jié)構(gòu)域的鑒定用精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)程序來(lái)鑒定本文所述候選抗原中的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1728P，SEQ ID NO2的氨基酸殘基6-22、47-65、227-243和228-245被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1732P，SEQ ID NO4的氨基酸殘基60-76和55-76被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1888P，SEQ ID NO6的氨基酸1-22、3-21、52-68、254-273、252-273和256-272被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1452P，SEQ ID NO10(剪接變體1)的氨基酸354-375、355-377和425-441被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO12(剪接變體2)的氨基酸354-375、355-377和425-441被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1462P，SEQ ID NO15的氨基酸2-23、3-21、369-385、976-999、977-993和979-1000被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1484P，SEQ ID NO18的氨基酸51-67、322-338、666-682、736-752、1078-1094、24-43、53-69、118-136、319-335、730-752、1586-1602、48-69、88-109、114-135、196-217、300-321、323-344、389-410、502-523、659-680、714-735、1076-1097、1158-1179和1321-1342被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO120的氨基酸10-86、63-84、118-139、480-501、562-583、725-746、70-86、113-129、134-156、280-296、481-497、560-577、653-674、721-738、734-752、833-869、879-895、990-1006、1023-1048、1070-1087、1112-1138、1135-1170和1146-1170被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO121的氨基酸94-129、102-123、367-383、394-423、447-464和493-513被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1486P，SEQ ID NO21的氨基酸24-40和24-45被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1693P，SEQ ID NO26的氨基酸47-63、80-96、114-130、158-174、207-223、237-253、289-305、117-134、144-160、167-184、516-535、44-65、85-106、111-132、150-171、204-225、242-263和290-311被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1715P，SEQ ID NO29的氨基酸38-54、38-56和34-55被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1727P，SEQ ID NO32的氨基酸68-100、214-234、304-320、84-105、217-238和302-323被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1905P，SEQ ID NO40的氨基酸68-100、214-234、84-105和217-238被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1885P，SEQ ID NO35的氨基酸218-234、219-235、626-654和219-240被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly663S，SEQ ID NO43的氨基酸22-38、41-57、60-76、92-108、242-258、20-38、23-57、60-77、86-102、241-257、14-35、89-110和248-269被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly664S，SEQ ID NO45的氨基酸11-27、15-31、74-93、209-227、8-29和67-88被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly667S，SEQ ID NO48的氨基酸13-31、139-157、184-202、231-247、329-351、435-451、473-490、609-626、685-705、688-704、7-28、233-254和685-706被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly677S，SEQ ID NO54的氨基酸149-165、10-30、144-165、7-28和144-165被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1891P，SEQ ID NO56的氨基酸31-47、66-82、93-109、128-144、171-187、205-221、242-258、31-48、64-82、94-111、120-145、170-187、205-221、244-266和29-50、63-84、93-114、124-145、168-189、206-227和241-262被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于CD138，SEQ ID NO58的氨基酸255-271、4-21、258-276、6-27和256-277被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于CD22，SEQ ID NO61的氨基酸688-704、3-19、29-46、157-174、185-201、349-366、386-406、479-505、688-709、1-22、159-180和689-710被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于CD79β，SEQ ID NO66的氨基酸161-177、4-29、59-78、160-181、4-25和161-180被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1454P，SEQ ID NO74的氨基酸5-22、231-249、7-28和425-446被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1485P，SEQ ID NO76的氨基酸殘基2-19被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1500P，SEQ ID NO80(剪接變體1)的氨基酸殘基10-31和327-344被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO82(剪接變體2)的氨基酸殘基13-38、71-92和388-405被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO84(剪接變體3)的氨基酸25-46和341-359被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1516P，SEQ ID NO87的氨基酸142-158、177-193、207-223、238-254、271-287、142-158、177-193、207-223、238-254和271-287被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1729P，SEQ ID NO101的氨基酸420-436 431-437和412-433被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1859P，SEQ ID NO107d氨基酸殘基128-144、293-311、408-425、435-454、465-483、516-533、290-311；435-456和507-528被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly1866P，SEQ ID NO109的氨基酸47-65和50-71被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly669S，SEQ ID NO114的氨基酸489-505、13-29、38-57、73-89、94-114、252-268、307-324、329-346、489-509、4-25和486-507被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly672S，SEQ ID NO117的氨基酸11-27、284-300、325-341、345-361、407-423、7-28、102-118、174-198、283-299、325-341、347-383、403-423、431-454、473-492、11-32、286-307、322-343、345-366、404-425、430-451和469-490被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于Ly675S，SEQ ID NO119的氨基酸154-170、187-203、428-444、518-534、846-862、81-97、155-172、235-251、374-391、428-444、477-195、520-542、539-573、694-714、807-823、843-862、50-71、77-98、145-166、518-539、802-823和845-866被鑒定為假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
5.8實(shí)施例8-實(shí)時(shí)PCR分析以鑒定在慢性淋巴細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤中過(guò)長(zhǎng)表達(dá)的抗原用實(shí)時(shí)PCR證實(shí)候選抗原在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的過(guò)度表達(dá)。
實(shí)時(shí)PCR評(píng)價(jià)了擴(kuò)增期間PCR產(chǎn)物積累的水平(參見(jiàn)例如Gibson等，GenomeResearch 6995-1001(1996)；Heid等，Genome Research 6986-994(1996))。實(shí)時(shí)PCR可以定量許估多個(gè)樣品中的mRNA水平。簡(jiǎn)言之，mRNA提取自腫瘤和正常組織并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備cDNA。例如，可用Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)9700棱鏡儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR?？捎美鏟erkin Elmer/Applied Biosystems(FosterCity，CA)提供的引物表達(dá)程序?yàn)楦信d趣的基因設(shè)計(jì)匹配的引物。引物和探針的最佳濃度最初由本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員確定，并通過(guò)商業(yè)如Perkin Elmer/AppliedBiosystems(Foster City，CA)獲得對(duì)照(如β-肌動(dòng)蛋白)引物和探針。為測(cè)定樣品中特定RNA的量，用含有感興趣基因的質(zhì)粒產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)曲線。用實(shí)時(shí)PCR中確定的Ct值產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，該值與測(cè)定中所用的最初cDNA濃度有關(guān)。感興趣基因的10-106拷貝的標(biāo)準(zhǔn)稀釋通常是足夠的。此外，產(chǎn)生了對(duì)照序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線。出于比較的目的，可將組織樣品的最初RNA含量標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照的量。
結(jié)果概略
這些序列方便地用于診斷、治療和預(yù)防這些基因過(guò)度表達(dá)的惡性疾病，包括多發(fā)性骨髓瘤、B-細(xì)胞淋巴瘤和B-CLL。例如，單克隆抗體，包括人源化的單克隆抗體可用于診斷和治療與抗原表達(dá)有關(guān)的疾病，所述抗原在血液惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)。
5.9實(shí)施例9-與CD20和CD52有類(lèi)似表達(dá)模式的其它抗原的序列分析、表達(dá)分析和結(jié)構(gòu)分析結(jié)果概略
5.10實(shí)施例10-Ly1451的序列分析衍生自淋巴瘤PCR扣除文庫(kù)克隆的Ly1451(SEQ ID NOS69-71和124)序列被用來(lái)查詢一些公共數(shù)據(jù)庫(kù)，包括GenBank和GenSeq。未檢測(cè)到5’-近端51bp的匹配(＞90同一性)提示該序列可能含有重復(fù)元件。對(duì)LifeSeq數(shù)據(jù)庫(kù)(Incyte)進(jìn)行BLASTN檢索鑒定出一個(gè)980bp模板(模板#1076101.8；SEQ ID NO124，它含有Ly1451的所有240bp。該模板由6個(gè)克隆的序列構(gòu)成，其中2個(gè)(33％)來(lái)自血液/免疫組織文庫(kù)。模板#1076101.8是bin的一部分，含有11個(gè)來(lái)自總共104個(gè)克隆的模板，其中12個(gè)(9％)來(lái)自血液/免疫組織文庫(kù)。
該序列(SEQ ID NO124)被用來(lái)進(jìn)一步檢索公共數(shù)據(jù)庫(kù)，但未得到其它序列。然而，這些檢索表明該序列是一種人內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒序列(HERV)，它編碼與部分整合酶和包膜基因相應(yīng)的多肽。具有ATG轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的單個(gè)ORF包含在LS1076101.8的正向閱讀中。
預(yù)計(jì)此ORF(SEQ ID NO124)編碼的多肽不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。
5.11實(shí)施例11-由與B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤有關(guān)的特異性基因LY1452編碼的Ly1452淋巴瘤抗原編碼的構(gòu)建了重組表達(dá)的Ly1452抗原以便迅速且簡(jiǎn)便地純化蛋白質(zhì)。
Ly1452的開(kāi)放讀框被PCR擴(kuò)增，并亞克隆入框內(nèi)用His標(biāo)記修飾的pET28載體中，并在大腸桿菌中重組表達(dá)(His-Ly1452SEQ ID NO10，482(nt)，SEQ ID NO10，483(蛋白質(zhì))。
Ly1452P在大腸桿菌中的表達(dá)用以下引物PCR擴(kuò)增LS編碼區(qū)域的開(kāi)放讀框PDM-797 5’gtgtcacaatctacagtcaggcaggattctcc 3’Tm 64℃(SEQ ID NO10，975)PDM-799 5’gttatgtagcggccgcttatcatgttgctgcagag 3’Tm 67℃(SEQ ID NO10，976)采用以下條件10μl 10X Herculase緩沖液1μl 10MM dNTPs2μl 10μM各種寡核苷酸83μl無(wú)菌水1.0μl Herculase DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA98℃ 3分鐘98℃ 40秒60℃ 30秒72℃ 2分鐘×10循環(huán)98℃ 40秒60℃ 30秒72℃ 2分鐘30秒×10循環(huán)98℃ 40秒60℃ 30秒72℃ 3分鐘×10循環(huán)98℃ 40秒60℃ 30秒72℃ 3分鐘30秒×10循環(huán)72℃ 4分鐘PCR產(chǎn)物用Xho I消化并克隆入已經(jīng)用Eco72I和XhoI消化的pPDM His(一種在5’末端的框中用His標(biāo)記修飾的pET28載體)。構(gòu)建物通過(guò)序列分析證實(shí)并轉(zhuǎn)化入BLR(DE3)pLysS和HMS 174 pLys S細(xì)胞。
還表達(dá)了重組蛋白，無(wú)組氨酸標(biāo)記或有其它淋巴瘤抗原。它們也在其它載體中表達(dá)，包括其它大腸桿菌構(gòu)建物、桿狀病毒、酵母和哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。此重組抗原可用來(lái)產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體，或用于免疫測(cè)定。
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本文和權(quán)利要求書(shū)披露的所有組合物和方法通過(guò)閱讀本文無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)即可制備和實(shí)施。雖然已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明的組合物和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明白可在不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍對(duì)本文所述組合物和方法及方法的步驟和步驟的順序進(jìn)行改進(jìn)。更具體說(shuō)，顯然可用化學(xué)或物理上相關(guān)的某些試劑來(lái)代替本文所述的試劑，而仍能獲得相同或相似結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，所有這些相似的替代和改變都屬于本發(fā)明附如權(quán)利要求的精神、范圍和概念之內(nèi)。本文引用的所有出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)都納入本文作為參考。因此，本發(fā)明申請(qǐng)的獨(dú)占專(zhuān)利權(quán)如以下權(quán)利要求書(shū)所述。
序列表<210>1<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11>Ly1728P，膜蛋白FOAP-12，全長(zhǎng)cDNActtccagagagcaatatggctggttccccaacatgcctcaccctcatctatatcctttggcagctcacagggtcagcagcctctggacccgtgaaagagctggtcggttccgttggtggggccgtgactttccccctgaagtccaaagtaaagcaagttgactctattgtctggaccttcaacacaacccctcttgtcaccatacagccagaagggggcactatcatagtgacccaaaatcgtaatagggagagagtagacttcccagatggaggctactccctgaagctcagcaaactgaagaagaatgactcagggatctactatgtggggatatacagctcatcactccagcagccctccacccaggagtacgtgctgcatgtctacgagcacctgtcaaagcctaaagtcaccatgggtctgcagagcaataagaatggcacctgtgtgaccaatctgacatgctgcatggaacatggggaagaggatgtgatttatacctggaaggccctggggcaagcagccaatgagtcccataatgggtccatcctccccatctcctggagatggggagaaagtgatatgaccttcatctgcgttgccaggaaccctgtcagcagaaacttctcaagccccatccttgccaggaagctctgtgaaggtgctgctgatgacccagattcctccatggtcctcctgtgtctcctgttggtgcccctcctgctcagtctctttgtactggggctatttctttggtttctgaagagagagagacaagaagagtacattgaagagaagaagagagtggacatttgtcgggaaactcctaacatatgcccccattctggagagaacacagagtacgacacaatccctcacactaatagaacaatcctaaaggaagatccagcaaatacggtttactccactgtggaaataccgaaaaagatggaaaatccccactcactgctcacgatgccagacacaccaaggctatttgcctatgagaatgttatctagacagcagtgcactcccctaagtctctgctcaaaaaaaaaacaattctcggcccaaagaaaacaatcagaagaattcactgatttgactagaaacatcaaggaagaatgaagaacgttgacttttttccaggataaattatctctgatgcttctttagatttaagagttcataattccatccactgctgagaaatctcctcaaacccagaaggtttaatcacttcatcccaaaaatgggattgtgaatgccagcaaaccataaaaaaagtgcttagaagtattcctatagaaatgtaaatgcaaggtcacacatattaatgacagcctgttgtattaatgatggctccaggtcagtgtctggagtttcattccatcccagggcttggatgtaaggattataccaagagtcttgctaccaggagggcaagaagaccaaaacagacagacaagtccagcagaagcagatgcacctgacaaaaatggatgtattaattggctctataaactatgtgcccagcactatgctgagcttacactaattggtcagacgtgctgtctgccctcatgaaattggctccaaatgaatgaactactttcatgagcagttgtagcaggcctgaccacagattcccagagggccaggtgtggatccacaggacttgaaggtcaaagttcacaaagatgaagaatcagggtagctgaccatgtttggcagatactataatggagacacagaagtgtgcatggcccaaggacaaggacctccagccaggcttcatttatgcacttgtgctgcaaaagaaaagtctaggttttaaggctgtgccagaacccatcccaataaagagaccgagtctgaagtcacattgtaaatctagtgtaggagacttggagtcaggcagtgagactggtggggcacggggggcagtgggtacttgtaaacctttaaagatggttaattcattcaatagatatttattaagaacctatgcggcccggcatggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccaaggtgggtgggtcatctgaggtcaggagttcaagaccagcctggccaacatggtgaaaccccatctctactaaagatacaaaaatttgctgagcgtggtggtgtgcacctgtaatcccagctactcgagaggccaaggcatgagaatcgcttgaacctgggaggtggaggttgcagtgagctgagatggcaccactgcactccggcctaggcaacgagagcaaaactccaatacaaacaaacaaacaaacacctgtgctaggtcagtctggcacgtaagatgaacatccctaccaacacagagctcaccatctcttatacttaagtgaaaaacatggggaaggggaaaggggaatggctgcttttgatatgttccctgacacatatcttgaatggagacctccctaccaagtgatgaaagtgttgaaaaacttaataacaaatgcttgttgggcaagaatgggattgaggattatcttctctcagaaaggcattgtgaaggaattgagccagatctctctccctactgcaaaaccctattgtagtaaaaaagtcttctttactatcttaataaaacagatattgtgagattcaaaaaaaaaaaaaaaa<210>2<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>22>Ly1728P，F(xiàn)OAP-12，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPLVTIQPEGGTIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEYVLHVYEHLSKPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSILPISWRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMVLLCLLLVPLLLSLFVLGLFLWFLKRERQEEYIEEKKRVDICRETPNICPHSGENTEYDTIPHTNRTILKEDPANTVYSTVEIPKKMENPHSLLTMPDTPRLFAYENVI<210>3<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>33>Ly1732P，BCM，全長(zhǎng)cDNA
ttgtaagatattacttgtccttccaggctgttctttctgtagctcccttgttttctttttgtgatcatgttgcagatggctgggcagtgctcccaaaatgaatattttgacagtttgttgcatgcttgcataccttgtcaacttcgatgttcttctaatactcctcctctaacatgtcagcgttattgtaatgcaagtgtgaccaattcagtgaaaggaacgaatgcgattctctggacctgtttgggactgagcttaataatttctttggcagttttcgtgctaatgtttttgctaaggaagataagctctgaaccattaaaggacgagtttaaaaacacaggatcaggtctcctgggcatggctaacattgacctggaaaagagcaggactggtgatgaaattattcttccgagaggcctcgagtacacggtggaagaatgcacctgtgaagactgcatcaagagcaaaccgaaggtcgactctgaccattgctttccactcccagctatggaggaaggcgcaaccattcttgtcaccacgaaaacgaatgactattgcaagagcctgccagctgctttgagtgctacggagatagagaaatcaatttctgctaggtaattaaccatttcgactcgagcagtgccactttaaaaatcttttgtcagaatagatgatgtgtcagatctctttaggatgactgtatttttcagttgccgatacagctttttgtcctctaactgtggaaactctttatgttagatatatttctctaggttactgttgggagcttaatggtagaaacttccttggtttctatgattaaagtctttt<210>4<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>44>Ly1732P，BCM，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKISSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR<210>5<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>55>Ly1888P，抗-Fas-誘導(dǎo)的表位(TOSO)，全長(zhǎng)cDNAttgcactctagaagggacaatggacttctggctttggccactttacttcctgccagtatcgggggccctgaggatcctcccagaagtaaaggtagagggggagctgggcggatcagttaccatcaagtgcccacttcctgaaatgcatgtgaggatatatctgtgccgggagatggctggatctggaacatgtggtaccgtggtatccaccaccaacttcatcaaggcagaatacaagggccgagttactctgaagcaatacccacgcaagaatctgttcctagtggaggtaacacagctgacagaaagtgacagcggagtctatgcctgcggagcgggcatgaacacagaccggggaaagacccagaaagtcaccctgaatgtccacagtgaatacgagccatcatgggaagagcagccaatgcctgagactccaaaatggtttcatctgccctatttgttccagatgcctgcatatgccagttcttccaaattcgtaaccagagttaccacaccagctcaaaggggcaaggtccctccagttcaccactcctcccccaccacccaaatcacccaccgccctcgagtgtccagagcatcttcagtagcaggtgacaagccccgaaccttcctgccatccactacagcctcaaaaatctcagctctggaggggctgctcaagccccagacgcccagctacaaccaccacaccaggctgcacaggcagagagcactggactatggctcacagtctgggagggaaggccaaggatttcacatcctgatcccgaccatcctgggccttttcctgctggcacttctggggctggtggtgaaaagggccgttgaaaggaggaaagccctctccaggcgggcccgccgactggccgtgaggatgcgcgccctggagagctcccagaggccccgcgggtcgccgcgaccgcgctcccaaaacaacatctacagcgcctgcccgcggcgcgctcgtggagcggacgctgcaggcacaggggaagcccccgttcccggccccggagcgccgttgccccccgccccgctgcaggtgtctgaatctccctggctccatgccccatctctgaagaccagctgtgaatacgtgagcctctaccaccagcctgccgccatgatggaggacagtgattcagatgactacatcaatgttcctgcctgacaactccccagctatcccccaaccccaggctcggactgtggtgccaaggagtctcatctatctgctgatgtccaatacctgcttcatgtgttctcagagccctcatcattcccatgccccatctcgatcccatccccatctatctgt<210>6<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>66>Ly1888P，抗-Fas-誘導(dǎo)的表位(TOSO)，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)MDFWLWPLYFLPVSGALRILPEVKVEGELGGSVTIKCPLPEMHVRIYLCREMAGSGTCGTVVSTTNFIKAEYKGRVTLKQYPRKNLFLVEVTQLTESDSGVYACGAGMNTDRGKTQKVTLNVHSEYEPSWEEQPMPETPKWFHLPYLFQMPAYASSSKFVTRVTTPAQRGKVPPVHHSSPTTQITHRPRVSRASSVAGDKPRTFLPSTTASKISALEGLLKPQTPSYNHHTRLHRQRALDYGSQSGREGQGFHILIPTILGLFLLALLGLVVKRAVERRKALSRRARRLAVRMRALESSQRPRGSPRPRSQNNIYSACPRRARGADAAGTGEAPVPGPGAPLPPAPLQVSESPWLHAPSLKTSCEYVSLYHQPAAMMEDSDSDDYINVPA
<210>7<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>77>Ly1452_His-tag-融合蛋白，Old-SEO-ID_10482，全長(zhǎng)cDNAatgcagcatcaccaccatcaccacgtgtcacaatctacagtcaggcaggattctcctgtggagccctgggaagggatcagcgatcactctggcattattgatggttcgcccagactcctgaacactgaccatcctccttgccaattagacatcaggctcatgaggcacaaagctgtctggattaacccccaggatgtgcagcaacagccgcaggacttgcaatctcaggtgccagcagcagggaacagtgggacccattttgtgacagatgctgcctctccctcaggcccttcaccttcgtgcctcggggactccctggcagagacaacgttgtctgaggataccacagactccgttggcagcgcttctccccatggctcgagtgaaaagagtagcagcttctctctgtcctcaacagaggtacacatggtccgcccaggatactctcatcgggtgtctctgcccacaagccctgggattttggccacctccccatatcctgagactgacagtgctttttttgagccttcccatctgacatctgctgctgatgaaggtgctgttcaagtcagtagaagaaccatttcttcgaattccttctcaccagaggtatttgtgctgcctgttgatgtagaaaaggaaaatgcccacttttatgttgcagatatgattatatcagcaatggagaaaatgaagtgtaacattctgagtcaacagcagacagagagctggagtaaagaagtcagtgggttacttgggagtgatcagcctgactctgaaatgacttttgataccaacataaagcaagagtctgggtcttctacttcttcatacagtggctatgaaggttgtgctgtgttacaggtcagcccagtgactgaaacacgtacttaccatgatgtgaaagagatttgcaaatgcgatgttgatgaatttgttattttagagcttggagattttaatgatatcacagaaacctgtagctgttcctgcagctcctctaagagtgtcacttatgagccagacttcaattctgcagaactattagccaaagagctgtaccgcgtgttccagaagtgctggatactgtcagtagttaattctcagctggcaggttccctgagtgcagctggctcgatagtcgtaaatgaagagtgtgtccgaaaagactttgaatccagtatgaatgtagtacaggaaattaaatttaagtctaggatcagagggactgaagactgggctcctcctagatttcaaatcatatttaatattcatccaccactcaagagggaccttgtggtggcagcccagaattttttctgtgccggctgtggaactccagtagagcctaagtttgtgaagcggctccggtactgcgaatacctagggaagtatttctgtgactgctgccactcatatgcagagtcgtgcatccctgcccgaatcctgatgatgtgggacttcaagaagtactacgtcagcaatttctccaaacagctgctcgacagcatatggcaccagcccattttcaatttgctgagcatcggccaaagcctgtatgcgaaagccaaggagctggacagagtgaaggaaattcaggagcagctcttccatatcaagaagctgttgaagacctgtaggtttgctaacagtgcattaaaggagttcgagcaggtgccgggacacttgactgatgagctccacctgttctcccttgaggacctggtcaggatcaagaaagggctgctggcacccttactcaaggacattctgaaagcttcccttgcacatgtggctggctgtgagctgtgtcaaggaaagggctttatttgtgaattttgccagaatacgactgtcatcttcccatttcagacagcaacatgtagaagatgttcagcgtgcagggcttgctttcacaaacagtgcttccagtcctccgagtgcccccggtgtgcgaggatcacagcgaggagaaaacttctggaaagtgtggcctctgcagcaaca<210>8<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>88>Ly1452_His-tag-融合蛋白，Old-SEQ-ID_10483，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)MQHHHHHHVSQSTVRQDSPVEPWEGISDHSGIIDGSPRLLNTDHPPCQLDIRLMRHKAVWINPQDVQQQPQDLQSQVPAAGNSGTHFVTDAASPSGPSPSCLGDSLAETTLSEDTTDSVGSASPHGSSEKSSSFSLSSTEVHMVRPGYSHRVSLPTSPGILATSPYPETDSAFFEPSHLTSAADEGAVQVSRRTISSNSFSPEVFVLPVDVEKENAHFYVADMIISAMEKMKCNILSQQQTESWSKEVSGLLGSDQPDSEMTFDTNIKQESGSSTSSYSGYEGCAVLQVSPVTETRTYHDVKEICKCDVDEFVILELGDFNDITETCSCSCSSSKSVTYEPDFNSAELLAKELYRVFQKCWILSVVNSQLAGSLSAAGSIVVNEECVRKDFESSMNVVQEIKFKSRIRGTEDWAPPRFQIIFNIHPPLKRDLVVAAQNFFCAGCGTPVEPKFVKRLRYCEYLGKYFCKCCHSYAESCIPARILMMWDFKKYYVSNFSKQLLDSIWHQPIFNLSSIGQSLYAKAKELDRVKEIQEQLFHIKKLLKTCRFANSALKEFEQVPGHLTDELHLFSLEDLVRIKKGLLAPLLKDILKASLAHVAGCELCQGKGFICEFCQNTTVIFPFQTATCRRCSACRACFHKQCFQSSECPRCARITARRKLLESVASAAT<210>9<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>99>Ly1452P_LS_400351.4_編輯的，剪接體-1，全長(zhǎng)cDNAgggagcctatagggttcaataacttgcagtgtggttggggcttatggatgctggatgaagataagtgagggaggtttacagggacagcatcatgtcaggccttgagggcaagaatagctctccagacccccagctggccatgtggtgagttcagggcccaaatcaagtagtaccagcaatcagggaactcctatctgttttgaatggattcacaccagccacaagcctggaaagatggtgtcacaatctacagtcaggcaggattctcctgtggagccctgggaagggatcagcgatcactctggcattattgatggttcgcccagactcctgaacactgaccatcctccttgccaattagacatcaggctcatgaggcacaaagctgtctggattaacccccaggatgtgcagcaacagccgcaggacttgcaatctcaggtgccagcagcagggaacagtgggacccattttgtgacagatgctgcctctccctcaggcccttcaccttcgtgcctcggggactccctggcagagacaacgttgtctgaggataccacagactccgttggcagcgcttctccccatggctcgagtgaaaagagtagcagcttctctctgtcctcaacagaggtacacatggtccgcccaggatactctcatcgggtgtctctgcccacaagccctgggattttggccacctccccatatcctgagactgacagtgctttttttgagccttcccatctgacatctgctgctgatgaaggtgctgttcaagtcagtagaagaaccatttcttcgaattccttctcaccagaggtatttgtgctgcctgttgatgtagaaaaggaaaatgcccacttttatgttgcagatatgattatatcagcaatggagaaaatgaagtgtaacattctgagtcaacagcagacagagagctggagtaaagaagtcagtgggttacttgggagtgatcagcctgactctgaaatgacttttgataccaacataaagcaagagtctgggtcttctacttcttcatacagtggctatgaaggttgtgctgtgttacaggtcagcccagtgactgaaacacgtacttaccatgatgtgaaagagatttgcaaatgcgatgttgatgaatttgttattttagagcttggagattttaatgatatcacagaaacctgtagctgttcctgcagctcctctaagagtgtcacttatgagccagacttcaattctgcagaactattagccaaagagctgtaccgcgtgttccagaagtgctggatactgtcagtagttaattctcagctggcaggttccctgagtgcagctggctcgatagtcgtaaatgaagagtgtgtccgaaaagactttgaatccagtatgaatgtagtacaggaaattaaatttaagtctaggatcagagggactgaagactgggctcctcctagatttcaaatcatatttaatattcatccaccactcaagagggaccttgtggtggcagcccagaattttttctgtgccggctgtggaactccagtagagcctaagtttgggaagcggctccggtactgcgaatacctagggaagtatttctgtgactgctgccactcatatgcagagtcgtgcatccctgcccgaatcctgatgatgtgggacttcaagaagtactacgtcagcaatttctccaaacagctgctcgacagcatatggcaccagcccattttcaatttgctgagcatcggccaaagcctgtatgcgaaagccaaggagctggacagagtgaaggaaattcaggagcagctcttccatatcaagaagctgttgaagacctgtaggtttgctaacagtgcattaaaggagttcgagcaggtgccgggacacttgactgatgagctccacctgttctcccttgaggacctggtcaggatcaagaaagggctgctggcacccttactcaaggacattctgaaagcttcccttgcacatgtggctggctgtgagctgtgtcaaggaaagggctttatttgtgaattttgccagaatacgactgtcatcttcccatttcagacagcaacatgtagaagatgttcagcgtgcagggcttgctttcacaaacagtgcttccagtcctccgagtgcccccggtgtgcgaggatcacagcgaggagaaaacttctggaaagtgtggcctctgcagcaacatgatgcccctgagtactgtgaaaaagactgttcaacatgccttatgataacaccgatttgtgtctattattggtgacattgttttagatattgggtattgtatattaaggaaaaagatggtctatattctctttattgcatatacttaatgtttcaaaagaatgcagattctgtgtttaagcacagggctgatagttgtggttttgtttacaaatgttctgttttggctgctattggttttttaaagaggttttttatacttttgtatttgaatagttatgtttcactgatgctgagccagtttgtatgtgtgtgcatatatgtgaactgtaactgacaagatgaattactcagtttctctttctctaaagcttgtttgatgaaactggttggtcctttcagtgaacaaaaatatgaccccaaatctgtttgctctggcttttatttcttcaggaagcagacttccacttaaatgccattttgtgattgtgtcaatcatacacattttatttacttcagagtttgaatagagagtacacatttcttctgcagatttatttcatgatgagtttgagttgcttagcagggcgtgtgggtcccgttgaagtgcagtttgaagcaactgcttctagatggcactctttcaggtggcacaaattgaacctgtatttgtcatctctgttccacacactgcaatgccaagggatgcagaagtgagtagaattccatccctgcccttgaggatcttgctttaacagatgtaaaactgaacataaggtatttgcagatttaaacgaactgggggaaataatgaacagtgtgattctagtaataacattaaaatcatagacattgactaataaggttaaatgaatcacaaaacctttatgaatttcttttttctaatagttcttatatgttttcctgaaacatgtgagcctattcttttttcttctactttctatatactttctcccacttgagaaaggggccttgaggctgggtcccttcatggtatacctttagactgaacggtttgcaacctagggcttgggcattacattccctgggattcacatgccctaactaaacctaccttgattttctcagacagcacaggcaggcaataaagcgtcacagattgtcccctaaccccatccagccatgtgtatgagtgtgttttattcaatgggatagtactgagcacatgaaagaaatgaatgacttctgtcaatctcttttcattcagtcttctcattctgtcaattgttttctcatccgcagtgcctctgccagaactgtgctcacatccattatttaagccagatcttttctaagtattatagaagtgtagaggcacatagaataaataaaaccagacttc<210>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1010>Ly1452P_LS_400351.4_編輯的，剪接體-1，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)MVSQSTVRQDSPVEPWEGISDHSGIIDGSPRLLNTDHPPCQLDIRLMRHKAVWINPQDVQQQPQDLQSQVPAAGNSGTHFVTDAASPSGPSPSCLGDSLAETTLSEDTTDSVGSASPHGSSEKSSSFSLSSTEVHMVRPGYSHRVSLPTSPGILATSPYPETDSAFFEPSHLTSAADEGAVQVSRRTISSNSFSPEVFVLPVDVEKENAHFYVADMIISAMEKMKCNILSQQQTESWSKEVSGLLGSDQPDSEMTFDTNIKQESGSSTSSYSGYEGCAVLQVSPVTETRTYHDVKEICKCDVDEFVILELGDFNDITETCSCSCSSSKSVTYEPDFNSAELLAKELYRVFQKCWILSVVNSQLAGSLSAAGSIVVNEECVRKDFESSMNVVQEIKFKSRIRGTEDWAQPRFQIIFNIHPPLKRDLVVAAQNFFCAGCGTPVEPKFVKRLRYCEYLGKYFCDCCHSYAESCIPARILMMWDFKKYYVSNFSKQLLDSIWHQPIFNLLSIGQSLYAKAKELDRVKEIQEQLFHIKKLLKTCRFANSALKEFEQVPGHLTDELHLFSLEDLVRIKKGLLAPLLKDILKASLAHVAGCELCQGKGFICEFCQNTTVIFPFQTATCRRCSACRACFHKQCFQSSECPRCARITARRKLLESVASAAT<210>11
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13>LY1462P，Old-SEQ-ID_6411，部分cDNActggttcacgtgtggagctagttaatacgtcctgccaagatgggtaccagttgactggacatgcttatcagatgtgtcaagatgctgaaaatggaatttggttcaaaaagattccactttgtaaagttatccactgcaccctccacca<210>14<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1414>Ly1462P，人EB病毒互補(bǔ)受體類(lèi)型II(cr2)全長(zhǎng)ccagagctgccggacgctcgcgggtctcggaacgcatcccgccgcgggggcttcggccgtggcatgggcgccgcgggcctgctcggggttttcttggctctcgtcgcaccgggggtcctcgggatttcttgtggctctcctccgcctatcctaaatggccggattagttattattctacccccattgctgttggtaccgtgataaggtacagttgttcaggtaccttccgcctcattggagaaaaaagtctattatgcataactaaagacaaagtggatggaacctgggataaacctgctcctaaatgtgaatatttcaataaatattcttcttgccctgagcccatagtaccaggaggatacaaaattagaggctctacaccctacagacatggtgattctgtgacatttgcctgtaaaaccaacttctccatgaacggaaacaagtctgtttggtgtcaagcaaataatatgtgggggccgacacgactaccaacctgtgtaagtgttttccctctcgagtgtccagcacttcctatgatccacaatggacatcacacaagtgagaatgttggctccattgctccaggattgtctgtgacttacagctgtgaatctggttacttgcttgttggagaaaagatcattaactgtttgtcttcgggaaaatggagtgctgtcccccccacatgtgaagaggcacgctgtaaatctctaggacgatttcccaatgggaaggtaaaggagcctccaattctccgggttggtgtaactgcaaactttttctgtgatgaagggtatcgactgcaaggcccaccttctagtcggtgtgtaattgctggacagggagttgcttggaccaaaatgccagtatgtgaagaaattttttgcccatcacctccccctattctcaatggaagacatataggcaactcactagcaaatgtctcatatggaagcatagtcacttacacttgtgacccggacccagaggaaggagtgaacttcatccttattggagagagcactctccgttgtacagttgatagtcagaagactgggacctggagtggccctgccccacgctgtgaactttctacttctgcggttcagtgtccacatccccagatcctaagaggccgaatggtatctgggcagaaagatcgatatacctataacgacactgtgatatttgcttgcatgtttggcttcaccttgaagggcagcaagcaaatccgatgcaatgcccaaggcacatgggagccatctgcaccagtctgtgaaaaggaatgccaggcccctcctaacatcctcaatgggcaaaaggaagatagacacatggtccgctttgaccctggaacatctataaaatatagctgtaaccctggctatgtgctggtgggagaagaatccatacagtgtacctctgagggggtgtggacaccccctgtaccccaatgcaaagtggcagcgtgtgaagctacaggaaggcaactcttgacaaaaccccagcaccaatttgttagaccagatgtcaactcttcttgtggtgaagggtacaagttaagtgggagtgtttatcaggagtgtcaaggcacaattccttggtttatggagattcgtctttgtaaagaaatcacctgcccaccaccccctgttatctacaatggggcacacaccgggagttccttagaagattttccatatggaaccacggtcacttacacatgtaaccctgggccagaaagaggagtggaattcagcctcattggagagagcaccatccgttgtacaagcaatgatcaagaaagaggcacctggagtggccctgctcccctatgtaaactttccctccttgctgtccagtgctcacatgtccatattgcaaatggatacaagatatctggcaaggaagccccatatttctacaatgacactgtgacattcaagtgttatagtggatttactttgaagggcagtagtcagattcgttgcaaacgtgataacacctgggatcctgaaataccagtttgtgaaaaaggctgccagccacctcctgggctccaccatggtcgtcatacaggtggaaatacggtcttctttgtctctgggatgactgtagactacacttgtgaccctggctatttgcttgtgggaaacaaatccattcactgtatgccttcaggaaattggagtccttctgccccacggtgtgaagaaacatgccagcatgtgagacagagtcttcaagaacttccagctggttcacgtgtggagctagttaatacgtcctgccaagatgggtaccagttgactggacatgcttatcagatgtgtcaagatgctgaaaatggaatttggttcaaaaagattccactttgtaaagttattcactgtcaccctccaccagtgattgtcaatgggaagcacacaggcatgatggcagaaaactttctatatggaaatgaagtctcttatgaatgtgaccaaggattctatctcctgggagagaaaaattgcagtgcagaagtgattctaaaggcatggatcttggagcgagccttcccacagtgcttacgatctctgtgccctaatccagaagtcaaacatgggtacaagctcaataaaacacattctgcatattcccacaatgacatagtgtatgttgactgcaatcctggcttcatcatgaatggtagtcgcgtgattaggtgtcatactgataacacatgggtgccaggtgtgccaacttgtatcaaaaaagccttcatagggtgtccacctccgcctaagacccctaacgggaaccatactggtggaaacatagctcgattttctcctggaatgtcaatcctgtacagctgtgaccaaggctacctggtggtgggagagccactccttctttgcacacatgagggaacctggagccaacctgcccctcattgtaaagaggtaaactgtagctcaccagcagatatggatggaatccagaaagggctggaaccaaggaaaatgtatcagtatggagctgttgtaactctggagtgtgaagatgggtatatgctggaaggcagtccccagagccagtgccaatcggatcaccaatggaaccctcccctggcggtttgcagatcccgttcacttgctcctgtcctttgtggtattgctgcaggtttgatacttcttaccttcttgattgtcattaccttatacgtgatatcaaaacacagagaacgcaattattatacagatacaagccagaaagaagcttttcatttagaagcacgagaagtatattctgttgatccatacaacccagccagctgatcagaagacaaaactggtgtgtgcctcattgcttggaattcagcggaatattgattagaaagaaactgctctaatatcagcaagtctctttatatggcctcaagatcaatgaaatgatgtcataagcgatcacttcctatatgcacttattctcaagaagaacatctttatggtaaagatgggagcccagtttcactgccatatactcttcaaggactttctgaagcctcacttatgagatgcctgaagccaggccatggctataaacattacatggctctaaaagttttgccctttttaaggaggcactaaaaagagctgtcctggtatctagacccatcttctttttgaaatcacatactcatgttactatctgcttttggttataatgtgtttttaattatctaaagtatgaagcattttctggggttatgatggccttacttttattag
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tccaacacaacatccagaagacagtgcagactctctggcagcagctggtggcacaaaggcagcagaccctggaggatgccttcaagatcgatctctctgtgaaacctggagagagggaagtgaagattgaagaggtcacaccgctctgggaggagacgatgctcaaggcctggcagcattacttagcatctgagaagaagtcactggcaagtcgttcaaatgttgcacaccacagcaaagtcactttgtggagtggaagcctgtcctcagccatgaagctgatgcccgggcggcaggccaaggaccctgagtgcaagacagaggattttgtgtcatgtatagagaactacagaagaagaggacaagagctatatgcatctttatacaaagaccatgtgcaaaggcgaaaatgtggcaacatcaaggcagccaacgcctgggccaggatccaggagcagctttttggggagctgggcttgtggagccagggggaagaaaccaagccctgttccccatgggaactcgactggagagaaggaccagctcgaatgaggaaacgcatcaaacgcttgtctcctttggaggccctgagctcaggaaggcacaaggaaagccaagacaaaaatgatcatatttctcaaacaaatgctgaaaaccaagatgaactgacactgagggaggctgagggcgagccggacgaggtgggggtggactgcacccagctgaccttcttcccagccttacacgaaagtctgcactcagaagacttcttggaactgtgtcgggaaagacaagttattttacaagagcttcttgataaagaaaaggtgacgcagaagttctccctggtgattgtgcagggccacctggtgtcagaaggggtcctgctttttggccaccaacacttctacatctgcgagaacttcacactgtctcccacgggtgatgtctactgtacccgtcactgcttatccaacatcagcgatccgttcattttcaacctgtgcagcaaagacaggtccactgaccattactcgtgccagtgccacagctacgctgacatgcgggagctacggcaggctcgcttcctcctgcaggacatcgccctggagatcttcttccacaatggatattccaagtttcttgtcttctacaacaatgatcggagtaaggcctttaaaagcttctgctctttccaacccagcctgaaggggaaagccacctcggaggacaccctcaatctaaggagataccccctctctgacaggatcatgctgcagaagtggcagaaaagggacatcagcaattttgagtatctcatgtacctcaacaccgcggctgggagaacctgcaatgactacatgcagtacccagtgttcccctgggtcctcgcagactacacctcagagacattgaacttggcaaatccgaagattttccgggatctttcaaagcccatgggggctcagaccaaggaaaggaagctgaaatttatccagaggtttaaagaagttgagaaaactgaaggagacatgactgtccagtgccactactacacccactactcctcggccatcatcgtggcctcctacctggtccggatgccacccttcacccaggccttctgcgctctgcagggcggaagcttcgacgtggcagacagaatgttccacagtgtgaagagcacgtgggagtcggcctccagagagaacatgagtgacgtcagggagctgaccccagagttcttctacctgcctgagttcttaaccaactgcaacggggtagagttcggctgcatgcaggacgggactgtgctaggagacgtgcagctccctccctgggctgatggggaccctcggaaattcatcagcctgcacagaaaggccctggaaagtgactttgtcagtgccaacctccaccattggatagaccttatttttgggtacaagcagcaggggccagccgcagtggatgctgttaatatcttccacccccacttctacggtgacagaatggacctcagcagcatcactgaccccctcatcaaaagcaccatcctggggtttgtcagcaactttggacaggtgcccaaacagctctttaccaaacctcacccagccaggactgcagcagggaagcctctgcctggaaaggatgtctccacccccgtgagcctgcctggccacccacagccctttttctacagcctgcagtcgctgaggccctcccaggtcacggtcaaagatatgtacctcttttctctaggctcagagtcccccaaaggggccattggccacattgtctctactgagaagaccattctggctgtagagaggaacaaagtgctgctgcctcctctctggaacaggaccttcagctggggctttgatgacttcagctgctgcttggggagctacggctccgacaaggtcctgatgacattcgagaacctggctgcctggggccgctgtctgtgcgccgtgtgcccatccccaacaacgattgtcacctctgggaccagcactgtggtgtgtgtgtgggagctcagcatgaccaaaggccgcccgaggggcttgcgcctccggcaggccttgtatggacacacacaggctgtcacgtgcctggcagcgtcagtcaccttcagcctcctggtgagcggctcccaggactgcacctgtatcctgtgggatctggaccacctcacccacgtgacccgcctgcccgcccatcgggaaggcatctcagccatcaccatcagtgacgtctcaggcaccattgtctcctgtgcgggagcacacttgtccctgtggaatgtcaatggacagcccctggccagcatcaccacagcctggggcccagaaggagccataacctgttgctgcctgatggagggcccagcatgggacacaagccagatcatcatcaccgggagtcaagacggcatggtccgggtttggaagactgaggatgtgaagatgtctgttcctggacggccagcaggagaggagcccctggctcagcctccaagcccaagaggccacaagtgggagaagaacctggccttgagtcgagagctggacgttagcattgctttgacagggaagcccagcaaaaccagccccgcagtgactgctctggccgtgtccagaaaccacaccaaactcctggttggtgatgagagggggagaatattctgctggtctgcagatgggtaggaagagagaggcagcagaggctctggcacaacagtgccaggctgagggtggcagaggtgactggggcctgagctctgcctacagaagaaacccccagggcctccttccccacagttctcaaggaagggcctctggcaatcacagctctgcagcccaaccctctccatggccgatgggacttctatgaaaaggatgagcacacacactcggagggctgagcagcacgctggaaactgtgacttggtgatgcccagctgcacacgaaattacacatgactcaccttattaagggctattgcactgaaaaaaaaaaaaagatgggtcgcttactggaaattattgtattgtctttattttattaaagcaactatgtttt<210>18<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1818>Ly1484P，KIAA1607，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)
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<210>37<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3737>Ly1905P，Old-SEQ-ID_2169，部分蛋白質(zhì)QVVAXIQHCHSRGVVHRDIKDENILIDLRRGCAKLIDFGSGALLHDEPYTDFDGTRVYSPPEWISRHQYHALPATVWSLGIXLYDM<210>38<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3838>Ly1905P_Old_SEQ-ID_52277部分cDNAaaataatccaggcaggagaagagaggagggcacacttggaactcccctccccacaatacgtgattatttacattttagtaattggacaatcccggctcaggaggaggttgcaagaatctgcaaaagttggagggagcgccccaggagaacaaacagcaagccttatttcccctagcccatcccccaaaaaaccatccatcccatcctagtgtctggtggtgtccggtggtgtccatcttccattccttcccaaattatggaagtaaggttcttctcaccagaataagagcacttgggataacagagtagggtcccctcacccaaaaaaaaaaaaaaaaangaagccttggggtaacaacagggcattacctcccccagaataaagaatcctgggctgaggcaggtaagcagcttgacccaatatgggaccctaggctaggggaaagggtccctttactaaaataaaagctactggggtattggaaggaaagcacccttgcccaagtaagagcatatgaactaagtttgngtggnggtagtaggaggngccaatgtggggtgacacatcatcagaataagagtcc<210>39<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3939>Ly1905P pim-2原癌基因全長(zhǎng)cDNAcgcgcgcggcgaatctcaacgctgcgccgtctgcgggcgcttccgggccaccagtttctctgctttccaccctggcgccccccggccctggctccccagctgcgctgccccgggcgtccacgccctgcgggcttagcgggttcagtgggctcaatctgcgcagcgccacctccatgttgaccaagcctctacaggggcctcccgcgccccccgggacccccacgccgccgccaggaggcaaggatcgggaagcgttcgaggccgagtatcgactcggccccctcctgggtaaggggggctttggcaccgtcttcgcaggacaccgcctcacagatcgactccaggtggccatcaaagtgattccccggaatcgtgtgctgggctggtcccccttgtcagactcagtcacatgcccactcgaagtcgcactgctatggaaagtgggtgcaggtggtgggcaccctggcgtgatccgcctgcttgactggtttgagacacaggagggcttcatgctggtcctcgagcggcctttgcccgcccaggatctctttgactatatcacagagaagggcccactgggtgaaggcccaagccgctgcttctttggccaagtagtggcagccatccagcactgccattcccgtggagttgtccatcgtgacatcaaggatgagaacatcctgatagacctacgccgtggctgtgccaaactcattgattttggttctggtgccctgcttcatgatgaaccctacactgactttgatgggacaagggtgtacagccccccagagtggatctctcgacaccagtaccatgcactcccggccactgtctggtcactgggcatcctcctctatgacatggtgtgtggggacattccctttgagagggaccaggagattctggaagctgagctccacttcccagcccatgtctccccagactgctgtgccctaatccgccggtgcctggcccccaaaccttcttcccgaccctcactggaagagatcctgctggacccctggatgcaaacaccagccgaggatgtacccctcaacccctccaaaggaggccctgcccctttggcctggtccttgctaccctaagcctggcctggcctggcctggcccccaatggtcagaagagccatcccatggccatgtcacagggatagatggacatttgttgacttggttttacaggtcattaccagtcattaaagtccagtattactaaggtaagggattgaggatcaggggttagaagacataaaccaagtctgcccagttcccttcccaatcctacaaaggagccttcctcccagaacctgtggtccctgattctggagggggaacttcttgcttctcattttgctaaggaagtttattttggtgaagttgttcccattctgagccccgggactcttattctgatgatgtgtcaccccacattggcacctcctactaccaccacacaaacttagttcatatgctcttacttgggcaagggtgctttccttccaataccccagtagcttttattttagtaaagggaccctttcccctagcctagggtcccatattgggtcaagctgcttacctgcctcagcccaggattctttattctgggggaggtaatgccctgttgttaccccaaggcttcttttttttttttttttgggtgaggggaccctactctgttatcccaagtgctcttattctggtgagaagaaccttacttccataatttgggaaggaatggaagatggacaccaccggacaccaccagacactaggatgggatggatggttttttgggggatgggctaggggaaataaggcttgctgtttgttctcctggggcgctccctccaacttttgcagattcttgcaacctcctcctgagccgggattgtccaattactaaaatgtaaataatcacgtattgtggggaggggagttccaagtgtgccctcctctcttctcctgcctggattatttaaaaagccatgtgtggaaacccactatttaataaaagtaatagaatcag<210>40
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4040>Ly1905P pim-2原癌基因全長(zhǎng)MLTKPLQGPPAPPGTPTPPPGGKDREAFEAEYRLGPLLGKGGFGTVFAGHRLTDRLQVAIKVIPRNRVLGWSPLSDSVTCPLEVALLWKVGAGGGHPGVIRLLDWFETQEGFMLVLERPLPAQDLFDYITEKGPLGEGPSRCFFGQVVAAIQHCHSRGVVHRDIKDENILIDLRRGCAKLIDFGSGALLHDEPYTDFDGTRVYSPPEWISRHQYHALPATVWSLGILLYDMVCGDIPFERDQEILEAELHFPAHVSPDCCALIRRCLAPKPSSRPSLEEILLDPWMQTPAEDVPLNPSKGGPAPLAWSLLP<210>41<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4141>Ly663S_Old_SEQ-ID_2757部分cDNActggaactgcacntagtcccagctctcctcggccgcggtctcctcggggntggtgccgtacttttggatggttttctctacnacntcccgcaagcttccntccag<210>42<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4242>Ly663S CD37抗原(CD37)全長(zhǎng)cDNAgtctcccccactgtcagcacctcttctgtgtggtgagtggaccgcttaccccactaggtgaagatgtcagcccaggagagctgcctcagcctcatcaagtacttcctcttcgttttcaacctcttcttcttcgtcctcggcagcctgatcttctgcttcggcatctggatcctcatcgacaagaccagcttcgtgtcctttgtgggcttggccttcgtgcctctgcagatctggtccaaagtcctggccatctcaggaatcttcaccatgggcatcgccctcctgggttgtgtgggggccctcaaggagctccgctgcctcctgggcctgtattttgggatgctgctgctcctgtttgccacacagatcaccctgggaatcctcatctccactcagcgggcccagctggagcgaagcttgcgggacgtcgtagagaaaaccatccaaaagtacggcaccaaccccgaggagaccgcggccgaggagagctgggactatgtgcagttccagctgcgctgctgcggctggcactacccgcaggactggttccaagtcctcatcctgagaggtaacgggtcggaggcgcaccgcgtgccctgctcctgctacaacttgtcggcgaccaacgactccacaatcctagataaggtgatcttgccccagctcagcaggcttggacacctggcgcggtccagacacagtgcagacatctgcgctgtccctgcagagagccacatctaccgcgagggctgcgcgcagggcctccagaagtggctgcacaacaaccttatttccatagtgggcatttgcctgggcgtcggcctactcgagctcgggttcatgacgctctcgatattcctgtgcagaaacctggaccacgtctacaaccggctcgctcgataccgttaggccccgccctccccaaagtcccgccccgcccccgtcacgtgcgctgggcacttccctgctgcctgtaaatatttgtttaatccccagttcgcctggagccctccgccttcacattcccctggggacccacgtggctgcgtgcccctgctgctgtcacctctcccacgggacctggggctttcgtccacagcttcctgtccccatctgtcggcctac<210>43<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4343>Ly663S，CD37抗原，全長(zhǎng)MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR<210>44<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4444>Ly664S，F(xiàn)LJ90810 fis，類(lèi)似于蛋白質(zhì)二氯化物異構(gòu)酶相關(guān)蛋白前體的每周克隆，全長(zhǎng)
agccccgccgcgatgcccgcgcgcccaggacgcctcctcccgctgctggcccggccggcggccctgactgcgctgctgctgctgctgctgggccatggcggcggcgggcgctggggcgcccgggcccaggaggcggcggcggcggcggcggacgggccccccgcggcagacggcgaggacggacaggacccgcacagcaagcacctgtacacggccgacatgttcacgcacgggatccagagcgccgcgcacttcgtcatgttcttcgcgccctggtgtggacactgccagcggctgcagccgacttggaatgacctgggagacaaatacaacagcatggaagatgccaaagtctatgtggctaaagtggactgcacggcccactccgacgtgtgctccgcccagggggtgcgaggataccccaccttaaagcttttcaagccaggccaagaagctgtgaagtaccagggtcctcgggacttccagacactggaaaactggatgctgcagacactgaacgaggagccagtgacaccagagccggaagtggaaccgcccagtgcccccgagctcaagcaagggctgtatgagctctcagcaagcaactttgagctgcacgttgcacaaggcgaccactttatcaagttcttcgctccgtggtgtggtcactgcaaagccctggctccaacctgggagcagctggctctgggccttgaacattccgaaactgtcaagattggcaaggttgattgtacacagcactatgaactctgctccggaaaccaggttcgtggctatcccactcttctctggttccgagatgggaaaaaggtggatcagtacaagggaaagcgggatttggagtcactgagggagtacgtggagtcgcagctgcagcgcacagagactggagcgacggagaccgtcacgccctcagaggccccggtgctggcagctgagcccgaggctgacaagggcactgtgttggcactcactgaaaataacttcgatgacaccattgcagaaggaataaccttcatcaagttttatgctccatggtgtggtcattgtaggactctggctcctacttgggaggaactctctaaaaaggaattccctggtctggcgggggtcaagatcgccgaagtagactgcactgctgaacggaatatctgcagcaagtattcggtacgaggctaccccacgttattgcttttccgaggagggaagaaagtcagtgagcacagtggaggcagagaccttgactcgttacaccgctttgtcctgagccaagcgaaagacgaactttaggaacacagttggaggtcacctctcctgcccagctcccgcaccctgcgtttaggagttcagtcccacagaggccactgggttcccagtggtggctgttcagaaagcagaacatactaagcgtgaggtatcttctttgtgtgtgtgttttccaagccaacacactctacagattctttattaaatgtgtaactcatggtcactgtgtaaacattttcagtggcgatatatcccctttgaccttctcttgatgaaatttacatggtttcctttgagactaaaatagcgttgagggaaatgaaattgctggactatttgtggctcctgagttgagtgattttggtgaaagaaagcacatccaaagcatagtttacctgcccacgagttctggaaaggttgccttgtggcagtattgacgttcctctgatcttaaggtcacagttgactcaatactgtgttggtccgtagcatggagcagattgaaatgcaaaaacccacacctctggaggataccttcacggccgctgctggagcttctgttgctgtgaatacttctctcagtgtgagaggttagccgtgatgaaagcagcgttacttctgaccgtgcctgagtaagagaatgctgatgccataactttatgtgtcgatacttgtcaaatcagttactgttcaggggatccttctgtttctcacggggtgaaacatgtctttagttcctcatgttaacacgaagccagagcccacatgaactgttggatgtcttccttagaaagggtaggcatggaaaattccacgaggctcattctcagtatctcattaactcattgaaagattccagttgtatttgtcacctggggtgacaagaccagacaggctttcccaggcctgggtatccagggaggctctgcagccctgctgaagggccctaactagagttctagagtttctgattctgtttctcagtagtccttttagaggcttgctatacttggtctgcttcaaggaggtcgaccttctaatgtatgaagaatgggatgcatttgatctcaagaccaaagacagatgtcagtgggctgctctggccctggtgtgcacggctgtggcagctgttgatgccagtgtcctctaactcatgctgtccttgtgattaaacacctctatctcccttgggaataagcacatacaggcttaagctctaagatagataggtgtttgtccttttaccatcgagctacttcccataataaccactttgcatccaacactcttcacccacctcccatacgcaaggggatgtggatacttggcccaaagtaactggtggtaggaatcttagaaacaagaccacttatactgtctgtctgaggcagaagataacagcagcatctcgaccagcctctgccttaaaggaaatctttattaatcacgtatggttcacagataattctttttttaaaaaaacccaacctcctagagaagcacaactgtcaagagtcttgtacacacaacttcagctttgcatcacgagtcttgtattccaagaaaatcaaagtggtacaatttgtttgtttacactatgatactttctaaataaactcctttttttt<210>45<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4545>Ly664S，全長(zhǎng)MPARPGRLLPLLARPAALTALLLLLLGHGGGGRWGARAQEAAAAAADGPPAADGEDGQDPHSKHLYTADMFTHGIQSAAHFVMFFAPWCGHCQRCQPTWNDLGDKYNSMEDAKVYVAKVDCTAHSDVCSAQGVRGYPTLKLFKPGQEAVKYQGPRDFQTLENWMLQTLNEEPVTPEPEVEPPSAPELKQGLYELSASNFELHVAQGDHFIKFFAPWCGHCKALSPTWEQLALGLEHSETVKIGKVDCTQHYELCSGNQVRGYPTLLWFRDGKKVDQYKGKRDLESLREYVESQLQRTETGATETVTPSEAPVLAAEPEADKGTVLALTENNFDDTIAEGITFIKFYAPWCGHCRTLAPTWEELSKKEFPGLAGVKIAEVDCTAERNICSKYSVRGYPTLLLFRGGKKVSEHSGGRDLDSLHRFVLSQAKDEL<210>46<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4646>Ly667S，Old-SEQ-ID_9413，部分cDNAccagccagtgacagaaaaaagagtgaatgtgcctttaagaagaagagcaatgagacacagtgtttcaacttcatccgtgtcctggtttcttacaatgtcacccatctctacacctgcggcaccttcgccttcagccctgcttgtaccttcattgaacttcaagattcctacctgttgccc
atctcggaggacaaggtcatggagggaaaaggccaaagcccctttgaccccgctcacaagcatacggctgtcttggtggatgggatgctctattctggtactatgaacaacttcctgggcagtgagcccatcctgatgcgcacactgggatcccagcctgtcctcaagaccgacaacttcctccgctggctgcatcatgacgcctcctttgtggcagccatcccttcgacccaggtcgtctacttcttcttcgaggagacagccagcgagtttgacttctttgagaggctccacacatcgcgggtggctagagtctgcaagaatgacgtgggcggcgaaaagctgctgcagaagaagtggaccaccttcct<210>47<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4747>Ly667S，腦信號(hào)蛋白B，全長(zhǎng)aggatgatgaaagtgagaccgtcttagggcccttccagatagtgaaccttctctgccccaatgccccacccctgccaccaatacacacgcttctgctgcctggggctctcctattggtcctcggggggatgtggtaagaactgctcacccagaaagtgcccgggtgcctgtttccccagacctccctggtgacagtctgtggctgagcatggccctcccagccctgggcctggacccctggagcctcctgggccttttcctcttccaactgcttcagctgctgctgccgacgacgaccgcggggggaggcgggcaggggcccatgcccagggtcagatactatgcaggggatgaacgtagggcacttagcttcttccaccagaagggcctccaggattttgacactctgctcctgagtggtgatggaaatactctctacgtgggggctcgagaagccattctggccttggatatccaggatccaggggtccccaggctaaagaacatgataccgtggccagccagtgacagaaaaaagagtgaatgtgcctttaagaagaagagcaatgagacacagtgtttcaacttcatccgtgtcctggtttcttacaatgtcacccatctctacacctgcggcaccttcgccttcagccctgcttgtaccttcattgaacttcaagattcctacctgttgcccatctcggaggacaaggtcatggagggaaaaggccaaagcccctttgaccccgctcacaagcatacggctgtcttggtggatgggatgctctattctggtactatgaacaacttcctgggcagtgagcccatcctgatgcgcacactgggatcccagcctgtcctcaagaccgacaacttcctccgctggctgcatcatgacgcctcctttgtggcagccatcccttcgacccaggtcgtctacttcttcttcgaggagacagccagcgagtttgacttctttgagaggctccacacatcgcgggtggctagagtctgcaagaatgacgtgggcggcgaaaagctgctgcagaagaagtggaccaccttcctgaaggcccagctgctctctgcacccagccggggcagctgcccttcaacgtcatccgccacgcggtcctgctccccgccgattctcccacagctccccacatctacgcagtcttcacctcccagtgggcaggttggcgggaccaggagctctgcggtttgtgccttctctctcttggacattgaacgtgtctttaaggggaaattcaaagagttgaacaaagaaacttcacgctggactacttataggggccctgagaccaacccccggccaggcagttgctcagtgggcccctcctctgataaggccctgaccttcatgaaggaccatttcctgatggatgagcaagtggtggggacgcccctgctggtgaaatctggcgtggagtatacacggcttgcagtggagacagcccagggccttgatgggcacagccatcttgtcatgtacctgggaaccaccacagggtcgctccacaaggctgtggtaagtggggacagcagtgctcatctggtggaagagattcagctgttccctgaccctgaacctgttcgcaacctgcagctggcccccacccagggtgcagtgtttgtaggcttctcaggaggtgtctggagggtgccccgagccaactgtagtgtctatgagagctgtgtggactgtgtccttgcccgggacccccactgtgcctgggaccctgagtcccgaacctgttgcctcctgtctgcccccaacctgaactcctggaagcaggacatggagcgggggaacccagagtgggcatgtgccagtggccccatgagcaggagccttcggcctcagagccgcccgcaaatcattaaagaagtcctggctgtccccaactccatcctggagctcccctgcccccacctgtcagccttggcctcttattattggagtcatggcccagcagcagtcccagaagcctcttccactgtctacaatggctccctcttgctgatagtgcaggatggagttgggggtctctaccagtgctgggcaactgagaatggcttttcataccctgtgatctcctactgggtggacagccaggaccagaccctggccctggatcctgaactggcaggcatcccccgggagcatgtgaaggtcccgttgaccagggtcagtggtggggccgccctggctgcccagcagtcctactggccccactttgtcactgtcactgtcctctttgccttagtgctttcaggagccctcatcatcctcgtggcctccccattgagagcactccgggctcggggcaaggttcagggctgtgagaccctgcgccctggggagaaggccccgttaagcagagagcaacacctccagtctcccaaggaatgcaggacctctgccagtgatgtggacgctgacaacaactgcctaggcactgaggtagcttaaactctaggcacaggccggggctgcggtgcaggcacctggccatgctggctgggcggcccaagcacagccctgactaggatgacagcagcacaaaagaccacctttctcccctgagaggagcttctgctactctgcatcactgatgacactcagcagggtgatgcacagcagtctgcctcccctatgggactcccttctaccaagcacatgagctctctaacagggtgggggctacccccagacctgctcctacactgatattgaagaacctggagaggatccttcagttctggccattccagggaccctccagaaacacagtgtttcaagagaccctaaaaaacctgcctgtcccaggaccctatggtaatgaacaccaaacatctaaacaatcatatgctaacatgccactcctggaaactccactctgaagctgccgctttggacaccaacactcccttctcccagggtcatgcagggatctgctccctcctgcttcccttaccagtcgtgcaccgctgactcccaggaagtctttcctgaagtctgaccacctttcttcttgcttcagttggggcagactctgatcccttctgccctggcagaatggcaggggtaatctgagccttcttcactcctttaccctagctgaccccttcacctctccccctccctcttcctttgttttgggattcagaaaactgcttgtcagagactgtttattttttattaaaaatataaggcttatgtatgat<210>48<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>48
48>Ly667S，腦信號(hào)蛋白B，全長(zhǎng)MALPALGLDPWSLLGLFLFQLLQLLLPTTTAGGGGQGPMPRVRYYAGDERRALSFFHQKGLQDFDTLLLSGDGNTLYVGAREAILALDIQDPGVPRLKNMIPWPASDRKKSECAFKKKSNETQCFNFIRVLVSYNVTHLYTCGTFAPSPACTFIELQDSYLLPISEDKVMEGKGQSPFDPAHKHTAVLVDGMLYSGTMNNFLGSEPILMRTLGSQPVLKTDNFLRWLHHDASFVAAIPSTQVVYFFFEETASEFDFFERLHTSRVARVCKNDVGGEKLLQKKWTTFLKAQLLSAPSRGSCPSTSSATRSCSPPILPQLPTSTQSSPPSGQVGGTRSSAVCAFSLLDIERVFKGKFKELNKETSRWTTYRGPETNPRPGSCSVGPSSDKALTFMKDHFLMDEQVVGTPLLVKSGVEYTRLAVETAQGLDGHSHLVMYLGTTTGSLHKAVVSGDSSAHLVEEIQLFPDPEPVRNLQLAPTQGAVFVGFSGGVWRVPRANCSVYESCVDCVLARDPHCAWDPESRTCCLLSAPNLNSWKQDMERGNPEWACASGPMSRSLRPQSRPQIIKEVLAVPNSILELPCPHLSALASYYWSHGPAAVPEASSTVYNGSLLLIVQDGVGGLYQCWATENGFSYPVISYWVDSQDQTLALDPELAGIPREHVKVPLTRVSGGAALAAQQSYWPHFVTVTVLFALVLSGALIILVASPLRALRARGKVQGCETLRPGEKAPLSREQHLQSPKECRTSASDVDADNNCLGTEVA<210>49<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4949>Ly677S，Old-SEQ-ID_465，部分cDNAaccagcagtcctgcggcacctacctccgcgtgcgccagccgccccccaggcccttcctggacatgggggagggcaccaagaaccgaatcatcacagccgaggggatcatcctcctgttctgcgcggtggtgcctgggacgctgctgctgttnaggaaacgatggcaagaacganaactcngg<210>50<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5050>Ly677S，Old-SEQ-ID_1923，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)QQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLXRKRWQERXLX<210>51<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5151>Ly677S，Old-SEQ-ID_5989，部分cDNAaccagcagtcctgcggcacctacctccgcgtgcgccagccgccccccaggcccttcctggacatgggggagggcaccaagaaccgaatcatcacagccgaggggatcatcctcctgttctgcgcggtggtgcctgggacgctgctgctgttnaggaaacgatggcaagaacganaactcngg<210>52<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5252>Ly677S，Old-SEQ-ID_1496，部分蛋白質(zhì)QQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLXRKRWQERXLX<210>53<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5353>Ly677S，CD79A抗原(免疫球蛋白相關(guān)的α)，全長(zhǎng)tgctgcaactcaaactaaccaacccactgggagaagatgcctgggggtccaggagtcctccaagctctgcctgccaccatcttcctcctcttcctgctgtctgctgtctacctgggccctgggtgccaggccctgtggatgcacaaggtcccagcatcattgatggtgagcctgggggaagacgcccacttccaatgcccgcacaatagcagcaacaacgccaacgtcacctggtggcgcgtcctccatggcaactacacgtggccccctgagttcttgggcccgggcgaggaccccaatggtacgctgatcatccagaatgtgaacaagagccatgggggcatatacgt
gtgccgggtccaggagggcaacgagtcataccagcagtcctgcggcacctacctccgcgtgcgccagccgccccccaggcccttcctggacatgggggagggcaccaagaaccgaatcatcacagccgaggggatcatcctcctgttctgcgcggtggtgcctgggacgctgctgctgttcaggaaacgatggcagaacgagaagctcgggttggatgccggggatgaatatgaagatgaaaacctttatgaaggcctgaacctggacgactgctccatgtatgaggacatctcccggggcctccagggcacctaccaggatgtgggcagcctcaacataggagatgtccagctggagaagccgtgacacccctactcctgccaggctgcccccgcctgctgtgcacccagctccagtgtctcagctcacttccctgggacattctcctttcagcccttctgggggcttccttagtcatattcccccagtggggggtgggagggtaacctcactcttctccaggccaggcctccttggactcccctgggggtgtcccactcttcttccctctaaactgccccacctcctaacctaatccccacgccccgctgcctttcccaggctcccctcacccagcgggtaatgagcccttaatcgctgcctctaggggagctgattgtagcagcctcgttagtgtcaccccctcctccctgatctgtcagggccacttagtgataataaattcttcccaactgc<210>54<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5454>Ly677S，CD9A抗原，完全蛋白質(zhì)MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP<210>55<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5555>Ly1891P，孤獨(dú)G-蛋白偶聯(lián)的受體(GPRC5D)，全長(zhǎng)atgtacaaggactgcatcgagtccactggagactattttcttctctgtgacgccgaggggccatggggcatcattctggagtccctggccatacttggcatcgtggtcacaattctgctactcttagcatttctcttcctcatgcgaaagatccaagactgcagccagtggaatgtcctccccacccagctcctcttcctcctgagtgtcctggggctcttcggactcgcttttgccttcatcatcgagctcaatcaacaaactgcccccgtacgctactttctctttggggttctctttgctctctgtttctcatgcctcttagctcatgcctccaatctagtgaagctggttcggggttgtgtctccttctcctggacgacaattctgtgcattgctattggttgcagtctgttgcaaatcattattgccactgagtatgtgactctcatcatgaccagaggtatgatgtttgtgaatatgacaccctgccagctcaatgtggactttgttgtactcctggtctatgtcctcttcctgatggccctcacattcttcgtctccaaagccaccttctgtggcccgtgtgagaactggaagcagcatggaaggctcatctttatcactgtgctcttctccatcatcatctgggtggtgtggatctccatgctcctgagaggcaacccgcagttccagcgacagccccagtgggacgacccggtcgtctgcattgctctggtcaccaacgcatgggttttcctgctgctgtacatcgtccctgagctctgcattctctacagatcgtgtagacaggagtgccctttacaaggcaatgcctgccccgtcacagcctaccaacacagcttccaagtggagaaccaggagctctccagagcccgagacagtgatggagctgaggaggatgtagcattaacttcatatggtactcccattcagccgcagactgttgatcccacacaagagtgtttcatcccacaggctaaactaagcccccagcaagatgcaggaggagtataa<210>56<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5656>Ly1891P，孤獨(dú)G-蛋白偶聯(lián)的受體(GPRC5D)，全長(zhǎng)MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILESLAILGIVVTILLLLAFLFLMRKIQDCSQWNVLPTQLLFLLSVLGLFGLAFAFIIELNQQTAPVRYFLFGVLFALCFSCLLAHASNLVKLVRGCVSFSWTTILCIAIGCSLLQIIIATEYVTLIMTRGMMFVNMTPCQLNVDFVVLLVYVLFLMALTFFVSKATFCGPCENWKQHGRLIFITVLFSIIIWVVWISMLLRGNPQFQRQPQWDDPVVCIALVTNAWVFLLLYIVPELCILYRSCRQECPLQGNACPVTAYQHSFQVENQELSRARDSDGAEEDVALTSYGTPIQPQTVDPTQECFIPQAKLSQQQDAGGV<210>57<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5757>CD138，多配聚糖1(SDC1)，全長(zhǎng)cDNAggcacgaggaagggcctgtgggtttattataaggcggagctcggcgggagaggtgcgggccgaatccgag
ccgagcggagaggaatccggcagtagagagcggactccagccggcggaccctgcagccctcgcctgggacagcggcgcgctgggcaggcgcccaagagagcatcgagcagcggaacccgcgaagccggcccgcagccgcgacccgcgcagcctgccgctctcccgccgccggtccgggcagcatgaggcgcgcggcgctctggctctggctgtgcgcgctggcgctgagcctgcagccggccctgccgcaaattgtggctactaatttgccccctgaagatcaagatggctctggggatgactctgacaacttctccggctcaggtgcaggtgctttgcaagatatcaccttgtcacagcagaccccctccacttggaaggacacgcagctcctgacggctattcccacgtctccagaacccaccggcctggaggctacagctgcctccacctccaccctgccggctggagaggggcccaaggagggagaggctgtagtcctgccagaagtggagcctggcctcaccgcccgggagcaggaggccaccccccgacccagggagaccacacagctcccgaccactcatcaggcctcaacgaccacagccaccacggcccaggagcccgccacctcccacccccacagggacatgcagcctggccaccatgagacctcaacccctgcaggacccagccaagctgaccttcacactccccacacagaggatggaggtccttctgccaccgagagggctgctgaggatggagcctccagtcagctcccagcagcagagggctctggggagcaggacttcacctttgaaacctcgggggagaatacggctgtagtggccgtggagcctgaccgccggaaccagtccccagtggatcagggggccacgggggcctcacagggcctcctggacaggaaagaggtgctgggaggggtcattgccgtaggcctcgtggggctcatctttgctgtgtgcctggtgggtttcatgctgtaccgcatgaagaagaaggacgaaggcagctactccttggaggagccgaaacaagccaacggcggggcctaccagaagcccaccaaacaggaggaattctatgcctgacgcgggagccatgcgccccctccgccctgccactcactaggcccccacttgcctcttccttgaagaactgcaggccctggcctcccctgccaccaggccacctccccagcattccagcccctctggtcgctcctgcccacggagtcgtggggtgtgctgggagctccactctgcttctctgacttctgcctggagacttagggcaccaggggtttctcgcataggacctttccaccacagccagcacctggcatcgcaccattctgactcggtttctccaaactgaagcagcctctccccaggtccagctctggaggggagggggatccgactgctttggacctaaatggcctcatgtggctggaagatcctgcgggtggggcttggggctcacacacctgtagcacttactggtaggaccaagcatcttgggggggtggccgctgagtggcaggggacaggagtccactttgtttcgtggggaggtctaatctagatatcgacttgtttttgcacatgtttcctctagttctttgttcatagcccagtagaccttgttacttctgaggtaagttaagtaagttgattcggtatccccccatcttgcttccctaatctatggtcgggagacagcatcagggttaagaagactttttttttttttttttttaaactaggagaaccaaatctggaagccaaaatgtaggcttagtttgtgtgttgtctcttgagtttgtcgctcatgtgtgcaacagggtatggactatctgtctggtggccccgtttctggtggtctgttggcaggctggccagtccaggctgccgtggggccgccgcctctttcaagcagtcgtgcctgtgtccatgcgctcagggccatgctgaggcctgggccgctgccacgttggagaagcccgtgtgagaagtgaatgctgggactcagccttcagacagagaggactgtagggagggcggcaggggcctggagatcctcctgcagaccacgcccgtcctgcctgtggcgccgtctccaggggctgcttcctcctggaaattgacgaggggtgtcttgggcagagctggctctgagcgcctccatccaaggccaggttctccgttagctcctgtggccccaccctgggccctgggctggaatcaggaatattttccaaagagtgatagtcttttgcttttggcaaaactctacttaatccaatgggtttttccctgtacagtagattttccaaatgtaataaactttaatataaagta<210>58<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5858>CD138，多配聚糖1(SDC1)，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)MRRAALWLWLCALALSLQPALPQIVATNLPPEDQDGSGDDSDNFSGSGAGALQDITLSQQTPSTWKDTQLLTAIPTSPEPTGLEATAASTSTLPAGEGPKEGEAVVLPEVEPGLTAREQEATPRPRETTQLPTTHQASTTTATTAQEPATSHPHRDMQPGHHETSTPAGPSQADLHTPHTEDGGPSATERAAEDGASSQLPAAEGSGEQDFTFETSGENTAVVAVEPDRRNQSPVDQGATGASQGLLDRKEVLGGVIAVGLVGLIFAVCLVGFMLYRMKKKDEGSYSLEEPKQANGGAYQKPTKQEEFYA<210>59<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5959>CD22，Old-SEQ-ID_4021，部分cDNActggggctgaggatggagtccaagactgagaaatggatggaacgaatacacctcaatgtctctgaagggccttttccacctcatatccagctccctccagaaattcaagagtcccaggaagtcactctgacctgcttgctgaatttctcctgctatgggtatccgatccaattgcagtggctcctagagggggttccaatgaggcaggctgctgtcacctcgacctccttgaccatcaagtctgtcttcacccggagcgagctcaagttctccccacagtggagtcaccatgggaagattgtgacctgccagcttcaggatgcagatgggaagttcctctccaatgacacggtgcag<210>60<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>60
60>CD22，全長(zhǎng)cDNAccatcccatagtgagggaagacacgcggaaacaggcttgcacccagacacgacaccatgcatctcctcggcccctggctcctgctcctggttctagaatacttggctttctctgactcaagtaaatgggtttttgagcaccctgaaaccctctacgcctgggagggggcctgcgtctggatcccctgcacctacagagccctagatggtgacctggaaagcttcatcctgttccacaatcctgagtataacaagaacacctcgaagtttgatgggacaagactctatgaaagcacaaaggatgggaaggttccttctgagcagaaaagggtgcaattcctgggagacaagaataagaactgcacactgagtatccacccggtgcacctcaatgacagtggtcagctggggctgaggatggagtccaagactgagaaatggatggaacgaatacacctcaatgtctctgaaaggccttttccacctcatatccagctccctccagaaattcaagagtcccaggaagtcactctgacctgcttgctgaatttctcctgctatgggtatccgatccaattgcagtggctcctagagggggttccaatgaggcaggctgctgtcacctcgacctccttgaccatcaagtctgtcttcacccggagcgagctcaagttctccccacagtggagtcaccatgggaagattgtgacctgccagcttcaggatgcagatgggaagttcctctccaatgacacggtgcagctgaacgtgaagcacaccccgaagttggagatcaaggtcactcccagtgatgccatagtgagggagggggactctgtgaccatgacctgcgaggtcagcagcagcaacccggagtacacgacggtatcctggctcaaggatgggacctcgctgaagaagcagaatacattcacgctaaacctgcgcgaagtgaccaaggaccagagtgggaagtactgctgtcaggtctccaatgacgtgggcccgggaaggtcggaagaagtgttcctgcaagtgcagtatgccccggaaccttccacggttcagatcctccactcaccggctgtggagggaagtcaagtcgagtttctttgcatgtcactggccaatcctcttccaacaaattacacgtggtaccacaatgggaaagaaatgcagggaaggacagaggagaaagtccacatcccaaagatcctcccctggcacgctgggacttattcctgtgtggcagaaaacattcttggtactggacagaggggcccgggagctgagctggatgtccagtatcctcccaagaaggtgaccacagtgattcaaaaccccatgccgattcgagaaggagacacagtgaccctttcctgtaactacaattccagtaaccccagtgttacccggtatgaatggaaaccccatggcgcctgggaggagccatcgcttggggtgctgaagatccaaaacgttggctgggacaacacaaccatcgcctgcgcacgttgtaatagttggtgctcgtgggcctcccctgtcgccctgaatgtccagtatgccccccgagacgtgagggtccggaaaatcaagcccctttccgagattcactctggaaactcggtcagcctccaatgtgacttctcaagcagccaccccaaagaagtccagttcttctgggagaaaaatggcaggcttctggggaaagaaagccagctgaattttgactccatctccccagaagatgctgggagttacagctgctgggtgaacaactccataggacagacagcgtccaaggcctggacacttgaagtgctgtatgcacccaggaggctgcgtgtgtccatgagcccgggggaccaagtgatggaggggaagagtgcaaccctgacctgtgagagtgacgccaaccctcccgtctcccactacacctggtttgactggaataaccaaagcctcccccaccacagccagaagctgagattggagccggtgaaggtccagcactcgggtgcctactggtgccaggggaccaacagtgtgggcaagggccgttcgcctctcagcacccttactgtctactatagcccggagaccatcggcaggcgagtggctgtgggactcgggtcctgcctcgccatcctcatcctggcaatctgtgggctcaagctccagcgacgttggaagaggacacagagccagcaggggcttcaggagaattccagcggccagagcttctttgtgaggaataaaaaggttagaagggcccccctctctgaaggcccccactccctgggatgctacaatccaatgatggaagatggcattagctacaccaccctgcgctttcccgagatgaacataccacgaactggagatgcagagtcctcagagatgcagagacctccccggacctgcgatgacacggtcacttattcagcattgcacaagcgccaagtgggcgactatgagaacgtcattccagattttccagaagatgaggggattcattactcagagctgatccagtttggggtcggggagcggcctcaggcacaagaaaatgtggactatgtgatcctcaaacattgacactggatgggctgcagcagaggcactgggggcagcgggggccagggaagtccccgagtttccccagacaccgccacatggcttcctcctgcgtgcatgtgcgcacacacacacacacacgcacacacacacacacacactcactgcggagaaccttgtgcctggctcagagccagtctttttggtgagggtaaccccaaacctccaaaactcctgcccctgttctcttccactctccttgctacccagaaatcatctaaatacctgccctgacatgcacacctcccctgccccaccagcccactggccatctccacccggagctgctgtgtcctctggatctgctcgtcattttccttcccttctccatctctctggccctctacccctgatctgacatccccactcacgaatattatgcccagtttctgcctctgagggaaagcccagaaaaggacagaaacgaagtagaaaggggcccagtcctggcctggcttctcctttggaagtgaggcattgcacggggagacgtacgtatcagcggccccttgactctggggactccgggtttgagatggacacactggtgtggattaacctgccagggagacagagctcacaataaaaatggctcagatgccacttcaaagaaaaaaaaaa<210>61<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6161>CD22，全長(zhǎng)蛋白質(zhì).
MHLLGPWLLLLVLEYLAFSDSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACARCNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPHHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRRVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEM
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<223>His-Ly1452P的PDM-797 PCR引物<400>122gtgtcacaat ctacagtcag gcaggattct cc32<210>123<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>His-Ly1452P的PDM-799 PCR引物<400>123gttatgtagc ggccgcttat catgttgctg cagag 35<210>124<211>980<212>DNA<223>Incyte Lifeseq數(shù)據(jù)庫(kù)模板#LS_1076101.8
人內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(HERV)<400>124gccgctgccg ctccaggaga caggttccca tgcaggaatg aaagacatgg aagggaagag 60gggggccagc tccctgagtc ctgtgtccac cagctgctgc taaatacctc tgagaaactc120tgcttctatc taaggggacc tacttctctc gggaatctca atacttggaa caagaacctc180ctagacggac cctttggcat aatgaattgg accaactgta ggttccagga ctagagagcc240agcaatgcct ccatgaacaa tctcacccaa ttactctgct caggaaacga ggtaactgat300ggacagccga ggcagcccct taggcggctt aggcctcccc tgtggagcat ccctgaggcg360gactccggcc agcccgagtg atgcgatcca aagagcactc ccgggtagga aattgccccg420gtggaatgcc tcaccagagc agcgtgtagc agttccctgt ggaggattaa cacagtggct480gaacaccggg aaggaactgg cacttggagt ccggacatct gaaacttgta gactgggagc540tgtacatgga tgggagcagc ttcaccaacc cctgcaaagt gactctgaag aagacgacaa600gccctgctcc agtcacaccc ggaagctgac tggtccacgc acagctgaag catgaggaaa660ctcatcgcgg gactaatttt ccttaaaatt tagacttgca cagtaaggac ttcaactgac720cttcctcaga ctgagaactg tttccagtat atacatcaag tcactgaggt aggacaaaag780attgctacat tcctattatt ttaaggttac atttttgggg acccctcttt cttctgttct840agctattacc tttcttgtgt cacctagaaa aggaccagtc cttaattgta ttttaaaaac900tgtgatcatg ggaagcttta aattggttca ataacacgca tcaagttggt tatttcctgg960gctacatacc ttggatagat980
權(quán)利要求
1.一種如SEQ ID N01-3、5、7、9、11、13-14、16-17、19-20、22-25、27-28、30-31、33-34、36、38-39、41-42、44、46-47、49、51、53、55、57、59-60、62、64-65、67-70、72-73、75、77-81、83、85-86、88-100、102-103、105-106、108、110-113、115-116、118或124所示的分離的多核苷酸，其中，所述多核苷酸編碼一種多肽或其免疫原性片段。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含有可操作連接于表達(dá)控制序列的如權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
3.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體。
4.一種免疫結(jié)合物，其特征在于，所述免疫結(jié)合物含有特異性結(jié)合由權(quán)利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽或其免疫原性片段的抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的免疫結(jié)合物，其特征在于，所述抗體連接于效應(yīng)分子。
6.如權(quán)利要求4所述的免疫結(jié)合物在藥物制造中的應(yīng)用，所述藥物在治療癌癥的組合物中作為活性成分。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述癌癥是慢性淋巴細(xì)胞白血病。
9.一種含有如SEQ ID NOS4、6、8、10、12、15、18、21、26、29、32、35、37、40、43、45、48、50、52、54、56、58、61、63、66、71、74、76、82、84、87、101、104、107、109、114、117或119-121所示氨基酸序列的分離的多肽。
10.一種分離的抗體，其特征在于，所述抗體特異性結(jié)合權(quán)利要求9所述的多肽或其免疫原性片段。
11.一種免疫結(jié)合物，其特征在于，所述免疫結(jié)合物含有權(quán)利要求10所述的抗體。
12.如權(quán)利要求11所述的免疫結(jié)合物，其特征在于，所述抗體連接于效應(yīng)分子。
13.如權(quán)利要求12所述的免疫結(jié)合物，其特征在于，所述效應(yīng)分子是治療性部分。
14.如權(quán)利要求11所述的免疫結(jié)合物在藥物制造中的應(yīng)用，所述藥物在治療癌癥的組合物中作為活性成分。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌癥是慢性淋巴細(xì)胞白血病。
全文摘要
公開(kāi)了檢測(cè)、診斷、預(yù)后和治療血液惡性腫瘤疾病，具體是B細(xì)胞白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的方法和組合物。公開(kāi)了在動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)特異性血液惡性腫瘤相關(guān)抗原性多肽及其抗原性多肽片段的免疫和T細(xì)胞應(yīng)答的組合物、方法和試劑盒。還公開(kāi)了用于鑒定含一種或多種血液惡性腫瘤相關(guān)組合物的細(xì)胞和生物樣品的組合物和方法，以及檢測(cè)和診斷這類(lèi)疾病和病變細(xì)胞的方法。還公開(kāi)了診斷和治療試劑盒及診斷、治療和/或預(yù)防各種白血病和淋巴瘤的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1643143SQ03806580
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月22日
發(fā)明者A·蓋格, P·A·阿爾蓋特, J·曼尼恩, J·D·克拉普, A·王, N·奧多尼斯, L·卡特, P·D·麥克內(nèi)爾 申請(qǐng)人:考麗克薩有限公司